WO2007007921A1 - 分節ゲノム型組換えモノネガウイルスベクター - Google Patents

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WO2007007921A1
WO2007007921A1 PCT/JP2006/314333 JP2006314333W WO2007007921A1 WO 2007007921 A1 WO2007007921 A1 WO 2007007921A1 JP 2006314333 W JP2006314333 W JP 2006314333W WO 2007007921 A1 WO2007007921 A1 WO 2007007921A1
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virus
vector
protein
dna
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PCT/JP2006/314333
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English (en)
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Makoto Takeda
Yusuke Yanagi
Jun You
Makoto Inoue
Mamoru Hasegawa
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Kyushu University, National University Corporation
Dnavec Corporation
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant mononegative virus vector. Specifically, the present invention relates to a segmented genome type recombinant mononegative virus vector.
  • Background Art-Viruses classified as Mononegaviruses are all RNA viruses with a non-segmented (single-stranded) RNA genome. This virus has a common gene arrangement and function, and has a similar gene expression mechanism (see Fig. 1).
  • Fig. 1 In 1994, for the first time using the rabies virus, the path for genetic manipulation of the same virus was opened. Since then, genetic manipulation systems have been developed for all of the typical virus of mononegative virus using the same method (see Fig. 2).
  • CHO cells CHO / hSLAM cells
  • measles virus receptor SLAM signal lymphocyte activation molecule
  • vaccinia viruses expressing T7 RNA polymerase
  • Monone and Gavirus polymerase is an RNA-dependent RNA polymerase that initiates transcription only from a single promoter located at the 3rd and 3rd ends of the genome, recognizing transcription termination sequences and initiation sequences between genes. 'Perform transcription while decreasing the transcription amount of each gene toward the end. Therefore, the mononegavirus genome has the characteristic that the gene upstream is higher in expression efficiency. Therefore, when a foreign gene is inserted into the viral genome for use as a viral vector, the expression efficiency can be increased as the gene is inserted upstream of the genome (see Fig. 3). However, if a foreign gene is inserted upstream of the genome, It is known that the negative effect on gene expression, that is, the decrease in expression efficiency tends to appear more strongly, leading to a decrease in the replication ability of the virus itself.
  • the virus replication ability may be strongly suppressed depending on the type of foreign gene.
  • wild-type (wt) virus virus inserted with EGFP gene
  • virus inserted with DsRed gene virus inserted with LacZ gene.
  • the replication ability of a virus that has introduced the LacZ gene is markedly reduced (see Fig. 6; Sakai Y. et. Al., Accommodation oi foreign genes into the Sendai virus' genome: sizes oi inserted genes and viral replication., FEBS Lett., 1999 Aug 6; 456 (2): 221-6 .; Takeda M, et. al., Generation of measles virus with a segmented "RNA genome., J. Virol ., 2006 May; 80 (9): 4242-8.) Disclosure of the Invention
  • the problem to be solved by the present invention is that a foreign gene can be expressed at a high level while maintaining the original growth ability of the mononegavirus, and the length and type of the foreign gene adversely affect the expression efficiency. It is an object of the present invention to provide a recombinant mononegavirus vector that is small in size and into which a plurality of foreign genes can be inserted. Another object of the present invention is to provide a method for producing such a recombinant mononegative virus vector. The present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • the present invention is as follows.
  • a recombinant mononegavirus vector characterized in that it contains a plurality of segmented genomes, and at least one segmented genome contains an exogenous gene that can be expressed in the host.
  • a foreign gene can be inserted upstream of the functional protein gene constituting the mononegative virus.
  • at least two segmental genomes can contain a foreign gene.
  • the vector of the present invention can contain a plurality of foreign genes, for example, in at least one of the segmented genomes containing the foreign genes.
  • a segmented genome is maintained, one segmental genome includes H gene and L gene, and the other segmental genome includes N gene, P gene, M gene and F gene.
  • a segmented genome a segmented genome
  • the first segment genome contains H and L genes
  • the second segment genome contains M and F genes
  • the third segment genome Examples include those containing N and P genes.
  • the vector of the present invention is, for example, a measles virus or Sendai virus recombinant virus vector.
  • a DNA comprising a truncated cDNA capable of transcribing the RNA according to (2) or a cRNA thereof.
  • the DNA of the present invention is, for example, plasmid DNA.
  • a host is infected with a recombinant vaccinia virus that expresses a predetermined RNA polymerase, or a predetermined RNA is introduced as a transcription unit.
  • DNA containing the polymerase gene can be introduced into the host or integrated into the host genome.
  • the RNA polymerase is, for example, T7 RNA polymerase
  • the recombinant vaccinia virus is obtained, for example, using the Lister strain as a parent strain.
  • CHO cells can be used as the host.
  • CHO cells can be used as the host.
  • a kit for producing a recombinant mononegative virus vector comprising the DNA according to (3) above and a transcription unit of the DNA.
  • the kit of the present invention may further comprise, for example, DNA containing the N gene of Mononegavirus, DNA containing the P gene, and DNA containing the L gene.
  • the transcription unit is, for example, a predetermined: recombinant vaccinia virus that expresses RNA polymerase, or DNA containing a predetermined RNA polymerase gene.
  • the RNA polymerase is, for example, T7 RNA polymerase
  • the recombinant vaccinia virus is obtained, for example, using the Lister strain as a parent strain.
  • a kit for producing a recombinant mononegative virus vector comprising the RNA according to (2) or a cRNA thereof.
  • the kit of the present invention can further include, for example, a host that expresses the N protein, P protein and L protein of the mononegative virus.
  • the host is, for example, a CHO cell.
  • a foreign protein is expressed in a host infected with the vector described in (1) above, A method for producing a foreign protein, comprising recovering the expressed foreign protein.
  • tissue, cell or body fluid of the present invention can contain, for example, an exogenous protein.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the mononegavirus particle and its genomic structure.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of the reconstitution system of the mononegative virus particle.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the effect on the expression efficiency by the position of insertion of a foreign gene into the Mononega virus genome.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the effect on the expression efficiency of the number of foreign genes inserted into the mononegavirus genome.
  • Figure 5 shows the wild type (wt) mononegative virus (IC323), the mononegative virus (IC323-EGFP) inserted with the EGFP gene, and the mononegative virus inserted with the DsRed gene • (IC323-DsRed), It is the schematic which shows the genome structure of the mononegative virus (IC323_lacZ) which inserted LacZ gene.
  • FIG. 6 is a graph showing the replication ability of each of the four types of mononegative viruses shown in FIG.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a method for producing a segmented genomic mononegavirus vector. , ⁇
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the genomic structure of a bi-segment genomic mononegavirus vector (2 seg-MeV).
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the genomic structure of a three-segment genomic mononegavirus vector (3 seg-MeV).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the genomic structure of IC323-lacZ ⁇ IC323-DsRed, IC323-EGFP, 2 seg-MeV, and 3 seg-MeV.
  • Figure 1 1 shows a foreign gene (EGFP (green) in 2 seg-MeV-infected B95a cells; It is a photograph showing the expression of DsRed (red).
  • Fig. 12 is a photograph showing the expression of a foreign gene (EGFP (green); DsRed (red)) in 3 seg-MeV-infected B95a cells.
  • Fig. 13 is a photograph showing the expression of a foreign gene (galactosidase gene) in 3 seg-MeV-infected B95a cells.
  • FIG. 14 is a graph showing the virus replication ability (proliferation ability) of IC323, IC323-lacZ, IC323.DsRed, IC323-EGFP, 2 seg-MeV, and 3 seg-MeV.
  • FIG. 15 is a photograph showing the presence or absence of plaque formation in each of IC323, IC323-lacZ, IC323_DsRed, IC323-EGFP, 2 seg-MeV, and 3 seg-MeV.
  • FIG. 16 is a photograph showing the presence or absence of galactosidase expression in the plaques of IC323, 2 seg-MeV and 3 seg-MeV.
  • FIG. 17 is a photograph showing fluorescence in 2 seg-MeV and 3 seg-MeV plaques and the presence or absence of ⁇ -galactosidase expression.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing the genome structure of 2 seg-MeV and the like, and a schematic diagram showing the presence or absence of virus particle replication and the expression of foreign genes in infected cells such as 2 seg-MeV.
  • FIG. 19 is a schematic diagram of the genome structure of 3 seg-MeV, etc., and is a schematic diagram showing the presence or absence of viral particle replication and the expression of foreign genes in infected cells such as 3 seg-MeV. '
  • FIG. 2 is an electrophoretogram showing the results of analysis using an immunoprecipitation method.
  • Figure 21 shows the expression level of foreign protein ( ⁇ -galactosidase) in infected cells of IC323, IC323-lacZ, IC323_DsRed, IC323-EGFP, 2 seg-MeV, and 3 seg-MeV. It is a graph which shows the result analyzed using.
  • foreign protein ⁇ -galactosidase
  • Figure 22 shows RT-quantitative PCR for the ratio of gene expression (mRNA) in 3 seg-MeV-infected cells to gene expression (mRNA) in IC323-EGFP-infected cells. It is a graph which shows the result analyzed using the method.
  • Fig. 23 is a photograph showing the presence or absence of GFP dependent on the T7 promoter depending on the vaccinia virus strain used.
  • Figure 24 is a graph showing a comparison of luciferase expression levels (fluorescence levels after addition of luciferin) in a minigenome virus transcription / replication experiment system depending on the vaccinia virus strain used (A) and the vaccinia virus strain used.
  • a graph (B) showing a comparison of the number of cells successfully initiating the synthesis of measles virus particles due to the difference of Figure 25 shows a photograph (A) showing the effect of addition of a caspase inhibitor on the apoptosis of vaccinia virus-infected cells (A) and electrophoresis showing the effect of addition of a caspase inhibitor on the chromosomal DNA fragmentation of vaccinia virus-infected cells. Photo (B).
  • Figure 26 shows a comparison of the amount of luciferase expressed (fluorescence after addition of luciferin) in a minigenome virus transcription / replication experiment system with or without the addition of a caspase inhibitor to vaccinia virus-infected cells (A), And (B) shows a comparison of the number of cells successfully initiating synthesis of measles virus particles depending on the amount of caspase inhibitor added to vaccinia virus-infected cells.
  • Fig. 27 is a schematic diagram showing the genome structure of the F-segment deficient Sendai virus (SeV) vector, etc., in the 2-segment and 3-segment genome types.
  • SeV Sendai virus
  • FIG. 28 shows the construction scheme of pMiniSeV / LacZ-NP-P-M.
  • FIG. 29 is a diagram showing a construction scheme for construction of pMiniSeV / GFP-HN-L.
  • FIG. 30 is a diagram showing a construction scheme of pMiniSeV / Luci-NP-P.
  • Fig. 31 shows the construction scheme of pMiniSeV / LacZ-M.
  • Figure 3 2 is a GFP fluorescence photograph showing the reconstitution and amplification of a two-segment genomic SeV vector (MiniSeV / GFP-HN-L and niSeV / Lac Z-NP-P-M).
  • Figure 33 shows a GFP fluorescence photo that shows the reconstruction and amplification of a three-segment genomic SeV vector (MiniSeV / GFP-HN-L, MniSeV / Lac Z-M and MniSeV / Luci-NP-P).
  • Figure 34 shows the results of in vitro expression by bisegment genomic SeV vectors (MiniSeV / GFP-HN-L and MniSeV / Lac Z-NP-PM) (LLC-MK2, Day 2).
  • Figure 35 shows the results of ia ra'iro expression by a three-segment genomic SeV vector (MiniSeV / GFP-HN-L, MiniSeV / Lac ZM and MiniSeV / Luci-NP-P) (LLC). -MK2, Day 3).
  • FIG. 36 is a diagram showing a construction scheme of p (+) MV-DsRed-NPMF.
  • FIG. 37 shows the construction scheme of p (+) MV-EGFP-HL.
  • FIG. 38 shows a construction scheme of p (+) MV-LacZ-NP.
  • FIG. 39 is a diagram showing a construction scheme of p (+) MV-DsRed-MF.
  • FIG. 40 is a diagram showing a construction scheme of p (+) MV-DsRed-CAT-MF.
  • FIG. 41 shows a construction scheme of p (+) MV-DsRed-CAT-MF-SEAP.
  • Fig. 4 2 shows the expression of foreign genes ((A) EGFP (green); (B) DsRed (red)) in Vero / hSLAM cells infected with the three-segment genomic mononegavirus vector (3 seg-MeV-CAT). And a photograph (D) showing the CAT activity of the infected cells.
  • FIG. 43 shows a photograph (A) showing the CAT activity of a Vero / hSLAM cell infected with a three-segment genome-type mononegavirus vector (3 seg-MeV-CAT-SEAP) and a graph (B) showing the SEAP activity.
  • CHO / hSLAM cells (CHO cells that have been gene-transfected to constitutively express the measles virus receptor SLAM) BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the recombinant mononegavirus vector of the present invention is characterized in that it retains a plurality of segmented genomes, and at least one segmented genome contains a foreign gene that can be expressed in a host.
  • “Segment” means that the base chain is composed of a plurality of base chains so that it functions as one virus genome by a group of base chains composed of a plurality of base chains. “Segmented genome” usually means individual base chains constituting a set of base chains, but may also mean a set of base chains themselves.
  • the genome of Mononegavirus (single-stranded RNA virus)) has a leader sequence (3'-Le) and a trailer sequence (Tr-5 ') involved in virus replication at both ends.
  • N protein is Genes (hereinafter referred to as “N genes”, and genes encoding other functional proteins are also indicated accordingly), P genes, M genes, F genes, H genes, and L genes Can be mentioned.
  • the N. protein (nucleocapsid) expressed from the N gene binds to and wraps around the viral RNA in order from the 5 'end.
  • the P gene expresses three types of proteins: P protein, V protein, and C protein.
  • the P protein functions as a small subunit of RNA-dependent RNA polymerase and is involved in transcriptional replication of the viral genome.
  • the L protein expressed from the L gene functions as a large subunit of RNA-dependent RNA polymerase and is involved in transcriptional replication of the viral genome together with the P protein.
  • the M protein expressed from the M gene has the function of supporting the virus particle structure from the inside. Both the F protein expressed from the F gene and the H protein expressed from the H gene are involved in the entry of the virus into the host cell.
  • the segmental genome retained by the viral vector of the present invention has a leader sequence and a trailer sequence at both ends, as in the case of the mononegative virus genome, and any of the genes encoding the functional proteins described above between these sequences. Have Then, when all the segmented genomes are combined, all N genes, P genes, M genes, F genes, H genes, and L genes necessary for virus particle replication and the like are obtained. These gene groups may be inserted into the segmental genome regardless of the arrangement (arrangement order) in the original mononegavirus genome. In addition, even if these gene groups are not completely identical to the base sequence of each gene contained in the mononegative virus genome, the mutation is introduced if the activity in transcription and replication is equal to or higher than that of the natural type. May have been used, or may have been substituted with a corresponding gene from another virus. In the present invention, the number of segments of the genome is not limited, but is preferably 6 at the maximum, particularly preferably 2 or 3.
  • a preferred form when the viral vector of the present invention holds two segmental genomes is, for example, that the first segmental genome includes H gene and L gene, the second segmental genome is N gene, P Examples include genes, M genes and F genes.
  • the first segment genome includes H gene and L gene, and the second segment genome is M gene.
  • F gene and the third segmented genome contains N gene and P gene.
  • the segmental genome of the viral vector of the present invention includes a foreign gene that can be expressed in the host.
  • the foreign gene is not limited and may be appropriately selected according to the use of the virus vector of the present invention. For example, genes encoding various proteins that cause pathogenicity such as viruses, bacteria, and parasites. And genes encoding various cytokines and genes encoding various peptide hormones.
  • the segment genome containing the foreign gene may be one of a plurality of segment genomes of the viral vector, or may be two or more, and is not limited. When inserting multiple foreign genes into the genome, all of the foreign genes may be inserted into one of the segmented genomes, or two or more segments. In each genome, multiple foreign genes can be inserted as a whole by inserting one or more foreign genes. When a plurality of foreign genes are inserted into one segmented genome, the number is not limited as long as the expression efficiency of the virus constituent protein gene is not significantly reduced.
  • the position of the foreign gene inserted into the segmental genome is not limited, but is preferably upstream of the functional protein gene constituting the mononegavirus. This allows higher expression of the foreign gene in the host. Using this knowledge, the expression level of a foreign gene can be regulated by the position of gene insertion or the RNA base sequence before and after the gene.
  • upstream side means that it is the leader sequence (3′-Le) side present at the 3 ′ end of the genome (the same applies hereinafter).
  • the segmented genome of the viral vector of the present invention is usually sufficient if it is constructed from (single-stranded RNA) as in the genome originally possessed by the mononegative virus, but if necessary, constructed from (+)-stranded RNA. It may be what was done.
  • reconstitution of virus particles reverse genetics
  • viral genetic manipulation ie genome segmentation and insertion of foreign genes
  • reconstruction of viral particles means that a nucleic acid of a viral genome is artificially produced, and the original virus or It means making a recombinant virus.
  • the mononegavirus used as the construction material of the virus vector of the present invention is not limited, and examples thereof include the following viruses.
  • Paramyxoviridae (CPara / nj3 ⁇ 4Ow: r fl3 ⁇ 4e), Measles virus, Sendai virus, New force, Nevcastle disease virus, Mumps virus, Mumps virus, Type 1 .
  • Reinfluenza virus (i3 ⁇ 4raioi? "En virus ⁇ ), type 2 parainfluenza virus (Parainfluenza virus 2), type 3 parainfluenza virus, parainfluenza virus, type 5 virus RS virus fe3 ⁇ 4wi3 ⁇ 4 syncytial virus), rinderpest virus (indeip 'est And Distemper virus 0
  • Rhabdoviridae (Vesicular stamatitis virus), rabies virus Cffafo'as virus), and wild boar fever virus (Bovine ephemeral fever virus) 0
  • mononegative viruses measles virus, Sendai virus and Newcastle disease virus are preferable.
  • Synthetic oligonucleotides and incomplete viruses such as DI particles (J. Virol., 68, 8413-8417 (1994)) can also be used as building materials as needed.
  • the mononegavirus derived from the above listed viruses may be used.
  • the recombinant mononegative virus may be, for example, an inactivated gene that is related to immunogenicity, or a modified version of some genes to increase RNA transcription efficiency or replication efficiency. Good.
  • the viral vector of the present invention usually has a cell infectivity and a transmission power.
  • Cell infectivity means the ability to introduce a nucleic acid or the like inside a virus into a cell by retaining the ability to adhere to a host cell and membrane fusion ability.
  • Transmission power refers to the infectious particle (or its equivalent) that replicates the nucleic acid introduced into the cell. The ability to form a complex) and to transmit the nucleic acid to another cell.
  • propagating power is the formation of virus particles that can be released outside the cell and move freely (can infect other cells) based on the nucleic acid information introduced into the cell. I can also say. , '
  • the virus vector of the present invention is excellent in stability as a vector. That is, the viral vector of the present invention can be stably passaged and can retain stable expression of an exogenous gene. Specifically, when a viral vector is infected to a suitable cultured cell at a low MOI (eg, 0.05 to 0.01 (number of viruses, number of Z cells)), then the cytopathic effect (CPE) due to virus infection becomes significant. Recover the culture supernatant and again infect another cultured cell with the same MOI. 8 ⁇ : If good expression of the foreign gene is observed even after repeated 10 times, the viral vector is stable. It can be said that it is excellent. In this case, the passage number is more preferably 10 to 20 times, and further preferably 20 times.
  • CPE cytopathic effect
  • the present invention also includes segmented genomic RNA or cRNA (complementary RNA) contained in the above-described viral vector of the present invention. Furthermore, the present invention also includes DNA (preferably plasmid DNA) containing a truncated cDNA capable of transcribing the RNA or cRNA.
  • the RNA of the present invention or cRNA thereof can be obtained by, for example, modifying the cDNA of the mononegavirus or its recombinant virus listed above by a known gene recombination technique (segmentation, insertion of a foreign gene, etc.) It can be obtained by transcription as cDNA in a test tube or cell.
  • the vertical cDNA is inserted downstream of the desired promoter, and depending on the direction of insertion, either Rl ⁇ A of the present invention or its cRNA, ie, (one) -stranded RNA and (+)-stranded RNA. Either one is obtained.
  • the RNA of the present invention or its cRNA is artificially inserted into a cDNA having a double-end structure of a viral genome (for example, a DI molecule), such as a viral component protein gene or a foreign gene, and the inserted DNA is tested. It can also be obtained by transcription in a tube or cell.
  • the viral vector of the present invention having a segmented RNA genome can be obtained by reconstructing virus particles using cDNA corresponding to each segmented genome or using RNA corresponding to each segmented genome. Can be produced. In either method, usually, genomic RNA is first isolated from the desired mononegative virus, and cDNA of this RNA is prepared by reverse transcription reaction or the like. Next, operations such as segmentation of the cDNA and insertion of foreign genes are carried out by known gene recombination techniques and nucleic acid amplification methods.
  • “segmentation” means that the original cDNA is fragmented into multiple cDNAs.
  • the fragmentation method is not particularly limited as long as a plurality of cDNA fragments are prepared as a result based on the base sequence information of the original cDNA.
  • As a preparation method based on the base sequence information of the original cDNA for example, multiple desired regions in the original cDNA can be set, and each region can be used as a saddle to perform amplification etc. to obtain amplified fragments. are preferred.
  • the desired region can be set as appropriate in consideration of the structure of the segmented genome to be expressed in the reconstruction, and is not limited.
  • each gene fragment encoding a functional protein of the virus can be amplified individually.
  • a plurality of cDNA fragments can be prepared by linking the obtained amplified fragments of each gene in the desired type, number and arrangement order (position).
  • the “foreign gene insertion” is not particularly limited, and a DNA fragment containing a separately prepared foreign gene may be inserted into the segmented cDNA using a known gene recombination technique.
  • each segmented cDNA preferably plasmid DNA
  • each segmented cDNA is transcribed into RNA in advance with ⁇ ' ⁇ , and these are transferred to the viral particle. Used for reconstruction. Even if introduced into a host cell, it does not form a UNA-dependent UNA polymerase trapezoid.
  • N protein, P protein and L protein exist in the initial stage of RNA synthesis reaction by the RNA polymerase, and it is necessary to form a complex (RNP complex) of these proteins and genomic RNA. And are known. Therefore, when reconstituting the viral vector of the present invention, it is desirable to use a force capable of expressing these N protein, P protein and L protein together, or a host capable of expression.
  • specific examples of the method for producing the virus vector of the present invention include the following methods (i) to (iii).
  • a method comprising introducing the DNA of the following (b) and a transcription unit of the DNA into a host expressing the N protein, P protein and L protein of the mononegative virus.
  • RNA of the following (a) or a cRNA thereof into a host expressing the N protein, P protein and L protein of a mononegative virus.
  • RNA of the following (a) or a cRNA thereof into a host expressing the N protein, P protein and L protein of a mononegative virus.
  • the DNAs of (c) to (e) used in the production method of (i) above may be those constructed so as to be able to express a predetermined protein using a known gene recombination technique. It is preferably a plasmid DNA.
  • each protein gene contained in the DNAs of (c) to (e) does not have to be completely identical to the base sequence of each protein gene contained in the Mononega virus genome. If it is equal to or more than each natural protein, one or several amino acids are deleted (eg, 1 to 15, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 5), It may be a base sequence encoding a protein consisting of a substituted or added amino acid (mutant protein), or may be substituted with a corresponding gene derived from another virus.
  • the homology of the amino acid sequence between the mutant protein and the natural protein is preferably 90 to 100%, for example, but if the activity in transcription and replication is maintained, amino acid homology
  • the sex may be, for example, 40-90%.
  • the nucleotide sequence encoding the mutant protein (DNA) [Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Haroor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 : 1997), etc. It can be prepared according to the site-specific displacement induction method described in 1.
  • mutation introduction kits that use site-directed mutagenesis, such as the Kunkel method or Gapped duplex method, such as the QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) GeneTaHor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaEa Site-Directed Mutagenesis System (utan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • Kunkel method such as the QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) GeneTaHor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaEa Site-Directed Mutagenesis System (utan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • the N protein, P protein and L protein of the mononegavirus are completely the same as long as they are equal to or higher than the activity of these natural proteins.
  • one or several (for example, 1 to 15, preferably 1 to 8, more preferably 1 to 5) amino acids have been deleted, substituted, or attached. It may be a protein (mutant protein) or a completely different protein derived from another virus or having a greatly different amino acid sequence.
  • the homology of the amino acid sequence between the mutant protein and the natural protein is preferably 90 to 100%, for example. However, if the activity in transcription and replication is maintained, the amino acid sequence The homology of, for example, 40-90. /. It may be.
  • the host (including transformants) used in the production methods of G) to (iii) is not particularly limited as long as it can express various viral RNAs.
  • cultured mammals or birds Cell and chicken egg.
  • Specific examples of cultured cells include CHO, 293 cells, B95a, monkey cells COS'7, Vero, mouse L cells, and rat cells.
  • BHK and two-fowl embryo fibroblasts can be used.
  • Insect cells such as Sf9 cells and Sf21 cells can also be used.
  • the host used in the above processes (ii) and (iii) is a predetermined transformant, that is, a host genome in which N gene, P gene and L gene are inserted, or these genes are host genome. Is introduced as independent DNA (plasmid DNA, etc.). These transformants can be obtained by, for example, electroporation, lipofection, heat shock, PEG, calcium phosphate, DEAE dextran, and methods of infecting various viruses such as DNA virus and RNA virus. Obtainable.
  • each protein encoded by the N gene, P gene and L gene is preferably expressed by the transcription / translation system of the host itself.
  • the transcription unit is preferably, for example, a recombinant vaccinia virus that expresses a predetermined DNA-dependent RNA polymerase, or DNA containing a predetermined DNA-dependent RNA polymerase gene.
  • a recombinant vaccinia virus those obtained by using a Lister strain that has been used clinically and has been recognized as safe as a parent strain are particularly preferably used.
  • the transcription unit can be introduced into the host by infecting the host with the virus, and when using the above DNA, the DNA can be introduced into the host. It can be integrated into the genome.
  • a caspase inhibitor When using recombinant vaccinia virus, a caspase inhibitor can be used to effectively suppress the induction of host cell apoptosis due to viral infection and increase work efficiency.
  • a predetermined DNA-dependent RNA polymerase is supplied into the host, and (b) to (e): DNA can be transcribed.
  • each type of protein gene in the (Tb)-(e) DNA must be inserted downstream of the promoter specifically recognized by the predetermined DNA-dependent RNA polymerase, and the expression thereof must be controlled.
  • the DNA-dependent RNA polymerase include T7 UNA polymerase, T3 RNA polymerase, RNA polymerase I, RNA polymerase II, RNA polymerase III and the like are preferably used.
  • the method (i) is more preferable among the above methods (i) to (iii).
  • the efficiency of reconstitution can be further increased.
  • the viral vector obtained by the production method of the present invention can be selectively and efficiently propagated by co-culture with other cells.
  • cultured cells obtained by the production method of the present invention (cells containing the reconstituted virus vector) are seeded on B95a cells that have been cultured in advance and co-cultured.
  • giant cells of B95a cells infected and propagated by virus vectors can be obtained.
  • the recombinant mononegavirus vector production kit of the present invention is a kit for cDNA encoding a segmented genomic RNA or cRNA contained in the aforementioned viral vector. Including DNA (preferably plasmid DNA), and including DNA transcription units. As for the details of the DNA and transcription unit, the explanation in 1 above can be similarly applied. The same applies to the other components described below.
  • the kit of the present invention preferably further comprises DNA containing the N protein gene of Mononegavirus, DNA containing the P protein quality protein and DNA containing the L protein gene.
  • the kit of the present invention may further comprise a host that expresses the N protein, P protein and L protein of the mononegative virus.
  • a host that expresses the N protein, P protein and L protein of the mononegative virus.
  • the use of the DNA containing the N protein gene, the DNA containing the P protein gene and the DNA containing the L protein gene can be used.
  • kits for producing a recombinant mononegavirus vector containing the segmented genomic RNA or cRNA contained in the aforementioned viral vector Is included.
  • the kit may further contain a host that expresses the N, P, and L proteins of the mononegative virus.
  • a foreign protein can be produced by expressing a foreign protein in a host infected with the virus vector of the present invention and recovering the expressed protein.
  • “Exogenous protein” means a protein encoded by a gene introduced into a viral genome and intended for expression. When cultured cells are used as the host, exogenous proteins can be recovered from the culture solution by conventional methods.
  • a protein can be expressed in an animal infected with the virus vector of the present invention, and a body fluid containing the expressed foreign protein can be recovered.
  • the body fluid may be collected by any known collection method depending on the type of infected animal and body fluid, and is not limited. For example, there is a method of collecting whole blood and removing blood cell components by centrifugation. Can be mentioned.
  • antiserum is produced or antibody protein is collected and applied to treatment or diagnosis.
  • a viral vector into which a protein gene involved in virus or bacterial pathogenicity is inserted is infected with an animal that is a host, the protein encoded by the gene is expressed, and then serum is obtained from this animal.
  • an antiserum containing an antibody against the protein can be produced.
  • the resulting antibody (antiserum) can be used for ELISA and neutralization tests.
  • mice to be infected with the virus vector of the present invention examples include mammals excluding humans such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, puta, inu, ferrets, cats, monkeys, hidges, horses and horses Among them, rodent (murine) animals such as mice, rats, and guinea pigs are more preferable, and mice are particularly preferable.
  • tissues or cells to be collected include spleen or lymph nodes, and examples of body fluids to be collected include blood, lymph and cerebrospinal fluid.
  • Plasmid DNA 1 that encodes each of the segmental genomes, and plasmid DNA 2 and P protein 7 that can express N protein 6 (nucleocapsid) of measles virus virus (of RNA-dependent RNA polymerase)
  • Plasmid DNA 3 capable of expressing small subunits and plasmid DNA 4 capable of expressing L protein 8 (the large subunit of RNA-dependent RNA polymerase) were constructed, and these were constructed as CHO / hSLAM cells. (DNA expression is controlled by the T7 promoter).
  • vaccinia virus 13 VTF7-3 strain
  • T7 RNA polymerase 14 T7 RNA polymerase 14
  • N nucleocapsid
  • P, L polymerase
  • M protein 10, F protein 11 and H protein 12 are expressed from the M gene, F gene and H gene in the segmental genome contained in RNP complex 9, and M protein 10 utilizes part of the CHO hSLAM cell membrane.
  • the F protein 11 and H protein 12 were presented on the outer surface of the viral particle membrane structure.
  • the RNP complex 9 was encapsulated in the membrane structure and became virus particles and released out of the cell.
  • a caspase inhibitor was added to prevent cell death (apoptosis) of CHO / hSLAM cells by vaccinia virus and improve the efficiency of virus vector production.
  • Vaccinia virus caused abortive infection in CHO / hSLAM cells and could not propagate, so it was easy to obtain only the viral vector.
  • p (+) MV323 is a plasmid that encodes the full length (15,894 bases) cDNA of the genome ((single-strand ENA) of the measles virus wild type strain (IC-B strain).
  • the T7 promoter sequence is located at the upstream end of the viral genomic cDNA (15,894 bases), and the ribozyme sequence is located at the downstream end. Therefore, T7 RNA polymerase binds to the T7 promoter; can initiate RNA synthesis and synthesize the full-length measles virus RNA genome (15,894 bases) from the measles virus cDNA region (15,894 bases) .
  • the ribozyme sequence located at the downstream end cleaves the downstream end of the synthesized measles virus RNA genome at exactly 15,894 bases. It is already known that infectious measles virus particles can be synthesized from the structure of p (+) MV323 and this synthesized RNA genome (Takeda M, et.
  • Measles virus (IC_B strain) genome sequence information is, for example, GenBank (http: // (www.ncbi.nlm.nih.gov/) is published as “Ac session number: NC_001498”.
  • N gene P gene
  • M gene M gene
  • F gene and marker gene MV_DsRed-NPMF with DsRed gene
  • EGFP gene as H gene, L gene and marker gene
  • the cDNAs for reconstructing the two-segment genomic vector are called p (+) MV-DsRed-NPMF and p (+) MV-EGFP_HL, respectively.
  • Portionwise 0.3 mu xi], respectively, were mixed with dH 2 within 0, 95 ° 10 min after heating in C, and double-stranded DNA with a protruding end corresponding to Pad and Clal by performing 10 minutes
  • Aniru reaction 50 ° C was constructed by incorporating it into the above cut-out part using a known gene recombination technique.
  • the synthetic double-stranded sequence is adjusted so that the site where the short synthetic double-stranded DNA is inserted functions as a new gene insertion site (corresponding to Emp-1 in Fig. 10).
  • p (+) MV323_EGFP was cleaved with restriction enzymes BstBI and Pacl to cut out all coding regions of N protein, P protein, M protein and F protein.
  • pCAG-T7-IC-N and pCAG-T7-IC-PAC have pCAGGS plasmid (Niwa, H. et. al., 1991, Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector., Gene, 108, 193-199.), And using the known gene recombination technology, the coding base sequence of N protein in pCAG-T7-IC-N is inserted downstream of the T7 promoter sequence, and pCAG- In T7-IC-PAC, the P protein code base sequence is inserted.
  • PGEMCR-9301B-L has pGEM-3Z (Promega) plasmid in the backbone, and the coding base sequence of L protein is inserted downstream of T7 promoter inside PGEM-3Z. 1.3.4 Vaccinia virus vTF7-3 strain
  • RNA genomes segmental genomes
  • N, P and L proteins the recombinant vaccinia virus vTF7-3 strain
  • the vTF7-3 strain is a known recombinant vaccinia winoles that expresses T7 RNA polymerase (Fuerst TR, et. al., Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase., Prbc. Natl. Acad. Sci. US A., 1986 Nov; 83 (21): 8122-6.), Applied to various research applications. 1.3.5 Host cell preparation
  • the grown CHO / hSLAM cells were seeded in a plurality of 6-well culture plates.
  • As a culture solution a 7.5% fetal bovine serum-containing RPMI culture solution was used.
  • (3) CHO / hSLAM cells were cultured at 37 ° C for 6 hours.
  • a virus solution of vTF7_3 strain prepared by adjusting the infectivity to 2.5 ⁇ 10 6 PFU / ml was prepared.
  • the culture solution of CHO / hSLAM cells in the 6-well culture plate was removed, and virus solution was added at 240 ⁇ / well.
  • the virus solution in the 6-well culture plate was removed from the CHO / hSLAM cells (after completion of the culture in 1.3.6 (3) above).
  • VTF7-3 can be easily removed by propagating reconstituted virus particles (virus vectors) in B95a cells, followed by plaque isolation or limiting dilution of virus solution. However, it can be further facilitated by using a vaccinia virus neutralizing antibody.
  • Fig. 8 and Fig. 10 show the structural diagrams of each segmented genome of the reconstructed two-segment genomic measles virus vector.
  • the EGFP gene a foreign gene
  • the foreign gene DsRed gene is inserted in addition to the viral gene N, P gene, M gene and F gene.
  • the insertion site was placed in the uppermost stream of each segmented genome.
  • there is another empty gene unit in each segmented genome see the arrow), and further foreign genes can be inserted into this gene unit.
  • a two-segment genomic measles virus vector capable of inserting a total of four foreign genes could be constructed. 1.4 Reconstruction of three-segment genomic measles virus vector
  • MV-LacZ-NP with N and P genes and Lac Z gene as a marker gene
  • MV- with M and F genes and DsRed gene as a marker gene DsRed-MF
  • MV-EGFP-HL equipped with H and L genes and EGFP gene as a marker gene Trial segmentation was attempted (Fig. 9).
  • the cDNAs used to reconstruct the three-segment genomic vector were called p (+) MV-LacZ-NP, P (+) MV-DsRed-M; F and p (+) MV_EGFP-HL, respectively.
  • p (+) MV-EGFP-HL is commonly used to reconstruct both the two-segment and three-segment genome vectors.
  • the construction scheme is shown in ( Figure 38). It was constructed based on the full-length genomic plasmid p (+) MV323-lacZ (see 1.5 below) for the control virus vector. p (+) MV323-lacZ was cleaved with restriction enzymes Sail and Pmll to cut out all of the coding regions of M protein, F protein and H protein, and most of the coding region of L protein.
  • the construction scheme is shown in ( Figure 39). It was constructed using p (+) MV-Ds: ed-NPMFH (see 1.3 above) for the above segmented genomic measles virus vector. p (+) MV-DsRed-NPMFH was cleaved with the restriction enzyme Blpl to cut out almost all coding regions of N protein and P protein.
  • a double strand with protruding ends corresponding to Blpl by mixing 0.3 each in dH 2 O, heating at 95 ° C for 10 minutes, and annealing at 50 ° C for 10 minutes It was constructed by synthesizing DNA and incorporating it into the above cut-out part using a known gene recombination technique.
  • the synthetic double-stranded sequence is adjusted so that the site where the short synthetic double-stranded DNA is inserted functions as a new gene insertion site (corresponding to Emp-3 in Fig. 10).
  • the reconstruction method of the three-segment genomic virus vector is the same as the reconstruction method of the two-segment genomic virus vector described above, except that p (+) MV-DsRed-NPMF and p (+) MV-EGFP-HL Instead, p (+) MV-lacZ-NP, p (+) MV-DsRed-MF and p (+) MV-EGFP-HL were used in the same manner.
  • the amounts of p (+) MV-lacZ-NP, p (+) MV-DsRed-MF and p (+) MV-EOFP-HL used were 2 respectively.
  • Fig. 9 and Fig. 10 show the schematic structure of each segmented genome of the reconstructed 3-segment genomic measles virus vector.
  • the foreign gene EGFP gene ⁇ (unsense is inserted.
  • the foreign DsRed gene is inserted in the third segment (Fig. 9 (C)), in addition to the viral genes N and P, the foreign gene LacZ.
  • the inserted site was placed in the uppermost stream of each segmented genome to allow high expression of foreign genes, and there was one empty gene unit in the first segment. Two sites are provided in the segment (see the arrow), and further foreign genes can be inserted, that is, a total of 6 foreign genes can be inserted into the three-segment genomic measles virus vector. Reconstitution of control virus vector
  • IC323-lacZ IC323-DsRed
  • IC323-EGFP IC323-EGFP
  • Will has a recombinant genome in which the LacZ gene, DsRed gene, or EGFP gene is inserted into the genome of wild-type measles virus (IC323 strain). Is a vector. In order to highly express foreign genes, all insertion sites were placed at the top of the genome.
  • MV323-EGFP was used as a plasmid DNA to reconstitute IC323-EGFP (Hashimoto K, et. Al., SLAM (CD 150) -in dependent measles virus entry as revealed by recombinant virus expressing green fluorescent protein., J. Virol., 2002 Jul; 76 (l3) "6743-9.)
  • p (+) MV323-EGFP is the T7 promoter side in the genomic cDNA region of p (+) MV323 measles virus.
  • the transcription start sequence and transcription termination sequence of the measles virus gene, and two restriction enzyme recognition sequences, Ascl and Aatll, are inserted into the most upstream side of the gene using a known gene thread replacement technique.
  • the measles virus obtained from p (+) MV323-EGKP is called IC323-EGP, and the virus is IC- Expresses E323 and IC323 obtained from p (+) MV323, which has the same gene structure as B strain Except for the same phenotype (Hashimoto K, et. Al., SLAM (CD 150)-in de endent measles virus entry as revealed by recombinant virus expressing green fluorescent protein., J. Virol. , 2002 Jul; 76 (13): 6743'9.) 1.5.2 Plasmid DNA for reconstitution of IC323-lacZ
  • (+) MV323_LacZ was used for lj (Takeda M, et.al., Efficient rescue of measles virus from cloned cDNA using SLAM-expressing Chinese hamster ovary cells., Virus Res., 2005 Mar; 108 (l-2): 161-5.).
  • (+) MV323-LacZ is derived from the EGFP translation sequence by using only the start and stop codons of the EGFP gene coding region (Open reading frame [ORF]) of p (+) MV323-EGFT.
  • Galactosidase A plasmid in which the translated sequence is replaced by a known gene recombination technique.
  • the measles virus obtained from p (+) MV323-LacZ is called IC323-LacZ, and the virus emits IC323 obtained from p (+) MV323 having the same gene structure as IOB strain and ⁇ -galactosidase.
  • IC323-LacZ The measles virus obtained from p (+) MV323-LacZ
  • P (+) MV323_DsRed was used as a plasmid DNA for reconstituting IC323-DsRed.
  • p (+) MV323-DsRed can be constructed in the same manner as p (+) MV323-LacZ above, and the start codon and termination of the coding region (ORF) of the EGFP gene of p (+) MV323-EGFP Only the internal sequence of the codon from the EGFP translation sequence: a plasmid in which the DsRed translation sequence is replaced by a known gene recombination technique.
  • the measles virus obtained from p (+) MV323-DsRed is called IC323-DsRed, and the virus expresses IC323 obtained from p (+) MV323 having the same gene structure as IC-B strain and DsRed. It has the same phenotype, except that its breeding capacity has declined.
  • a segment of the 3-segment genomic virus vector was inserted, and an extraneous gene was inserted into MV-DsRed-MF.
  • CAT plasmid sidhu MS, et. Al., Rescue of synthetic measles virus minireplicons: measles genomic termini direct efficient expression and propagation of a reporter gene., Virology, 1995 Apr 20; 208 (2): 800-7.
  • reaction solution composition The PCR reaction solution composition and reaction conditions are as follows. Reaction solution composition>
  • pSEAP-control plasmid (Clontech) in a saddle shape, and the SEAP gene coding sequence and Pad and Eco47III restriction enzyme recognition sequences at both ends according to known nucleic acid amplification technology (PCR).
  • PCR nucleic acid amplification technology
  • a DNA fragment was obtained. This DNA fragment is converted to p (+) MV-DsRed-CAT-MF
  • the p (+) MV-DsRed-CAT-MF-SEAP plasmid was obtained by inserting into the pad and Eco47III restriction enzyme recognition sequence within Rasmid's Emp-1 (Fig. 41).
  • the method for reconstructing a three-segment genomic virus vector using these p (+) MV-DsRed-CAT-MF or p (+) MV-DsRed_CAT-MF-SEAP is the same as the three-segment genomic virus vector described above. In one reconstruction method, except that p (+) MV-DsRed-CAT-MF or p (+) MV-DsRed-CAT-MF-SEAP was used instead of p (+) MV-DsRed-MF And so on. Note that the usage amount of p (+) MV-DsRed-CAT-MF and p (+) MV-DsHed-CAT-MF-SEAP were both 2.
  • the reconstructed two-segment genomic measles virus vector (hereinafter referred to as “2 seg-MeV”) is expressed in the host CHO cells by EGFP (green, panel in FIG. 11A) and DsRed (red, panel in FIG. 11B). It was observed under a fluorescence microscope that the cells grew while forming giant cells that emitted the same fluorescence. Note that the panel in FIG. 11C is an overlay of the panel in FIG. 11A and the panel in FIG. 11B, and the panel in FIG. 11D is a photograph of the virus cell itself (without excitation light irradiation).
  • the virus vector (hereinafter referred to as “3 seg-MeV”) forms giant cells in host B95a cells that emit fluorescence of EGFP (green, panel in FIG. 12A) and DsRed (red, panel in FIG. 12B). However, it was observed to grow under a fluorescence microscope. Note that the panel in Fig. 12C is an overlay of the panel in Fig. 12A and the panel in Fig. 12B, and the panel in Fig. 12D is the virus cell itself (excitation light unilluminated). This is a photo of In addition to the above fluorescence, galactosidase encoded by the lacZ gene was also expressed (Fig. 13B panel, Fig. 13A panel (enlarged)). 2.2.2 Three-segment genomic measles virus vector reconstituted with ⁇ (+) MV-LacZ-NP, p (+) MV-DsRed-CAT-MF and p (+) MV-EGFP-HL
  • the virus vector (hereinafter “3 seg-MeV-CAT”) is a giant cell that fluoresces EGFP (green, panel in Fig. 42A) and DsRed (red, panel ⁇ in Fig. 42B) in host Vero / hSLAM cells.
  • the panel shown in Fig. 42C is a superposition of the panel shown in Fig. 42 and the panel shown in Fig. 42, and the virus cells themselves.
  • the virus vector (hereinafter referred to as “3 seg-MeV-CAT-SEAP”) grows in the host Vero / hSLAM cells while forming giant cells that emit EGFP and DsRed fluorescence. This was observed under a microscope. In addition to the above fluorescence, 3 galactosidase encoded by the lacZ gene was also expressed. In addition to these, host Vero / hSLAM cells infected with 3 seg-MeV-CAT-SEAP were collected over time and analyzed for CAT activity and SEAP activity. CAT activity ( Figure 43A) and SEAP activity ( The increase over time in Fig. 43B) was confirmed.
  • VTeV and 3 seg-MeV were found to form plaques that emit fluorescence of two colors (red and green) (Figs. 17A to 17D). Furthermore, 3 seg-MeV was found to express / 3 galactosidase (Fig. 17 G).
  • the amount of EGFP mRNA in 3 seg-MeV-infected cells was about 50% of the amount of EGFP mRNA in IC323-EGFP-infected cells.
  • the amount of viral protein mRNA in 3 seg-MeV-infected cells is 100% of the amount of viral protein mRNA in IC323-EGFP-infected cells, despite the introduction of three foreign genes: It was confirmed that it was more than%.
  • the 3 seg-MeV segmental genome still has an empty gene uet (gene insertion site) that can accommodate additional insertions of 3 foreign genes, and there are a total of 6 3 seg-MeVs. It is a very useful viral vector that can insert foreign genes.
  • the CAT and SEAP genes were inserted and expressed, respectively, as shown in the section for additional insertion of exogenous genes in 1.6 above.
  • the 3-segment genomic measles virus vector (3 seg-MeV) prepared in Example 1 was infected into Vero / hSLAM cells at a low MOI of about 0.01.
  • the post-infection cytopathic effect (CPE) is then observed daily with a phase contrast microscope or fluorescence microscope, and when CPE becomes prominent (ie, a sufficient amount of virus has been produced and the amount of virus synthesis has reached its peak). After that, at the stage where virus synthesis is expected to be attenuated due to the death of the host cell), the cell culture supernatant (virus solution) is recovered and infected with another Vero / hSLAM cell at a low MOI. It was.
  • the recombinant vaccinia virus LO-T7-1 which expresses T7 RNA polymerase, which is the parent strain of Lister, was a known strain (Yasui K, et. Al., The native form and maturation process of hepatitis C J. Virol., 1998 Jul; 72 (7): 6048-55; Kashiwakuma T, et. al., Detection of hepatitis C virus specific core protein in serum of patients by a sensitive fluorescence enzyme immunoassay ( FEIA)., J. Immunol. Methods, 1996 Mar 28; 190 (l): 79-89.).
  • Genomic RNA was extracted from wild-type measles virus (IC-B strain) by a conventional method and subjected to reverse transcription reaction under the conditions shown below to produce plasmid p (+) MV323 having full-length genomic cDNA.
  • the reaction solution composition and reaction conditions for the reverse transcription reaction are as follows:
  • Type IV RNA (1.0 ⁇ ⁇ ⁇ : 5 ⁇
  • MV323 is a plasmid that encodes the full length (15,894 bases) cDNA of the genome ((single-stranded RNA)) of the wild-type strain of measles virus (IC-B strain).
  • the measles virus genomic cDNA (15,894 bases) has a T7 promoter sequence at the upstream end and a ribozyme sequence at the downstream end.
  • T7 RNA polymerase binds to the T7 promoter to initiate RNA synthesis, and synthesizes the full-length measles virus RNA genome (15,894 bases) from the measles virus cDNA region (15,894 bases). Can do.
  • the downstream end of the synthesized measles virus RNA genome is cleaved at exactly 15,894 bases by the ribozyme sequence located at the downstream end.
  • infectious measles virus particles can be synthesized from the structure of p (+) MV323 and this synthesized RNA genome (Takeda M, et.al., Recovery of pathogenic measles virus from cloned cDNA. ., J. Virol "2000 Jul; 74 (14): 6643-7.).
  • Genome sequence information of measles Will (IC-B strain) For example, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
  • CHO / hSLAM cells grown in a moderately dense manner on a 10 cm diameter culture dish were prepared by a conventional method.
  • the grown CHO / hSLAM cells were seeded in one 6-well culture plate.
  • As the culture solution RPMI culture solution containing 7.5% fetal calf serum was used.
  • each plasmid was introduced into the host and measles virus particles were reconstituted.
  • CHO / hSLAM cells were prepared in a conventional manner by growing 6-well diameter culture plates in a moderately dense manner.
  • vTF7-3 strain see Example 1
  • LO-T7-1 strain see Example 3
  • MVA-T7 strain Wiatt LS, et. Al
  • Virus solutions were prepared.
  • pBS-GFP pBluescript plasmid (Stratagenene soil incorporated with GFP gene)
  • the virus solution in the 6-well culture plate was removed from the CHO / hSLAM cells (after completion of the culture in 1-.2 (3) above).
  • the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours, and each plasmid was introduced into the host, and foreign genes were transferred and expressed.
  • Example 3 reconstruction of measles virus
  • p (+) MV323, pl8MGFLuc01 Komase K, et.ai., The phosphoprotem oi attenuated measles AIK-C vaccine strain contributes to its temperature-sensitive phenotype ., Vaccine., 2006 Feb 6; 24 (6): 826-34. Epub 2005 Aug 15.), except that the expression of luciferase (ie, the amount of fluorescence after addition of luciferin) was confirmed. did.
  • pBS-GKP Blue script plasmid (Stratagene) with GFP gene
  • p (+) MV323-EGFP (5 ⁇ ) (1.5 control virus) (See Vector Reconstruction)
  • pCAG-T7-IC-N (1 ⁇ ⁇
  • pCAG-T7-IC-PAC ⁇ .5 ⁇ 3 ⁇ 4
  • pGEMCR-9301B-'L ⁇ ⁇
  • Opti-MEM medium supplemented with caspase inhibitor (z-Asp-CH 2 -DCB, Peptide Institute, 50 ⁇ / ml) was added to some wells. Thereafter, the cells were cultured at 37 ° C for 18 hours. As a result, many cell deaths due to apoptosis were confirmed in the wells to which no caspase inhibitor was added, but almost no cell death due to apoptosis was confirmed in the tools to which the caspase inhibitor was added (Fig. 25 (a)). )
  • luciferase that is, the amount of fluorescence after addition of luciferin
  • MiniSeV / LacZ-NP-PM equipped with NP gene, P gene and M gene and LacZ gene as a powerful gene, and HN gene and L gene and GFP gene as marker gene
  • MiniSeV / GFP-HN-L which is equipped with, and miniseV / Luci-NP-P, which carries NP gene and P gene and ludferase gene as a marker gene, as a three-segment genomic vector 3 segments of MniSeV / LacZ-M with M gene and LacZ gene as a marker gene, and MiniSeV / GFP-HN-L with HN gene and L gene and GFP gene as marker gene (Fig. 27).
  • the cDNAs for reconstructing the three-segment genomic vector are pMiniSeV / Luci-NP-P, pMiniSeV / LacZ-M and pMiniSeV, respectively. Called / GFP-HN-L and used. Of these, pMiniSeV / GFP-HN-L is commonly used for the reconstruction of both 2-segment and 3-segment genome vectors.
  • pMiniSeV / NP-P-M was obtained.
  • pMniSeV / NP-P-M was digested with Notl again to construct pMiniSeV / LacZ-NP-P-M in which a Notl fragment (SEQ ID NO: 17) of the LacZ gene containing the EIS sequence was inserted into pniSeV / NP-P-M.
  • the construction scheme is shown in Figure 29.
  • SeV vector genomic cDNA P SeV (+18)
  • PCR was performed using the following two primers: Not I-HN-F and Sac II-R.
  • a fragment (Not ⁇ ⁇ / L-Sac II fragment: SEQ ID NO: 20) containing the HN gene and L gene having a recognition sequence was obtained.
  • Sac II-R 5'-aagtggcggccgccacagatcatggatggtgatag-3 '(35mer, ⁇ ⁇ ⁇ II number 1 8) Sac II-R :
  • pSeV (+18) was similarly digested with Not I and Sac II to obtain the NP gene, P gene, M gene, F gene, HN gene, and L gene. Insert into the cDNA from which all gene sequence fragments have been removed,
  • pMiniSeV / HN-L was obtained.
  • p niSeV / HN-L was again Notl consumption I fire, the P MiniSeV / GFP-HN-L was ⁇ the Notl fragment (SEQ ID NO: 2: 1) to pMiniSeV / HN-L of including GFP gene EIS array It was constructed.
  • Figure 30 shows the construction scheme. PCR using SeV vector genomic cDNA (pSeV (+18)) as a template and the following two primers, and fragments containing NP gene and P gene having Notl recognition sequence and SacII recognition sequence at both ends, respectively. (Not I-NP / P-Sac II fragment: SEQ ID NO: 23) was obtained.
  • pMiniSeV / NP-P was obtained.
  • pMniSeV / NP-P was digested again with Notl, and
  • pMiniSeV / Luci-NP-P was constructed by inserting Notl fragment (SEQ ID NO: 24) of luciferase gene containing EIS sequence into pMiniSeV / NP'P.
  • the construction scheme is shown in Figure 31.
  • pMiniSeV / M was digested again with Notl, and pMniSeV / LacZ'M was constructed by inserting a Notl fragment (SEQ ID NO: 17) of the LacZ gene containing EIS sequence into pMiniSeV / M.
  • segmented genomic SeV vector Recombination of segmented genomic SeV vector is the method of Li et al. (Li, H.-O. et al., J. Virology, 74: 6564-6569 ( 2000); WO 00/70070) Yes! ⁇ It was carried out according to the improved method (WO 2005/071092).
  • this segmented vector is a segmented type based on the F gene-deficient SeV vector. Therefore, for its amplification, packaging cells that highly express F protein (LLC-MK2 / F7 / A: Li , H.-O. et al., J. Virology, 74: 6564-6569 (2000), WO00 / 70070).
  • FIG. 32 A GFP fluorescence photograph in the process of amplification of a two-segment genomic vector is shown in Figure 32.
  • a two-segment genomic vector can be amplified by culturing with packaging cells (LLC-MK2 / F7 / A). Met.
  • packaging cells LLC-MK2 / F7 / A
  • MiniSeV / GFP-HN-L and MiniSeV / Lac Z-NP-PM bi-segment SeV solid solution cultured supernatant after amplification
  • 10 The diluted solution was added at 1 ml / well to introduce the gene. Two days later, GFP fluorescence was observed and a photograph was taken (confirmation of GFP expression). In addition, staining was performed using Invitrogen's -Gal Staining Kit (Cat. No. K1465-01), and bright field photographs were taken (confirmation of Lac Z expression).
  • a foreign gene can be highly expressed while maintaining the original good growth ability of the virus, and the length and type of the foreign gene have a small effect on the expression efficiency.
  • a recombinant mononegative virus vector capable of inserting a foreign gene, a method for producing the same, and a kit for producing the same can be provided.
  • the development of the vector of the present invention proved that the mononegative virus is a virus capable of bold modification of segmentation of the genome, and the genomic manipulation of the mononegative virus has been greatly simplified.
  • a method for producing a foreign protein using the viral vector, and an animal tissue, cell or body fluid, and antiserum or antibody obtained using the viral vector can be provided. .
  • the viral vector of the present invention is extremely useful as a highly practical vector that is excellent in stability and capable of highly expressing a plurality of foreign genes.
  • Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 2: Synthetic DNA SEQ ID NO: 3: Synthetic DNA SEQ ID NO: 4: Synthetic DNA SEQ ID NO: 5: Synthetic DNA SEQ ID NO: 6: Synthetic DNA SEQ ID NO: 7: Synthetic DNA SEQ ID NO: 8: Synthetic DNA SEQ ID NO: 9: -Synthetic DNA SEQ ID NO: 10: Synthetic DNA SEQ ID NO: 1 1: Synthetic DNA SEQ ID NO: 1 2: Synthetic DNA SEQ ID NO: 1 3: Synthetic DNA SEQ ID NO: 14: Synthetic DNA SEQ ID NO: 15: Synthetic DNA SEQ ID NO: 16: Synthetic DNA
  • Synthetic DNA SEQ ID NO: 17 Synthetic DNA SEQ ID NO: 1 8: Synthetic DNA SEQ ID NO: 1 9: Synthesis: DNA SEQ ID NO: 20: Synthetic DNA SEQ ID NO: 2 1: Synthetic DNA SEQ ID NO: 2 2: Synthetic DNA SEQ ID NO: 23: Synthesis DNA SEQ ID NO: 24: Synthetic DNA SEQ ID NO: 25: Synthetic DNA SEQ ID NO: 26: Synthetic DNA

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Abstract

本発明は、ウイルス本来の良好な増殖能を保持しつつ外来遺伝子を高発現させることができ、しかも、外来遺伝子の長さ及び種類による発現効率への影響が小さく、複数個の外来遺伝子を挿入することができる組換えモノネガウイルスベクターを提供する。本発明の組換えモノネガウイルスベクターは、複数に分節されたゲノムを保持し、少なくとも１つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含むことを特徴とする。

Description

明 細 書 分節ゲノム型組換えモノネガウィルスベクター 技術分野
本発明は、 組換えモノネガウィルスベクターに関する。 詳しくは、 分節ゲノム 型の組換えモノネガウィルスベクターに関する。 背景技術 - モノネガウィルス目に分類されるウィルス （モノネガウィルス） は、 すべて、 非分節型の（一）鎖 RNAのゲノムを有する RNAウィルスである。 このウィルスは、 遺伝子の並びや機能に共通性があり、 類似の遺伝子発現機構を備えている （図 1 参照） 。 1994年に狂犬病ウィルスを用いて初めて同目のウィルスの遺伝子操作 の道が開かれた。 以後、 同様の方法を用いてモノネガウィルスの代表的なウィル スでは、 全てにおいて遺伝子操作システムが開発されている （図 2参照） 。 例え ば、 麻疹ウィルスに関しては、 麻疹ウィルスの受容体 SLAM (signaling lymphocyte activation molecule) を発現する CHO細胞 （CHO/hSLAM細胞） と T7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルスとを応用した高効率の再 構成 （リバースジエネテイクス） 系が構築されている （Takeda, M. et. al.，
Efncient rescue of measles virus irom cloned cDNA using SLAM-expressmg Chinese hamster ovary cells., Virus Res., 2005 Mar; 108(1-2)： 161-5) 。
モノネ,ガウィルスのポリメラーゼは、 RNA依存性 RNAポリメラーゼであり、 ゲノムの 3，末端側に存在する単一のプロモーターからのみ転写を開始し、 遺伝 子間の転写終結配列及び開始配列を認識しながら 5 '末端側に向かって各遺伝子 の転写量を減衰させながら転写を行う。 そのため、 モノネガウィルスゲノムにお いては、 より上流側にある遺伝子ほど発現効率が高いという特性がある。 従って、 ウィルスベクターとして用いるためウィルスゲノムに外来遺伝子を挿入する場合 は、 ゲノムの上流側へ挿入するほど発現効率を高くすることができる （図 3参 照） 。 しかしながら、 外来遺伝子をゲノムの上流側に挿入した場合、 ウィルス遺 伝子の発現に対する悪影響、 すなわち発現効率の低下がより強く現れる傾向にあ るため、 ウィルスそのものの複製能の低下を招く ことが知られている
(Tokusumi T， et. al.， Recombinant Sendai viruses expressing difterent levels of a foreign reporter gene., Virus Res., 2002 Jun;86(l-2):33-8.) 。
また、 ウィルスゲノム中に外来遺伝子を複数個挿入した場合、 ウィルス複製能 がさらに低下することや （図 4参照； Skiadopoulos MH， et. al., Evaluation of the replication and immunogenicity of recombinant human parainfluenza virus type 3 vectors expressing up to three foreign glycoproteins., Virology., 2002 May 25；297(1)：136-52.) 、 挿入する外来遺伝子の長さが長いほどウィルス 複製能が低下することも知られている （Sakai Y. et. al., Accommodation of foreign genes into the Sendai virus genome: sizes of inserted genes and viral replication., FEBS Lett., 1999 Aug 6;456(2) :221_6.) 。
さらに、 外来遺伝子の種類によっては、 ウィルス複製能が強く抑制される場合 があることも分かっている。 例えば、 図 5に示すように、 野生型 (wt)ウィルス、： EGFP 遺伝子を挿入したウィルス、 DsRed遺伝子を挿入したウィルス、 及び LacZ 遺伝子を揷入したウィルスの 4種のウィルスの複製能を比較した場合、 特 に、 LacZ 遺伝子を揷入したウィルスにおいて複製能が顕著に低下することが認 められてい (図 6参照； Sakai Y. et. al., Accommodation oi foreign genes into the Sendai virus 'genome: sizes oi inserted genes and viral replication., FEBS Lett., 1999 Aug 6；456(2)：221-6.； Takeda M, et. al., Generation of measles virus with a segmented" RNA genome., J. Virol., 2006 May;80(9):4242-8.) 。 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題は、 モノネガウィルス本来の良好な増殖能を保 持しつつ外来遺伝子を高発現させることができ、 しかも、 外来遺伝子の長さ及ぴ 種類による発現効率への悪影響が小さく、 複数個の外来遺伝子を挿入することが できる組換えモノネガウィルスベクターを提供することにある。 また、 このよう な組換えモノネガウィルスベクターの製造方法を提供することにある。 本発明者は、 上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。 その結果、 ゲノムを 複数に分節した状態で有するモノネガウィルスベクターであって、 その分節した ゲノム中に外来遺伝子を挿入した組換えモノネガウィルスベク ーであれば、 上 記課題を解決できることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 複数に分節されたゲノムを保持し、 少なくとも 1つの分節ゲノムが宿主内 で発現可能な外'来遺伝子を含むことを特徴とする、 組換えモノネガウィルスべク ター。
本発明のベクターは、 例えば、 外来遺伝子を、 モノネガウィルスを構成する機 能性タンパク質遺伝子より上流側に挿入することができる。 また、 本発明のべク ターは、 例えば、 少なくとも 2つの分節ゲノムが外来遺伝子を含むことができる。 さらに、 本発明のベクターは、 例えば、 外来遺伝子を含む分節ゲノムのうちの少 なくとも 1つにおいて複数の外来遺伝子を含むことができる。
本発明のベクターとしては、 例えば、 2つに分節されたゲノムを保持し、 一方 の分節ゲノムが H遺伝子及び L遺伝子を含み、 他方の分節ゲノムが N遺伝子、 P 遺伝子、 M遺伝子及び F遺伝子を含むもの、 並びに、 3つに分節されたゲノムを 保持し、 第 1の分節ゲノムが H遺伝子及び L遺伝子を含み、 第 2の分節ゲノムが M遺伝子及び F遺伝子を含み、 第 3の分節ゲノムが N遺伝子及び P遺伝子を含む ものが挙げられる。 - 本発明,のベクターは、 例えば、 麻疹ウィルス又はセンダイウィルスの組換えゥ ィルスべクタ一である。
( 2 ) 上記 (1)記載のベクターに含まれる分節ゲノム RNA又はその cRNA。
( 3 ) 上記 (2)記載の RNA又はその cRNAを転写し得る铸型 cDNAを含む DNA。 本発明の DNAは、 例えば、 プラスミド DNAである。
( 4 ) 宿主内に、 上記 (3)記載の DNAと、 モノネガウィルスの N遺伝子を含む DNA、 P遺伝子を含む DNA及ぴ L遺伝子を含む DNAと、 当該 DNAの転写ュニ ットとを導入することを含む、 組換えモノネガウィルスベクターの製造方法。 ( 5 ) モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質を発現 する宿主内に、 上記 (3)記載の DNAと、 当該 DNAの転写ユニットとを導入するこ とを含む、 組換えモノネガウィルスベクターの製造方法。 .
本発明の方法 （上記 (4)及び (5)記載の方法） は、 転写ユニッ の導入として、 例えば、 所定の RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスを宿主 に感染させること、 又は、 所定の RNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNAを宿主内 に導入すること若しくは宿主ゲノムに組込むことができる。 ここで、 RNAポリ メラーゼは、 例えば T7 RNAポリメラーゼであり、 また、 組換えワクシニアウイ ルスは、 例えば Lister株を親株として得られたものである。 さらに、 本発明の方 法では、 宿主として、 例えば CHO細胞を用いることができる。
( 6 ) モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及ぴ Lタンパク質を発現 する宿主内に、 上記 (2)記載の; RNA又はその cRNAを導入することを含む、 組換 えモノネガウィルスベクターの製造方法。
本発明の方法では、 宿主として、 例えば CHO細胞を用いることができる。
( 7 ) 上記 (3)記載の DNA、 及ぴ当該 DNAの転写ユニットを含む、 組換えモノネ ガウィルスベクターの製造用キット。
-本発明のキットは、 例えば、 モノネガウィルスの N遺伝子を含む DNA、 P遺 伝子を含む DNA及び L遺伝子を含む DNAをさらに含むことができる。 また、 本 発明のキットは、 転写 ニットが、 例えば、 所定の: RNAポリメラーゼを発現す る組換えワクシニアウィルス、 又は、 所定の RNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNAである。 ここで、 RNAポリメラーゼは、 例えば T7 RNAポリメラーゼであ り、 また,、 組換えワクシニアウイルスは、 例えば Lister株を親株として得られた ものである。
( 8 ) 上記 (2)記載の RNA又はその cRNAを含む、 組換えモノネガウィルスべク ターの製造用キット。
本発明のキットは、 例えば、 モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質 及ぴ Lタンパク質を発現する宿主をさらに含むことができる。 ここで、 宿主は、 例えば CHO細胞である。
( 9 ) 上記 (1)記載のベクターを感染させた宿主に外来性タンパク質を発現させ、 発現した外来性タンパク質を回収することを含む、 外来性タンパク質の製造方法。
( 1 0 ) 上記 (1)記載のベクターを感染させた動物から採取された、 組織、 細胞 又は体液。 .
本発明の組織、 細胞又は体液は、 例えば外来性タンパク質を含むことができる。
( 1 1 ) 上記 (1)記載のベクターを感染させた動物から回収された、 抗血清又は 抗体。 図面の簡単な説明
図 1は、 モノネガウィルス粒子及びそのゲノム構造を示す概略図である。
図 2は、 モノネガウィルス粒子の再構成系の概略を示す図である。
図 3は、 モノネガウィルスゲノムへの外来遺伝子の挿入位置による発現効率へ の影響を示す概略図である。
図 4は、 モノネガウィルスゲノムへの外来遺伝子の挿入個数による発現効率へ の影響を示す概略図である。 ' 図 5は、 野生型 (wt)のモノネガウィルス （IC323) 、 EGFP遺伝子を挿入した モノネガウィルス （IC323-EGFP) 、 DsRed遺伝子を揷入したモノネガウィルス •(IC323-DsRed) 、 及ぴ LacZ遺伝子を揷入したモノネガウィルス （IC323_lacZ ) のゲノム構造を示す概略図である。
図 6は、 図 5に示す 4種のモノネガウィルスそれぞれの複製能を示すグラフで ある。
図 7は、 分節ゲノム型モノネガウィルスべクターの作製方法を示す概略図であ る。 ， ·
図 8は、 2分節ゲノム型モノネガウィルスベクター （2 seg-MeV) のゲノム構 造を示す概略図である。
図 9は、 3分節ゲノム型モノネガウィルスベクター （3 seg-MeV) のゲノム構 造を示す概略図である。
図 1 0は、 IC323-lacZゝ IC323-DsRed, IC323-EGFP, 2 seg-MeV及び 3 seg- MeVのゲノム構造を示す概略図である。
図 1 1は、 2 seg-MeV感染 B95a細胞における外来遺伝子 （EGFP (緑色） ； DsRed (赤色） ） の発現を示す写真である。
図 1 2は、 3 seg-MeV感染 B95a細胞における外来遺伝子 （EGFP (緑色） ； DsRed (赤色） ） の発現を示す写真である。
図 1 3は、 3 seg-MeV感染 B95a細胞における外来遺伝子 （ ガラクトシダー ゼ遺伝子） の発現を示す写真である。
図 1 4は、 IC323、 IC323-lacZ、 IC323.DsRed、 IC323-EGFP, 2 seg-MeV及 ぴ 3 seg-MeVそれぞれのウィルス複製能 （増殖能） を示すグラフである。
図 1 5は、 IC323, IC323-lacZ、 IC323_DsRed、 IC323-EGFP, 2 seg-MeV及 び 3 seg-MeVぞれぞれのプラーク形成の有無を示す写真である。
図 1 6は、 IC323、 2 seg-MeV及び 3 seg-MeVそれぞれのプラークにおける、 ガラクトシダーゼの発現の有無を示す写真である。
図 1 7は、 2 seg-MeV及ぴ 3 seg-MeVそれぞれのプラークにおける蛍光、 及ぴ、 βガラクトシダーゼの発現の有無を示す写真である。
図 1 8は、 2 seg-MeV等が有するゲノム構造の概略図、 及ぴ、 2 seg-MeV等の 感染細胞におけるウィルス粒子の複製の有無と外来遺伝子の発現とを示す模式図 である。
. 図 1 9は、 3 seg-MeV等が有するゲノム構造の概略図、 及ぴ、 3 seg-MeV等の 感染細胞におけるウィルス粒子の複製の有無と外来遺伝子の発現とを示す模式図 である。 '
図 2 0は、 IC323、 IC323-lacZ、 IC323-DsRed、 IC323-EGFP, 2 seg-MeV及 び 3 seg-MeVそれぞれの感染細胞におげる、 ウィルスタンパク質及び外来性タン パク質の発現量について、 免疫沈降法を用いて解析した結果を示す電気泳動写真 である。
図 2 1は、 IC323、 IC323-lacZ、 IC323_DsRed、 IC323-EGFP, 2 seg-MeV及 ぴ 3 seg-MeVそれぞれの感染細胞における、 外来性タンパク質 ( βガラク トシダ ーゼ） の発現量について、 ルミノメーターを用いて解析した結果を示すグラフで ある。
図 2 2は、 IC323-EGFP感染細胞での遺伝子発現量 （mRNA量） に対する 3 seg-MeV感染細胞での遺伝子発現量 （mRNA量） の割合について、 RT-定量 PCR 法を用いて解析した結果を示すグラフである。
図 2 3は、 使用したワクシニアウィルス株の違いによる T7プロモーターに依 存した GFPの有無を示す写真である。
図 2 4は、 使用したワクシニアウィルス株の違いによるミニゲノムウィルス転 写 ·複製実験系におけるルシフェラーゼ発現量 （ルシフェリン添加後の蛍光量） の比較を示すグラフ （A) 、 及び、 使用したワクシニアウィルス株の違いによる 麻疹ウィルス粒子の合成開始に成功した細胞数の比較を示すグラフ （B) である。 図 2 5は、 ワクシニアウィルス感染細胞のアポトーシスに対するカスパーゼ阻 害剤の添加効果'を示す写真 （A) 、 及び、 ワクシニアウィルス感染細胞の染色体 DNAの断片化に対するカスパーゼ阻害剤の添加効果を示す電気泳動写真 （B) である。
図 2 6は、 ワクシニアウィルス感染細胞へのカスパーゼ阻害剤の添加の有無に よるミニゲノムウィルス転写 ·複製実験系におけるルシフェラーゼ発現量 （ルシ フェリン添加後の蛍光量） の比較を示すグラフ （A) 、 及び、 ワクシニアウィル ス感染細胞へのカスパーゼ阻害剤の添加量の違いによる麻疹ウィルス粒子の合成 開始に成功した細胞数の比較を示すグラフ （B) である。
•図 2 7は、 2分節及び 3分節ゲノム型の F遺伝子欠損型センダイウィルス (SeV)ベクター等のゲノム構造を示す概略図である。
図 2 8は、 pMiniSeV/LacZ-NP-P-Mの構築スキームを表す図である。
図 2 9は、 pMiniSeV/GFP-HN-Lの構築の構築スキームを表す図である。
図 3 0は、 pMiniSeV/Luci-NP-Pの構築スキームを表す図である。
図 3 1 ,は、 pMiniSeV/LacZ-Mの構築スキームを表す図である。
図 3 2 は、 2分節ゲノ ム型 SeV ベク ター （ MiniSeV/GFP-HN-L と niSeV/Lac Z-NP-P-M) の再構成と増幅を示す GFP蛍光写真である。
図 3 3 は、 3分節ゲノ ム型 SeV ベク ター （ MiniSeV/GFP-HN-L、 MniSeV/Lac Z-M と MniSeV/Luci-NP-P) の再構成と増幅を示す GFP蛍光写 真である。
図 3 4 は、 2分節ゲノ ム型 SeV ベク ター （MiniSeV/GFP-HN-L と MniSeV/Lac Z-NP-P-M) による n vitro発現の結果を示す図である (LLC-MK2, Day 2)。
図 3 5 は、 3分節ゲノ ム型 SeV ベク ター （ MiniSeV/GFP-HN-L、 MiniSeV/Lac Z-Mと MiniSeV/Luci-NP-P) による ia ra'iro発現の結果を示す図 である (LLC-MK2、 Day 3)。
図 3 6は、 p(+)MV-DsRed-NPMFの構築スキームを表す図である。
図 3 7は、 p(+)MV-EGFP-HLの構築スキームを表す図である。
図 3 8は、 p(+)MV-LacZ-NPの構築スキームを表す図である。
図 3 9は、 p(+)MV-DsRed-MFの構築スキームを表す図である。
図 4 0は、 p(+)MV-DsRed-CAT-MFの構築スキームを表す図である。
図 4 1は、 p(+)MV-DsRed-CAT-MF-SEAPの構築スキームを表す図である。 図 4 2は、 3分節ゲノム型モノネガウィルスベクター (3 seg-MeV-CAT) の 感染 Vero/hSLAM 細胞における外来遺伝子 （ （A) EGFP (緑色） ； （B) DsRed (赤色） ） の発現を示す写真、 及び、 当該感染細胞の CAT活性を示す写 真 （D) である。
図 4 3は、 3分節ゲノム型モノネガウィルスベクター （3 seg-MeV-CAT- SEAP) の感染 Vero/hSLAM細胞の CAT活性を示す写真 （A) 及び SEAP活性 を示すグラフ （B) である。 符号の説明
1 ：分節ゲノムをコードするプラスミ ド DNA
2 ： Nタンパク質をコ一ドするプラスミ_ド DNA
3 ： Pタンパク質をコードするプラスミ ド DNA
4 ： Lタンパク質をコードするプラスミ ド DNA
5 ：分節ゲノム
6 ： Nタンパク質
7 ： Pタンパク質
8 ： Lタンパク質
9 ： RNP複合体
1 0 ： Mタンパク質 1 1 ： Fタンパク質
1 2 ： Hタンパク質
1 3 ： ワクシュアウィルス
1 4 ： T7 RNAポリメラーゼ '
1 5 ： CHO/hSLAM細胞 （麻疹ウィルスの受容体 SLAMを恒常的に発現するよ うに遺伝子導入された CHO細胞） 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明'について詳しく説明するが、 本発明の範囲はこれらの説明に拘束 されることはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない範囲 で適宜変更し実施し得る。
なお、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる米国特許仮出願 60/699,101 号明細書の全体を包含する。 また、 本明細書において引用された全ての先行技術 文献、 並びに公開公報、 特許公報及びその他の特許文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。
1 . 組換えモノネガウィルスベクター
(1) ウイノレスベクター
本発明の組換えモノネガウィルスベクターは、 複数に分節されたゲノムを保持 し、 少なくとも 1つの分節ゲノムが宿主内で発現可能な外来遺伝子を含むことを 特徴とする。 ―
「分節,」 とは、 複数本の塩基鎖からなる一組の塩基鎖群によって一つのウィル スゲノムとして機能するように、 複数本の塩基鎖になっていることを意味する。 また、 「分節ゲノム」 とは、 通常は、 一組の塩基鎖群を構成する個々の塩基鎖を 意味するが、 一組の塩基鎖群そのものを意味することもある。
モノネガウィルス （(一)鎖 RNAウィルス） のゲノムは、 ウィルスの複製に関与 するリーダー配列 （3'-Le) とトレーラー配列 （Tr-5') とを両端に有し、 これら の配列の間に、 ウィルスを構成する機能性タンパク質をコードする各種遺伝子を 有する。 上記機能性タンパク質をコードする遺伝子としては、 Nタンパク質をコ ードする遺伝子 （以下、 「N遺伝子」 という。 他の機能性タンパク質をコードす る遺伝子もこれに準じて表記する。 ） 、 P遺伝子、 M遺伝子、 F遺伝子、 H遺伝 子、 及び L遺伝子が挙げられる。 N遺伝子から発現する N.タンパク質 （ヌクレオ キヤプシド） は、 ウィルス RNAに対して 5 '末端から順に整然^並んで結合し包 装する。 P遺伝子からは Pタンパク質、 Vタンパク質及び Cタンパク質の 3種類 のタンパク質が発現する。 そのうち Pタンパク質は、 RNA依存性 RNAポリメラ 一ゼの小サブユニットとして機能し、 ウィルスゲノムの転写複製に関与する。 L 遺伝子から発現する Lタンパク質は、 RNA依存性 RNAポリメラーゼの大サブュ ニットとして機-能し、 Pタンパク質と共にウィルスゲノムの転写複製に関与する。 M遺伝子から発現する Mタンパク質は、 ウィルス粒子構造を内側から支える機能 を有する。 F遺伝子から発現する Fタンパク質、 及び H遺伝子から発現する Hタ ンパク質は、 ともに宿主細胞へのウィルスの侵入に関与する。
本発明のウィルスベクターが保持する分節ゲノムは、 モノネガウィルスゲノム と同様に、 両端にリーダー配列とトレーラー配列とを有し、 これらの配列の間に、 前述した機能性タンパク質をコードする遺伝子のいずれかを有する。 そして、 す ベての分節ゲノムを合わせると、 ウィルス粒子の複製等に必要な N遺伝子、 P遺 伝子、 M遺伝子、 F遺伝子、 H遺伝子、 及び L遺伝子をすベて有する状態となる。 なお、 これら遺伝子群は、 元のモノネガウィルスゲノムにおける配置 （並び順） とは無関係に、 分節ゲノム中に挿入されていてもよい。 また、 これら遺伝子群は、 モノネガウィルスゲノムに含まれる各遺伝子の塩基配列と完全に同一でなくとも、 転写及び複製における活性が天然型の活性と同等かそれ以上であれば、 変異が導 入された,ものであってもよいし、 あるいは他のゥィルス由来の相当邊伝子で代用 されたものであってもよい。 本発明においては、 ゲノムの分節数は、 限定はされ ないが、 最大で 6であることが好ましく、 特に好ましくは 2又は 3である。
本発明のウィルスベクターが、 2つの分節ゲノムを保持する場合の好ましい-形 態としては、 例えば、 第 1の分節ゲノムが H遺伝子及ぴ L遺伝子を含み、 第 2の 分節ゲノムが N遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子及ぴ F遺伝子を含むものが挙げられ る。 また、 3つの分節ゲノムを保持する場合の好ましい形態としては、 例えば、 第 1の分節ゲノムが H遺伝子及び L遺伝子を含み、 第 2の分節ゲノムが M遺伝子 及び F遺伝子を含み、 第 3の分節ゲノムが N遺伝子及び P遺伝子を含むものが挙 げられる。
本発明のウィルスベクターの分節ゲノムには、 宿主内で発現可能な外来遺伝子 が含まれる。 外来遺伝子としては、 限定はされず、 本発明のゥ ルスベクターの 用途に応じて適宜選択すればよいが、 例えば、 ウィルス、 細菌及び寄生虫等の病 原性を惹起する各種タンパク質をコードする遺伝子や、 各種サイトカインをコ一 ドする遺伝子、 並びに各種ぺプチドホルモンをコードする遺伝子等が挙げられる。 外来遺伝子が含まれる分節ゲノムは、 ウィルスベクターが有する複数の分節ゲノ ムのうちの 1つであってもよいし、 2つ以上であってもよく限定はされない。 複 数個の外来遺伝子をゲノムに挿入する場合は、 複数の分節ゲノムのうちの 1つの 分節ゲノムに、 複数個の外来遺伝子をすベて挿入してもよいし、 あるいは、 2つ 以上の分節ゲノムのそれぞれにおいて、 1個以上の外来遺伝子を揷入することで、 全体として複数個の外来遺伝子を挿入することもできる。 1つの分節ゲノム中に 複数個の外来遺伝子が挿入される場合、 その個数は、 ウィルスの構成タンパク質 遺伝子の発現効率が著しく低下しない範囲内であれば限定はされない。
分節ゲノムに挿入される外来遺伝子の位置は、 限定はされないが、 モノネガゥ ィルスを構成する機能性タンパク質遺伝子より上流側であることが好ましい。 こ れにより、 宿主内において外来遺伝子をより高発現させることができる。 またこ の知見を利用して、 外来遺伝子の発現量を、 遺伝子挿入の位置あるいは遺伝子の 前後の RNA塩基配列により調節することも可能である。
ここで、 「上流側」 とは、 ゲノムの 3 '末端に存在するリーダー配列 （3'-Le) 側である,ことを意味する （以下、 同様である。 ） 。 '
本発明のウィルスベクターの分節ゲノムは、 通常は、 モノネガウィルスが本来 有するゲノムと同様に (一)鎖 RNAで構築されたものであればよいが、 必要に応じ、 (+)鎖 RNAで構築されたものであってもよい。 （+)鎖 RNAゲノムのウィルスべク ターの場合、 ウィルス粒子の再構成 （リバースジエネテイクス） が効率よく行わ れ、 ウィルスの遺伝子操作 （すなわちゲノムの分節化や外来遺伝子の挿入） を容 易に行うことができる。 ここで、 「ウィルス粒子の再構成」 とは、 ウィルスゲノ ムの核酸を人工的に作製し、 試験管内又は細胞内において、 もとのウィルス又は 組換えウィルスを作製することを意味する。
本発明のウィルスベクターの構築材料となるモノネガウィルスとしては、 限定 はされないが、 例えば、 以下のウィルスが挙げられる。
パラミクソウィルス科 CPara/nj¾Ow:r fl¾e)に属する、 麻疹ウィルス (Measles virus)、 センダイ ウィルス {Sendai virus)、 ニュー力 ッスノレ病ウイ /レス {Nevcastle disease virus)、 おたふくかぜウイノレス Mumps virus)、 1型ノヽ。ライ ンフルェンザウィルス (i¾raioi?"en virus ϊ)、 2型パラインフルエンザウィル ス (Parainfluenza virus 2), 3型パラインフルエンザウイルス Parainfluenza virus 、 5型ノ ラインフゾレエンザウイノレス {Parainfluenza virus 5， Simian virus
Figure imgf000013_0001
RSウィルス fe¾wi¾ syncytial virus), 牛疫ウィ ス ( indeip' est
Figure imgf000013_0002
及びジステンパーウィルス {Distemper virus) 0
ラブドウィルス科 (Mhabdoviridae に属する、 水疱性口内炎ウィルス { Vesicular stamatitis virus), 狂犬病ウィルス Cffafo'as virus), 及びゥシ流行熱 ウイノレス {Bovine ephemeral fever virus) 0
ブイロウィルス科 FilovirMa^)に属する、 マールブルダウィルス (Marburg virus)、 及びエボラウイノレス (Ebola virus)0
本発明においては、 上記モノネガウィルスのなかでも、 麻疹ウィルス、 センダ ィウィルス及ぴニューカッスル病ウィルスが好ましい。 また、 合成オリゴヌクレ ォチドや、 DI粒子 （J. Virol.， 68, 8413-8417(1994)) 等の不完全ウィルス等も、 必要に応じ、 構築材料として使用するこ-とができる。 さらに、 構築材料となるモ ノネガウィルスとしては、 上記列挙したウィルスに由来する組換えモノネガウイ ルスを用いてもよい。 組換えモノネガウィルスとしては、 例えば、 免疫原性に関 与する遺伝子を不活性化したものでもよいし、 RNAの転写効率や複製効率を高 めるために一部の遺伝子を改変したものでもよい。
本発明のウィルスベクターは、 通常、 細胞感染能及ぴ伝播力を有している。 「 細胞感染能」 とは、 宿主となる細胞への接着能及び膜融合能等を保持しているこ とにより、 細胞内にウィルス内部の核酸等を導入し得る能力を意味する。 また、 「伝播力」 とは、 細胞内に導入された核酸を複製し、 感染性粒子 （又はそれに準 ずる複合体） を形成して、 当該核酸を別の細胞に伝播し得る能力を意味する。 換 言すれば、 「伝播力」 とは、 細胞内に導入された核酸情報に基づき、 細胞外に放 出され自由に運動し得る （他の細胞へ感染し得る） ウィルス粒子を形成すること と言うこともできる。 ， '
本発明のウィルスベクターは、 ベクターとしての安定性に優れるものである。 すなわち、 本発明のウィルスベクターは、 安定的に継代でき、 かつ、 安定した外 来遺伝子の発現能が保持され得るものである。 具体的にば、 ウィルスベクターを 適当な培養細胞に低い MOI (例えば 0.05〜0.01 (ウィルス数 Z細胞数） ） で感 染させ、 その後ウィルス感染による細胞変性効果 （CPE) が顕著になった段階 で培養上清を回収し、 再び同様の MOIで別の培養細胞に感染させるという継代 操作を 8〜： 10回繰り返しても外来遺伝子の良好な発現が認められるときは、 その ウィルスベクターは安定性に優れるということができる。 この場合、 継代数は、 より好ましくは 10〜20回であり、 さらに好ましくは 20回である。
また本発明は、 上述した本発明のウィルスベクターに含まれる分節ゲノム RNA又はその cRNA (相補 RNA) を包含するものである。 さらに、 本発明は、 当該 RNA又はその cRNAを転写し得る鐯型 cDNAを含む DNA (好ましくはプラス ミ ド DNA) も包含するものである。 本発明の RNA又はその cRNAは、 例えば、 先に列挙したモノネガウィルス又はその組換えウィルスの cDNAを公知の遺伝子 組換え技術により改変し （分節化、 外来遺伝子の挿入等） 、 これを鎵型 cDNAと して試験管内又は細胞内で転写することにより得ることができる。 転写において、 鎵型 cDNAは所望のプロモーターの下流に挿入され、 その挿入の向きによって本 発明の Rl^A及びその cRNAのいずれか一方、'すなわち（一)鎖 RNA及ぴ (+)鎖 RNA のいずれか一方が得られる。 また、 本発明の RNA又はその cRNAは、 ウィルスゲ ノムの両端構造を持つ cDNA (例えば DI分子など） にウィルスの構成タンパク質 遺伝子や外来遺伝子等の cDNAを人工的に挿入し、 挿入後の DNAを試験管内又 は細胞内で転写することによって得ることも可能である。 なお、 公知の遺伝子組 換え技術としては、 列えば、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の技術を適宜用いることがで きる （以下、 同様)
(2) ウィルスベクターの製法
分節型の RNAゲノムを有する本発明のウィルスベクターは、、各分節ゲノムに 対応する cDNAを用いて、 あるいは、 各分節ゲノムに相当する RNAを用いて、 ゥ ィルス粒子の再構成を行うことにより、 作製することができる。 いずれの方法に おいても、 通常は、 まず所望のモノネガウィルスからゲノム RNAを単離し、 逆 転写反応等によりこの RNAの cDNAを作製する。 次いで、 公知の遺伝子組換え技 術及び核酸増幅法等により、 当該 cDNAの分節化、 及び外来遺伝子の挿入等の操 作を施す。
ここで、 ゲノム RNAに基づいて作製された連続した 1本の cDNAを 「元の cDNA」 とすると、 「分節化」 とは、 元の cDNAを複数の cDNAに断片化するこ とを意味する。 この断片化の方法は、 元の cDNAの塩基配列情報等に基づいて結 果的に複数の cDNA断片が調製される方法であればよく、 限定はされない。 元の cDNAの塩基配列情報に基づく調製方法としては、 例えば、 元の cDNA中の所望 の領域を複数設定し、 それぞれの領域を铸型として別々に PCR法等を行って増 幅断片を得る方法が好ましく挙げられる。 所望の領域の設定は、 再構成において 発現させる分節ゲノムの構造を考慮して適宜設定することができ、 限定はされな い。 例えば、 ウィルスの機能性タンパク質をコードする各遺伝子断片をそれぞれ 個別に増幅で.きるように設定することが好ましい。 このように領域設定した場合 は、 得られた各遺伝子の增幅断片を、 所望の種類、 個数、 並び順 （位置） で結合 させるこ で、 複数の cDNA断片を調製することができる。
また 「外来遺伝子の挿入」 は、 別途調製した外来遺伝子を含む DNA断片を、 上述め分節化した cDNA中に、 公知の遺伝子組換え技術を用いて挿入すればよく、 限定はされない。
その後、 分節化した各 cDNAを含む DNA (好ましくはプラスミ ド DNA) を構 築する力 又は、 分節化した各 cDNAを予め ώ κ'έτοで RNAに転写しておき、 こ れらをウィルス粒子の再構成に用いる。 ま宿主細胞内に導入しても UNA依存性 UNAポリメラーゼの铸型とはならない。 鎵型となるには、 当該 RNAポリメラーゼによる RNA合成反応の初期段階におい て、 Nタンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質が存在し、 これらタンパク質 とゲノム RNAとの複合体 （RNP複合体） の形成が必要であるととが知られてい る。 そのため、 本発明のウィルスベクターを再構成するにあたっては、 これら N タンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質を併せて発現させる力、 あるいは、 発現し得る宿主を用いることが望ましい。
すなわち、 本発明のウィルスベクターの製造方法としては、 具体的には、 下記 (i)〜(iii)の方法が挙げられる。
(i) 宿主内に、 下記 (b)〜(e)の DNAと当該 DNAの転写ュニットとを導入するこ とを含む方法。
(ii) モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質を発現 する宿主内に、 下記 (b)の DNAと当該 DNAの転写ュニットとを導入することを含 む方法。
(iu) モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質を発 現する宿主内に、 下記 (a)の RNA又はその cRNAを導入することを含む方法。 • (a) 前述した本発明のウィルスベクターに含まれる各々の分節ゲノム RNA又はその cRNA
(b) 上記 (a)の RNA又は cRNAを転写し得る铸型 cDNAを含む DNA
(c) モノネガウィルスの Nタンパク質遺伝子を含む DNA
(d) モノネガウィルスの Pタンパク質遺伝子を含む DNA
(e) ,モノネガウィルスの Lタンパク質遺伝子を含む： DNA
上記 (i)の製法において使用する (c)〜 (e)の DNAは、 公知の遺伝子組換え技術を 用いて所定のタンパク質を発現し得るように構築されたものであればよいが、 例 えば、 プラスミ ド DNAであることが好ましい。 また、 （c)〜(e)の DNAに含まれる 各タンパク質遺伝子は、 モノネガウィルスゲノムに含まれる各タンパク質遺伝子 の塩基配列と完全に同一でなくてもよく、 例えば、 転写及び複製における活性が 天然型の各タンパク質と同等又はそれ以上であれば、 1若しくは数個 （例えば 1 〜1 5個、 好ましくは 1〜8個、 より好ましくは 1〜 5個） のアミノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミノ酸からなるタンパク質 （変異型タンパク質） をコード する塩基配列であってもよいし、 あるいは、 他のウィルス由来の相当遺伝子で代 用されたものであっても'よい。 当該変異型のタンパク質と天然型のタンパク質と のアミノ酸配列の相同性は、 例えば、 90〜： 100%であることが好ましいが、 転写 及ぴ複製における活性が、 保持されていれば、 アミノ酸の相同性は、 例えば、 40〜90%であってもよい。 なお、 変異タンパク質をコードする塩基配列 （DNA ) 【ま、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Haroor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987:1997)等に記載の部位特異的変位誘発法に従って調製することが できる。 DNAに変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法等の公知 手法により、 部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (ス トラタジーン社製） 、 GeneTaHor™ Site-Directed Mutagenesis System (ィンビトロジェン社製） 、 TaKaEa Site-Directed Mutagenesis System ( utan-K、 Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製） 等を用いて行うことができる。
上記 (ii)及び (iii)の方法におけるモノネガウイルスの Nタンパク質、 Pタンパク 質及び Lタンパク質としては、 これらの天然型のタンパク質の活性と同等又はそ れ以上であれば、 完全に同一のものでなくてもよく、 例えば、 1若しくは数個 （ 例えば 1〜1 5個、 好ましくは 1〜8個、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸 が欠失、 置換又は付カ卩されたアミノ酸からなるタンパク質 （変異型タンパク質） であってもよいし、 あるいは、 他のウィルス由来又はアミノ酸配列が大きく異な る全く別,のタンパク質であってもよい。 当該変異型のタンパク質と天然型のタン パク質とのアミノ酸配列の相同性は、 例えば、 90〜： 100%であることが好ましい が、 '転写及び複製における活性が、 保持されていれば、 アミノ酸の相同性は、 例 えば、 40〜90。/。であってもよい。
上記 G)〜(iii)の製法において使用する宿主 （形質転換体も含む） は、 各種ウイ ルス RNAが発現し得る細胞であれば、 特に限定はされず、 例えば、 培養された 哺乳動物又は鳥類の細胞や鶏卵などが挙げられる。 具体的に、 培養細胞としては、 例えば、 CHO、 293細胞、 B95a、 サル細胞 COS'7、 Vero、 マウス L細胞、 ラッ ト GH3、 ヒ ト FL細胞、 LLCMK2 , MDCK、 MDBE：、 CV- 1、 HeLaヽ HepG2、 P19、 F9、 PC1Z, BAF3、 Jurkat, ヒ ト PBMCN、 MT-4、 Molt-4、 NIH3T3、 L929、 Vero hSLAM , CHO/hSLAM, A549/hSLAM、 HeLa/hSLAM, 293T、
BHK及び二ヮトリ胚繊維芽細胞等を用いることができる。 また、、 Sf9細胞、 Sf21 細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
特に、 上記 (ii)及び (iii)の製法で使用する宿主は、 所定の形質転換体、 すなわち、 宿主ゲノムに N遺伝子、 P遺伝子及び L遺伝子が挿入されたもの、 又は、 これら 遺伝子が宿主ゲノムとは独立した DNA (プラスミ ド DNA等） として導入された ものである。 れら形質転換体は、 例えば、 電気穿孔法、 リポフエクション法、 ヒートショック法、 PEG法、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、 並び に、 DNAウィルスや RNAウィルス等の各種ウィルスを感染させる方法等により得 ることができる。 また、 当該宿主 （形質転換体） においては、 N遺伝子、 P遺伝 子及ぴ L遺伝子によりコードされる各タンパク質が、 宿主自体の転写 ·翻訳系に より発現されることが好ましい。
上記 (i)及び (ii)の製法において、 転写ユニットとしては、 例えば、 所定の DNA 依存性 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルス、 又は、 所定の DNA依存性 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNAなどが好ましい。 上記組換えヮ クシニアウィルスとしては、 臨床的に既に使用され安全性が認められている Lister株を親株として得られたものが特に好ましく用いられる。 宿主内への転写 ユニットの導入は、 上記ワクシニアウィルスを用いる場合は当該ウィルスを宿主 に感染させればよく、 また、 上記 DNAを用いる場合は当該 DNAを宿主内に導入 する力若,しくは宿主ゲノムに組込むようにすればよい。 組換えワクシニアウィル スを用いる場合は、 ウィルス感染による宿主細胞のアポトーシス誘導を効果的に 抑制して作業効率を高めるため、 カスパーゼ阻害剤を使用することができる。 以 上の転写ュニットの導入により、 所定の DNA依存性 RNAポリメラーゼが宿主内 に供給され、 （b)〜(e)の: DNAが転写され得る。 つまり、 （Tb)〜(e)の DNAにおける 鏺型 cDNAゃ各タンパク質遺伝子は、 上記所定の DNA依存性 RNAポリメラーゼ により特異的に認識されるプロモーターの下流に挿入され、 発現制御されている ことが好ましい。 上記 DNA依存性 RNAポリメラーゼとしては、 例えば、 T7 UNAポリメラーゼ、 T3 RNAポリメラーゼ、 RNAポリメラーゼ I、 RNAポリメラ ーゼ II、 及び RNAポリメラーゼ III等が好ましく用いられる。
本発明の製造方法としては、 上記 (i)〜(iii)の方法の中でも (i)の方法がより好ま しい。 特に、 麻疹ウィルス又はセンダイウィルスを材料.とする 換えウィルスべ クタ一の作製において上記 (i)の方法を用いた場合は、 再構成の効率を一層高める ことができる。
また、 本発明の製造方法で得られるウィルスベクターば、 他の細胞との共培養 等により選択的かつ効率的に増殖させることができる。 例えば、 麻疹ウィルスを 用いたウィルス'ベクターの場合、 本発明の製造方法で得られる培養細胞 （再構成 したウィルスベクターを含む細胞） を、 予め培養しておいた B95a細胞上に播き 共培養することにより、 ウィルスべクターが感染及び増殖した B95a細胞の巨細 胞を得ることができる。
2 . 組換えモノネガウィルスベクターの製造用キット - 本発明の組換えモノネガウィルスベクターの製造用キットは、 前述したウィル スベクターに含まれる分節ゲノム RNA又はその cRNAを転写し得る鍚型 cDNAを 含む DNA (好ましくはプラスミ ド DNA) 、 及ぴ、 DNAの転写ュニッ .トを含むも のである。 当該 DNA及び転写ユニッ トの詳細については、 前記 1 . における説 明が同様に適用できる。 また、 以下に記載する他の各構成要素についても同様で ある。
本発明のキットは、 モノネガウィルスの Nタンパク質遺伝子を含む DNA、 P タンパク.質遺伝子を含む DNA及ぴ Lタンパク質遺伝子を含む DNAをさらに含む ものであることが好ましい。
本発明のキットは、 モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及ぴ Lタ ンパク質を発現する宿主をさらに含む.ものであってもよい。 この場合、 上記の N タンパク質遺伝子を含む DNA、 Pタンパク質遺伝子を含む DNA及ぴ Lタンパク 質遺伝子を含む DNAの使用に代えることができる。
また本発明においては、 前述したウィルスベクターに含まれる分節ゲノム RNA又はその cRNAを含む、 組換えモノネガウィルスベクターの製造用キットも 包含される。 当該キットは、 モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及 ぴ Lタンパク質を発現する宿主をさらに含むものであってもよい。
3 . 外来性タンパク質の製造方法等 '
本発明のウィルスベクターを感染させた宿主に外来性タンパク質を発現させ、 発現したタンパク質を回収することにより、 外来性タンパク質を製造することが できる。 「外来性タンパク質」 とは、 ウィルスゲノム中に導入された遺伝子によ りコードされるタンパク質であって発現の目的となるタンパク質を意味する。 宿主として培養'細胞を用いた場合、 常法により、 その培養液から外来性タンパク 質を回収することができる。 また、 本発明のウィルスベクターを感染させた動物 にタンパク質を発現させ、 発現した外来性タンパク質を含む体液を回収すること もできる。 体液の回収方法としては、 感染動物及び体液の種類に応じて、 公知の 回収方法を用いればよく、 限定はされないが、 例えば、 全血を採取して、 遠心に より血球成分を取り除く方法などが挙げられる。
さらに、 本発明のウィルスベクターを動物に感染させ、 この動物から組織、 細 胞もしくは体液を採取することにより、 例えば、 抗血清を作製し又は抗体タンパ ク質を回収して、 治療や診断に応用することができる。 具体的には、 ウィルスや 細菌の病原性に関与するタンパク質遺伝子を挿入したウィルスベクターを、 宿主 となる動物に感染させて、 当該遺伝子がコードするタンパク質を発現させ、 その 後この動物から血清を得ることで、 上記タンパク質に対する抗体を含有する抗血 清を製造することができる。 得られた抗体 （抗血清） は、 ELISAや中和試験に 使用する.ことができる。 '
本発明のウィルスベクターを感染させる動物としては、 マウス、 ラット、 モル モッ ト、 ゥサギ、 プタ、 ィヌ、 フェレッ ト、 ネコ、 サル、 ヒッジ、 ゥシ及ぴゥマ 等のヒ トを除く哺乳類動物が好ましく挙げられ、 中でも、 マウス、 ラット及びモ ルモッ ト等の齧歯類 （ネズミ目） 動物がより好ましく、 特に好ましく.はマウスで ある。 採取する組織又は細胞としては脾臓又はリンパ節など、 採取する体液とし ては血液、 リンパ液及び髄液等が挙げられる。 以下に、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。 ，
〔実施例 1〕 ウィルスベクターの作製 、
1 . 分節ゲノム型組換え麻疹ウィルスベクターの作製
1.1 作製方法の概要 （図 7参照）
まず、 分節ゲノムの各々をコードするプラスミ ド DNA 1、 並びに麻疹ウィル スウィルスの Nタンパク質 6 (ヌクレオキヤプシド） を発現し得るプラスミ ド DNA 2、 Pタンパク質 7 (RNA依存性 RNAポリメラ一ゼの小サブュニット） を 発現し得るプラスミ ド DNA 3、 及び Lタンパク質 8 (RNA依存性 RNAポリメラ 一ゼの大サブユニット） を発現し得るプラスミ ド DNA4をそれぞれ構築し、 こ れらを CHO/hSLAM細胞 15へ導入した （DNAの発現は、 T7プロモーターで制御 されている） 。 併せて、 T7 RNAポリメラーゼ （DNA依存性 RNAポリメラーゼ ) 14を発現するワクシニアウィルス 13 (VTF7-3株） を感染させ、 T7 RNAポリ メラーゼ 14を CHO/hSLAM細胞内に供給した。 これにより、 分節ゲノム 5にヌ クレオキヤプシド （N) 及びポリメーラーゼ （P, L) が結合して、 RNP複合体 9 が形成された。 その後、 RNP複合体 9に含まれる分節ゲノム中の M遺伝子、 F 遺伝子及び H遺伝子から Mタンパク質 10、 Fタンパク質 11及び Hタンパク質 12 が発現され、 Mタンパク質 10は、 CHO hSLAM細胞膜の一部を利用してウィル ス粒子の膜構造を形成し、 Fタンパク質 11及び Hタンパク質 12は、 ウィルス粒 子の膜構造の外側表面に提示された。 ごれとともに、 RNP複合体 9が上記膜構 造に内包されてウィルス粒子となり細胞外へ放出された。
なお、 CHO/hSLAM細胞のヮクシニアウィルスによる細胞死 (apoptosis)を阻 止してウィルスベクターの作製効率を向上させるため、 カスパーゼ阻害剤を添加 した。 ワクシニアウィルスは、 CHO/hSLAM細胞内で abortive infectionを起こ し増殖できないため、 容易にウィルスベクターだけを得ることができた。
1.2 麻疹ウィルスゲノム由来 cDNAの作製
ベクタ一の分節化を麻疹ウィルスの系で実施するにあたって、 すでに構築が完 了した公知のプラスミド p(+)MV323 (Takeda M， et. al., Recovery of pathogenic measles virus from cloned cDNA., J. Virol., 2000 Jul;74(14):6643_7.)を基礎に 用いた。 p(+)MV323 は、 麻疹ウィルスの野生型株 （IC-B株） のゲノム （(一)鎖 ENA) の完全な長さ （15,894塩基） の cDNAをコードしてい プラスミドであ り、 その麻疹ウィルスゲノム cDNA (15，894塩基） の上流末端には、 T7プロモ 一ター配列が、 下流末端にはリボザィム配列を配置してある。 そのため、 T7 RNAポリメラーゼが、 T7 プロモーターに結合して、 ； RNA合成を開始し、 麻疹 ウィルスの cDNA領域 （15,894塩基） から完全長の麻疹ウィルス RNAゲノム ( 15，894塩基） を合成することができる。 下流末端に配置されたリボザィム配 列によって、 合成された麻疹ウィルス RNA ゲノムの下流末端が、 正確に 15，894塩基で切断される。 p(+)MV323 の構造や、 この合成された RNAゲノム から、 感染性を持つた麻疹ウィルス粒子が合成できることは、 既に知られている (Takeda M， et. al., Recovery of pathogenic measles virus irom cloned cDNA., J. Virol., 2000 Jul;74(l4):6643-7.)0 麻疹ウィルス （IC_B株） のゲノム塩基配列情 報 （配列番号 1 ) は、 例えば、 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) に 「ァク 'セッション番号： NC_001498」 として公表されている。
1.3 2分節ゲノム型麻疹ウィルスベクターの再構成
2分節ゲノム型ベクターとして、 N遺伝子、 ： P遺伝子、 M遺伝子、 F遺伝子 及びマーカー遺伝子としての： DsRed遺伝子を搭載した MV_DsRed-NPMF、 並 びに H遺伝子、 L遺伝子及びマーカー遺伝子としての EGFP遺伝子を搭載した MV-EGFP-HLの 2分節化を試みた （図 8 )·。 2分節ゲノム型ベクターの再構成 用の cDNAをそれぞれ p(+)MV-DsRed-NPMF及び p(+)MV-EGFP_HL と呼び、 使用する。
1.3.1 p(+)MV-DsRed-NPMFの構築
構築スキームを （図 36) に示す。 対照ウィルスベクター用完全長ゲノムブラ スミド p(+)MV323-DsRed (下記 1.5を参照)を基礎に用いて構築した。
p(+)MV323-DsRedを制限酵素 Padと Clalで切断して、 Hタンパク質のコー ド領域のすべて、 及び Lタンパク質のコード領域の大半を切り出した。
一方、 下記の 2本の合成一本鎖 DNA：
5'-taaaacttagggtgcaagatcatccacaatgtgataat-3' (酉己.列番号 2 )
5'-cgattatcacattgtggatgatcttgcaccctaagttttaat-3' (gd歹 !J番号 3 j
をそれぞれ 0.3 μξずつ、 dH20内で混合し、 95°Cで 10分加熱後、 50°Cで 10 分間ァニール反応を行うことによって Padと Clalに対応する突出末端を持つ 二重鎖 DNAを合成し、 それを上記の切り出し部に、 公知の遺伝子組換え技術で 組み込むことによって構築した。 短い合成二重鎖 DNAが挿入された部位は、 新 たな遺伝子挿人部位として機能するように合成二重鎖の配列を調整してある （図 10の Emp-1に相当する） 。
1.3.2 p(+)MV-EGFP-HLの構築
構築スキームを （図 37) に示す。 対照ウィルスベクター用完全長ゲノムブラ スミド p(+)MV323_EGFP (下記 1.5を参照)を基礎に用いて構築した。 p(+)MV323- EGFPを制限酵素 BstBIと Paclで切断して、 Nタンパク質、 Pタンパク質、 Mタ ンパク質及び Fタンパク質のコード領域のすべてを切り出した。
-一方、 下記の 2本の合成一本鎖 DNA :
5'-cgaacgagatggccaacgatatcggtagttaat-3' (酉己歹 (J畨^" 4 )
5，-taactaccgatatcgttggccatctcgtt-3， (酉己歹 IJ番"^ 5 )
をそれぞれ 0.3 μ§ずつ、 dH20内で混合し、 95°Cで 10分加熱後、 50°Cで 10分間ァ ニール反応を行うことによつて BstBIと Paclに対応する突出末端を持つた二重鎖 DNAを合成し、 それを上記の切り出し部に； 公知の遺伝子組換え技術で組み込 むことによって構築した。 短い合成二重鎖 DNAが揷入された部位は、 新たな遺 伝子挿入部位として機能するように合成二重鎖の配列を調整してある （図 10の Emp-2に相当する） 。
1.3.3 pCAG-T7-IC-N、 pCAG-T7-IC-PAC及び pGEMCR_9301B-Lの構築 上記プラスミドから感染性をもつウィルス （ウィルスベクター） を再構成する ためには、 N タンパク質、 P タンパク質及ぴ L タンパク質をそれぞれ発現する 3種のプラスミ ドが必要である。 これらのプラスミ ドは、 公知の pCAG-T7-IC- N、 pCAG-T7-IC-PAC及び pGEMCR-9301B-Lを利用した （Take da M， et. al.， Efficient rescue of measles virus from cloned cDNA using SLAM- expressing Chinese hamster ovary cells., Virus Res., 2005 Mar; 108(1-2): Ϊ61-5.) 。
pCAG-T7-IC-N及ぴ pCAG-T7-IC-PACは、 その骨格に pCAGGSプラスミ ド (Niwa, H. et. al.， 1991, Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector., Gene, 108, 193-199.) を持ち、 公知の遺伝子組 換え技術で、 T7プロモーター配列とその下流に、 pCAG-T7-IC-Nでは Nタンパ ク質のコード塩基配列が挿入され、 pCAG-T7-IC-PAC では P タンパク質のコー ド塩基配列が挿入されている。
PGEMCR-9301B-L は、 pGEM-3Z (プロメガ社） プラスミ ドを骨格に持ち、 PGEM-3Z内部の T7 プロモーターの下流に、 L タンパク質のコード塩基配列が 揷入されている。 1.3.4 ワクシニアウィルス vTF7-3株
上記 1.3.1〜： 1.3.3に記載の 5種のプラスミ ドから、 麻疹ウィルスベクターの 2 つの分節ゲノム （RNAゲノム） 、 並びに Nタンパク質、 Pタンパク質及ぴ Lタ ンパク質をコードする mRNA を合成するために、 組換えワクシニアウィルス vTF7-3株を用いた。 vTF7-3株は、 T7 RNAポリメラーゼを発現する公知の組 換えワクシニアウイノレスであり（Fuerst TR, et. al.， Eukaryotic transient- expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase., Prbc. Natl. Acad. Sci. U S A.， 1986 Nov;83(21):8122-6.)、 様々な研究用途に応用されているものである。 1.3.5 宿主細胞の準備
(1) 常法により、 直径 10 (^1培養皿に適度に密に生育させた0110/118]^]\1細胞 を用意した。
(2) 上記生育後の CHO/hSLAM細胞を、 複数枚の 6穴培養プレートに播種した。 培養液としては、 7.5%の胎児牛血清入 RPMI培養液を用いた。 (3) 37°Cで 6時間、 CHO/hSLAM細胞の培養を行った。
1.3.6 ワクシニアウィルスの感染
(1) 2.5 X 106 PFU/mlに感染価を調整した vTF7_3株のウイルス'液を用意した。 (2) 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞の培養液を取り除き、 ウィルス液を 240 μΐ/wellずつ加えた。
(3) 37°Cで 1時間培養し、 感染させた。
1.3.7 プラスミ ド DNAの導入
(1) p(+)MV-DsRed-NPMF (2.5 g)及ぴ p(+)MV-EGFP-HL(2.5 g)、 並びに pCAG-T7-IC-N (l g)、 pCAG-T7-IC-PAC (ΐ.δμ^)及び pGEMCR-9301B-Lの各 プラスミドをポリスチレンチューブに入れ混和して用いた。
(2) 上記チューブに、 200 μΐ の Opti-MEM培養液 （インビトロジヱン社） を 加えて混和した。
(3) 別のポリスチレンチューブに、 7μ1 の Lipofectamine 2000 試薬 （インビ ト口ジヱン社） 及び 200μ1の Opti-MEM培養液を入れて混和した。
- (4) 上記 (2)により得た混和液と上記 (3)により得た混和液とを混和し、 室温で 20分放置した。 .
(5) 6穴培養プレートのウィルス液を CHO/hSLAM細胞から取り除いた （前記 1.3.6(3)の培養終了後） 。
(6) 次いで、 カスパーゼ阻害剤 （z-Asp-CH2-DCB、 ペプチド研究所） を 50 g/mlの濃度で添加した Opti-MEM培養液 2 inlを、 6穴培養プレートの
CHO/hSLAM細胞の各穴に添カ卩した。
(7) 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞の各穴に、 上記 (4)により得た混和 液を滴下した。
(8) 37°Cで 18時間培養し、 宿主への各プラスミドの導入、 及び麻疹ウィルス粒 子 （麻疹ウィルスベクター） の再構成を行った。
1.3.8 B95a細胞との共培養 (1) 直径 10 cmの培養皿に約 60%程度の密度に均一に培養された B95a細胞を用 意した。
(2)前記 1.3.7 (8)の培養後の CHO/hSLAM細胞をトリプシン液で剥がして上記 (1)の B95a細胞上に播種し、 37°Cで共培養を行った。
(3) 共培養後、 約 30時間以内に、 再構成及び増殖された麻疹ウィルスが感染し た巨細胞が多数観察された。 通常、 VTF7-3株の排除は、 再構成されたウィルス粒子 （ウィルスベクター） を B95a細胞で ^殖させた後に、 プラークアイソレーションすることや、 ウィル ス液の限界希釈によって容易に行うことができるが、 ワクシニアウィルスの中和 抗体を用いることで、 さらに容易に行うことができる。
1.3.9 再構成したウィルスベクター
再構成した 2分節ゲノム型麻疹ウィルスベクターの各分節ゲノムの構造模式図 を図 8及ぴ図 10に示す。 1分節目 （図 8 (A)) には、 ウィルス遺伝子の H遺伝子 及び L遺伝子に加え、 外来遺伝子の EGFP遺伝子が挿入されている。 2分節目 （ 図 8 (B)) には、 ウィルス遺伝子の N遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子及び F遺伝子に 加え、 外来遺伝子の DsRed遺伝子が挿入されている。 外来遺伝子を高発現させ るために、 挿入部位は各々の分節ゲノムの最上流に設置した。 また、 空の遺伝子 ユニットが、.各々の分節ゲノムにもう 1箇所ずつ用意されており （矢印部分参照 ) 、 この遺伝子ユニットに、 さらに外来遺伝子を挿入することが可能である。 す なわち、 合計 4つの外来遺伝子の挿入が可能である 2分節ゲノム型麻疹ウィルス ベクターを作製することができた。 1.4 3分節ゲノム型麻疹ウィルスベクターの再構成
3分節ゲノム型ベクターとして、 N遺伝子及ぴ P遺伝子とマーカー遺伝子とし ての Lac Z遺伝子とを搭載した MV-LacZ-NP、 M遺伝子及び F遺伝子とマーカー 遺伝子としての DsRed遺伝子とを搭載した MV-DsRed-MF、 並びに H遺伝子及び L遺伝子とマーカー遺伝子としての EGFP遺伝子とを搭載した MV-EGFP-HLの 3分節化を試みた （図 9 ) 。 3分節ゲノム型ベクターの再構成用の cDNAをそれ ぞれ p(+)MV-LacZ-NP、 P(+)MV-DsRed-M;F及び p(+)MV_EGFP-HLと呼び、 使 用した。 そのうち p(+)MV-EGFP-HLは、 2分節ゲノム型及び 3分節ゲノム型べ クタ一の両者の再構成に共通に使用する。
1.4.1 p (+) MV-LacZ-NPの構築
構築スキームを （図 38) に示す。 対照ウィルスベクター用完全長ゲノムブラ スミド p(+)MV323-lacZ (下記 1.5を参照)を基礎に用いて構築した。 p(+)MV323- lacZを制限酵 Sailと Pmllで切断して、 Mタンパク質、 Fタンパク質及ぴ H タンパク質のコード領域のすべて、 及び Lタンパク質のコード領域の大半を切 り出した。
—方、 下記の 2本の合成一本鎖 DNA：
5'-tcgacctaattagtggcccgaa^tcac-3 (酉己歹 IJ番号 6 j
5'-gtgacttcgggccactaattagg-3' (酉己歹 U番号 7 )
をそれぞれ 0.3 μ ずつ、 dH20内で混合し、 95°Cで 10分加熱後、 50°Cで 10 分間ァニール反応を行うことによって Sailと Pmllに対応する突出末端を持つ た二重鎖 DNAを合成し、 それを上記の切り出し部に、 公知の遺伝子組換え技術 で組み込むことによって構築した。 1.4.2 p(+)MV-DsRed-MFの構築
構築スキームを （図 39) に示す。 上記の分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター 用 p(+)MV-Ds: ed-NPMFH (上記 1.3を参照)を基礎に用いて構築した。 p(+)MV- DsRed-NPMFHを制限酵素 Blplで切断して、 Nタンパク質及ぴ Pタンパク質 のコード領域のほとんどすべてを切り出した。
—方、 下記の 2本の合成一本鎖 DNA：
5'-ttagcatagttctaatgaaacaagc-3' (酉 S歹 U香号 8 )
5'-tgagcttgtttcattagaactatgc-3' (酉己歹 II番号 9 )
をそれぞれ 0.3 ずつ、 dH2O内で混合し、 95°Cで 10分加熱後、 50°Cで 10 分間ァニール反応を行うことによって Blplに相当する突出末端を持った二重鎖 DNAを合成し、 それを上記の切り出し部に、 公知の遺伝子組換え技術で組み込 むことによって構築した。 短い合成二重鎖 DNAが挿入された部位は、 新たな遺 伝子挿入部位として機能するように合成二重鎖の配列を調整してある （図 10の Emp-3に相当する） 。
1.4.3 再構成方法
3分節ゲノム型ウィルスベクターの再構成方法は、 前述した 2分節ゲノム型ゥ ィルスべクタ一の再構成方法において、 p(+)MV-DsRed-NPMF及ぴ p(+)MV- EGFP-HLの代わ り に p(+)MV-lacZ-NP、 p (+) MV-DsRed-MF及び p(+)MV- EGFP-HLを使用したこと以外は、 同様に行った。 なお、 p(+)MV-lacZ-NP、 p(+)MV-DsRed-MF及び p(+)MV-EOFP-HLの使用量は、 それぞれ 2 とした。
1.4.4 再構成したウィルスベクター
再構成した 3分節ゲノム型麻疹ウィルスベクターの各分節ゲノムの構造模式図 を図 9及び図 10に示す。 1分節目 （図 9 (A)) には、 ウィルス遺伝子の Η遺伝子 と L遺伝子に加え、 外来遺伝子の EGFP遺^ (云子が挿入されている。 2分節目 （図 9 (B) ) には、 ウィルス遺伝子の Μ遺伝子と F遺伝子に加え、 外来遺伝子の DsRed遺伝子が挿入されている。 3分節目 （図 9 (C)) には、 ウィルス遺伝子の Nと Pに加えて外来遺伝子の LacZ遺伝子が挿入されている。 外来遺伝子を高発現 させるために、 挿入部位は各々の分節ゲノムの最上流に設置した。 また、 空の遺 伝子ユニットが、 1分節目には 1箇所、 — 2分節目に 2箇所用意されており （矢印 部分参照） 、 さらに外来遺伝子の挿入が可能である。 すなわち、 3分節ゲノム型 麻疹ウィルスベクターには、 合計 6つの外来遺伝子の挿入が可能である。 1.5 対照ウィルスベクターの再構成
比較対照として、 外来遺伝子を挿入した 3種の非分節ゲノム型麻疹ウィルスべ クタ一 （IC323-lacZ、 IC323-DsRed, IC323-EGFP) を作製した （図 5， 図 10 参照） 。 具体的には、 野生型の麻疹ウィルス （IC323株） のゲノムに LacZ遺伝 子、 DsRed遺伝子、 又は EGFP遺伝子が揷入された組換えゲノムを有するウィル スベクターである。 外来遺伝子を高発現させるため、 挿入部位はいずれもゲノム の最上流に設置した。
1.5.1 IC323-EGFPを再構成するためのプラスミド DNA
IC323-EGFP を再構成するためのプラスミ ド DNA として、 p(+)MV323- EGFPを利用した (Hashimoto K, et. al.， SLAM (CD 150) -in dependent measles virus entry as revealed by recombinant virus expressing green fluorescent protein., J. Virol., 2002 Jul;76(l3)"6743-9.) 。 p(+)MV323-EGFP は 、 p (+) MV323 の麻疹ウィルスのゲノム cDNA領域内の T7プロモーター側の最上 流側に麻疹ウィルスの遺伝子の転写開始配列と転写終結配列、 そして Ascl及び Aatll の 2つの制限酵素認識配列を公知の遺伝子糸且換え技術にて挿入し、 さらに その制限酵素認識配列を利用して、 その間に、 EGFP タンパク質のコード配列 を挿入したプラスミドである （図 10を参照） 。 この p(+)MV323-EGKPから得 られる麻疹ウィルスを IC323-EGP とよび、 そのウィルスは、 IC-B株と同じ遺 伝子構造をもつ p(+)MV323 から得られる IC323 と、 EGFP を発現すること以 外は、 同じ表現型を有している（Hashimoto K, et. al., SLAM (CD 150)- in de endent measles virus entry as revealed by recombinant virus expressing green fluorescent protein., J. Virol., 2002 Jul;76(13):6743'9.)。 1.5.2 IC323-lacZを再構成するためのプラスミ ド DNA
IC323-lacZ を再構成するためのブラ ミ ド DNA として、 p(+)MV323_LacZ を禾 lj用レた (Takeda M， et. al., Efficient rescue of measles virus from cloned cDNA using SLAM-expressing Chinese hamster ovary cells., Virus Res., 2005 Mar; 108(l-2):161-5.)。 (+) MV323-LacZは、 p(+)MV323-EGFTの EGFP遺伝 子のコード領域 （Open reading frame [ORF]) の開始コドン、 終止コドンの内 部配列のみを EGFP翻訳配列から LacZ ( /3ガラクトシダーゼ） 翻訳配列に公知 の遺伝子組換え技術で置換えたプラスミ ドである。 この p(+)MV323-LacZ から 得られる麻疹ウィルスを IC323-LacZ とよび、 そのウィルスは、 IOB株と同じ 遺伝子構造をもつ p(+)MV323から得られる IC323と、 βガラクトシダーゼを発 現すること、 增殖能力が低下していること以外は、 同じ表現型を有している
1.5.3 IC323-DsRedを再構成するためのプラスミ ド DNA
IC323-DsRedを再構成するためのプラスミ ド DNAとして、 p(+)MV323_DsRed を用いた。 p(+)MV323-DsRedは、 上記 p(+)MV323-LacZと同様の方法で構築す ることができ、 p(+)MV323-EGFPの EGFP遺伝子のコード領域 （ORF) の開始 コドン、 終止コ ドンの内部配列のみを EGFP翻訳配列から： DsRed翻訳配列に公知 の遺伝子組換え技術で置換えたプラスミ ドである。 この p(+)MV323-DsRedから 得られる麻疹ウィルスを IC323-DsRedとよび、 そのウィルスは、 IC-B株と同じ 遺伝子構造をもつ p(+)MV323から得られる IC323と、 DsRedを発現すること、 増 殖能力が低下していること以外は、 同じ表現型を有している。 p (+) MV323-EGFP、 p (+) MV323-DsRed、 p(+)MV323-lacZ力 らの IC323- EGFP, IC323-DsRed、 IC323¾cZの再構成方法は、 前述した 2分節ゲノム型 ウィルスベクターの再構成方法において、 p(+)MV-DsRed-NPMF及び p(+)MV- EGFP-HLの代わりに p(+)MV323_EGFP、 p(+)MV323-DsRed及ぴ p(+)MV323- lacZを使用したこと以外は、 同様に行った。 なお、 p(+)MV323-EGFP、 p(+)MV323-DsRed及び p(+)MV323-lacZの使用量は、 それぞれ 5 とした。 1.6 外来性遺伝子の追加挿入
3分節ゲノム型ウィルスベクターの分節、 MV-DsRed-MFへの外来性遺伝子の 追加挿入,を行った。
1.6.1 p (+) MV-DsRed-CAT-MF の構築 ： Emp-3 への Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)遺伝子の揷入
下記の合成一本鎖 DNA：
S'-agttcgaagctaaaatggagaaaaaaatc-S' (酉己歹 !j畨"^ 1 0 )
5，-cggctgagcttacgccccgccctgccact-3， (酉己歹 (J番号 1 1 )
をプライマーとして使用し、 pl07MV (-)： CAT プラスミ ド (Sidhu MS, et. al., Rescue of synthetic measles virus minireplicons: measles genomic termini direct efficient expression and propagation of a reporter gene., Virology, 1995 Apr 20;208(2):800-7.)を铸型にして公知の核酸増幅技術 （PCR) に従って、 CAT 遺伝子のコード配列とその両末端に BstBI と Blpl 制限酵素認識配列をもつ DNA断片を得た。 この DNA断片を公知の遺伝子組換え技術によって p(+)MV- DsRed-MFプラスミドの Emp-3内部の BstBIと Blpl制限酵素認識配列部へ揷 入することにより、 p(+)MV-DsRed-CAT-MFプラスミドを得た （図 40) 。
上記 PCRの反応液組成及び反応条件は、 次の通りである。 ぐ反応液組成 >
錄型 DNA (1.0 μ^μΏ ： 1 μΐ^
KOD plus polymerase： 1 unit
Fプライマー (ΙΟΟμΜ)： 0.5 μL
Rプライマー (ΙΟΟμΜ)： 0.5
dNTP(2.5mM each)： 10
lOxBuffer： 10
25mM MgS04
滅菌水： 73
A pきT· · · 100 μL
<反応条件 >
「94°Cで 15秒間の熱変性 ·解離→55°Cで 30秒間のァニーリング→68°C で 2分間の合成 ·伸長」 を 1サイクルとするサイクル条件で、 計 20サイ クル。 ' 1.6.2 p (+) MV-DsRed-CAT-MF-SEAP の構築 ： Emp-1 への Secreted alkaline phosphatase (SEAP)遺伝子の挿入
下記の合成一本鎖 DNA：
5'-gattaattaaaacttagggtgcaagatcacgcgaattcgcccaccatgc-3' (酉己歹 U番号 1 2 ) 5'-atagcgcttcatgtctgctcgaagcggc-3' (酉己歹 IJ畨号 1 3 )
をプライマーとして使用し、 pSEAP-control プラスミ ド （クローンテック社） を铸型にして公知の核酸増幅技術 （PCR) に従って、 SEAP 遺伝子のコード配 列とその両末端に Padと Eco47III制限酵素認識配列をもつ DNA断片を得た。 この DNA断片を公知の遺伝子組換え技術によって p(+)MV-DsRed-CAT-MFプ ラスミ ドの Emp-1内部の Padと Eco47III制限酵素認識配列部へ挿入すること により、 p(+)MV-DsRed-CAT-MF-SEAPプラスミドを得た （図 41) 。
なお、 上記 PCRの反応液組成及び反応条件は、 1.6.1と同様にして行った。 1.6.3 再構成方法
これら p(+)MV-DsRed-CAT-MF又は p(+)MV-DsRed_CAT-MF-SEAPを用いて の 3分節ゲノム型ウィルスベクターの再構成方法は、 前述した 3分節ゲノム型ゥ ィルスべクタ一の再構成方法において、 p(+)MV-DsRed-MFの代わりに p(+)MV- DsRed-CAT-MF又は p(+)MV-DsRed-CAT-MF-SEAPを使用したこと以外は、 同 様に行った。 なお、 p(+)MV-DsRed-CAT-MF及び p(+)MV-DsHed-CAT-MF- SEAPの使用量は、 いずれも 2 とした。
2 . 外来遺伝子の発現
2.1 2分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター （図 11参照）
再構成された 2分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター （以下、 「2 seg-MeV」 と いう） は、 宿主 CHO細胞において、 EGFP (緑色、 図 11Aのパネル） 及ぴ DsRed (赤色、 図 11Bのパネル） の蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖しているこ とが、 蛍光顕微鏡下で認められた。 なお、 図 11Cのパネルは、 図 11Aのパネルと 図 11Bのパネルを重ね合わせて表示したものであり、 図 11Dのパネルはウィルス 細胞そのもの （励起光未照射） の写真である。
2.2 3,分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター （図 12、 13参照）
2.2.1 p (+) MV-LacZ-NP , p(+)MV-DsRed-MF及び p(+)MV_EGFP-HLで再 構成された 3分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター
当該ウィルスベクター （以下、 「3 seg-MeV」 という） は、 宿主 B95a細胞に おいて、 EGFP (緑色、 図 12Aのパネル） 及び DsRed (赤色、 図 12Bのパネル） の蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖していることが、 蛍光顕微鏡下で認め られた。 なお、 図 12Cのパネルは、 図 12Aのパネルと図 12Bのパネルを重ね合わ せて表示したものであり、 図 12Dのパネルはウィルス細胞そのもの （励起光未照 射） の写真である。 また、 上記蛍光に加えて、 lacZ遺伝子にコードされている ガラクトシダーゼが発現していることも認められた （図 13Bのパネル、 図 13Aの パネル (拡大)） 。 2.2.2 ρ (+) MV-LacZ-NP, p(+)MV-DsRed-CAT-MF及び p(+)MV-EGFP-HL で再構成された 3分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター
当該ウィルスベクター （以下、 「3 seg-MeV-CAT」 という） は、 宿主 Vero/hSLAM細胞において、 EGFP (緑色、 図 42Aのパネル） 及び DsRed (赤色、 図 42Bのパネル ί の蛍光を発する巨細胞を形成しながら増殖していることが、 蛍 光顕微鏡下で認められた。 なお、 図 42Cのパネルは、 図 42Αのパネルと図 42Βの パネルを重ね合わせて表示したものであり、 ウィルス細胞そのもの （励起光未照 射） の写真である。 また、 上記蛍光に加えて、 lacZ遺伝子にコードされている ;3 ガラクトシダーゼが発現していることも認められた。 それらに加えて、 3 seg- MeV-CATを感染させた宿主 Vero/hSLAM細胞を経時的に採取して CAT活性を解 析したところ、 CAT活性の経時的な増加が確認できた （図 42C) 。
- 2.2.3 p (+) MV-LacZ-NP , p(+)MV-DsRed-CAT-MF-SEAP及び p(+)MV_ EGFP-HLで再構成された 3分節ゲノム型麻疹ウィルスべクター
当該ウィルスベクター （以下、 「3 seg-MeV-CAT-SEAP」 という） は、 宿主 Vero/hSLAM細胞において、 EGFP及ぴ DsRedの蛍光を発する巨細胞を形成しな がら増殖していることが、 蛍光顕微鏡下—で認められた。 また、 上記蛍光に加えて、 lacZ遺伝子にコードされている ]3ガラクトシダーゼが発現していることも認めら れた。 それらに加えて、 3 seg-MeV-CAT-SEAPを感染させた宿主 Vero/hSLAM 細胞を経時的に採取して CAT活性及び SEAP活性を解析したところ、 CAT活性 （ 図 43A) 及ぴ SEAP活性 （図 43B) の経時的な増加が確認できた。
3 . ウィルス複製能
2 seg-MeVが、 野生型麻疹ウィルス (IC323株）と同程度の増殖能を維持してい ることが認められた （図 14参照） 。 3 seg-MeVは、 感染後 24時間までは、 野生型麻疹ウィルス (IC323株）と同程度 に増殖することが認められた。 また、 LacZ遺伝子を有する非分節ゲノム型麻疹 ウィルスベクター (IC323-lacZ)と比較すると、 感染後 24時間の時点で約 50倍量の ウィルスを生産していることが認められた （図 14参照） ·。 '
これらの結果から、 2 seg-MeV及び 3 seg-MeVは高い増殖性を維持した麻疹ゥ ィルスべクタ一であることが確認された。
4 . プラーク形成能
4.1 プラーク形成能 （図 15参照）
2 seg-MeV及び 3 seg-MeVは、 いずれも、 野生型麻疹ウィルス (IC323株）と同 様にプラーク形成能を保持していることが認められた。 なお、 各プラークが 1つ の粒子に由来するであろうことは、 希釈系列とプラークの数との linealityにより 確認されている。 4.2 プラークにおける jSガラクトシダーゼの発現 （図 16参照）
3 seg-MeVのプラークが、 j3ガラクトシダーゼを高発現していることが認めら れた。 '
野生型麻疹ウィルス (IC323株)及ぴ 2 seg-MeVのプラークでは、 j3ガラク トシ ダーゼの発現は認められなかった。
4.3 プラークにおける蛍光の発現 （図 17参照）
2 se ] VTeV及ぴ 3 seg-MeVは、 いずれも、 · 2色 （赤色、緑色） の蛍光を発する プラークを形成していることが認められた （図 17 A〜D) 。 さらに、 3 seg-MeV は、 /3ガラク トシダーゼを発現していることが認められた （図 17 G) 。
また、 3 seg-MeVのプラークの周辺には、 緑色の蛍光と） 3ガラク トシダーゼの 発現は認められるが、 赤色の蛍光発現は認められない細胞が観察された。 これに ついて後述する （詳しくは、 4.3.2を参照） 。
4.3.1 2 seg-MeVについて （図 18参照) 通常、 ウィルスゲノムの転写、 すなわち遺伝子発現に必須のウィルスタンパク 質は、 ヌクレオキヤプシド (N)とポリメラーゼ (P, L)である。 2 seg-MeVでは、 遺 伝子発現に両分節が必ず必要なため （図 18(C)のパネル） 、 全ての巨細胞 （Hと F による） 力 2色の蛍光を発する。
4.3.2 3 seg-MeVについて （図 19参照）
一方、 3 seg-MeVでは、 前述したように、 lacZと をもつ 2分節のみでも 遺伝子発現が可能であることを示唆する結果が得ら^た。 これは、 3分節のゲノ ムを全て有していなくても、 図 19(B)のパネルに示すように 2分節のゲノムを有 していれば、 少なくともヌクレオキヤプシド （N) とポリメラーゼ （P， L) につ いては発現することができるためである。 このような、 3分節ゲノム型のウィル スベクターの複製時に生じ得る非増殖型のゥィルス粒子、 すなわち M遺伝子や F 遺伝子を持たないことにより伝播性や感染性を有しないウィルス粒子は、 安全性 の高いウィルスベクターの開発や、 タンパク質持続発現型ベクターの開発に応用 が可能である。
5 . 外来性タンパク質の発現解析
5.1 免疫沈降法を用いた解析 （図 20参照）
2 seg-MeVを感染させた Vero/hSLAM細胞及ぴ 3 seg-MeVを感染させた
Vero/hSLAM細胞における、 ウィルスタンパク質及び外来性タンパク質の発現 を、 免疫沈降法を用いて解析した。 ―
2 seg-MeV感染細胞では、 EGFPと DsDeiiを発現していることがことが認めら れ （図 20 左から 5レーン目「2 seg-MeVj ) 、 3 seg-MeV感染細胞では、 EGFP、 DsDedに加えて j3ガラク トシダーゼも発現していることが認められた （図 20 左 から 6レーン目「3 seg-MeV」） 。 しかも、 これら分節ゲノム型ウィルス感染細胞 におけるタンパク質 (外来性タンパク質及びウイルスタンパク質) 発現効率は、 非分節ゲノム型麻疹ウィルスべクタ一 (IC323-EGFP, IC323-DsRed, IC323-lacZ) の感染細胞よりも優れていることが確認された （図 20 右から 1レーン目「3 seg- MeV」、 2レーン目「2 seg-MeV」） 。 ' 5.2 ルミノメーターを用いた解析 （図 21参照）
3 seg-MeV等を感染ざせた Vero/hSLAM細胞における ガラタトシダーゼの発 現量を、 ルミノメーターを用いて定量した。 非分節ゲノム型麻疹ウィルスベクタ 一 IC323-lacZよりも、 3 seg-MeVの方が、 6倍以上発現効率が高いことが確認さ れた。
6 . 遺伝子発現量 (mRNA量)の解析 （図 22参照）
3 seg-MeVを 染させた Vero/hSLAM細胞における各遺伝子の発現量 (mRNA 量)を、 RT-定量 PCR法により定量し、 非分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター （ IC323-EGFP) の感染細胞における mRNA量と比較した。
その結果、 3 seg-MeV感染細胞での EGFP mRNA量は、 IC323-EGFP感染細 胞での EGFP mRNA量に対して約 50%程度であった。 しかしながら、 3 seg- MeV感染細胞でのウィルスタンパク質の mRNA量は、 3種の外来遺伝子の揷入： にも関わらず、 いずれも、 IC323-EGFP感染細胞でのウィルスタンパク質の mRNA量に対して 100%以上であることが確認された。
-以上の結果、 及ぴ前記 2 , 4 , 5での結果から、 2 seg-MeV及び 3 seg-MeVに より 2種及び 3種の外来性タンパクを高発現させ得ることが確認できた。
また、 3 seg-MeVの分節ゲノムには、 さらに 3つの外来遺伝子の追加挿入にも 対応し得る空の遺伝子ユエット （遺伝子挿入部位） が残されており、 3 seg-MeV は、 合計 6つもの外来遺伝子を挿入でき—る極めて有用なウィルスベクターである。 このうち,の 2つの揷入部位には、 それぞれ CATと SEAP遺伝子を挿入し、 発現さ れることを、 前記 1.6の外来性遺伝子の追加挿入の項目で示した。 〔実施例 2〕 分節ゲノム型組換え麻疹ウィルスベクターの安定性
本実施例では、 分節ゲノム型組換え麻疹ウィルスベクターが、 外来遺伝子の発 現を維持しつつ、 安定的に継代できるものであるかどうかを確認した。
実施例 1において作製した 3分節ゲノム型麻疹ウィルスベクター (3 seg-MeV) を、 約 0.01程度の低レ、 MOIで、 Vero/hSLAM細胞へ感染させた。 その後、 感染後の細胞変性効果 （CPE) を、 位相差顕微鏡又は蛍光顕微鏡で 毎日観察し、 CPEが顕著になった段階 （すなわちすでに十分量、 ウィルスが生 産され、 ウィルス合成量がピークに達し、 以後、 宿主細胞の死滅のためにウィル ス合成が減衰すると予想される段階） で、 細胞培養上清 （ウィルス液） を回収し、 再ぴ低い MOIで、 別の Vero/hSLAM細胞へ感染させた。
このような継代操作を 20回繰り返したときの細胞培養上清を新たな Vero/hSLAM細胞に感染させて、 外来遺伝子 （レポーター遺伝子） の発現を観 察した。 すなわち、 感染細胞における EGFP及び DsRedの蛍光を蛍光顕微鏡で観 察し、 併せて、 X-gal染色法により感染細胞を染色して 3 -ガラクトシダーゼの発 現を観察した。
観察の結果、 ウィルス感染により形成された多核巨細胞の全細胞数の 90%以 上において、 EGFP及び DsRedの両蛍光が検出され、 かつ /3 -ガラク トシダーゼ を発現していることが確認された。
以上の結果から、 3 seg-MeVが、 外来遺伝子の発現を維持しつつ、 安定的に継 代できるものであることが示された。 実施例 3〕 ワクシニアウィルス LO-T7- 1株を利用した麻疹ウィルスの再構成
1 . T7 RNAポリメラーゼ発現ワクシニアウィルス LO-T7-1株の利用
Lister株を親株とする、 T7 RNAポリメラーゼを発現.する組換えワクシニアゥ ィルス LO-T7- 1株は、 公知のものを使用した （Yasui K, et. al.， The native form and maturation process of hepatitis C virus core protein., J. Virol., 1998 Jul; 72(7)：6048-55. ； Kashiwakuma T, et. al., Detection of hepatitis C virus specific core protein in serum of patients by a sensitive fluorescence enzyme immunoassay (FEIA)., J. Immunol. Methods, 1996 Mar 28; 190(l):79-89.) 。
2 . 麻疹ウィルスゲノム cDNAを含むプラスミ ド DNA p(+)MV323の構築
野生型麻疹ウィルス (IC-B株)から、 常法により、 ゲノム RNAを抽出し、 下記 に示す条件で逆転写反応を行い、 全長ゲノムの cDNA を持つプラスミ ド p (+) MV323を作製した。 逆転写反応の反応液組成及び反応条件は、 次の通りである,
<反応液組成 >
铸型 RNA(1.0 μ^μθ： 5 μϋι
逆転写酵素 Superscriptll 1 unit
プライマー (10 μΜ)： 0.5 μL·
dNTP(2.5mM each)： 4 μ∑
RNase Inhibitor： 1 unit
5X First strand buffer： 4 μ
0.1M DTT 2
滅菌水：- 適量 (約 2.5 L)
Αき + 20 HL
<反応条件 >
「42°Cで 60分間 （cDNA合成) >65°Cで 15分間 （酵素失活)
→4 °Cで保存 （冷却） 」 p(+)MV323から再構成されたウィルス （13個の同義置換 「アミノ酸置換を伴 わない塩基置換」 を除き親株の IC-B 株と同じゲノム構造と有している） を IC323と呼ぶ。 p(+)MV323の構築は、 すでに完了している （Takeda M, et. al., Recovery of pathogenic measles virus from cloned cDNA., d. Virol. , 2000 juL74(l4):6643-7.)0 p(+)MV323 は、 麻疹ウィルスの野生型株 （IC-B株） のゲ ノム （(一)鎖 RNA) の完全な長さ （15,894塩基） の cDNAをコードしているプ ラスミ ドであり、 その麻疹ウィルスゲノム cDNA (15,894塩基） の上流末端に は、 T7 プロモーター配列が、 下流末端にはリボザィム配列が配置されている。 そのため、 T7 RNAポリメラーゼが、 T7プロモーターに結合して、 RNA合成を 開始し、 '麻疹ウィルスの cDNA領域 （15，894塩基） から完全長の麻疹ウィルス RNAゲノム （15，894塩基） を合成することができる。 下流末端に配置されたリ ボザィム配列によって、 合成された麻疹ウィルス RNAゲノムの下流末端が、 正 確に 15,894塩基で切断される。 p(+)MV323の構造や、 この合成された RNAゲ ノムから、 感染性を持った麻疹ウィルス粒子が合成できることは公知である (Takeda M, et. al., Recovery of pathogenic measles virus from cloned cDNA., J. Virol" 2000 Jul;74(14):6643-7.)。 麻疹ウィル （IC-B株） のゲノム塩基配列情 報 （配列番号 1 ) は、 例えば、 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
「ァクセッション番号： NC_001498」 として公表されている。
3 . 麻疹ウィルスの再構成
3.1 宿主細胞の準備
(1) 常法により、 直径 10 cm培養皿に適度に密に生育させた CHO/hSLAM細胞 を用意した。
(2) 上記生育後の CHO/hSLAM細胞を、 6穴培養プレート一枚に播種した。 培 養液としては、 7.5%の胎児牛血清入 RPMI培養液を用いた。
(3) 37°Cで 6時間、 CHO/hSLAM細胞の培養を行った。
3.2 ワクシニアウィルスの感染
(1) 2.5 X 106 PFU/mlに感染価を調整した LO-T7-1株ウィルス液を用意した。
(2) 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞の培養液を取り除き、 各穴に上記ゥ ィルス液を 240 μΐ加えた。
(3) 37°Cで 1時間培養し、 LO-T7-1株を感染させた。
3.3 各種プラスミド DNAの導入、 及ぴウィルス粒子の再構成
(1) p (+) MV323 (5μ^、 並びに実施例 1で構築した pCAG-T7-IC_N (1μ )、 pCAG-T7-IG-PAC (ΐ.5μ¾) 及び pGEMCR-9301B-L (Ιμ^)の各プラスミド溶液を、 それぞれ所定の DNA量となるようにポリ—スチレンチューブに入れて混和した。
(2) 上記チューブに、 200 μΐ の Opti-MEM培養液 （インビトロジェン社） を 加えて混和した。
(3) 別のポリスチレンチューブに、 7μ1 の Lipofectamine 2000試薬 （インビ トロジェン社） 及ぴ 200μ1の Opti-MEM培養液を入れて混和した。 '
(4) 上記 (2)により得た混和液と上記 (3)により得た混和液とを混和し、 室温で 20分放置した。
(5) 6穴培養プレートの LO-T7-1ウィルス液を CHO/hSLAM細胞から取り除い た （前記 3.2 (3)の培養終了後） 。 (6) 次いで、 カスパーゼ阻害剤 （z-Asp-CH2-DCB、 ペプチド研究所、 50 μΐ/ml ) を添力 Πした Opti-MEM培養液 2 mlを、 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞 の各穴に添加した。
(7) 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞の各穴に、 上記 (4)により得た混和 液を滴下した。
(8) 37。Cで 18時間培養し、 宿主への各プラスミ ドの導入、 及び麻疹ウィルス粒 子の再構成を行った。
3.4 B95a細^との共培養
(1) 直径 10 cmの培養皿に約 40%程度の密度に均一に培養された B95a細胞を用 意した。
(2) 前記 3.3 (8)の培養後の CHO/hSLAM細胞をトリプシン液で剥がして上記 (1)の B95a細胞上に播種し、 37°Cで共培養を行った。
(3) 共培養後、.約 30時間以内に、 再構成及び増殖された麻疹ウィルスが感染し た巨細胞が多数観察された。
〔実施例 4〕 LO-T7-1株を用いた外来遺伝子の転写 ·発現効果
1 . GFPを指標にした T7プロモーターの駆動性 （T7 RNAポリメラーゼの発現 性） の検証実験
1.1 宿主細胞の準備
(1) 常法により、 直径 6穴培養プレートこ適度に密に生育させた CHO/hSLAM 細胞を用意した。
(2)培養液としては、 7.5%の胎児牛血清入 RPMI培養液を用いた。 1.2 ワクシニアウィルスの感染
(1) 2.5 X 106 PFU/mlに感染価を調整した vTF7-3株 （実施例 1参照） 、 LO- T7-1 株 （実施例 3参照） 及び MVA-T7 株 （Wyatt LS， et. al., Replication- deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells., Virology, 1995 J n 20；210(1)：202-5.) のウィルス液をそれぞれ用意した。
(2) 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞の培養液を取り除き、 プレートごと に異なるウィルス液を感染価が MOI=5になるように加えた。
(3) 37°Cで 1時間培養し、 各ウィルス株を感染させた。
1.3 プラスミド DNAの導入、 及ぴ外来遺伝子の転写 ·発現
(1) pBS-GFP (pBluescriptプラスミド (ストラタジーンネ土)に GFP遺伝子を組み 込んだもの） のプラスミ ド溶液を、 1.0 の DNA量となるようにポリスチレン チューブに入れた。
(2) 上記チューブに、 200 μΐ の Opti-MEM培養液 （インビトロジェン社） を 加えて混和した。
(3) 別のポリスチレンチューブに、 7μ1 の Lipofectamine 2000試薬 （インビ トロジェン社） 及び 200μ1の Opti-MEM培養液を入れて混和した。
(4) 上記 (2)により得た混和液と上記 (3)により得た混和液とを混和し、 室温で 20分放置した。
(5) 6穴培養プレートのウィルス液を CHO/hSLAM細胞から取り除いた （前記 1-.2 (3)の培養終了後） 。
(6) 次いで、 Opti-MEM培養液 2 mlを、 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞 の各穴に添加した。 '
(7) 6穴培養プレートの CHO/hSLAM細胞の各穴に、 上記 (4)により得た混和 液を滴下した。 ―
(8) 37°Cで 24時間培養し、 宿主への各プラスミ ドの導入、 及び外来遺伝子の転 写 ·発現を行った。
(9) 上記 (1)〜(8)の操作を各プレートについて行った。
1.4 外来遺伝子の発現確認
各 CHO細胞について EGP の発現を蛍光顕微鏡による蛍光の検出により確認 した。 その結果、 ワクシニアウィルス vTF7-3株及び LO-T7-1株を感染させた細 胞において、 EGPTの蛍光が確認された （図 23参照） 。 2 . ルシフヱラーゼの発現を指標にしたミニゲノムウィルス転写 ·複製実験系に よる RNP複合体形成誘導能の検証実験
上記、 実施例 3 (麻疹ウィルスの再構成） において、 p(+)MV323 の代わりに p l8MGFLuc01 ( Komase K, et. ai., The phosphoprotem oi attenuated measles AIK-C vaccine strain contributes to its temperature-sensitive phenotype., Vaccine., 2006 Feb 6；24(6)：826-34. Epub 2005 Aug 15.) を用レ、た こと以外は同様にして、 ルシフェラーゼの発現 （すなわちルシフェリン添加後の 蛍光量） を確認した。
その結果、 ワクシニアウィルス vTF7-3株及ぴ LO-T7-1株を感染させた細胞に おいて蛍光が確認された。 なお、 LO-T7- 1株を感染きせた細胞の方が若干蛍光量 は少なかった （図 24 (A)参照） 。
3 . 麻疹ウィルス （EGFPを発現するもの ： 1.5 対照ウィルスベクターの再構成 を参照） 粒子の再構成
上記 1 .の GF の発現において、 pBS-GKP (p Blue scriptプラスミ ド（ス トラタ ジーン社）に GFP遺伝子を組み込んだもの） の代わりに、 p(+)MV323-EGFP (5μξ) ( 1.5 対照ウィルスベクターの再構成を参照） 、 並びに pCAG-T7-IC-N (1μ^)、 pCAG-T7-IC-PAC (ΐ.5μ¾)及ぴpGEMCR-9301B-'L (ΐμ^) (実施例 1参照 ) の各プラスミ ドを混和して用い、 また、 ワクシニアウィルス MVA-T7株を使用 しなかったこと以外は上記 1と同様にし 、 麻疹ウィルス粒子の合成開始に成功 した細胞数を測定した。
その結果、 ヮクシニアウィルス vTF7-3株及び LO-T7- 1株を感染させた細胞に おいて、 いずれも麻疹ウィルス粒子の複製が確認された。 なお、 LO-T7- 1株を感 染させた方では、 VTF7-3株を感染させた方に比べ、 約 55〜60%程度の細胞数で あった （図 24 (B)参照） 。
〔実施例 5〕 LO-T7-1株感染細胞におけるカスパーゼ阻害剤の効果
1 . ワクシニアウィルスの感染によるアポトーシス抑制効果 実施例 4中の 1 .の 1.1及び 1.2と同様にして、 CHO/hSLAM細胞を用意した。 2.5 X 106 PFU/mlに感染価を調整した LO-T7-1株 （実施例 3参照） のウィルス液 を用意し、 CHO/hSLAM細胞に添力 Πして （240 μΐ/well) 、 37°Cで 1時間培養し、 LO-T7-1株を感染させた。 '
培養後、 ウィルス液を CHO/hSLAM細胞から取り除いた。 その後、 一部のゥ エルにはカスパーゼ阻害剤 （z-Asp-CH2-DCB、 ペプチド研究所、 50 μΐ/ml) を 添加した Opti-MEM培養液 2 mlを添加した。 その後、 37°Cで 18時間培養した。 その結果、 カスパーゼ阻害剤を添加しなかったゥエルにおいてはアポトーシス による細胞死が多く確認されたが、 カスパーゼ阻害剤を添加したゥヱルにおいて はアポトーシスによる細胞死がほとんど確認されなかった （図 25 (a)) 。
また、 カスパーゼ阻害剤を添加しなかったゥエルの細胞では染色体 DNAの断 片化が生じたが、 カスパーゼ阻害剤を添加したゥエルの細胞では染色体 DNAの 断片化はほとんど生じなかった （図 25 (b)) 。 2 . ルシフヱラーゼの発現を指標にしたミニゲノムウィルス転写 ·複製実験系に よる RNP複合体形成誘導能の亢進
-実施例 4中の 2 .と同様にして、 ワクシニアウィルス LO-T7-1株を感染させた 細胞におけるルシフェラーゼの発現 （すなわちルシフェリン添加後の蛍光量） を 確認した。 一方、 対照として、 カスパーゼ阻害剤を使用せずに同様の操作を行つ た。
その結果、 カスパーゼ阻害剤を添加じなかつた場合は、 添加した場合に比べ、 蛍光量が約 1/10程度に低下した （図 26 (a))' 。 カスパーゼ阻害剤を添加すること による （ルシフェラーゼの発現を指標にした） ミニゲノムウィルス転写 '複製実 験系による RNP複合体形成誘導能の亢進が認められた。
3 . ウィルス粒子合成開始に成功した細胞数の増加
実施例 4中の 3 .と同様にして、 ワクシニアウィルス LO-T7-1株を感染させた 細胞における麻疹ウィルス粒子の合成開始に成功した細胞数えを測定した。 対照 として、 カスパーゼ阻害剤の濃度を 25 μΐ/ηιΐとした場合、 及び、 カスパーゼ阻害 剤を使用しなかった場合 （Ο μΐ/ml) についても同様の操作を行った。
その結果、 カスパーゼ阻害剤の濃度依存的に麻疹ウィルス粒子の合成開始に成 功した細胞数の増加が確認された （図 26 (b)) 。 〔実施例 6〕 SeVベクターによる分節ゲノム型ベクター cDNAの構築
ベクターの分節化をセンダイウィルス （SeV) ベクター系で実施するにあたつ て、 遺伝子治療及び遺伝子ワクチンへの臨床応用可能なベタタ一化に成功してい る 「非伝播性 F遺伝子欠失型 SeVベクタ一」 （Li， H.-O. et al, J. Virology, 74： 6564-6569 (2000), WO00/70070) をベースにした分節化を検討した。
2分節ゲノム型ベクターとして、 NP遺伝子、 P遺伝子及び M遺伝子とマー 力一遺伝子としての LacZ遺伝子とを搭載した MiniSeV/LacZ-NP-P-M、 並びに HN遺伝子及ぴ L遺伝子とマーカー遺伝子としての GFP遺伝子とを搭載した MiniSeV/GFP-HN-Lの 2分節化を試み、 3分節ゲノム型ベクターとして、 NP 遺伝子及ぴ P遺伝子とマーカー遺伝子としての ludferase遺伝子とを搭載した MiniSeV/Luci-NP-P, M遺伝子とマーカ一遺伝子としての LacZ遺伝子とを搭 載した MniSeV/LacZ-M、 並びに HN遺伝子及び L遺伝子とマーカー遺伝子と しての GFP遺伝子とを搭載した MiniSeV/GFP-HN-Lの 3分節化を試みた （図 27) 。 2分節ゲノム型ベクターの再構成用の cDNAをそれぞれ
pMiniSeV/LacZ-NP-P-M及ぴ p niSeV/GPT-HN-Lと呼び、 3分節ゲノム型べ クタ一の再構成用の cDNAをそれぞれ pMiniSeV/Luci-NP-P、 pMiniSeV/LacZ- M及び pMiniSeV/GFP-HN-Lと呼ぴ、 使用した。 そのうち pMiniSeV/GFP- HN-Lは、 2分節ゲノム型及び 3分節ゲノム型べクターの両者の再構成に共通に 使用する。 (1) pMniSeV/LacZ-NP-P-Mの構築
構築スキームを （図 28) に示す。 SeVベクターゲノム cDNA (pSeV(+18)： Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology, 78: 2813-2820) を templateと して、 次の 2種のプライマー、 Not NP-F及び Sac II-M-Rを用いて PCRを行 レ、、 両端にそれぞれ Notl認識配列及ぴ SacII認識配列を有する NP遺伝子、 P 遺伝子及び M遺伝子を含む fragment (Not I-NP/P/M-Sac II fragment：配列番 号 1 6 ) を得た。
Not I-NP-F：
5'-ttcacgcggccgcagatcttcacg-3' (24mer, 酉 3歹 lj畨^" 1 4 )
Sac II-M-R：
5'-tccatccgcggagcttatttaagacaaggagtgac-3' (35mer, 酉 S歹 II番号 1 5 この fragmentを Notl及び SacIIで消化し精製後、 pSeV(+18) を同様に Not Iと Sac IIで消化し、 NP遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子、 F遺伝子、 HN遺伝子 及ぴ L遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いた cDNAに挿入し、
pMiniSeV/NP-P-Mを得た。 pMniSeV/NP-P-Mを再度 Notl消化し、 EIS配列 を含む LacZ遺伝子の Notl fragment (配列番号 1 7 ) を p niSeV/NP-P-Mに 揷入した pMiniSeV/LacZ-NP-P-Mを構築した。
(2) pMiniSeV/GFP-HN-Lの構築
構築スキームを図 29に示す。 SeVベクターゲノム cDNA (PSeV(+18)) を templateとして、 下記の 2種のプライマー、 Not I-HN-F及ぴ Sac II-Rを用い て PCRを行い、 両端にそれぞれ Notl認識配列及び SacII認識配列を有する HN遺伝子及び L遺伝子を含む fragment (Not ΙΉΝ/L-Sac II fragment：配列 番号 2 0 ) を得た。
Not I-HN-F：
5'-aagtggcggccgccacagatcatggatggtgatag-3' (35mer, 酉己歹 II番号 1 8 ) Sac II-R：
5'-ttccaggtaccgcggagcttcgatc-3' (25mer, 酉 3歹 !J番^" 1 9 )
この fragmentを Notl及ぴ SacIIで消化し精製後、 pSeV(+18) を同様に Not Iと Sac IIで消化し、 NP遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子、 ； F遺伝子、 HN遺伝子 及ぴ L遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いた cDNAに挿入し、
pMiniSeV/HN-Lを得た。 p niSeV/HN-Lを再度 Notl消ィヒし、 EIS配列を含 む GFP遺伝子の Notl fragmentを （配列番号 2 1 ) を pMiniSeV/HN-Lに揷入 した PMiniSeV/GFP-HN-Lを構築した。 (3) p niSeV/Luci-NP-P 構築
構築スキームを図 30に示す。 SeVベクターゲノム cDNA (pSeV(+18)) を templateとして、 下記の 2種のプライマーを用いて PCRを行い、 両端にそれぞ れ Notl認識配列及び SacII認識配列を有する NP遺伝子及び P遺伝子を含む fragment (Not I-NP/P-Sac II fragment：配列番号 2 3 ) を得た。
Not I-NP-F：
5'-ttcacgcggccgcagatcttcacg-3' (24mer, 酉己歹 U番^" 1 4 )
Sac II-P-R：
5'-tccatccgcggagctagttggtcagtgactctatg-3' (35mer, gii歹1 J番号 2 2 ) この fragmentを Notl及ぴ SacIIで消化し精製後、 pSeV(+18) を同様に Not Iと Sac IIで消化し、 NP遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子、 F遺伝子、 HN遺伝子 及び L遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いた cDNAに挿入し、
pMiniSeV/NP-Pを得た。 pMniSeV/NP-Pを再度 Notl消化し、 EIS配列を含む luciferase遺伝子の Notl fragmentを （配列番号 2 4 ) を pMiniSeV/NP'Pに揷 入した pMiniSeV/Luci-NP-Pを構築した。
(4) pMiniSeV/LacZ-Mの構築
構築スキームを図 31に示す。 SeVベクターゲノム cDNA (PSeV(+18)) を templateとして、 下記の 2種のプライマー、 並びに Not I-M-F及ぴ Sac II-M-K を用いて PCRを行い、 両端にそれぞれ ^otl認識配列及び SacII認識配列-を有 する M遺伝子を含む fragment (Not I-M-Sac II fragment：配列番号 2 6 ) を 得た。
Not I-M-F：
5'-aagtggcggccgcacggcgcaatggcagatatc-3' (33mer, 酉 S歹番号 2 5 )
Sac II-M-R：
5'-tccatccgcggagcttatttaagacaaggagtgac-3' (35mer, 酉己歹 (I番号 1 5 ) この fragmentを Notl及び SacIIで消化し精製後、 pSeV(+18) を同様に Not Iと Sac IIで消化し、 NP遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子、 F遺伝子、 HN遺伝子 及び L遺伝子の全遺伝子配列断片を取り除いた cDNAに揷入し、 pMiniSeV/M を得た。 pMiniSeV/Mを再度 Notl消化し、 EIS配列を含む LacZ遺伝子の Notl fragment (配列番号 1 7 ) を pMiniSeV/Mに挿入した pMniSeV/LacZ'Mを構 築した。
〔実施例 7〕 分節ゲノム型 SeVベタターの再構成と増幅
分節ゲノム型 SeVベクターの再構成は、 非分節 F遺伝子欠失型 SeVの再構成 法である Liらの方法 （Li, H.-O. et al., J. Virology, 74： 6564-6569 (2000)； WO 00/70070) 及！^その改良法 （WO 2005/071092) に従って行った。 また、 本分 節型ベクターは F遺伝子欠失型 SeVベクターをベースにした分節型であるので、 その増幅のためには F タンパク質を高発現するパッケージング細胞 （LLC- MK2/F7/A： Li, H.-O. et al., J. Virology, 74： 6564-6569 (2000), WO00/70070) を利用した。 2分節ゲノム型ベクターの増幅の過程における GFP蛍光写真を図 32 に示すが、 パッケージング細胞 （LLC-MK2/F7/A) を用いた培養を行うこと で、 2分節ゲノム型ベクターの増幅が可能であった。 また、 3分節ゲノム型べク ターについてもパッケージング細胞 （LLC-MK2/F7/A) を用いることで、 べク ターを増幅することが可能であった （図 33) 。
〔実施例 8〕 分節ゲノム型 SeVベタター由来搭載遺伝子発現確認
1 . 2分節ゲノム型 SeVベクターによる発現確認
コンフルェントになつた LLC-MK2 (12-weU plate)細胞へ、 MiniSeV/GFP- HN-Lと ,MiniSeV/Lac Z-NP-P-Mの 2分節 SeVベタタ一溶液 （増幅後培養上 清） 或は 10倍希釈液を 1 ml/wellで添加し、 遺伝子導入した。 2日後に GFP蛍 光観察を行い、 写真を撮影した （GFP発現の確認） 。 また、 Invitrogenの - Gal Staining Kit (Cat. No. K1465-01)を用いて染色し、 明視野写真を撮影した (Lac Z発現の確認） 。 図 34に示したように、 MiniSeV/GFP-HN-Lと
MiniSeV/Lac Z-NP-P-Mの 2分節 SeVベクターによつて感染した細胞では GFP と Lac Zの両者の発現が確認された。 2 . 3分節ゲノム型 SeVベクターによる発現確認
コンフルェントになった LLC-MK2 (12-well plate)細胞 (24-well plate)へ、 MiniSeV/GFP-HN-L MniSeV/Lac Z- Mと niSeV/Luci-NP-Pの 3分節 SeV ベクター溶液 （増幅後培養上清） を 0.5 ml/wellで感染した。 3'日後 GFP蛍光 観察を行い、 写真を撮影した （GKP発現の確認、 図 35A) 。 また、 Inviteogen 社の 3 -Gal Staining Kit (Cat. No. K1465-01)を用いて染色し、 明視野写真を撮 影した （Lac Z発現の確認、 図 35B) 。 また、 Goat Anti-Luciferase抗体を一次 抗体とし、 AlexaFluor 488 Rabbit Anti-Goat IgG抗体を二次抗体として蛍光免 疫染色を行い、 '染色した細胞の蛍光写真を撮影した （Ludferase発現の確認、 図 35C) 。 さらに、 Promega社の Bright-Glo L ciferase Assay System (Cat. No. E2610)を用いて感染細胞の Luciferase活性を測定した （図 35D) 。 図 35 に示したように、 MiniSeV/GFP-HN-L、 MniSeV/Lac Z- Mと MiniSeV/Luci- NP-Pの 3分節 SeVベクターによつて感染した細胞では GFP、 Lac Z及び Luciferaseの 3種の発現が確認された。 ' 産業上の利用可能性
-本発明によれば、 ウィルス本来の良好な増殖能を保持しつつ外来遺伝子を高発 現させることができ、 しかも、 外来遺伝子の長さ及び種類による発現効率への影 響が小さく、 複数個の外来遺伝子を挿入することができる組換えモノネガウィル スベクター、.その製造方法、 及ぴその製造用キットを提供することができる。 本 発明のベクターの開発により、 モノネガ―ゥィルスがゲノムの分節化という大胆な 改変が可能なウィルスであることが証明されるとともに、 モノネガウィルスのゲ ノム操作が大きく簡便化された。 さらに、 当該ウィルスベクターを用いた外来性 タンパク質の製造方法、 並びに、 当該ウィルスベクターを用いて得られる動物組 織、 細胞又は体液、 及び抗血清又は抗体を提供することができる。.
本発明のウィルスベクターは、 安定性に優れ、 複数の外来遺伝子をそれぞれ高 発現させることができる実用性の高いベクターとして、 極めて有用である。 配列表フリーテキスト 配列番号 2 ：合成 DNA 配列番号 3 ：合成 DNA 配列番号 4 ：合成 DNA 配列番号 5 ：合成 DNA 配列番号 6 ：合成 DNA 配列番号 7 ：合成 DNA 配列番号 8 ：合成 DNA 配列番号 9 ： -合成 DNA 配列番号 1 0 ：合成 DNA 配列番号 1 1 ：合成 DNA 配列番号 1 2 ：合成 DNA 配列番号 1 3 ：合成 DNA 配列番号 1 4 ：合成 DNA 配列番号 1 5 ：合成 DNA 配列番号 1 6 ：合成 DNA
-配列番号 1 7 ：合成 DNA 配列番号 1 8 ：合成 DNA 配列番号 1 9 ：合成： DNA 配列番号 2 0 ：合成 DNA 配列番号 2 1 ：合成 DNA 配列番号 2 2 ：合成 DNA 配列番号 2 3 ：合成 DNA 配列番号 2 4 ：合成 DNA 配列番号 2 5 ：合成 DNA 配列番号 2 6 ：合成 DNA

Claims

請求 の 範 囲
1 . 複数に分節されたゲノムを保持し、 少なくとも 1つの分節ゲノムが宿主内で 発現可能な外来遺伝子を含むことを特徴とする、 組換えモ ネガウィルスべ クタ一。
2 . 外来遺伝子がモノネガウィルスを構成する機能性タンパク質遺伝子より上流 側に揷入されたものである、 請求項 1記載のベクター。
3 . 少なくとも 2つの分節ゲノムが外来遺伝子を含むものである、 請求項 1記載 のべクタ一。
4 . 外来遺伝子を含む分節ゲノムのうちの少なくとも 1つが複数の外来遺伝子を 含むものである、 請求項 1記載のベクター。
5 . 2つに分節されたゲノムを保持し、 一方の分節ゲノムが H遺伝子及び L遺伝 子を含み、 他方の分節ゲノムが N遺伝子、 P遺伝子、 M遺伝子及び F遺伝子 を含むものである、 請求項 1記載のベクター。
6 . 3つに分節されたゲノムを保持し、 第 1の分節ゲノムが H遺伝子及び L遺伝 , 子を含み、 第 2の分節ゲノムが M遺伝子及び F遺伝子を含み、 第 3の分節ゲ - ノムが N遺伝子及び P遺伝子を含む.ものである、 請求項 1記載のベクター。 7 . モノネガウィルスが麻疹ウィルス又はセンダイウィルスである、 請求項 1記 載のベクター。 .
8 . 請求項 1記載のベクターに含まれる分節ゲノム RNA又はその cRNA。
9 . 請求項 8記載の RNA又はその cRNA—を転写し得る錶型 cDNAを含む DNA。
1 0 . プラスミド DNAである、 請求項 9記載の DNA。
1 1 . 宿主内に、 請求項 9記載の DNAと、 モノネガウィルスの N遺伝子を含む DNA、 P遺伝子を含む DNA及び L遺伝子を含む DNAと、 当該 DNAの転写 ユニットとを導入することを含む、 組換えモノネガウィルスベクターの製造
Figure imgf000050_0001
Pタンパク質及び Lタンパク質を発現 する宿主内に、 請求項 9記載の DNAと、 当該 DNAの転写ユニットとを導入 することを含む、 組換えモノネガウィルスベクターの製造方法。 • 13. 転写ユニットの導入が、 所定の: NAポリメラーゼを発現する組換えワク シニアウィルスを宿主に感染させること、 又は、 所定の RNAポリメラーゼ 遺伝子を含む DNAを宿主内に導入すること若しくは宿主ゲノムに組込むこ とである、 請求項 11又は 12記載の方法。
14. RNAポリメラーゼが T7 RNAポリメラーゼである、 請求項 13記載の方法。
15. 組換えワクシニアウィルスが Lister株を親株として得られたものである、 請求項 13記載の方法。
16. モノネガウイ/レスの Nタンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質を発現 する宿主内に、 請求項 8記載の RNA又はその cRNAを導入することを含む、 組換えモノネガウィルスベクターの製造方法。
17. 宿主が CHO細胞である、 請求項 1 1、 12又は 16記載の方法。
18. 請求項 9記載の DNA、 及ぴ当該 DNAの転写ユニットを含む、 組換えモノ ネガウィルスベクターの製造用キット。
19. モノネガウィルスの N遺伝子を含む DNA、 P遺伝子を含む DNA及ぴ L遺 伝子を含む DNAをさらに含む、 請求項 18記載のキット。
. 20. 転写ユニットが、 所定の RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニア - ウィルス、 又は、 所定の RNAポリメラーゼ遺伝子を含む DNAである、. 請求 項 18記載のキット。
21. RNAポリメラーゼが T7 RNAポリメラーゼである、 請求項 20記載のキッ
22. 組換えワクシニアウィルスが Lister株を親株として得られたものである、 請求項 20記載のキット。
23. 請求項 8記載の RNA又はその cRNAを含む、 組換えモノネガウィルスべク ターの製造用キット。
24. モノネガウィルスの Nタンパク質、 Pタンパク質及び Lタンパク質を発現 する宿主をさらに含む、 請求項 18記載のキット。
25. 宿主が CHO細胞である、 請求項 24記載のキット。
26. 請求項 1記載のベクターを感染させた宿主に外来性タンパク質を発現させ、 発現した外来性タンパク質を回収することを含む、 外来性タンパク質の製造
27. 請求項 1記載のベクターを感染させた動物から採取された、 組織、 細胞又 は体液。
28. 外来性タンパク質を含む、 請求項 27記載の組織、 細胞又は体液。
29. 請求項 1記載のベクターを感染させた動物から回収された、 抗血清又は抗 体。
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