WO2006114322A1 - Verwendung von tlr- und/oder nod2-liganden zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung einer krankheit des zentralen nervensystems - Google Patents

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WO2006114322A1
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Hermann SCHLÜSENER
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
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Definitions

  • TLR and / or Nod2 ligands for the manufacture of a medicament for the treatment of a central nervous system disease
  • the present invention relates to the use of at least one TLR and / or Nod2 ligand for the manufacture of a medicament for the treatment of a central nervous system ailment and to pharmaceutical compositions containing at least one TLR and / or Nod2 ligand for treating a disease of the CNS.
  • Central nervous system disorders include a variety of neurological and neuropsychiatric disorders. see diseases such as neurodegenerative diseases, behavioral disorders, mood disorders and cognitive disorders. These diseases are often associated with genetic predispositions, allergies, drug side effects, traumatic injuries or cerebrovascular events, such as aneurysms or strokes. There are also some CNS disorders that are triggered without obvious causes.
  • neuronal diseases such as Parkinson's, Alzheimer's, multiple sclerosis or amyotrophic lateral sclerosis, are based on the destruction of neuronal leads. The goal of therapy must therefore be to regenerate or replace these neuronal lines.
  • One approach to treating such neurological diseases is by transplanting cells to at least partially restore the neural circuits. Thereafter, it should be possible to regenerate or replace injured or dead neural tissue by transplanting neuronal stem cells.
  • neuronal progenitor cells persist in the brain and spinal cord, which may contribute to the regeneration of injured tissue in neuronal injuries.
  • Stem cells / progenitor cells are responsible for tissue homeostasis and repair.
  • TLR and / or Nod2 ligands for the preparation of a medicament, which is used for the treatment of neuronal CNS diseases.
  • the object is further achieved by the provision of a pharmaceutical composition for the treatment of CNS diseases.
  • tions wherein the pharmaceutical composition contains at least one TLR and / or Nod2 ligands.
  • the object is achieved by the use of a TLR and / or Nod2 ligand for the manufacture of a medicament prepared for the treatment of the CNS, which is treatable by stimulating the growth, proliferation or differentiation of neuronal progenitor cells.
  • the inventors have shown in their own experiments that by the administration of TLR or Nod2 ligands a proliferation of neuronal stem cells could be achieved. This creates the possibility of regenerating or replacing destroyed tissue by proliferation and differentiation of neuronal progenitor cells, for example in the spinal cord. In this way, diseases of the CNS can be treated, which are based on the destruction or impairment of neural leads or neuronal tissue.
  • the Nod2 receptor and Toll-like receptors are transmembrane proteins of immune cells that play a key role in the innate immune system. In addition, they show a connection between the innate and the adaptive immune system in vertebrates.
  • the receptors were first discovered in the fruit fly Drosophila melanogaster, but are highly homologous to corresponding receptors in mammalian immune cells. Their function is the detection of pathogens and the triggering of a Iunununreaction of cells directed against these pathogens.
  • the receptors Due to the specificity of Nod2 and Toll-like receptors, the receptors must recognize determinants that are predominantly expressed by microorganisms, whereas host determinants are rarely recognized. Therefore, the TLRs recognize molecules or parts of molecules of a pathogenic organism that are extremely well conserved. Well conserved examples are e.g. bacterial cell surfaces, lipopolysaccharides (LPS), lipoproteins, lipopeptides, proteins such as flagellin, double-stranded RNA from viruses, etc.
  • LPS lipopolysaccharides
  • lipoproteins lipoproteins
  • lipopeptides proteins such as flagellin, double-stranded RNA from viruses, etc.
  • Nod2 and TLR are key receptors by which mammals can recognize the presence of infection by identifying specific biomolecules derived from microorganisms. These biomolecules represent pathogen-associated molecular patterns (hereafter referred to as "PAMPs") .
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • TLR2 Structurally similar TLRs usually respond to the same types of ligands.
  • TLR2 is essential in the recognition of peptidoglycans such as N-acetylmuramyl-dipeptide
  • TLR3 is involved in the recognition of double-stranded RNA derived from viruses
  • TLR4 is particularly activated by LPS.
  • Natural ligands for TLR9 are bacterial oligonucleotides having CpG motifs.
  • the Nod2 receptor recognizes muramyldipeptides (MDP).
  • Nod2 and TLR signaling pathways Activation of the Nod2 and TLR signaling pathways by different ligands leads to Expression of many genes that are defensive in the host, such as inflammatory cytokines, chemokines, MHC (major histocompatibility complex) molecules, co-stimulatory molecules, and various effector molecules.
  • the medicament be prepared to treat a disease of the CNS, the disease being selected from the group comprising amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, muscular dystrophy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and other degenerative processes of the CNS, e.g. be triggered by vascular undersupply.
  • a disease of the CNS the disease being selected from the group comprising amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, muscular dystrophy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and other degenerative processes of the CNS, e.g. be triggered by vascular undersupply.
  • Amyotrophic lateral sclerosis is characterized, for example, by a progressive degeneration of the first and second neurons in the spinal cord and in the elongated medulla; in multiple sclerosis, a medullary decay is observed.
  • Parkinson's disease the substantia nigra is degenerated in the midbrain.
  • Nod2 or TLR ligands represents an excellent therapeutic approach for the treatment of the respective nerve endings.
  • the medicament can be prepared for treating a disease of the CNS, the disease being a consequence of traumatic injury to the CNS.
  • Spinal cord lesions can also be treated by stimulating the proliferation or differentiation of intact neuronal progenitor cells by Nod2 or TLR ligands.
  • To the Spinal cord lesions include, for example, traumatic injuries to the CNS or ischemic lesions, which may be, for example, consequences of a stroke. These injuries can also lead to paralysis of the limbs as motor neurons are destroyed. Therefore, the drug can also be used to treat stroke-induced CNS ischemic lesions.
  • Nod2 or TLR ligand which is selected from the group comprising lipopolysaccharides (LPS), R848, poly inosine polycytidylic acid (poly I: C), N-acetylmuramyl-dipeptide , or derivatives thereof.
  • LPS lipopolysaccharides
  • R848 poly inosine polycytidylic acid
  • N-acetylmuramyl-dipeptide or derivatives thereof.
  • TLR ligands were administered peripherally.
  • the lipopolysaccharide is a characteristic component of the complex outer wall layer (outer membrane) of Gram-negative bacteria (bacterial cell wall).
  • the lipopolysaccharide molecules are synthesized in the cell on the cytoplasmic membrane and transported to the outside in a carrier-bound state.
  • the lipopolysaccharides for example, the Enterobacteriaceae are constructed very similar. However, other Gram-negative bacterial families may have a very different lipopolysaccharide structure. Lipopolysaccharide is recognized by TLR4.
  • R848, an imidazoquinoline derivative is recognized in humans by TLR7 and TLR8 and is also referred to as resquimod.
  • Poly I: C is a synthetic homopolymer that closely resembles viral RNA.
  • PoIy I: C is recognized by TLR3.
  • N-acetylmuramyl-dipeptide is a derived building block of the polysaccharide chains of murein and thus part of the cell walls (bacterial cell wall) of many bacteria and is recognized by the Nod2 receptor.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing at least one Nod2 and / or TLR ligand for treating a disease of the CNS.
  • the pharmaceutical composition is used to treat a disease of the CNS selected from the group comprising amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, muscular dystrophy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease.
  • the pharmaceutical composition may contain only one Nod2 or TLR ligand, but also different Nod2 and TLR ligands may be used in combination.
  • the pharmaceutical composition may further contain other ingredients and / or carriers commonly employed in the preparation of a pharmaceutical composition to be administered.
  • ingredients include, for example, diluents, binders, suspending agents, lubricants, stabilizers, etc. These include, but are not limited to, eg, water, saline, alcohols, vegetable oils, polyethylene glycols, monoglycerides, etc. An overview Such ingredients are found, for example, in A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
  • the composition will be formulated, that is, for example, when injected in the form of liquid preparations. Administration may also be systemically or locally directed, depending on the patient and the condition.
  • composition may also contain other active ingredients or drugs, such as interferons, epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), as well as cytokines, chemokines, complement system proteins and / or cell adhesion molecules that can modulate the role of neural progenitor cells in tissue homeostasis.
  • active ingredients or drugs such as interferons, epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), as well as cytokines, chemokines, complement system proteins and / or cell adhesion molecules that can modulate the role of neural progenitor cells in tissue homeostasis.
  • the administration amounts depend on the particular disease as well as the patient, whereby factors such as age and weight must be taken into account.
  • Fig. 1 The distribution and quantification of BrdU + cells in the spinal cord on days 2 and 3 after injection of different TLR ligands:
  • FIG. 4 Investigation of inhibition of poly I C-mediated cell activation after administration of dexamethasone and indomethacin:
  • Phosphorothioate CpG ODN (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3 '; SEQ ID NO: 1) was synthesized by MWG-Biotech AG (Ebersberg, Germany).
  • Pam3Cys (5 mg / kg), N-acetylmuramyl-dipeptide (1 mg / kg), Poly I: C (5 mg / kg), LPS (1 mg / kg), R848 (1 mg / kg) or PS CpG- ODN (5 mg / kg) was injected intraperitoneally.
  • the control group was also injected intraperitoneally with 1 ml of phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • dexamethasone 5 mg / kg
  • indomethacin (2 mg / kg) was injected 2 hours after poly I: C administration.
  • rats were sacrificed at different time points after injection as shown below. Two days before sacrifice, the rats received BrdU injections (50 mg / kg, intraperitoneally) twice daily at 8-hour intervals. Following this, the rats were anesthetized with diethyl ether; 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS was then administered intracardially. The spinal cord was removed in each case and post-fixed in 4% PFA overnight at 4 ° C. The spinal cord was divided into 8 mm sections and embedded in paraffin, serially cut (3 ⁇ m) and placed on silanized slides.
  • BrdU injections 50 mg / kg, intraperitoneally
  • PFA paraformaldehyde
  • mice were incubated with 10% normal pig serum (Biochem, Berlin, Germany) to block non-specific binding of immunoglobulins and tested with the following mouse monoclonal antibodies: ED-I (Anti-Rat, Serotec, Oxford, UK, 1 : 100) for the detection of activated microglia, GFAP for the detection of astrocytes, W3 / 13 for the detection of T-lymphocytes (all Serotec), Nestin (Chemicon, Planegg-Munich, Germany, 1: 500) for the detection of stem / progenitor cells and BrdU (Anti-BrdU, BD Pharmingen, San Diego, 1: 100) for the detection of proliferating cells.
  • ED-I Anti-Rat, Serotec, Oxford, UK, 1 : 100
  • GFAP for the detection of astrocytes
  • W3 / 13 for the detection of T-lymphocytes (all Serotec)
  • Nestin Chemicon, Planegg-Munich
  • the binding of the antibodies to animal tissue was visualized by means of biotinylated rabbit anti-mouse IgG F (ab) 2 antibody fragments (DAKO, Hamburg, Germany, 1: 400). Subsequently, the sections were incubated with a streptavidin-avidin-biotin complex (DAKO, Hamburg, Germany) and subsequently developed with diaminobenzidine (DAB) substrate (Fluka, Neu-Ulm, Germany). Finally, the sections were counterstained with hematoxylin.
  • the slides were pretreated with the spinal cord sections as described above and subsequently incubated with the respective monoclonal antibody. Subsequently, a reaction was carried out with the secondary antibody (biotinylated rabbit anti-mouse IgG) at a dilution of 1: 400 in TBS-BSA for 30 minutes and with an alkaline phosphatase-conjugated ABC complex diluted 1: 400 in Tris-BSA for 30 minutes. Subsequently, immunostaining with Fast Blue BB salt-chromogen substrate solution was developed. Subsequently, the slides were again cooked in citrate buffer in a microwave for 15 minutes and immuno-labeled as described above.
  • the secondary antibody biotinylated rabbit anti-mouse IgG
  • the spinal tissue sections were divided into groups of eight to twelve sections of different regions of the spinal cord. For immunohistochemistry, the stained sections were examined by light microscopy. The number of BrdU-labeled cells in the gray matter, white matter and around the central channel was determined by manual counting under twenty times magnification. The number of ED-I + was counted on average throughout the spinal cord. The region of gray and white matter of the spinal cord incisions was made using the Axio Vision LE ReI.4.1 (Carl Zeiss Vision GmbH) software evaluated. The results for the white and gray matter are given as arithmetic means of the positive cells per mm 2 and were standardized.
  • the number of ependymal cells are given and standardized as arithmetic mean BrdU-positive cells per spinal cord incision. Statistical analysis was performed by ANOVA and Dunnett's Multiple Comparison Test (Graph Päd Prism 4.0 software). Data with p ⁇ 0.05 were considered statistically significant.
  • mice were injected intraperitoneally with TLR ligands and proliferating cells labeled by intraperitoneal injection of BrdU (BrdU is a thymidine analogue generated during cell division is incorporated into DNA). Proliferating cells were detected by immunohistochemistry with anti-BrdU antibodies.
  • the rats were injected with BrdU for two days, followed by immunohistologic proliferation of the neuronal progenitor cells.
  • BrdU + cells were distributed in the spinal cord over the white and gray matter. Nevertheless, a higher density of BrdU + cells could be detected in the white matter of all groups compared to the gray matter (see Fig. IA).
  • ED-I and BrdU double staining showed that ED-I positive microglial cells were rarely BrdU positive.
  • the ependymal cells around the central canal of the spinal cord are considered to be neuronal stem cells.
  • proliferation of ependymal cells in the normal spinal cord tissue could be observed, however, the TLR ligands did not induce a significant increase in the number of ependymal BrdU + cells (see FIG. 1B, average number of ependymal BrdU + cells in FIG Control group is equal to 1.1 ⁇ 0.40).
  • the highest density of BrdU + cells was found to be 111.2 ⁇ 7.67 cells / mm 2 in the white matter and 72.22 ⁇ 2.8 cells / 2 now in the gray matter in the spinal cord of Rats were administered to BrdU on days 2 and 3 (compared to the control group the differences are significant (p ⁇ 0.05)). At later times, the density of BrdU + cells rapidly decreased to basal levels (see Fig. 2B).
  • the spinal cord sections were stained with the monoclonal antibody ED-I and examined by light microscopy.
  • a significant increase in ED-1 + cells was observed four days after poly I: C injection (see FIG. 3A, average density of treated and control groups are 9.1 cells / mm 2 ⁇ 0.99 and 0, 91 cells / mm 2 ⁇ 0.24, p ⁇ 0.05).
  • C injection see FIG. 3A, average density of treated and control groups are 9.1 cells / mm 2 ⁇ 0.99 and 0, 91 cells / mm 2 ⁇ 0.24, p ⁇ 0.05.
  • Even on day 6 post-injection a significant increase in ED-1 + cells was observed (5.2 cells / mm 2 ⁇ 0.35, p ⁇ 0.05).
  • the density of ED-1 + cells reached a maximum on day 4 post-injection (3.1 cells / mm 2 ⁇ 0.35, p ⁇ 0.05), but decreased on day 5 injection (2.4 cells / mm 2 ⁇ 0.25, p ⁇ 0.05) and decreased to baseline on day 6 post-injection (see Fig. 3B).
  • PoIy I C was used as a stimulus and subsequently investigated whether treatment with a cyclooxygenase blocker, indomethacin, passing through the blood-brain barrier cin, or a potent synthetic corticosteroid, defamethasone, that inhibited cell activation in the spinal cord.
  • neural progenitor cells can be temporarily stimulated to proliferate in the spinal cord by the peripheral administration of certain Nod2 and / or TLR ligands.
  • the number of proliferating cells was during the day 2-3 after the injection the strongest and then quickly dropped to ground level.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von zumindest einem TLR-Liganden (Toll-ähnlichem Rezeptorliganden) und/oder einem Nod2-Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit des zentralen Nervensystems (ZNS). Insbesondere wird das Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit hergestellt, die durch die Stimulation des Wachstums der Proliferation oder der Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen behandelbar ist. Für die Herstellung des Arzneimittels wird insbesondere ein Nod2- und/oder TLR-Ligand eingesetzt, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Lipopolysaccharide (LPS), R848, Polyinosin-Polycytidylsäure, N-acetylmuramyl-dipeptid, oder Derivate davon.

Description

Verwendung von TLR- und/oder Nod2-Liqanden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit des zentralen Nervensystems
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von zumindest einem TLR- und/oder Nod2-Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit des zentralen Nervensystems sowie pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend zumindest einen TLR- und/oder Nod2-Liganden zur Behandlung einer Krankheit des ZNS.
Erkrankungen des zentralen Nervensystems (im Folgenden: ZNS) umfassen eine Vielzahl von neurologischen und neuropsychiatri- sehen Krankheiten, wie bspw. neurodegenerative Krankheiten, Verhaltensstörungen, Gemütskrankheiten und kognitive Störungen. Die genannten Erkrankungen werden oftmals mit genetischen Veranlagungen, Allergien, Arzneimittel-Nebenwirkungen, traumatischen Verletzungen oder cerebrovaskulären Vorgängen, wie bspw. Aneurysmen oder Hirnschlägen, in Verbindung gebracht. Ferner gibt es einige ZNS-Erkrankungen, die ohne erkennbare Ursachen ausgelöst werden.
Viele neurologische Krankheitszustände gehen jedoch mit einem durch eine Krankheit oder eine Verletzung ausgelösten Verlust bestimmter Zellpopulationen des Nervensystems einher, wobei die zerstörten Zellen nicht durch funktionsfähige Zellen ersetzt werden können. Viele neuronale Krankheiten, wie bspw. Parkinson, Alzheimer, Multiple Sklerose oder Amyotrophische Lateralsklerose beruhen auf einer Zerstörung neuronaler Leitungen. Ziel einer Therapie muss daher sein, diese neuronalen Leitungen wieder zu regenerieren bzw. zu ersetzen.
Ein Ansatz zur Behandlung solcher neurologischer Krankheiten stellt die Transplantation von Zellen dar, durch welche die neuronalen Schaltkreise zumindest teilweise wieder hergestellt werden sollen. Danach sollte es möglich sein, durch Transplantation von neuronalen Stammzellen verletztes oder abgestorbenes Nervengewebe zur regenerieren oder zu ersetzen.
Um mit diesem Ansatz Erfolge zu erzielen, müssen jedoch viele verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, die von Krankheit zu Krankheit und von Patient zu Patient unterschiedlich sind und jeweils berücksichtigt werden müssen, und die damit diese Therapie sehr aufwändig, kostspielig und kompliziert machen. Ein anderer Ansatz ist die medikamentöse Behandlung, wobei insbesondere solche Arzneimittel eingesetzt werden, die die Verfügbarkeit von Neurotransmittern erhöhen.
Dieser Ansatz ist jedoch in seinem Wirkungsspektrum sehr begrenzt und oftmals mit starken Nebenwirkungen verbunden.
Neuere Erkenntnisse zeigten, dass im Gehirn und im Rückenmark neuronale Vorläuferzellen persistieren, die bei neuronalen Verletzungen zur Regeneration des verletzten Gewebes beitragen können. Stammzellen/Vorläuferzellen sind für die Gewebehomöostase und -reparatur verantwortlich. Im Rückenmark sorgt die dort vorliegende Population von neuronalen Vorläuferzellen (neuronal progenitor cells, NPC) für diese Regenerierungsprozesse. Ferner konnte gezeigt werden, dass neuronale Stammzellen abgestorbene und absterbende Zellen sowie abgestorbene neuronale Leitungen im degenerativen ZNS ersetzen können.
Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Therapieansätze und insbesondere Substanzen bereitzustellen, mit welchen neuronale Krankheiten effektiv und einfach bekämpft werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von TLR- und/oder Nod2-Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels gelöst, welches zur Behandlung von neuronalen ZNS-Krankheiten eingesetzt wird.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von ZNS-Erkran- kungen, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest einen TLR- und/oder Nod2-Liganden enthält.
Ferner wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines TLR- und/oder Nod2-Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels, welches zur Behandlung des ZNS hergestellt wird, welche durch Stimulation des Wachstums, der Proliferation oder der Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen behandelbar ist.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst.
Die Erfinder haben in eigenen Versuchen gezeigt, dass durch die Verabreichung von TLR- oder Nod2-Liganden eine Proliferation von neuronalen Stammzellen erreicht werden konnte. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, durch die Proliferation und Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen — bspw. im Rückenmark —, zerstörtes Gewebe zu regenerieren bzw. zu ersetzen. Auf diese Weise können Krankheiten des ZNS behandelt werden, denen eine Zerstörung bzw. Beeinträchtigung neuronaler Leitungen oder neuronalen Gewebes zu Grunde liegt.
Der Nod2-Rezeptor und die Toll-ähnlichen Rezeptoren (oder toll- like receptors, im Folgenden: TLR) sind Transmembranproteine von Immunzellen, die beim angeborenen Immunsystem eine Schlüsselrolle spielen. Darüber hinaus zeigen sie eine Verbindung zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem in Wirbeltieren. Die Rezeptoren wurden zuerst in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster entdeckt, sind jedoch zu entsprechenden Rezeptoren in Immunzellen von Säugern stark homolog. Ihre Funktion ist die Erkennung von Pathogenen und die Auslösung einer Iitununreaktion von Zellen, die gegen diese Pathogene gerichtet ist.
Auf Grund der Spezifität der Nod2 und Toll-ähnlichen Rezeptoren müssen die Rezeptoren Determinanten erkennen, die überwiegend von Mikroorganismen exprimiert werden, wohingegen Wirtsdeterminanten selten erkannt werden. Daher erkennen die TLR Moleküle oder Teile von Molekülen eines pathogenen Organismus, die extrem gut konserviert sind. Gut konservierte Beispiele sind z.B. bakterielle Zeil-Oberflächen, Lipopolysaccharide (LPS), Lipoproteine, Lipopeptide, Proteine wie Flagellin, doppelsträngi- ge RNA von Viren, etc .
Nod2 und TLR sind Schlüsselrezeptoren, durch welche Säugetiere das Vorliegen einer Infektion erkennen können, und zwar durch Identifizierung spezifischer Biomoleküle, die von Mikroorganismen abstammen. Diese Biomoleküle stellen pathogen-assoziierte molekulare Muster dar (pathogen-associated molecular patterns, im Folgenden „PAMPs"). Die Freisetzung der PAMPs während einer Infektion bildet das Signal für die Nod2 und TLRs und löst die angeborene Immunantwort aus .
Strukturell ähnliche TLR reagieren meist auf gleiche Typen von Liganden. TLR2 ist bspw. essentiell bei der Erkennung von Pep- tidoglykanen wie N-acetylmuramyl-dipeptid, TLR3 ist bei der Erkennung von doppelsträngiger RNA beteiligt, die von Viren abgeleitet ist, und TLR4 wird insbesondere durch LPS aktiviert. Natürliche Liganden für TLR9 sind bakterielle Oligonucleotide, die CpG-Motive aufweisen. Der Nod2-Rezeptor erkennt Muramyldi- peptide (MDP). Die Aktivierung der Nod2 und TLR- Signalisierungswege durch unterschiedliche Liganden führt zur Expression vieler Gene, die im Wirt zur Verteidigung dienen, wie bspw. inflammatorische Zytokine, Chemokine, MHC (major histocompatibility complex) -Molehüle, co-stimulierende Moleküle und verschiedene Effektormoleküle.
Insbesondere ist bevorzugt, wenn das Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit des ZNS hergestellt wird, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Amyotrophe Lateralsklerose, Multiple Sklerose, Muskeldystrophie, Alzheimer Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, und andere degenerative Prozesse des ZNS, die z.B. durch vaskuläre Unterversorgung ausgelöst werden.
Die Amyotrophe Lateralsklerose zeichnet sich bspw. durch eine fortschreitende Degeneration des ersten und zweiten Neurons im Rückenmark und im verlängerten Mark aus, bei der Multiplen Sklerose ist ein Markscheidenzerfall zu beobachten. Bei der Parkinsonschen Krankheit ist die Substantia nigra im Mittelhirn degeneriert. Die Möglichkeit der Stimulation bzw. Differenzierung intakter neuronaler Vorläuferzellen bei diesen Erkrankungen durch Nod2 oder TLR-Liganden stellt einen ausgezeichneten Therapieansatz für die Behandlung der jeweiligen Nervendegenerationen dar.
Ferner kann das Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit des ZNS hergestellt werden, wobei die Krankheit eine Folge einer traumatischen Verletzung des ZNS ist.
Durch Stimulation der Proliferation bzw. Differenzierung intakter neuronaler Vorläuferzellen durch Nod2- oder TLR-Liganden können ferner Rückenmarksläsionen behandelt werden. Zu den Rückenmarksläsionen zählen bspw. traumatische Verletzungen des ZNS oder ischämische Läsionen, die bspw. Folgen eines Schlaganfalls sein können. Diese Verletzungen können auch zu einer Lähmung der Gliedmaßen führen, da motorische Neuronen zerstört sind. Daher kann das Arzneimittel auch zur Behandlung von durch einen Schlaganfall ausgelöste ischämische Läsionen des ZNS eingesetzt werden.
Es ist bevorzugt, wenn bei der Herstellung des Arzneimittels ein Nod2- oder TLR-Ligand verwendet wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Lipopolysaccharide (LPS), R848, PoIy Inosin-Polycytidylsäure (PoIy I:C), N-acetylmuramyl-dipeptid, oder Derivate davon.
Mit einigen der genannten Nod2- und TLR-Liganden konnte eine Induzierung der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen gezeigt werden. Die TLR-Liganden wurden dabei peripher verabreicht.
Das Lipopolysacharid ist ein charakteristischer Bestandteil der komplexen äußeren Wandschicht (äußere Membran) gramnegativer Bakterien (Bakterienzellwand) . Die Lipopolysaccharid-Moleküle werden in der Zelle an der Cytoplasma-Membran synthetisiert und trägergebunden nach außen transportiert. Die Lipopolysaccharide bspw. der Enterobacteriaceae sind sehr ähnlich aufgebaut. Andere gramnegative Bakterien-Familien können jedoch einen stark abweichenden Lipopolysaccharid-Aufbau besitzen. Lipopolysaccha- rid wird von TLR4 erkannt.
R848, ein Imidazochinolin-Derivat , wird beim Menschen von TLR7 und TLR8 erkannt und wird auch als Resquimod bezeichnet. PoIy I: C ist ein synthetisches Homopolymer, das viraler RNA stark ähnelt. PoIy I:C wird von TLR3 erkannt.
N-acetylmuramyl-dipeptid ist ein abgeleiteter Baustein der Polysaccharidketten des Mureins und damit Bestandteil der Zellwände (Bakterienzellwand) zahlreicher Bakterien und wird vom Nod2-Rezeptor erkannt.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche zumindest einen Nod2- und/oder TLR-Liganden zur Behandlung einer Krankheit des ZNS enthält.
Es ist bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit des ZNS eingesetzt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Amyotrophe Lateralsklerose, Multiple Sklerose, Muskeldystrophie, Alzheimer Krankheit, Par- kinsonsche Krankheit.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei nur einen Nod2- oder TLR-Liganden enthalten, ferner können jedoch auch verschiedene Nod2- und TLR-Liganden in Kombination eingesetzt werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann darüber hinaus weitere Inhaltsstoffe und/oder Träger enthalten, die üblicherweise bei der Zubereitung einer zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden. Solche Inhaltsstoffe sind z.B. Verdünnungsmittel, Bindemittel, Suspensionsmittel, Schmiermittel, Stabilisatoren usw. Dazu zählen, sind aber nicht hierauf beschränkt, z.B. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche Öle, Polyethylenglykole, Monoglyceride etc. Eine Übersicht über derartige Inhaltsstoffe findet sich bspw. in A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Edition 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
Je nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung wird die Zusammensetzung formuliert sein, also bspw. bei Injektion in Form von flüssigen Zubereitungen. Die Verabreichung kann ferner in Abhängigkeit vom Patienten und der Erkrankung systemisch oder lokal gerichtet vorgenommen werden.
Die Zusammensetzung kann ferner weitere aktive Inhaltsstoffe oder Arzneimittel aufweisen, wie bspw. Interferone, EGF (epidermal growth factor), FGF (fibublast growth factor) und BDNF (brain-derived neurotrophic factor), ebenso wie Zytokine, Che- mokine, Proteine des Komplementsystems und/oder Zell-Adhäsions- moleküle, die die Rolle der neuronalen Vorläuferzellen in der Gewebehomöostase modulieren können.
Die Verabreichungsmengen hängen dabei jeweils von der jeweiligen Krankheit sowie vom Patienten ab, wobei Faktoren wie bspw. Alter und Gewichtberücksichtigt werden müssen.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den Figuren und dem nachfolgenden Beispiel.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Die Verteilung und Quantifizierung von BrdU+-Zellen im Rückenmark an den Tagen 2 und 3 nach Injektion unterschiedlicher TLR-Liganden:
(A) Anzahl der BrdU+-Zellen/m2 in der grauen und weißen Substanz bei Verabreichung von N-acetylmuramyl- dipeptid, LPS, R848, PoIy I:C und CpG Oligonucleotid;
(B) Quantifizierung von BrdU+-Zellen im Ependym des Zentralkanals an den Tagen 2 und 3;
Fig. 2 Änderung der BrdU+-Zelldichte nach Injektion von PoIy I:C oder R848:
(A) Markierungszeitraum nach PoIy I :C-Injektion in der weißen und grauen Substanz;
(B) Markierungszeitraum nach R848-Injektion in der weißen und grauen Substanz;
Fig. 3 die transiente Aktivierung von Mikrogliazellen im Rückenmark nach PoIy I:C oder R848-Injektion:
(A) PoIy I:C-Injektion
(B) R848-Injektion; Fig. 4 Untersuchung zur Inhibierung der PoIy I: C- vermittelten Zellaktivierung nach Verabreichung von Dexamethason und Indomethacin:
(A) ED-1+-Zellen pro mm2 Rückenmark
(B) BrdU+-Zellen pro mm2 Rückenmark.
Beispiel
1. Material und Methoden
1.1 Eingesetzte Tiere
Sechs bis acht Wochen alte männliche Lewis-Ratten (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden unter standardisierten Laborbedingungen gehalten, wobei Nahrung und Flüssigkeit in beliebiger Menge zur Verfügung standen. Alle Verfahren, die bei den Tieren vorgenommen wurden, wurden gemäß den "International Health Guide Lines" nach einem von verschiedenen Tierschutz-Komitees genehmigten Protokoll durchgeführt .
1.2 Reagenzien
Phosphorothioat CpG-ODN ( 5 ' -tccatgacgttcctgacgtt-3 ' ; SEQ ID Nr. 1) wurde von MWG-Biotech AG (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Pam3Cys, R848, PoIy I:C und N- muramyl-dipeptid (MDP) wurden von InVivogen (San Diego, USA), LPS (des E. coli Serotyps 026 :B6) und Indomethacin von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) und BrdU und Dexa- methason von Serva (Heidelberg, Deutschland) käuflich erworben .
1.3 Tierversuche
Pam3Cys (5 mg/kg), N-acetylmuramyl-dipeptid (1 mg/kg), PoIy I:C (5 mg/kg), LPS (1 mg/kg), R848 (1 mg/kg) oder PS CpG-ODN (5 mg/kg) wurden intraperitoneal injiziert. Der Kontrollgruppe wurden 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) ebenfalls intraperitoneal injiziert. Für die Untersuchungen der Inhibierung der PoIy I :C-vermittelten Zellaktivierung, wurde 2 Stunden nach PoIy I :C-Verabreichung Dexamethason (5 mg/kg) oder Indomethacin (2 mg/kg) injiziert.
Für die histologischen Untersuchungen wurden die Ratten an unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Injektion wie nachstehend gezeigt getötet. Zwei Tage vor der Tötung erhielten die Ratten zweimal täglich BrdU-Injektionen (50 mg/kg, intraperitoneal), im Abstand von 8 Stunden. Im Anschluss daran wurden die Ratten mit Diethylether anästhesiert; 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS wurden anschließend intrakardial verabreicht. Das Rückenmark wurde jeweils entfernt und in 4 % PFA über Nacht bei 4 0C nachträglich fixiert. Das Rückenmark wurde in 8 mm-Abschnitte eingeteilt und in Paraffin eingebettet, seriell geschnitten (3 μm) und auf silanisierte Objektträger gegeben.
1.4 Immunhistochemie Nach Entparaffinisierung wurden die Objektträger mit den Rückenmarkschnitten 15 Minuten lang in Citratpuffer (2,1 g Natriumcitrat/L, pH 6) gekocht (in einem 600 W Mikrowellenofen). Endogene Peroxidase wurde mit 1 % H2O2 in Methanol 15 Minuten lang inhibiert. Die Objektträger wurden mit 10 % normalem Schweineserum (Biochem, Berlin, Deutschland) inkubiert, um unspezifische Bindung von Immunglobulinen zu blockieren, und mit den folgenden Maus-monoklonalen Antikörpern getestet: ED-I (Anti-Ratte, Serotec, Oxford, Großbritannien, 1:100) zur Detektion aktivierter Mikroglia, GFAP zur Detektion von Astrozyten, W3/13 zur Detektion von T-Lymphocyten (alle Serotec), Nestin (Chemicon, Planegg- München, Deutschland, 1:500) zur Detektion von Stamm- /Vorläuferzellen und BrdU (Anti-BrdU, BD Pharmingen, San Diego, 1:100) zur Detektion proliferierender Zellen.
Die Bindung der Antikörper an Tiergewebe wurde mittels biotinylierter Kaninchen-Anti-Maus IgG F(ab)2 Antikörperfragmente (DAKO, Hamburg, Deutschland, 1:400) sichtbar gemacht. Im Anschluss daran wurden die Schnitte mit einem Streptavidin-Avidin-Biotin-Komplex (DAKO, Hamburg, Deutschland) inkubiert und anschließend mit Diaminobenzi- din (DAB) -Substrat (Fluka, Neu-Ulm, Deutschland) entwickelt. Abschließend wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt.
1.5 Doppelfärbungsexperimente Für Doppelfärbungsexperimente wurden die Objektträger mit den Rückenmarksschnitten wie oben beschrieben vorbehandelt und anschließend mit dem jeweiligen monoklonalen Antikörper inkubiert. Anschließend erfolgte eine Reaktion mit dem sekundären Antikörper (biotinyliertem Kaninchen Anti-Maus IgG) mit einer Verdünnung von 1:400 in TBS-BSA für 30 Minuten sowie mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten ABC-Komplex, verdünnt mit 1:400 in Tris-BSA für 30 Minuten. Im Anschluss daran wurde die Immunfärbung mit Fast Blue BB-Salz-Chromogensubstratlösung entwickelt. Anschließend wurden die Objektträger wiederum in einer Mikrowelle 15 Minuten lang in Citratpuffer gekocht und wie oben beschrieben immun-markiert.
Der BrdU-Einbau durch verschiedene Zelltypen wurde durch Doppelfärbung mit den oben unter 1.4 beschriebenen Antikörpern detektiert.
1.6 Auswertung
Die Rückenmarkgewebeschnitte wurden in Gruppen von acht bis zwölf Schnitten unterschiedlicher Regionen des Rückenmarks eingeteilt. Für die Immunhistochemie wurden die gefärbten Schnitte mittels Lichtmikroskop untersucht. Die Anzahl der BrdU-markierten Zellen in der grauen Substanz, weißen Substanz und um den zentralen Kanal wurde durch manuelles Auszählen unter zwanzigfacher Vergrößerung bestimmt. Die Anzahl der ED-I+ wurde im Schnitt des gesamten Rückenmarks ausgezählt. Die Region der grauen und weißen Substanz der Rückenmarkschnitte wurde unter Verwendung der Axio Vision LE ReI.4.1 (Carl Zeiss Vision GmbH) Software ausgewertet. Die Ergebnisse für die weiße und graue Substanz sind als arithmetische Mittelwerte der positiven Zellen pro mm2 angegeben und wurden standardisiert. Die Anzahl der ependymalen Zellen sind als arithmetische Mittel der BrdU-positiven Zellen pro Rückenmarksschnitt angegeben und standardisiert. Die statistische Analyse wurde durch ANOVA durchgeführt, sowie mit einem Dunnett ' s Multiple Comparison-Test (Graph Päd Prism 4.0 Software). Daten mit p<0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
2. Ergebnisse
Um den Effekt unterschiedlicher Nod2- und TLR-Liganden auf die Proliferation neuronaler Vorläuferzellen innerhalb des intakten Rückenmarks zu bestimmen, wurden Ratten TLR- Liganden intraperitoneal injiziert und proliferierende Zellen durch intraperitoneale Injektion von BrdU markiert (BrdU ist ein Thymidin-Analogon, das während der Zellteilung in DNA eingebaut wird) . Proliferierende Zellen wurden durch Immunhistochemie mit Anti-BrdU-Antikörpern detek- tiert.
Einen Tag nach Injektion der Nod2- und TLR-Liganden wurde den Ratten BrdU zwei Tage lang injiziert und anschließend die Proliferation der neuronalen Vorläuferzellen durch Immunhistologie bestimmt.
In Fig. IA ist gezeigt, dass sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz bei den Gruppen, die mit entweder N-acetylmuramyl-dipeptid, LPS, R848 oder PoIy I:C behan- delt wurden, eine signifikant höhere Dichte an BrdU+- Zellen gemessen werden konnte als in der Kontrollgruppe (durchschnittliche Dichte in der grauen und weißen Substanz der Kontrollgruppe: 9,45 ± 0,83 Zellen/mm2 und 7,72 ± 0,84 Zellen/nun2 (p<0,05)). Lediglich bei der Gruppe, die mit PS CpG-ODN (von TLR9 erkannt) behandelt wurde, konnte kein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden.
BrdU+-Zellen lagen im Rückenmark über die weiße und graue Substanz verteilt vor. Dennoch konnte - im Vergleich zur grauen Substanz - eine höhere Dichte der BrdU+-Zellen in der weißen Substanz aller Gruppen festgestellt werden (siehe Fig. IA) .
Um proliferierende Zellen zu identifizieren, wurden Doppelfärbungsexperimente eingesetzt. ED-I und BrdU Doppelfärbungen zeigten, dass ED-I positive Mikrogliazellen nur selten BrdU positiv waren.
Die ependymalen Zellen um den Zentralkanal des Rückenmarks erachtet man als neuronale Stammzellen. In den Experimenten des Erfinders konnte eine Proliferation ependymaler Zellen im normalen Rückenmarksgewebe beobachtet werden, jedoch induzierten die TLR-Liganden keinen bedeutenden Anstieg in der Anzahl der ependymalen BrdU+-Zellen (siehe Fig. IB, durchschnittliche Anzahl der ependymalen BrdU+- Zellen in der Kontrollgruppe ist gleich 1,1 ± 0,40).
Um den Zeitverlauf der NPC-Proliferation zu untersuchen, wurden Ratten, die zuvor mit PoIy I:C oder R848 behandelt wurden, an unterschiedlichen Zeitpunkten getötet und anschließend die Zeilproliferation analysiert. Wie in Fig. 2A gezeigt, konnte ein signifikanter Anstieg in der Anzahl der BrdU+-Zellen pro mm2 in Ratten beobachtet werden, welche BrdU an den Tagen 2-3 nach PoIy I:C-Injektion erhalten hatten. Ähnliche Ergebnisse wurden sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz beobachtet (80,67 ± 3,34 Zellen/mm2 und 64,19 ± 4,04 Zellen/mm2; p<0,05). Zu späteren Zeitpunkten sank die Dichte der BrdU+-Zellen schnell auf den Grundlevel, sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz.
Bezüglich der R848-behandelten Gruppen konnte die höchste Dichte von BrdU+-Zellen mit 111,2 ± 7,67 Zellen/mm2 in der weißen Substanz und 72,22 ± 2,8 Zellen/nun2 in der grauen Substanz im Rückenmark von Ratten beobachtet werden, welchen BrdU an den Tagen 2 und 3 verabreicht wurde ( im Vergleich zur Kontrollgruppe sind die Unterschiede signifikant (p<0,05)). Zu späteren Zeitpunkten sank die Dichte der BrdU+-Zellen rasch auf Grundlevel (siehe Fig. 2B).
In weiteren Versuchen wurden die Rückenmarksschnitte mit dem monoklonalen Antikörper ED-I gefärbt und mittels Lichtmikroskopie untersucht. Ein bedeutender Anstieg der ED-1+-Zellen konnte vier Tage nach PoIy I :C-Injektion beobachtet werden (siehe Fig. 3A, durchschnittliche Dichte der behandelten und der Kontrollgruppen sind 9,1 Zellen/mm2 ± 0,99 und 0,91 Zellen/mm2 ± 0,24; p<0,05). Sogar am Tag 6 nach der Injektion konnte ein bedeutender Anstieg der ED-1+-Zellen beobachtet werden (5,2 Zellen/mm2 ± 0,35; p<0,05) . Bezüglich der mit R848 behandelten Ratten erreichte die Dichte der ED-1+-Zellen am Tag 4 nach der Injektion ein Maximum (3,1 Zellen/mm2 ± 0,35; p<0,05), sank jedoch am Tag 5 nach der Injektion (2,4 Zellen/mm2 ± 0,25; p<0,05) und sank am Tag 6 nach der Injektion auf Grundlevel (siehe Fig. 3B).
Für die weitere Untersuchung der regulatorischen Kaskade, die durch die Injektion der TLR-Agonisten angestoßen wurde, wurde PoIy I:C als Stimulus verwendet und im Folgenden untersucht, ob eine Behandlung mit einem die Blut-Hirn- Schranke passierenden Cyclooxygenase-Blocker, Indometha- cin, oder einem starken synthetischen Corticosteroid, De- xamethason, die Zellaktivierung im Rückenmark inhibiert werden konnte .
Die Ergebnisse dieser Studien sind in Fig. 4 gezeigt. Aus Fig. 4A und 4B geht hervor, dass die PoIy I :C-vermittelte Zellaktivierung durch Injektion von Dexamethason inhibiert werden konnte. Überraschenderweise zeigte damit Dexamethason einen stark supprimierenden Effekt, wohingegen Indo- methacin keinen Effekt zeigte.
3. Zusammenfassung
Durch die oben dargestellten Versuche konnte gezeigt werden, dass neuronale Vorläuferzellen durch die periphere Verabreichung von bestimmten Nod2- und/oder TLR-Liganden zur Proliferation im Rückenmark temporär stimuliert werden können. Die Anzahl der proliferierenden Zellen war am Tag 2-3 nach der Injektion am stärksten und sank anschließend rasch auf Grundlevel.
In normalem Rückenmark stellen sich teilende Zellen nur eine sehr kleine Population unter physiologischen Umständen dar. In den oben dargestellten Versuchen konnte eine geringe Dichte von BrdU+-Zellen im Rückenmark der Kontrollgruppen beobachtet werden (9,45 + 0,83 Zellen/mm2 und 7,72 ± 0,84 Zellen/mm2). Es ist zwar bekannt, dass unter bestimmten Bedingungen, wie bspw. Verletzung, Entzündung oder Autoimmun-Reaktionen, die Anzahl der proliferierenden Zellen dramatisch ansteigen kann, jedoch gibt es keine Erkenntnisse über den Mechanismus der Proliferations- Regulation der neuronalen Vorläuferzellen.
Limke et al., "Neural stem cell therapy in the aging brain: pitfalls and possibilities" , J. Hematother Stem Cell Res. 2003; 12:615-23, zeigten, dass verschiedene Faktoren in der Mikroumgebung des ZNS, wie bspw. der epidermal growth factor (EGF) und der fibroblast growth factor (FGF) und der brain-derived neurotrophic factor (BDNF), die Rolle der neuronalen Vorläuferzellen bei der Gewebehomöostase modulieren können, genauso wie bestimmte inflammatorische Zytokine, Chemokine, Proteine des Komplementsystems oder Zell-Adhäsionsmoleküle (siehe Tzeng und Wu, "Responses of microglia and neural progenitors to mechani- cal brain injury", Neuroreport 1999, 10:2287-2292).
Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass peripher verabreichte Nod2- und TLR-Liganden temporär die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im Rückenmark induzieren.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von zumindest einem Nod2- und/oder TLR-Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit des zentralen Nervensystems (ZNS).
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit des ZNS hergestellt wird, die durch die Stimulation des Wachstums, der Proliferation oder der Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen behandelbar ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit des ZNS hergestellt wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Amyotrophe Lateralsklerose, Multiple Sklerose, Muskeldystrophie, Alzheimer Krankheit, Parkinsonsche Krankheit.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur Behandlung einer Krankheit des ZNS hergestellt wird, wobei die Krankheit eine Folge einer traumatischen Verletzung oder einer Ischämie des ZNS ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der TLR-Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Lipopolysaccharid, R848, Polyinosin- Polycytidylsäure, N-acetylmuramyl-dipeptid, oder Derivate davon.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend zumindest einen Nod2- und/oder TLR-Liganden zur Behandlung einer Krankheit des ZNS.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Behandlung einer Krankheit des ZNS, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Amyotrophe Lateralsklerose, Multiple Sklerose, Muskeldystrophie, Alzheimer Krankheit, Parkin- sonsche Krankheit.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7 zur parenteralen, intracerebralen oder intrathekalen Verabreichung.
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