WO2007009519A1 - Vorrichtung zur affinitätsseparation mittels magnetischer partikel - Google Patents

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WO2007009519A1
WO2007009519A1 PCT/EP2006/004296 EP2006004296W WO2007009519A1 WO 2007009519 A1 WO2007009519 A1 WO 2007009519A1 EP 2006004296 W EP2006004296 W EP 2006004296W WO 2007009519 A1 WO2007009519 A1 WO 2007009519A1
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magnetic
separation space
separation
particles
fluid
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PCT/EP2006/004296
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Matthias Franzreb
Niklas Ebner
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Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
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    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2446/20—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being present in the particle core
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the invention relates to a device for affinity separation by means of magnetic micro sorbents, in particular in biological suspensions according to the first patent claim.
  • Such devices serve to selectively separate suspended or dissolved substances, e.g. Proteins from a solution.
  • magnetic microparticles which have a selective affinity for one or more of the aforementioned substances and bind them to the suspension are mixed into the suspension. After binding, the microsorbents with the selectively bound substances are deposited in a magnetic field. Finally, washing and elution steps take place, which release the bound substance in purified and often concentrated form.
  • magnetic microsorbents in combination with suitable magnetic technology.
  • magnetic microparticles microsorbents, magnetic beads
  • a container for example, Ruhr vessel
  • the loaded magnetic particles are pulled by applying a magnetic field to a wall surface in the container and held.
  • the residual suspension is applied with the applied magnetic field, i. without the retained particles removed from the vessel and replaced by a Spul Wegmaschine.
  • a deposition matrix usually a wire mesh fabric is used.
  • a measure to improve the particle pressure from a ball dump as a deposition matrix is described in [7]. It is a carousel magnetic separator whose annular deposition matrix is formed by a Kugelschuttung. To clean the matrix, a small portion of the balls is continuously withdrawn through a Auslasso réelle, externally washed and brought back via a Forderband back into the Matrixgehause.
  • the separated particles are separated from the separation elements (spheres) by means of a through-flow or an ejection of the spherical packing
  • the object of the invention is to propose a device which realizes the handling of magnetic micro-sorbents for separations in the praperative and technical scale easier and more efficient, and in particular to a special extent for use in suspensions with biological substances with a generally increased adhesion tendency.
  • the device should thereby both the separation and insbeson ⁇ particular the effective re-suspension of magnetic microparticles allow, without consuming Kreislaufbowschschungen and valve circuits.
  • the object is achieved by a device having the features of the first claim.
  • the dependent claims give advantageous Ausfuh ⁇ tion forms of the device again.
  • the device comprises a non-magnetic Separatorbehalter having a separation space with at least one fluid inlet and at least one fluid outlet, a deposition matrix for magnetizable particles in the separation space, comprising a Schüttung of similar magnetizable moldings and acting on the deposition matrix magnetic field.
  • the separation space is preferably elongated, has two ends, wherein it is preferably delimited at its two ends by a non-magnetic fluid-permeable wall as a fluid inlet or fluid outlet.
  • the magnetic field can be activated and deactivated by suitable means, such as a process control or a switch, for example by removal of permanent magnets or by switching off electromagnets.
  • the above-mentioned magnetic particles are suspended as microsorbents in the suspension which is to be passed through the separation space and selectively removed.
  • these particles Preferably, these particles have a high affinity for certain substances to be filtered out, so that they are preferred, i. selectively attach or attach to the particle. This can also be done, for example, by a specific assembly of the microsorbents, e.g. via functionalization of the surface (e.g., activation).
  • the fluid-permeable walls are permeable to all possible fluids to be treated, i. Liquids, suspensions, aerosols as well as particle streams such as dust without liquid phases, but not permeable to the Formkorper, which form the deposition matrix as a debris.
  • the walls on breakthroughs (holes, columns, etc.), whose cross-sections are dimensioned so that they are not penetrable by the moldings in each projection direction.
  • they have a width that clearly falls below the smallest cross-sectional dimensions.
  • An essential feature of the invention comprises means for circulating the debris in Separationsbehalter.
  • the circulation brings about a juxtaposition of the moldings with each other and on the Separationsraumwandung and thus a particularly efficient way of separating tion of the magnetizable particles of the Formenkorperoberflachen and the deagglomeration of the detached particle associations.
  • the separation is particularly effective when the Formkorper each have a fully outwardly directed Formkorperoberflache that are accessible to the other Formkorper in a circulation as Reibeflachen.
  • the shaped bodies therefore preferably also have no pores, breakthroughs, punches, deeper depressions, surface roughness or other depressions or undercuts.
  • the debris comprising the moldings and the interstices between the moldings, does not occupy the entire separation space volume for better re-rollability, but at most 95%, preferably between 20 and 70%, more preferably between 25 and 50%.
  • the device is therefore particularly suitable for use in the affinity separation of biological substances by means of magnetic micro sorbents in real biosuspensions. Only by the mechanical and thus particularly efficient cleaning of the mutually-rubbing shaped bodies, in fact, does the back-washing efficiency increase below about 70% (cf the state of the art in connection with biological substances) to more than 95%, despite the above-mentioned increased tendency of particles to adhere in the presence of biological substances.
  • the bedding must be well flowable for a fluid (especially for the suspension and the fluidity), i.
  • the moldings may occupy only a certain volume fraction in the debris.
  • the Formkorperflachen are not flat, but have a respect to the Formkorper outwardly directed curvature.
  • the shaped bodies in particular in view of the above transformations balls made of a magnetizable material said Formkorperoberflache is preferably gehartet or before ⁇ preferably a wear protection layer and a generally low Be ⁇ wettability and low affinity for passing to conducting suspension, in particular therein containing Having substances.
  • the use of spheres as shaped bodies for a bed, which can be used as a deposition matrix in the context of the invention, is particularly advantageous for the abovementioned reasons of bulk flowability and, in particular, cleanability.
  • the device has an operating state with an activated magnetic field and a cleaning state preferably, but not absolutely necessary, with the magnetic field deactivated.
  • the shaped bodies are acted on by the applied magnetic field, wherein the separation space is flowed through by the bed of the fluid to be cleaned with the magnetic particles.
  • the magnetic particles are deposited with the substances bound to them, e.g. biological substances or molecules to the shaped body surfaces.
  • the means for circulating the debris comprise means which effect a relative movement of the shaped bodies to one another and to the separation space inner walls.
  • the simplest variant for these means is based on a tilting and / or a rotating device for the entire separation space, wherein optionally mounted on the Separationsrauminnenwandungen mixing blades accelerate a circulation.
  • the circulation of the dumping takes place to the relevant part solely by a changed orientation of the dumping to the direction of gravity.
  • the prerequisite for an effective circulation is a comparatively small volume fraction of the bedding in the separation chamber volume, preferably between 10 and 60%, preferably between 20 or 25 and 50%, while the remaining empty volume fraction in the separation volume serves as an alternative space for the bedding. If this is too small, i. the separation space filled to over 70% with moldings or the debris and thus too full, hinder the moldings in their individual movements increasingly and thus the Umwalzungseffizienz.
  • the sliding friction activity of the shaped bodies is also reduced relative to one another and thus also the cleaning efficiency.
  • the aforementioned means for circulating the debris comprise at least two components in the separation space, which perform a relative movement to one another.
  • at least one of these components can be formed by the Separationsraumwandung.
  • the circulation is actively carried out by the aforementioned relative movement, wherein a shift is transmitted to the Formkorper the debris by the components and the above-mentioned influence of gravity plays at most a minor role.
  • the Be ⁇ interpretation of the aforementioned scum-free alternative space for the molding The body in the separation chamber is no longer so decisive for high strapping efficiency. Consequently, the volume fraction of the scum in the separation volume can also be set between 10 or 20% and preferably 50%, 60%, 70% or 80%.
  • the means preferably comprise a rotatable Ruhr element or a conveying screw in the separation space.
  • the stated upper limits of the volume fraction are preferably possible when the shaped bodies are balls.
  • Fig.l is a schematic side view of a manually operable first embodiment, e.g. with electromagnet,
  • FIG. 2 shows a plan view of a permanent magnet based embodiment with a schematic representation of a mechanical Umwalzvorraum
  • FIG. 3 shows a basic perspective view of another embodiment.
  • Fig.l shows a side view of a first embodiment of the device for ⁇ ffinitatsseparation.
  • the Separatorbehalter 1 consists of a non-magnetic material, such as plastic, and is characterized in that the elongated separation chamber 9 can be sealed with a Schüttung 2 at both ends by a respective cover 4 with respect to Flusstechniksaustritt.
  • the separation chamber 9 is bounded at its upper and lower ends by a non-magnetic perforated plate 5 (fluid-permeable wall) by being clamped between the lid 4 and the separator container 1, for example.
  • the perforated plate is characterized in that the dimensions of the punches are selected so that the retention of shaped bodies of the debris 2 (deposition matrix) is ensured, but that the passage of liquid can take place.
  • the debris 2 itself consists of a plurality of similar soft magnetic moldings, eg balls with a diameter of 1 - 5 mm, which in the exemplary embodiment fill the separation space 9 to 10 - 50%.
  • the covers 4 are provided with at least one respective bore for the fluid inlet and fluid outlet (inlet or outlet for the separation chamber). Constructively, these are attached as spigot 6, 7 with valves 14, 15 on the lids, so that fluids such as liquids or suspensions can be introduced into and discharged from the Separatorbehalter.
  • the upper cover contains at least one second bore with outlet 8, which serves as an air outlet for pressure equalization in the separator and is also closable via a valve.
  • the Separatorbehalter 1 is during the operating state in an upright position with the filled with the debris 2 Behaltabites in the range of a magnetic field 3, e.g. within a coil of an electromagnet, a superconducting magnet or between the poles of a permanent magnet.
  • a magnetic field e.g. within a coil of an electromagnet, a superconducting magnet or between the poles of a permanent magnet.
  • an equilibration buffer for example a protein binding buffer
  • a separation space 9 For operation (operating state), an equilibration buffer, for example a protein binding buffer, is first introduced into the separation space 9. If this is completely filled, the air valve is closed at the outlet port 8, and the Biorohsuspension with the magnetic particles, which are loaded with the target product via Affinitats- ligands supplied to the separator, while discharged via the lower valve of Equilibir michspuffer via a pump.
  • the magnetic field is turned on, so that the magnetic particles are retained within the debris.
  • the liquid originally present in the separation space 9 has been displaced by (eg bioroh) suspension, it is possible to add further biorohine suspension with magnetic particles until the particle uptake capacity of the bedding is almost exhausted. At this time, the separation process is stopped and then the still Biorohsuspension located within the separation chamber discharged from the lower valve 15, while at the same time wash buffer (Spul Wegtechnik) is introduced via the upper valve
  • the means 11 for circulating the debris such as e.g. by the rotation of a supported shaft 10 flanged over a non-magnetic sleeve 13 (see Fig. 2), or manually, the debris is rearranged by moving the separator several times through 180 ° about its central axis by rotation 12 in the vertical direction , This results in a shift of the Schuttung forming Formkorper due to gravity and thereby to their intensive mixing.
  • the mutual contact of the Formkorper with each other and with the washing buffer leads to an effective detachment of the deposited magnetic particles.
  • the precipitators break up any microsorbent agglomerates and at the same time serve as a rotting tool to ensure complete resuspension of the particles.
  • the separator is again brought into the coil or between the pole pieces 16 and the magnetic field for jerking the magnetic particles is turned on.
  • the aforementioned winding procedure is preferably repeated 1-2 times as part of a purification process.
  • an elution buffer which dissolves the biological target product of the magnetic particles. Further elution steps are optional
  • the final discharge of the elution buffer results in the product being purified and in virtually solids-free solution.
  • Fig.3 sees a motor driven non-magnetic auger
  • any very solid microsorbent agglomerates may be easier to break up than by merely changing the position / rotation of the separator.

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Abstract

Vorrichtung zur Affinitätsseparation mittels magnetischer Partikel. Aufgabe ist es, eine Vorrichtung vorzuschlagen, die die Handhabung magnetischer Mikrosorbentien für Trennungen im präperativen und technischen Maßstab einfacher und effizienter realisiert, und zwar im besonderen Maße auch speziell für eine Verwendung für Suspensionen mit biologischen Substanzen mit grundsätzlich verstärkter Adhäsionsneigung. Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung, umfassend einen unmagnetischen Separatorbehälter (1) mit einem Separationsraum (9) mit mindestens einen Fluideinlass und mindestens einen Fluidauslass, eine Abscheidungsmatrix für magnetisierbare Partikel im Separationsraum, umfassend einer Schüttung (2) aus gleichartigen magnetisierbaren Formkörpern, ein Magnetfeld (3) auf die Abscheidungsmatrix wirkend sowie Mittel zum Umwälzen der Schüttung gelöst.

Description

Vorrichtung zur Affinitatsseparation mittels magnetischer Partikel
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Affinitatsseparation mittels magnetischer Mikrosorbentien insbesondere in biologischen Suspensionen gemäß des ersten Patentanpruchs.
Derartige Vorrichtungen dienen der selektiven Separation von suspendierten oder gelosten Substanzen, z.B. Proteine aus einer Losung. Dabei werden in die Suspension zusatzlich magnetische Mikropartikel (Mikrosorbentien) eingemischt, die eine selektive Affinitat zu einer oder mehreren der vorgenannten Substanzen aufweisen und diese an sich binden. Nach der Anbindung werden die Mikrosorbentien mit den selektiv gebundenen Substanzen in einem Magnetfeld abgeschieden. Abschließend erfolgen Wasch- und Elutionsschritte, die die gebundene Substanz in gereinigter und oftmals aufkonzentrierter Form freisetzen.
Stand der Technik der Bioproduktaufarbeitung ist in der Regel eine Adsorptionschromatographie in einer Chromatogaphiesaule. Dies setzt jedoch eine vollständige Entfernung aller suspendierter Feststoffan- teile aus der Suspension voraus, so dass der Chromatographie FaI- lungs-, Zentrifugations- und oftmals auch Mikrofiltrationsstufen voraus gehen. Obwohl sich hierdurch in der Regel partikelfreie Losungen gewinnen lassen, fuhrt diese vielstufige Vorgehensweise zu langen Prozesszeiten sowie zu einer Reduzierung der Produktausbeute.
Eine Reduzierung der Anzahl der Aufarbeitungsschritte bietet nun das Potential den hohen Anteil der Aufarbeitungskosten an den Gesamtkosten eines Bioprozesses zu senken. Die Senkung des Anteils der Aufarbeitungskosten konnte dabei durch geringere Investitionskosten sowie durch eine Erhöhung der Produktausbeute bewirkt werden.
Eine Möglichkeit zur Reduzierung der Anzahl der Aufarbeitungsschritte bietet die direkte und selektive Abtrennung von Bioprodukten aus Zellsuspensionen, Zellkulturen und ZellaufSchlüssen, z.B. mit Hilfe spezieller Afflnitatsmatnces, immobilisierter Antikörper oder Rezeptoren. Die hierfür im Labor- bzw. industriellem Maßstab untersuchten Verfahren wie "Fluid-bed"-Adsorption, EBA (expanded bed adsorption) und "Aqueous Two Phase"-Extraktion konnten bisher keine breite Akzeptanz finden, so dass von Seiten der Bioindustrie ein starker Bedarf nach einem robusten Verfahren für eine direkte, primäre Bioproduktaufremigung besteht.
Ein interessanter Ansatz zur direkten, primären Bioproduktaufreinigung ist der Einsatz magnetischer Mikrosorbentien in Kombination mit geeigneter Magnettechnologie. Im Bereich der Bioanalytik und der medizinischen Diagnostik werden dabei magnetische Mikropartikeln (Mikrosorbentien, Magnetbeads) bereits seit längerem erfolgreich für die Isolierung von z.B. Nukleinsäuren bzw. Proteinen angewandt [1, 2, 3] . Dabei werden in einem ersten Schritt magnetische Partikel (Beads) in einen Behalter (z.B. Ruhrgefaß) mit der die Substanzen enthaltenden Suspension in Kontakt gebracht. Anschließend werden die beladenen magnetischen Partikel durch Anlegen eines Magnetfeldes an eine Wandungsflache im Behalter gezogen und festgehalten. In einem folgenden Schritt wird die Restsuspension bei anliegendem Magnetfeld, d.h. ohne die festgehaltenen Partikel aus dem Gefäß entfernt und durch eine Spulflussigkeit ersetzt. Nach Deaktivierung des Magnetfeldes erfolgt eine Suspendierung der Partikel in die Spullosung, das Ausschleusen der verbrauchten Spullosung sowie anschließend die Desorption bzw. Elution der Biosubstanz durch Resuspension der Partikel in einem EIu- tionspuffer. Abschließend wird der Elutionspuffer zusammen mit der Biosubstanz ausgeschleust, wahrend die Magnetbeads erneut bei eingelegtem Magnetfeld zurückgehalten werden.
Wahrend die spezifische Bindung gelöster Stoffe, insbesondere Biomo- lekule, an Magnetbeads sowie die Reagenzien für die anschließenden Spul- und Elutionsschritte grundsatzlich auf den technischen Maßstab übertragbar sind, lässt sich eine Abtrennung magnetischer Mikroparti- kel mit Durchmessern von ca. 1 μm im Pilot- oder technischen Maßstab sicherlich nicht über das einfache Anbringen eines Permanentmagnets an die Außenwand eines Ruhrgefaßes bewerkstelligen. Wahrend sich aufgrund der geringen Partikelgroße auch magnetische Trommelseparatoren für solche Abtrennungen nicht eignen, ist die Anwendbarkeit sogenann¬ ter Hochgradienten-Magnetseparatoren zur industriellen Abtrennung magnetischer Mikropartikel aus der Erzaufbereitung und der Umwelttechnologie bekannt [4, 5].
Die prinzipielle Eignung von Hochgradienten-Magnetseparatoren für die Abtrennung magnetischer Mikropartikel auch im Rahmen einer Bioproduktaufbereitung wurde bereits mehrfach demonstriert [3, 6]. Neben dem eigentlichen Hochgradienten-Magnetseparations-System (HGMS- System) fallt dabei insbesondere die Realisierung eines Kreislaufes mit Leitungen und Ventilen auf, in dem die Magnetbead-Suspension umgepumpt werden kann. Die notwendigen Spul- und Elutionsschritte können nämlich nur in einem suspendierten und nicht agglomerierten oder gebundenen Zustand der Partikel effizient ablaufen. Folglich müssen die Partikel im Rahmen des Gesamtverfahrens vielfach nach der Abtrennung im Magnetseparator aus diesem mittels einer Wasch- oder EIu- tionslösung wieder ausgespult und effektiv deagglomeriert werden. Anschließend wird die Suspension wieder durch den Magnetseparator gepumpt und hierdurch von den Partikeln befreit. Bei dem dargestellten Aufbau erfolgen die Wasch- und Elutionsschritte innerhalb eines Kreislaufs. Dabei zeigte sich aber, dass eine unzureichende Ruckspülung der Partikel aus dem Separator ein schwerwiegendes Problem des Verfahrens darstellt. Wahrend die Ruckspulung im Falle reiner Partikelmodelllosung noch mit Effizienzen von über 90 % möglich ist, fuhrt die Anwesenheit realer Biosuspensionen oftmals zu Ruckspüleffizienzen unterhalb ca. 70 %. Grund hierfür ist eine durch die biologischen Substanzen verstärkte Adhasionsneigung der Partikel an der Abscheidematrix sowie der Partikel untereinander (Agglomerate) . Als Abhilfe wurden verschiedene Möglichkeiten der Verbesserung wie z.B. Ultraschall oder mechanische Erschütterungen erprobt, die jedoch nur teilweise Abhilfe brachten. Zudem verbleibt auch nach der Ablösung der Partikel aus der Separatormatrix oftmals das Problem einer Agglomeration der μm-Partikel.
Als Abscheidematrix wird gewöhnlich ein Drahtnetzgewebe eingesetzt.
Ferner wird in [8] und [9] eine Abscheidematrix mit einer Kugelpackung aus sehr kleinen, beschichteten Kugeln zur Abtrennung magnetisch markierter Zellen bzw. Biomoleküle vorgeschlagen. -A-
Eine Maßnahme zur Verbesserung der Partikelruckspulung aus einer Ku- gelschuttung als Abscheidematrix wird in der [7] beschrieben. Es handelt sich um einen Karussell-Magnetseparator, dessen ringförmige Abscheidematrix durch eine Kugelschuttung gebildet wird. Zur Reinigung der Matrix wird kontinuierlich ein geringer Teil der Kugeln über eine Auslassoffnung abgezogen, extern gewaschen und über ein Forderband wieder zurück in das Matrixgehause gebracht.
Diese externe Waschung ist jedoch aufwendig und im Falle der Notwendigkeit einer raschen Ruckspulung der gesamten Matrix nicht praktikabel. Zudem gewahrleistet die beschriebene Kugelwanderung durch einen Siebboden keine effektive Deagglomerierung der abgespulten Partikel- agglomerate. Zweck der in [7] beschriebenen Vorrichtung ist allein die Reinigung der Kugeln und nicht die Deagglomeration von Partikelverbanden.
In den vorgenannten Abscheidematrices erfolgt das Ablosen der abgeschiedenen Partikel von den Abscheideelementen (Kugeln) mittels einer Durchstromung bzw. eines Abspruhens der Kugelpackung
Ausgehend davon liegt die Aufgabe der Erfindung darin, eine Vorrichtung vorzuschlagen, die die Handhabung magnetischer Mikrosorbentien für Trennungen im praperativen und technischen Maßstab einfacher und effizienter realisiert, und zwar im besonderen Maße auch speziell für eine Verwendung für Suspensionen mit biologischen Substanzen mit grundsatzlich verstärkter Adhasionsneigung.
Die Vorrichtung sollte dabei sowohl die Abtrennung als auch insbeson¬ dere die effektive Resuspendierung der magnetischen Mikropartikeln ermöglichen, und zwar ohne aufwendige Kreislauffuhrungen und Ventilschaltungen.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des ersten Patentanspruchs gelost. Die Unteranspruche geben vorteilhafte Ausfuh¬ rungsformen der Vorrichtung wieder. Die Vorrichtung umfasst einen unmagnetischen Separatorbehalter mit einem Separationsraum mit mindestens einen Fluideinlass und mindestens einen Fluidauslass, einer Abscheidungsmatrix für magnetisierbare Partikel im Separationsraum, umfassend einer Schuttung aus gleichartigen magnetisierbaren Formkorpern sowie ein auf die Abscheidungsmatrix wirkendes magnetisches Feld. Der Separationsraum ist vorzugsweise länglich geformt, weist zwei Enden auf, wobei er an seinem beiden Enden vorzugsweise jeweils durch eine unmagnetische fluid- durchlassige Wand als Fluideinlass bzw. Fluidauslass begrenzt ist. Das Magnetfeld ist durch geeignete Mittel wie z.B. eine Prozesssteuerung oder einen Schalter aktivier- und deaktivierbar, beispielsweise durch eine Entfernung von Dauermagneten oder durch Abschaltung von Elektromagneten .
In die durch den Separationsraum durchzuleitende und selektiv abzu- reinigende Suspension sind die vorgenannten magnetischen Partikel als Mikrosorbentien einsuspendiert. Vorzugsweise weisen diese Partikel eine für bestimmte herauszufilternde Substanzen hohe Affinitat auf, sodass sich diese bevorzugt, d.h. selektiv an den Partikel anheften oder anbinden. Dies kann beispielsweise auch durch eine bestimmte Konfektionierung der Mikrosorbentien erfolgen, wie z.B. über eine Funktionalisierung der Oberflache (z.B. Aktivierung).
Die fluiddurchlassigen Wände sind durchlassig für alle möglichen zu behandelnden Fluide, d.h. Flüssigkeiten, Suspensionen, Aerosole aber auch Partikelströme wie Staube ohne flussige Phasen, jedoch nicht durchlassig für die Formkorper, die als Schuttung die Abscheidungsmatrix bilden. Vorzugsweise weisen die Wände Durchbruche (Locher, Spalten etc.) auf, deren Querschnitte so bemessen sind, dass sie von den Formkorpern in jeder Projektionsrichtung nicht durchdringbar sind. Vorzugsweise weisen sie eine Weite auf, die den jeweils kleinsten Querschnittsabmessungen deutlich unterschreitet.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung umfasst Mittel zum Umwälzen der Schuttung im Separationsbehalter . Die Umwälzung bewirkt ein Aneinanderreihen der Formkorper untereinander und an der Separationsraumwandung und damit eine besonders effiziente Möglichkeit der Abtren- nung der magnetisierbaren Partikel von den Formkorperoberflachen sowie der Deagglomerierung der abgelösten Partikelverbande. Die Abtrennung ist dann besonders wirksam, wenn die Formkorper jeweils eine vollständig nach außen gerichtete Formkorperoberflache aufweisen, die für die jeweils anderen Formkorper bei einer Umwälzung als Reibeflachen zuganglich sind. Die Formkorper weisen daher bevorzugt auch keine Poren, Durchbruche, Locher, tiefere Mulden, Oberflachenrauhigkeiten oder sonstige Vertiefungen oder Hinterschnitte auf.
Vorzugsweise nimmt die Schuttung, umfassend die Formkorper und die Zwischenräume zwischen den Formkorpern, für eine bessere Um- walzbarkeit nicht das gesamte Separationsraumvolumen ein, sondern maximal 95 %, bevorzugt zwischen 20 und 70 %, weiter bevorzugt zwischen 25 und 50 %.
Die Vorrichtung eignet sich daher in besonderem Maße für eine Verwendung zur Affinitatsseparation von biologischen Substanzen mittels magnetischer Mikrosorbentien in realen Biosuspensionen. Allein durch die mechanische und damit besonders effiziente Abreinigung der aneinander reibenden Formkorper erhöht sich nämlich die Ruckspuleffizienzen von unterhalb ca. 70 % (vgl. Stand der Technik in Verbindung mit biologischen Substanzen) auf über 95 %, und zwar trotz der vorgenannten verstärkten Adhasionsneigung von Partikien in Anwesenheit von biologischen Substanzen.
Die Schuttung muss für ein Fluid (insbes. für die Suspension und die Spulflussigkeit) gut durchstrombar sein, d.h. die Formkorper dürfen nur einen bestimmten Volumenanteil in der Schuttung einnehmen. Vorzugweise sind die Formkorperflachen nicht eben, sondern weisen eine in Bezug auf den Formkorper nach außen gerichtete Wölbung auf.
Vorzugsweise sind die Formkörper insbesondere in Hinblick auf die vorgenannten Umwälzungen Kugeln aus einem magnetisierbaren Material, wobei die Formkorperoberflache vorzugsweise gehartet ist oder vor¬ zugsweise eine Verschleißschutzschicht und eine allgemein geringe Be¬ netzbarkeit und geringe Affinitat zu der hindurch zu leitenden Suspension, insbesondere der darin enthaltenden Substanzen aufweist. Die Verwendung von Kugeln als Formkörper für eine Schüttung, die als Abscheidematrix im Rahmen der Erfindung einsetzbar ist, ist aus den vorgenannten Gründen der Schüttungsdurchströmbarkeit und speziell der Abreinigbarkeit besonders vorteilhaft.
Die Vorrichtung weist einen Betriebszustand mit aktivierten Magnetfeld und einen Abreinigungszustand vorzugsweise, aber nicht absolut notwendig, mit deaktivierten Magnetfeld auf.
Im laufenden Betrieb (Betriebszustand) erfolgt eine Beaufschlagung der Formkörper durch das anliegende magnetische Feld, wobei der Separationsraum mit der Schüttung von dem abzureinigenden Fluid mit den magnetischen Partikeln durchströmt wird. In Folge dessen lagern sich die magnetischen Partikel mit den an diesen gebundenen Substanzen wie z.B. biologische Substanzen oder Moleküle an die Formkörperoberflächen.
Die Abreinigung der Formkörperoberflächen im Abreinigungszustand geschieht in der vorgeschlagenen Vorrichtung durch Ablösung der Partikel in einem Spülfluid innerhalb des geschlossenen Separationsbehälters, d.h. ohne Durchströmung allein aufgrund der Relativgeschwindigkeit zwischen den frei beweglichen Abscheideelementen (Formkörper) und der Lösung infolge einer Umlagerung der Schüttung. Die Formkörper verlassen dabei den Separationsraum nicht. Dabei wird ein Spülfuid in den Separationsraum eingefüllt, wobei gleichzeitig die ursprüngliche Biosuspension verdrängt wird und die Partikel durch das Magnetfeld an den Formkörper festgehalten werden. Anschließend erfolgen eine Schließung der Ventile (Fluideinlass und Fluidauslass) zum Separationsraum sowie eine Deaktivierung des Magnetfeldes. Durch die vorgenannten Mittel eine Umwälzung der Formkörper werden die an den Formkörpern anhaftenden magnetischen Partikel samt der gebundenen Substanzen von den Formkörperoberflächen abgeschert und von dem Spülfluid aufgenommen. Zusätzlich erfolgt das Aufbrechen abgelöster Partikelverbände aufgrund der zahllosen Kugelkollisionen während der Umwälzung, vergleichbar dem Prinzip einer Kugelmühle. Anschließend erfolgt eine Ableitung des Spülfluids, wobei das magnetische Feld im Bereich der Schuttung zuvor wieder zur Partikelruckhaltung aktiviert wurde .
Dieselbe Vorgehensweise wie für das Spulfluid wird mit einem Elutionsfluid wiederholt, um ein gewünschtes Protein (Zielprotein) von den Partikeln zu desorbieren und damit in geeigneter Form zu gewinnen.
Die Mittel zur Umwälzung der Schuttung umfassen Einrichtungen, die eine Relativbewegung der Formkorper zueinander und zu den Separati- onsrauminnenwandungen bewirken.
Die einfachste Variante für diese Mittel geht von einem Kipp- und/oder einer Drehvorrichtung für den gesamten Separationsraum aus, wobei optional an den Separationsrauminnenwandungen angebrachte Mischschaufeln eine Umwälzung beschleunigen. Die Umwälzung der Schuttung erfolgt zum maßgeblichen Teil allein durch eine veränderte Ausrichtung der Schuttung zur Richtung der Schwerkraft. Vorraussetzung für eine wirksame Umwälzung ist ein vergleichsweise geringer Volumenanteil der Schuttung im Separationsraumvolumen, vorzugsweise zwischen 10 und 60 %, bevorzugt zwischen 20 oder 25 und 50 %, wahrend der verbleibende leere Volumenanteil im Separationsvolumen als Ausweichraum für die Schuttung dient. Ist dieser zu klein, d.h. der Separationsraum zu über 70 % mit Formkorpern bzw. der Schuttung gefüllt und damit zu voll, behindern sich die Formkorper in ihren Einzelbewegungen zunehmend und damit auch die Umwalzungseffizienz . Ferner reduziert sich dabei auch die Gleitreibungsaktivitat der Formkorper gegeneinander und damit auch die Abreinigungseffizienz .
Alternativ umfassen die vorgenannten Mittel zur Umwälzung der Schuttung mindestens zwei Komponenten im Separationsraum, die eine Relativbewegung zueinander durchfuhren. Dabei kann mindestens eine dieser Komponenten durch die Separationsraumwandung gebildet werden. Durch diese Maßnahmen erfolgt die Umwälzung aktiv durch die vorgenannte Relativbewegung, wobei durch die Komponenten eine Verschiebung auf die Formkorper der Schuttung übertragen wird und der vorgenannte Einfluss der Schwerkraft allenfalls eine untergeordnete Rolle spielt. Die Be¬ deutung des vorgenannten schuttungsfreien Ausweichraum für die Form- korper im Separationsraum ist für eine hohe Umwalzungseffizienz nicht mehr so maßgeblich. Folglich kann auch der Volumenanteil der Schut- tung im Separationsvolumen zwischen 10 oder 20 % und vorzugsweise 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % eingestellt werden. Die Mittel umfassen bevorzugt ein drehbares Ruhrelement oder eine Forderschnecke im Separationsraum.
Die genannten Obergrenzen des Volumenanteils sind bevorzugt dann möglich, wenn die Formkorper Kugeln sind.
Die Erfindung wird anhand von Ausfuhrungsbeispielen und den folgenden Figuren naher erläutert. Es zeigen
Fig.l eine prinzipielle Seitenansicht einer manuell bedienbaren ersten Ausfuhrungsform z.B. mit Elektromagneten,
Fig.2 eine Aufsicht einer auf Permanentmagneten beruhenden Ausfuhrungsform mit einer schematischen Darstellung einer mechanischen Umwalzvorrichtung sowie
Fig.3 eine prinzipielle Perspektivansicht einer weiteren Ausfuhrungsform.
Fig.l zeigt eine Seitenansicht einer ersten Ausfuhrungsform der Vorrichtung zur Äffinitatsseparation. Der Separatorbehalter 1 besteht aus einem unmagnetischen Material, wie z.B. Kunststoff, und ist dadurch gekennzeichnet, dass der längliche Separationsraum 9 mit einer Schuttung 2 an beiden Enden durch jeweils einen Deckel 4 hinsichtlich Flussigkeitsaustritt abgedichtet werden kann. Der Separationsraum 9 ist an seinem oberen und unteren Ende jeweils durch ein unmagnetisches Lochblech 5 (fluiddurchlassige Wand) begrenzt, indem dieses z.B. zwischen dem Deckel 4 und dem Separatorbehalter 1 eingespannt wird. Das Lochblech ist dadurch gekennzeichnet, dass die Abmaße der Locher so gewählt werden, dass der Ruckhalt von Formkorpern der Schuttung 2 (Abscheidungsmatrix) gewahrleistet ist, jedoch Flussig- keitsdurchtritt stattfinden kann. Die Schuttung 2 selbst besteht aus einer Vielzahl gleichartiger weichmagnetischen Formkorper, z.B. Kugeln mit einem Durchmesser von 1 - 5 mm, wobei diese im Ausfuhrungsbeispiel den Separationsraum 9 zu 10 - 50 % füllen.
Die Deckel 4 sind mit mindestens je einer Bohrung für den Fluid- einlass und Fluidauslass (Zulauf bzw. Ablauf für den Separationsraum) versehen. Konstruktiv sind diese als Anschlussstutzen 6, 7 mit Ventilen 14, 15 auf den Deckeln aufgesetzt, sodass Fluide wie Flüssigkeiten oder Suspensionen in den Separatorbehalter ein- und ausgeschleust werden können. Zusatzlich enthalt der obere Deckel mindestens eine zweite Bohrung mit Auslassstutzen 8, der als Luftauslass zum Druckausgleich im Separator dient und ebenfalls über ein Ventil schließbar ist.
Der Separatorbehalter 1 befindet sich wahrend des Betriebszustands in aufrechter Position mit dem mit der Schuttung 2 gefüllten Behalterabschnitt im Bereich eines Magnetfelds 3, z.B. innerhalb einer Spule eines Elektromagneten, eines supraleitenden Magneten oder zwischen den Polen eines Permanentmagnetens .
Zum Betrieb (Betriebszustand) wird zunächst ein Equilibirierungs- puffer, z.B. ein Proteinbindepuffer in den Separationsraum 9 eingefüllt. Ist dieser vollständig gefüllt, wird das Luftventil am Auslassstutzen 8 geschlossen, und dem Separator die Biorohsuspension mit den magnetischen Partikeln, die mit dem Zielprodukt über Affinitats- liganden beladen sind, zugeführt, wahrend über das untere Ventil der Equilibirierungspuffer über eine Pumpe ausgeschleust wird. Hierbei ist das Magnetfeld eingeschaltet, sodass die magnetischen Partikel innerhalb der Schuttung zurückgehalten werden. Nachdem die ursprunglich im Separationsraum 9 vorliegende Flüssigkeit durch (z.B. Bioroh- ) Suspension verdrangt ist, kann solange noch weitere Biorohsuspension mit magnetischen Partikeln zugeführt werden bis die Partikel- aufnahmekapazitat der Schuttung nahezu erschöpft ist. Zu diesem Zeitpunkt wird der Separationsprozess gestoppt und anschließend die noch innerhalb des Separationsraums befindliche Biorohsuspension aus dem unteren Ventil 15 ausgeschleust, wahrend über das obere Ventil 14 gleichzeitig Waschpuffer (Spulflussigkeit) eingeschleust wird.
Danach werden der Fluidein- und -auslass über die Ventile 14 und 15 geschlossen und der Separator bei ausgeschaltetem Magnetfeld manuell oder durch eine Vorrichtung aus der Spule oder den Polschuhen 16 (vgl. Fig. 2) genommen.
Durch die Mittel 11 zum Umwälzen der Schuttung, wie z.B. durch die Rotation einer gelagerten Welle 10, die über eine unmagnetische Manschette 13 angeflanscht ist (vgl. Fig. 2), oder manuell.wird die Schuttung umgelagert, indem der Separator mehrfach um 180° um seine Mittelachse durch Drehung 12 in der Vertikalen bewegt wird. Hierbei kommt es zu einer Verlagerung der die Schuttung bildenden Formkorper aufgrund der Schwerkraft und dadurch zu ihrer intensiven Durchmischung. Der gegenseitige Kontakt der Formkorper untereinander sowie mit dem Waschpuffer fuhrt dabei zu einer effektiven Ablösung der abgeschiedenen magnetischen Partikel. Zu dem brechen die Abscheidekor- per hierbei eventuelle Mikrosorbentien-Agglomerate auf und dienen gleichzeitig als Ruhrwerkzeuge um eine vollständige Resuspendierung der Partikel zu gewahrleisten. Nach dieser Waschung wird der Separator erneut in die Spule oder zwischen die Polschuhe 16 gebracht und das Magnetfeld zur Ruckhaltung der Magnetpartikel eingeschaltet. Durch Ersetzen der verbrauchten Spulflussigkeit mit frischer Spulflussigkeit bei gleichzeitigem Ausschleusen der verbrauchten Spulflussigkeit wird der erste Waschschritt abgeschlossen.
Die vorgenannte Spulprozedur wird im Rahmen eines Aufreinigungs- vorgangs vorzugsweise 1-2 mal wiederholt. Nach den 2-3 Waschungen (Spulvorgangen) wird die im Behalter verbliebene Spulflussigkeit durch einen Elutionspuffer ersetzt, der das biologische Zielprodukt von den Magnetpartikeln lost. Weitere Elutionsschritte sind optional Durch die abschließende Ausschleusung des Elutionspuffer liegt das Produkt in aufgereinigt und in praktisch feststofffreier Losung vor. Eine alternative Ausführungsform der Vorrichtung, dargestellt in
Fig.3, sieht eine motorisch angetriebene unmagnetische Förderschnecke
17 im Separatorraum vor. Die gegen den Separator abgedichtete Welle
18 der Förderschnecke 17 wird aus einem der Deckel (nicht explizit dargestellt, vgl. aber Fig.l) herausgeführt. Für eine Partikel- umlagerung sorgt in diesem Fall die axial orientierte Förderwirkung der Schnecke, so dass der Separator nicht mehr aus dem Magnetfeld herausgehoben werden muss. Zusätzlich sind eventuelle sehr feste Mikro- sorbentien-Agglomerate unter Umständen einfacher aufzubrechen als durch eine bloße Positionsänderung/Drehung des Separators.
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[8] US 5.711.871
[9] US 6.417.011
Bezugszeichenliste
1 Separatorbehälter
2 Schüttung
3 Magnetfeld
4 Deckel
5 Lochblech
6 oberer Anschlussstutzen
7 unterer Anschlussstutzen
8 Auslassstutzen
9 Separationsraum
10 Manipulator
11 Mittel
12 Drehung
13 Manschette
14 obere Ventil
15 untere Ventil
16 Polschuh
17 Förderschnecke
18 Welle

Claims

Patentansprüche :
1. Vorrichtung zur Affinitätsseparation mittels magnetischer Partikel, umfassend a) einen unmagnetischen Separatorbehälter (1) mit einem Separationsraum (9) mit mindestens einen Fluideinlass und mindestens einen Fluidauslass, b) einer Abscheidungsmatrix für magnetisierbare Partikel im Separationsraum, umfassend einer Schüttung (2) aus gleichartigen magnetisierbaren Formkörpern, c) ein Magnetfeld (3) auf die Abscheidungsmatrix wirkend sowie d) Mittel (11) zum Umwälzen der Schüttung.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Formkörper Kugeln sind.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Formkörper aus einem weichmagnetischen Eisenwerkstoff gefertigt sind.
4. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Formkörper auf ihrer Formkörperoberfläche und/oder die Innenwandung des Separationsraums (9) gehärtet sind oder eine Verschleiß mindernde Beschichtung aufweisen.
5. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die Partikel eine funktionelle Beschichtung zur Affinitätsseparation aufweisen.
6. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Separationsraum länglich ist und zwei Enden aufweist, wobei der Separationsraum (9) an seinem beiden Enden jeweils durch eine unmagnetische fluiddurchlässige, aber für die Formkörper undurchlässige Wand (5) begrenzt ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Wände durch Lochbleche mit Durchbrüchen gebildet sind, wobei die Durchbrüche in ihren Abmessungen kleiner als die Formkörper sind.
Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die Mittel eine Kipp- und/oder Schwenkvorrichtung für den Separations- raum umfassen.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Schüttung im Separationsraum ein Volumenanteil zwischen 10 und 60 % einnimmt.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Mittel mindestens zwei relativ zueinander bewegbare Komponenten im Separationsraum aufweisen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei mindestens eine Komponente durch die Separationsraumwandung gebildet wird.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, wobei mindestens eine Komponente durch ein drehbares Rührelement oder eine Förderschnecke im Separationsraum gebildet wird.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Schüt¬ tung im Separationsraum ein Volumenanteil zwischen 10 und 95 % einnimmt .
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