WO2006126574A1 - Es細胞の分化誘導方法 - Google Patents

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WO2006126574A1
WO2006126574A1 PCT/JP2006/310324 JP2006310324W WO2006126574A1 WO 2006126574 A1 WO2006126574 A1 WO 2006126574A1 JP 2006310324 W JP2006310324 W JP 2006310324W WO 2006126574 A1 WO2006126574 A1 WO 2006126574A1
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endoderm
differentiation
cell
pdxl
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PCT/JP2006/310324
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Shoen Kume
Nobuaki Shiraki
Tetsu Yoshida
Hideo Goto
Kazuhiko Kume
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Kumamoto University
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of ES cells. More specifically, the present invention relates to a method for inducing ES cells into endoderm using a cell line derived from mesoderm as a support cell.
  • ES cells Due to its pluripotency, ES cells are a useful model system for studying gene function in the nascent stage, and have the potential to become a transplantable cell source for medical use. In order to use ES cells for cell replacement therapy in diseases such as diabetes, differentiation needs to be controlled, which remains a major challenge. Although understanding of the differentiation of ES cells into neural tissue, hematopoietic tissue and heart tissue has advanced considerably (Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., et al. (200 0).
  • Flkl- positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenit ors.Nature 408, 92-6; and Ying, QL, Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., and Smith, A. (2003). Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol 21, 183-6) There is little knowledge about the differentiation of ES cells into endoderm tissues.
  • insulin-containing splenocytes such as ES cells
  • ES cells insulin-containing splenocytes
  • splenocytes such as ES cells
  • splenocytes were formed in vitro by adding specific factors after culturing under conditions where the nestin-positive neuron population was enriched.
  • s reported (Lumelsky, N., Blondel, 0. , Laeng, P., Velasco, I., Ravin, R., and Mc Kay, R. (2001). Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structure s similar to pancreatic islets. Science 292, 1389—94).
  • this insulin-positive cell does not express Pdxl, a marker of 8 cells in the functional knee of both the spleen and duodenum endoderm. The cells did not express insulin I transcripts, but expressed trace amounts of insulin II transcripts.
  • Pdxl expression is the first divergence signal and is detected in the dorsal endoderm of the intestinal tract in day 8.5 embryos. In day 9.5 embryos, Pdxl expression is found in dorsal and ventral spleen buds and duodenal endoderm. In adults, Pdxl expression is maintained in the duodenal epithelium and the islet ⁇ cells that secrete insulin and plays an important role in the transcriptional regulation of the insulin gene (Offield, MF, Jetton, TL, Labosky, PA, et al. (199 6). PDX ⁇ is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duod enum. Development 122, 983-95).
  • Pdxl is required for splenectomy and rostral duodenum development (Ahlgren, U., Jons son, J., and Edlund, H. (1996).
  • the morphogenesis of the pancreatic mesenchyme is uncoupled from that of the pancreatic epithelium in I PF1 / PDX1— deficient mice.
  • De velopment 122, 1409-16 Therefore, Pdxl is an essential molecule for the development of the spleen and is useful as an early marker for splenic progenitor cells and other endoderm-derived tissues such as the stomach, duodenum, and bile ducts.
  • the present inventors have previously reported a protocol for efficiently generating Pdxl-positive cells using an ES cell line having a lacZ reporter gene at the Pdxl locus.
  • Co-culture of ES cells with embryonic spleen primordia or splenic mesenchyme showed that the number of cells induced to differentiate into Pdxl-expressing cells was markedly increased.
  • TGF 2 is a factor that partially mimics the splenic primordium activity.
  • F.V F.V "Jr., Sugden, L., and Bothwell, M. (1998).
  • CMIX Ch aracterization of CMIX, a chicken homeobox gene related to the Xenopus gene mix.
  • CMIX a paired-type homeobox gene expressed before and during formation of The avian prim mitive streak.
  • Mech Dev 75, 163-5 This specifically promoted the differentiation of ES cells into the endoderm system. Application of embryonic spleen primordia or splenic mesenchyme to induce ES cell differentiation is difficult.
  • An object of the present invention is to provide a novel ES cell sorting method that enables differentiation of even a large amount of ES cells into the endoderm system.
  • any type of cell promotes the growth of endoderm cells, leading to the separation of specific cells on the anteroposterior axis, and these cells are of splenic primordia or splenic mesenchymal force We speculated that it would replace the signal. Therefore, the present inventors screened established cell lines in order to discover such induction sources, and the cell line derived from mesoderm strongly induces differentiation of ES cells into endoderm! They found sputum activity and promoted spleen or liver development. The present invention has been completed based on these findings.
  • a method for inducing differentiation from ES cells to endoderm cells comprising culturing ES cells derived from a mammal in the presence of supporting cells.
  • the feeder cells are cells derived from mesoderm.
  • the feeder cells are M15 cells, MEF cells or ST2 cells.
  • differentiation is induced from ES cells into any of undifferentiated endoderm progenitor cells, immature cells of endoderm-derived organs, or mature cells of endoderm-derived organs.
  • the endoderm-derived organ is the spleen, liver, lung, pharynx, or small intestine.
  • actin bin basic fibroblast growth growth factor (bFGF), and Z or noggin are added and cultured.
  • bFGF basic fibroblast growth growth factor
  • nicotinamide is further added and cultured.
  • mammalian ES cells are mouse, monkey or human ES cells.
  • an endoderm cell obtained by the above-described method of the present invention and induced to differentiate from an ES cell.
  • a step of inducing differentiation from an ES cell into an endoderm cell by the above-described method of the present invention, and the endoderm cell induced to differentiate by fluorescence labeling is provided.
  • a method for obtaining endoderm cells induced to differentiate from ES cells, comprising a step of separation by flow cytometry (FACS) is provided.
  • endoderm cells differentiated from ES cells obtained by the method of the present invention described above are coated on a plate coated with 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine.
  • Endodermal system derived from ES cells, including culturing A method for maintenance culture of cells is provided.
  • the culture is performed in the presence of knockout serum replacement (KSR).
  • KSR knockout serum replacement
  • the presence of a test substance is induced when differentiation is induced from ES cells to endoderm cells by culturing mammalian-derived ES cells in the presence of supporting cells.
  • ES cells are cultured under the condition that ES cells are cultured in the absence of the test substance, the degree of differentiation induction into endoderm cells and when the ES cells are cultured in the presence of the test substance
  • a method is provided for screening for a substance that promotes or inhibits differentiation induction from ES cells to endoderm cells, comprising comparing the degree of differentiation induction into system cells.
  • the test substance is a growth factor or a low molecular weight compound.
  • the degree of differentiation induction into endoderm cells is measured using the expression level of the marker expressed in the endoderm as an index.
  • mammalian ES cells are mouse, monkey or human ES cells.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation from ES cells into endoderm cells, and in particular, a method characterized by culturing mammalian-derived ES cells in the presence of supporting cells.
  • ES cells can be induced to differentiate into endoderm-derived digestive organ cells such as knees using feeder cells. Inducing differentiation of endoderm cells using feeder cells has been achieved for the first time by the present invention which has not been reported so far.
  • the expression of the gene marker gene (Pdxl) of spleen stem cells was visualized with a fluorescent protein to enable rapid and sensitive detection.
  • ES cells are easily induced to differentiate by co-culture with supporting cells. Therefore, addition of a specific growth and proliferation factor further promotes differentiation induction. Therefore, the method of the present invention can also be used as a screening for unknown differentiation-inducing factors.
  • the ES cells used in the present invention may be ES cells derived from mammals. It is not particularly limited, and for example, mouse, monkey or human-derived ES cells can be used.
  • a cell having a reporter gene introduced in the vicinity of the Pdxl gene can be used in order to facilitate confirmation of the extent of the ES cell.
  • ES cell SK7 with 129 / Sv-derived ES cell line Rl, J1 or GFP reporter transgene under the control of the Pdxl promoter incorporating the lacZ gene at the P dxl locus Stocks can be used.
  • 8 endoderm-specific enzyme fragment and a GFP reporter transgene under the control of the Pdxl promoter can also be used.
  • Mammal-derived ES cells can be cultured by a conventional method. For example, in the presence of mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts (MEF) as feeder cells, LIF ( Differentiation medium supplemented with ESGRO 1000 units / ml, manufactured by Chemicon (10% urine fetal serum (FBS), O.lmM 2-mercaptoethanol, 100 M non-essential amino acids, Dulbecco's supplement supplemented with 2 mM L-glutamine Eagle medium (DMEM, Sigma)).
  • MEF mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts
  • LIF Differentiation medium supplemented with ESGRO 1000 units / ml, manufactured by Chemicon (10% urine fetal serum (FBS), O.lmM 2-mercaptoethanol, 100 M non-essential amino acids, Dulbecco's supplement supplemented with 2 mM L-glutamine Eagle medium (DMEM, Sigma)
  • ES cells are cultured in the presence of supporting cells, that is, ES cells are co-cultured with supporting cells.
  • the feeder cells used in the present invention are not particularly limited as long as ES cells can be induced to differentiate into endoderm cells, but preferably cells derived from mesoderm can be used as feeder cells. . Specific examples of cells derived from mesoderm that can induce differentiation of ES cells into endoderm cells include M15 cells, MEF cells, and ST2 cells.
  • M15 cells are registered in the cell bank as registration number ECACC 95102517.
  • M15 cells are described in the literature (Larsson, SH, Charlieu, JP, Miyagawa, K., et al. (1995). Subnuclear localization of WTl in splicing or transcription factor dom ains is regulated by alternative splicing. Cell 81, 391—401). Description [Accordingly, obtain nj " ⁇ . Bank information about M15 is described below.
  • the W ⁇ 1 -expressing mesonephric cell line M15 (alias Mesol5) was established from mouse mesonephros transgenically expressing the large T protein of polyoma virus under the control of the early viral enhancer.As a tumour suppresser gene with a ke y role in urogenital development , WTl is implicated as predisposition gene in the pathogenesis of Wilms' tumour (WT).
  • MEF from ICR mouse
  • ATCC # SCRC-1046 catalog number ATCC # SCRC-1046.
  • MEF cells can be obtained from the literature (Nagy A, et al. Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Third Edition Cold Spring Harbor Press; 2003).
  • ST2 cells are registered as RCB0224 in the RIKEN Tsukuba Research Institute Bioresource Center.
  • ST2 cells can be used in the literature (Ogawa, M., Nishikawa, S., Ikuta, K., Yamamura, F., Naito, M., Takahashi, K. and Nishikawa, S. EMBO J 1988; 7: 1337. -1343).
  • feeder cells can be cultured according to a conventional method using a normal medium for animal cells supplemented with serum or the like (eg, RPMI medium or DMEM medium).
  • a normal medium for animal cells supplemented with serum or the like eg, RPMI medium or DMEM medium.
  • ES cells can be cultured using feeder cells as feeder cells.
  • feeder cells For example, undifferentiated ES cells are dissociated with trypsin and suspended in an untreated culture dish in the presence of LIF in a differentiation medium to form embryoid bodies. Embryoid bodies that have been differentiated for 2 days are treated with trypsin, and seeded in a sorting medium on a plate that has been previously engrafted (pre-coated) with feeder cells (support cells).
  • the endoderm system can be cultured by culturing for several days. Differentiation can be induced into cells.
  • the separation induction method of the present invention when culturing ES cells in the presence of supporting cells, another substance (eg, a growth factor or a low molecular weight compound) is added and cultured. You can also. For example, differentiation induction from ES cells to endoderm cells can be further promoted by culturing with actinbin, bFGF and / or noggin. In addition, when lactinbin, bFGF, and / or noggin is added, differentiation induction from ES cells to endoderm cells can be promoted by further culturing with nicotinamide.
  • ES cell differentiation induction method using the feeder cells from ES cells, undifferentiated endoderm progenitor cells, immature cells of endoderm-derived organs, or maturation of endoderm-derived organs Differentiation can be induced into any of the cells.
  • endoderm-derived organs include, but are not limited to, the spleen, liver, lung, pharynx, or small intestine.
  • the separation from ES cells to endoderm cells can be confirmed by determining the expression level of the marker specific to the endoderm.
  • ES cells derived from mammals are cultured in the presence of supporting cells to induce differentiation from ES cells to endoderm cells, in the presence of a test substance.
  • ES cells are cultured in the presence of ES, and the ES cells are cultured in the absence of the test substance, they become endoderm cells, and the degree of differentiation is induced and the ES cells are cultured in the presence of the test substance.
  • a method of screening for a substance that promotes or inhibits differentiation induction from ES cells to endoderm cells comprising comparing differentiation induction to the degree of differentiation induction.
  • a growth factor or a low molecular weight compound can be used as a test substance.
  • the degree of differentiation induction into endoderm cells can be measured using the expression level of the marker expressed in the endoderm as an index.
  • the 129 / Sv-derived ES cell line Rl incorporating the lacZ gene at the Pdxl locus was provided by Dr. Christopher Wri ght (Panderbilt University).
  • the Pdxl / LacZ ES cell line is a differentiation medium (10% Ushii) supplemented with LIF (ESGR 0 1000 units / ml, Chemicon) in the presence of mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts (MEF) as feeder cells.
  • ES cell SK7 strain having an EGFP reporter transgene under the control of the Pdxl promoter was isolated from a transgenic mouse homozygous for the Pdxl / EGFP gene.
  • ES cell line SK 7 is supplemented with (1000 units / 1 ⁇ 21), 15% Knock-out Serum Replacement (KSR ⁇ Invitrogen), 1% FBS, 100 M non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, ImM sodium pyruvate Maintain on MEF in Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM, Sigma).
  • the ES cell PH3 strain which has an mRFPl reporter transgene under the control of the ⁇ endoderm-specific enhancer fragment and an EGFP reporter transgene under the control of the Pdxl promoter, is a transgenic mouse heterozygous with the Hnf3 ⁇ / mRFPl gene. And blastocyst power obtained by crossing the Pdxl / EGF P gene with a homozygous transgenic mouse.
  • the ES cell PH3 line is maintained in the same manner as the ES cell SK7 line except that it is maintained without MEF.
  • Force-quizal ES cell CMK6 strain was purchased from Asahi Techno Glass Co., Ltd. Force-quizal ES cell line is 20% KnockOut Serum Replacement (KSR, Gibco BRL), O.lmM 2-mercaptoethanol, 100 in the presence of mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts (MEF) as feeder cells. It was maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with ⁇ non-essential amino acids, 2 mM L-glutamine, and ImM sodium pyruvate and a F-12 nutrient mixture (1: 1 mixed medium (D MEM / F12, Sigma)).
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • Human ES cell strain KhES-1 was provided by the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University. Human ES cell line is 20% KnockOut Serum Replacement (KSR, Gibco BRL), O.lmM 2-mercaptoethanol, 100 M non-essential in the presence of mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts (MEF) as one feeder cell Maintained in Dulbecco's modified Dal medium supplemented with the amino acid, 2 mM L-glutamine, and a one-to-one mixed medium of F-12 nutrient mixture (DMEM / F12, Sigma)) It was.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • Pdxl / LacZ ES cells passaged once on gelatin-coated plates were used. Undissolved Pdxl / LacZ ES cells were dissociated with trypsin and treated in an untreated culture dish (Batteria grade, Iwaki Glass) at a concentration of 3.0 x 10 5 cells / 90 mm plate in the absence of LIF. Suspension culture was performed to form embryoid bodies. Embryoid bodies that had been differentiated for 2 days were treated with trypsin, and 5000 per seed in a differentiation medium was seeded on a 24-well plate pre-coated with a feeder cell. The control well was precoated with gelatin alone. ES cells seeded on control gelatin-coated wells or feeder-coated wells were allowed to stand for 12 days in differentiation medium, then the cells were fixed and analyzed for X-Gal staining.
  • ES cell line SK7 passaged on MEF was directly passaged on a gelatin-coated plate and then used directly for differentiation studies without forming embryoid bodies.
  • 500 ES cells per strain were seeded in differentiation medium and cultured for 3 to 4 days.
  • FBS was replaced with KSR at the indicated times and growth factors were added.
  • the medium was replaced only once on the 6th day with KSR replacement medium supplemented with growth factors.
  • the exact date on which growth factors were added, or the exact date on which the differentiation medium was replaced with KSR-substituted differentiation medium, is as shown in each figure. Fluorescence photographs of ES cells were taken every 24 hours under a stereomicroscope (Leica MZFLIII).
  • Day 0 of culture Seed 20,000 monkey ES cells per well in a 24-well plate in a differentiation medium. Culture medium is changed on days 1, 3, 5, 7, and 9. The differentiation medium is the same as the differentiation medium for mouse ES cells.
  • the culture conditions for human ES cells are as follows. On day 0 of culture, human ES cells were seeded on a 24-well plate at a concentration of 20,000 cells / well, and the medium was changed on days 1, 3, 5, 7, 9, and 11 of culture.
  • the medium used was KSR-substituted differentiation medium (10% KSR / DMEM (high glucose)).
  • Embryonic kidney-derived cell line M15 cells from Dr. T. Noce of Mitsubishi Chemical Life Science Institute Provided.
  • ST2 cells are stromal cells that are known to have the ability to promote differentiation into ES cells and blood cells.
  • MEFs were isolated from embryonic day 12.5-14.5 day embryos.
  • ST2 cells were cultured in RPMI medium supplemented with 5% FBS and O.lmM 2-mercaptoethanol, and the other cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS.
  • Feeder cells other than ST2 cells were treated with 200 g / ml mitomycin C for 2.5 hours before use.
  • M15 cells were seeded on gelatin-coated 24 well plates at a concentration of 2 ⁇ 10 5 per well.
  • MEF cells were used at IX 10 5 per well.
  • ST2 cells were used without mitomycin C treatment, and seeded at 5 x 10 4 cells / well on 24 well plates 3-4 days before seeding with ES cells.
  • Recombinant human fluorstatin 300 (GT, # 2669) was purchased from GT. Recombinant human activin A (GT, # 2338) was used at 10 ng / ml. Recombinant mouse noggin ZFc chimera (R & D, # 719-NG) was used at 100 ng / ml. Recombinant human bone morphogenetic protein (BMP) 2 (Osteogenetics GmbH, Wurzburg, Germany) was used at 5 ng / m or 25 ng / ml. Nicotinamide was purchased from Sigma.
  • ES cell cultures were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS for 20 minutes at room temperature, rinsed several times with PBS, and stained for j8-galactosidase activity.
  • the cells were washed with 20 mM K Fe (CN), 20 mM K Fe (CN) in PBS in the presence of lmg / ml X-gal.
  • RT reverse transcription
  • 1 ⁇ l of 5-fold diluted cDNA was used for PCR analysis.
  • Table 1 PCR primers used to detect mouse gene expression
  • Pax4 CAG GAGCCAAATGGCG TGAGCAATGGGTTGATGGCA 27
  • Pax6 CAGTCACAGCGGAGTGAATC CGCTTCAGCTGMGTCGCAT 26
  • mesoderm cells or ES cells were placed on a Nunc Thermanox Colerslips 24-well type (Nunc, # 174950). The cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature and washed thoroughly with phosphate buffered saline (PBS-T) containing 0.1% tween. Infiltrate with PBS containing 1% TritonX-100 at room temperature for 10 minutes, incubate with blocking solution (x5 Blocking One, Nacalai Tesque) for 1 hour, then add the primary antibody in the blocking solution to the sample, 4 ° Incubate overnight at C.
  • PBS-T phosphate buffered saline
  • the antibodies used for detection were rabbit anti-AFP (Biomeda, # A02), goat anti-albumin (Sigma, # A1151), mouse anti-Cdx2 (BioGenex, # MU392-UC), mouse anti-CK19 (DAKO, # M0888), Goat Anti-HNF3 ⁇ (Santa Cruz, # sc-9187), Usagi Anti-Pdxl (Chemicon, # AB5754), and Usagi Anti-T (Santa Cruz, # sc-20109), Usagi Anti-Nkx2.1 (Santa Cruz, # sc-13040) and Usagi anti-GFP (MBL, # 598).
  • M15 cells were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells per well and cultured before use.
  • 5,000 SK7 ES cells were seeded on the mesodermal cell layer in the differentiation medium and allowed to differentiate for 8 days.
  • SK7 ES cells were dissociated using Cell dissociation buffer (GIBCO BRL) at 37 ° C for 20 minutes.
  • Cells were stained with a combination of monoclonal antibodies (mAb).
  • the antibodies used in this experiment were ECCN2 (Piotin-conjugated anti-E-cadherin monoclonal antibody ECCD2 (provided by Prof. Akiyoshi Nagahama, Prof.
  • ES cell line SK7 was trypsinized with 0.25% trypsin-EDTA for 10 minutes, filtered through a 40 ⁇ m mesh, and at a concentration of 1 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 6 cells / ml, The sample was resuspended in HBSS-1% BSA containing iodine iodide and analyzed with FACS Vantage SE. Undifferentiated ES cell line SK7 was used as a negative control. Differentiated ES cells were divided into 5 fractions according to the intensity of green fluorescence, and RNA extraction and RT-PCR analysis were performed.
  • dES cells Differentiated ES (dES) cells were cultured for 8 days in a medium supplemented with both activin and bFGF under M15 and supplemented with 10% FBS. After culturing ES cells for 8 days, dES is trypsinized with 0.05% trypsin / EDTA and coated with 2-methacryloyloxyethyl PhosphorylCholine (MPC). Pdxl positive cells can be maintained and cultured by seeding again on dishes &plates; Nalgenunc, # 145389).
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl PhosphorylCholine
  • dES approximately 3 X 10 6 cells
  • mice were sacrificed transplanted ES cells, kidneys removed, by immunohistochemistry cryosections were fixed I spoon in 4% paraformaldehyde aldehyde.
  • graft (10 m) Analyzed.
  • SK7 ES cells were seeded at 5,000 cells per well in a 24-well plate pre-coated with mesoderm cells in sorting medium for 8 days. Cultured. The medium was changed every 2 days. ES cells or Pdxl / EGFP cells differentiated into embryonic endoderm (E-cadherin + / CXCR4 + cells) were compared.
  • ES cells were prepared in 10% FBS (FBS) or with or without 20 ng / ml of activin, 10 g / ml insulin (Sigma), 5.5 ⁇ g / ml transferrin (Sigma), 6.7 pg Differentiation was performed in serum-free basal medium (DMEM, Gibco BRL) (ITS) supplemented with / ml selenium (Sigma) and 0.25% albumin (Al bmax, GIBCO).
  • FBS FBS
  • ITS serum-free basal medium
  • albumin Al bmax, GIBCO
  • MEF moderately promoted differentiation of ES cells into Pdxl / ⁇ -gal expressing endoderm cells. Since ES cells cultured on M15 cells produced the most Pdxl / ⁇ -gal expressing cells with good reproducibility, the M15 cell line was used in subsequent experiments.
  • Pdxl / GFP Monitoring of endoderm differentiation in living ES cells using Pdxl / GFP expression
  • Pdxl / GFP is included P # 48.9 strain transgenic mice (Gu, G., Wells, JM, Dom bkowski, D., Preffer, F., Aronow, B., and Melton, DA (2004). Global expression A development of ES cell lines was established. The P # 48.9 strain of transgenic mice has been shown to reproduce Pdxl expression through embryogenesis. Initially, eight ES cell lines were established, all of which showed similar Pdxl / GFP expression patterns during in vitro differentiation.
  • SK7 proliferated well and was used for the subsequent experiments.
  • Pdxl / GFP-expressing ES cells (SK7) were differentiated on mitomycin-treated M15 cells and the time-dependent changes in Pdxl / GFP expression were monitored.
  • FIG. 3A A schematic representation of the differentiation procedure is shown in Figure 3A.
  • the ES cell line SK7 was seeded at a density of 500 Zwell on a 24-well plate containing differentiation medium containing 10% FBS.
  • the culture conditions were compared between a control differentiation medium and a medium in which FBS in the differentiation medium after 4th day was replaced with Knocked-out Serum Replacement (KSR-substituted differentiation medium).
  • KSR-substituted differentiation medium Knocked-out Serum Replacement
  • endocrine molecular and exocrine markers such as glucagon, spleen polypeptide (Pp), and somatostatin (Sst), are also specific for ES cells separated on M15 feeder cells. Is detected. Maturation 'cell markers such as Iapp, Darcokinase, Kir6.2 are detected
  • liver markers albumin, ⁇ -fetoprotein, Met
  • lung markers Sft pc (Immunostaining in Fig. 5 also shows Nkx2.1 expression! /)
  • Oral cavity Marker Pax9
  • the differentiation induction method of the present invention is useful for inducing differentiation of endoderm organs including spleen, liver, lung, small intestine and oral cavity (Pax9, RT-PCR).
  • M15 support cells specifically promote the differentiation of ES cells into endoderm-derived organs such as spleen and liver.
  • This activity was named Mesodermal Derived Inducing Activity (mesoderm-derived ⁇ inducing activity; MDIA).
  • MDIA meoderm-derived differentiation induction activity
  • ES cells Rl and Jl ES cells
  • Pdxl, or endocrine marker insulin, spleen polypeptide, and Somatostatin expression was elevated in MDIA-treated R1 and Jl ES cells! /, (Right figure in Fig. 4). Therefore, it was shown that MDIA can be applied to various types of ES cells.
  • Fig. 5 shows the results of detecting the expression of endoderm-related markers in SK7 cell-derived differential cells by immunohistochemistry.
  • HNF3 ⁇ a common marker of endoderm cells, various endoderm organ-related genes: albumin of liver marker gene, Nkx2.1 of lung marker gene, and Cdx2 gene of marker of small intestine (red) ) was recognized.
  • Hnf3 ⁇ -expressing cells overlap with Pdxl / EGFP positive cells.
  • Cells expressing endoderm organ-related genes other than spleen such as lung and liver are different from the Pdxl / EGFP positive cells (green). there were.
  • RT-PCR analysis showed that other endoderm-derived tissues (such as liver) were also induced by MDIA treatment of ES cells. This shows that MDIA treatment specifically induces differentiation from ES cells to endoderm.
  • endoderm-specific enhancer fragment of ⁇ ⁇ gene to monitor endoderm precursor differentiation (Nishizaki, Y., Shima zu, K., Kondoh, ⁇ ⁇ , Sasaki, ⁇ .
  • ⁇ j8 / mRFPl Transgenic Mouse is Pdxl / EGFP Transgenic Mouse Strain P # 48.9 (Gu, G., Wells, JM, Dombkowski, D "Preffer, F” Aronow, B “and Melton, DA (2004 ) .Global e xpression analysis of gene regulatory pathways during endocrine pancreatic development.Development 131, 165-79) Crossed with ⁇ j8 / mRFPl and Pdxl / EGFP transgenes.
  • the ES cell line designated PH3, was used in subsequent experiments ES cells
  • the PH3 line was separated on M15 cells treated with mitomycin and depends on the time of expression of Pdx 1 / EGFP and Hnf3 ⁇ / mRFPl.
  • Figure 6 shows the monitored dynamics.
  • the expression of ⁇ / mRFPl was observed on day 7 of differentiation, indicating that one day preceded the expression of Pdxl / EGFP.
  • the population of ES cells that express ⁇ is larger than the population that expresses Pdxl.
  • a population of ES cells that express time-dependent expression and Hnf3 ⁇ and Pdxl reproduces normal embryonic development. From these results, it was shown that the endoderm precursor is induced by MDIA treatment of ES cells.
  • MDIA mesoderm-derived differentiation-inducing activity
  • activin ⁇ ⁇ , activin ⁇ ⁇ , and fluorstatin in the feeder cell line used in the experiment to clarify the molecular mechanism of mesoderm-derived ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ inducible activity (MDIA) did.
  • Activin 13 ⁇ and activin 13 B are expressed at high levels in M15 cells and at moderate levels in MEF cells. Fluorostatin is not expressed in M15 cells, but is expressed at high levels in MEF cells and ST2 cells (FIG. 7A). The effect of activin A supplementation in ES cell cultures was analyzed.
  • MDIA is not completely inhibited by fluorstatin
  • the M15 cells involved in MDIA that contain ES cells into endoderm cells may contain other molecules.
  • studying secreted or membrane-bound molecules expressed in M15 cells or other feeder cells that exhibit MDIA we are interested in elucidating the molecular mechanism of ES cell differentiation into the endoderm system. Information can be obtained.
  • MDIA promotes the differentiation of ES cells into the endoderm system and can be used to screen for inducers or culture conditions that promote this differentiation.
  • MDIA can be used to screen for induced molecules that further promote the differentiation of ES cells into the endoderm system when added to ES cells cultured on M15 cell layers. It was examined. As shown in FIG. 3A, ES cells cultured in KSR-substituted medium showed higher production of Pdxl / EGFP-expressing cells, so the possibility of the presence of an inhibitor in serum was estimated. Noggin, an inhibitor of BMP, was added at various times to test its effect on MDIA. Results showed that lOOng / ml noggin supplemented on days 5-8 enhanced MDIA. As shown in Fig. 8, the enhancement effect of Noggin can be observed by using KSR-substituted medium instead of medium.
  • the number of Pdxl / EGFP-expressing cells in ES cells differentiated in KSR-substituted medium was decreased by the addition of BMP2, but this was offset by the addition of noggin (Fig. 9).
  • Fig. 9 it was revealed that the expression of Pdxl / EGFP was low in ES cell sorting in the serum-free state on days 0 to 4 due to poor cell growth. Therefore, in subsequent experiments, noggin was added on the 3rd to 4th days to promote differentiation of ES cells into the endoderm system, and after the 4th day of differentiation, the KSR replacement solution was used instead of the differentiation medium. Use media.
  • FIG. 10 shows that the addition of noggin and activin or noggin and nicotinamide did not show any additive effect. However, the addition of noggin, activin, and nicotinamide promoted Pdxl / EGFP expression.
  • the inset shows time-series data when noggin, activin, nicotinamide V, or any of them is added.
  • FIG. 11A shows the Pdx 1 / EGFP image on day 8. It was added so as to be activin 20 ng / ml and bFGF 5 ng / ml.
  • FIG. 11A the morphology of Pdxl / EGFP positive colonies was changed by arranging activin and FGF. The cell mass that was in the center of the positive colony disappeared, resulting in an increase in the number of cells expressing Pdxl / EGFP.
  • the synergistic effect was shown by making both act on ES cell simultaneously.
  • the uppermost figure of d8 / M15 shows that the Pdxl / EGFP positive colony when spreading with M15 is spread, the cell mass appears to be small in the center, and the Pdxl / EGFP positive cell is colony. Located on the edge of the (arrow). In Pdxl-negative colonies, a large round colony is observed in the center (arrow head). + Activin (20) contains 20 ng / ml of activin from day 0 to day 8 of differentiation. Many Pdxl / EGFP positive spleen stem cells appeared, showed a wide colony morphology, and Pdxl / EGFP negative colonies decreased.
  • + bFGF (5) is supplemented with 5 ng / m1 of bFGF up to day 8 and day 8.
  • the migration of cells in the center is promoted, and the colony morphology is expanded.
  • Pdxl / EGFP positive cells are accumulated by the marginal part of the colony.
  • + activin (20) + bFGF (5) retains activin and bFGF up to the 8th day of differentiation on the 0th day of differentiation.
  • FIG. 11B shows the results of staining of the separated cells obtained under the conditions in which both activin and bFGF in FIG. 11A are stored with an antibody against C peptide. Since the C peptide occurs as a byproduct during insulin biosynthesis, positive cells are shown to actually biosynthesize insulin. Pdxl / EGFP positive cells are green. In the cell line, C peptide alone positive (red) was also observed, but many cells were both C peptide / Pdxl positive (yellow). Enlarged pictures are shown in A and B.
  • the endoderm (definitive endoderm) is a positive cell for both E-cadherin and Cxcr4.
  • Splenic progenitor cells should be both E-cadherin and Pdxl / EGFP positive cells.
  • M15 endoderm accounts for 8% of all cells on day 8.
  • activin and bFGF were added, the percentage of endoderm increased, accounting for 47% of all cells.
  • splenic progenitor cells are 22% of the endoderm on M15. Under GF-added conditions, the proportion of knee progenitor cells in the endoderm increased to 67%.
  • FIG. 12B shows ES cells and M15 cells using side scattered light (SSC) that reflects the complexity of the internal structure of the cell and forward scattered light (FSC) that reflects the size of the cell.
  • SSC side scattered light
  • FSC forward scattered light
  • the FACS development image of the differentiated ES cell is shown.
  • M15 cells can be removed by separating the part enclosed by the polygon in the figure.
  • FIG. 12B shows the force under the conditions where activin and bFGF were added. It can be seen that this M15-free fraction contains Pdxl / EGFP positive cells.
  • FIGS. 13A and 13B show that the population of Pdxl / EGPF positive cells is shifted to the GFP positive side in ES cells sorted on M15 cells compared to undifferentiated ES cells. Differentiated ES cells were divided into 5 fractions according to the expression level of GFP, and for each fraction, the expression of molecular markers in spleen cells was analyzed by RT-PCR. RT-PCR analysis shows high Pdxl expression in the no.4 fraction with a strong GFP positive signal ( Figure 13C).
  • This fraction represents approximately 1% of all differentiated ES cells (Figure 13B). In this fraction with a strong GFP-positive signal, expression of NeuroD, insulin, PP, and Sst was also observed, indicating that the cells in this fraction are of the spleen lineage.
  • Differentiated ES cells can be maintained and cultured by the method shown in FIG.
  • Pdxl positive cells could be maintained and cultured by re-seeding the differentiated ES cells in a low cell binding dish coated with MPC under both M15 and both activin and bFGF. ( Figure 14).
  • FIG. 15 shows that Pdxl / EGFP expression is maintained and insulin expression is also seen.
  • FIG. 16 shows a stained image of cells induced to differentiate on M15 using monkey ES cells in the same manner as mouse ES cells.
  • the culture conditions of monkey ES cells (purchased from Asahi Techno Glass Co., Ltd.) are as follows. On day 0 of culture, monkey ES cells were seeded on a 24-well plate at a concentration of 20,000 cells / well, and the medium was changed on days 1, 3, 5, 7, and 9 of culture. The medium used was a broth medium (10% FBS / D MEM (high glucose). A and B in FIG. 16 are stained images on days 4 and 8 after differentiation induction.
  • FIG. 17 shows a stained image of cells induced to differentiate on M15 using human ES cells in the same manner as mouse ES cells.
  • the culture conditions for human ES cells are as follows. On day 0 of culture, human ES cells were seeded on a 24-well plate at a concentration of 20,000 cells / well, and the medium was changed on days 1, 3, 5, 7, 9, and 11 of culture. The medium used was a differentiation medium (10% KSR / DMEM (high glucose).
  • endoderm cell marker HNF3 ⁇ , small intestine marker Cdx2, liver marker. Albumin, ⁇ -fetoprotein, and biliary CK19 were expressed, indicating that they were divided into endoderm cells (liver, bile duct, small intestine).
  • FIG. 18 shows the results of evaluation of differentiation potential using SK7 cells on M15 feeder cells.
  • the definitive endoderm is a positive cell for both E-cadherin and Cxcr4. Serum factors may be required for endoderm maintenance and separation into Pdxl / EGFP positive cells.
  • serum-free medium alone differentiation into endoderm and splenic progenitor cells was low on M15 cells, but when activin was added, the ability to differentiate into endoderm and splenic progenitor cells increased (Fig. 18). In particular, only 2% of the cells were distributed to splenic progenitor cells, and a high efficiency was achieved.
  • ES cell power can be efficiently separated from endoderm cells such as spleen stem cells. Can be guided. Further, by using the culture method of the present invention, it is possible to measure the separation-inducing effect of an unknown substance on the spleen with high sensitivity, and therefore, it can be applied as a screening method for a separation-inducing substance.
  • differentiated ES cell-derived spleen stem cells or hepatic stem cells can be purified and maintained and cultured in vitro.
  • the method of the present invention can be applied to multiple types of ES cell lines. The method of the present invention can also be applied to cells of endodermal origin that have the same development.
  • FIG. 1 shows screening of spleen-inducing ability in various cell lines.
  • A A schematic diagram of the differentiation induction method. After seeding ES cells in which LacZ gene was knocked into the Pdxl promoter at a density of 5000 cells / well (24 wells) on cultured cells, the cells were cultured in the presence of serum and stained with X-gal on the 12th day. The effect of inducing splenic differentiation was evaluated. Since floating embryoid bodies (EBs) are seeded on cultured cells on the second day after the formation, they were evaluated by X-gal staining on the 14th day of culture.
  • B X-gal stained image. Each photograph shows the cell name used as a feeder cell.
  • the vertical axis represents the proportion of Pdxl / ⁇ -gal positive cells when each cell line is used as a feeder cell. Inductive effects were observed for M15, MEF, and ST2. Student's t-test was significantly different from ES cells differentiated on control experiment gels: **, p ⁇ 0.01.
  • FIG. 2 shows evaluation of Pdxl / ⁇ -gal positive cells from ES cells over time using M15.
  • A Using M15, which showed the highest spleen induction effect by screening, differentiation induction experiments from ES cells were performed and evaluated over time by X-gal staining. The photo shows the number of days after the start of differentiation induction. The number of days in parentheses is the number of days after passage.
  • B Time course of appearance of Pdxl / ⁇ -gal positive cells by passage on M15 feeder cells. The horizontal axis represents the number of days after the start of differentiation induction, and the vertical axis represents the number of Pdxl / 18-gal positive cells.
  • Pdxl / ⁇ -gal positive cells In differentiation induction using M15, Pdxl / ⁇ -gal positive cells initially peak at day 12, but then decrease. When passaged onto M15 feeder cells, Pdxl / ⁇ -gal positive cells peaked again 7-8 days after passage. The first passage is indicated by a black circle, and the second passage is indicated by a black square.
  • FIG. 3 shows evaluation of differentiation into Pdxl / EGFP positive cells in real time using ES cells (SK7 cells) in which GFP is introduced under the Pdxl promoter.
  • A A schematic diagram of the differentiation induction method is shown. In differentiation induction method using SK7, seeding on M15 without forming EB . In both figures, after seeding at 500 cells / well (24 wells), the cells were cultured in 10% serum medium until the fourth day of culture, and cultured in 10% KSR medium from the fourth day of culture. The appearance of Pdxl / EGFP positive cells over 6 to 8 days after differentiation induction was evaluated. At high density (5000 cells / well), differentiation occurs only in 10% serum medium, but at low density (500 cells / well), differentiation efficiency is poor.
  • Pdxl / EGFP-positive cells When replaced with 10% KSR medium, Pdxl / EGFP-positive cells can Appears. It reaches its peak on the 8th day. Evaluation of differentiation into Pdxl / EGFP positive cells was carried out by summing fluorescence intensities for fluorescent photographs using Luminavision software.
  • C Image of time-lapse culture using SK7 cells and appearance of Pdxl / EGFP positive spleen stem cells.
  • FIG. 4 shows the results of RT-PCR analysis. Expression of various spleen progenitor cell-related genes, spleen endocrine cell marker genes, exocrine cell marker genes, diffractive ⁇ -cell marker genes, and liver marker genes was observed. Although the SK7ES cell line was established from ICR mice, the same M15 support cells promoted the differentiation induction in other Rl and Jl ES cell lines. In cells induced on M15 feeder cells, expression of pdxl gene or endocrine marker genes such as insulin, spleen peptide, and somatostatin was detected on day 8.
  • FIG. 5 shows the results of detecting the expression of an endoderm-related marker in SK7 cell-derived differentiation cells by immunohistochemistry. Expression of HNF3 ⁇ , albumin, Nkx2.1, and Cdx2 was observed.
  • FIG. 6 shows that endoderm progenitor cells are induced from ES cells.
  • the endoderm-specific expression control enhancer region of the mouse Hnf3 ⁇ gene was used. Pdxl / G so that the expression of Hnf3 ⁇ gene can be visualized with the mRFPl (monomeric Red Fluorescent Protein 1) reporter protein.
  • ES cell lines were established from FP, Hnf3 ⁇ / mRFPl double transgenic mice.
  • Fig. 7 shows that part of the mechanism of M15 induction by M15 is mediated by activin.
  • ⁇ A comprehensive analysis of gene expression was performed on the cultured cells used for screening to elucidate the mechanism of spleen ⁇ induction by ⁇ 15 using Aifymetrix's Gene Chip, and the expression of genes showing bioactive effects was examined. As a result, it was clarified that the inhibitor folistatin of activin, which is involved in spleen induction in normal development, is extremely low at M15. In addition, activin is expressed to some extent in M15 cells, MEF, and ST2 cells.
  • B Induction of spleen was promoted by activin, and differentiation induction was inhibited by fluoristin.
  • Activin and fluorstatin were added on the third day after induction of differentiation.
  • the medium was cultured in a medium containing FBS until the third day, and the medium replaced with KSR was used until the third to the eighth day.
  • the appearance of Pdxl / E GFP positive spleen stem cells on the 8th day was evaluated.
  • FIG. 8 shows the results of examining the effect on differentiation induction by adding noggin to the medium.
  • a medium containing FBS is used. Factors were considered.
  • Noggin was added for various periods to evaluate Pdxl / EGFP positive cells appearing in real time.
  • Induction of spleen differentiation was promoted by adding noggin at the early stage of differentiation induction. The number of days that promoted by adding noggin could be identified on days 2-4, or on days 3-4 as the minimum.
  • FIG. 9 shows that the promotion of splenic differentiation induction by noggin is due to inhibition of BMP2 contained in serum.
  • Differentiation induction On day 3-4, noggin was added at 100 ng / ml, or BMP2 at a predetermined concentration. Where indicated, FBS in the medium on days 3-4 is replaced with KSR. On day 6, Pdxl / EGFP positive cells were evaluated. In the FBS-containing fraction broth medium, there was a significant difference due to noggin-added calories compared to the non-added group (Student's t-test, ** p ⁇ 0.01). When KSR was replaced, spleen ⁇ induction was enhanced (compared to Noggin (-).
  • FIG. 10 shows that noggin and nicotinamide, or activin and nicotinamide synergistically induce splenic differentiation. Nicotinamide alone did not promote induction of splenic differentiation, but synergistically induced induction of spleen by using in combination with noggin or activin. The combined use of noggin, activin, and nicotinamide shifted the appearance of Pdxl / EGFP positive cells to an early stage and peaked on the 6th day after induction of differentiation. Compare with KSR-replacement medium control group by each day Student's t-test, * * p ⁇ 0.01)
  • FIG. 11 shows the promotion of spleen induction by the addition of activin and bFGF.
  • Figure 11A shows that the number of Pdxl / EGFP-expressing cells greatly increases with the addition of activin, bFGF, or both activin and bFGF into differentiation medium containing 10% FBS. Shown in the image.
  • FIG. 11B shows the result of staining the cells of the cells obtained under the condition where both activin and bFGF in FIG. 11A are supported with an antibody against C peptide.
  • FIG. 12 shows that FACS can quantitatively evaluate the promotion of spleen induction in the spleen by the addition of activin and bFGF, and shows that the degree is very large.
  • MACS support cells can be selectively removed using FACS using FACS.
  • Figure 12A shows that the endoderm (definitive endoderm) is a positive cell for both E-cadherin and Cxcr4. It shows.
  • Figure 12B shows an M15 cell from a population of ES cells separated using side-scattered light (SSC) that reflects the complexity of the cell's internal structure and forward-scattered light (FSC) that reflects the size of the cell.
  • SSC side-scattered light
  • FSC forward-scattered light
  • FIG. 13 shows the purification of ES cell-derived spleen stem cells using a cell sorter and analysis of the molecular markers expressed.
  • SK7 ES cells were induced to differentiate in FBS-containing medium in 300,000 cells / 90 mm dish on M15 cells, and FACS was performed on the 9th day.
  • the cell population of the fraction of GFP-positive cells was increased by induction.
  • Fractions 1-4 were collected.
  • Fraction 4 is strongly GFP positive, and cells expressing Pdxl gene are concentrated in this fraction. In addition, it expresses NeuroD, Somat ostatin, and insulin!
  • FIG. 14 shows a maintenance culture method of differentiation-induced Pdxl positive splenic progenitor cells.
  • Pdxl-expressing cells can be maintained and cultured by re-seeding the differentiated ES cells in a low cell binding dish coated with MPC under M15 with both activin and bFGF.
  • FIG. 15 shows transplantation of differentiation-induced ES cells under the adult mouse kidney capsule.
  • Fig. 14 shows how ES cell-derived Pdxl positive knee progenitor cells are transplanted under the adult kidney capsule.
  • FIGS. 15A and 15B show fluorescent micrographs, in which Pdxl / EGFP positive cells are retained.
  • FIG. 15C shows the presence of insulin, Pdxl / EGFP double positive cells by immunohistochemical analysis of the graft.
  • FIG. 16 shows the results of induction of differentiation into endoderm progenitor cells and hepatic knee cells using force quizal ES cells.
  • Fig. A on the fourth day of differentiation induction, many endoderm progenitor cells and mesoderm progenitor cells are induced to differentiate. Images of HNF3 ⁇ (red: endoderm marker), ⁇ (green: mesoderm marker) and DAPI nuclear staining of cells on differentiation day 4 (A) and day 8 (B).
  • Fig. IV many endoderm cells remain on the 8th day of differentiation induction. Mesodermal progenitor cells can no longer be detected.
  • Fig. A on the fourth day of differentiation induction, many endoderm progenitor cells and mesoderm progenitor cells are induced to differentiate. Images of HNF3 ⁇ (red: endoderm marker), ⁇ (green: mesoderm marker) and DAPI nuclear staining of cells on differentiation day 4 (A) and day 8 (B).
  • FIG. 17 shows the results of induction of differentiation into endoderm organs using human ES cells.
  • Fig. A on the 12th day of induction of differentiation, Hnf3 ⁇ positive cells (red) of endoderm cells and Cd x2 positive cells (green) of small intestinal progenitor cells were detected. Although many cells co-expressed, Cdx2-only positive cells were also observed.
  • Fig. B on day 12 of differentiation induction, albumin positive cells (red) and ⁇ -fetoprotein positive cells (green) were detected as liver progenitor cells.
  • Fig. C CK19-positive cells (green) and oc-protein-positive cells (red) of bile duct cells were detected on the 12th day of differentiation induction.
  • FIG. 18 shows the results of the induction of knee progenitor cells by induction of serum using serum-free medium on M15 feeder cells.

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Abstract

　本発明の目的は、大量のES細胞でも内胚葉系へと分化誘導することを可能とするような新規なES細胞の分化誘導方法を提供することである。本発明によれば、支持細胞の存在下で哺乳動物由来のES細胞を培養することを含む、ES細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導する方法が提供される。

Description

ES細胞の分化誘導方法
技術分野
[0001] 本発明は、 ES細胞の分化誘導方法に関する。より詳細には、本発明は、中胚葉由 来の細胞株を支持細胞として用いて ES細胞を内胚葉へと分ィ匕誘導する方法に関す る。
背景技術
[0002] ES細胞はその多能性のため、発生期の遺伝子機能の研究に有用なモデル系であ り、医療用の移植可能な細胞源となる可能性がある。糖尿病などの疾患において細 胞補充療法に ES細胞を用いるためには、分化を制御する必要があり、これは依然と して大きな課題である。神経組織、造血組織および心臓組織への ES細胞の分化〖こ 関する理解はかなり進んでいるが（Yamashita, J., Itoh, H.， Hirashima, M., et al. (200 0). Flkl -positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenit ors. Nature 408, 92- 6 ;及び Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., and Smi th, A. (2003). Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors i n adherent monoculture. Nat Biotechnol 21, 183-6)、内胚葉系組織への ES細胞の 分ィ匕に関する知見はほとんどない。
[0003] 2001年に、 nestin陽性神経細胞集団が濃縮される条件下で培養した後に特定の因 子を添加することにより、 in vitroで ES細胞カゝらインスリン含有脾細胞が形成されること 力 s報告された (Lumelsky, N., Blondel, 0., Laeng, P., Velasco, I., Ravin, R., and Mc Kay, R. (2001). Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structure s similar to pancreatic islets. Science 292, 1389—94)。し力し、このインスリン陽性細 胞は、脾および十二指腸双方の内胚葉の機能性膝 )8細胞のマーカーである Pdxlを 発現しない。この細胞はインスリン I転写物も発現しないが、痕跡量のインスリン II転写 物を発現した。また、これらの細胞はインスリンについての染色は陽性である力 イン スリンの de novo合成の副産物である抗 C-ペプチド抗体では染色されなかった（Rajag opal, J., Anderson, W. J., Kume, S., Martinez, O. I., and Melton, D. A. (2003). Insu lin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 299, 363)。これらの知見 は、インスリン染色は培地からのインスリン取り込みが原因であって細胞自身はインス リンを合成していないことを示しており、 nestin陽性細胞力インスリンを産生する /3細 胞を生じるのかどうかについては疑問であった。し力しながら、 nestin陽性細胞に選択 的な同様の条件を用いて ES細胞からインスリン分泌細胞が産生することを他の研究 者が報告しており、この問題はまだ解明されていない（Blyszczuk, P., Czyz, J., Kania , G., et al. (2003). Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiati on of nestin— positive progenitor and insulin-producing cells. Proc Natl Acad ¾ci U S A 100, 998— 1003 ; Hori, Y" Rulifson, I. C, Tsai, B. C, Heit, J. J., Cahoy, J. D" an d Kim, S. K. (2002). Growtn inhibitors promote differentiation of insulin-producing ti ssue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16105- 10 ;及び Morit oh, Y., Yamato, E., Yasui, Y., Miyazaki, S., and Miyazaki, J. (2003). Analysis of ins ulin— producing cells during in vitro differentiation from feeder-free embryonic stem c ells. Diabetes 52, 1163-8)。グルコースを培地に添加した場合、 nestin陽性前駆細胞 力 Sインスリンを遊離する細胞集団を生じさせるが、注目すべきことに C-ペプチドの遊 離は全く検出されないことが最近報告された（Hansson, M., Tonning, A., Frandsen, U., et al. (2004). Artifactual insulin release from differentiated embryonic stem cells. Diabetes 53, 2603-9) 0これは、この細胞が機能性のインスリン分泌 ·細胞ではないこ とを示唆している。従って、 ES細胞を操作して内分泌性の脾 |8細胞を作製するという 課題は依然として未解決である。
マウス胚では、 Pdxlの発現が最初の分ィ匕シグナルであり、 8.5日目胚で腸管の背側 内胚葉に検出される。 9.5日目胚では、 Pdxl発現は背側および腹側の脾芽、と十二 指腸の内胚葉で認められる。成体では、 Pdxl発現は、十二指腸上皮とインスリンを分 泌する脾島 β細胞において維持されており、インスリン遺伝子の転写制御において 重要な役割を果たしている（Offield, M. F., Jetton, T. L.， Labosky, P. A., et al. (199 6). PDX丄 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duod enum. Development 122, 983-95)。マウスでの Pdxlの標的突然変異導入から、脾ぉ よび吻側十二指腸の発生に Pdxlが必要であることが示されている (Ahlgren, U., Jons son, J., and Edlund, H. (1996). The morphogenesis of the pancreatic mesenchyme is uncoupled from that of the pancreatic epithelium in I PF1/PDX1— deficient mice. De velopment 122, 1409-16)。従って、 Pdxlは脾臓の発生に必須の分子であり、脾前駆 細胞および胃、十二指腸、胆管などの他の内胚葉由来組織の初期マーカーとしても 有用である。
[0005] 本発明者らは以前に、 Pdxl座位に lacZレポーター遺伝子を持つ ES細胞株を用いて Pdxl陽性細胞を効率的に生成させるプロトコールを報告した。 ES細胞を胚の脾原基 または脾間葉と共培養することにより、 Pdxl発現細胞に分化誘導される細胞の数の 著 、増加が誘導されることを示した。われわれは ES細胞の脾への分化を促進する 増殖因子のスクリーニングを行い、 TGF 2が脾原基のもつ分ィ匕導能活性を部分的 に模倣する因子であることを明らかにした。 -ヮトリ mixファミリー (cmix)遺伝子の過剰 発現のような遺伝子操作（Peale, F. V" Jr., Sugden, L.， and Bothwell, M. (1998). Ch aracterization of CMIX, a chicken homeobox gene related to the Xenopus gene mix. 1. Mech Dev 75, 167— 70 ;及び Stein, S.， Roeser, T.， and Kessel, M. (1998). CMIX, a paired-type homeobox gene expressed before and during formation of the avian pri mitive streak. Mech Dev 75, 163-5)〖こより、 ES細胞の内胚葉系への分化が特異的 に促進された。しカゝしながら、大量の誘導源が必要な場合には、 ES細胞の分化を誘 導するために胚の脾原基または脾間葉の応用は困難である。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 上記した通り、 ES細胞の培養条件を変える方法を用いて、インスリン抗体で染色さ れる細胞が増えてくることが報告されている。しかし、この方法で検出される細胞は、 生体内でインスリン産生 β細胞が正常に作られる過程を迪つてできた細胞ではない 。しかも、細胞が培地中のインスリンを吸着することにより見かけ上の現象であることが 指摘されている（Rajagopal, J. et al, Science 299, 363, 2003)。これを解決するため には、脾臓の発生初期マーカーの発現が誘導されるような培養方法が有効となる。 本発明は、大量の ES細胞でも内胚葉系へと分化誘導することを可能とするような新 規な ES細胞の分ィ匕誘導方法を提供することを解決すべき課題とした。 課題を解決するための手段
[0007] 何れかの種類の細胞が内胚葉細胞の増殖を促して前後軸上での特定の細胞への 分ィ匕へと導いており、それらの細胞は脾原基あるいは脾間葉力ものシグナルを代替 すると本発明者らは推測した。そこで、本発明者らは、このような誘導源を発見する目 的で、株化培養細胞のスクリーニングを行い、中胚葉由来の細胞株が ES細胞の内胚 葉への分化を誘導する強!ヽ活性を示すとともに、脾または肝の発生を促進することを 見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
[0008] 即ち、本発明によれば、支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞を培養するこ とを含む、 ES細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導する方法が提供される。
好ましくは、支持細胞は、中胚葉に由来する細胞である。
好ましくは、支持細胞は M15細胞、 MEF細胞又は ST2細胞である。
[0009] 好ましくは、 ES細胞から、未分化な内胚葉の前駆細胞、内胚葉由来器官の未熟な 細胞、又は内胚葉由来器官の成熟細胞の何れかへと分化誘導する。
好ましくは、内胚葉由来器官は、脾臓、肝臓、肺、咽頭、又は小腸である。 好ましくは、支持細胞の存在下で ES細胞を培養する際に、ァクチンビン、塩基性線 維芽細胞成長増殖因子 (bFGF)、及び Z又はノギンを添加して培養する。
好ましくは、支持細胞の存在下で ES細胞を培養する際〖こさらにニコチンアミドを添 加して培養する。
好ましくは、哺乳動物由来の ES細胞がマウス、サル又はヒト由来の ES細胞である。
[0010] 本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により得られる、 ES細胞から 分化誘導された内胚葉系細胞が提供される。
[0011] 本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法により ES細胞から内胚 葉系細胞へと分化誘導する工程、及び分化誘導された内胚葉系細胞を蛍光標識に よるフローサイトメトリー (FACS)によって分離する工程を含む、 ES細胞から分化誘導 された内胚葉系細胞を取得する方法が提供される。
[0012] 本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法により得られる ES細胞 から分化誘導された内胚葉系細胞を、 2-メタクリルオイロキシェチルホスホリルコリン で被覆したプレート上で培養することを含む、 ES細胞から分化誘導された内胚葉系 細胞の維持培養方法が提供される。
好ましくは、上記の維持培養方法では、ノックアウト血清リプレースメント (KSR)の存 在下で培養を行う。
[0013] 本発明のさらに別の側面によれば、支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞 を培養することによって ES細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導する際に、被験物質 の存在下で ES細胞を培養し、被験物質の非存在下で ES細胞を培養した場合におけ る内胚葉系細胞へと分化誘導の程度と被験物質の存在下で ES細胞を培養した場合 における内胚葉系細胞へと分化誘導の程度とを比較することを含む、 ES細胞から内 胚葉系細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供 される。
[0014] 好ましくは、被験物質は成長因子又は低分子化合物である。
好ましくは、内胚葉で発現するマーカーの発現量を指標として、内胚葉系細胞へと 分化誘導の程度を測定する。
好ましくは、哺乳動物由来の ES細胞がマウス、サル又はヒト由来の ES細胞である。 発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明は、 ES細胞から内胚葉系細胞へと分ィ匕誘導する方法に関するものであり、 特に支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞を培養することを特徴とする方法 である。
[0016] 本発明の分ィ匕誘導方法では、支持細胞を用いて ES細胞力も膝などの内胚葉由来 の消化器の細胞を分化誘導することができる。支持細胞を用いて、内胚葉系細胞を 分化誘導することはこれまで報告がなぐ本発明により初めて達成された。本発明の 実施例では、脾幹細胞の遺伝子マーカー遺伝子 (Pdxl)の発現を蛍光蛋白質で可 視化して、迅速かつ感度の良い検出を可能にした。本発明では、支持細胞との共培 養によって、 ES細胞は分化誘導しやすい状態にある。そのため、特定の成長増殖因 子を添加すると、さらに分化誘導が促進される。従って、本発明の方法は、未知の分 化誘導因子のスクリーニングとしても利用できる。
[0017] 本発明で用いる ES細胞は、哺乳動物由来の ES細胞であればよぐその種類などは 特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来の ES細胞などを使用することが できる。 ES細胞としては、例えば、その分ィ匕の程度の確認を容易とするために、 Pdxl 遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、以下 の実施例で使用しているような、 P dxl座位に lacZ遺伝子を組み込んだ 129/Sv由来 E S細胞株 Rl、 J1又は、 Pdxlプロモーター制御下の GFPレポータートランスジーンをも つ ES細胞 SK7株などを使用することができる。あるいは、 Hnf3 |8内胚葉特異的ェンノヽ ンサー断片制御下の mRFPlレポータートランスジーン及び Pdxlプロモーター制御下 の GFPレポータートランスジーンを有する ES細胞 PH3株を使用することもできる。
[0018] 哺乳動物由来の ES細胞の培養方法は常法により行うことができ、例えば、所望によ りフィーダ一細胞としてのマイトマイシン C処理マウス胚線維芽細胞（MEF)の存在下 において、 LIF (ESGRO 1000単位/ ml、 Chemicon製）を添カ卩した分化培地（10%ゥシ 胎児血清（FBS)、 O.lmM 2-メルカプトエタノール、 100 M非必須アミノ酸、 2mM L- グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、シグマ製） )で維持する ことができる。
[0019] 本発明では、 ES細胞を支持細胞の存在下で培養すること、即ち、 ES細胞を支持細 胞と共培養する。本発明で用いる支持細胞としては、 ES細胞を内胚葉系細胞へと分 化誘導できる細胞であれば、特に限定されないが、好ましくは、中胚葉に由来する細 胞を支持細胞として用いることができる。 ES細胞を内胚葉系細胞へと分化誘導するこ とができる中胚葉に由来する細胞の具体例としては、 M15細胞、 MEF細胞、又は ST2 細胞などが挙げられる。
[0020] M15細胞 (mouse, mesonephros)は、登録番号 ECACC 95102517として、細胞バンク
(し AMR Centre for Applied Microbiology & Research (Eし Aし C, Salisbury, Wiltshire) )に登録されている。 M15細胞は文献（Larsson, S. H., Charlieu, J. P., Miyagawa, K., et al. (1995). Subnuclear localization of WTl in splicing or transcription factor dom ains is regulated by alternative splicing. Cell 81, 391— 401)の記載【こ従って入手 nj"會 である。 M15についてのバンク情報を以下に記載する。
[0021] Version 4.200201
15 (mouse, mesonepnros ECACC 95102517
Morphology: Epithelial
Mouse mesonephric epithelium, polyoma virus large T transformed
Depositor: Prof V van Heyningen, MRC Human Genetics Unit, Western General Ho spital, Edinburgh, UK (Originator)
No restrictions. Patent: None Specified By Depositor
Properties: Products: WTl (expressed gene) Applications: Gene expression and prot ein studies connected to kidney development and Wilms' tumourigenesis.
Available in the following LABORATORY:
CAMR Centre for Applied Microbiology & Research (ECACC, Salisbury, Wiltshire) DMEM + 2mM ulutamine + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Split confluent cultures 1:5 to 1:10 i.e. seeding at 5x1,000 to 1x10,000 cells/ cm2 using 0.25% trypsin or try psin/EDTA; 5% C02; 37C [cell growth impaired at lower densities]. Karyotype: Hyp erdiploid
Hazard: CZ- II
The W\ 1 -expressing mesonephric cell line M15 (alias Mesol5) was established from mouse mesonephros transgenically expressing the large T protein of polyoma virus under the control of the early viral enhancer. As a tumour suppresser gene with a ke y role in urogenital development, WTl is implicated as predisposition gene in the pa thogenesis of Wilms' tumour (WT).
Further information
Research council deposit: Yes
Price— code: C
Bibliographic references:
Cell 1995;81:391
By Beatrice...
TITLE:M15
DATE:2005/04/24 00:32 URL:http://www.biotech. ist.unige.it/cldb/cl3312. html
European Collection of Cell Cultures,
Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, UK
June Poulton
European Collection of Cell Cultures
Health Protection Agency,
Porton Down
SP40JG Salisbury, Wiltshire UK
Phone: +44-1980-612512
Fax: +44-1980-611315
E-mail: ecacc@hpa.org.uk
URL: http://www.ecacc.org.uk/
[0022] MEF (ICRマウスより）は ATCCにカタログ番号 ATCC # SCRC- 1046として登録され ている。また、 MEF細胞は、文献（Nagy A , et al. Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Third Edition Cold Spring Harbor Press; 2003)の己載【こ従つ て入手可能である。
[0023] ST2細胞は、 RCB0224として、独立行政法人理化学研究所筑波研究所バイオリソー スセンターに登録されている。また、 ST2細胞は、文献（Ogawa, M., Nishikawa, S.， Ik uta, K., Yamamura, F., Naito, M., Takahashi, K. and Nishikawa, S. EMBO J 1988; 7 : 1337-1343)の記載に従って入手可能である。
[0024] これらのフィーダ一細胞は、血清などを補充した動物細胞用の通常の培地 (例えば 、 RPMI培地又は DMEM培地など）を用いて常法に従って培養することができる。
[0025] 支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞を培養する方法は特に限定されない 力 例えば、支持細胞をフィーダ一細胞として使用して、 ES細胞を培養することがで きる。例えば、未分ィ匕の ES細胞をトリプシンで解離させ、未処理培養皿で分化培地中 LIF非存在下に懸濁培養し、胚様体を形成させる。 2日間分化させた胚様体をトリプ シンで処理し、フィーダ一細胞 (支持細胞)であらかじめ一層に生着させた (プレコー トした)プレートで分ィ匕培地中播種する。以下、数日間培養することにより、内胚葉系 細胞へと分化誘導を行うことができる。
[0026] 本発明の分ィ匕誘導方法においては、支持細胞の存在下で ES細胞を培養する際に 、他の物質 (例えば、増殖因子又は低分子化合物など)を添加して、培養することも できる。例えば、ァクチンビン、 bFGF、及び/又はノギンを添カ卩して培養することによ り、 ES細胞から内胚葉系細胞への分化誘導をさらに促進することができる。また、ァク チンビン、 bFGF、及び/又はノギンを添加する際に、さらにニコチンアミドを添カ卩して 培養することにより、 ES細胞から内胚葉系細胞への分化誘導を促進することができる
[0027] 本発明による支持細胞を用いた ES細胞の分化誘導方法によれば、 ES細胞から、未 分化な内胚葉の前駆細胞、内胚葉由来器官の未熟な細胞、又は内胚葉由来器官の 成熟細胞の何れかへと分化誘導することができる。内胚葉由来器官としては、脾臓、 肝臓、肺、咽頭、又は小腸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。な お、 ES細胞から内胚葉系細胞への分ィ匕は、内胚葉に特異的なマーカーの発現量を 柳』定すること〖こより確認することができる。
[0028] さらに本発明によれば、支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞を培養するこ とによって ES細胞から内胚葉系細胞へと分ィ匕誘導する際に、被験物質の存在下で E S細胞を培養し、被験物質の非存在下で ES細胞を培養した場合における内胚葉系 細胞へと分化誘導の程度と被験物質の存在下で ES細胞を培養した場合における内 胚葉系細胞へと分化誘導の程度とを比較することを含む、 ES細胞から内胚葉系細胞 へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。被験 物質としては、成長因子又は低分子化合物などを使用することができる。この際、内 胚葉で発現するマーカーの発現量を指標として、内胚葉系細胞へと分化誘導の程 度を測定することが可能である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例
[0029] (A)実験方法
(1) ES細胞株 Pdxl座位に lacZ遺伝子を組み込んだ 129/Sv由来 ES細胞株 Rlは、 Christopher Wri ght博士 (パンダービルト大学)から提供された。 Pdxl/LacZ ES細胞株は、フィーダ一 細胞としてのマイトマイシン C処理マウス胚線維芽細胞（MEF)の存在下に LIF (ESGR 0 1000単位/ ml、 Chemicon製）を補充した分化培地（10%ゥシ胎児血清（FBS)、 0.1m M 2-メルカプトエタノール、 100 μ Μ非必須アミノ酸、 2mM L-グルタミンを補充したダ ルべッコ改変イーグル培地（DMEM、シグマ製） )で維持した。
[0030] Pdxlプロモーター制御下の EGFPレポータートランスジーンをもつ ES細胞 SK7株は、 Pdxl/EGFP遺伝子とホモ接合性のトランスジエニックマウスから榭立した。 ES細胞 SK 7株は、し （1000単位/½1)、 15% Knock-out Serum Replacement (KSRゝ Invitrogen) 、 1%FBS、 100 M非必須アミノ酸、 2mM L-グルタミン、 ImMピルビン酸ナトリウムを 補充したグラスゴー最小必須培地 (GMEM、シグマ製）中、 MEF上で維持する。
[0031] Ηηβ 内胚葉特異的ェンハンサー断片制御下の mRFPlレポータートランスジーン 及び Pdxlプロモーター制御下の EGFPレポータートランスジーンを有する ES細胞 PH3 株は、 Hnf3 β /mRFPl遺伝子とヘテロ接合性のトランスジヱニックマウスと、 Pdxl/EGF P遺伝子とホモ接合性のトランスジエニックマウスとを交配して得られる胚盤胞力ゝら榭 立した。 ES細胞 PH3株は、 MEFなしで維持すること以外は、 ES細胞 SK7株と同様に維 持する。
[0032] 力-クイザル ES細胞 CMK6株は、旭テクノグラス (株)より購入した。力-クイザル ES 細胞株は、フィーダ一細胞としてのマイトマイシン C処理マウス胚線維芽細胞（MEF) の存在下に 20% KnockOut Serum Replacement(KSR、 Gibco BRL)、 O.lmM 2-メル カプトエタノール、 100 μ Μ非必須アミノ酸、 2mM L-グルタミン、 ImMピルビン酸ナトリ ゥムを補充したダルベッコ改変イーグル培地と F-12栄養混合物の 1対 1混合培地 (D MEM/F12,シグマ製））で維持した。
[0033] ヒト ES細胞 KhES-1株は、京都大学再生医科学研究所より供与された。ヒト ES細胞 株は、フィーダ一細胞としてのマイトマイシン C処理マウス胚線維芽細胞（MEF)の存 在下に 20% KnockOut Serum Replacement(KSR、 Gibco BRL)、 O.lmM 2-メルカプト エタノール、 100 M非必須アミノ酸、 2mM L-グルタミンを補充したダルベッコ改変ィ 一ダル培地と F-12栄養混合物の 1対 1混合培地（DMEM/F12、シグマ製） )で維持し た。
[0034] (2) ES細胞の分ィ匕
分化研究には、ゼラチンコーティングプレート上で一度継代した Pdxl/LacZ ES細胞 を用いた。未分ィ匕の Pdxl/LacZ ES細胞をトリプシンで解離させ、未処理培養皿 (バタ テリアグレード、岩城硝子）で分ィ匕培地中 LIF非存在下に 3.0 X 105個 /90mmプレート の濃度で懸濁培養し、胚様体を形成させた。 2日間分化させた胚様体をトリプシンで 処理し、フィーダ一細胞でプレコートした 24ゥエルプレートで分化培地中 1ゥエル当た り 5000個を播種した。対照のゥエルはゼラチンのみでプレコートした。対照のゼラチン コーティングゥエルまたはフィーダ一細胞でコートしたゥエルに播種した ES細胞を分 化培地中で 12日間分ィ匕させた後に、細胞を固定して X-Gal染色について解析した。
[0035] MEF上で継代した ES細胞 SK7株は、ゼラチンコートプレート上に一度継代した後、 胚様体を形成させずに分化研究に直接用いた。フィーダ一細胞でプレコートした 24 ゥエルプレート中で、 1ゥエル当たり 500個の ES細胞 SK7株を分化培地中に播種し、 3 〜4日間培養した。 3日目又は 4日目に、記述した時点で FBSを KSRに置き換え、増殖 因子を添加した。培地は 6日目に 1回のみ、増殖因子を補充した KSR置換分ィ匕培地と 交換した。増殖因子を添加した正確な日付、または分化培地を KSR置換分化培地と 交換した正確な日付は、各図中に記したとおりである。 ES細胞の蛍光写真は、実体 顕微鏡 (ライカ MZFLIII)下で 24時間ごとに撮影した。
[0036] サル ES細胞の分化培養方法
培養 0日目： 24well plateにサル ES細胞を 1ゥエル当たり 20,000個のサル ES細を分 化培地に播種する。培養 1,3,5,7,9日目に培地交換する。分化培地はマウス ES細胞 の分化培地と同様。
[0037] ヒト ES細胞の分化培養方法
ヒト ES細胞の分ィ匕培養条件は以下の通りである。培養 0日目に 24ゥエルプレートにヒ ト ES細胞を 20,000細胞/ wellの濃度で播種し、培養 1,3,5,7,9, 11日目に培地交換した 。培地は KSR置換分化培地（10%KSR/DMEM (high glucose)を用いた。
[0038] (3)フィーダ一細胞株
胎生腎由来の細胞株 M15細胞は、三菱化学生命科学研究所の T. Noce博士から 供与された。 ST2細胞は、 ES細胞力 血液細胞への分ィ匕を促進する能力をもつこと が既知である間質細胞である。 MEFは、胚齢 12.5〜14.5日の胚から単離した。 ST2細 胞は 5%FBSおよび O.lmM 2-メルカプトエタノールを補充した RPMI培地中で、他の細 胞は 10%FBSを補充した DMEM培地中で培養した。 ST2細胞以外のフィーダ一細胞 は、使用前に 200 g/mlのマイトマイシン Cで 2.5時間処理した。 M15細胞は、ゼラチ ンコートした 24ゥエルプレートに、 1ゥエル当たり 2 X 105個の濃度で播種した。 MEF細 胞は、 1ゥエル当たり I X 105個で用いた。 ST2細胞はマイトマイシン C処理を行わずに 用い、 ES細胞を播種する 3〜4日前に 24ゥエルプレートに 5 X 104個/ゥエルで播種した
[0039] (4)増殖因子
組換えヒトフオリスタチン 300 (GT、 #2669)は GTから購入した。組換えヒトァクチビン A (GT、 #2338)は 10ng/mlで使用した。組換えマウスノギン ZFcキメラ（R&D、 #719-N G)は 100ng/mlで使用した。組換えヒト骨形成タンパク（BMP) 2 (Osteogenetics GmbH 、ヴュルツブルク、ドイツ）は、 5ng/mほたは 25ng/mlで使用した。ニコチンアミドは Sigm aから購入した。
[0040] (5) j8 -ガラクトシダーゼ活性検出のための X-gal染色
ES細胞培養物を、 PBS中 4%パラホルムアルデヒド中で室温で 20分間固定し、 PBS で数回すすぎ、 j8 -ガラクトシダーゼ活性について染色した。 X-gal染色のために、細 胞を、 lmg/mlの X- galの存在下、 PBS中に 20mM K Fe(CN)、 20mM K Fe(CN) - 3Η Ο
3 6 4 6 2
、 2mM MgCl、 0.02% Nonidet- P40、 0.01%デォキシコール酸を含む緩衝液中で 37
2
°Cで一晩インキュベートした。各ゥエルの LacZ陽性細胞数を顕微鏡下でカウントした 。 X-gal染色後に細胞カゝら DNAを抽出して定量した。各ゥエルの細胞の総数を DNA標 準力も測定し、各ゥエルでの X-gal陽性細胞の割合を算出した。 12日間分ィ匕させた細 胞の総数は 3 X 105〜1 X 106個であった。
[0041] (6) GFP陽性細胞の定量
ES細胞の蛍光写真を実体顕微鏡 (ライカ MZFLIII)下で 24時間ごとに撮影し、 Lumin a Visionソフトウエア（三谷商事、 日本)で蛍光強度を定量した。免疫蛍光写真は、 CC Dカメラ（DP50)を使用した Olympus 1X70で撮影した。 [0042] (7)逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)による解析
TRIZOL試薬（G¾co BRL)、その後 DNase (Sigma)を使用して、 ES細胞から RNAを 抽出した。逆転写 (RT)反応には、 M-MLV逆転写酵素 (Toyobo)およびオリゴ dTブラ イマ一（Gibco BRL)を用いて、 3 μ gの RNAを逆転写した。 1 μ 1の 5倍希釈 cDNA (逆転 写産物の 1/100に相当）を PCR解析に用いた。
[0043] プライマーの各組み合わせについて、サイクル数と直線範囲の RT-PCRに必要な c DNA量を経験的に決定した。プライマーの配列、各プライマー対に用いたサイクル数 を表 1に示す。 RT-PCR産物の 1/5を 5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAG E)にロードし、 DNA感受性の色素 SYBRGreenl (Molecular Probes)を用いて Fluorolm ager (Molecular Dynamics)で解祈した。
[0044] [表 1]
表 1 ：マウス遺伝子発現を検出するために使用し P C Rプライマー
退 feナ フォヮ一ドプライマ一 リノ ースプライマー 、ナイク
Afp TCGTATTCCAACAGGAGG AGGCTTTTGCTTCACCAG 25
Amylase CAGGCAATCCTGCAGGAACAA CACTTGCGGATAACTGTGCCA 30 β Act in GTGATGGTGGGMTGGGTCA TTTGATGTCACGCACGATTTCC 18
Ckl9 GTCCTACAGATTGACAATGC CACGCTCTGGATCTGTGACAG 22
Glucagon ATTCACAGGGCACATTCACC GGTCTCTGAAGTAGTTGACC 29
Glut2 ACAGAGCTACAATGCAACGTGG CAACCAGAATGCCAATGACGAT 27
Iapp GATTCCCTATTTGGATCCCC CTCTCTGTGGCACTGAACCA 27
Insl CAGCCCTTAGTGACCAGCTA ATGCTGGTGCAGCACTGATC 30
Ins2 TCCGCAACAATCAAAAACCAT GCTGGGTAGTGGTGGGTCTA 29
Isll GACTGAGAGGGTCTCCAGCTC AGCAAGAACGACTTCGTGATG 26
Kir6. 2 GGCTCCTAGTGACCTGCACCA CCACAGCCACACTGCGCTTGCG 26
Met GATCGTTCAACCGGATCAGAA GGAAGAGCCCGGATAATAACAA 25
NeuroD GGAGTAGGGATGCACCGGGAA CTTGGCCAAGAACTACATCTGG 25
Ngn3 CTGCGCATAGCGGACCACAGCTTC GCTGAGTTCCAAGCTCCGAT 26
Nkx2. 2 AACCGTGCCACGCGCTCAAA AGGGCCTAAGGCCTCCAGTCT 25
Nkx6. 1 TACTTGGCAGGACCAGAGAG CGCTGGATTTGTGCTTTTTC 25
Pax4 CAG GAGCCAAATGGCG TGAGCAATGGGTTGATGGCA 27
Pax6 CAGTCACAGCGGAGTGAATC CGCTTCAGCTGMGTCGCAT 26
Pax9 CAAGGTGGAGGAGTGGAGCAG GAGGGGGATAGGTTTCTTCTCTG 26
Pdxl CCAAAACCGTCGCATGAAGTG CTCTCGTGCCCTCAAGAATTTTC 28
PP AGGATGGCCGTCGCATACTG CTGAAGGACCTCACGTCGAG 30
Sst CCGTCAGTTTCTGCAGAAGT CAGGGTCMGTTGAGCATCG 26
Sftpc CATCGTTGTGTATGACTACCAGAG GAATCGGACTCGGMCCAGTATC 34
PCR条件：
Iapp, Ins2及び PP:
96°C (変性）で 30秒、 60°C (アニーリング）で 2秒、及び 72°C (伸長）で 45秒（Hot start) Amylase, Insl及び Kir6.2
96°C (変性）で 30秒、及び 70°C (アニーリング及び伸長）で 30秒（Hot start) その他： 96°C (変性）で 30秒、 60°C (アニーリング）で 2秒、及び 72°C (伸長）で 45秒
[0046] (8)免疫組織化学検査（図 5及び図 16の実験方法）
全マウント免疫組織ィ匕学検査を行う際、中胚葉細胞又は ES細胞を Nunc Thermanox Colerslips 24well type (Nunc, # 174950)上に置いた。細胞を、 4%パラホルムアルデ ヒド中で室温で 20分間固定し、 0.1 %tween含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS-T)で充 分に洗浄した。 1% TritonX-100を含有する PBSで室温で 10分間浸透させ、ブロッキ ング溶液（x5 Blocking One, Nacalai Tesque)で 1時間インキュベートした後、ブロッキ ング溶液中の一次抗体を試料に添加し、 4°Cで一夜インキュベートした。試料を PBS- Tで充分に洗浄し、 PermaFluor Aqueous Mounting Medium (IMMUNON)でマウントし た。共焦点画像を Leica Spectral Confocal Scanning System, TCS- SP2 (Leica)を用い て取得した。
[0047] 検出に用いた抗体は、ゥサギ抗 AFP (Biomeda, #A02)、ャギ抗アルブミン (Sigma, # A1151)、マウス抗 Cdx2 (BioGenex, #MU392- UC)、マウス抗 CK19 (DAKO, #M0888) 、ャギ抗 HNF3 β (Santa Cruz, #sc- 9187)、ゥサギ抗 Pdxl (Chemicon, #AB5754)、及 びゥサギ抗 T (Santa Cruz, #sc- 20109)、ゥサギ抗 Nkx2.1 (Santa Cruz, #sc- 13040)、ゥ サギ抗 GFP(MBL, #598)である。用いた二次抗体は、 Allexa 568結合ャギ抗ゥサギ及 びマウス抗体 (Molecular Probes, #A11036 and #A11019), Allexa 488結合ャギ抗ゥサ ギ及びマウス抗体 (Molecular Probes, #A11070)、 C y3結合ロバ抗ャギ抗体 (Jackson Lab, #705- 166- 147)である。
[0048] (9)蛍光標識によるフローサイトメトリー（FACS) (図 12の実験方法）
M15細胞は、ゥエル当たり 2 X 105個で播種し、使用前に培養した。 5,000細胞の SK7 ES細胞を、分化培地中の中胚葉細胞層に播種し、 8日間分化させた。分化の 8日目 に、 SK7 ES細胞を Cell dissociation buffer (GIBCO BRL)を用いて 37°Cで 20分間解離 させた。細胞を、モノクローナル抗体 (mAb)の組み合わせを用いて染色した。この実 験で使用した抗体は、ピオチン結合抗 E-カドヘリンモノクローナル抗体 ECCD2(熊本 大学永渕昭良教授、小川峰太郎教授より供与、非標識抗体はタカラバイオ (株)より 購入可能)、 PE結合抗 Cxcr4モノクローナル抗体 2B11 (Becton, Dickinson and Compa ny)である。表面染色のために、細胞を標識したモノクローナル抗体の混合物と一緒 にインキュベートした。染色した細胞を、 40 mのメッシュで濾過し、ヨウ化プロピジゥ ムを含む HBSS- 1%BSAに再懸濁し、 FAC S Canto (Becton, Dickinson and Company )で解析した。丁 ~~タは、 CellQuest Prosoftware (Becton, Dickinson and Company)を 用いて記録し、 Flowjo program (Tree Star)を用いて解析した。
[0049] (10)蛍光標識によるフローサイトメトリー（FACS) (図 13の実験方法）
マイトマイシン処理した M15細胞は、使用前に 90mmプレート 1枚当たり 6 X 106個を一 晚培養した。 3 X 105個の ES細胞 SK7株を分化培地中の M15細胞層上に播種し、 9日 間分ィ匕させた。分化の 9日目に、 ES細胞 SK7株を 0.25%トリプシン- EDTAで 10分間トリ プシン処理し、 40 μ mのメッシュで濾過し、 1 X 106〜2 X 106個/ mlの濃度で、ヨウ化プ 口ビジゥムを含む HBSS-1%BSAに再懸濁し、 FACS Vantage SEで解析した。未分化 の ES細胞 SK7株をネガティブコントロールとして用いた。分化した ES細胞を緑色蛍光 の強度により 5画分に分け、 RNA抽出および RT-PCR解析を行った。
[0050] (11) ES細胞由来分化細胞の維持培養方法
分化した ES(dES)細胞を、 M15の下、ァクチビン及び bFGFの両方を添カ卩して、 10%F BSを添カ卩した培地中で 8日間培養した。 ES細胞を 8日間培養した後、 dESを 0.05%トリ プシン/ EDTAでトリプシン処理し、 2-メタクリルオイロキシェチルホスホリルコリン (2- Methacryloyloxyethyl PhosphorylCholine； MPC)を被覆した低細胞結合ディッシュ（口 一セルバインディングディッシュ &プレート； Nalgenunc, #145389)に再度播種するこ とで Pdxl陽性細胞を維持培養することが出来る。
[0051] (12)マウス腎臓皮膜下への移植
(上記の項で維持培養 1日目の Pdxl陽性分ィ匕細胞を改修し、移植実験に使用した（ 図 14)。通常の麻酔下で、マウスの左腎臓皮膜下に dES (約 3 X 106細胞)を移植した。 移植の 1週間後に、 ES細胞を移植したマウスを殺し、腎臓を取り出し、 4%パラホルム アルデヒドで固定ィ匕した。移植片（10 m)の凍結切片を免疫組織化学により解析し た。
[0052] (13) ES細胞の分化 (図 17の実験方法）
血清なしの条件下での分ィ匕のために、 SK7 ES細胞を、分ィ匕培地中において、中胚 葉細胞で予め被覆した 24ゥエルプレートにゥエル当たり 5,000細胞で播種し、 8日間 培養した。培地は 2日毎に交換した。胚性内胚葉 (E-cadherin +/CXCR4+ cells)に分 化した ES細胞又は Pdxl/EGFP細胞を比較した。 ES細胞は、 10%FBS (FBS)中におい て、又は 20ng/mlのァクチビンありの場合となしの場合で、 10 g/mlインスリン（Sigma) , 5.5 μ g/mlトランスフェリン (Sigma), 6.7 pg/mlセレン (S igma)及び 0.25%アルブミン (Al bmax, GIBCO)を補充した血清なしの基礎培地 (DMEM, Gibco BRL) (ITS)中におい て分化させた。
[0053] (B)結果
(1)中胚葉細胞による、 ES細胞から Pdxl発現腸管内胚葉細胞への分化を促進する 因子の産生
共培養系を用いて、 ES細胞の内胚葉分化を促進する活性について、初代培養細 胞と株化細胞のスクリーニングを行った。 Pdxl座位に lacZレポーター遺伝子を挿入し た ES細胞株を用いたため、 Pdxl遺伝子の発現は in situ X-Gal染色により視覚化する ことができた。その結果、中腎細胞株 M15 (Larsson, S. H., Charlieu, J. P., Miyagawa, K., et al. (1995). Subnuclear localization of WT1 in splicing or transcription factor domains is regulated by alternative splicing. Cell 81, 391-401)、マウス胚線維牙ホ田 胞 (MEF) (Nagy A , et al. (2003) Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory M anual. Third Edition Cold Spring Harbor Press)、及び ST2細胞（Ogawa, M., Nishika wa, S., Ikuta, K., Yamamura, F., Naito, M., Takahashi, K. and Nishikawa, S. (1988) EMBO J, 7:1337-1343)など数種の中胚葉由来細胞株をフィーダ一細胞として用い て ES細胞と共培養した場合に、 ES細胞の Pdxl/ β -gal発現細胞への分化が促進され ることが判明した。 M15細胞株により、 ES細胞の Pdxl/ 18 -gal発現内胚葉細胞への分 化が顕著に促進された。 M15細胞層上で培養した場合、分ィ匕した全 ES細胞の 0.1% が Pdxl/ -gal発現細胞になった（図 1)。これは、胚性脾原基との共培養で誘導され る Pdxl/ β -gal発現細胞の割合と同様である。 MEFにより、 ES細胞の Pdxl/ β -gal発 現内胚葉細胞への分化が中程度に促進された。 M15細胞上で培養した ES細胞は再 現性よく Pdxl/ β -gal発現細胞を最も多く生じさせたため、以後の実験には M15細胞 株を用いた。
[0054] M15フィーダ一細胞層上の Pdxl/ β -gal発現細胞の時間依存性の変化をモニター した。図 2は、 Pdxl/ β -gal発現細胞数が 12日目にピークに達し、その後は減少したこ とを示す。分化した ES細胞を 7日目にトリプシン処理し、新たに調製した M15細胞層 上で継代した場合、 15日目（継代後 8日目に相当）に Pdxl/ β -gal陽性細胞が再び出 現した。 Pdxl/ 18 - gal陽性細胞の再出現までに、短い時間しか要しないことは、 ES細 胞を M15フィーダ一細胞層上で培養する場合に培養物中に未分化細胞またはある 種の内胚葉前駆細胞が存在することを示している。 10回まで継代を行ったところ、 Pd xl/ β -gal陽性細胞の再出現が同様に観察された。
[0055] (2) Pdxl/GFP発現を利用した生存 ES細胞での内胚葉系への分ィ匕のモニタリング 蛍光色素を用いて生存 ES細胞での pdxl発現を追跡するため、 Pdxl/GFPを含むプ ラスミドを導入した P#48.9系統のトランスジエニックマウス（Gu, G., Wells, J. M., Dom bkowski, D., Preffer, F., Aronow, B., and Melton, D. A. (2004). Global expression a nalysis of gene regulatory pathways during endocrine pancreatic development. Devel opment 131, 165- 79)力 ES細胞株を榭立した。 P#48.9系統のトランスジエニックマウ スは、胚形成を通じて Pdxlの発現を再現することが示された。当初、 ES細胞株を 8系 統榭立したが、これらすベては in vitroでの分化中に類似の Pdxl/GFP発現パターン を示した。この中で、 SK7と命名した ES細胞株が良好に増殖したので、これを以後の 実験に用いた。 Pdxl/GFP発現 ES細胞（SK7)をマイトマイシンで処理した M15細胞上 で分化させ、 Pdxl/GFP発現の時間依存性の変化をモニターした。
[0056] 分化手順の略図を図 3Aに示す。 ES細胞 SK7株は、 10%の FBSを含む分化培地を 含む 24ゥエルプレートに、 500個 Zゥェルという低密度で播種した。対照の分化培地と 、第 4日以降分化培地中の FBSを Knocked- out Serum Replacementで置換えた培地（ KSR置換分化培地)で、培養条件を比較した。低密度培養では、 ES細胞を KSR置換 分化培地中で培養した場合、第 4日以降の Pdxl/EGFP陽性細胞数が増加することが 明ら力となった（図 3A)。分ィ匕の中の ES細胞のコロニーの形態変化を図 3Cに示す。 コロニーの多くは分ィ匕第 5日まで盛り上がった形を保ち、 6日目前後にはコロニーの中 心からの細胞の移動が観察される（図 3C)。細胞の移動に伴い、 6日目には Pdxl/EG FP発現が検出できるようになり、 8日目には発現細胞が最多値に達してその後は減 少する（図 3B)。 Pdxl/EGFP陽性コロニーでは、細胞はコロニーの中心力も移動し、 その後、 Pdxl/EGFP陽性細胞がコロニー周縁部にあり、丸く大きい平坦なコロニーを 形成した。 Pdxl/EGFP陰性コロニーは、盛り上がった密集したコロニーの特徴を示し た。これらの結果は、脾の分ィ匕には移動性能の獲得が必要であることを示している。
[0057] (3) RT-PCR解析による M15フィーダ一細胞層上で分ィ匕させた ES細胞における脾内 分泌マーカーと他の内胚葉由来組織マーカーの発現の検出
M15フィーダ一細胞上の ES細胞 SK7株の分ィ匕状態の特徴を明らかにするため、脾 内分泌マーカーの発現を解析した。 Pdxlの発現は 4日目に検出され、 8日目にピーク に達した（図 4)。 Nkx2.2、 Nkx6.1、 Pax 4、 Pax6、 Isll、 NeuroD、 Ngn3などの他の内分 泌前駆細胞のマーカーも検出された。 Pax4と Isllの発現は、ゼラチンコートしたゥエル で分化した対照 ES細胞でも検出されるが、他のマーカーの発現は Ml 5フィーダ一細 胞層上で分ィ匕させた ES細胞で特異的に誘導される。 M15フィーダ一細胞層上で分ィ匕 させた ES細胞でのインスリン 2発現は、第 8日に検出された。グルカゴン、脾ポリぺプ チド (Pp)、ソマトスタチン (Sst)などの成熟脾の他の内分泌の分子マーカーや外分泌 マーカーであるアミラーゼも、 M15フィーダ一細胞上で分ィ匕させた ES細胞で特異的に 検出される。 Iapp、ダルコキナーゼ、 Kir6.2などの成熟'細胞のマーカーが検出される
[0058] また、未熟肝臓マーカー（アルブミン、 αフエトプロテイン、 Met)、肺のマーカー（Sft pc (図 5の免疫染色ではさらに Nkx2.1の発現が示されて!/、る））、口腔マーカー（Pax9) が検出されている。即ち、 M15を用いた誘導方法によって、内胚葉性器官が脾臓以 外にも、肝臓、肺、口腔が誘導されている。さらに小腸も（図 5)誘導されているので、 広い器官誘導能があることが示されている。従って、本発明の分化誘導法は、脾臓、 肝臓、肺、小腸、口腔 (Pax9, RT-PCR)を含む内胚葉性器官の分化誘導に有用であ る。
[0059] 上述の結果は、 M15支持細胞が、 ES細胞の脾ゃ肝などの内胚葉由来臓器への分 化を特異的に促していることを裏付けている。この活性を Mesodermal Derived Induci ng Activity (中胚葉由来分ィ匕誘導活性； MDIA)と名づけた。
[0060] さらに、他の ES細胞（Rl、及び Jl ES細胞）に対する MDIA (中胚葉由来分化誘導活 性)の効果を調べた。 Pdxl,又は内分泌マーカー (インスリン、脾ポリペプチド、及び ソマトスタチン）の発現は MDIA処理した R1及び Jl ES細胞で上昇して!/、た（図 4の右 図）。従って、 MDIAは、各種の ES細胞に適用できることが示された。
[0061] (4) SK7細胞由来の分ィ匕細胞における内胚葉関連マーカーの発現の検出
免疫組織ィ匕学検査により SK7細胞由来の分ィ匕細胞における内胚葉関連マーカー の発現を検出した結果を図 5に示す。図 5に示す通り、内胚葉細胞の共通マーカーで ある HNF3 β、各種内胚葉系器官関連遺伝子:肝臓マーカー遺伝子のアルブミン、 肺のマーカー遺伝子の Nkx2.1、小腸のマーカーの Cdx2遺伝子の発現 (赤色）が認 められた。また、 Hnf3 βの発現細胞は Pdxl/EGFP陽性細胞と重なる力 肺や肝臓な どの脾臓以外の内胚葉系器官関連遺伝子を発現する細胞は Pdxl/EGFP陽性細胞（ 緑)とは異なった糸田胞であった。
[0062] (5) MDIA処理により誘導される内胚葉前駆細胞
RT-PCR分析の結果により、他の内胚葉由来組織 (肝臓等)も ES細胞の MDIA処理 により誘導されることが示された。これにより、 MDIA処理が、 ES細胞から内胚葉への 分化を特異的に誘導することが分かる。内胚葉前駆体の分化をモニターするために 、 Ηηβ 遺伝子の内胚葉特異的ェンハンサー断片を使用して（Nishizaki, Y., Shima zu, K., Kondoh, Η·, Sasaki, Η.(2001) Identification of essential sequence motifs in t he node/ notochord enhancer of Foxa2 (HnlBbeta) gene that are conserved across ve rtebrate species. Mech Dev 102, 57-66)、単量体赤色蛍光タンパク質 Iレポーター遺 伝子 (mRFPl)の発現を制御するように設計した Hnf3 β /mRFPl遺伝子を導入したトラ ンスジエニックマウスを作製した。 Hnf3 β /mRFPlトランスジエニックマウスは、 Hnf3 β の発現パターンを既報の通り再現した (Nishizaki et al.， 2001)。 Ηηβ j8 /mRFPlトラン スジエニックマウスは、 Pdxl/EGFPトランスジエニックマウス株 P # 48.9(Gu, G., Wells, J. M., Dombkowski, D" Preffer, F" Aronow, B" and Melton, D. A. (2004). Global e xpression analysis of gene regulatory pathways during endocrine pancreatic develop ment. Development 131, 165- 79)と交配させた。 Ηηβ j8 /mRFPlと Pdxl/EGFPの両方 の導入遺伝子を有する ES細胞株を榭立し、 PH3と命名した ES細胞株を以後の実験 で使用した。 ES細胞 PH3株を、マイトマイシンで処理した M15細胞上で分ィ匕させ、 Pdx 1/EGFP及び Hnf3 β /mRFPlの発現の時間に依存した動態をモニターした。図 6は、 Ηηβ β /mRFPlの発現が分化の 7日目に観察され、これは Pdxl/EGFPの発現より 1日 先行していることを示す。 Ηηβ βを発現する ES細胞の集団は、 Pdxlを発現する集団 より大きい。時間依存的な発現及び Hnf3 β及び Pdxlを発現する ES細胞の集団は、 通常の胚発生を再現する。これらの結果から、 ES細胞の MDIA処理により内胚葉前駆 体が誘導されることが示された。
[0063] (6)中胚葉由来分化誘導活性 (MDIA)の一部はァクチビンによる作用である
中胚葉由来分ィ匕誘導活性 (MDIA)の分子メカニズムを明らかにするため、実験に 用いたフィーダ一細胞株でのァクチビン β Α、ァクチビン β Β、フオリスタチンなどの数 種の増殖因子の発現をスクリーニングした。ァクチビン 13 Αとァクチビン 13 Bは M15細 胞中で高レベルで、 MEF細胞中で中レベルで発現している。フオリスタチンは、 M15 細胞では発現しないが、 MEF細胞、 ST2細胞では高レベルに発現している（図 7A)。 ES細胞の分ィ匕培養物中でのァクチビン A添カ卩の効果を分析した。 lOng/mlのァクチビ ン Aの添カ卩により、 M15細胞上での Pdxl/EGFP発現が有意に促進された（図 7B、 Stud entの t-検定、 * p〈0.01)。フオリスタチンを 25ng/mlで添カ卩した場合、 Pdxl/EGFP陽 性細胞は減少し、 250ng/mlで添加するとさらに有意に減少した。ァクチビン A(10ng/ ml)を外から添加することによる MDIA促進は 250ng/mlのフオリスタチンで阻害される。 これらの結果は、 MDIAを媒介する分子についての研究力 ES細胞の膝への分化に 必要とされる誘導シグナルを研究する際に有用であることを示している。上記の結果 は、ァクチビンが MDIAを媒介する分子の一つであることを示している。 MDIAはフオリ スタチンによって完全には阻害されないため、 ES細胞を内胚葉系細胞に分ィ匕させる MDIAに関与する M15細胞には他の分子が含まれている可能性がある。 M15細胞、ま たは MDIAを示す他のフィーダ一細胞中で発現される分泌型または膜結合型の分子 について研究することにより、 ES細胞の内胚葉系への分ィ匕の分子メカニズム解明に 関する情報を得ることができる。
[0064] (7) MDIAは ES細胞の内胚葉系への分ィ匕を促進し、この分化を促進する誘導因子ま たは培養条件のスクリーニングに利用できる
M 15細胞層上で培養した ES細胞に添加した際に ES細胞の内胚葉系への分ィ匕をさ らに促進する誘導分子のスクリーニングのために、 MDIAを利用できるかどうかをさら に検討した。 KSR置換分ィ匕培地で培養した ES細胞は Pdxl/EGFP発現細胞の産生が より多いことが図 3Aから示されたことから、血清中に阻害因子が存在する可能性を推 測した。 BMPの阻害因子であるノギンを様々な時期に添カ卩し、 MDIAに対する効果を 試験した。その結果、第 5 - 8日目に添カ卩した lOOng/mlのノギンは MDIAを増強するこ とが明らかになった。図 8に示すように、ノギンの増強効果は分ィ匕培地の代わりに KSR 置換分ィ匕培地を用いても観察できる。しかしながら、ノギン添加の効果は分ィ匕の後期 に限定されなかった。第 0 - 4日の lOOng/mlのノギンの添カ卩により MDIAが増強された 。より短い時期にノギンを添加した追加実験からは、第 3 - 4日のノギン添加が第 0 - 4 日まで添加した場合と同様の結果になることが示されている（図 8)。次に、血清中の B MPが ES細胞の内胚葉系への分ィ匕に対し阻害的に作用するかどうかを検討した。図 9 は、第 3 - 4日の分ィ匕培地へのノギン添カ卩により、ノギン非添加の KSR置換分ィ匕培地 で培養した場合と同程度の Pdxl/EGFP発現細胞が生じたことを示す。 KSR置換分ィ匕 培地中で分化させた ES細胞中の Pdxl/EGFP発現細胞の数は BMP2添カ卩により減少 したが、これはノギンの添加の追カ卩により相殺された（図 9)。し力しながら、第 0 - 4日 に無血清状態での ES細胞の分ィ匕では、細胞の増殖が不良なため、 Pdxl/EGFP発現 が低いことが明らかになった。従って、以後の実験では、 ES細胞の内胚葉系への分 化を促進するために第 3 - 4日目にノギンを添加し、分化第 4日以降は分化培地の代 わりに KSR置換分ィ匕培地を用いて 、る。
[0065] さらに、ニコチンアミド (NA)をノギンまたはァクチビン Aとともに添カ卩した場合の効果 を検討した。図 10は、ノギンとァクチビン、またはノギンとニコチンアミドの添加で相加 効果を示さな力つたことを示す。し力しながら、ノギン、ァクチビン、ニコチンアミドの添 加で Pdxl/EGFP発現が促進された。挿入図は、ノギン、ァクチビン、ニコチンアミドの V、ずれかを添加した場合の時系列データを示す。
[0066] BMP2とニコチンアミドは、 M15細胞でも他の細胞株でも発現して!/、な!/、ため、これら の結果は、内胚葉分ィ匕を促進する増殖因子または化合物のスクリーニングに MDIA が利用可能であることを示して 、る。
[0067] (8)成長増殖因子の添加による脾臓への分化誘導の促進
10%FBS入りの分化培地中へのァクチビン、 bFGF、又はァクチビン +bFGFの添カロ により、 Pdxl/EGFPの発現細胞の数が増えることが示された。図 11Aは、 8日目の Pdx 1/EGFP像を示す。ァクチビン 20ng/ml, bFGF 5ng/mlになるように加えた。図 11Aで は、ァクチビンと FGFをカ卩えることで、 Pdxl/EGFP陽性コロニーの形態が変化した。陽 性コロニーの中心部にあった細胞の塊が消えて、その結果、 Pdxl/EGFPを発現する 細胞の数が増加した。また、両者を同時に ES細胞に作用させることにより、相乗効果 を示した。また、 d8/M15最上の図は、 M15を用いて分ィ匕誘導した場合の Pdxl/EGFP 陽性コロニーは広がった形態を示し、中心には細胞の塊が小さく見え、 Pdxl/EGFP 陽性細胞がコロニーの辺縁部に位置する（矢印）。 Pdxl陰性コロニーでは、中心に丸 い大きいコロニーが観察される（矢頭)。 +ァクチビン (20)では、分化 0日目力ら 8日目ま でァクチビンを 20ng/mlカ卩えている。 Pdxl/EGFP陽性脾幹細胞が多く出現し、広がつ たコロニーの形態を示し、 Pdxl/EGFP陰性コロニーが減少している。 Pdxl/EGFP陽 性コロニーの中心に見えていた細胞の小さい塊が消失している。 +bFGF (5)では、分 ィ匕 0日目力 8日目まで、 bFGFを 5ng/m 1添カ卩している。中心部の細胞の移動が促進 され、広がったコロニーの形態を示す。その結果、 Pdxl/EGFP陽性細胞がコロニー の辺縁部により集積されるようになる。また、 +ァクチビン (20)+bFGF (5)では、分化 0日 目力 8日目まで、ァクチビンと bFGFをカ卩えている。両者がさらに相乗作用し、 Pdxl/ EGFP陽性膝幹細胞がさらに多く出現した。
[0068] 図 11Bは、図 11Aにおけるァクチビンと bFGFの両方をカ卩えている条件で得た分ィ匕細 胞につ 、て C ペプチドに対する抗体で染色した結果を示す。 C ペプチドはインス リン生合成時の副産物として生じるので、陽性細胞はインスリンを実際生合成してい ることが示される。 Pdxl/EGFP陽性細胞は緑色である。分ィ匕細胞では、 C ペプチド 単独陽性 (赤色)の細胞も観察されたが、多くの細胞が C ペプチド/ Pdxl両陽性 (黄 色)であった。拡大写真を Aと Bに示している。
[0069] さらに FACSを用いて分化を評価した。図 12Aでは、内胚葉（胚性内胚葉； definitive endoderm)は E- cadherin,Cxcr4両陽性細胞とする。脾臓前駆細胞は E-cadherin,Pdxl /EGFP両陽性細胞とする。 M15上では、 8日目では内胚葉が全細胞の 8%を占める。 ァクチビンと bFGF添加条件では内胚葉の割合が上昇し、全細胞の 47%を占めるよう になる。また、脾前駆細胞は M15上では内胚葉中の 22%を占める力 ァクチビンと bF GF添加条件では内胚葉における膝前駆細胞の割合が 67%に上昇した。
[0070] また、図 12Bは、細胞の内部構造の複雑さを反映する側方散乱光 (SSC)と細胞の 大きさを反映する前方散乱光 (FSC)の指標を用いた ES細胞、 M15細胞、分化 ES細 胞の FACS展開像を示す。 SSCと FSCの指標を用いて、図の多辺形で囲む部分を分 取することで、 M15細胞を除くことができる。図 12Bは、ァクチビンと bFGF添加条件で の実施例を示している力 この M15不含画分に Pdxl/EGFP陽性細胞が含まれること が分かる。
[0071] (9) FACSによる ES細胞由来 Pdxl/EGFP陽性細胞の分離および発現解析
ES細胞由来 Pdxl/EGFP発現細胞の分子的特徴を検討するために、分化した ES細 胞集団を FACSで解析した。図 13A及び Bは、 M15細胞上で分ィ匕した ES細胞では、未 分化 ES細胞の場合と比較して、 Pdxl/EGPF陽性細胞の集団が GFP陽性側にシフトし ていることを示す。分化 ES細胞を GFP発現量により 5画分に分け、各画分について、 脾分ィ匕の分子マーカー発現を RT-PCR法で解析した。 RT- PCR解析により、 GFP陽 性シグナルが強い no.4の画分で Pdxl発現が高いことが示される（図 13C)。この画分 は分化した ES細胞全体の約 1%に相当する（図 13B)。 GFP陽性シグナルが強いこの画 分では NeuroD、インスリン、 PP、 Sstの発現も観察されており、この画分の細胞が脾の 系譜であることを示して 、る。
[0072] (10)分化 ES細胞の維持培養
分化した ES細胞は図 14に示す方法で維持培養できる。即ち、分化した ES細胞を、 M15の下、ァクチビン及び bFGFの両方を添カ卩して、 MPCを被覆した低細胞結合ディ ッシュに再度播種することで Pdxl陽性細胞を維持培養することができた（図 14)。
[0073] (11)マウスの腎臓皮膜下へ移植した ES細胞における Pdxl/EGFP及びインスリンの 発現の維持
分ィ匕した ES細胞を腎臓皮膜下に移植した。移植マウスを 1週間後に殺し、移植片の 凍結切片を免疫組織ィ匕学により分析した。図 15は、 Pdxl/EGFP発現が維持され、ィ ンスリン発現も見られることを示す。これらの結果は、 Pdxl/EGFP陽性細胞は、マウス に移植した際に、増殖してインスリン産生細胞に分ィ匕できることを示して 、る。
[0074] (12)サル ES細胞を用 ヽた分化誘導 サル ES細胞を用いて、マウス ES細胞のと同様に M15上で分化誘導した細胞につい ての染色像を図 16に示す。サル ES細胞の培養条件 (旭テクノグラス (株)より購入）は 以下の通りである。培養 0日目に 24ゥエルプレートにサル ES細胞を 20,000細胞/ well の濃度で播種し、培養 1,3,5,7,9日目に培地交換した。培地は分ィ匕培地（10%FBS/D MEM (high glucose)を用いた。図 16の A及び Bは、分化誘導して 4日目と 8日目の染色 像で、中胚葉前駆細胞のマーカーである HNF3 j8、と中胚葉のマーカー T (Brachyury )で染色した結果を示す。 4日目と 8日目にはともに HNF3 βの発現が強く検出された。 図 16の C,D,Eは、 10日目には脾臓前駆細胞のマーカー Pdxl、小腸のマーカーである Cdx2、肝臓のマーカーのアルブミン、胆管のマーカーの CK19が発現していることか ら、内胚葉系細胞 (脾臓、肝臓、胆管、小腸)への分化が示された。
[0075] (13)ヒト ES細胞を用いた分化誘導
ヒト ES細胞を用 、て、マウス ES細胞のと同様に M 15上で分化誘導した細胞について の染色像を図 17に示す。ヒト ES細胞の分ィ匕培養条件は以下の通りである。培養 0日 目に 24ゥエルプレートにヒト ES細胞を 20,000細胞/ wellの濃度で播種し、培養 1,3,5,7, 9,11日目に培地交換した。培地は分化培地（10%KSR/DMEM (high glucose)を用い た。図 17の A, Bおよびにおいて、 12日目には内胚葉細胞のマーカー HNF3 β、小腸 のマーカーである Cdx2、肝臓のマーカーのアルブミン、 αフエトプロテイン、胆管のマ 一力一の CK19が発現していることから、内胚葉系細胞 (肝臓、胆管、小腸)への分ィ匕 が示された。
[0076] (14) M15支持細胞上における無血清培地を用いた脾前駆細胞の誘導
M15支持細胞上での SK7細胞を用いて、分化能を評価した結果を図 18に示す。内 胚葉（definitive endoderm)は E-cadherin,Cxcr4の両陽性細胞とする。内胚葉の維持 及び Pdxl/EGFP陽性細胞への分ィ匕には血清中の因子が必要と考えられる。無血清 培地のみでは、 M15細胞上では、内胚葉ゃ脾前駆細胞への分化が低いが、ァクチビ ンを加えると、内胚葉ゃ脾前駆細胞への分化能が上昇した（図 18)。特に脾前駆細 胞へ分ィ匕した細胞が 2%であり、力なり高い効率を達成できた。
産業上の利用可能性
[0077] 本発明の方法によれば、 ES細胞力も脾幹細胞などの内胚葉系細胞を効率よく分ィ匕 誘導することができる。また、本発明の培養方法を用いることにより、未知の物質の脾 への分ィ匕誘導効果を感度良く測定することができることから、分ィ匕誘導物質のスクリ 一二ング方法として応用できる。本発明によれば、分化した ES細胞由来の脾幹細胞 又は肝幹細胞などを純ィ匕し、それを試験管内で維持培養することができる。また、本 発明の方法は、複数種類の ES細胞株に応用できる。本発明の方法は、発生が同じ 内胚葉起源の細胞にも応用できる。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、各種細胞株における脾分ィ匕誘導能のスクリーニングを示す。 A:分化誘 導法の模式図。 Pdxlプロモーターに LacZ遺伝子ノックインした ES細胞を培養細胞上 に 5000 cells/well (24well)の密度で播種後、血清存在下で培養し 12日目に X-gal染 色をすることにより各種細胞株の脾分化誘導効果を評価した。浮遊胚様体 (EB)形成 後 2日目に培養細胞上に播種するので、培養 14日目で X-gal染色による評価をした こととなる。 B : X-gal染色像。各写真に支持細胞に用いた細胞名を示した。 C :各細胞 株を支持細胞に用いた時の Pdxl/ β -gal陽性の細胞の占める割合を縦軸に示す。 M15, MEF, ST2について誘導効果が認められた。 Student's t-testで対照実験のゲ ル上で分化させた ES細胞と差が有意であったもの： * * , p〈0.01。
[図 2]図 2は、 M15を用いた ES細胞からの Pdxl/ β -gal陽性細胞の経時的な評価を示 す。 A:スクリーニングによって一番高い脾分ィ匕誘導効果が認められた M15を用いて、 ES細胞からの分化誘導実験を行い、経時的に X-gal染色で評価した。写真には分化 誘導開始後の日数を示した。括弧の中の日数は継代後の日数。 B :M15支持細胞 細胞上への継代による Pdxl/ β -gal陽性細胞の出現の時間経過。分化誘導開始後 の日数を横軸、 Pdxl/ 18 -gal陽性細胞の数を縦軸に示した。 M15を用いた分化誘導 では、最初に Pdxl/ β -gal陽性細胞は 12日目をピークに出現するが、その後減少す る。 M15支持細胞細胞上へ継代すると、 Pdxl/ β -gal陽性細胞が継代後 7-8日目に 再びピークに達した。 1回目の継代を黒丸、 2回目の継代は黒四角で示す。
[図 3]図 3は、 Pdxlプロモーター下に GFPを遺伝子導入した ES細胞（SK7細胞）を用い たリアルタイムでの Pdxl/EGFP陽性細胞への分化の評価を示す。 A：分化誘導法の 模式図を示す。 SK7を用いた分化誘導方法では EBを形成せずに M15上に播種する 。どちらの図も 500cells/well(24well)で播種後、培養 4日目までは 10%血清培地で培養 し、培養 4日目からは 10% KSR培地で培養した。分化誘導後 6 - 8日目の Pdxl/EGFP 陽性細胞の経時的出現を評価した。高密度 (5000cells/well)では 10%血清培地のみ で分化するが低密度（500cells/well)の場合では分化効率が悪ぐ 10%KSR培地に置 換すると 6日目力も Pdxl/EGFP陽性細胞が出現してくる。 8日目にはピークに達する。 Pdxl/EGFP陽性細胞への分化の評価は蛍光写真について、 Luminavisionソフトゥェ ァを用いて蛍光強度の総和により行った。 B： M15を用いて分化誘導した場合の Pdxl /EGFP陽性コロニーは広がった形態を示し、 Pdxl/EGFP陽性細胞がコロニーの辺縁 部に位置する。 Pdxl/EGFP陰性コロニーは丸いコロニーの形態を示す。分化誘導後 7日目の分化像を示す。 C : SK7細胞を用いた経時的な培養像と Pdxl/EGFP陽性脾 幹細胞の出現。分ィ匕誘導後 5日目までは丸いコロニーを示すが、分化誘導後 6日目 には、細胞の移動が急激に起こり、広がったコロニーの形態を示す。 Pdxl/EGFP陽 性細胞がコロニーの辺縁部に位置する。分化誘導後 9日目には Pdxl/EGFP陽性細 胞が減少する。
[図 4]図 4は、 RT-PCR解析の結果を示す。各種脾臓前駆細胞関連遺伝子、脾臓内 分泌細胞マーカー遺伝子、外分泌細胞マーカー遺伝子、分ィヒ β細胞マーカー遺伝 子、肝臓マーカー遺伝子の発現が認められた。 SK7ES細胞株は ICRマウスより榭立し たが、ほかの Rl, Jl ES細胞株についても同様な M15支持細胞による分ィ匕誘導の促 進が検出された。 M15支持細胞上で分ィ匕誘導した細胞では 8日目には pdxl遺伝子、 あるいはインスリン、脾ペプチド，ソマトスタチンなどの内分泌細胞のマーカー遺伝子 の発現が検出された。
[図 5]図 5は、免疫組織ィ匕学検査により SK7細胞由来の分ィ匕細胞における内胚葉関連 マーカーの発現を検出した結果を示す。 HNF3 β、アルブミン、 Nkx2.1、 Cdx2の発現 が認められた。
[図 6]図 6は、 ES細胞から内胚葉前駆細胞が誘導されていることを示す。 ES細胞から 分ィ匕した内胚葉前駆細胞の動態をさらに調べるために、マウス Hnf3 β遺伝子の内胚 葉特異的発現制御ェンハンサー領域を用いた。 Hnf3 β遺伝子の発現を mRFPl(mon omeric Red Fluorescent Protein 1)レポーター蛋白質で可視ィ匕できるように、 Pdxl/G FP, Hnf3 β /mRFPlダブルトランスジエニックマウスより ES細胞株を榭立した。榭立さ れた Pdxl/EGFP- Hnf3 β /mRFPl ES細胞株では、 Pdxl/EGFPの発現力 日目より発 現しているのに対して、 Hnf3 |8 /mRFPlの発現が 7日目より（1日早く）検出され、しか も Pdxl/EGFP発現細胞より広範囲の細胞において Hnf3 β /mRFPlの発現が誘導さ れている。トランスジニックマウスの解析により、 Hnf3 |8遺伝子は発生初期内胚葉の 領域化が決定される時期 (胎生 8.5日目ころ)の腸管上皮で前後軸に沿って発現して いること、 pdxl遺伝子に比べて、 1日ほど早く、より広範囲において発現していること が確認されているので、この HNF3 β陽性細胞が領域ィ匕される前のステージにある内 胚葉前駆細胞に相当すると示唆された。したがって、 M15支持細胞上での分化誘導 は正常発生過程を反映して 、るものと考えられる。
[図 7]図 7は、 M15による分ィ匕誘導の機序の一部はァクチビンを介していることを示す 。Α:Μ15による脾分ィ匕誘導機序を解明するためにスクリーニングで用いた培養細胞 について Aifymetrixの Gene Chipを用いて網羅的遺伝子発現解析を行い、生理活性 作用を示す遺伝子の発現を調べた。その結果、正常発生において脾分ィ匕誘導に関 与するァクチビンの阻害因子フオリスタチンが M15で極端に低いことが明らかになつ た。また、 M15細胞、 MEF, ST2細胞において、ある程度ァクチビンが発現されている 。 B :ァクチビンにより脾分ィ匕誘導が促進され、フオリスタチンによって分化誘導が阻 害された。ァクチビン、フオリスタチンは分化誘導後 3日目に添加した。 3日目までは F BS入り培地で培養し、 3-8日目までは KSRで置換した培地を用いた。 8日目の Pdxl/E GFP陽性脾幹細胞の出現を評価した。フオリスタチンの影響を評価するために分ィ匕 誘導時にフオリスタチンを添加すると、濃度依存的に脾分化誘導を阻害した。 (Cont 比較して有意 Student's t-test, * p〈0.05, n=3)。し力し、 M15による脾分化誘導効果 を 100%阻害することはできな力つた。また、ァクチビン（lOng/ml)により脾分化誘導 効果の促進が見られた力 過剰量のフオリスタチン添加によりその効果を阻害するこ とができた（ァクチビン 10ng/ml添加群と比較して student's t-testで有意、 * * p〈0. 01, n=3)。
[図 8]図 8は、培地中にノギンを加えることによる分化誘導に対する効果を調べた結 果を示す。初期の分ィ匕誘導では FBS入りの培地を用いるが、この中に含まれる阻害 因子が考えられた。様々な期間にノギンを加え、リアルタイムに現れる Pdxl/EGFP陽 性細胞を評価した。分化誘導の初期にノギンを加えることにより脾分化誘導が促進さ れた。ノギンを加えることによる促進効果のある日数は 2-4日目、あるいは最小日数と して 3-4日目に特定できた。
[図 9]図 9は、ノギンによる脾分化誘導の促進は血清中に含まれる BMP2を阻害するこ とによるものであることを示す。分化誘導 3-4日目にノギン 100ng/ml、あるいは所定濃 度の BMP2を添カ卩した。標記がある場合は 3-4日目の培地中の FBSを KSRに置換して いる。 6日目に Pdxl/EGFP陽性細胞を評価した。 FBS入り分ィ匕培地ではノギン添カロ により、非添加群と比較し、有意に差があった（Student's t-test, * * p〈0.01)。 KSR に置換した場合は脾分ィ匕誘導の促進が見られた (ノギン (-)と比較。 Student's t-test, * pく 0.05,)。この促進は BMP2の添カ卩により阻害された（KSR置換分ィ匕培地ノギン (-)と BMP添加群と比較 (* p〈0.05, * * p〈0.01)。 BMP2による阻害はノギン添カ卩で再び消 去された（* * , p〈0.01)。
[図 10]図 10は、ノギンとニコチンアミド、あるいはァクチビンとニコチンアミドは相乗的 に脾分化誘導を促進することを示す。ニコチンアミド単独では脾分化誘導を促進しな いが、ノギンあるいはァクチビンと併用することにより相乗的に脾分ィ匕誘導を促進した 。ノギン,ァクチビン，ニコチンアミドの 3つの併用により Pdxl/EGFP陽性細胞の出現が 早い時期にシフトし、分化誘導後 6日目にピークを示すようになった。 KSR置換分ィ匕 培地の対照群とそれぞれの日数で比較し Student's t-test, * * p〈0.01)
[図 11]図 11は、ァクチビンと bFGFの添カ卩による脾臓への分ィ匕誘導の促進を示す。図 11Aは、 10%FBS入りの分化培地中へのァクチビン、 bFGF、又はァクチビンと bFGFの 両方の添カ卩により、 Pdxl/EGFPの発現細胞の数が大きく増えることを 8日目の Pdxl/ EGFP像で示す。図 11Bは、図 11Aにおけるァクチビンと bFGFの両方をカ卩えている条 件で得た分ィヒ細胞について C ペプチドに対する抗体で染色した結果を示す。
[図 12]図 12は、 FACSを用いて、ァクチビンと bFGFの添カ卩による脾臓への分ィ匕誘導の 促進を定量的に評価でき、その程度が非常に大きいことを示す。また、 FACSを用い て、 M15支持細胞を分ィ匕 ES細胞力 選択的に除くことが出来ることを示す。図 12Aは 、内胚葉（胚性内胚葉； definitive endoderm)は E-cadherin,Cxcr4両陽性細胞とするこ とを示す。図 12Bは、細胞の内部構造の複雑さを反映する側方散乱光 (SSC)と細胞 の大きさを反映する前方散乱光 (FSC)を用いた分ィ匕した ES細胞の集団から、 M15細 胞を選択的に除く前後の、分化 ES細胞の FACS展開像を示す。
[図 13]図 13は、セルソーターを用 、た ES細胞由来の脾幹細胞の純化とその発現する 分子マーカーの解析を示す。 M15細胞上で SK7 ES細胞を 300,000cells/ 90mm dish で FBS入り培地で分化誘導し、 9日目に FACSを行った。分ィ匕誘導により GFP陽性細 胞の分画の細胞集団が増えた。分画 1 - 4の 4つを分取した。分画 4は GFP強陽性で あり、この分画に Pdxl遺伝子の発現細胞が濃縮されている。ほかにも NeuroD, Somat ostatin,インスリンを発現して!/、る。
[図 14]図 14は、分化誘導した Pdxl陽性脾前駆細胞の維持培養方法を示す。分化し た ES細胞を、 M15の下、ァクチビン及び bFGFの両方を添カ卩して、 MPCを被覆した低 細胞結合ディッシュに再度播種することで Pdxlの発現細胞を維持培養できる。
[図 15]図 15は、分化誘導した ES細胞をマウス成体腎臓皮膜下への移植を示す。図 14 の方法で ES細胞由来の Pdxl陽性膝前駆細胞をマウス成体腎臓皮膜下へ移植する。 図 15A及び Bは蛍光顕微鏡写真像を示し、 Pdxl/EGFP陽性細胞が保持されて 、る。 図 15Cは、移植片についての免疫組織ィ匕学的な解析によりインスリン、 Pdxl/EGFPダ ブル陽性細胞が存在して 、ることを示す。
[図 16]図 16は、力二クイザル ES細胞を用いた内胚葉前駆細胞および肝膝の細胞へ の分化誘導の結果を示す。図 Aでは、分化誘導 4日目には内胚葉前駆細胞と中胚葉 前駆細胞が多く分化誘導されている。分化後 4日目（A)と 8日目（B)の細胞について 、 HNF3 β (赤：内胚葉マーカー）、 Τ (緑：中胚葉マーカー）と DAPIによる核染を重ね た像。図 Βでは、分化誘導 8日目には内胚葉細胞が多く残っている。中胚葉前駆細胞 はもう検出できない。図 Cでは、分化誘導 10日目には脾臓前駆細胞の Pdxl陽性細胞 (赤色）と小腸前駆細胞の Cdx2陽性細胞 (緑色）が検出された。両者は異なる細胞集 団である。図 Dでは、分ィ匕誘導 10日目には肝臓前駆細胞のアルブミン陽性細胞 (赤 色）と αフエトプロテイン陽性細胞 (緑色）が検出された。それぞれ単独に発現する細 胞が多いが、共発現する細胞も観察された。図 Εでは、分化誘導 10日目には胆管細 胞の CK19陽性細胞 (赤色）と aフヱトプロテイン陽性細胞 (緑色）が検出された。それ ぞれ単独に発現する細胞が観察された。
[図 17]図 17は、ヒト ES細胞を用いた内胚葉臓器への分化誘導の結果を示す。図 Aで は分化誘導 12日目には内胚葉細胞の Hnf3 β陽性細胞 (赤色）と小腸前駆細胞の Cd x2陽性細胞 (緑色）が検出された。共発現する細胞が多いが、 Cdx2単独陽性細胞も 見られた。図 Bでは、分化誘導 12日目には肝臓前駆細胞のアルブミン陽性細胞 (赤 色）と αフエトプロテイン陽性細胞 (緑色）が検出された。図 Cでは、分化誘導 12日目 には胆管細胞の CK19陽性細胞 (緑色）と ocフ トプロテイン陽性細胞 (赤色）が検出 された。
圆 18]図 18は、 M15支持細胞上における無血清培地を用いた分ィ匕誘導による膝前 駆細胞の誘導の結果を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞を培養することを含む、 E S細胞から内 胚葉系細胞へと分化誘導する方法。
[2] 支持細胞が中胚葉に由来する細胞である、請求項 1に記載の方法。
[3] 支持細胞が M15細胞、 MEF細胞又は ST2細胞である、請求項 1又は 2に記載の方法
[4] ES細胞から、未分化な内胚葉の前駆細胞、内胚葉由来器官の未熟な細胞、又は内 胚葉由来器官の成熟細胞の何れかへと分化誘導する、請求項 1から 3の何れかに記 載の方法。
[5] 内胚葉由来器官が脾臓、肝臓、肺、咽頭、又は小腸である、請求項 4に記載の方法
[6] 支持細胞の存在下で ES細胞を培養する際にァクチンビン、塩基性線維芽細胞成長 増殖因子 (bFGF)、及び Z又はノギンを添加して培養する、請求項 1から 5の何れか に記載の方法。
[7] 支持細胞の存在下で ES細胞を培養する際にさらにニコチンアミドを添加して培養す る、請求項 6に記載の方法。
[8] 哺乳動物由来の ES細胞がマウス、サル又はヒト由来の ES細胞である、請求項 1から 7 の何れかに記載の方法。
[9] 請求項 1から 8の何れかに記載の方法により得られる、 ES細胞から分化誘導された内 胚葉系細胞。
[10] 請求項 1から 8の何れかに記載の方法により ES細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導 する工程、及び分化誘導された内胚葉系細胞を蛍光標識によるフローサイトメトリー ( FACS)によって分離する工程を含む、 ES細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を取 得する方法。
[II] 請求項 1から 8の何れかに記載の方法により得られる ES細胞から分化誘導された内 胚葉系細胞を、 2-メタクリルオイロキシェチルホスホリルコリンで被覆したプレート上 で培養することを含む、 ES細胞から分化誘導された内胚葉系細胞の維持培養方法。
[12] ノックアウト血清リプレースメン KKSR)の存在下で培養を行う、請求項 11に記載の方 法。
[13] 支持細胞の存在下で哺乳動物由来の ES細胞を培養することによって ES細胞から内 胚葉系細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下で ES細胞を培養し、被験物 質の非存在下で ES細胞を培養した場合における内胚葉系細胞へと分化誘導の程度 と被験物質の存在下で ES細胞を培養した場合における内胚葉系細胞へと分化誘導 の程度とを比較することを含む、 ES細胞から内胚葉系細胞へと分化誘導を促進又は 阻害する物質をスクリーニングする方法。
[14] 被験物質が成長因子又は低分子化合物である、請求項 13に記載のスクリーニング 方法。
[15] 内胚葉で発現するマーカーの発現量を指標として、内胚葉系細胞へと分化誘導の 程度を測定する、請求項 13又は 14に記載のスクリーニング方法。
[16] 哺乳動物由来の ES細胞がマウス、サル又はヒト由来の ES細胞である、請求項 13から 15の何れかに記載のスクリーニング方法。
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