WO2006129594A1 - 核酸含有複合体製剤の製造方法 - Google Patents

核酸含有複合体製剤の製造方法 Download PDF

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WO2006129594A1
WO2006129594A1 PCT/JP2006/310647 JP2006310647W WO2006129594A1 WO 2006129594 A1 WO2006129594 A1 WO 2006129594A1 JP 2006310647 W JP2006310647 W JP 2006310647W WO 2006129594 A1 WO2006129594 A1 WO 2006129594A1
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acid
poly
nucleic acid
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PCT/JP2006/310647
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Yoshiharu Fukui
Akira Saheki
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co., Ltd.
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    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid-containing complex preparation containing a complex of a polynucleotide and a cationic carrier.
  • RNA short interfering RNA
  • poly I poly I: C
  • pharmaceuticals for example, see Patent Documents:! To 3
  • polynucleotides have very low uptake into cells, it is necessary to efficiently exhibit their physiological activity in cells.
  • a method of forming a complex of a polynucleotide and a cationic carrier and administering it is known.
  • a method for preparing a complex of a polynucleotide and a cationic carrier a method of forming a double strand and mixing the polynucleotide and the cationic carrier is common.
  • a complex of a polynucleotide and a cationic carrier prepared by a powerful method generally has a very large particle size of several zm to several hundreds xm. Therefore, a nucleic acid-containing complex preparation containing such a complex cannot be sterilized by filtration, and has problems such as the possibility of embolization of capillaries when intravenously administered to humans. Have.
  • the polynucleotide as the main drug is more susceptible to degradation by nucleolytic enzymes and temperature and is preferably more stable.
  • Patent Document 1 International Publication No. 99/20283 Pamphlet
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No.99 / 48531
  • Patent Document 3 International Publication No. 2004/106511 Pamphlet
  • Patent Document 4 Pamphlet of International Publication No.99 / 61032 Disclosure of the invention
  • the main object of the present invention is to provide a method for producing a nucleic acid-containing complex preparation that can be sterilized by filtration and intravenously administered to humans and that can maintain the stability of the polynucleotide. To do.
  • the present inventors obtained two single-stranded polynucleotides when producing a nucleic acid-containing complex preparation using two complementary polynucleotides and a cationic carrier. After dissolving in the same solution, the powerful solution and the cationic carrier were mixed and dispersed to find that the above object could be achieved, and the present invention was completed.
  • Examples of the present invention include the following (1) and (2).
  • a solution containing two polynucleotides that can form a double strand in a single strand in the same solution is mixed with a cationic carrier or a raw material solution before the cationic carrier is formed.
  • a method for producing a nucleic acid-containing complex preparation characterized by carrying out a dispersion treatment.
  • polynucleotide includes polydioxyribonucleotides and polyribonucleotides.
  • Polydeoxyribonucleotides contain oligodeoxyribonucleotides, and polyribonucleotides contain oligoribonucleotides.
  • Polyoxyribonucleotides may be partially substituted with carboxynucleotides. A part of the polyribonucleotide may be substituted with deoxyribonucleotide.
  • polynucleotide examples include polyinosinic acid (hereinafter referred to as "poly I"), polycytidylic acid (hereinafter referred to as “poly C”), polyadenylic acid, polyuridylic acid, poly (cytidylic acid, uridic acid).
  • RNA interference RNA interference (hereinafter ⁇ RN It is possible to raise the sense strand and antisense strand of a double-stranded oligonucleotide capable of exhibiting “Ai”.
  • RNA interference RNA interference (hereinafter ⁇ RN It is possible to raise the sense strand and antisense strand of a double-stranded oligonucleotide capable of exhibiting “Ai”.
  • RNA interference hereinafter ⁇ RN It is possible to raise the sense strand and antisense strand of a double-stranded oligonucleotide capable of exhibiting “Ai”.
  • RNA interference RNA interference
  • ⁇ RN RNA interference
  • siRNA siRNA
  • miRNA microRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • snRNA small nucleated RNA
  • RNAi is obvious to those skilled in the art, but has a sequence complementary to the sense strand or antisense strand of the introduced double-stranded oligonucleotide by introducing the double-stranded oligonucleotide into the cell. This is a phenomenon in which mRNA is specifically degraded, and as a result, synthesis of gene products encoded by powerful mRNA is suppressed.
  • the number of bases of the polynucleotide is not particularly limited. For example, 5000 or less is appropriate, and 2 000 or less is preferable.
  • the number of bases to be used can be appropriately selected depending on the properties of the polynucleotide.
  • the term “oligooxyribonucleotide” and “oligoribonucleotide” means those having a base number of 2 to 99.
  • the “number of bases” here refers to the number of bases calculated from the chromatogram peak of the molecular weight standard product and the peak of the chromatogram of the sample by, for example, so-called size exclusion chromatography. That is, it means the number of bases calculated from the maximum frequency of the chromatogram.
  • An internal force S in the range of 30 to 2000 is appropriate, and 60 to: an internal force S in the range of 1000 is preferable, and the range of 100 to 500 is more preferable.
  • the "polynucleotide” according to the present invention is a sense strand or an antisense strand of a double-stranded oligonucleotide capable of exhibiting RNAi
  • the number of bases is suitably within the range of 10-50. Yes, preferably in the range of 12-40, more preferably in the range of 15-30.
  • the polynucleotide may be chemically modified in whole or in part.
  • Such chemically modified polynucleotides include, for example, partially chemically modified poly I or poly (5-bromocytidylic acid) such as poly (7-diazinosinic acid), poly (2'-azidoinosinic acid), Partly chemically modified poly C such as (2_thiocytidylic acid), poly (cytidine-5'-thiophosphoric acid) can be mentioned.
  • partially chemically modified poly I or poly (5-bromocytidylic acid) such as poly (7-diazinosinic acid), poly (2'-azidoinosinic acid), Partly chemically modified poly C such as (2_thiocytidylic acid), poly (cytidine-5'-thiophosphoric acid) can be mentioned.
  • at least a part of the sugar component or phosphate backbone constituting the nucleotide may be modified.
  • Polynucleotides can be produced by methods known to those skilled in the art. For example, it can be produced by a nucleic acid automatic synthesizer or manually by a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method by a phosphoramidite method or a triester method. Alternatively, the polynucleotide forming the double strand can be produced by dissociating the double strand by a non-enzymatic treatment in which heating is performed at 60 ° C. or higher or an enzymatic treatment using a helicase or the like.
  • the "two polynucleotides" according to the present invention are not particularly limited as long as they can form a double strand, and are, for example, a combination of a polydeoxynucleotide and a polyribonucleotide. May be. Further, the number of bases of the two polynucleotides is not necessarily the same.
  • “Can form a double strand” means having a sequence that is complementary to the extent that a double strand can be formed when two polynucleotides are mixed under physiological conditions.
  • physiological conditions means conditions adjusted to pH, salt composition, and temperature similar to those in the living body. For example, it can be mentioned that the pH is in the range of 5 to 8 at room temperature and the sodium chloride concentration is 150 mM.
  • the "cationic carrier” is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and includes, for example, 2-0 1 (2-jetylaminoethyl) strength rubamoyl 1, 3-.
  • ⁇ 1 Cathodic carrier (hereinafter referred to as “Carrier A”) comprising dioleoylglycerol (hereinafter referred to as “Compound A”) and phospholipid as essential constituents, N_ [l _ (2,3-Geolei mouth Xy) propyl] —N, N, N—trimethylammonium chloride and phospholipid as essential constituents Cationic carrier, Oligofactamine (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), Ribofectin (registered) Trademark) (manufactured by Invitrogen), ribofactamine (registered trademark) (manufactured by Invitrogen), lipofectamine 2000 (registered trademark) (manufactured by Invitrogrog) (manufact
  • Compound A constituting carrier A is disclosed in WO94 / 19314. Can be synthesized by this method.
  • the phospholipid constituting the carrier A is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable phospholipid.
  • phosphatidylcholine such as egg yolk phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, sphingomyelin or Examples include lecithin such as egg yolk lecithin and soybean lecithin. Of these, lecithin is particularly preferable.
  • Carrier A can be prepared, for example, by mixing compound A and phospholipid and dispersing them in a solution by a conventional method.
  • an emulsifying disperser or the like can be used as appropriate.
  • a powerful emulsifier / disperser is not particularly limited as long as it is used for pharmaceutical purposes.
  • an ultrasonic disperser such as SONIFIER (registered trademark) (manufactured by BRANSON, the same shall apply hereinafter) or a microfluidic device.
  • the solvent for dispersing the compound A and the phospholipid is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include electrolytes such as water for injection, distilled water for injection, and physiological saline, Examples of the sugar solution include sugar solutions and maltose solutions.
  • Processing conditions, processing time, processing temperature, and the like for dispersion can be selected as appropriate.
  • the mixing ratio of compound A and phospholipid (weight of phospholipid Z weight of compound A) used in preparing carrier A is the type of phospholipid used and the nucleic acid-containing complex preparation. Different forces depending on the nature of the two polynucleotides to be mixed with the carrier A, etc. Suitable range is 0.:! ⁇ 10, preferably in the range 0.5-5: more in the range! ⁇ 2 preferable.
  • the preparation of the present invention In the nucleic acid-containing complex preparation (hereinafter referred to as "the preparation of the present invention") according to the present invention, after two polynucleotides are dissolved in the same solution, a strong solution and a cationic carrier are dispersed. It can be produced by mixing the solution or the raw material solution before the cationic carrier is formed, and performing a dispersion treatment by a conventional method.
  • a dispersion treatment an emulsifying disperser or the like can be used as appropriate.
  • a powerful emulsifier / disperser if it is used for medical purposes There is no particular limitation.
  • an ultrasonic disperser such as SONIFIER (registered trademark), a microfluidizer (registered trademark), a nanomizer (registered trademark), DeBEE2000 (registered trademark), a finalizer (registered trademark), Nano2000 ( Listed high-pressure emulsifiers such as registered trademark).
  • the solvent for dissolving the polynucleotide is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include electrolyte solutions such as water for injection, distilled water for injection, and physiological saline, glucose solution, and maltose solution. And the like.
  • Processing conditions, processing time, processing temperature, and the like for dispersion can be selected as appropriate.
  • the mixing ratio of the polynucleotide and the cationic carrier (total weight of the polynucleotide / weight of the force thionic carrier) used when producing the preparation of the present invention is determined by the properties of the polynucleotide used and the cationic carrier, etc. Depending on the force, a range of 0.0005 to 1 is appropriate, and a range of 0.001 to 0.4 is preferable. Further, when the cationic carrier is carrier A, an internal force S in the range of 0.0005 to:! Is suitable, an internal force S in the range of 0.001 to 0.4, preferably in the range of 0.01 to 0.2. The inside is more preferable.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention may optionally contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • emulsification aids eg, strength prillic acid, strength purine acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, docosahexaenoic acid, etc.
  • Fatty acids and pharmaceutically acceptable salts thereof albumin, dextran), stabilizers (eg, cholesterol, phosphatidic acid), isotonic agents (eg, sodium chloride salt, glucose, maltose, ratatose, sucrose, Trehalose) and pH adjusters (for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine).
  • stabilizers eg, cholesterol, phosphatidic acid
  • isotonic agents eg, sodium chloride salt, glucose, maltose, ratatose, sucrose, Trehalose
  • pH adjusters for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine.
  • the content of the additive in the preparation of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, more preferably 50% by weight or less.
  • the additive can be added in an appropriate step before or after dispersion.
  • the dispersion of the present invention can be sterilized by filtration using a 0.2 ⁇ m membrane filter, if necessary, after the dispersion treatment.
  • the preparation of the present invention may be a lyophilized preparation.
  • Such a freeze-dried preparation can be prepared by freeze-drying the liquid preparation of the present invention by a conventional method. For example, after appropriate sterilization of the liquid preparation of the present invention, a predetermined amount is dispensed into a vial, and pre-freezing is carried out for about 2 hours under a condition of about 40 to -20 ° C.
  • ⁇ Primary drying under reduced pressure at 10 ° C, followed by secondary drying under reduced pressure at about 15-25 ° C and lyophilization.
  • the inside of the vial can be replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain a freeze-dried preparation of the preparation of the present invention.
  • the lyophilized preparation of the preparation of the present invention can be used by re-dissolving generally by adding any appropriate solution (re-dissolving solution).
  • re-dissolving solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the amount of this redissolved solution varies depending on the application and is not particularly limited, but it is suitably 0.5 to 5 times the amount before lyophilization or 500 mL or less.
  • the dosage form of the preparation of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable dosage form.
  • intravenous administration, intraarterial administration, oral administration, intratumoral administration, transdermal administration, mucosal administration, Intrarectal administration may be mentioned. Of these, intravenous administration, transdermal administration, and mucosal administration are particularly preferred.
  • it can be administered as a suitable dosage form, for example, various injections, oral preparations, drops, absorbents, eye drops, ointments, lotions, and suppositories.
  • this preparation of the present invention was dispensed into vials, and a lyophilized preparation was prepared according to a conventional method.
  • the resulting freeze-dried preparation was re-dissolved by adding 8 mL of water for injection.
  • a particle size measuring device by a dynamic light scattering method [Nicomp370 (registered trademark): manufactured by Particle Sizing Systems, Inc.]. same as below. ] And it was 152 nm. Also, particles of 1 / im or more were not included.
  • this preparation of the present invention was dispensed into vials to prepare a freeze-dried preparation according to a conventional method.
  • the resulting freeze-dried preparation was redissolved by adding 5 mL of water for injection.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention after re-dissolution was measured by a particle size measuring device using a dynamic light scattering method and found to be 146 nm. More than 1 / im Particles were not included.
  • this preparation of the present invention was dispensed into vials, and a lyophilized preparation was prepared according to a conventional method.
  • the resulting freeze-dried preparation was re-dissolved by adding 8 mL of water for injection.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention after re-dissolution was measured by a particle size measuring apparatus using a dynamic light scattering method, it was 142 nm. Also, particles of 1 / im or more were not included.
  • Water for injection was added to 12 g of Compound A, 0.2 g of purified egg yolk lecithin and 2 g of maltose to make 10 mL, followed by thorough mixing to obtain a crude dispersion of a cationic carrier.
  • the crude dispersion was further subjected to a dispersion treatment at an output of 100 W for 15 minutes using an ultrasonic disperser to obtain 0.32 g of a cationic carrier dispersion.
  • 10 mg of Poly I having a base number of about 310 and 10 mg of Poly C having a base number of about 330 were added to 50 mL of water for injection and dissolved.
  • Water for injection was added to 12 g of Compound A, 0.2 g of purified egg yolk lecithin and 2 g of maltose to make 10 mL, followed by thorough mixing to obtain a coarse dispersion of a cationic carrier.
  • the crude dispersion was further subjected to a dispersion treatment at an output of 100 W for 15 minutes using an ultrasonic disperser to obtain 0.32 g of a cationic carrier dispersion.
  • 30 mg of poly I having a base number of about 310 and 30 mg of poly C having a base number of about 330 were added to 10 mL of water for injection and dissolved.
  • this preparation of the present invention was dispensed into vials to prepare a freeze-dried preparation according to a conventional method.
  • the resulting lyophilized preparation was redissolved by adding 0.87 mL of water for injection.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention after re-dissolution was measured by a particle size measuring device using a dynamic light scattering method, and found to be 163 nm. Also, particles of 1 / im or more were not included.
  • N— [1— (2,3-Doleyloxy) propyl] —N, N, N-trimethylammonyl chloride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • 0.16 g of dioleylphosphatidylethanolamine ( (Nippon Yushi Co., Ltd.) and 2 g of maltose were mixed with water for injection to make 10 mL, and the mixture was mixed well with stirring to obtain a coarse dispersion of a cationic carrier.
  • the coarse dispersion was further subjected to a dispersion treatment at an output of 100 W for 15 minutes using an ultrasonic disperser to obtain 0.32 g of a cationic carrier dispersion.
  • 0.6 g of Compound A, lg of purified egg yolk lecithin and 10 g of maltose were added to water for injection to make 50 mL, and then stirred well to obtain a crude dispersion of a cationic carrier.
  • the crude dispersion was further dispersed for 90 minutes at a treatment pressure of 135 MPa using a high-pressure emulsifying disperser to obtain 1.6 g of a cationic carrier dispersion.
  • 25 mg of two oligoribonucleotides having 21 bases and complementary sequences were dissolved in a solution of 5 g maltose to which water for injection was added to 25 mL.
  • this preparation of the present invention was dispensed into vials to prepare a freeze-dried preparation according to a conventional method.
  • the resulting lyophilized preparation was redissolved by adding 0.87 mL of water for injection.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention after re-dissolution was measured by a particle size measuring apparatus using a dynamic light scattering method, it was 147 nm. Moreover, the above particles were not included.
  • an aqueous solution of lOOmL containing 250 mg of poly I having a base number of about 180 and an aqueous solution of lOOmL containing 250 mg of poly C having a base number of about 200 were added simultaneously with stirring.
  • the mixture was dispersed for 2 hours at a processing pressure of 108 MPa, and then sterilized by filtration through a membrane filter of 0. to obtain a comparative preparation.
  • 2 mL of this comparative preparation was dispensed into vials and made into a freeze-dried product according to a conventional method.
  • the resulting freeze-dried preparation was re-dissolved by adding 8 mL of water for injection.
  • the average particle size of the composite particles in the comparative preparation after re-dissolution was measured by a particle size measurement device using a dynamic light scattering method, it was 149 nm. Also, particles larger than lzm were not included.
  • the stability of poly I and poly C contained in the preparation of the present invention obtained in Example 1 and the comparative preparation obtained in Comparative Example 1 with respect to temperature was determined from changes in the number of bases of poly I and poly C. evaluated.
  • each preparation was stored for 2 weeks under conditions of a temperature of 40 ° C. and a relative humidity of 75%, and then degreased using diethyl ether (manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd., the same applies hereinafter). Then, size exclusion chromatograph using T SK-Gel G5000PW column (manufactured by Tosohichi Co., Ltd., the same shall apply hereinafter).
  • Poly I and Poly C temperatures contained in the preparation of the present invention obtained in Example 2 and Example 3. was evaluated from the change in the number of bases of poly I and poly c.
  • each preparation was stored for 6 months under conditions of a temperature of 40 ° C. and a relative humidity of 75%, and then degreased using diethyl ether. Then TSK_Gel G5000PW column
  • the stability of the oligoribonucleotide contained in the preparation of the present invention obtained in Example 7 with respect to temperature was evaluated from the change in the number of bases of the oligoribonucleotide.
  • each preparation was stored for 6 months under conditions of a temperature of 40 ° C. and a relative humidity of 75%, and then degreased using diethyl ether. Thereafter, the base number of the oligoribonucleotide was calculated by anion exchange chromatography using a DNAPac PA-100 column (manufactured by DIO NEX).
  • Example 7 As is apparent from Table 3, the oligoribonucleotide in the preparation of the present invention obtained in Example 7 was stable with respect to temperature without changing its base number before and after storage.
  • A431 Changes in pharmacological activity after 6 months of storage of the preparation of the present invention obtained in Example 2 under the conditions of a temperature of 40 ° C. and a relative humidity of 75% are shown in A431, a cell line derived from human squamous cell carcinoma. It was evaluated from the growth inhibitory effect on cells.
  • IC is the concentration of poly I and poly C combined.
  • Example 2 As is apparent from Table 4, the preparation of the present invention obtained in Example 2 was measured before and after storage.
  • the pharmacological activity remained unchanged at 50.
  • the presence of two polynucleotides in a nucleic acid-containing complex preparation is determined using the Fluorescence Resonance Energy Transfer (F, “FRET” and Re-J) method. Was evaluated by measuring.
  • F, “FRET” and Re-J Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the FRET method is a method known to those skilled in the art. Specifically, the relative positional relationship between the excitation energy donor fluorescent molecule and the excitation energy acceptor fluorescent molecule generated by light absorption is measured as a fluorescence signal. It is a method to do.
  • Alexa Fluor568 manufactured by Molecular Probes
  • fluorescently labeled poly I hereinafter referred to as “fluorinated poly I”
  • Alexa Fluor546 manufactured by Molecular Probe
  • poly C having about 180 bases to prepare fluorescently labeled poly C
  • the evaluation is based on the preparation of the present invention, comparative preparation, positive control sample and each prepared in 1) above.
  • the fluorescence intensity of the comparative control sample was measured, and the FRET efficiency was calculated from the measured value.
  • the FRET efficiency is the fluorescence intensity of the test sample containing both Fluorescent Poly I and Fluorescent Poly C, and the fluorescence intensity of the control sample of the test sample containing only Fluorescent Poly C. The value divided by 1 is subtracted from 1.
  • the distance between poly I and poly C in the formulation of the present invention is shorter than the distance between poly I and poly C in the comparative formulation and in the positive control sample. It was equivalent to the distance between. That is, it was shown that poly I and poly C in the preparation of the present invention are equivalent to the distance between poly I and poly C forming a double chain.

Abstract

　本発明の目的は、ろ過滅菌及び人への静脈内投与が可能であって、かつ核酸含有複合体製剤に含有されているポリヌクレオチドの安定性が保持される、核酸含有複合体製剤の製造方法を提供することにある。 　本発明は、二本鎖を形成し得る２つのポリヌクレオチド（例えば、ポリＩとポリＣ）を同一溶液中に一本鎖の状態で含有する溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法に関するものである。

Description

明 細 書
核酸含有複合体製剤の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、ポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体を含有する核酸含有複合 体製剤の製造方法に関するものである。 背景技術
[0002] 近年、 short interfering RNA (以下、「siRNA」という）やポリ I : C等のポリヌクレ ォチドの医薬への応用が検討されている（例えば、特許文献：!〜 3を参照）。しかしな がら、ポリヌクレオチドは、細胞内への取り込みが極めて低いため、その生理活性を 細胞内で効率的に発揮させる必要がある。その方法として、ポリヌクレオチドとカチォ ン性担体との複合体を形成させ、投与する方法が知られてレヽる。
[0003] ポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体を調製する方法としては、二本鎖を形 成してレ、るポリヌクレオチドとカチオン性担体とを混合する方法が一般的である。しか しながら、力かる方法により調製されたポリヌクレオチドとカチオン性担体との複合体 は、その粒子径が数 z m〜数百 x mと一般に非常に大きい。そのため、かかる複合 体を含有する核酸含有複合体製剤は、ろ過滅菌をすることができず、また、人に静脈 内投与した場合に、毛細血管に塞栓等を生ずるおそれがある等の問題点を有してい る。
[0004] 上記問題点を解決する方法として、 2つのポリヌクレオチドを、それぞれ別々に一本 鎖の状態でカチオン性担体と混合し、分散処理することを特徴とする製造方法が公 開されている（例えば、特許文献 4を参照）。
[0005] ところで、主薬となるポリヌクレオチドは核酸分解酵素や温度による分解を受けやす く、より安定である方が好ましいことは言うまでもない。
[0006] 特許文献 1：国際公開第 99/20283号パンフレット
特許文献 2 :国際公開第 99/48531号パンフレット
特許文献 3 :国際公開第 2004/106511号パンフレット
特許文献 4 :国際公開第 99/61032号パンフレット 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、ろ過滅菌及び人への静脈内投与が可能であって、かつポリヌクレオチド の安定性を保持しうる、核酸含有複合体製剤の製造方法を提供することを主な目的 とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、相補的な 2つのポリヌクレオチドとカチオン 性担体とを用いて核酸含有複合体製剤を製造する際に、 2つの一本鎖ポリヌクレオ チドを同一溶液中に溶解させた後に、力かる溶液とカチオン性担体とを混合し、分散 処理することにより、上記目的を達成しうることを見出し、本発明を完成した。
[0009] 本発明としては、例えば、下記（1)、（2)を挙げることができる。
(1)二本鎖を形成し得る 2つのポリヌクレオチドを同一溶液中に一本鎖の状態で含有 する溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混 合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法。
(2)上記（1)の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明に係る「ポリヌクレオチド」には、ポリデォキシリボヌクレオチド及びポリリボヌク レオチドが含まれる。また、ポリデォキシリボヌクレオチドにはオリゴデォキシリボヌタレ ォチドが、ポリリボヌクレオチドにはオリゴリボヌクレオチド力 それぞれ含まれる。
[0011] ポリデォキシリボヌクレオチドは、その一部カ^ボヌクレオチドに置換されていてもよ レ、。ポリリボヌクレオチドは、その一部がデォキシリボヌクレオチドに置換されていても よい。
[0012] ポリヌクレオチドとしては、例えば、ポリイノシン酸（以下、「ポリ I」という）、ポリシチジ ル酸（以下、「ポリ C」という）、ポリアデニル酸、ポリゥリジル酸、ポリ（シチジル酸、ゥリ ジン酸）、ポリ（シチジル酸、 4 チォゥリジン酸）、ポリシチジル酸 'ポリ L リジン、 ポリ（1ービエルシチジル酸）やアンチセンス DNA、アンチセンス RNA、 DNAェンザ ィム、リボザィム、デコイ、ァプタマ一、 RNA干渉 [RNA interference (以下、「RN Ai」とレ、う） ]を発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖、アンチセンス鎖を挙 げること力 Sできる。また、 RNAiを発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例え ば、 siRNA、 microRNA(miRNA)、 short hairpin RNA (shRNA)、 small nu clear RNA (snRNA)を挙げることができる。なお、「RNAi」とは、当業者にとって 自明であるが、二本鎖オリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、導入した二本 鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ mRN Aが特異的に分解され、その結果、力かる mRNAのコードする遺伝子産物の合成が 抑制される現象である。
[0013] ポリヌクレオチドの塩基数は、特に制限されず、例えば、 5000以下が適当であり、 2 000以下が好ましレ、。力かる塩基数は、ポリヌクレオチドの性質により適宜選択するこ とができる。なお、本発明において、オリゴデォキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレ ォチドとは、構成する塩基数が 2〜99の範囲内のものを意味する。ここでいう「塩基 数」とは、例えば、いわゆるサイズ排除クロマトグラフィーにより、分子量標準品のクロ マトグラムのピークと試料のクロマトグラムのピークとから算出される塩基数をいう。即 ち、当該クロマトグラムの最大頻度から算出される塩基数を意味する。
[0014] 本発明に係る「ポリヌクレオチド」 、ポリ Iやポリ Cである場合には、その塩基数は、
30〜2000の範囲内力 S適当であり、 60〜： 1000の範囲内力 S好ましぐ、 100〜500の範 圏内がより好ましい。
[0015] 本発明に係る「ポリヌクレオチド」が、 RNAiを発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチド のセンス鎖やアンチセンス鎖である場合には、その塩基数は、 10〜50の範囲内が 適当であり、 12〜40の範囲内が好ましぐ 15〜30の範囲内がより好ましい。
[0016] ポリヌクレオチドは、その全部又は一部が化学修飾されたものでもよレ、。かかる化学 修飾されたポリヌクレオチドとしては、例えば、ポリ（7—デァザイノシン酸）、ポリ（2' - アジドイノシン酸）等の部分的に化学修飾されたポリ Iやポリ（5—ブロモシチジル酸）、 ポリ（2_チオシチジル酸）、ポリ（シチジン— 5'—チォリン酸）等の部分的に化学修 飾されたポリ Cを挙げること力できる。また、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安 定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖成分又はリン酸バックボーン 等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。 [0017] ポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法により製造することができる。例えば、ホス ホアミダイト法又はトリエステル法による固相合成法又は液相合成法により、核酸自 動合成機又は手動にて製造することができる。また、二本鎖を形成しているポリヌクレ ォチドに、 60°C以上の加熱を行う非酵素処理又はへリカーゼ等を用いた酵素処理に より、二本鎖を解離させ、製造することもできる。
[0018] 本発明に係る「2つのポリヌクレオチド」としては、二本鎖を形成し得るものであれば 特に制限されず、例えば、ポリデォキシヌクレオチドとポリリボヌクレオチドとの組み合 わせであってもよい。また、 2つのポリヌクレオチドの塩基数は、必ずしも、同数である 必要はない。
[0019] 「二本鎖を形成し得る」とは、生理的条件下で、 2つのポリヌクレオチドを混合した場 合に、二本鎖を形成し得る程度に相補的な配列を有することを意味する。ここで、上 記「生理的条件下」とは、生体内と類似の pH、塩組成、温度に調節された条件を意 味する。例えば、室温下、 pHが 5〜8の範囲内であって、塩化ナトリウム濃度が 150 mMの条件下を挙げることができる。
[0020] 本発明に係る「カチオン性担体」としては、医薬上許容されるものであれば特に制 限されず、例えば、 2—〇一（2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3—〇一 ジォレオイルグリセロール (以下、「化合物 A」という）とリン脂質を必須の構成成分と するカチオン性担体（以下、「担体 A」という）、 N_ [l _ (2， 3—ジォレイ口キシ）プロ ピル]— N， N, N—トリメチルアンモニゥムクロリドとリン脂質を必須の構成成分とする カチオン性担体、ォリゴフヱクトァミン (登録商標）（Invitrogen社製）、リボフヱクチン（ 登録商標）（Invitrogen社製）、リボフヱクトァミン (登録商標）（Invitrogen社製）、リ ポフエクトァミン 2000 (登録商標）（Invitrogen社製）、 DMRIE— C (登録商標）（Inv itrogen社製）、 GeneSilencer (登録商標）（Gene Therapy Systems社製）、 Tr ansMessenger (登録商標）（QIAGEN社製）又は TransIT TK〇（登録商標）（Mi ms社製）を挙げることができる。それらの中で、特に担体 Aが好ましい。
[0021] 本発明に係る「カチオン性担体」の製造方法を、担体 Aを例として掲げ、以下に説 明する。
[0022] 担体 Aを構成する化合物 Aは、国際公開第 94/19314号パンフレットに開示され てレ、る方法により合成することができる。
[0023] 担体 Aを構成するリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限 されず、例えば、卵黄ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン、ホスファチジル エタノールァミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフインゴミエリ ン又は卵黄レシチンや大豆レシチン等のレシチンを挙げることができる。それらの中 で、特にレシチンが好ましい。
[0024] 担体 Aは、例えば、化合物 Aとリン脂質とを混合し、常法により、溶液中で分散処理 することにより調製すること力 Sできる。分散処理には、乳化分散機等を適宜用いること ができる。力かる乳化分散機としては、医薬用途で用いられるものであれば特に制限 されず、例えば、 SONIFIER (登録商標）（BRANSON社製。以下同じ。）等の超音 波分散機やマイクロフルイダィザー（登録商標）（マイクロフルィディックス社製。以下 同じ。）、ナノマイザ一（登録商標）（吉田機械興業社製。以下同じ。）、 DeBEE2000 (登録商標） (BEE international社製。以下同じ。）、アルティマイザ一（登録商標） (スギノマシン社製。以下同じ。）、 Nano2000 (登録商標）（日本ビーィーィ一社製。 以下同じ。）等の高圧乳化分散機を挙げることができる。
[0025] 化合物 Aとリン脂質を分散させる溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特 に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブド ゥ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。
[0026] 分散させる際の処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択することができる。
[0027] 担体 Aを調製する際に用いる、化合物 Aとリン脂質との混合比率 (リン脂質の重量 Z化合物 Aの重量)は、用いるリン脂質の種類や核酸含有複合体製剤を製造する際 に担体 Aと混合する 2つのポリヌクレオチドの性質等により異なる力 0.：!〜 10の範 圏内が適当であり、 0. 5〜5の範囲内が好ましぐ：!〜 2の範囲内がより好ましい。
[0028] 本発明に係る核酸含有複合体製剤（以下、「本発明製剤」という）は、 2つのポリヌク レオチドを同一溶液中に溶解させた後に、力かる溶液とカチオン性担体が分散して いる溶液又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、常法により、分 散処理することにより製造することができる。分散処理には、乳化分散機等を適宜用 レ、ることができる。力かる乳化分散機としては、医薬用途で用いられるものであれば 特に制限されず、例えば、 SONIFIER (登録商標）等の超音波分散機やマイクロフ ルイダイザ一（登録商標）、ナノマイザ一（登録商標）、 DeBEE2000 (登録商標）、了 ルティマイザ一（登録商標）、 Nano2000 (登録商標）等の高圧乳化分散機を挙げる こと力 Sできる。
[0029] ポリヌクレオチドを溶解させる溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制 限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖 液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。
[0030] 分散させる際の処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択することができる。
[0031] 本発明製剤を製造する際に用いる、ポリヌクレオチドとカチオン性担体との混合比 率（ポリヌクレオチドの総重量/力チオン性担体の重量）は、用いるポリヌクレオチド ゃカチオン性担体の性質等により異なる力 0. 0005〜1の範囲内が適当であり、 0 . 001 -0. 4の範囲内が好ましい。また、カチオン性担体が担体 Aである場合には、 0. 0005〜：!の範囲内力 S適当であり、 0. 001〜0. 4の範囲内力 S好ましく、 0. 01〜0 . 2の範囲内がより好ましい。
[0032] 本発明製剤には、 2つのポリヌクレオチドとカチオン性担体以外に、任意に医薬上 許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤としては、例えば、乳化補 助剤（例えば、力プリル酸、力プリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステ アリン酸、ォレイン酸、リノール酸、ァラキドン酸又はドコサへキサェン酸等の脂肪酸 やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステ ロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩ィ匕ナトリウム、グルコース、マルトー ス、ラタトース、スクロース、トレハロース）、 pH調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、 酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールァミン）を挙げることができる。 これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明製剤中の当該添加剤の含 有量は、 90重量％以下が適当であり、 70重量％以下が好ましぐ 50重量％以下が より好ましい。
[0033] 上記添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
[0034] 本発明製剤は、分散処理後、必要に応じて、 0. 2 μ mのメンブランフィルターを用 いて、ろ過滅菌を行うことができる。 [0035] 本発明製剤は、凍結乾燥製剤とすることができる。かかる凍結乾燥製剤は、常法に より、液状の本発明製剤を凍結乾燥することにより調製することができる。例えば、液 状の本発明製剤を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約一 40 〜 _ 20°Cの条件で予備凍結を 2時間程度行レ、、約 0〜： 10°Cで減圧下に一次乾燥を 行レ、、次いで、約 15〜25°Cで減圧下に二次乾燥して、凍結乾燥することができる。 そして、一般的には、バイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して、本発明製剤の凍 結乾燥製剤を得ることができる。
[0036] 本発明製剤の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液 (再溶解液）の添加に よって再溶解し、使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生 理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等 によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の 0. 5〜5倍量、又は 500 mL以下が適当である。
[0037] 本発明製剤の投与形態は、医薬上許容される投与形態であれば特に制限されず、 例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、粘膜投与、 直腸内投与を挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、粘膜 投与が好ましい。また、投与形態に応じて、適した剤型、例えば、各種の注射剤、経 口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤として投与することがで きる。
実施例
[0038] 以下に、実施例、比較例、試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本 発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
実施例：!〜 7及び比較例 1で行われた分散処理後の 0. 2 μ mのメンブランフィルタ 一によるろ過滅菌において、いずれもフィルターの目詰まりもなくろ過滅菌を行うこと ができ、またろ液中の回収率も、いずれも 98〜： 102%の範囲内であり、ほぼ 100%の ろ過滅菌が可能であった。
[0039] 実施例 1
3gの化合物 A、 5gの精製卵黄レシチン (キューピー社製。以下同じ。）及び 50gの マルトース（林原社製。以下同じ。）に 215mLの注射用水（大塚製薬社製。以下同じ 。）をカ卩ぇ攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて 30分間分散処理し、カチオン性担体 の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機 [マイクロフルイダィザ 一（登録商標）。以下同じ。 ]を用いて、処理圧 108MPaで 30分間分散処理し、 8gの カチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約 170である、 250mgのポリ Iと、 塩基数が約 180である、 250mgのポリ Cとを 200mLの注射用水に加え、溶解させた 。この溶液 200mLをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、 高圧乳化分散機を用いて、処理圧 108MPaで 2時間分散処理した後、 0. 2 μ mのメ ンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を 2mLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 1. 8mLの注射用水を加えて再溶解した。再 溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置 [Nicomp370 (登録商標）： Particle Sizing Systems, Inc.社製。 以下同じ。 ]によって測定したところ、 152nmであった。また、 1 /i m以上の粒子は含 まれなかった。
実施例 2
1. 5gのィ匕合物 Aゝ 2. 5gの精製卵黄レシチン及び 50gのマノレ卜ースに 221mLの注 射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて 30分間分散処理し、カチオン性 担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧 108MPaで 30分間分散処理し、 4gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基 数力約 400である、 125mgのポリ Iと、塩基数カ 勺 380である、 125mgのポリ Cとを 2 OOmLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液 200mLをカチオン性担体の分散 液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧 108MPa で 2時間分散処理した後、 0. 2 z mのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製 剤を得た。
その後、この本発明製剤を lmLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 5mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解 後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測 定装置粒子径測定装置によって測定したところ、 146nmであった。また、 1 /i m以上 の粒子は含まれなかった。
[0041] 実施例 3
3gの化合物 A、 5gのパルミトイル―ォレイル—ホスファチジルコリン（日本油脂社製 。）及び 50gのマルトースに 215mLの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザー を用いて 30分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を 、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧 108MPaで 30分間分散処理し、 8gのカチ オン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約 310である、 250mgのポリ Iと、塩基 数力 S約 330である、 250mgのポリ Cとを 200mLの注射用水にカロえ、溶解させた。こ の溶液 200mLをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧 乳化分散機を用いて、処理圧 108MPaで 2時間分散処理した後、 0. 2 μ mのメンブ ランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を 2mLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 1. 8mLの注射用水を加えて再溶解した。再 溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 142nmであった。また、 1 /i m以上の粒子は含 まれなかった。
[0042] 実施例 4
0. 12gのィ匕合物 A、 0. 2gの精製卵黄レシチン及び 2gのマルトースに注射用水を 加えて 10mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる 粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力 100Wで 15分間分散処理し、 0. 32 gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約 310である、 lOmgのポリ Iと 、塩基数が約 330である、 lOmgのポリ Cとを 50mLの注射用水に加え、溶解させた。 この溶液 5mLをカチオン性担体の分散液 5mLに、攪拌しながら添加し、更に、超音 波分散機 [SONIFIER (登録商標）。以下同じ。 ]を用いて、出力 100Wで 15分間分 散処理した後、 0. 2 z mのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。 その後、この本発明製剤を lmLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 0. 87mLの注射用水を加えて再溶解した。再 溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 145nmであった。また、 以上の粒子は含 まれなかった。
[0043] 実施例 5
0. 12gのィ匕合物 A、 0. 2gの精製卵黄レシチン及び 2gのマルトースに注射用水を 加えて 10mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる 粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力 100Wで 15分間分散処理し、 0. 32 gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約 310である、 30mgのポリ Iと 、塩基数が約 330である、 30mgのポリ Cとを 10mLの注射用水に加え、溶解させた。 この溶液 5mLをカチオン性担体の分散液 5mLに、攪拌しながら添加し、更に、超音 波分散機を用いて、出力 100Wで 15分間分散処理した後、 0. 2 / mのメンブランフ ィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を lmLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 0. 87mLの注射用水を加えて再溶解した。再 溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 163nmであった。また、 1 /i m以上の粒子は含 まれなかった。
[0044] 実施例 6
0. 16gの N— [1— (2, 3—ジォレイ口キシ）プロピル]— N, N, N—トリメチルアン モニゥムクロリド（東京化成工業社製。）、0. 16gのジォレイルホスファチジルエタノー ルァミン（日本油脂社製。）及び 2gのマルトースに注射用水をカ卩えて 10mLにした後 、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音 波分散機を用いて、出力 100Wで 15分間分散処理し、 0. 32gのカチオン性担体の 分散液を得た。次に、塩基数が約 310である、 10mgのポリ Iと、塩基数が約 330であ る、 10mgのポリ Cとを 10mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液 5mLをカチ オン性担体の分散液 5mLに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機を用いて、 出力 100Wで 15分間分散処理した後、 0. 2 z mのメンブランフィルターでろ過滅菌 し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を lmLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 0. 87mLの注射用水を加えて再溶解した。再 溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 151nmであった。また、 l z m以上の粒子は含 まれなかった。
[0045] 実施例 7
0. 6gの化合物 A、 lgの精製卵黄レシチン及び 10gのマルトースに注射用水を加 えて 50mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗 分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて処理圧 135MPaで 90分間分散処理し、 1 . 6gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、 5gのマルトースに注射用水を加え 25 mLにした溶液に、塩基数が共に 21である、互いに相補的な配列を有する 2つのオリ ゴリボヌクレオチドを、それぞれ 25mg溶解させた。この溶液 25mLをカチオン性担体 の分散液 25mLに、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧 1 35MPaで 40分間分散処理した後、 0. 2 μ mのメンブランフィルターでろ過滅菌し、 本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を lmLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥 製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 0. 87mLの注射用水を加えて再溶解した。再 溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 147nmであった。また、 以上の粒子は含 まれなかった。
[0046] 比較例 1
3gの化合物 A、 5gの精製卵黄レシチン及び 50gのマルトースに 215mLの注射用 水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて 30分間分散処理し、カチオン性担体 の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧 108 MPaで 30分間分散処理し、 8gのカチオン性担体の分散液を得た。この分散液全量 に塩基数が約 180である、 250mgのポリ Iを含む lOOmLの水溶液と塩基数が約 200 である、 250mgのポリ Cを含む lOOmLの水溶液を同時に攪拌しながら添加し、更に 、高圧乳化分散機を用いて、処理圧 108MPaで 2時間分散処理した後、 0. の メンブランフィルターでろ過滅菌し、比較製剤を得た。 その後、この比較製剤を 2mLづっバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製 剤とした。得られた凍結乾燥製剤に 1. 8mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶 解後の比較製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測 定装置によって測定したところ、 149nmであった。また、 l z m以上の粒子は含まれ なかった。
[0047] 試験例 1
実施例 1で得られた本発明製剤と比較例 1で得られた比較製剤に含有されている ポリ Iとポリ Cの温度に対する安定性を、ポリ Iとポリ Cのそれぞれの塩基数の変化から 評価した。
実験は、各製剤を、温度 40°C、相対湿度 75%の条件下で、 2週間保存した後、ジ ェチルエーテル (ナカライテスタ社製。以下同じ。）を用いて脱脂を行った。その後、 T SK-Gel G5000PW カラム（東ソ一社製。以下同じ。）を用い、サイズ排除クロマ
XL
トグラフィ一の一種であるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、 250nmと 260nmの吸 光度を測定し、ポリ Iとポリ Cのそれぞれの塩基数を算出した。
その結果を表 1に示す。
表 1から明らかな通り、比較例 1で得られた比較製剤中のポリ I及びポリ Cは、保存中 に、その塩基数は減少したのに対して、実施例 1で得られた本発明製剤中のポリ I及 びポリ Cは、保存前後で、その塩基数は変動せず、比較製剤より温度に対して安定 であった。
[0048] [表 1]
Figure imgf000013_0001
[0049] 試験例 2
実施例 2及び実施例 3で得られた本発明製剤に含有されているポリ Iとポリ Cの温度 に対する安定性を、ポリ Iとポリ cのそれぞれの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度 40°C、相対湿度 75%の条件下で、 6ヶ月保存した後、ジ ェチルエーテルを用いて脱脂を行った。その後、 TSK_Gel G5000PW カラムを
XL
用レ、、ゲルろ過クロマトグラフィーを行レ、、 250nmと 260nmの吸光度を測定し、ポリ I とポリ Cのそれぞれの塩基数を算出した。
その結果を表 2に示す。
表 2から明らかな通り、実施例 2及び実施例 3で得られた本発明製剤中のポリ I及び ポリ Cは、保存前後で、その塩基数は変動せず、共に温度に対して安定であった。
[表 2]
Figure imgf000014_0001
[0051] 試験例 3
実施例 7で得られた本発明製剤に含有されているオリゴリボヌクレオチドの温度に 対する安定性を、オリゴリボヌクレオチドの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度 40°C、相対湿度 75%の条件下で、 6ヶ月保存した後、ジ ェチルエーテルを用いて脱脂を行った。その後、 DNAPac PA— 100カラム（DIO NEX社製。）を用い、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、オリゴリボヌクレオチドの 塩基数を算出した。
その結果を表 3に示す。
表 3から明らかな通り、実施例 7で得られた本発明製剤中のオリゴリボヌクレオチド は、保存前後で、その塩基数は変動せず、温度に対して安定であった。
[0052] [表 3] 保存前 保存後 実施例マ 2 1 ± 0 2 1 ± 0
[0053] 試験例 4
実施例 2で得られた本発明製剤を、温度 40°C、相対湿度 75%の条件下で、 6ヶ月 保存した後の薬理活性の変動を、ヒト扁平上皮がん由来の細胞株である A431細胞 に対する増殖抑制作用から評価した。
1)実験方法
細胞濃度を 105個/ mLに調整した A431細胞の細胞浮遊液を、 96穴ゥエルプレ ートに 90 μ Lずつ分注した後、 4〜6時間静置し、 A431細胞をプレート底面に接着 させた。その後、種々の濃度の本発明製剤を添加し、その 3日後に、 ΜΤΤ法により 呈色反応を行った後に、マイクロプレートリーダーを用いて、各ゥエルの 570nmにお ける吸光度を測定した。なお、本発明製剤の代わりに、生理食塩水を添加し、同様に 培養した細胞を陰性対照細胞とした。
2)評価方法
評価は、次式より算出した細胞増殖阻害率（％)に基づき、 IC (ngZmL)を算出
50
することにより行った。なお、 IC は、ポリ Iとポリ Cとを合わせた濃度である。
50
細胞増殖阻害率（％) = (1— [薬剤処理細胞の吸光度/陰性対照細胞の吸光度] ) X 100
3)試験結果
その結果を表 4に示す。
表 4から明らかな通り、実施例 2で得られた本発明製剤は、保存前後で、その
50 に変動はなぐ薬理活性は保持されていた。
[0054] [表 4] 保存前 保存後
実施例 2 7 . 6 土 1 . 2 8 . 1 土 1 . 5 試験例 5
核酸含有複合体製剤中の 2つのポリヌクレオチドの存在形態を、蛍光共鳴エネルギ 一移励 [Fluorescence Resonance Energy Transfer (以 f、「FRET」とレヽっ J」 法を用い、 2つのポリヌクレオチド間の距離を測定することにより評価した。
FRET法とは、当業者に既知の方法であり、具体的には、光吸収により発生する励 起エネルギー供与体蛍光分子と励起エネルギー受容体蛍光分子の相対的位置関 係を蛍光のシグナルとして測定する方法である。
1)試験用試料の調製
1)蛍光標識したポリ I及びポリ Cの調製
当業者に既知の方法により、塩基数が約 170であるポリ Iに Alexa Fluor568 (Mo lecular Probe社製。）を導入し、蛍光標識したポリ I (以下、「蛍光化ポリ I」という）を 調製した。同様に、塩基数が約 180であるポリ Cに Alexa Fluor546 (Molecular Probe社製。）を導入し、蛍光標識したポリ C (以下、「蛍光化ポリ C」という）を調製し た。
ii)本発明製剤及びその比較対照用試料の調製
上記 i)で得られた蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを用いて、実施例 1と同様の条件下 で、蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを共に含有する本発明製剤と、蛍光化ポリ Cのみを 含有する本発明製剤の比較対照試料を調製した。
iii)比較製剤及びその比較対照用試料の調製
上記 i)で得られた蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを用いて、比較例 1と同様の条件下 で、蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを共に含有する比較製剤と、蛍光化ポリ Cのみを含 有する比較製剤の比較対照試料を調製した。
iv)陽性対照試料及びその比較対照用試料の調製
上記 i)で得られた蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを用いて、同一の生理食塩水中に、 蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを共に溶解させた陽性対照試料と、蛍光化ポリ Cのみを 溶解させた陽性対照試料の比較対照試料を調製した。
2)評価方法
評価は、上記 1)で調製した本発明製剤、比較製剤、陽性対照試料及びそれぞれ の比較対照試料の蛍光強度を測定し、その値より FRET効率を算出することにより行 つた。なお、 FRET効率とは、蛍光化ポリ Iと蛍光化ポリ Cとを共に含有する試験用試 料の蛍光強度を、蛍光化ポリ Cのみを含有する当該試験用試料の比較対照試料の 蛍光強度で除した値を、 1より引いた値である。
FRET効率が高くなるほど、試験試料中のポリ Iとポリ Cの間の距離は近いと判断さ れる。
3)試験結果
試験結果を表 5に示す。
表 5から明らかな通り、本発明製剤中のポリ Iとポリ Cの間の距離は、比較製剤中の ポリ Iとポリ Cの間の距離よりも短ぐ陽性対照試料中のポリ Iとポリ Cの間の距離と同等 であった。即ち、本発明製剤中のポリ Iとポリ Cは、二本鎖を形成しているポリ Iとポリ C の距離と同等であることが示された。
[表 5]
F R E T効率
本発明製剤 0 . 5 9 土 0 . 0 0
比較製剤 0 . 2 0 土 0 . 0 7
陽性対照試料 0 . 6 1 土 0 . 0 3

Claims

請求の範囲
[1] 二本鎖を形成し得る 2つのポリヌクレオチドを同一溶液中に一本鎖の状態で含有す る溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合 し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法。
[2] ポリヌクレオチド力 ポリデォキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドである、請 求項 1に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
[3] ポリヌクレオチド力 S、オリゴデォキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドであ る、請求項 1に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
[4] ポリヌクレオチド力 ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリアデニル酸、ポリゥリジノレ 酸、ポリ（シチジル酸、ゥリジン酸）、ポリ（シチジル酸、 4 チォゥリジン酸）、ポリシチ ジル酸 ·ポリ— L—リジン、ポリ（1—ビュルシチジル酸）、アンチセンス DNA、アンチ センス RNA、 DNAェンザィム、リボザィム、デコイ、ァプタマ一又は RNA干渉を発揮 し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖である、請求項 1 に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
[5] ポリヌクレオチド力 ポリイノシン酸、ポリシチジノレ酸又は RNA干渉を発揮し得る二 本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖である、請求項 1に記載の 核酸含有複合体製剤の製造方法。
[6] カチオン性担体が、 2_〇_ (2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイル— 1， 3 _〇 —ジォレオイルグリセロールとリン脂質とを必須の構成成分とするカチオン性担体で ある、請求項:!〜 5のいずれかに記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
[7] リン脂質が、レシチンである、請求項 6に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
[8] 請求項：!〜 7のいずれかに記載の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
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