WO2006118085A1 - 肝細胞複製促進剤およびインスリン抵抗性改善剤 - Google Patents

肝細胞複製促進剤およびインスリン抵抗性改善剤 Download PDF

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WO2006118085A1
WO2006118085A1 PCT/JP2006/308580 JP2006308580W WO2006118085A1 WO 2006118085 A1 WO2006118085 A1 WO 2006118085A1 JP 2006308580 W JP2006308580 W JP 2006308580W WO 2006118085 A1 WO2006118085 A1 WO 2006118085A1
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cxcl10
insulin resistance
hepatocytes
antibody
agent
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PCT/JP2006/308580
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Hiroyuki Yoneyama
Takafumi Ichida
Shosaku Narumi
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Stelic Institute Of Regenerative Medicine
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a drug that promotes replication of hepatocytes, and more specifically, a hepatocyte replication promoter that can contribute to regeneration or repair of hepatocytes in a damaged liver tissue.
  • the present invention relates to a method for promoting the proliferation of hepatocytes using the same.
  • the present invention also relates to a drug that improves insulin resistance. Specifically, in a patient exhibiting insulin resistance, an insulin resistance improving agent that can improve insulin resistance and contribute to normalization of glucose tolerance, and the like. This invention relates to a method for improving insulin resistance.
  • the liver is an important organ that performs amino acid metabolism, ammonia metabolism, and chemical detoxification, and functions mainly in hepatocytes. Therefore, liver dysfunction due to trauma, poisonous damage or disease may lead to life-threatening serious conditions for the living body. In particular, patients suffering from acute liver failure due to hepatocellular injury have a high mortality rate, and the survival rate is only 30% or less when only conservative treatment including plasma exchange is performed. To date, definitive conservative treatment is considered to be the only established treatment that improves liver survival. However, problems such as long-term use of immunosuppressants and risk of infection, high cost, lack of donors or unknown side effects have not been solved, and QoL (quality of life) is significantly reduced. Has drawbacks.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • hepatocytes at normal time are in a resting state, and the theory that the number of hepatocytes that synthesize DNA is several percent or less and the physiological turnover is several years is dominant. While In the case of harm, the turnover is accelerated, eg 70% hepatectomy has been shown to recover in a week.
  • sources are currently estimated as sources of newly created hepatocytes. Anatomically, mature hepatocytes in the sinusoidal region, small hepatocytes around the portal vein region Hering (a group considered to be liver tissue stem cells called opal cells), bile duct epithelial cells, and bone marrow-derived cells It is. Knowing the origins, contributions, and interactions of these cell populations is a fundamental research topic for controlling liver regeneration, but it has not been fully elucidated.
  • Chemokine has an effect of activating leukocyte migration 'produced in vivo. Is a general term for basic, heparin-binding proteins. There are four cysteine residues in the site conserved in the primary structure, and they are classified into four subfamilies, CXC, CC, C, and CX3C, depending on the location of the first two cysteine residues. There are 19 types of receptors, CXCR1_6, CCR1-10, CR1-2, and CX3CR1. Each receptor is specifically expressed on a specific cell, and migration and fixation of immunocompetent cells to a specific location is controlled by chemokines and chemokine receptors.
  • the chemokine receptor CXCR3 and its ligand CXCL10 are molecules involved in the migration of activated T cells, especially T helper-1 cells (Thl cells). It is becoming clear that it plays a role in so-called Thl-dominated diseases such as reactions and autoimmune diseases (Non-patent document 6, Non-patent document 7, Non-patent document 8, Non-patent document 9, Non-patent document 10). ). It has been reported that mRNA expression of CXCL10 is enhanced in various Thl-dominant diseases including viral hepatitis. However, since inhibition experiments with CXCL10 neutralizers etc. have not been carried out so far due to actual liver damage, the significance of its expression may be favorable to the living body or vice versa. Still unknown. Furthermore, it is almost assumed that there will be no experimental evidence as to whether or not it will have any effect on not only Thl cells but also liver cells themselves.
  • diabetes is a disease caused by a relative deficiency of insulin, which is a hypoglycemic hormone, and is insulin-dependent type 1 (IDDM) and insulin-independent. It can be divided into type 2 (NIDDM).
  • IDDM insulin-dependent type 1
  • NIDDM insulin-independent type 2
  • IDDM type 1 diabetes mellitus
  • IDDM type 2 diabetes mellitus
  • NIDDM non-insulin-dependent diabetes that develops when genetic factors are added to environmental factors such as obesity and lack of exercise.
  • non-insulin dependent diabetes mellitus type 2 NIDDM
  • the westernization of meals, lack of exercise, and changes in lifestyles, and an aging society are expected to accelerate the increase in diabetes and continue to increase.
  • Treatment is based on diet therapy and exercise therapy, and nateglinide, a darcosidase inhibitor, sulfonylurea (SU), biguanide (BG), which is a drug targeted at insulin-related enzymes and insulin receptors.
  • BG biguanide
  • oral antidiabetic drugs such as thiazolidine drugs are used in clinical settings.
  • Non-Patent Documents 11 and 12, 13 and 14, and 15 lifestyle-related diseases such as type 2 diabetes are being collectively referred to as metabolic syndrome. Although it is a disease located in an area where research has finally become active as “21st century disease”, the fact that there are many potential patients has been pointed out, and its treatment and symptom improvement The need to provide means early is emphasized.
  • the liver is an important organ that controls the uptake of glucose from the blood and the release of glucose into the blood, that is, the blood glucose level. Insulin acts on the insulin receptor expressed in hepatocytes, thereby converting glucose into glycogen (stimulating glycogen synthesis) and storing it in the liver, thereby suppressing the release of glucose into the blood (gluconeogenesis). This captures glucose in the blood (Non-patent Document 16). Therefore, a decrease in liver response to insulin is a very important cause of insulin resistance (Non-patent Documents 17 and 18).
  • Non-Patent Document 1 Latest Review; Fausti N. Hepatology 39: 1477, 2004
  • Non-Patent Document 2 Taub R. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 836
  • Non-Patent Document 3 Zajicek G. Am. J. Pathol. 146: 772, 1995
  • Non-Patent Document 4 Latest Review; Taub R. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 836, 2004
  • Non-patent literature 5 Review article; Simpson KJ, et al.. Clin. Sci. 104: 47, 2003
  • Non-patent literature 6 Khan IA et al. Immunity 12: 483, 2000
  • Non-patent document 7 Liu MT et Al. J. Immunol. 166: 1750, 2001
  • Non-patent document 8 Hancock WW et al. J. Exp. Med. 192: 1515, 2000
  • Non-patent document 9 Hancock WW et al J. Exp. Med. 193: 975, 2001
  • Non-patent literature 10 Narumi S et al. Eur. J. Immunol. 32: 1784, 2002
  • Non-patent literature ll Fujita, T et al. Biochemical Pharmacology (1996) 52 407-411
  • Non-Patent Document 12 Tsukuda, K et al. Horm Metab Res (1998) 30 42— 4 9
  • Non-patent literature 13 Fujitani, S et al. Metabolism (1996) 45 184—189
  • Non-patent literature 14 Spiegelman et al. J Clin Invest (1997) 100 1863— 1869
  • Non-patent literature 15 ⁇ lefsky et al. Diabetes ( 1997) 46 1678— 1683
  • Non-Patent Document 16 Sherrington AD. Diabetes 48: 1198— 1214, 1999.
  • Non-Patent Document 17 DeFronzo RA. Diabetes rev 5: 177-269, 1997.
  • Non-Patent Document 18 Michael MD et al. Mol. Cell 6: 87-97, 2000, Disclosure of the Invention
  • an object of the present invention is to provide a drug for proliferating hepatocytes and a method for proliferating hepatocytes using the same.
  • the present invention also provides a drug for improving insulin resistance of hepatocytes and a method for improving insulin resistance using the same, which are useful for metabolic syndrome, which can replace conventional diabetes drugs. Is also an issue. Means for solving the problem
  • CXCL10 is one of the ligands for the chemokine receptor CXCR3 and one of the proteins classified into the chemokine subfamily CXC. Has been found to be greatly involved in the regeneration of hepatocytes. Further research was conducted on CXCL10, and CXCL10 was found to suppress hepatocyte replication, and the idea that CXCL10 could promote hepatocyte replication by suppressing the function of CXCL10. Then, the present inventors have obtained a demonstration that a neutralizing agent that suppresses the function of CXCL10 actually promotes replication of hepatocytes, and has completed the present invention.
  • the present invention provides the following hepatocyte replication promoter, method for promoting hepatocyte proliferation, and the like as embodied embodiments.
  • a neutralizing agent for CXCL10 not only promotes hepatocyte replication, but also has a mechanism of action that is presumed to be common. It was also demonstrated that the responsiveness / sensitivity of cells to insulin significantly increased and glucose intolerance improved significantly. From this finding, it was found that a neutralizing agent for CXCL10 is also useful as an insulin resistance ameliorating agent based on a completely new mechanism of acting on hepatocytes to enhance the reactivity to insulin and the like, thereby completing the present invention. It came to.
  • the present invention also provides the following insulin resistance improving agent and method for improving insulin resistance as embodied embodiments.
  • a hepatocyte replication promoter comprising a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines, as an active ingredient. More specifically, a hepatocyte replication promoter comprising a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for promoting the proliferation of hepatocytes comprising a step of administering an effective amount of a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines, to hepatocytes.
  • the damage is caused by toxic substances, mechanical injuries and pathogens.
  • An insulin resistance improving agent comprising a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines, as an active ingredient. More specifically, an insulin resistance ameliorating agent comprising a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for improving insulin resistance comprising a step of administering to hepatocytes an effective amount of a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines.
  • Neutralizing power against CXCL10 A factor that suppresses the expression of chemokine CXCL10
  • CXCL10 is also known to be strongly expressed in the liver during inflammation. However, it is not known at all that the neutralizing agent of CXCL10 administered from outside the body directly contributes to the replication of mature liver cells. It was discovered for the first time.
  • the present invention can also serve as a basis for treatment for patients exhibiting insulin resistance, such as patients with type 2 diabetes (NIDDM), patients with metabolic syndrome, and the like.
  • NIDDM type 2 diabetes
  • liver tissue cells can be promoted. Therefore, according to the present invention, damaged liver tissue can be regenerated.
  • the insulin resistance can be improved according to the present invention, it is useful in the treatment of diseases that exhibit insulin resistance, such as type 2 diabetes and metabolic syndrome.
  • FIG. 1 is a graph showing the transition of CXCL10 mRNA expression in CCL4-induced liver injury.
  • FIG. 2 is a view showing an immunostained image of CCL4-induced liver injury.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in liver weight in CCL4-induced liver injury.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in serum ALT in CCL4-induced liver injury.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in necrotic area in CCL4-induced liver injury.
  • FIG. 6 is a diagram showing a CD31 positive staining image in the sinusoidal region of CCL4-induced liver injury (3 days after CCL4 administration).
  • FIG. 7 shows quantitative data of BrdU positive proliferating hepatocytes in the sinusoidal region of CCL4-induced liver injury (3 days after CCL4 administration).
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of anti-CXCL 10 antibody on CCL4-induced liver injury in liver tissue stem cells.
  • the upper row shows the test results of the 8th week after birth (8w), the middle row shows the control on the third day (d3) after CCL4 administration, and the lower row shows the anti-CXCL10 antibody administration test on the third day (d3) after CCL4 administration.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of anti-CXCL10 antibody administration in normal mice.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of CXCL10 recombinant protein in normal mice.
  • FIG. 11 is a diagram showing an electrophoretic image for detecting the expression of a receptor for CXCL10 in human hepatocyte cell line HepG2.
  • FIG. 12 shows the effect of anti-CXCL10 antibody on HepG2 proliferation.
  • FIG. 13 is a graph showing improvement of glucose tolerance abnormality by anti-CXCL10 antibody.
  • FIG. 14 is a graph showing improvement of insulin resistance by anti-CXCL10 antibody. Explanation of symbols
  • CD31 CD31 positive site
  • the hepatocyte replication promoter of the present invention comprises a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines, as an active ingredient.
  • the hepatocyte replication promoter of the present invention may be a preparation containing a neutralizing agent for CXC L10 and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the method for promoting the proliferation of hepatocytes of the present invention comprises a step of administering to hepatocytes an effective amount of a neutralizing agent for CXCL10, which is one of chemokines.
  • a preferred embodiment of the present invention is exemplified by the ability to promote replication of hepatocytes in damaged liver tissue.
  • the hepatocyte replication promoter of the present invention is useful in situations where hepatocytes are intended to proliferate regardless of the cause of damage.
  • the hepatocyte promoter of the present invention is suitably applied to liver tissue having damage caused by toxic substances, damage caused by mechanical injury, damage caused by pathogens, and the like.
  • damage caused by toxic substances include damage caused by diseases such as alcoholic hepatitis and drug-induced liver damage.
  • pathogens include hepatitis virus.
  • Examples of the damage caused by mechanical injury include damage caused by, for example, liver transplantation, cell transplantation, and surgical partial hepatectomy.
  • the hepatocyte replication promoter of the present invention is applicable to steatohepatitis.
  • alcohol-independent hepatitis is one of the lifestyle-related diseases that are associated with metabolic syndrome.
  • the present invention is also useful for the treatment of alcohol-independent hepatitis. .
  • a neutralizing agent for CXCL10 is used in a subject who has or is likely to develop loss of dysfunction and dysfunction of mature hepatocytes associated with liver tissue damage.
  • Administration of a therapeutically effective amount of can reduce or recover serious tissue dysfunction in a subject.
  • the present invention is clinically useful for regeneration and repair of liver tissue having, for example, acute liver failure, chronic liver failure, or liver damage caused by a neurological disease.
  • Subjects can be mammals including humans.
  • neutralizing agent for CXCL10 refers to a drug having an action of suppressing the activity of the physiological function of CXCL10.
  • the physiological function of CXCL10 means the function exerted by CXCL 10, such as CXCL10 is a receptor, specifically an example For example, the function that is exhibited by binding to CXR3.
  • the neutralizing agent in the present invention is a factor that suppresses the activity of CXCL10 and promotes at least replication of mature hepatocytes. Examples of the neutralizing agent include a factor that specifically binds to CXCL10 and suppresses the activity of CXCL10, and a factor that suppresses the expression of CXCL10.
  • the neutralizing agent can be any molecule that binds to CXC L10 with sufficient affinity to reduce CXCL10 activity.
  • the neutralizing agent is preferably a binding molecule such as an antibody against CXCL10 (anti-CXCL10 antibody).
  • Further examples include CXCR3 receptor fragments or peptidomimetics that bind CXCL10 with sufficient affinity to reduce CXCL10 activity.
  • an enzyme that specifically degrades CXCL10 is also exemplified.
  • a neutralizing agent for CXCL10 a substance that inhibits the activity of CXCL10 by acting on a substance other than CXCL10 as well as a substance that directly acts on CXCL10 to suppress the activity can also be mentioned.
  • CXCL10 An example of such a neutralizing agent is a receptor antagonist (antagonist) for CXCL10.
  • receptor antagonist antagonist for CXCL10
  • Examples of the receptor for CXCL10 include receptors present in hepatocytes.
  • CXCR3 such as C XCR3 A and CXCR3—B can be mentioned.
  • the anti-CXCL10 antibody can be prepared as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Methods for raising polyclonal antibodies in, for example, rabbits, goats, mice or other mammals are well known in the art.
  • Production of anti-peptide antibodies usually involves the use of a host animal such as a rabbit, mouse, guinea pig or rat. If a large amount of serum is required, larger animals such as Hedge, Goat, Horse, Pig or Donkey can be used. Animals are usually selected based on the amount of antiserum required. Suitable animals include rabbits, mice, rats, guinea pigs, and hamsters. The amount of serum obtained from these animals is usually up to 25 mL for rabbits, 100-200 for mice, and 2 to 2 mL for other animals per collection.
  • monoclonal antibodies may be obtained using methods that are well known and routine in the art.
  • the peptide portion of a protein (eg, CXCL10) for use as an immunogen can be determined by methods well known in the art.
  • Spleen cells from mice immunized with CXCL10 can be fused with an appropriate myeloma cell line to produce hyperidoma cells.
  • Cloned hyperidoma cell lines can be screened with labeled CXCL10 protein to identify clones that secrete anti-CXCL10 antibodies.
  • Hybridomas expressing anti-CXCL10 monoclonal antibodies with the desired specificity and affinity can be isolated and utilized as a sustained source of antibody neutralizing agents.
  • Recombinant antibodies such as chimeric and human rabbit antibodies
  • Human rabbit antibodies can be constructed by conferring essentially any antigen binding specificity to the human antibody framework.
  • Methods for constructing humanized antibodies include suitable antibody neutralizing agents for carrying out the methods of the invention and for avoiding host immune responses against antibody neutralizing agents when used therapeutically. Useful for preparation.
  • the neutralizing agent inhibits or promotes the function of the regulatory protein or gene region of CXCL10 and provides a regulatory molecule or gene region that reduces the extent, amount or rate of CXCL10 expression, or its activity.
  • examples of neutralizing agents that reduce C XCL10 expression include antisense nucleic acids, transcription inhibitors, and the like.
  • One embodiment of the present invention includes a polynucleotide encoding CXCL10, a regulatory molecule that regulates the expression or activity of CXCL 10, or any fragment thereof, or as an antisense molecular force neutralizing agent.
  • a polynucleotide encoding CXCL10 a regulatory molecule that regulates the expression or activity of CXCL 10, or any fragment thereof, or as an antisense molecular force neutralizing agent.
  • an antisense molecule against CXCL10 encoding nucleic acid can be used to block transcription or translation of the mRNA.
  • cells can be transformed with a sequence complementary to a nucleic acid encoding CXCL10.
  • sense or antisense oligonucleotides or larger fragments can be designed from various positions in the coding or control region of the sequence encoding CXCL10. .
  • the antisense molecules thus obtained can be used to achieve regulation of gene function or genes that can neutralize CXCL10 activity.
  • a ribozyme specific for CXCL 10 or an RNAi active molecule (siRNA) may be used as a neutralizing agent.
  • the method for promoting the proliferation of hepatocytes of the present invention can be applied in any scene where hepatocytes are allowed to proliferate regardless of the purpose such as therapeutic purpose or academic purpose.
  • neutralizing agents useful for performing the methods of the invention include the severity of the hepatocellular injury being treated; the rate or amount of injury; the weight, sex, age and health status of the subject; Can be formulated and administered by those skilled in the art in an appropriate manner and amount in a manner compatible with the combined treatment regimen; and biochemical properties, biological activity, viability and side effects of the compounds. Appropriate amounts and formulations can be extrapolated from reliable animal models for specific disorders known in the art.
  • the neutralizing agent showing significantly higher binding affinity can be administered at a lower dose relative to CXCL10.
  • the dosage of the neutralizing agent must be adjusted based on the binding affinity of the neutralizing agent for CXCL10.
  • suitable dosages for therapeutic treatment can be determined as appropriate within the range of about 10 xg and about 1 mg / kg body weight per day.
  • the dosage is generally 0.1 ⁇ g / ml, preferably 1. O zg / ml, more preferably about 2 zg / ml.
  • the neutralizing agent which is an active ingredient of the hepatocyte replication promoter of the present invention, has many known in the art.
  • the subject can be administered by route (eg, systemic administration (eg, intravenous administration)).
  • the neutralizing agent for CXC L10 is in the form of isolated and substantially purified polypeptides and polypeptide fragments in pharmaceutically acceptable formulations using formulation methods known to those skilled in the art. Can be provided. These formulations include standard routes (local, transdermal, intraperitoneal, oral, rectal, or parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, or intrahepatic routes)) Can be administered.
  • Intravenous administration of a neutralizing agent for CXCL10 is a particularly suitable route for carrying out the method of the present invention.
  • the intrahepatic route can be performed to target delivery of the neutralizing agent to the site of injury or trauma.
  • a modified neutralizing agent for CXCL10 can be incorporated into a biodegradable polymer, which allows the sustained release of compounds useful for reducing liver damage.
  • an appropriate dosage form can be selected based on the conditions such as the administration route and administration method as described above.
  • the neutralizing agent for CXCL10 can be administered as a solution or suspension together with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable media include, for example, sterile aqueous media (e.g., sodium phosphate buffer, phosphate buffered saline, normal saline or Ringer's solution, or other physiological Buffered saline) or other solvent or vehicle (eg, glycol, glycerol, oil (eg, olive oil) or injectable organic ester).
  • the pharmaceutically acceptable vehicle further includes a physiologically acceptable compound (eg, a compound that stabilizes the neutralizing agent, a compound that increases its solubility, or a compound that increases its absorbency). obtain.
  • physiologically acceptable compounds include, for example, carbohydrates (eg, glucose, sucrose, or dextran); antioxidants (eg, ascorbic acid or gnolethione); chelating agents (eg, EDTA) (this Disrupts microbial membranes); divalent metal ions (eg, calcium or magnesium); low molecular weight proteins; lipids or ribosomes; or other stabilizers or excipients.
  • carbohydrates eg, glucose, sucrose, or dextran
  • antioxidants eg, ascorbic acid or gnolethione
  • chelating agents eg, EDTA
  • Suitable formulations for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injection solutions (eg, , A pharmaceutically acceptable medium as described above).
  • the solution may further include, for example, buffering agents, bacteriostatic agents, and solutes that render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient.
  • Other formulations include, for example, aqueous and non-aqueous sterile suspensions that may include suspending agents and thickening agents.
  • the formulation can be presented in unit dose containers or multi-dose containers (eg, sealed ampoules and sealed vials) and stored in a lyophilized condition requiring the addition of, for example, a sterile liquid carrier immediately before use.
  • Extemporaneous injection solutions and immediate injection suspensions can be prepared from sterile powders, granules, and tablets of the kind previously described.
  • a treatment system comprising a neutralizing agent for CXCL10 and instructions for use in a method for reducing the severity of hepatocellular injury, preferably a kit Present in form.
  • the therapeutic simultaneous IJ is an anti-CXCL10 antibody.
  • a suitable kit includes at least one CXCL10 neutralizing agent (neutralizing agent for CXCL10) as a separate packaged chemical reagent in an amount sufficient for at least one therapeutic application. Instructions for use of the packaged kit may also be included.
  • CXCL10 neutralizing agent neutralizing agent for CXCL10
  • One skilled in the art can readily incorporate the CXCL10 medium in combination with appropriate buffers and solutions for carrying out the methods of the invention as described herein in the form of a kit.
  • the present inventors have the effect that the neutralizing agent for CXCL10 has the effect of promoting the replication of hepatocytes and at the same time increasing the reactivity 'sensitivity to insulin and improving glucose tolerance. And has been found to be useful as an active ingredient of an insulin resistance improving agent.
  • the present invention also provides an insulin resistance improving agent containing a neutralizing agent for CXCL10 as an active ingredient.
  • improving the resistance of insulin means enhancing the reactivity and sensitivity of the liver, specifically, hepatocytes to insulin.
  • the reactivity and sensitivity of hepatocytes to insulin may be the same as or close to those of a normal individual.
  • the mechanism of action of the neutralizing agent for CXCL10 to improve insulin resistance is presumed to proceed through the following pathway. First, when a neutralizing agent for CXCL10, such as anti-CXCL10 antibody, is administered, at least liver When cells (mainly mature hepatocytes) are inhibited from binding to CXCL10 receptors, ⁇ -catenin, a hepatocyte membrane protein, moves in the cell toward the nucleus.
  • the expression of the protein c_Myc is activated, resulting in an increase in the amount of insulin bound to the insulin receptor of hepatocytes. That is, the response of the liver to insulin is improved, and improvement of liver glucose metabolism is promoted.
  • the action mechanism for promoting replication of hepatocytes is also an action on the hepatocytes of the neutralizing agent for CXCL10, the action mechanism and all or at least a part of the above-described action for improving insulin resistance (for example, ⁇ The part up to the control of the catenin signal is assumed to be common.
  • the insulin resistance-improving agent of the present invention improves insulin resistance as a result of the neutralizing agent for CXCL10 acting on hepatocytes as described above. Therefore, since it is the same as the above-mentioned hepatocyte replication promoter in terms of targeting hepatocytes, the amount of neutralizing agent used for CXCL10, administration conditions, etc. are the same as in the above-described hepatocyte replication promoter. It can be.
  • insulin resistance is improved in hepatocytes having insulin resistance, for example, hepatocytes derived from mammals including humans. Examples of such hepatocytes include those obtained by extracting, purifying and culturing individual strength exhibiting insulin resistance.
  • insulin resistance in a subject is improved by administering to a subject exhibiting insulin resistance a therapeutically effective amount of a neutralizing agent for CXCL10. Can be mentioned.
  • the present invention is clinically useful for improving impaired glucose tolerance in patients exhibiting insulin resistance, for example, insulin resistance such as type 2 diabetes (NIDDNI) and metabolic syndrome.
  • Example 1 Enhanced expression of CXCL10 in injured hepatocytes using a tetra-salt carbon-induced liver injury model
  • CXCL10 was evaluated using a carbon tetrachloride-induced liver injury model.
  • the carbon tetrachloride-induced liver injury model was constructed according to the description of Morrison GR. Arch. Biochem. Biophys. 111: 448, 1965. Since this liver injury model has no infiltration of Thl cells, it has the advantage that the influence of CXCL10 on Thl cells can be ignored, and the replication and regeneration of hepatocytes in vivo can be evaluated purely.
  • the base sequence of CXCL10 has already been registered in databases such as DDBJ (DNA Data Bank of Japan).
  • CXCL10 protein and anti-CXCL10 antibody are also available as commercial products.
  • C57BL6 / J mice female, 8-9 weeks old, manufactured by CLEA Japan
  • CCL4 carbon tetrachloride
  • mice 5 i L / g body weight (Sigma-Aldrich) was injected intraperitoneally. Before CCL4 administration, and 1, 6, 12 hours after administration, 1, 2, 3, 5, 7, and 10 days later, mice were sacrificed and livers were collected. A portion of the first leaf of the liver was immediately frozen in liquid nitrogen, and total RNA was extracted using RNAzol reagent (BIOT ECX LAB) and reverse-transcribed to cDNA.
  • RNAzol reagent BIOT ECX LAB
  • the expression of CXCL10 is ABI7700 sequence detector system (manufactured by PE Applied Biosystems), 95 ° C15, 55. The analysis was carried out by the ryanore time quantitative PCR method with 30 cycles of C1 min and 40 cycles of width.
  • a part of the second lobe of the liver was embedded in an OCT compound (manufactured by Miles), and a frozen block was prepared with liquid nitrogen. Sections with cryostat (HMicrom) were prepared, anti-CXCL10 antibody (goat polyclonal antibody; 20 zg / mL; Santa Cruz), anti-CX CR3 antibody (goat polyclonal antibody; 20 ⁇ g / mL; Santa) Cruz) at room temperature Reacted for 1 hour.
  • HMicrom cryostat
  • FIG. 1 shows the results of quantitative PCR (change in enhancement magnification over time).
  • FIG. 2 shows an immunostained image (200 ⁇ ).
  • the left shows the stained image of the tissue before CCL4 administration
  • the right shows the stained image of the tissue after CCL administration (1 day later).
  • P indicates the portal vein.
  • F indicates the stained site.
  • CXCL10 protein could be detected in hepatocytes constitutively by immunostaining, but CXCL10-positive moon-dried cells increased markedly after 6 hours of CCL4 administration, and the number was 1 day later. Reached the peak.
  • a dramatic increase in the expression of CXCL10 in liver damage was confirmed at the mRNA and protein levels, and it was also shown that its localization was injured hepatocytes.
  • CXCL10 expression enhancing ability To analyze whether it is beneficial or harmful to the living body, just before administering CCL4 to C57BL6 / J mice (8 weeks old, female, CLEA Japan), 100 ⁇ g A single tail vein injection of monoclonal CXCL10 antibody (suspended in 200 ⁇ L sterile PBS) was given. The monoclonal antibodies used in these studies are specific for CXCL10 and do not cross immunologically with CXCL9 and CXCL11, which are other ligands for its receptor CXCR3. As neutralizing activity, chemotaxis of CXCR3-positive activated T lymphocytes is suppressed. The mice were sacrificed over time, and clinical findings were compared with the control antibody-treated group.
  • the monoclonal antibody was prepared using a method that is well-known and conventional in the art.
  • the peptide portion of the CXCL10 protein for use as an immunogen was determined by methods well known in the art to produce CXCL10 recombinant proteins (such recombinant proteins are readily available from R & D, etc.).
  • CXCL10 Spleen cells derived from immunized mice were fused with a myeloma cell line to produce hyperidoma cells.
  • a mouse CXCR3 (receptor for CXCL10) was transferred to the CH1 K1 cell line by a method well known in the art to produce a CHO-K1 cell line that constantly expresses CXCR3.
  • mouse recombinant protein was added to this cell line and the effect was confirmed by the calcium influx assay, it was confirmed that the calcium reaction was inhibited by adding monoclonal CXCL10 antibody.
  • immunoprecipitation tests confirmed that the monoclonal CXCL10 antibody did not cross with other CXCR3 ligands CXCL9 and CXCL10.
  • control antibody a monoclonal antibody against human parathyroid-related peptide (parathyroid gland) matched with IgGl subclass of CXCL10 monoclonal antibody was used. This antibody can be easily obtained from several companies such as Santa Cruz and Chemicon. The monoclonal antibody was used in the same manner for the control antibody (control antibody) in the following Examples.
  • Figure 3 shows the transition of mouse liver weight (liver tissue weight).
  • “*” indicates p by t-test.
  • ⁇ 0. 05 indicates significant difference.
  • liver weight decreased rapidly until 1 day after CCL4 administration, and gradually recovered after 3 days.
  • the liver weight decreased 1 day after CCL4 administration, but recovered rapidly compared to the control antibody-treated group. This indicates that anti-CXCL10 antibody treatment promotes more rapid regeneration after liver injury.
  • FIG. 4 shows the transition of ALT (alanine transferase) concentration (IU / L) in mouse serum.
  • ALT alanine transferase
  • FIG. 4 indicates that a significant difference of p ⁇ 0.05 was observed by t-test.
  • Serum ALT is the most reliable index for clinical evaluation of the degree of hepatocellular injury and was measured with Fuji Dry Chem-Slide (manufactured by Fuji Medical System).
  • Fuji Dry Chem-Slide manufactured by Fuji Medical System
  • the control antibody treatment group After the administration of CCL4, it rose dramatically, showed a peak on the first day, gradually decreased from the third day, and recovered to the normal range on the seventh day.
  • the anti-CXCL10 antibody-treated group the increase in serum ALT level was significantly suppressed and recovered to the normal range on the fifth day. It was found that hepatocyte damage was dramatically suppressed by anti-CXCL10 antibody treatment.
  • mice Immediately prior to CCL4 administration to C57BL6 / J mice (8 weeks old, female, CLEA Japan), 100 ⁇ g monoclonal CXCL10 antibody (suspended in 200 ⁇ L sterile PBS) or control antibody tail A single intravenous injection was given. The mice were sacrificed over time, and histopathological findings were compared with the control antibody-treated group. A frozen section of the liver was prepared by the method described in Example 1 and subjected to immunohistological analysis.
  • rat anti-mouse CD31 monoclonal antibody (2 ⁇ g / mL; manufactured by PharMingen) or rabbit anti-mouse type IV collagen 'polyclonal antibody (Sigma; diluted 1: 250) was reacted at room temperature for 1 hour. I let you. Then alkaline phosphatase labeled anti-rat or rabbit IgG Jackson
  • FIG. 1 Transition of the necrotic area of the liver tissue is shown in FIG.
  • Substantial hepatocytes can be identified by type IV collagen staining.
  • the area of the cell necrosis was determined by clarifying the construction of the hepatic cell cord by staining with type IV collagen, and the area of the area was calculated using the Winnoref image software. Measurements were made over a range of at least 15 mm 2 on liver sections. In the control antibody-treated group, multiple extensive hepatocellular necrosis centered on the central venous region was observed 3 days after CCL4 administration, whereas in the anti-CXCL10 antibody-treated group, the necrotic range decreased dramatically. It was.
  • the CD31 antibody is a monoclonal antibody that reacts with vascular endothelial cells and is used to detect sinusoidal endothelial cells in the liver.
  • Fig. 6 shows an immunostained image of CD31 on day 3 of CCL4 administration (20x magnification).
  • the sinusoidal wall structure collapsed due to necrosis, as shown in the area surrounded by the dotted line, whereas the anti-CXC L10 antibody treatment group (figure 6).
  • Figure 6 shows the construction of the sinusoidal wall.
  • BrdU is a thymidine analog that is incorporated into DNA during the S phase of the cell cycle.
  • mice treated with CXCL10 antibody or control antibody after induction of liver injury by CCL as in Examples 2 and 3 were treated with Brd U (Sigma; 500 ⁇ g in 100 ⁇ L sterilized).
  • Example 3 (Suspended in PBS) was injected into the tail vein, and sacrificed 1 hour later, the second lobe of the liver was collected, and a frozen section was prepared by the method of Example 1. After visualizing the type IV collagen by the method of Example 3, immunostaining using an anti-BrdU antibody (BrdU staining kit; manufactured by Zymed) was added to specifically detect the S phase nucleus. Tissue quantification was also performed as described in Example 3.
  • BrdU-positive hepatocytes were markedly increased in the anti-CXCL10 antibody-treated group.
  • Quantitative analysis of the sinusoidal area revealed that in the anti-CXCL10 antibody-treated group, BrdU-positive hepatocytes increased from day 1 to day 3 of CCL4 administration, and on the contrary, from day 7 to day 10, BrdU The number of positive hepatocytes was decreasing.
  • This result indicates that the anti-CXCL10 antibody rapidly proliferates hepatocytes, and also mature hepatocytes in the sinusoidal region, and quickly returns to the resting state after the hepatocyte cord is reconstructed. In other words, it was demonstrated at the in vivo level that anti-CXCL10 antibody promotes liver regeneration after injury.
  • Newborn mice were treated with BrdU (50 xg 10 for 3 days from 3 to 5 days after birth. Suspension in ⁇ L of sterile PBS) is injected subcutaneously twice a day, and after 8 weeks, hepatocytes with a slow cell cycle, in which BrdU label remains for a long time, are detected.
  • BrdU-labeled cells are called Label retaining cells (LRCs), and are known to be in a resting state in 8-week-old mice and have properties as tissue stem cells (reviews; Fuchs E, et al. Cell 116: 769, 2004).
  • LRCs are rarely found in the portal vein region (approximately 7% of all hepatocytes) in the moon's psoriasis, and are considered to be liver tissue stem cells different from mature hepatocytes.
  • CCL4-induced liver injury was induced after administration of anti-CXCL10 antibody or control antibody in the same manner as in Example 2 to Example 4, and sacrificed on the third day. The second leaf was collected and a frozen section was prepared.
  • the upper row shows the results before administration
  • the middle row shows the results of the control antibody treatment group
  • the lower row shows the results of the anti-CXCL10 antibody treatment group.
  • the labeling index (Labeling Index)% indicates the area ratio of each labeled site to 100% of all hepatocytes displayed in the image.
  • LRC-derived proliferating cells were 34.5% (22.3% of all hepatocytes), and proliferating cells thought to be derived from mature hepatocytes (cyclin A positive BrdU negative) were 65. 5% (42.3% of all hepatocytes), and indeed dinuclear mature hepatocytes immediately after division are also observed.
  • hepatocyte regeneration after liver injury involves not only liver tissue hepatic stem cells (LRC) but also rapid division and replication of mature hepatocytes.
  • LRC liver tissue hepatic stem cells
  • FIG. 9 The results are shown in FIG.
  • “*” indicates that a significant difference of 0.05 was found by t-test.
  • the vertical axis indicates the number of immunostained sites per unit area.
  • CXCL10 protein suppresses proliferation and replication of hepatocytes.
  • BrdU 50 ⁇ g suspended in sterile PBS in 10 ⁇ L
  • the second lobe of the liver was collected, and frozen sections were prepared, followed by immunostaining.
  • the recombinant protein of CXCL 10 (2 mgZkg; manufactured by R & D system) or PBS was injected subcutaneously from day 3 to day 4 after birth.
  • FIG. 10 The quantitative data is shown in FIG.
  • "*" indicates that a significant difference of p ⁇ 0.05 was found by t-test.
  • B was administered on the third day (d7).
  • rdU-labeled hepatocytes remained significantly. Usually, BrdU labeling decays rapidly with postnatal hepatocyte fragmentation. Therefore, administration of CXCL10 suppressed postpartum hepatocyte division, and as a result, it is assumed that BrdU-labeled hepatocytes remained significantly. This result indicates that CXCL10 actually suppresses hepatocyte division at the biological level.
  • RNA of the hepatocyte cell line was extracted by the method of Example 1, and the expression of human CXCL10 receptors CXC R3-A and CXCR3-B was determined by RT-PCR (94 ° C 45 seconds, 58 ° C 45 seconds, 30 cycles at 72 ° C for 60 seconds).
  • CXCR3-A was strongly expressed, but CXCR3-B was not expressed (FIG. 11).
  • CXCL10 shows that it performs its function via CXCR3_A.
  • FIG. 12 shows the measurement results of absorbance.
  • the absorbance is shown as the average soil SD.
  • "*" Indicates that a significant difference of 0.05 was found by t-test.
  • Anti-CXCL10 antibody concentrations administered in mice was significantly promote the proliferation of human liver cell lines the He P G2. These results indicate that high concentrations of CXCL10 directly regulate the division and proliferation of human liver cells even in vitro.
  • C57BL6jZjcL mice (manufactured by CLEA Japan, Inc.) on the 14th day of pregnancy were raised and given birth.
  • Streptozotocin 10 mg / mL (manufactured by SIGMA) was subcutaneously injected into each 20-day-old C57BL6jZjcL mouse female (manufactured by CLEA Japan, Inc.) at 20 ⁇ L / head.
  • CE 2 (days until 4 weeks old This Claire's feed and sterilized water were bred and bred. From 4 weeks of age, High Fat Diet diet (Nihon Claire) and sterilized water were fed and bred for 2 weeks.
  • a phosphate buffer containing ⁇ ⁇ g ⁇ ⁇ L of anti-CXCL10 antibody and a phosphate buffer containing ⁇ ⁇ ⁇ g ZlOO z L of control antibody were administered twice a week for Z1 week (IshotZl week). Treatment was administered 4 times (treatment period: 2 weeks). On the 14th day, an experiment was conducted to examine the effect of the antibody.
  • Figure 13 shows the results.
  • Fig. 13 shows normal, untreated mouse group, and anti-CXCL10 antibody-administered group and control antibody-administered group in type 2 diabetes (NID DM) model mice. It is a figure which shows the fluctuation
  • the vertical axis represents blood glucose level (mg / dL), and the horizontal axis represents measurement time (min) after loading.
  • “*” indicates that there was a significant difference at 0.05 in the t-test.
  • NIDDM model was prepared by the same method as in Example 9, and an insulin resistance test was performed.
  • Human cryst Alline insulin (0.775 U / kg) was intraperitoneally administered. After 0 minutes (before insulin administration), 15 minutes, and 60 minutes later, the blood glucose level was measured with a Gnore Test Ace blood glucose level measuring instrument (manufactured by Bombix Pharmaceuticals).
  • Figure 14 shows the results.
  • Figure 14 shows normal (untreated) mouse group and anti-CXCL10 antibody-administered group and control antibody-administered group in type 2 glycouria (NIDDM) model mouse, after 0 min, 15 min, 60 min It is a figure which shows the fluctuation
  • the vertical axis represents blood glucose level (mg / dL), and the horizontal axis represents measurement time (min) after loading.
  • “**” indicates that there was a significant difference at p ⁇ 0.01 in the t-test.
  • C57BL6jZjcL mice (manufactured by CLEA Japan, Inc.) on the 14th day of pregnancy were raised and given birth.
  • Streptozotocin 10 mg ZmL (manufactured by SIGMA) was subcutaneously injected 20 ⁇ L / head into each of C57BL6jZjcL mice female (manufactured by CLEA Japan, Inc.) two days after birth.
  • CE_2 manufactured by Claire Japan
  • High Fat Diet diet made by Claire Japan
  • sterilized water were given and bred for 2 weeks.
  • anti-CXCL10 antibody at 100 / ig A phosphate buffer containing ⁇ ⁇ L and a phosphate buffer containing ⁇ ⁇ ⁇ g / ⁇ ⁇ L of the control antibody were administered intraperitoneally.
  • FITC-labeled insulin manufactured by Molecular Probes; 0.775 U / kg was intraperitoneally administered for the purpose of analyzing whether the insulin receptor in the liver would function. Based on this method, frozen sections of the liver were prepared.
  • C57BL6J / JCL mice (manufactured by CLEA Japan, Inc.) on the 14th day of pregnancy were bred and given birth.
  • Streptozotocin 10 mg / mL (manufactured by SIGMA) was subcutaneously injected into each 20-day-old C57BL6j / jcL mouse female (manufactured by Claire Japan) 20 ⁇ L / head.
  • CE-2 manufactured by Claire Japan
  • High Fat Diet diet (manufactured by Claire Japan) and sterilized water were fed and bred for 2 weeks.
  • a phosphate buffer containing 10 ⁇ g ZlOO x L of anti-CXCL10 antibody and a phosphate buffer containing 100 zg / 100 ⁇ L of control antibody were intraperitoneally administered.
  • frozen sections of liver were prepared based on the method of Example 1, and analyzed by double fluorescence immunostaining as in Example 5.
  • Fluorescent immunodouble staining uses an anti- ⁇ -catenin antibody (R & D) and type IV collagen antibody as primary antibodies.
  • Alexa 647-labeled anti-rabbit IgG (manufactured by Molecular Probes), Alexa 564-labeled anti-rabbit IgG ( This was performed in the same manner as in Example 5 except that it was detected as blue and red by a molecular probe.
  • C57BL6J / JCL mice (manufactured by CLEA Japan, Inc.) on the 14th day of pregnancy were bred and given birth.
  • Streptozotocin 10 mg / mL (manufactured by SIGMA) was subcutaneously injected into each 20-day-old C57BL6jZjcL mouse female (manufactured by Claire Japan) 20 ⁇ L / head.
  • CE-2 manufactured by Claire Japan
  • High Fat Diet diet (manufactured by Claire Japan) and sterilized water were fed and bred for 2 weeks.
  • a phosphate buffer containing 10 ⁇ g / ⁇ ⁇ L of the anti-CXCL10 antibody and a phosphate buffer containing 100 ⁇ g / 100 ⁇ L of the control antibody were intraperitoneally administered.
  • frozen sections of the liver were prepared based on the method of Example 1, and analyzed by immunostaining in the same manner as in Example 5.
  • the immunostaining was carried out in the same manner as in Example 5 except that an anti-phosphorylated c-Myc antibody (Biovision) was used as the primary antibody and detected as blue with anti-rabbit IgG.
  • the present invention is useful when hepatocytes are to proliferate.
  • the present invention is effective when it is desirable to proliferate hepatocytes due to various liver diseases. It is also effective when regenerating liver tissue by transplanting liver tissue.
  • the present invention is also useful when intended to improve insulin resistance.
  • patients with insulin resistance such as patients with type 2 diabetes (NIDDM) and patients with metabolic syndrome
  • NIDDM type 2 diabetes
  • this is effective in enhancing insulin responsiveness and sensitivity in hepatocytes and improving glucose tolerance.

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Abstract

　本発明は、肝細胞の複製を促進させる薬剤および方法を提供すること、ならびに、インスリン抵抗性を改善させる薬剤および方法を提供することを課題とする。 　ヘパリン結合性タンパク質であるケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）のサブファミリーに属するＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を肝細胞に投与し、肝細胞の複製を促進する。ＣＸＣＬ１０に対する中和剤としては、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子またはＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子などが好適に用いられる。障害を有する肝組織に上記中和剤を投与することにより、肝組織を修復、再生し得る。一方、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を肝細胞に投与することにより、２型糖尿病、メタボリック症候群等におけるインスリン抵抗性を改善する。

Description

明 細 書
肝細胞複製促進剤およびインスリン抵抗性改善剤
技術分野
[0001] 本発明は、肝細胞の複製を促進する薬剤に関し、詳しくは、障害を有する肝組織に ぉレ、て、肝細胞を再生または修復することに寄与し得る肝細胞複製促進剤およびこ れを用いた肝細胞の増殖促進方法に関する。また、本発明は、インスリン抵抗性を改 善する薬剤に関し、詳しくは、インスリン抵抗性を呈する患者において、インスリン抵 抗性を改善し耐糖能の正常化に寄与しうるインスリン抵抗性改善剤およびこれを用 いたインスリン抵抗性の改善方法に関する。
背景技術
[0002] 肝臓はアミノ酸代謝、アンモニア代謝および化学物質の解毒を行う重要な臓器であ り、主に肝細胞で機能される。従って、外傷、毒物による損傷あるいは疾病による肝 機能障害は、生体にとって生命に関わる重篤な状態を招く場合がある。ことに肝細胞 障害による急性肝不全に陥った患者は高い死亡率を有し、血漿交換を含む保存的 治療のみを行った場合の救命率は 30%以下とされてレ、る。現在まで決定的な保存 的治療法はなぐ肝臓移植が生存率を改善する唯一の確立された治療法と考えられ ている。し力しながら、免疫抑制剤の長期間使用と感染の危険、高いコスト、ドナー不 足あるいは未知の副作用などの問題が解決されておらず、 Q〇L (quality of life) が著しく低下するという欠点を持つ。これらのことから肝移植に勝る方法として、肝再 生に基づいた治療法の開発が近年ますます盛んになつている。そもそも肝臓は古く 力 再生能の高い臓器として知られており、肝細胞の増殖、分化機序も IL— 6 (インタ 一ロイキン 6)や HGF (肝細胞増殖因子）を中心に、詳細に検討されつつある。それ にもかかわらず、実際の生体内で肝細胞の再生を最初に誘発する因子や、再生過 程における肝細胞索構築や機能を維持せしめる因子は未だ大きな疑問として立ちは だ力 ている (非特許文献 1、非特許文献 2)。
[0003] 正常時の肝細胞はほとんどが休止期の状態であり、 DNA合成している肝細胞は数 %以下で、生理的ターンオーバーも数年とする説が支配的である。し力 ながら、障 害時にはそのターンオーバーは加速し、例えば 70%肝切除の場合は 1週間で回復 することが証明されている。新たに作られる肝細胞の供給源として、現在 4つのソース が推定されている。解剖学的には、類洞領域の成熟肝細胞、門脈領域 Hering管周 囲の小型肝細胞（オーパル細胞と呼ばれる肝組織幹細胞と考えられている集団）、 胆管上皮細胞、そして骨髄由来の細胞である。これらの細胞集団の起源や貢献度、 相互作用を知る事は、肝再生を制御するための基礎的研究課題であるが、未だ十分 解明されていない。
[0004] 障害時に肝機能を維持するため臨床的に最も重要なのは、如何に胆汁鬱帯を防ぐ か、すなわち胆汁排泄機構を獲得させるか、という課題であり、近年の人工肝臓補助 装置開発の最大のネックにもなつている。単一の肝細胞レベルではなぐ 3次元的な 肝細胞索構築としての胆汁排泄機構が問題となっており、その点で肝細胞の移動様 式は重要な意義をもつ。現在、肝再生における分化依存的な肝細胞の移動には 2つ の説が提唱されている。門脈領域の肝組織幹細胞が分化に伴って類洞から中心静 脈領域に移動するという「ストリーミング説」と、分化に伴いクラスターを形成しながら、 一塊となってランダムに移動するという「モザイク説」であり、現在「モザイク説」が優勢 だが完全な決着はついていない（非特許文献 3)。更に、肝細胞の配列を決定する因 子と供給源としての幹細胞の関わり方についてはほとんど報告がない。
[0005] 現在の肝再生療法開発においては、成長因子やサイト力インによる再生促進療法 と、幹細胞を利用した方法が主流である。前者は肝細胞の増殖を刺激する因子とし て、 IL_6、 HGFの他、 TNF- α (腫瘍壊死因子）、 uPA (ゥロキナーゼ型プラスミノ 一ゲン活性化因子）、プラスミノーゲン、 VEGF (血管内皮細胞増殖因子）が候補とし て研究されている。し力 ながら、半減期が短い事、全身に作用する事に起因する副 作用の問題がある。決定的には肝細胞索の配列形成に関する作用が不明である。 後者の主流は胚性幹細胞（ES細胞）、骨髄幹細胞、あるいは組織幹細胞を試験管 内で操作し、生体内に戻す方法である。し力 ながら、ソースの品質維持、倫理的問 題、長期的な癌化リスクというハードルがある。これも決定的には実際の生体肝内で どのように肝細胞索形成に関わってくるのかが全く不明である（非特許文献 4)。
[0006] ケモカイン（chemokine)は、生体内で産生される白血球遊走'活性化作用を有す る塩基性の、へパリン結合性タンパク質の総称である。一次構造上保存された部位 に 4つのシスティン残基があり、最初の 2つのシスティン残基の部位により、 CXC、 C C、 C、 CX3Cと 4つのサブファミリーに分類されている。その受容体も CXCR1 _ 6、 CCR1 - 10, CR1— 2、 CX3CR1と現在まで 19種類報告されている。各受容体は 特定の細胞上に特異的に発現しており、免疫担当細胞の特定の場所への遊走 ·定 着が、ケモカインとケモカイン受容体によって制御されている。さらに、例えば受容体 CXCR3のリガンドには、 CXCL9、 CXCL10、 CXCL11の 3種類が報告されている 力 これら 3種類のケモカインの作用が必ずしも同一ではないことも明らかになつてい る。したがって、同じケモカインファミリーであっても個々の役割は極めて多様'性があ るため一括して考える事は不可能であり、生体内で実際にどのような機能を果たして レ、るかというのは未だ十分解明されていない。
[0007] 肝細胞、胆管上皮細胞にも複数のケモカイン 'ケモカイン受容体が発現する事が報 告されており、炎症時の免疫細胞浸潤を制御している事が推定されている（非特許 文献 5)。しかしながら、肝細胞の複製や、分化依存的な移動にどのように関わってく るのかは、全く知られていない。
[0008] ケモカイン受容体である CXCR3およびそのリガンド CXCL10に関しては、活性化 T細胞、特に T helper— 1細胞 (Thl細胞）の遊走に関わる分子であり、ウィルス' 細菌等の感染症、移植片拒絶反応、自己免疫疾患など、いわゆる Thl優位疾患に 対して役割を果たしていることが明力されつつある（非特許文献 6、非特許文献 7、非 特許文献 8、非特許文献 9、非特許文献 10)。ウィルス肝炎を含む様々な Thl優位 疾患で CXCL10の mRNAの発現が増強する事が報告されている。しかしながら、実 際の肝障害で CXCL10の中和剤等による阻害実験が今まで行われていないため、 その発現意義に関しては、生体にとって好ましいものなのカ あるいは逆に好ましくな いものなのか、という点がいまだに不明である。さらには、 Thl細胞のみならず、肝細 胞自体に何らかの作用を及ぼすかどうかに関しては、実験的証左がないだけでなぐ ほとんど想定すらされてレ、なレ、。
[0009] 一方、糖尿病は血糖降下作用をもつホルモンであるインスリンの相対的不足によつ て引き起こされる疾患で、インスリン依存性である 1型 (IDDM)とインスリン非依存性 である 2型 (NIDDM)に分けることができる。 1型糖尿病（IDDM)は自己免疫などに より、先天的にインスリンを産生する膝 /3細胞が破壊されている状態をいう。これに対 して 2型糖尿病（NIDDM)は、遺伝因子に肥満や運動不足などの環境因子が加わ ることによって発症する、いわばインスリン非依存性糖尿病である。厚生省調查研究 班の報告によると、インスリン非依存性糖尿病（2型 NIDDM)の有病率は 40歳以上 の人口の約 10%、 日本全体では約 600万人に達している。食事の欧米化や運動不 足とレ、つたライフスタイルの変化、高齢化社会になりつつあることが糖尿病増加をカロ 速させ、今後も増加の一途をたどると予測されている。治療は、食事療法、運動療法 を基本とし、薬物療法としてインスリン関連酵素、インスリンレセプターなどをターゲッ トとした薬剤であるナテグリニド、 a ダルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素剤（SU 剤）、ビグアナイド剤（BG剤）、チアゾリジン系薬剤などの経口糖尿病薬が臨床現場 で用いられている。し力しながら、インスリン抵抗性に関する機序は多彩であり、未だ 決定的にインスリン抵抗性を改善するための方法は乏しい（非特許文献 11及び 12 及び 13及び 14及び 15)。また、 2型糖尿病を中心とした生活習慣病は、メタボリック 症候群という総称でまとめられつつある。 「21世紀病」として近年ようやく研究が盛ん になってきた領域に位置する疾病であるが、潜在的な患者が多数存在することが指 摘されること力ら、その治療、症状改善のための手段を早期に提供する必要性が重 要視されている。
[0010] 肝臓は、血中からのブドウ糖の取り込みならびに血中へのブドウ糖の放出、すなわ ち血糖値を制御する重要な臓器である。インスリンは、肝細胞に発現するインスリン 受容体に作用する事で、ブドウ糖をグリコーゲンに変え (グリコーゲン合成促進)肝臓 内に貯蔵し、血中へのブドウ糖の放出（糖新生）を抑制する。これにより血中のブドウ 糖を取り込む（非特許文献 16)。したがって、インスリンに対する肝臓の反応が低下 することが、インスリン抵抗性を来す極めて重要な原因となる（非特許文献 17及び 18
[0011] 非特許文献 1 :最新総説； Fausti N. Hepatology 39 : 1477, 2004
非特許文献 2 : Taub R. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5 : 836 非特許文献 3:Zajicek G. Am. J. Pathol. 146:772, 1995
非特許文献 4:最新総説； Taub R. Nature Reviews Molecular Cell Biolo gy 5:836, 2004
非特許文献 5:総説； Simpson KJ, et al. . Clin. Sci. 104:47, 2003 非特許文献 6:Khan IA et al. Immunity 12:483, 2000
非特許文献 7:Liu MT et Al. J. Immunol. 166:1750, 2001 非特許文献 8: Hancock WW et al. J. Exp. Med. 192:1515, 2000, 非特許文献 9: Hancock WW et al. J. Exp. Med. 193:975, 2001 非特許文献 10:Narumi S et al. Eur. J. Immunol. 32:1784, 2002 非特許文献 ll:Fujita, T et al. Biochemical Pharmacology (1996) 52 407-411
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非特許文献 16 Sherrington AD. Diabetes 48:1198— 1214, 1999.
非特許文献 17:DeFronzo RA. Diabetes rev 5:177-269, 1997.
非特許文献 18: Michael MD et al. Mol. Cell 6:87-97, 2000, 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
上述したように、肝組織損傷に関連する、損傷した肝細胞とその機能障害を修復す るためには、移植療法や細胞療法に変わる、あるいは併用しうる更なる治療方法が 求められる。このような状況の下、本発明は、肝細胞を増殖する薬剤およびそれを用 いた肝細胞の増殖方法を提供することを課題とする。また、本発明は、従来の糖尿病 薬に代わりうる、メタボリック症候群に対しても有用な、肝細胞のインスリン抵抗性を改 善する薬剤およびそれを用いたインスリンの抵抗性改善方法を提供することをも課題 とする。 課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、ケモカイン受容 体 CXCR3に対するリガンドの 1種であり、ケモカインのサブファミリー CXCに分類さ れるタンパク質の 1種である CXCL10が肝細胞の再生に大きく関与しているという知 見を得た。さらに CXCL10について研究を進め、 CXCL10は肝細胞の複製を抑制 することを見出すと共に、 CXCL10の機能を抑制することによって肝細胞の複製を促 進し得るという着想を得た。そして、本発明者等は CXCL10の機能を抑制する中和 剤が実際に肝細胞の複製を促進するという実証を得て、本発明を完成するに至った 。本発明は、具現化された態様として下記肝細胞複製促進剤および肝細胞の増殖 促進方法等を提供するものである。
[0014] さらに、本発明者らは、インスリン抵抗性を呈している個体において、 CXCL10に 対する中和剤が肝細胞の複製を促進するのみならず、共通と推測される作用機序に より肝細胞のインスリンに対する反応性 ·感受性が有意に増加し、耐糖能異常も有意 に改善するという実証も得た。この知見から、 CXCL10に対する中和剤は肝細胞に 働きかけてインスリンに対する反応性等を増強させるという全く新しい機序に基づくィ ンスリン抵抗性改善剤としても有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。 本発明は、具現化された態様として下記インスリン抵抗性改善剤およびインスリン抵 抗性の改善方法等をも提供するものである。
[0015] 〔1〕ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤を有効成分とする肝細胞複製 促進剤。より具体的には、ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤および薬 学的に受容可能なキャリアを含む肝細胞複製促進剤。
〔2〕少なくとも成熟肝細胞の複製を促進することを特徴とする、〔1〕に記載の肝細胞 複製促進剤。
〔3〕損傷した肝組織における肝細胞の複製を促進することを特徴とする、上記〔1〕ま たは〔2〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔4〕前記損傷が、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷および病原体 を原因とする損傷からなる群より選択される損傷である、上記〔1〕から〔3〕のいずれか 一項に記載の肝細胞複製促進剤。 [5]前記毒性物質を原因とする損傷が、アルコール性肝炎および薬剤誘発性肝障 害からなる群より選ばれる疾患による損傷である、上記〔4〕に記載の肝細胞複製促進 剤。
〔6〕前記病原体が肝炎ウィルスである、上記〔4〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔7〕前記機械的傷害による損傷が、肝臓移植、細胞移植および外科的部分肝切除 からなる群より選ばれる原因による損傷である、上記〔4〕に記載の肝細胞複製促進剤
〔8〕前記損傷が、脂肪性肝炎による損傷である、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に 記載の肝細胞複製促進剤。
〔9〕前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10の活 性を抑制する因子である、上記〔1〕から〔8〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促 進剤。
〔10〕前記活性を抑制する因子力 抗 CXCL10抗体である、上記〔9〕に記載の肝細 胞複製促進剤。
〔11〕前記 CXCL 10に対する中和剤が、 CXCL 10の発現を抑制する因子である上 記〔1〕から〔8〕のレ、ずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔12〕前記 CXCL 10に対する中和剤が、 CXCL 10に対する受容体の拮抗剤である 上記〔1〕から〔8〕のレ、ずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔13〕ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤の、肝細胞複製促進剤を製 造するための利用。
〔14〕ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与 する工程を含む、肝細胞の増殖促進方法。
〔15〕前記肝細胞が哺乳動物の肝細胞である、上記〔14〕に記載の肝細胞の増殖促 進方法。
〔16〕前記哺乳動物がヒトである、上記〔15〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔17〕障害を有する肝組織に、前記中和剤を投与する、上記〔14〕から〔16〕のいずれ か一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔18〕前記障害が、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷および病原 体を原因とする損傷よりなる群から選択される、上記〔17〕に記載の肝細胞の増殖促 進方法。
〔19〕前記毒性物質を原因とする損傷が、アルコール性肝炎および薬剤誘発性肝障 害からなる群より選ばれる疾患による損傷である、上記〔18〕に記載の肝細胞の増殖 促進方法。
〔20〕前記機械的傷害による損傷が、肝臓移植、細胞移植および外科的部分肝切除 力もなる群より選ばれる原因による損傷である、上記〔18〕に記載の肝細胞の増殖促 進方法。
〔21〕前記病原体が肝炎ウィルスである、上記〔18〕に記載の肝細胞の増殖促進方法
〔22〕前記障害が、脂肪性肝炎による損傷である、上記〔14〕から〔16〕のいずれか一 項に記載の肝細胞複製促進方法。
〔23〕前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10の 活性を抑制する因子である、上記〔14〕から〔22〕のいずれか一項に記載の肝細胞の 増殖促進方法。
〔24〕前記活性を抑制する因子が、抗 CXCL10抗体である、上記〔23〕に記載の肝 細胞の増殖促進方法。
〔25〕前記 CXCL10に対する中和剤力 ケモカイン CXCL10の発現を抑制する因子 である、上記〔14〕から〔22〕のレ、ずれか一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔26〕前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に対する受容体の拮抗剤である 上記〔14〕から〔22〕のレ、ずれか一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔27〕ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤を有効成分とするインスリン抵 抗性改善剤。より具体的には、ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤およ び薬学的に受容可能なキャリアを含むインスリン抵抗性改善剤。
〔28〕メタボリック症候群におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、上記〔 27]に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔29〕 2型糖尿病におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、上記〔27〕に 記載のインスリン抵抗性改善剤。 〔30〕 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10 の活性を抑制する因子である上記〔27〕から〔29〕のレ、ずれか一項に記載のインスリ ン抵抗性改善剤。
〔31〕 前記活性を抑制する因子が、抗 CXCL10抗体である上記〔30〕に記載のイン スリン抵抗性改善剤。
〔32〕 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10の発現を抑制する因子である上 記〔27〕から〔29〕のレ、ずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔33〕 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に対する受容体の拮抗剤である 〔27〕から〔29〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
[34] ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤の、インスリン抵抗性改善剤 を製造するための利用。
〔35〕 ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与 する工程を含む、インスリン抵抗性の改善方法。
〔36〕前記肝細胞が哺乳動物の肝細胞である、上記〔35〕に記載のインスリン抵抗性 の改善方法。
〔37〕前記哺乳動物がヒトである、上記〔36〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。 〔38〕前記哺乳動物がインスリン抵抗性を呈する患者である、上記〔36〕に記載のイン スリン抵抗性の改善方法。
〔39〕前記哺乳動物がメタボリック症候群の患者である、上記〔36〕に記載のインスリ ン抵抗性の改善方法。
〔40〕前記哺乳動物が 2型糖尿病患者である、上記〔36〕に記載のインスリン抵抗性 の改善方法。
〔41〕前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10の 活性を抑制する因子である、上記〔35〕から〔40〕のレ、ずれか一項に記載のインスリン 抵抗性の改善方法。
〔42〕前記活性を抑制する因子が、抗 CXCL10抗体である、上記〔41〕に記載のイン スリン抵抗性の改善方法。
〔43〕前記 CXCL10に対する中和剤力 ケモカイン CXCL10の発現を抑制する因子 である、上記〔35〕から〔40〕のレ、ずれか一項に記載のインスリン抵抗性の改善方法。 〔44〕 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に対する受容体の拮抗剤である 〔35〕から〔40〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
[0019] 障害時の肝細胞では複数のケモカイン、ケモカイン受容体が発現する事が報告さ れており、その関与が推定されている。 CXCL10も炎症時において肝臓で強く発現 する事が知られている。しかし、生体外から投与した CXCL10の中和剤が成熟肝細 胞の複製に直接的に寄与する事は全く知られておらず、実際に肝再生を促進すると レ、う作用は、本発明者等によって初めて発見された事である。
[0020] 更に、 CXCL10の中和剤が傷害後の肝細胞索の構築を迅速に回復させ、肝機能 障害も軽度に留めておく事が、下記実施例 2及び 3において詳述される。
[0021] したがって本発明により、重症の肝組織障害や肝機能不全に陥った患者に対し、 残存する成熟肝細胞の迅速な複製を促進する事で、肝組織構築を保持しながら機 能的にも改善させるという、新規の生体内作用機転を有する治療法開発への道が拓 かれたと言える。
[0022] これに加えて、生体外から投与した CXCL10が肝細胞のインスリン抵抗性の顕著 な改善をもたらすことについても、従来知られていない、本発明者等により初めて明 らかにされた知見である。したがって、本発明は、インスリン抵抗性を呈する患者、例 えば 2型糖尿病（NIDDM)患者、メタボリック症候群患者等のための治療法の基礎と もなりうるものである。
発明の効果
[0023] 本発明により、肝組織細胞の複製を促進することができる。したがって、本発明によ れば、損傷を受けた肝組織を再生することができる。
さらに、本発明によれば、インスリン抵抗性を改善することができるので、インスリン 抵抗性を呈する疾患、例えば 2型糖尿病、メタボリック症候群の治療において有用で ある。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]図 1は、 CCL4誘発肝障害における CXCL10 mRNA発現の推移を示す図で ある。 [図 2]図 2は、 CCL4誘発肝障害の免疫染色像を示す図である。
[図 3]図 3は、 CCL4誘発肝障害における肝重量の推移を示す図である。
[図 4]図 4は、 CCL4誘発肝障害における血清 ALTの推移を示す図である。
[図 5]図 5は、 CCL4誘発肝障害における壊死面積の推移を示す図である。
[図 6]図 6は、 CCL4誘発肝障害（CCL4投与 3日後）の類洞領域における CD31陽 性染色像を示す図である。
[図 7]図 7は、 CCL4誘発肝障害（CCL4投与 3日後）の類洞領域における BrdU陽性 増殖肝細胞の定量的データを示す図である。
[図 8]図 8は、肝組織幹細胞における CCL4誘発肝障害に対する抗 CXCL 10抗体の 効果を示す図である。上段は生後 8週目（8w)、中段は CCL4投与後 3日目（d3)の コントロール、下段は CCL4投与後 3日目（d3)の抗 CXCL10抗体投与の試験結果 を示す図である。
[図 9]図 9は、正常マウスにおける抗 CXCL10抗体投与の効果を示す図である。
[図 10]図 10は、正常マウスにおける CXCL10組み替え蛋白質の効果を示す図であ る。
[図 11]図 11は、ヒト肝細胞株 HepG2における CXCL10の受容体の発現を検出する 電気泳動像を示す図である。
[図 12]図 12は、 HepG2の増殖に対する抗 CXCL10抗体の効果を示す図である。
[図 13]図 13は、抗 CXCL10抗体による耐糖能異常の改善を示す図である。
[図 14]図 14は、抗 CXCL10抗体によるインスリン抵抗性の改善を示す図である。 符号の説明
[0025] P :門脈部
F :蛍光染色部
CD31 : CD31陽性部位
Nuclei :核染色部位
ND : not aone
発明を実施するための最良の形態
[0026] 本発明は限られた数の実施形態に関して記載されたが、本発明の多くのバリエ一 シヨン、改変及び他の適応を行う事ができる事は理解されたレ、。
[0027] 本発明の肝細胞複製促進剤は、ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤 を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の肝細胞複製促進剤は、 CXC L10に対する中和剤および薬学的に受容可能なキャリアを含有する製剤とし得る。ま た、本発明の肝細胞の増殖促進方法は、ケモカインの 1種である CXCL10に対する 中和剤の有効量を、肝細胞に投与する工程を含むものである。
[0028] 本発明の好ましい一形態として、損傷した肝組織における肝細胞の複製を促進す ること力 S例示される。本発明の肝細胞複製促進剤は、損傷の原因によらず、肝細胞を 増殖させること意図する場面において有用である。例えば、毒性物質を原因とする損 傷、機械的傷害による損傷、病原体を原因とする損傷などを有する肝組織に本発明 の肝細胞促進剤は好適に適用される。毒性物質を原因とする損傷としては例えば、 アルコール性肝炎、薬剤誘発性肝障害などの疾患による損傷が挙げられる。また、 病原体によるものとしては例えば肝炎ウィルスなどが例示される。また、機械的傷害 による損傷としては、例えば肝臓移植、細胞移植、外科的部分肝切除などを原因と する損傷が例示される。更に、本発明の肝細胞複製促進剤は、脂肪性肝炎に適用 可能である。脂肪性肝炎のうち特に、アルコール非依存性肝炎は、メタボリック症候 群との関連性が指摘される生活習慣病の一つである力 本発明はこのアルコール非 依存性肝炎の治療にも有用である。
[0029] 本発明の一つの好ましい形態としては、肝組織損傷に関連する成熟肝細胞の損失 と機能障害を有するか、またはそれを発症する可能性のある被験体に、 CXCL10に 対する中和剤の治療学的有効量を投与する事によって、被験体における重篤な組 織'機能障害の減少または回復を図ることが挙げられる。本発明は、臨床的には、例 えば、急性肝不全、慢性肝不全、または神経性疾患に起因する肝障害などを有する 肝組織の再生、修復に有用である。被験体としては、ヒトを含む哺乳類を対象とし得 る。
[0030] 本明細書において「CXCL10に対する中和剤」は、 CXCL10の生理的機能の活 性を抑制させる作用を有する薬剤のことをいう。 CXCL10の生理的機能とは、 CXCL 10に起因して発揮される機能を意味し、例えば CXCL10が受容体、具体的には例 えば CXR3に結合して発揮される機能が挙げられる。好ましい一形態として本発明に おける中和剤は、 CXCL10の活性を抑制し、少なくとも成熟肝細胞の複製を促進す る因子である。また、中和剤としては、 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10の活 性を抑制する因子、および CXCL10の発現を抑制する因子が例示される。
[0031] 一つの形態として中和剤は、 CXCL10活性を減少するのに十分な親和性で CXC L10に結合する任意の分子であり得る。中和剤として好ましくは、 CXCL10に対する 抗体 (抗 CXCL10抗体）のような結合分子などが挙げられる。さらに、 CXCL10活性 を低下させるのに十分な親和性で CXCL10に結合する CXCR3受容体のフラグメン トまたはペプチド模倣物なども例示される。さらには、 CXCL10を特異的に分解する 酵素なども例示される。また、 CXCL10に対する中和剤としては、 CXCL10に直接 的に作用して活性を抑制させる物質だけでなぐ CXCL10以外の物質に作用するこ とにより CXCL10の活性を阻害する物質を挙げることもできる。このような中和剤の例 としては、 CXCL10に対する受容体の拮抗剤（アンタゴニスト）が示される。 CXCL10 に対する受容体としては、肝細胞に存在する受容体を挙げることができる。例えば C XCR3 A、 CXCR3— Bなどの CXCR3を挙げることができる。
[0032] 抗 CXCL10抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として調製し得 る。
ポリクローナル抗体を、例えば、ゥサギ、ャギ、マウスまたは他の哺乳動物において 惹起するための方法は当該分野で周知である。抗ペプチド抗体の産生は通常、ゥサ ギ、マウス、モルモットまたはラットのような宿主動物の使用を含む。多量の血清が必 要な場合には、ヒッジ、ャギ、ゥマ、ブタまたはロバのようなより大きな動物が使用され 得る。動物は通常、必要とされる抗血清の量に基づいて選択される。適切な動物とし ては、ゥサギ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターが挙げられる。これらの動 物から得られる血清の量は、通常、 1回の採血につき、ゥサギの場合最大で 25mL、 マゥスの場合100〜200 /レその他の動物の場合:!〜 2mLである。例えば、フロイ ント完全アジュバントのような適切なアジュバント中にある 15〜50 μ gの抗原を用いて 、 2〜4週間の間隔をあけて 2回注射した後で、血液が収集され得、そして抗血清の 分析がなされ得る。 [0033] さらに、モノクローナル抗体は、当該分野で周知でありかつ慣用的である方法を使 用して入手され得る。免疫原として使用するためのタンパク質（例えば、 CXCL10)の ペプチド部分は、当該分野で周知の方法によって決定され得る。 CXCL10で免疫さ れたマウスに由来する脾臓細胞が、適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイプリドー マ細胞を生成し得る。クローン化されたハイプリドーマ細胞株は、抗 CXCL10抗体を 分泌するクローンを同定するために、標識化 CXCL10タンパク質を用いてスクリー二 ングされ得る。所望の特異性および親和性を有する抗 CXCL10モノクローナル抗体 を発現するハイブリドーマが単離され得、そして抗体中和剤の持続的供給源として利 用され得る。
[0034] 組換え抗体、例えば、キメラおよびヒトイ匕抗体をまたこの分野において知られている 方法により得ることができる。ヒトイ匕抗体は、ヒト抗体フレームワークに本質的に任意の 抗原結合特異性を付与することによって構築され得る。ヒト化抗体を構築する方法は 、本発明の方法を実施するため、そして治療的に使用される場合に抗体中和剤に対 する宿主の免疫応答を回避するために適切な抗体中和剤を調製するために有用で ある。
[0035] さらに、中和剤は、 CXCL10の調節タンパク質または遺伝子領域の機能を阻害ま た促進し、そして、 CXCL10発現の程度、量または速度、あるいはその活性の減少 を与える調節分子、または遺伝子領域に結合する任意の分子であり得る。さらに、 C XCL10発現の減少を与える中和剤の例としては、アンチセンス核酸、転写阻害剤な どが挙げられ得る。
[0036] 本発明の 1つの実施形態としては、 CXCL10をコードするポリヌクレオチド、 CXCL 10の発現もしくは活性を調節する調節分子、またはそれらの任意のフラグメント、ある いはアンチセンス分子力 中和剤として使用され得る。 1つの局面では、 CXCL10の コード核酸に対するアンチセンス分子を使用して、その mRNAの転写または翻訳を ブロックし得る。詳細には、 CXCL10をコードする核酸に対して相補的な配列により、 細胞が形質転換され得る。このような方法は当該分野で周知であり、そしてセンスま たはアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはより大きなフラグメントが、 CXCL10をコ ードする配列のコード領域または制御領域中の種々の位置から設計され得る。このよ うにして得られるアンチセンス分子を使用して、 CXCL10活性を中和し得るカ また は遺伝子機能の調節を達成し得る。また、本発明においては、中和剤として、 CXCL 10に対し特異的なリボザィム、 RNAi活性分子（siRNA)などを用いてもょレ、。
[0037] 本発明の肝細胞増殖促進方法は、治療目的、学術的目的などその目的によらず、 肝細胞を増殖しょうとするあらゆる場面において適用可能である。本発明の肝細胞の 増殖促進方法の好ましい形態の一つとして、肝細胞に障害を有する被験者の治療、 肝組織移植などにおける肝組織の提供者または、肝組織移植を受けた患者に対す る肝細胞再生が挙げられる。
[0038] 本発明において中和剤を投与する際には、中和剤の種類や目的に応じて有効な 量、処方等の条件を適宜設定してよい。例えば、本発明の方法を実施するために有 用な中和剤は、処置される肝細胞傷害の重篤度；傷害の速度または量;被験体の体 重、性別、年齢および健康状態;特定の化合物の生化学的性質、生物活性、バイァ ピリティおよび副作用；ならびに併用する処置レジメンに適合する様式において適切 な様式および量で、当業者により処方および投与され得る。適切な量および処方は 、当該分野で公知の特定の障害に関する信頼性ある動物モデルから推定され得る。 より低い結合親和性を有する中和剤に必要とされる投薬量と比較して、有意に、かつ より高い結合親和性を示す中和剤がより少ない用量で投与され得るように、 CXCL1 0に対する中和剤の投薬量が、 CXCL10に対するその中和剤の結合親和性に基づ レ、て調整されなければならないことが理解される。従って、適切な投薬量は、特定の 処置に応じて、および所望される処置の期間に応じて変動する。通常、治療的処置 のために適切な投薬量は、 1日あたり体重 lkgあたりで約 10 x gと約 lmgとの範囲内 で適宜定めることができる。また、例えば生理的に受容可能な組成物中において投 与される場合の投与量は、一般に 0. 1 μ g/ml,好ましくは 1. O z g/ml,より好まし くは約 2 z g/ml以上の血漿濃度を達成するために十分な範囲で定めることができる 。具体的には、約 0. 1 μ g/ml〜約 ΙΟΟ μ g/ml、好ましくは約 1. Ο μ gZml〜約 5 0 μ g/ml,中でも約 2 z gZml〜約 50 z g/ml、そして特に、 5〜10 x gZmlの血 漿濃度を達成するために十分な範囲で定めることが望ましレ、。
[0039] 本発明の肝細胞複製促進剤の有効成分たる中和剤は、当該分野で公知の多数の 経路により被験体に投与され得る (例えば、全身投与 (例えば、静脈内投与)）。 CXC L10に対する中和剤が、当業者に公知の処方方法を使用して、薬学的に受容可能 な処方物中にある、単離され実質的に精製されたポリペプチドおよびポリペプチドフ ラグメントの形態で提供され得る。これらの処方物は、標準的経路（局所経路、経皮 経路、腹腔内経路、経口経路、直腸経路、または非経口経路 (例えば、静脈内経路 、皮下経路、もしくは肝動脈内経路）を含む）により投与され得る。 CXCL10に対する 中和剤の静脈内投与が、本発明の方法を実施するために特に適切な経路である。 肝動脈内経路は、損傷部位または外傷部位に上記中和剤の送達を標的化するため に実施され得る。さらに、 CXCL10に対する中和剤の改変体力 生分解性ポリマー 中に組み込まれ得、これにより、肝障害を減少するために有用な化合物の徐放が可 能になる。本発明の肝細胞複製促進剤は上記のような投与経路、投与方法などの条 件に基づき、適切な剤型を選択し得る。
[0040] CXCL10に対する中和剤は、薬学的に受容可能な媒体と一緒に溶液または懸濁 物として投与され得る。そのような薬学的に受容可能な媒体は、例えば、滅菌水性溶 媒 (例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常生理食塩水もし くはリンゲル溶液、または他の生理学的緩衝化生理食塩水）または他の溶媒もしくは ビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油（例えば、ォリーブ油）もしくは注射可 能な有機エステル)であり得る。薬学的に受容可能な媒体は、さらに、生理学的に受 容可能な化合物 (例えば、中和剤を安定化する化合物、その溶解度を増加する化合 物、もしくはその吸収度を増加する化合物）を含み得る。そのような生理学的に受容 可能な化合物としては、例えば、糖質（例えば、グルコース、スクロース、またはデキス トラン）；抗酸化剤（例えば、ァスコルビン酸またはグノレタチオン）；キレート剤（例えば、 EDTA) (これは、微生物膜を破壊する）；二価金属イオン (例えば、カルシウムまたは マグネシウム）；低分子量タンパク質;脂質またはリボソーム；または他の安定化剤もし くは賦形剤が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、中和 剤を含む化合物の投与経路、ならびにその特定の物理的特徴および化学的特徴に 依存することを理解する。
[0041] 非経口投与に適切な処方物としては、水性および非水性の滅菌注射溶液（例えば 、上記の薬学的に受容可能な媒体）力挙げられる。その溶液は、さらに、例えば、緩 衝剤、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を 含み得る。他の処方物としては、例えば、懸濁剤および濃化剤を含み得る、水性およ び非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。その処方物は、単位用量容器または多用量 容器 (例えば、密封アンプルおよび密封バイアル）中に提示され得、そして使用直前 に例えば滅菌液体キャリアの添加を必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時 注射溶液および即時注射懸濁物が、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、お よび錠剤から調製され得る。
[0042] 本発明の別の実施形態に従って、 CXCL10に対する中和剤と、肝細胞傷害の重 篤度を減少するための方法において使用するための指示書とを含む、治療システム 力 好ましくは、キット形態で存在する。 1つの実施形態において、例えば、その治療 斉 IJは、抗 CXCL10抗体である。
[0043] 適切なキットは、少なくとも 1つの治療適用に十分な量で、別個の包装された化学 試薬として少なくとも 1つの CXCL10中和剤（CXCL10に対する中和剤）を含む。包 装されたキットの使用のための指示書も含み得る。当業者は、 CXCL10中禾ロ剤を、 本明細書中に記載されるような本発明の方法の実施のために適切な緩衝液および 溶液と組み合わせてキットの形態に容易に組み込み得る。
[0044] 一方、本発明者らは、前述したように、 CXCL10に対する中和剤が、肝細胞の複製 を促進すると同時にインスリンに対する反応性'感受性を増加させ耐糖能異常を改善 する作用を有することを確認しており、インスリン抵抗性改善剤の有効成分としても有 用であることを見出している。本発明は、別の一形態として、 CXCL10に対する中和 剤を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤をも提供するものである。
[0045] 本発明において、インスリンの抵抗性を改善するとは、肝臓の、具体的には肝細胞 のインスリンに対する反応性や感受性を増強させることを意味する。特に、インスリン 抵抗性を呈している個体において、肝細胞のインスリンに対する反応性、感受性を正 常個体と同様或いは近いものとすることが挙げられる。 CXCL10に対する中和剤が、 インスリンの抵抗性を改善する作用機序は、以下の経路で進むものと推測される。ま ず、 CXCL10に対する中和剤、例えば抗 CXCL10抗体を投与すると、少なくとも肝 細胞（主に成熟肝細胞）において CXCL10の受容体に対する結合が阻害されると同 時に、肝細胞膜のタンパク質である βカテニンが細胞内を核の方向へ移行する。続 いて、タンパク質 c_Mycの発現が活性化され、その結果、肝細胞のインスリン受容 体へのインスリン結合量が増加する。すなわち、インスリンに対する肝臓の反応が向 上し、肝臓の糖代謝の改善が促進される。尚、上述した肝細胞の複製促進の作用機 序も、 CXCL10に対する中和剤の肝細胞に対する作用であるから、上記したインスリ ン抵抗性改善の作用機序と全部、又は少なくとも一部（例えば βカテニンシグナルの 制御までの部分）が共通であるものと推測される。
[0046] 本発明のインスリン抵抗性改善剤は、上記のように、 CXCL10に対する中和剤が 肝細胞に働きかけることにより、その結果としてインスリン抵抗性を改善させるもので ある。したがって、肝細胞を対象とする点で上述した肝細胞複製促進剤と同様である から、 CXCL10に対する中和剤の使用量、投与条件などについては、上述した肝細 胞複製促進剤の場合と同様とすることができる。
[0047] 本発明の好ましい一形態としては、インスリン抵抗性を有する肝細胞、例えばヒトを はじめとする哺乳動物由来の肝細胞において、インスリン抵抗性を改善することが例 示される。このような肝細胞としては、インスリン抵抗性を呈する個体力 抽出、精製し 培養したものを例示することができる。一方、本発明の別の好ましい形態としては、ィ ンスリン抵抗性を呈する被験体に、 CXCL10に対する中和剤の治療学的有効量を 投与する事によって、被験体におけるインスリン抵抗性の改善を図ることが挙げられ る。本発明は、臨床的には、例えば、インスリン抵抗性、例えば、 2型糖尿病（NIDD Μ)、メタボリック症候群などのインスリン抵抗性を呈する患者において、耐糖能異常 の改善を図るために有用である。尚、メタボリック症候群の機序におけるインスリン抵 抗性及び糖代謝異常 (耐糖能の異常など)などの位置付けは科学的に解明されてレ、 ないものの、これらが関与することは明らかである。メタボリック症候群の有病率はか なり高いものと見られることから、本発明はその症状緩和、治療に貢献するものとして 有用である。
実施例
[0048] 以下、非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。以下の実施例は、本発明 を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。本発明の種 々の実施形態の活性に実質的には影響を与えない改変もまた、本明細書中に提供 される本発明の定義内に包含されることが、理解される。従って、以下の実施例は、 本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
[0049] [実施例 1]四塩ィ匕炭素誘発肝障害モデルを用いた傷害肝細胞における CXCL10 の発現増強
四塩化炭素誘発肝障害モデルを利用し、 CXCL10の発現について評価を行った 。四塩化炭素誘発肝障害モデルは、 Morrison GR. Arch. Biochem. Biop hys. 111 : 448, 1965の記載に準じて構築した。この肝障害モデルは Thl細胞 の浸潤がないため、 CXCL10の Thl細胞に対する影響を度外視でき、生体内での 肝細胞の複製 ·再生を純粋に評価することができるという利点がある。なお、 CXCL1 0の塩基配列は DDBJ (DNA Data Bank of Japan)などのデータベースにおい て既に登録されたものがある。また、 CXCL10タンパク質および抗 CXCL10抗体は 、それぞれ市販品として入手も可能である。
[0050] C57BL6/Jマウス（雌、 8— 9週齢、 日本クレア社製）に、四塩化炭素（CCL4、 0.
5 i L/g体重； Sigma—Aldrich社製）を腹腔内に注射した。 CCL4投与前、ならび に投与の 1、 6、 12時間後、 1、 2、 3、 5、 7、 10日後にマウスを屠殺、肝臓を採取した 。肝臓の第 1葉の一部をすぐに液体窒素で凍結し、全 RNAを、 RNAzol試薬（BIOT ECX LAB社製）を用いて抽出し、 cDNAまで逆転写した。 CXCL10の発現は、 A BI7700 sequence detector system (PE Applied Biosystems社製) 用レヽ 、 95°C15禾少、 55。C1分 30禾少とレヽぅ曽幅サイクノレを 40回行うリアノレタイム定量 PCR法 にて解析した。各々のサンプルの CXCL10の発現量を内因性コントロールである G APDHの発現量で補正した後に、 CCL4投与前の発現量に対する相対的発現量を 算出し、これを増強倍率とした。図 1に増強倍率の経時的推移を示す。
[0051] また、肝臓の第 2葉の一部は OCTコンパウンド (Miles社製）に包埋し、液体窒素で 凍結ブロックを作成した。クライオスタツ HMicrom社製）で の切片を作成し、抗 CXCL10抗体（ャギポリクローナル抗体； 20 z g/mL ; Santa Cruz社製）、抗 CX CR3抗体（ャギポリクローナル抗体； 20 μ g/mL ; Santa Cruz社製）を用い室温で 1時間反応させた。その後、 Alexa— 594標識抗ャギ IgG (Molecular Probe社製； 各 1： 200希釈）で室温 30分更に反応させ、アンチフェード封入剤（DAKO社製）で 封入後、共焦点蛍光レーザー顕微鏡（TCS SP2 A〇BS ; Leica Microsystems 社製)で観察、撮影した。
[0052] 定量的 PCRの結果 (増強倍率の経時的推移）を図 1に示す。肝臓にぉレ、ては CXC L10 mRNAは恒常的に発現していた力 CCL4投与によりその発現は劇的に増強 した。 CCL4投与 1時間後より増強し、 1日後に第 1の最高のピークを示し、一度減弱 した後、 5日後に第 2のピークを示すという、 2峰性の発現増強様式を呈した。
[0053] 図 2に免疫染色像（200倍）を示す。図 2中、左は CCL4投与前の組織の染色像を 、右は CCL投与後（1日後）の組織の染色像を示す。また、図 2中、 Pは門脈部を示 す。また、 Fは染色された部位を示す。図 2に示されるように、免疫染色でも CXCL10 蛋白は肝細胞に恒常的に検出できたが、 CCL4投与 6時間後より、 CXCL10陽性月干 細胞は著明に増加し、 1日後にその数はピークに達した。肝障害における CXCL10 の劇的な発現増強を、 mRNAレベルならびに蛋白レベルで確認し、かつその局在 が傷害肝細胞であることも示された。
[0054] [実施例 2]
CXCL10の発現増強力 生体にとって有益なのカ あるいは有害な現象なのかを 解析する目的で、 C57BL6/Jマウス（8週齢、雌、 日本クレア社製）に CCL4を投与 する直前に、 100 μ gのモノクローナル CXCL10抗体（200 μ Lの滅菌 PBS中に懸 濁した）の尾静脈注射を 1回与えた。これらの研究において使用したモノクローナル 抗体は、 CXCL10に特異的であり、その受容体 CXCR3の他のリガンドである CXCL 9および CXCL11とは免疫学的に交差しなレ、。また中和活性としては、 CXCR3陽性 活性化 Tリンパ球の走化性を抑制する。経時的にマウスを屠殺し、臨床的所見をコン トロール抗体処置群と比較検討した。
[0055] なお、モノクローナル抗体は、当該分野で周知でありかつ慣用的である方法を使用 して作製した。免疫原として使用するための CXCL10タンパク質のペプチド部分は、 当該分野で周知の方法によって決定し、 CXCL10組み替えタンパク質を作製した（ このような組み換えタンパク質は、 R&D社などより容易に入手できる）。 CXCL10で 免疫されたマウスに由来する脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合し、ハイプリドーマ細胞 を作製した。クローン化されたハイプリドーマ細胞株のうち、抗 CXCL10を分泌するク ローンを同定するために、ピオチン標識化 CXCL10タンパク質を用いてスクリーニン グした。これにより特異性および親和性を有する抗 CXCL10モノクローナル抗体を発 現するハイブリドーマを単離し、持続的供給源として利用できる。
[0056] 以下のようにして、作製した抗体の中和活性、特異性を確認した。 CH〇一 K1細胞 株に、マウス CXCR3 (CXCL10の受容体）を当該分野で周知の方法によってトラン スフエクシヨンし、恒常的に CXCR3を発現する CHO—K1細胞株を作製した。この 細胞株にマウス組み換えタンパク質を添加し、カルシウム流入反応（Calcium influ x assay)でその効果を確認する実験系において、モノクローナル CXCL10抗体を 添加することにより、カルシウム反応が阻害されることを確認した。また、免疫沈降試 験により、モノクローナル CXCL10抗体は、他の CXCR3リガンドである CXCL9およ び CXCL10との交差性がない事も確認した。
[0057] また、コントロール抗体として、 CXCL10モノクローナル抗体の IgGlサブクラスを一 致させた、ヒト parathyroid— related peptide (副甲状腺）に対するモノクローナル 抗体を用いた。この抗体は、サンタクルズ社、ケミコン社、など数社より容易に入手で きる。尚、以下の実施例におけるコントロール抗体 (対照抗体）でもこのモノクローナ ル抗体を同様に用いた。
[0058] マウス肝重量 (肝組織重量）の推移を図 3に示す。図 3中「*」は、 t一検定による p
< 0. 05の有意差が認められたことを示す。コントロール抗体処置群では、 CCL4投 与 1日後まで急速に肝重量が減少し、 3日後より徐々に回復した。一方、抗 CXCL10 抗体処置群でも CCL4投与 1日後には肝重量が減少するが、コントロール抗体投与 群に比較し、速やかに回復した。これは、抗 CXCL10抗体処置により、肝臓の傷害 後の再生がより速やかに促進される事を示してレ、る。
[0059] マウス血清中 ALT (alanine transferase)濃度（IU/L)の推移を図 4に示す。図 4中「*」は、 t—検定による p< 0. 05の有意差が認められたことを示す。血清 ALTは 肝細胞傷害の程度をみる臨床的にも最も信頼度の高い指標であり、富士ドライケム- スライド（Fuji Medical System社製）にて測定した。コントロール抗体処置群では 、 CCL4投与後劇的に上昇し、 1日目にピークを示した後、 3日目より徐々に減少し、 7日目には正常範囲内まで回復した。一方、抗 CXCL10抗体処置群では、血清 AL T値の上昇は有意に抑制され、 5日目には正常範囲内に回復した。抗 CXCL10抗 体処置により、肝細胞傷害が劇的に抑制されている事が判明した。
[0060] [実施例 3]
C57BL6/Jマウス（8週齢、雌、 日本クレア社製）に CCL4を投与する直前に、 100 μ gのモノクローナル CXCL10抗体（200 μ Lの滅菌 PBS中に懸濁した）もしくはコン トロール抗体の尾静脈注射を 1回与えた。経時的にマウスを屠殺し、組織病理学的 所見をコントロール抗体処置群と比較検討した。肝臓の凍結切片を実施例 1に記載 の方法により作成し、免疫組織学的解析を行った。一次抗体として、ラット抗マウス C D31モノクローナル抗体（2 μ g/mL ; PharMingen社製）またはゥサギ抗マウス IV 型コラーゲン 'ポリクローナル抗体（Sigma社製； 1： 250希釈）を用い室温で 1時間反 応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ラットまたはゥサギ IgG Jackson
ImmunoResearch社製；各 1： 200希釈）で室温 1時間更に反応させ、アルカリフォ スファターゼ発色基質（ベクター.レッド； Vector Laboratory社製）を使用して、抗 体の結合を光学顕微鏡 (Leica社製)で可視化した。
[0061] 肝組織の壊死面積の推移を図 5に示す。 IV型コラーゲン染色により、実質的な肝 細胞を特定することができる。 IV型コラーゲン染色により肝細胞索の構築を明確にす る事で細胞壊死範囲を決定し、ウィンノレーフ画像ソフトウェアを使用して、該範囲の 面積を算出した。肝臓切片上少なくとも 15mm2の範囲に渡って計測した。コントロー ル抗体処置群では、 CCL4投与 3日後に、中心静脈領域を中心とした多発性広範囲 の肝細胞壊死が認められたのに対し、抗 CXCL10抗体処置群では壊死範囲が劇的 に減少していた。
[0062] CD31抗体は血管内皮細胞に反応するモノクローナル抗体であり、肝臓では類洞 内皮細胞を検出するのに用いられる。 CCL4投与 3日目の CD31の免疫染色像 (倍 率 20倍）を図 6に示す。コントロール抗体投与群（図 6の上図）では、点線で囲まれた 領域に現れているように、壊死により類洞壁の構築が崩壊しているのに対し、抗 CXC L10抗体処置群（図 6の下図）では類洞壁の構築が明確になってきている。これらの 結果は、抗 CXCL10抗体が、病理学的にも肝細胞傷害を抑制し、なおかつ速やか に類洞の構築を再建させることを示してレ、る。
[0063] [実施例 4]
生体内で実際に肝細胞の再生が起こっているかどうかを調べるため、増殖細胞の 指標となる BrdU (5 _ブロモ _ 2 '—デォキシゥリジン/臭化デォキシゥリジン）の取 込みを解析した。 BrdUはチミジン類似体であり、細胞周期の S期の間に DNA中に 取り込まれる。 BrdUで組織を標識するため、実施例 2および 3と同様に CCLによる 肝障害惹起後に CXCL10抗体処置またはコントロール抗体処置したマウスに、 Brd U (Sigma社製； 500 μ gを 100 μ L中の滅菌 PBSで懸濁した）を尾静脈注射し、 1時 間後に屠殺、肝臓第 2葉を採取し、実施例 1の方法で凍結切片を作成した。 IV型コラ 一ゲンを実施例 3の方法で可視化した後、抗 BrdU抗体を用いた免疫染色（BrdU染 色キット； Zymed社製）を追加し、 S期核を特異的に検出した。組織上の定量も、実施 例 3に記載のごとく行った。
[0064] 定量データの結果を図 7に示す。図 7中、「*」は t 検定による ρ< 0· 05の有意差 が認められたことを示す。 BrdU陽性細胞は、肝実質細胞のみならず、免疫細胞など の非実質細胞にも認められるため、 IV型コラーゲンとの 2重染色により、肝細胞だけ を正確にカウントした。図 7の縦軸（Brdu+hepatocytes (個数/ mm2) )は、 BrdU 抗体染色及び IV型コラーゲン染色により 2重染色された箇所を単位面積あたりの個 数で示したものである。コントロール抗体処置群に比較して、抗 CXCL10抗体処置 群で、 BrdU陽性肝細胞が著明に増加していた。類洞領域について定量ィ匕したとこ ろ、類洞領域においては抗 CXCL10抗体処置群では、 CCL4投与 1から 3日目まで BrdU陽性肝細胞が増加し、 7から 10日目になるとむしろ逆に BrdU陽性肝細胞の 数が減少していた。この結果は、抗 CXCL10抗体により、肝細胞、それも類洞領域 の成熟肝細胞が迅速に増殖し、肝細胞索が再建された後は速やかに休止期に戻る 事を示している。つまり抗 CXCL10抗体は、傷害後の肝再生を促進させる事が、生 体内レベルで実証された。
[0065] [実施例 5]肝組織幹細胞に対する効果
新生仔マウスに、出生後 3日から 5日目までの 3日間に渡って、 BrdU (50 x gを 10 μ L中の滅菌 PBSで懸濁した）を 1日 2回ずつ皮下注射し、 8週間経過を追うと、長期 間に渡って BrdU標識が残存する、細胞周期の遅い肝細胞が検出される。このような BrdU標識長期残存細胞は Label retaining cell (LRC)と呼ばれ、生後 8週のマ ウスにおいては休止期の状態にあり、組織幹細胞としての性質をもつことが知られて いる（総説； Fuchs E， et al. Cell 116 : 769, 2004)。 LRCは月干臓におレヽて は主に門脈域に極少数 (全肝細胞の約 7%)散見され、成熟肝細胞とは異なる肝組 織幹細胞と考えられる。このような標識を施されたマウス（8週令）に実施例 2から実施 例 4と同一の方法で抗 CXCL10抗体またはコントロール抗体投与後に CCL4誘導肝 障害を惹起し、 3日目に屠殺、肝臓第 2葉を採取し、凍結切片を作成した。細胞周期 の S期核を特異的に検出する抗サイクリン A (Cyclin A)抗体（ 100 μ g/mL；ャギ ポリクローナル抗体； Santa Cmz社製）と抗 BrdU抗体を用いた免疫 2重染色により 、屠殺時に増殖している肝細胞と LRCを同時に検出した。 2次抗体としては、 Alexa — 488標識抗ャギ IgG (Molecular Probe社製；各 1： 200希釈）と Alexa— 594標 識ストレブトアビジンを用いた。組織上の定量も、実施例 3に記載のごとく行った。 定量的データの結果を図 8に示す。図 8中、上段は投与前の結果、中段はコント口 ール抗体処置群の結果、下段は抗 CXCL10抗体処置群の結果を示す。図 8中、標 識インデックス（Labeling Index) %は、画像中に表示された全肝細胞を 100%とし 、これに対する各標識部位の面積割合を示したものである。コントロール抗体処置群 の CCL4投与 3日目（図 8中中段の図参照）の肝臓における増殖肝細胞（サイクリン A (Cycline A)陽性細胞）は、全肝細胞の 64. 5% (平均値; n = 5、 15mm2切片、以 下同様）であった。このうち、 LRC由来の増殖細胞（サイクリン A陽性 BrdU陽性）は 3 4. 5% (全肝細胞の 22. 3%)、成熟肝細胞由来と考えられる増殖細胞（サイクリン A 陽性 BrdU陰性）は 65. 5% (全肝細胞の 42. 3%)であり、実際に分裂直後の 2核性 成熟肝細胞も認められている。すなわち、肝障害後の肝細胞再生には、肝組織肝幹 細胞（LRC)のみならず、成熟肝細胞の迅速な分裂 ·複製が関与している事が明らか になった。これに対し抗 CXCL10抗体処置群（図 8中下段の図参照）では実に 88. 4 %もの増殖肝細胞を認め、内訳は LRC由来が 30% (全肝細胞の 26. 5%)、成熟肝 細胞由来が 70% (全肝細胞の 61. 8%)であった。抗 CXCL10抗体により、より有意 に成熟肝細胞の複製が促進された事を示している。
[0067] [実施例 6]正常マウス肝臓における抗 CXCL10抗体の効果
定常状態の C57BL6ZJマウス（雌、 8週齢、 日本クレア社製）に、抗 CXCL10抗体 もしくはコントロール抗体を尾静脈注射し、 6時間後に屠殺、肝臓第 2葉を採取し、凍 結切片を作成した。実施例 4の方法で、屠殺の 1時間前に BrdU (500 z gを 100 z L 中の滅菌 PBSで懸濁した）を尾静脈注射しておき、抗 BrdU抗体で免疫染色を行つ た。
[0068] 結果を図 9に示す。図 9の縦軸（Brdu + hepatocytes (個数/ mm2) )は、 2重染色 された箇所を類洞領域の単位面積あたりの個数で示したものである。図 9中、「*」は t—検定により pく 0. 05の有意差が認められたことを示す。また、縦軸は、単位面積 あたりの免疫染色箇所の数を示す。
[0069] 通常、正常マウスの類洞領域においては BrdU陽性肝細胞はほとんど認められな い（BrdU標識指数 (標識インデックス：実施例 8参照）；全肝細胞の 2. 0%)。しかし、 抗 CXCL10抗体処置により、 BrdU陽性肝細胞が有意に増加した (BrdU標識指数; 全肝細胞の 4. 1 %)。
[0070] [実施例 7]正常マウス肝臓における CXCL10の効果
次に、逆に CXCL10蛋白が肝細胞の増殖や複製を抑制するかどうかを調べた。出 生後 4日目の新生仔マウスに BrdU (50 μ gを 10 μ L中の滅菌 PBSで懸濁した）を 1 回皮下注射し、 1時間後ならびに 7日目（BrdU投与 3日後）に屠殺、肝臓第 2葉を採 取し、凍結切片を作成後免疫染色を行った。この際、出生 3日から 4日後まで CXCL 10の組み替え蛋白質（2mgZkg； R&D system社製）もしくは PBSを皮下注射し ておいた。
[0071] 定量データを図 10に示す。図 10の縦軸（Brdu + hepatocytes (個数 Zmm2) )は 、 2重染色された箇所を単位面積あたりの個数で示したものである。図 10中、「*」は t—検定により p < 0. 05の有意差が認められたことを示す。 PBSを投与したコント口 ール群では、 BrdU投与 1時間後（出生 4日目： d4)において BrdU標識細胞を多数 認めるが、投与 3日目（出生 7日目： d7)において BrdU標識細胞が激減していた。こ れに対し、 CXCL10組み替え蛋白質を投与した群では、投与 3日目（d7)において B rdU標識肝細胞が有意に残存していた。通常、 BrdU標識は出生後の肝細胞の分 裂に伴って迅速に減衰していく。したがって、 CXCL10の投与によって、出生後の肝 細胞の分裂が抑制されたため、その結果として BrdU標識肝細胞が有意に残存した ものと推察される。すなわちこの結果は、 CXCL10が実際に生体レベルで肝細胞の 分裂を抑制する事を示してレ、る。
[0072] [実施例 8]ヒト肝細胞株の増殖における CXCL10、抗 CXCL10抗体の効果
ヒト肝細胞株の増殖における CXCL10、抗 CXCL10抗体の効果。次に、ヒト肝細 胞株 HepG2 (ATCC社製； 2xl04個）を 96穴平底プレート（Nunc社製）を用いて培 養する実験系において、ヒト CXCL10組み替え蛋白質 (R&D systems社製）、抗ヒ ト CXCL10抗体（R&D systems社製）、コントロール抗体をそれぞれ添加し、 3日 間培養した。培養後、 WST— 1溶液 (Takara社製）を 20 μ L/穴加え、 1時間後に 各穴の 550nmの吸光度を測定することにより、該肝細胞株の増殖を測定した。また、 該肝細胞株の RNAを実施例 1の方法で抽出し、ヒト CXCL10の受容体である CXC R3— Aと CXCR3— Bの発現を RT— PCR (94°C45秒、 58°C45秒、 72°C60秒で、 30サイクル）で調べた。
[0073] CXCL10を添加したヒト肝細胞株 HepG2においては CXCR3—Aが強く発現して いたが、 CXCR3— Bの発現は認めなかった（図 11)。すなわち、 CXCL10は CXCR 3 _ Aを介してその機能を発揮する事を示してレ、る。
[0074] 図 12に吸光度の測定結果を示す。図 12中では、吸光度を平均土 SDとして記載し ている。また、「*」は t—検定により pく 0. 05の有意差が認められたことを示す。マウ スで投与した濃度の抗 CXCL10抗体は、ヒト肝細胞株 HePG2の増殖を有意に促進 した。これらの結果は、 in vitroにおいても高濃度の CXCL10が直接的にヒト肝細 胞の分裂 ·増殖を制御している事を示すものである。
[0075] [実施例 9] Streptozotocin誘発性 C57BL6j/jcL 2型糖尿病（NIDDM)モデル マウスにおける抗 CXCL 10抗体の効果：ブドウ糖負荷試験
妊娠 14日目の C57BL6jZjcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出生 後 2日令の C57BL6jZjcLマウス 雌（日本クレア社製）の各々に、 Streptozotocin 10mg/mL (SIGMA社製）を 20 μ L/head皮下注射した。 4週令まで CE— 2 (日 本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、 4週令より High Fat Diet食（日本ク レア社製）、滅菌水を与え、 2週間飼育した。 2週間目に、抗 CXCL10抗体を ΙΟΟ μ g ΖΐΟΟ μ L含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体を ΙΟΟ μ gZlOO z L含むリン酸緩 衝液を、 2回 Z1週間、腹腔内投与（IshotZl週間）の 4回（処置期間：2週間）投与 する処置を行った。 14日目に抗体の効果を検討するための実験を施行した。
[0076] 実験 13日目より、 15時間の絶食を施し、 14日目に D—グルコース（SIGMA社製；
2gZkg)を腹腔内に注射した。注射前 (0分)、注射後 30分、 120分後に眼窩採血を 施行し、ダルテストエース血糖値測定器 (ボンビックス薬品社製）を用いて血糖値を測 定した。
図 13に結果を示す。図 13は、正常（未処置）マウス群、ならびに 2型糖尿病（NID DM)モデルマウスにおける抗 CXCL10抗体投与群、対照抗体投与群における、ブ ドウ糖負荷後、 0分後、 30分後、 120分後の血糖値の変動を示す図である。図中、縦 軸は血糖値 (mg/dL)、横軸は負荷後の測定時間（min)を示す。また、「 *」は t— 検定により pく 0. 05にて有意差があったことを示す。
[0077] 対照抗体投与群ではグルコース負荷後 30分、 120分の血糖値はそれぞれ 620土 168mg/dL (n = 5)、 405土 156mg/dL (n= 5)と顕著に増加してレ、た。 10週齢 の未処置 C57BL6j/jcLマウス（日本クレア社製）においてはそれぞれ 270 ± 36m gZdL (n = 5)、 147 ± 21mgZdL (n = 5)であり、これが正常値の範囲であることか ら、本実験モデルにおいて対照群マウスは、耐糖能異常を来している事が明らかに なった。一方、抗 CXCL10抗体投与群では、それぞれ 284± 80mgZdL (n = 5)、 1 48 ±43mg/dL (n = 5)にとどまっており、対照群に比較して有意（有意差、各々 p =0. 017、 p = 0. 026、 t_検定）な低値を示した。したがって、抗 CXCL10抗体投 与により、 NIDDMマウスモデルにおける耐糖能異常が有意に改善される事が判明 した。
[0078] [実施例 10] Streptozotocin誘発性 C57BL6jZjcL 2型糖尿病（NIDDM)モ デルマウスにおける抗 CXCL 10抗体の効果:インスリン抵抗性試験
実施例 9と同一の方法で NIDDMモデルを作製し、インスリン抵抗性試験を行った 。実施例 9の飼育条件において、絶食処置無しに、実験 14日目に、 Human cryst alline insulin (0. 75U/kg)を腹腔内投与処置した。 0分後（インスリン投与前）、 1 5分後、 60分後の血糖値を、グノレテストエース血糖値測定器 (ボンビックス薬品社製） で測定した。図 14に結果を示す。図 14は、正常 (未処置）マウス群、ならびに 2型糖 尿病（NIDDM)モデルマウスにおける抗 CXCL10抗体投与群、対照抗体投与群に おける、インスリン負荷後、 0分後、 15分後、 60分後の血糖値の変動を示す図である 。図 14中、縦軸は血糖値 (mg/dL)、横軸は負荷後の測定時間（min)を示す。また 、「* *」は t—検定において p< 0. 01で有意差があったことを示す。
[0079] 10週齢の未処置 C57BL6j/jcLマウス（日本クレア社製）においては、 0分、 15分 、 60分値は各々、 125 ± 12mg/dL (n = 5)、
Figure imgf000030_0001
、 47. 8 ± 7. 7mg/dL (n= 5)であり、インスリン投与に反応して血糖値が良好に低下して いた。対照抗体投与群では、各々、 448· 2 ± 72mg/dL (n= 5)、 433. 8 ± 138m g/dL (n = 5)、
Figure imgf000030_0002
と、インスリン投与前から高血糖を示す のみならず、インスリンに対する反応性が低ぐ血糖値が高値のまま推移した。すなわ ち、本 NIDDMモデルにおいては、インスリン感受性が悪い、つまりインスリン抵抗性 を示していると判定できた。これに対し、抗 CXCL10抗体投与群では、各々、 409. 3 ± 35mg/dL (n = 5) , 210. 6 ± 59mg/dL
Figure imgf000030_0003
と 、インスリン投与前は高血糖を示すものの、インスリン投与に極めて良好に反応し血 糖値が低下してきた。対照抗体投与群と比較すると、インスリン投与後の血糖値は有 意差（有意差、各々 p = 0. 31、 p = 0. 005、 p = 0. 0005、 t—検定）を持って低下し ていた。したがって、抗 CXCL10抗体は、インスリン抵抗性を改善させる効果を有し ている事が明らかになった。
[0080] [実施例 11] Streptozotocin誘発性 C57BL6jZjcL 2型糖尿病（NIDDM)モ デルマウスにおける、肝臓インスリン受容体を介したインスリン取り込み能：
妊娠 14日目の C57BL6jZjcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出生 後 2日令の C57BL6jZjcLマウス 雌（日本クレア社製）の各々に、 Streptozotocin 10mgZmL (SIGMA社製）を 20 μ L/head皮下注射した。 4週令まで CE_ 2 (日 本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、 4週令より High Fat Diet食（日本ク レア社製）、滅菌水を与え、 2週間飼育した。 2週間目に、抗 CXCL10抗体を 100 /i g ΖΐΟΟ μ L含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体 ΙΟΟ μ g/ΐθθ μ Lを含むリン酸緩 衝液を腹腔内投与した。その 2時間後に、肝臓におけるインスリン受容体が機能して くるかどうかを解析する目的で、 FITC標識インスリン (モレキュラープローブ社製； 0. 75U/kg)を腹腔内投与し、 30分後に実施例 1の方法に基づき、肝臓の凍結切片 を作成した。
[0081] 各切片を顕微鏡にて観察したところ、対照抗体投与群ではインスリンの肝臓への結 合がほとんど認められないのに対し、抗 CXCL10抗体投与群の肝臓では、インスリン の結合が顕著に増加していた。本実施例におけるインスリンの結合能は、インスリン 受容体の機能を示すものと認められる。したがって、抗 CXCL10抗体投与により、肝 臓におけるインスリン取り込みの増力 Q、すなわち、インスリン反応性'感受性が明確に 改善していると結論できる。
[0082] [実施例 12] Streptozotocin誘発性 C57BL6j/jcL 2型糖尿病（NIDDM)モ デルマウスにおける、肝細胞の βカテニンの細胞内移行：
妊娠 14日目 の C57BL6J/JCLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出 生後 2日令の C57BL6j/jcLマウス 雌（日本クレア社製）の各々に、 Streptozoto cin 10mg/mL (SIGMA社製）を 20 μ L/head皮下注射した。 4週令まで CE— 2 (日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、 4週令より High Fat Diet食（日 本クレア社製）、滅菌水を与え、 2週間飼育した。 2週間目に、抗 CXCL10抗体を 10 Ο μ gZlOO x L含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体 100 z g/100 ζ Lを含むリン 酸緩衝液を腹腔内投与した。その 2時間後に、実施例 1の方法に基づき肝臓の凍結 切片を作製し、実施例 5と同様に、蛍光免疫 2重染色で解析した。蛍光免疫 2重染色 は、一次抗体には抗 βカテニン抗体 (R&D社製）、 IV型コラーゲン抗体を使用し、 各々 Alexa 647標識抗ラビット IgG (モレキュラープローブ社製）、 Alexa 564標識 抗ラビット IgG (モレキュラープローブ社製）で青、赤として検出したほかは実施例 5と 同様にして行った。
[0083] 免疫染色後の各切片を顕微鏡で観察したところ、対照群では βカテニンが肝細胞 膜で検出されるのに対し、抗 CXCL10抗体投与群では、 /3カテニンが細胞質、一部 細胞核内に移行している像が認められた。これは、抗 CXCL10抗体により、肝細胞 膜の βカテニンが核内に移行してくる事を示す。すなわち、抗 CXCL10抗体による 肝細胞複製の機序の一つとして、 βカテニンの細胞内シグナルを制御しているという 、全く新規の、予想外の機序が判明した。
[0084] [実施例 13] Streptozotocin誘発性 C57BL6jZjcL 2型糖尿病（NIDDM)モ デルマウスにおける、肝細胞の c_Myc発現の増強：
妊娠 14日目 の C57BL6J/JCLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出 生後 2日令の C57BL6jZjcLマウス 雌（日本クレア社製）の各々に、 Streptozoto cin 10mg/mL (SIGMA社製）を 20 μ L/head皮下注射した。 4週令まで CE— 2 (日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、 4週令より High Fat Diet食（日 本クレア社製）、滅菌水を与え、 2週間飼育した。 2週間目に、抗 CXCL10抗体を 10 Ο μ g/ΐθθ μ L含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体を 100 μ g/ 100 μ L含むリン 酸緩衝液を腹腔内投与した。その 2時間後に、実施例 1の方法に基づき肝臓の凍結 切片を作製し、実施例 5と同様に、免疫染色で解析した。免疫染色において、一次 抗体には抗リン酸化 c— Myc抗体 (バイオビジョン社製）を使用し、抗ラビット IgGで青 として検出したほかは実施例 5と同様にして行った。
[0085] 免疫染色後の各切片を顕微鏡で観察したところ、対照群では c— Mycのリン酸化 がほとんど認められないのに対し、抗 CXCL10抗体投与群では、 c— Mycのリン酸 化所見が認められた。これは、抗 CXCL10抗体による j3カテニンの核内移行に伴い 、 c_Mycのリン酸化が起こってくる事を示している。肝細胞の c_Mycの発現は、肝 臓における糖代謝の改善を促進する事が報告されており（Vaeva A et al. FAS EB J.9 : 1067— 1078, 1995.及び Riu E et al. FASEB J.fj. 02_ 1163fje . Published online July 18, 2003. )、この機序にぉレヽても抗 CXCL10抗体力 S 、肝臓の糖代謝を改善するための役割を果たしている事が判明した。
産業上の利用可能性
[0086] 本発明は、肝細胞を増殖しょうとする場合に有用である。例えば、本発明は、さまざ まな肝臓疾患等により、肝細胞を増殖させることが望ましい場合に有効である。また、 肝組織の移植などにより、肝組織の再生を図る場合などにも有効である。
また、本発明は、インスリン抵抗性の改善を意図する場合にも有用である。例えば、 2型糖尿病（NIDDM)患者やメタボリック症候群患者のようなインスリン抵抗性を呈す る患者において、肝細胞におけるインスリンの反応性や感受性を増強し、耐糖能異 常の改善を図る場合に有効である。

Claims

請求の範囲
[I] ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤を有効成分とする肝細胞複製促 進剤。
[2] 少なくとも成熟肝細胞の複製を促進することを特徴とする、請求項 1に記載の肝細 胞複製促進剤。
[3] 損傷した肝組織における肝細胞の複製を促進することを特徴とする、請求項 1また は 2に記載の肝細胞複製促進剤。
[4] 前記損傷が、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷および病原体を 原因とする損傷からなる群より選択される損傷である、請求項 1から 3のいずれか一項 に記載の肝細胞複製促進剤。
[5] 前記毒性物質を原因とする損傷が、アルコール性肝炎および薬剤誘発性肝障害 力もなる群より選ばれる疾患による損傷である、請求項 4に記載の肝細胞複製促進剤
[6] 前記病原体が肝炎ウィルスである、請求項 1から 3のいずれか一項に記載の肝細胞 複製促進剤。
[7] 前記機械的傷害による損傷が、肝臓移植、細胞移植および外科的部分肝切除か らなる群より選ばれる原因による損傷である、請求項 4に記載の肝細胞複製促進剤。
[8] 前記損傷が、脂肪性肝炎による損傷である、請求項 4に記載の肝細胞複製促進剤
[9] 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10の活性 を抑制する因子である請求項 1から 8のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
[10] 前記活性を抑制する因子が、抗 CXCL10抗体である請求項 9に記載の肝細胞複 製促進剤。
[I I] 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10の発現を抑制する因子である請求項
1から 8のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
[12] 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に対する受容体の拮抗剤である請求 項 1から 8のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
[13] ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤の、肝細胞複製促進剤を製造す るための利用。
[14] ケモカインの 1種である CXCLIOに対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与する 工程を含む、肝細胞の増殖促進方法。
[15] ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤を有効成分とするインスリン抵抗 性改善剤。
[16] メタボリック症候群におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、請求項 1
5に記載のインスリン抵抗性改善剤。
[17] 2型糖尿病におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、請求項 15に記 載のインスリン抵抗性改善剤。
[18] 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に特異的に結合し、 CXCL10の活性 を抑制する因子である請求項 15から 17のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性 改善剤。
[19] 前記活性を抑制する因子が、抗 CXCL10抗体である請求項 18に記載のインスリン 抵抗性改善剤。
[20] 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10の発現を抑制する因子である請求項
15から 17のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
[21] 前記 CXCL10に対する中和剤力 CXCL10に対する受容体の拮抗剤である請求 項 15から 17のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
[22] ケモカインの 1種である CXCL10に対する中和剤の、インスリン抵抗性改善剤を製 造するための利用。
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