WO2006095474A1

WO2006095474A1 - 非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法

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Publication number: WO2006095474A1
Application number: PCT/JP2005/021978
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Aoyama; Shinsuke Sando; Keiichiro Kanatani
Original assignee: Kyoto University NUC
Current assignee: Kyoto University NUC
Priority date: 2005-03-09
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2007-09-09
Also published as: JPWO2006095474A1

Abstract

　タンパク質翻訳系において、選択された天然アミノ酸Ｘと該アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記アミノ酸Ｘに対するｔＲＮＡとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法、並びにそのキット。本発明により、単離されたｍＲＮＡ又はクローン化されたＤＮＡから得られたｍＲＮＡを用いて、簡便に、非天然アミノ酸及び／又はヒドロキシ酸含有化合物を製造することができる。

Description

明細書

非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法

技術分野

[oooi] 本発明は、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法及びそのキットに関する。

背景技術

[0002] 近年、部位特異的変異導入法による野生型タンパク質の改変により、自然にはみられな、新たな活性を有するタンパク質、野生型タンパク質とは大きく構造の異なるタンパク質の創製が試みられて、る。

[0003] 力かる部位特異的変異導入法によるタンパク質の改変は、野生型タンパク質のアミノ酸配列への天然アミノ酸の導入、例えば、野生型タンパク質に本来存在するァミノ酸を他の天然アミノ酸と置換すること、野生型タンパク質に天然アミノ酸を付加すること等に基づくものである。

[0004] 一方、野生型タンパク質のアミノ酸配列への非天然アミノ酸の導入は、例えば、人ェ RNAを铸型とし、非天然アミノ酸のコドンとして「ストップコドン」を利用すること〔非特許文献 1を参照〕、人工 RNAを铸型とし、非天然アミノ酸の遺伝暗号として「4連塩基」を利用すること〔特許文献 1、非特許文献 2を参照〕等により行なわれてヽる

[0005] しかし、「ストップコドン」を利用する場合、例えば、大腸菌にぉ、ては、ストップコドンが 3種あり（UAG、 UAA、 UGA)、 1つはストップコドンとして機能させる必要があるため、残りの 2つし力使用できない。したがって、最大 2種の非天然アミノ酸の導入しかできな!/、と!/、う欠点がある。

[0006] また、「4連塩基」を利用する場合、実用的に使用するには、レアコドンを選択する必要があるため、最大でも 1度に 2種の非天然アミノ酸の導入しかできないという欠点がある。

特許文献 1：国際公開第 2004Z009709号パンフレット

非特許文献 1 : Science,第 244卷、第 182頁、 1989年発行

非特許文献 2 : RNAミーティング依頼講演 4要旨、宍戸昌彦、「蛋白質生合成系の有機化学的拡張と合成生命体への挑戦」日本 RNA学会

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は、 1つの側面では、天然の RNAを铸型として用いること、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸を導入すること、アミノ酸配列への非天然アミノ酸の導入に際し、任意のセンスコドンを利用すること、多数のコドンへの非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸の割り当てを行なうこと、天然アミノ酸と非天然ァミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び Z又はポリエステルを得ること等の少なくとも 1つを達成する、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法を提供することにある。また、本発明は、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸を導入すること、多数のコドンへの非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸の割り当てを行なうこと、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び Z又はポリエステルを得ること等の少なくとも 1つを達成する、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有ィ匕合物の製造用キットを提供することにある。

課題を解決するための手段

[0008] すなわち、本発明の要旨は、

〔1〕タンパク質翻訳系において、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンカゝらなる群より選択されたアミノ酸 Xと該アミノ酸 Xに対する tRNA との結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィヒ合物と前記アミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法、

〔2〕アミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質により、ァミノ酸 Xに対する tRNAと、アミノ酸 Xとの結合を阻害する、前記〔1〕記載の製造方法〔3〕該阻害物質が、 5'— O— [N— (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体化合物である、前記〔2〕記載の製造方法、

〔4〕 (A)タンパク質翻訳系にお!/、て、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンカなる群より選択されたアミノ酸 Xに対する tRNAと該ァミノ酸 Xとの結合を阻害する条件下に、さらに該アミノ酸 X以外のアミノ酸 Yに対する tRN Aと該アミノ酸 Yとを結合させる工程、並びに

(B)前記ステップ (A)で得られた産物と、铸型となる mRNAとを用い、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物とアミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体の存在下、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせる工程、

を含む、前記〔1〕〜〔3〕 V、ずれか 1項に記載の製造方法、

〔5〕 1)ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びパリンからなる群より選択されたアミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質と、

2)非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物と、

3)タンパク質翻訳系と、

を含有してなる、前記〔1〕〜〔4〕 Vヽずれか 1項に記載の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有ィ匕合物の製造方法に用いるためのキット、

〔6〕阻害物質が、 5'— O— [N— (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体化合物である、前記〔5〕記載のキット、並びに

〔7〕非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物に代えて、非天然アミノ酸—tR NA及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物—tRNAを含有してなる、前記〔5〕又は〔6〕記載のキット、

に関する。

発明の効果 [0009] 本発明の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法によれば

、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物を導入することができ、アミノ酸配列への非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物の導入に際し、任意のセンスコドンを利用し、多数のコドンへ非天然アミノ酸を割り当てることができ、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び/又はポリエステルを得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に用いるためのキットによれば、簡便に、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物を導入することができ、多数のコドンへ非天然アミノ酸及び z又はヒドロキシ酸ィ匕合物を割り当てることができ、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸ィヒ合物との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び Z 又はポリエステルを得ることができるという優れた効果を奏する。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]図 1は、 Phe— SAを用いるイン 'ビトロ原核生物翻訳系又は Phe— SAを用いな V、イン ·ビト口原核生物翻訳系における DHFR [6]生産及び DHFR [0]生産のウェスタンプロット解析の結果を示す図である。図中、レーン 1は、対照、レーン 2〜7は、 5 μ Μ Phe— SA非存在下、レーン8— 13は、5 _iu M Phe— SA存在下における結果を示す。また、レーン 3、 6、 9及び 12は、 30分のプレインキュベーション、レーン 4 、 7、 10及び 13は、 60分のプレインキュベーションの結果を示す。レーン 2〜4及びレーン 8〜： LOは、 DHFR[6]であり、レーン 5〜7及びレーン 11〜13は、 DHFR[0]である。

[0011] [図 2]図 2は、インヒビター Phe— SA (5 /z M)とサプレッサー Nap— tRNA^Phe (0. 5

GAA

gZ L) )の存在又は非存在下での 50°Cで 30分間のプレインキュベーション後に、翻訳された DHFR[1]のウェスタンブロット解析の結果を示す。図中、レーン 1は、铸型なし、レーン 2は、铸型が存在し、かつインヒビター非存在、レーン 3は、铸型及びインヒビター共に存在、レーン 4は、铸型、インヒビター及びサプレッサー存在の場合の結果である。

[0012] [図 3]図 3は、 Pheコドンを Nap導入対象コドンとした場合の Nap含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。

[0013] [図 4]図 4は、 lieコドンを Nap導入対象コドンとした場合の Nap含有ハイブリッドポリべプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。

[0014] [図 5]図 5は、 Valコドンを Nap導入対象コドンとした場合の Nap含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。上段は、 Va

1— SA (—）、 Nap— tRNA (—）条件下での結果を示し、下段は、 Val— SA( + )

CAC

、 Nap— tRNA ( + )条件下での結果を示す。

CAC

[0015] [図 6]図 6は、 lieコドンを Bph導入対象コドンとした場合の Bph含有ハイブリッドポリべプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。上段は、 lie— SA(―)、 Bph— tRNA (―)条件下での結果を示し、下段は、 lie— SA ( + )、 Bp

GAU

h— tRNA ( + )条件下での結果を示す。

GAU

[0016] [図 7]図 7は、 Valコドンを Ido導入対象コドンとした場合の Ido含有ハイブリッドポリべプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。上段は、 Val — SA(— )、 Ido— tRNA (―)条件下での結果を示し、下段は、 Val— SA( + )、 I

CAC

do -tRNA ( + )条件下での結果を示す。

CAC

[0017] [図 8]図 8は、 Pheコドンを PheOH導入対象コドンとした場合の産物について、希釈アンモニア水を用いたアルカリ加水分解により調べた結果を示す図である。図中、パネル（a)は、 PheOH— tRNA非存在下、パネル（b)は、 PheOH— tRNA存在下、パネル（c)は、 PheOH— tRNA及び Phe— S A存在下、（d)は、 PheOH— tRNA及び Phe— SA存在下、かつプレインキュベーションの場合の結果を示す。

[0018] [図 9]図 9は、 Pheコドンを Nap導入対象コドンとした場合の Nap含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。上段は、 Ph e— SA (—）、 Nap— tRNA (—）条件下での結果を示し、下段は、 Phe— SA( +

GAA

)、 Nap -tRNA ( + )条件下での結果を示す。

GAA

[0019] [図 10]図 10は、 lieコドンを Bph導入対象コドンとした場合の Bph含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べた MALDIマススペクトルの結果を示す図である。上段は、 lie ― SA(―)、 Bph— tRNA (―)条件下での結果を示し、下段は、 lie— SA ( + )、

GAU

Bph -tRNA ( + )条件下での結果を示す。 [0020] [図 11]図 11は、 Pheコドンを Nap導入対象コドン、 lieコドンを Bph導入対象コドンとした場合の Nap及び Bph含有ハイブリッドポリペプチドの形成を調べた MALDIマススベクトルの結果を示す図である。上段は、 SA (—）、非天然アミノ酸— tRNA (—）条件下での結果を示し、下段は、 SA( + )、非天然アミノ酸— tRNA ( + )条件下での結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0021] 本明細書において、「天然アミノ酸」とは、生体内におけるコドンによりコードされるアミノ酸であり、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォ- ン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びパリンを意味する。なお、本明細書においては、ァラニンを、 Ala又は A；アルギニンを、 Ar g又は R、ァスパラギンを、 Asn又は N ;ァスパラギン酸を、 Asp又は D、システィンを、 Cys又は C ;グルタミン酸を、 Glu又は E ;グルタミンを、 Gin又は Q ;グリシンを、 Gly又は G ;ヒスチジンを、 His又は H、イソロイシンを、 lie又は I；ロイシンを、 Leu又は L ;リジンを、 Lys又は K;メチォニンを、 Met又は M ;フエ-ルァラニンを、 Phe又は F;プロリンを、 Pro又は P ;セリンを、 Ser又は S ;スレオニンを、 Thr又は T;トリプトファンを、 Tr p又は W;チロシンを、 Tyr又は Y;パリンを、 Val又は Vと表記する場合がある。

[0022] 前記「非天然アミノ酸」とは、アミノ酸骨格を有する化合物であり、前記天然アミノ酸を除く化合物を意味する。さらに、前記「アミノ酸骨格」とは、アミノ酸中のカルボキシル基と、ァミノ基と、該カルボキシル基と該ァミノ基とを連結する部分とから構成される部分を意味する。

[0023] 本発明の製造方法に用いられうる非天然アミノ酸としては、特に限定されないが、リポソームを介した導入を行なえる化合物であればよぐ具体的には、例えば、 βーァミノ酸等の主鎖長の異なる化合物、ナフチルァラニン、ビフエ二ルァラニン、アンスラリルァラニンのように広、芳香環面を持つ化合物、アジドチロシンのように高、反応基を有する化合物等が挙げられる。

[0024] なお、本発明にお、ては、前記アミノ酸及び非天然アミノ酸のようにアミド結合を介して重合する化合物の他、例えば、エステル結合等を介して重合する化合物を用いることもできる。力かる化合物としては、リボソームを介した導入を行なえる化合物であればよぐ特に限定されないが、例えば、 α—ヒドロキシ酸、 j8—ヒドロキシ酸等のヒド口キシ酸化合物が挙げられ、より具体的には、フエ-ルァラニンヒドロキシ類縁体、 3 ヒドロキシ 3 フエ-ルプロピオン酸等が挙げられる。

[0025] 本明細書にぉ、て、非天然アミノ酸含有化合物とは、前記非天然アミノ酸の部分を、化学結合 (アミド結合)を介して有する化合物を意味する。また、ヒドロキシ酸含有化合物とは、前記ヒドロキシ酸ィ匕合物の部分を、エステル結合等を介して有する化合物をいい、ヒドロキシ酸の誘導体をも包含する。

[0026] 本発明は、 1つの側面では、タンパク質翻訳系において、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリブトファン、チロシン及びバリンカなる群より選択されたアミノ酸 Xと該アミノ酸 Xに対する tRNAとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸化合物と前記アミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に関する。

[0027] 本発明の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法は、タンパク質合成過程におけるアミノ酸と該アミノ酸に対する tRNAとの結合、すなわち、 tRN Aのアミノアシルイ匕の過程にぉ、て、選択されたアミノ酸に対する tRNAと該アミノ酸との結合を阻害することに 1つの大きな特徴がある。

[0028] そのため、本発明の製造方法によれば、前記選択されたアミノ酸に代わる非天然ァミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物と前記 tRNAとの複合体を形成させ、タンパク質翻訳系による翻訳を行なうことができる。

[0029] また、本発明の製造方法は、 tRNAのアミノアシルイ匕の過程にぉ、て、選択されたアミノ酸に対する tRNAと該アミノ酸との結合を阻害し、該選択されたアミノ酸に代わる非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィヒ合物を前記 tRNAに結合させ、タンパク質翻訳系による翻訳を行なうことに 1つの大きな特徴がある。

[0030] したがって、本発明の製造方法によれば、生体から単離した特定のポリペプチドをコードする DNA又はその転写産物である mRNAをそのままの状態で铸型として用いることができる。さらに、本発明の製造方法によれば、簡便な操作で、所望のァミノ酸配列へ非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物を導入することができる。また、本発明の製造方法によれば、アミノ酸配列への非天然アミノ酸の導入に際し、任意のセンスコドンを利用し、多数のコドンへ非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物を割り当てることができる。さらに、本発明の製造方法によれば、天然アミノ酸と非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物との任意の組合せによる所望のポリペプチド及び Z又はポリェステルを簡便に得ることができる。

[0031] 本発明の製造方法においては、天然の tRNAが用いられているため、天然アミノ酸に対する tRNAの種類にあわせ、最大 20種の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸を用いることができる。

[0032] 本発明の製造方法においては、アミノ酸 Xに対する tRNAとアミノ酸 Xとの結合の阻害は、例えば、前記アミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質により、アミノアシル tRNA合成酵素を阻害し、それにより、アミノ酸 Xに対する tR NAと、アミノ酸 Xとの結合を阻害すること等により行なわれうる。

[0033] 前記のように、アミノアシル tRNA合成酵素を阻害する場合、特定の tRNAのァミノァシルイ匕を阻害することができ、任意のセンスコドンを、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物に割り当てることができ、多数のコドンへの非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物の割り当てが可能になる点で有利である。すなわち、本発明の製造方法においては、アミノアシル tRNA合成酵素を阻害することにより、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せで、所望のポリペプチド及び/又はポリエステル、およびタンパク質を合成することができる。

[0034] 前記阻害物質としては、例えば、下記式 (I)：

[0035] [化 1]

[0036] 〔式中、 Rは、ァラニン残基、アルギニン残基、ァスパラギン残基、ァスパラギン酸残基、システィン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチォニン残基、フエ二ルァラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリブトファン残基、チロシン残基及びノリン残基からなる群より選ばれたアミノ酸残基を示す〕

で示される 5'— O— [N— (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体ィ匕合物、 5 '— O— [N— (アミノアシル)スルフアミド]アデノシン誘導体等； 5，一 O— [N— (ァミノァシル)スルファメート]アデノシン誘導体等のアミノアシルー ATP類縁体；ミュピロシン、フラノマイシン、シスペンタシン等のアミノアシルイ匕反応阻害を目的とする抗生物質等が挙げられる。また、本発明においては、前記阻害物質として、アミノアシル tR NA合成酵素に対する抗体又はその断片、アミノアシル tRNA合成酵素に対する D NAアブタマ一等も使用されうる。

[0037] 前記 5'— O— [N— (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体ィ匕合物としては、例えば、下記式 (Π) :

[0038] [化 2]

[0039] で示される 5，一 O— [N—（フエ-ルァラ-

)、下記式 (III)：

[0040] [化 3]

[0041] で示される 5，— O— [N— (イソ口イシ-ル)スルファモイル]アデノシン（lie— SA)等が挙げられる。

[0042] 本発明の製造方法にお!、ては、アミノ酸 Xに対する tRNAと、アミノ酸 Xとの結合の阻害は、前記アミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質の存在下に、タンパク質翻訳系を予めインキュベーションすること（プレインキュベーション）により行なわれうる。

[0043] 前記プレインキュベーションの時間は、特に限定されないが、アミノアシル tRNA合成酵素を阻害するに十分な時間であればよい。例えば、前記 Phe— SAを用いる場合、インキュベーションは、デァシルイ匕反応を十分に行なう観点から、 30分以上、好ましくは、 60分以上、より好ましくは、 90分以上であることが望ましぐタンパク質翻訳活性を十分に発揮させる観点から、 120分以下、好ましくは、 90分以下、より好ましくは、 60分以下であることが望ましい。

[0044] 前記プレインキュベーションの温度は、特に限定されないが、好ましくは、 37-50 °Cが望ましい。

[0045] 本発明の製造方法に用いられる「タンパク質翻訳系」としては、 tRNA、アミノアシル tRNA合成酵素、リボソーム、アミノ酸、 ATP、 GTP、 Mg²⁺、 K+、リリースファクター、リボソームリサイクリングファクター、ェロンゲーシヨンファクタ一等、真核生物のタンパク質翻訳系においては、クレアチンリン酸、クレアチンリンサンキナーゼ等、大腸菌のタンパク質翻訳系においては、ホスホェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ等を少なくとも含有した反応系が挙げられる。

[0046] 前記 5' -0- [Ν- (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体ィ匕合物等の阻害物質は、大腸菌等の生細胞とともにインキュベーションされることにより、該細胞内に浸透し、対応するアミノ酸に特異的なアミノアシル tRNA合成酵素を阻害することができる。従って、前記成分を含有する反応系である限り、本発明の製造方法に用いられる「タンパク質翻訳系」としては、生細胞を使用してもよいし、無細胞タンパク質翻訳系を使用してもよい。

[0047] 前記のタンパク質翻訳系として使用され得る生細胞としては、大腸菌、酵母、植物培養細胞、昆虫培養細胞、動物培養細胞、超高熱菌等が挙げられる。カゝかる生細胞をタンパク質翻訳系として使用する態様は、簡便に大量の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有ィ匕合物が得られるという点において有効である。また、前記「無細胞タンパク質翻訳系」としては、例えば、大腸菌由来の無細胞抽出液、超高熱菌由来の無細胞抽出液、小麦由来の無細胞抽出液、ゥサギ由来の無細胞抽出液等が挙げられる。

[0048] 本発明の製造方法において、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物とアミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体は、タンパク質翻訳系において形成させうる。また、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物とアミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体は、例えば、 1) 非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物とジヌクレオチド pdCpAとを結合させて、非天然アミノ酸― pdCp A又はヒドロキシ酸ィ匕合物― pdCpAを得る工程、及び

2) 特定のアミノ酸に対する、 3，末端の CAジヌクレオチドを欠損した tRNA (tRNA — CA)と、前記非天然アミノ酸— pdCpA又はヒドロキシ酸ィ匕合物— pdCpAとを連結する工程、

を含む方法や、非天然アミノ酸及びヒドロキシ酸ィ匕合物を tRNAに連結できる改変ァミノアシノレイ匕酵素（ί列えば、 Methods 36 (2005) 227— 238)等の酵素を用いる方法によっても得られうる。

作業の容易性および経済性の観点から、「タンパク質翻訳系」として、生細胞を使用する場合は、酵素を用いる方法を使用して、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物とアミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体を形成させることが好ましい。

[0049] 前記工程 1)における非天然アミノ酸と pdCpAとの結合に際して、非天然アミノ酸のァミノ基に、 t—ブトキシカルボ-ル基、光脱保護能のある NVOC基等を導入して保護し、さらに、得られた産物をシァノメチルエステルイ匕すればよい。なお、得られた産物は、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。また、前記工程 1)におけるヒド口キシ酸ィ匕合物と PdCpAとの結合に際して、ヒドロキシ酸の水酸基にジメトキシトリチル基等を導入して保護し、さら〖こ、得られた産物をシァノメチルエステルイ匕すればよい。なお、得られた産物は、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。

[0050] 前記 pdCpAは、ホスホロアミダイト法等により得られうる。得られた pdCpAは、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。

[0051] 前記工程 1)にお、て、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィ匕合物と pdCpAとの結合後、得られた産物について、脱保護をすればよい。なお、得られた非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸 pdCpAは、各種クロマトグラフィーにより適宜精製されうる。

[0052] 前記特定のアミノ酸に対する tRNA— CAは、例えば、イン 'ビトロ系において転写反応を行ったのちゲル精製することにより、作製されうる。

[0053] 工程 2)において、前記非天然アミノ酸— pdCpA又はヒドロキシ酸ィ匕合物— pdCpA と、前記特定のアミノ酸に対する tRNA— CAとは、例えば、リガーゼを用いることにより連結させることができる。 [0054] 前記「タンパク質翻訳反応条件」としては、用いられるタンパク質翻訳系の種類により異なる力例えば、大腸菌のタンパク質翻訳系の場合、 37°Cで 60分、 42°Cで 30分等の条件が挙げられる。

[0055] 本発明の製造方法は、より具体的には、例えば、（A)タンパク質翻訳系において、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエニノレアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びパリンからなる群より選択されたアミノ酸 Xに対する tRNAと、該選択されたアミノ酸 Xとの結合を阻害する条件下に、該アミノ酸 X以外のアミノ酸 Yに対する tRNAと該アミノ酸 Yとを結合させる工程、並びに

を含むプロセスにより行なわれうる。

[0056] 本発明の製造方法によれば、種々の材料化学、特に、非天然型アミノ酸の化学的性質を利用したナノテクノロジーなどの基礎研究分野への応用、生体の生命機能を発現させる様々な生体分子、例えば、タンパク質の化学的機能に着目した人工タンパク分子デバイス等の創製等が期待される。

[0057] 本発明は、他の側面では、 1)前記アミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質と、

2)非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物と、

3)タンパク質翻訳系と、

を含有した、本発明の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法に用いるためのキットに関する。

[0058] 本発明のキットにおける阻害物質と、非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物とタンパク質翻訳系とは、前記と同様である。

[0059] 本発明のキットは、前記阻害物質と非天然アミノ酸、ヒドロキシ酸ィ匕合物とタンパク質翻訳系とを含有することに 1つの大きな特徴がある。したがって、本発明のキットによれば、本発明の製造方法を簡便に行なうことができる。また、本発明のキットによれば、アミノ酸配列へ非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物を導入することができ、多数のコドンへ非天然アミノ酸及び/又はヒドロキシ酸ィ匕合物を割り当てることができ、天然アミノ酸と非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物との任意の組合せによる所望のポリペプチドを得ることができる。

[0060] 本発明のキットは、前記 2)の非天然アミノ酸に代えて、非天然アミノ酸 tRNA及び/又はヒドロキシ酸ィ匕合物 tRNAを含有してもよい。また、本発明のキットは、適宜、タンパク質翻訳系に必要な各種試薬を含有してもよヽ。

[0061] 以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

[0062] 調製例 1

(l) N-Boc-L-ナフチルァラニンシァノメチルエステルの調製

N— Boc— L ナフチルァラ-ン〔1. Ommol、ワタナベケミカル（Watanabe Che mical)社製〕 300mgを、トリェチルァミン（2当量）とクロロアセトニトリル（3当量）との混合物に溶解させ、得られた溶液を、室温で 12時間撹拌した。その後、得られた産物に、酢酸ェチル lOOmLを添カ卩し、ついで、 1M 重硫酸ナトリウム水溶液を添カロして、抽出を行なった。得られた有機層を、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、重硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧乾燥させ、それにより、収率 86%で黄色の粉末 304mg を得た。

[0063] 得られた黄色の粉末の化合物を、商品名： Varian Mercury 400 (400 MHz )スぺクトロメーターに供し、 ¾ NMRスペクトルを得た。結合定数 (J値）を Hzで示す。ケミカルシフトを、内部標準として残存クロ口ホルム (d = 7. 24)を用いて、テトラメチルシランからの低磁場の ppmで示す。また、得られた黄色の粉末の化合物を、商品名： JMS DX- 300スぺクトロメーター（JEOL社製）に供し、 FABマススペクトルを得た。

[0064] 得られた¹ H NMR ^ベクトルのケミカルシフトは、 ¹ H NMR(CDC1、 300Hz) d =

3

7. 82 (m, 3H) , 7. 62 (s, 1H) , 7. 48 (m, 2H) , 7. 29 (d, 1H, J= l. 5) , 4. 94 (d, 1H, J = 7. 8) , 4. 74 (m, 3H) , 3. 28 (m, 2H) , 1. 40 (s, 9H)である。また、 FABマススペクトルにより、分子量 354と算出された。

[0065] (2) L—ナフチルァラ-ル pdCpAの調製

ィ匕学リン酸化試薬（商品名： Chemical Phosphorylation reagent 〔グレンリサーチ（Glen Research)社製〕 )、デォキシシトシンホスホロアミダイト〔グレンリサーチ (Glen Research)社製〕）、及び CPG固定化アデノシン（商品名： Bz—A—CPG〔グレンリサーチ（Glen Research)社製〕）を用いて、商品名： ABI392 DNA/RN Aシンセサイザー〔パーキン一エルマ一（Perkin— Elmer)社製〕で、ジヌクレオチド p dCpAを合成した。合成した pdCpAについて、アンモニア水 (6mL)中、 55°Cで脱保護を行ない、その後、溶媒をスピードバック ·凍結乾燥により除去した。ついで、得られた産物を、 1M テトラプチルアンモ -ゥム溶液 lmLに再溶解した。得られた溶液を、商品名： Wakosil 5C18カラムでの逆相 HPLCに供し、 0〜50容積％ァセトニトリル-水のリニアグラジェントにより精製し、 pdCpAのテトラ— n—ブチルアンモ -ゥム塩を得た。

[0066] 得られた pdCpAのテトラー n—ブチルアンモ-ゥム塩を、ジメチルホルムアミド（DM F)に溶解させた。得られた pdCpA テトラ一 n—ブチルアンモ -ゥム塩の DMF溶液 (20 L、 0. 5 mol)に、前記（1)で得られた N— Boc— L—ナフチルァラニンシァノメチルエステル 10 μ molを添カ卩し、得られた溶液を室温で 3時間インキュベーシヨンすることにより、 pdCpAのアミノアシル化を行なった。

[0067] ついで、得られた産物を、商品名： Wakosil 5C18カラムでの逆相 HPLCに供し、 5〜75容積％ァセトニトリルの 0. 1M トリェチルァミン酢酸 (TEAA)緩衝液（pH7 . 0)のリニアグラジェントにより精製し、 N— Boc— L—ナフチルァラ-ル pdCpAを得た。得られた産物を、凍結乾燥させ、氷中、トリフルォロ酢酸 100 Lに再溶解させた。

[0068] 得られた溶液を、氷上で 10分間放置し、 Nガスを吹き付けることによりトリフルォロ

2

酢酸を除去した。残渣を、 lmLのジェチルエーテルで洗浄し、残った沈殿を、遠心分離（15, 000 X g、 4°Cで 30分間）で回収した。前記ジェチルエーテルによる洗浄と遠心分離とのサイクルを 2回繰り返した。得られた産物について、 aーシァノー 4ーォキシ桂皮酸をマトリックスとして用いて、商品名： Voyager Elite装置〔アプライドバイォシステム（Applied Biosystem)社製〕で、 MALDI— TOFマススペクトルを測定した結果、分子量 832. 08であり、 L ナフチルァラ-ル pdCp Aが得られたことが示された。得られた L—ナフチルァラ-ル pdCpAを、ジメチルスルホキシドに溶解させ、 3mM L—ナフチルァラ-ル pdCpAの DMSO溶液を得た。

[0069] (3) 酵母 tRNA^Phe — CAの Run— off転写

GAA

QuikChange (登録商標） Site Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（ Stratagene)社製〕を用いて、酵母 tRNA^Phe —C Aをコードするプラスミド (大阪大

CUA

学の遠藤博士より供与）に部位特異的に変異導入し、それにより、 T7プロモーターの制御下に酵母 tRNA^Phe — CAをコードするプラスミドを調製した。

GAA

[0070] 得られたプラスミド 30 gを、 1 X反応緩衝液〔ニューイングランドバイオラボ社製〕

110 Lに溶解させた。得られた溶液に、 20ユニットの Fokl〔ニューイングランドバィォラボ社製〕を添加し、得られた溶液を、 37°Cで 6時間インキュベーションし、ついで、 65°Cで 20分間インキュベーションした。得られた溶液は、精製せずに、転写反応に用いた。

[0071] Fokl 直鎖状化プラスミド溶液 55 μ Lと各 2 μ molの NTP (MBI社製）と 5 μ mol の GMP〔シグマ（Sigma)社製〕と 80Uの RNaseインヒビター〔東洋紡績株式会社製〕と 1Uの無機ピロホスファターゼ〔カルビオケム一ノバビオケム（Calbiochem— Nova biochem)社製〕と 2200Uの T7 RNAポリメラーゼ〔東洋紡績株式会社製〕と 10 L の 10 X反応緩衝液〔組成： 400mM Tris— HCl (pH8. 0)、 200mM MgCl、 50

2 mM DTT]とを含む反応溶液 500 μ Lを、 37°C、 8時間インキュベーションし、転写反応を行なった。

[0072] キアジェン（QIAGEN)社製 DNAZRNAキットを用いて、転写された酵母 tRNA^Ph ° — CAを精製した。

GAA

[0073] (4)ミスァシレーシヨンされた全長 tRNAの調製

前記（3)で得られた tRNA^Phe — CA 10 gと、前記（2)で得られた L ナフチル

GAA

ァラ-ル pdCpAの DMSO溶液（L -ナフチルァラ-ル pdCpA 12pmol)と、 50U の T4 RNAリガーゼ〔タカラバイオ株式会社製〕とを含む反応溶液〔組成： 55mM Hepes— Na (pH7. 5)、 15mM MgCl、 3. 3mM DTT, ImM ATP] 20 ^ L を、 4°Cで 2時間インキュベーションし、 tRNA — CAと L—ナフチルァラ-ル pdC

GAA

pAとをライゲーシヨンさせた。得られた産物を、 0. 45M 酢酸カリウム水溶液 (pH5. 0) 40 /z Lで希釈した。

[0074] 得られた溶液に、フエノール Zクロ口ホルム Zイソアミルアルコール（25Z24ZD 6 0 μ Lを添カ卩して、 tRNA^Phe - CAと L -ナフチルァラ-ル pdCpAとから生成した

GAA

産物（Nap— tRNA)を含む水層を得た。得られた水層に、クロ口ホルム 60 μ Lを添加して、 Nap— tRNAを含む水層を得た。前記水層に、 100 (v/v) % エタノール 350 Lを添加し、ついで、 15000 X gの遠心分離により、 Nap— tRNA沈殿を回収した。回収した Nap— tRNA沈殿を、冷 70% (vZv)エタノール（120 L)で 1回洗浄し、真空下に乾燥させ、 ImM 酢酸ナトリウム水溶液 (pH5. 0) 4 Lに再懸濁させた。

[0075] 調製例 2〜5

調製例 1と同様にして、 Nap— tRNA^Phe 、 Nap— tRNA^Phe 、： Bph— tRNA^Phe

GAU CAC

、及び Ido - tRNA^Phe を得た。

GAU CAC

[0076] 実施例 1 Phe— S Aによる DHFR発現の抑制作用の確認

(1) DHFR発現铸型の構築

全 6個の Pheコドン（3個の UUUコドン及び 3つの UUCコドン）を含み、 N—末端に T7—タグを有する E. coliジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR[6])の mRNA铸型を、以下のように調製した。

[0077] E. coli DHFR遺伝子（6つの Pheを有する；以下、「pDHFR [6]」という）を含むプラスミド〔Post Genome Instituteの清水博士より供与〕と、商品名： QuikChan ge (登録商標） Site Directed Mutagenesis Kit〔ストラタジーン（Stratagene) 社製〕とを用いて、前記 DHFR[6]をコードする核酸の塩基配列における 6つの Phe コドンの全てを他のコドンに置換し、 Pheコドンを全く含まな!/、pDHFR [0]铸型を得た。なお、前記 DHFR[6]をコードする核酸において、 31位の UUUを GUUに、 10 3位の UUCを CUCに、 125位の UUUを UACに、 137位の UUCを UACに、 140 位の UUCを UACに、 153位の11111；を1；八1；に置換した。

[0078] また、 1つの Pheコドンを含む DHFR[1]铸型を、前記と同様の方法で、 pDHFR[0 ]の 137位の UUCコドンを元の UUCに戻すことにより調製した。

[0079] 得られた铸型 20ngを用い、 T7タグと SD配列とを有するフォワードプライマー（4p mol) S列番号： 1 ; 5'— (AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGG TGGACAGCAAATG GGTATCAGTCTGATTGCG) 3'〔オペロン (Opero n)社製〕 ]と、リバースプライマー（4pmol) 己列番号： 2； 5'— (TATTCATTACCG CCG CTCCAGAATCTCATAGCAATAGCT) - 3 '〔オペロン（Operon)社製〕]と、 1. 25Uの Pfu Ultra HF DNAポリメラーゼ〔ストラタジーン（Stratagene) 社製〕と、各 4nmolの dNTP〔東洋紡績株式会社製〕と 10 X Pfu Ultra HF反応緩衝液 2 /z Lとを含む反応混合物 20 /z L中で、 1st PCRを行なった。その後、得られた PCR産物を、ァガロースゲル電気泳動に供し、精製し、精製 1st PCR産物を得た。

[0080] 精製 1st PCR産物 0. lpmolを铸型として用い、 T7プロモーターを有するュ- バーサルプライマー（4pmol) S列番号： 3； 5，一 d (GAAATTAATACGACTCA

AACTTTAAGAAGGAGATATACCA) - 3，〔オペロン（Operon)社製〕 ]とリバースプライマー 4pmolと、 1. 25Uの Pfu Ultra HF DNAポリメラーゼと、各 4n molの dNTPと、 10 X Pfu Ultra HF反応緩衝液 2 Lとを含む反応混合物 20 μ L中で、 2nd PCRを行なった。得られた二本鎖铸型 DNAは、 Τ7プロモーターと、 SD配列と開始コドン (ATG)と、 Ν末端における Τ7タグ配列と、終止コドン（ΤΑΑ )とを有する DNAであった。

[0081] 得られた DNAを铸型とし、商品名： Τ7 MEGAshortscriptキット〔アンビオン (Α mbion)〕を用いた T7 1：1111—0££転写にょり、011?1^[ ] mRNA (x=6、 1又は 0) を得、商品名： RNeasy MinElute Clean Upキット〔キアジェン（Qiagen)社製〕で精製した。

[0082] (2) DHFRの翻訳及びウェスタンブロット解析

5 ,u M 5，— Ο— [Ν— (フエ-ルァラ -ル）スルファモイル]アデノシン〔Phe— SA ( RNA— TEC製)〕の存在下又は非存在下に、再構成 E. coli翻訳溶液 [Classic 1 ( ポストゲノムインスティチュート（Post Genome Institute)製〕 8 1^を、37。〇又は 50。Cで 0、 30又は 60分インキュベーションした。

[0083] その後、得られた産物に、 mRNA铸型 1. 8 gと Nap— tRNA 5 μ gとを添カロ又は mRNA铸型 1. 8 gのみを添加して全 11. 5 μ Lとし、得られた混合物を 37°Cで 60分間インキュベーションして、翻訳を行ない、 T7タグタンパク質を得た。

[0084] 得られた産物を、試料ローデイング緩衝液〔125mM Tris—HCl (pH7. 4)、 4 (w /v) % SDS, 20 (w/v) % グリセローノレ、 0. 002 (wZv) % ブロモフエノーノレブノレ一、 10 (v/v) % 2—メノレカプトエタノーノレ〕 25 μ Lと水 13. 5 Lと混合した。得られた試料を、 95°Cで 5分間インキュベーションした。ついで、得られた溶液 5 μ Lを、商品名： Mini Protein SPR300 system〔バイオラッド（Bio— Rad)社製〕を用いた 15% SDS— PAGEに供した。その後、泳動後のゲル上のタンパク質を、商品名： Trans— Blot SD system 〔バイオラッド（Bio— Rad)社製〕を用いて、 PV DF膜〔商品名： Hybond™— P、アマシャム (Amersham)社製〕に転写させた。

[0085] その後、前記 PVDF膜上の T7タグタンパク質を、抗 T7— HRPコンジュゲート〔ノバジェン（Novagen)社製〕と商品名： ECL Plus'^M Western Blotting Detection Reagent〔アマシャム (Amersham)社製〕とにより可視化させた。その結果を、図 1 に示す。

[0086] また、 DHFR [0]及び DHFR[ 1]の収率について、別の同じ条件下で得られた DH FR[6]の収率を参照して、連続希釈された（10%、 20%、 40%、 60%、 80%、 100 %) DHFR [6]溶液のセットを用いたキャリブレーション後、少なくとも 3回の実験のパ一セント平均値士 SD (標準偏差)として示した。

[0087] その結果、図 1のレーン 11に示されるように、 DHFR[0]が、 Phe— SAによりほとんど影響を受けず、効率よく合成されるのに対し、レーン 8に示されるように、 Phe - SA の存在下で、 DHFR[6]は、 10%以下に、強く抑制されることがわかる。

[0088] また、図 1に示されるように、翻訳開始前に、 Phe— SAの存在下に、 37°Cで 30分又は 60分プレインキュベーションする処理により、 DHFR[0]の収量は、レーン 6及び 7それぞれに対して、レーン 12及び 13それぞれにおいて、 90%以上であり、顕著に減少することなぐ実質的に、 DHFR[6] (レーン 9及び 10)の収量を抑制することがわカゝる。 [0089] 実施例 2 Phe— tRNA複合体の形成が阻害される条件下における Nap— tRNAを用いたタンパク質の翻訳

Phe— SA (RNA— TEC製）の存在下又は非存在下に、再構成 E. coli翻訳溶液 [Classic 1 (ポストゲノムインスティチュート（Post Genome Institute)製〕を、 37°C又は 50°Cで 0、 30又は 60分インキュベーションした。

[0090] その後、 137位における 1つの Pheコドン（UUU)を有する DHFR[ 1] mRNA铸型 1. と Nap— tRNA^Phe 5 gとの添カロ又は mRNA铸型 1. のみの

GAA

添加をして全 11. とし、得られた混合物を 37°Cで 60分間インキュベーションして、翻訳を行ない、 T7タグタンパク質を得た。

[0091] 得られた産物を、試料ローデイング緩衝液〔125mM Tris—HCl (pH7. 4)、 4 (w /v) % SDS, 20 (w/v) % グリセローノレ、 0. 002 (wZv) % ブロモフエノーノレブノレ一、 10 (v/v) % 2—メノレカプトエタノーノレ〕 25 μ Lと水 13. 5 Lと混合した。得られた試料を、 95°Cで 5分間インキュベーションした。ついで、得られた溶液 5 μ Lを、商品名： Mini Protein SPR300 system〔バイオラッド（Bio— Rad)社製〕を用いた 15% SDS— PAGEに供した。その後、泳動後のゲル上のタンパク質を、商品名： Trans— Blot SD system 〔バイオラッド（Bio— Rad)社製〕を用いて、 PV DF膜〔商品名： Hybond™— P、アマシャム (Amersham)社製〕に転写させた。

[0092] その後、前記 PVDF膜上の T7タグタンパク質を、抗 T7— HRPコンジュゲート〔ノバジェン（Novagen)社製〕と商品名： ECL Plus'^M Western Blotting Detection Reagent〔アマシャム (Amersham)社製〕とにより可視化させた。その結果を図 2に示す。

[0093] その結果、図 2に示されるように、 Phe— SA存在下にプレインキュベーションされた反応混合物中、 Nap -tRNA^Phe の存在下、翻訳を行なった場合、全長 DHFR[ 1

GAA

]は、レーン 2の通常の条件の場合に比べ、 100%以上の収率で回収されることがわかる。

[0094] 実施例 3 Napを 1つ含有する化合物の製造 1

( 1)オリゴペプチド発現铸型の構築

1つの !¾6 (9位の111；じコドン）と他の 12アミノ酸とを有する 24マーのオリゴぺプチド H N— fMKETAAAKFERQHMDSDYKDDDDK— CO H〔配列番号： 4 ;m

2 2

/z = 2902. 26)【こ対する mRN Aを以下のよう【こ作製した。

[0095] SD配列を有するフォワードプライマーほ己列番号： 5； 5 ' - AAGG AG ATATACC AATGAAAGAAACCGCTGCTGC— 3，〕 4pmolと、リバースプライマーほ己列番号： 6； 5，— (TATTCATTACTTGTCATCGTCATCCT)— 3，〕 4pmolと、合成 DNA铸型 0. lpmolと、商品名： Pfu Ultra HF DNAポリメラーゼ〔ストラタジーン（Stratagene)社製〕 1. 25Uと、各 4nmolの dNTP〔東洋紡績株式会社製〕と 10 X Pfu Ultra HF反応緩衝液 2 Lとを含む反応混合物 20 /z L中で 1st P CRを行なった。 PCR条件は、 95°C3分、（95°C1分と 51°C1分、 72°C1分）を 30サイクル、 72°C 10分であった。なお、前記合成 DNA铸型として、 5' -ATGAAAGAA

AAGGATGACGATGACAAGTAA— 3，（配列番号： 7)〔オペロン（Operon)社製〕を用、た。前記配列番号： 7中、 FLAG—タグ〔 AspTyrLy sAspAsp Asp AspLy s (配列番号： 8)〕をコードする塩基配列は、塩基番号: 48〜72であり、 Pheコドン (T TC)は、塩基番号： 25〜27である。

[0096] IstPCR後、得られた産物を、ァガロースゲル電気泳動で精製した。

[0097] 得られた 1st PCR産物 0. lpmolと、 T7プロモーターを有するユニバーサルプライマ一ほ S列番号： 3； 5，— d (GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAC

GAGATATACCA)—3，〕 4pmolと、リバースプライマー 4pmolと、商品名： Pfu Ultra HF DNAポリメラーゼ 1. 25Uと、各 4nmolの dNTPと、 lO X Pfu Ultr a HF反応緩衝液 2 Lとを含む反応混合物 20 L中で 2nd PCRを行なった。 PCR条件は、 95°C3分のインキュベーションの後、 95°C1分と 47°C1分と 72°C1分とを 1サイクルとする 30サイクル、 72°C 10分のインキュベーションであった。

[0098] 得られた二本鎖铸型 DNAは、 T7プロモーターと、 SD配列と開始コドン (ATG)と 1 つの Pheコドン（TTC)と FLAGタグとを有する。商品名： T7 MEGAshortscriptキット〔アンビオン (Ambion)社製〕を用い、前記二本鎖铸型 DNAの T7 run— off転写を行ない、オリゴペプチド発現铸型 mRNAを得た。得られたオリゴペプチド発現铸型 mRNAを、商品名： RNeasy MinElute Clean Up Kit〔キアジェン（Qiagen )社製〕で精製した。

[0099] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

再構成 E. coli翻訳溶液〔40 レ Classic I、ポストゲノムインスティチュート（Post Genome Institute)製〕を、 5 M Phe— SA〔RNA—TEC製〕存在又は非存在下に、 37°C又は 50°Cで 0又は 30分プレインキュベーションした。

[0100] プレインキュベーション後の溶液に、 mRNA铸型 10 μ gを添カ卩すること又は Nap

-tRNA 20 /z gと共に mRNA録型 10 gを添カロすることにより、全反応液量 55. 5 Lとし、 37°Cで 60分間インキュベーションして翻訳を行なった。

[0101] 得られた産物に、 Anti— FLAG™ M2ァフィ二ティーゲル〔シグマ（Sigma)社製〕と、溶解緩衝液〔組成： 50mM Tris—HCl (pH7. 4)、 150mM NaCl、 1 mM EDTA、0. 05% Tween™— 20〕 350 Lとを添カ卩した。得られた混合物を、 4°Cで 5時間、穏やかに反転させた。得られた産物を、商品名： MicroSpinカラム〔アマシャム (Amersham)社製〕に供し、 1000 X g、 5秒間の遠心分離でろ過した。ろ過後に得られた前記 Anti— FLAG™ M2ァフィ二ティーゲルのァガロースビーズを、予め冷却した TBS緩衝液〔組成： 50mM Tris— HCl (pH7. 4)、 150mM NaCl 〕 300 μ Lので 5回洗浄した。洗浄後のァガロースビーズを、抽出緩衝液〔組成： 0. 1M グリシン HCl (pH3. 5)〕 170 Lに再懸濁させた。得られた懸濁物を、室温で 5分間、穏やかに振盪させながらインキュベーションし、 1000 X g、 5秒間の遠心分離でろ過した。

[0102] 得られたろ液に、 1. 5M NaClを含む 0. 5M Tris— HCl (pH7. 4) を添加した。得られた溶液を、商品名： Mini Dialysis kit lkDaカットオフ、アマシャム (Amersham)社製で大量の蒸留水に対して 12時間透析し、精製オリゴペプチド溶液を得た。得られた精製オリゴペプチド溶液 1 μ Lを、 0. 3% トリフルォロ酢酸を含む水とァセトニトリルとの 1： 1混合液に溶解させた 10mg/mL a—シァノ一 4—ォキシ桂皮酸溶液 4 Lに添加した。

[0103] 得られた混合物（2 μ L)を、 MALDIプレートにスポットし、空気乾燥させ、解析した。なお、 Napが Pheの代わりに取り込まれた場合、得られたペプチドのマスは、 mZz = 2952. 28であり、（Nap— Phe)のマスシフト = + 50. 06Daである。 MALDI— T OF MSスペクトルの結果を図 3に示す。

[0104] その結果、図 3の（a)に示されるように、通常の翻訳条件で得られたペプチド産物は、 Sタグアツセィにより測定して、翻訳混合物 50 L力ら精製ペプチド 260± 30ng であり、 2901. 76m/z【こシグナノレを示した【こすぎな!/ヽ。また、図 3の（b)【こ示されるように、 Nap— tRNA^Phe を添カロすることにより、 2951. 44m/zにお!/、て常に ¾

GAA

い別のシグナルの出現をもたらした。これに対して、図 3の（c)に示されるように、フエ二ルァラニンの触媒再ァシル化が、 Phe— SAの添カ卩により阻害された場合、 Nap含有ノヽイブリツドペプチドに対応する別のより高い 2951. 59のシグナルが、容易に検出できるようになった。また、図 3の（d)に示されるように、 Phe— SA存在下、 37°Cで 30分間インキュベーションすることにより、 2951. 58mZz付近のシグナルとして示される主要産物として Nap含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。さらに、図 3の（e)に示されるように、 Phe— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーションにより、 2951. 62mZz付近のシグナルとして示される主要産物として Nap含有ハイブリツドペプチドが得られることがわかる。

[0105] 実施例 4 Napを 1つ含有する化合物の製造 2

(1)オリゴペプチド発現铸型の構築

1つの 116 (9位の八11じコドン）と他の 12アミノ酸とを有する 24マーのオリゴペプチド H N— fMKETAAAKIERQHMDSDYKDDDDK—CO H〔配列番号： 9

2 2 ;mZz

= 2868. 27)に対する mRNAを実施例 3と同様にして作製した。

[0106] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

実施例 3と同様の手法により Pheコドンの代わりに、 lieコドンを Nap導入対象コドンとし、同様の条件における Nap含有ノヽイブリツドペプチドの形成を調べた。その結果を図 4に示す。

[0107] 図 4に示されるように、 5 M lie— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーションにより、 2951. 5 lmZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく N ap含有ノヽイブリツドペプチドが得られることがわかる。

[0108] 実施例 5 Napを 1つ含有する化合物の製造 3 (1)オリゴペプチド発現铸型の構築

1つの Val (l l位の GUGコドン）と他の 12アミノ酸とを有する 24マーのオリゴぺプチド H N— fMKETAAAKFEVQHMDSDYKDDDDK— CO H〔配列番号： 10 ;m

2 2

/z = 2856. 03)に対する mRNAを実施例 3と同様にして作製した。

[0109] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

Val— SA濃度を 10 μ Μとし、 Pheコドンの代わりに、 Valコドンを Nap導入対象コドンとし、プレインキュベーションを 50°C、 30分で行った以外は実施例 3と同様の手法及び条件で Nap含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図 5に示す。

[0110] 図 5に示されるように、 10 M Val— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーシヨンにより、 2953. 74mZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく Nap含有ノヽイブリツドペプチドが得られることがわかる。

[0111] 実施例 6 Bphを 1つ含有する化合物の製造

(1)オリゴペプチド発現铸型の構築

実施例 4と同様にして、同様の mRNAを作製した。

[0112] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

非天然アミノ酸として Bph (Bph-tRNA 20 μ g)を用い、 lieコドンを Bph導入

GAU

対象コドンとし、プレインキュベーションを 50°C、 30分で行った以外は実施例 3と同様の手法及び条件で Bph含有ノヽイブリツドペプチドの形成を調べた。その結果を図 6に示す。

[0113] 図 6に示されるように、 5 /z M lie— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーションにより、 2978. 72mZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく B ph含有ノ、イブリツドペプチドが得られることがわかる。

[0114] 実施例 7 Idoを 1つ含有する化合物の製造

(1)オリゴペプチド発現铸型の構築

実施例 5と同様にして、同様の mRNAを作製した。

[0115] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

非天然アミノ酸として Ido (ido-tRNA g)を用い、 Valコドンを Ido導入対

CAC

象コドンとし、実施例 5と同様の手法及び条件で Ido含有ハイブリッドペプチドの形成を調べた。その結果を図 7に示す。

[0116] 図 7に示されるように、 10 M Val— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーシヨンにより、 3029. 54mZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく Ido含有ノヽイブリツドペプチドが得られることがわかる。

[0117] 以上の結果より、任意のアミノ酸コドンを、任意の非天然アミノ酸導入対象コドンとして用いることができることがわ力る。

[0118] 実施例 8 PheOHを 1つ含有する化合物の製造

前記実施例 3における Napに代えて、 PheOH (ヒドロキシフエ-ルァラニン）を用い

、実施例 3と同様に、 PheOH含有ハイブリッドペプチドを形成させた。ついで、得られた産物を希釈アンモニア水で加水分解し、生じた産物を調べた。結果を図 8に示す。

[0119] その結果、図 8に示されるように、 Phe— SA存在下におけるプレインキュベーション後にヒドロキシフエ-ルァラニン付カ卩 tRNAを添カ卩したサンプルでは、エステルカロ水分解により全長ポリペプチドのバンドが時間経過とともに消失していることが確認されたため、 PheOHがペプチド鎖に導入されていることがわかった。

[0120] 実施例 9 Napを 2つ含有する化合物の製造

(1)オリゴペプチド発現铸型の構築

2つの Phe (9位と 10位の UUCコドン）と他の 12アミノ酸とを有する 25マーのオリゴペプチド H N - f MKETAAAKFFERQHMDSDYKDDDDK - CO H〔配列番

2 2 号： 11 ;mZz = 3049. 32)に対する mRNAを実施例 3と同様にして作製した。

[0121] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

非天然アミノ酸として Nap (Nap-tRNA g)を用い、プレインキュベーショ

GAA

ンを 50°C、 30分で行った以外は実施例 3と同様の手法及び条件で Nap含有ハイブリツドペプチドの形成を調べた。その結果を図 9に示す。

[0122] 図 9に示されるように、 5 /z M Phe— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーシヨンにより、 3149. 85mZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく

Nap含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

[0123] 実施例 10 Bphを 2つ含有する化合物の製造 (1)オリゴペプチド発現铸型の構築

2つの lie (9位と 10位の AUCコドン）と他の 12アミノ酸とを有する 25マーのオリゴぺプチド H N— fMKETAAAKIIERQHMDSDYKDDDDK— CO H〔配列番号： 1

2 2

2 ;m/z = 2981. 35)に対する mRNAを実施例 3と同様にして作製した。

[0124] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

GAU

対象コドンとし、プレインキュベーションを 50°C、 30分で行った以外は実施例 3と同様の手法及び条件で Bph含有ノヽイブリツドペプチドの形成を調べた。その結果を図 10 に示す。

[0125] 図 10に示されるように、 5 /z M lie— SA存在下、 50°Cで 30分間のインキュベーシヨンにより、 3201. 94mZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく Bph含有ハイブリッドペプチドが得られることがわかる。

[0126] 以上の結果より、複数のアミノ酸コドンに、非天然アミノ酸を導入することができることがわかる。

[0127] 実施例 11 Napと Bphとを含有する化合物の製造

(1)オリゴペプチド発現铸型の構築

それぞれ 1つの Phe (9位の UUCコドン）と lie (10位の AUCコドン）と他の 12ァミノ酸とを有する 25マーのオリゴペプチド H N— fMKETAAAKFIERQHMDSDYK

2

DDDDK—CO Hほ己列番号： 13 ;mZz = 3015. 34)に対する mRNAを実施例 3

2

と同様にして作製した。

[0128] (2)オリゴペプチドの翻訳、精製及び質量分析

非天然アミノ酸として Nap (Nap tRNA 20 μ g)及び Bph (Bph tRNA

GAA GAU

20 g)を用い、 Pheコドンを Nap導入対象コドン、 lieコドンを Bph導入対象コドンとし、プレインキュベーションを 50°C、 30分で行った以外は実施例 3と同様の手法及び条件で Nap及び Bph含有ノヽイブリツドペプチドの形成を調べた。その結果を図 11に示す。

[0129] 図 11に示されるように、 5 /z M Phe— SA及び lie— SA存在下、 50°Cで 3 0分間のインキュベーションにより、 3175. 97mZz付近のシグナルとして示される主要産物として、効率よく Nap及び Bph含有ノ、イブリツドペプチドが得られることがわかる。

[0130] 以上の結果より、複数種のアミノ酸コドンに、それぞれ異なる非天然アミノ酸を導入することができることがゎカゝる。

[0131] 略語一覧

Nap :ナフチルァラニン

Bph：ビフエ二ルァラニン

Ido：ョードフエ二ルァラニン pdCpA: 5，一ホスフェート一 2，ーデォキシシチジリル一（3，一 5，）アデノシン産業上の利用可能性

[0132] 本発明により、単離された mRNA又はクローンィ匕された DNAから得られた mRNA を用いて、簡便に、非天然アミノ酸及び又はヒドロキシ酸含有化合物を製造することがでさる。

配列表フリーテキスト

[0133] 配列番号： 1は、プライマーの配列である。

[0134] 配列番号： 2は、プライマーの配列である。

[0135] 配列番号： 3は、プライマーの配列である。

[0136] 配列番号： 4は、オリゴペプチドの配列である。

[0137] 配列番号： 5は、プライマーの配列である。

[0138] 配列番号: 6は、プライマーの配列である。

[0139] 配列番号： 7は、プライマーの配列である。

[0140] 配列番号: 8は、プライマーの配列である。

[0141] 配列番号： 9は、オリゴペプチドの配列である。

[0142] 配列番号： 10は、オリゴペプチドの配列である。

[0143] 配列番号： 11は、オリゴペプチドの配列である。

[0144] 配列番号： 12は、オリゴペプチドの配列である。

[0145] 配列番号： 13は、オリゴペプチドの配列である。

Claims

請求の範囲

[1] タンパク質翻訳系にお、て、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グノレタミン酸、グノレタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンカなる群より選択されたアミノ酸 Xと該アミノ酸 Xに対する tRNAとの結合を阻害する条件下で、非天然アミノ酸又はヒドロキシ酸ィヒ合物と前記アミノ酸 Xに対する tRNAとの複合体を形成し、タンパク質翻訳反応条件下に翻訳を行なわせることを特徴とする非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有化合物の製造方法。

[2] アミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質により、ァミノ酸 Xに対する tRNAと、アミノ酸 Xとの結合を阻害する、請求項 1記載の製造方法。

[3] 該阻害物質が、 5'— O— [N— (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体ィ匕合物である、請求項 2記載の製造方法。

[4] (A)タンパク質翻訳系にお!/、て、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンカゝらなる群より選択されたアミノ酸 Xに対する tRNAと該アミノ酸 X との結合を阻害する条件下に、さらに該アミノ酸 X以外のアミノ酸 Yに対する tRNAと該アミノ酸 Yとを結合させる工程、並びに

を含む、請求項 1〜3いずれか 1項に記載の製造方法。

[5] 1)ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエニルァラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びパリンからなる群より選択されたアミノ酸 Xに特異的なアミノアシル tRNA合成酵素に対する阻害物質と、

2)非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸化合物と、 3)タンパク質翻訳系と、

を含有してなる、請求項 1〜4いずれか 1項に記載の非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸含有ィ匕合物の製造方法に用いるためのキット。

[6] 阻害物質が、 5'— O— [N— (アミノアシル)スルファモイル]アデノシン誘導体ィ匕合物である、請求項 5記載のキット。

[7] 非天然アミノ酸及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物に代えて、非天然アミノ酸— tRNA 及び Z又はヒドロキシ酸ィ匕合物—tRNAを含有してなる、請求項 5又は 6記載のキット