WO2006085040A1 - Procede de detection des interactions entre un recepteur couple aux proteines g (rcpg) et l' une des sous-unites galpha ou galpha/gamma d' une proteine g - Google Patents

Procede de detection des interactions entre un recepteur couple aux proteines g (rcpg) et l' une des sous-unites galpha ou galpha/gamma d' une proteine g Download PDF

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WO2006085040A1
WO2006085040A1 PCT/FR2006/050127 FR2006050127W WO2006085040A1 WO 2006085040 A1 WO2006085040 A1 WO 2006085040A1 FR 2006050127 W FR2006050127 W FR 2006050127W WO 2006085040 A1 WO2006085040 A1 WO 2006085040A1
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receptor
acceptor
protein
fluorophore
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PCT/FR2006/050127
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Hervé ANSANAY
Michel Fink
Gérard Mathis
Damien Maurel
Eric Trinquet
Jean-Philippe Pin
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Cis Bio International
Centre National De La Recherche Scientifique
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Definitions

  • a method of detecting interactions between a G-protein coupled receptor (GPCR) and a Galpha or Galpha / gamma subunit of a G protein is described.
  • the present invention relates to a method for detecting the interactions between a G-protein coupled receptor (GPCR) and one of the Ga or G ⁇ subunits of a G protein by proximity effect transfer between the two members of a pair donor / acceptor and its applications, such as in particular the screening of new drugs and the identification of orphan receptors.
  • GPCR G-protein coupled receptor
  • transfer by proximity effect refers to a transfer of energy characterized by a FRET signal (HTRF® technology, CIS BIO INTERNATIONAL), a singlet oxygen transfer (Alphascreen® technology, PerkinElmer, see for example, Beaudet et al., Genome Res., 2001 Apr. 11 (4), 600-8), electron transfer (SPA technology, Amersham Biosciences, see, for example, Udenfriend et al., Anal Biochem, 1987). , Mar., 161 (2), 494-500).
  • the Time Resolved Fluorescence Resonance Energy (TR-FRET) technique allows fluorescence measurement in time resolved and in a homogeneous medium.
  • TR-FRET Time Resolved Fluorescence Resonance Energy
  • the implementation of this technique with rare earth chelates or cryptates, developed in particular by G. Mathis et al. (see in particular "Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptates as a tool for molecular interaction in biology", Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) has many advantages that have already allowed several applications in the field. in vitro diagnostics and high throughput screening in the pharmaceutical industry.
  • This technique also known as HTRF® (Homogenous Time Resolved Fluorescence) uses a first fluorescent donor compound and a second acceptor fluorescent compound.
  • GPCRs G-protein coupled transmembrane domain receptors
  • an agonist ligand modifies the tertiary structure thereof, which in turn activates G protein coupled to GPCR.
  • Activation of the G protein causes, as appropriate, the activation or inhibition of an effector that produces a second intracellular messenger such as cAMP or I 1 IP 3 .
  • orphan receptors refers to transmembrane receptors whose DNA sequence suggests that it is RCPG but whose specific natural ligand is unknown.
  • a ligand detection method uses a non-hydrolysable GTP radioactive derivative, namely GTPy [ 35 S] which binds to Ga protein when GPCR is activated.
  • GTPy [ 35 S] binds to Ga protein when GPCR is activated.
  • the kinetic parameters of the GTP analog binding are dependent on the type of G protein. This radioactive method is not suitable for high throughput screening of drugs.
  • the activation of the effectors and the production of second messengers such as I 1 cAMP or PIP 3 are produced after stimulation of the GPCR and G protein. This method therefore focuses on substances produced downstream of the GPCR process.
  • Methods adapted to high-throughput drug screening utilize recombinant systems based on the measurement of enzyme activity, such as ⁇ -galactosidase or luciferase activity, the expression of which is controlled by the latter. messengers produced by the activation of GPCR. These are indirect methods of measuring GPCR activity, which are also relevant to substances produced downstream of the GPCR activation process.
  • Another method of ligand detection focuses on the translocation of arrestin-GFP.
  • Arrestin is involved in the regulatory machinery that extinguishes the activation path triggered by ligand binding to GPCR. It makes it possible to trigger the process of internalization of the receptor in the cell, a step necessary for its degradation or recycling on the cell membrane.
  • the technology developed by NORAK BIOSCI uses Parrestin fused to a fluorescent protein (GFP) (arrestin-GFP) that is expressed in cells. Under normal conditions, arrestin-GFP is distributed in cystosol. After activation of GPCR, arrestin-GFP will interact with GPCR present in the membrane and stimulated by an agonist. Its cellular distribution will therefore be modified.
  • arrestin-GFP The fluorescence of arrestin-GFP attached to its receptor may also be measured in the vicinity of internal vesicles (endosomes) to the cell that reflect the phenomenon of endocytosis of certain receptors.
  • Another method is to insert molecular biology fluorescent protein (CFP and YFP) in a GPCR, at the 3 rd intracellular loop and C-terminal part, respectively, and measure, by variation of a signal FRET , activation of the receiver.
  • CFP and YFP molecular biology fluorescent protein
  • Another method is to detect the oligomerization of GPCRs by the FRET technique (US Patent 6,824,990 B1).
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the measurement of the proximity effect transfer signal takes into account the activation state of a given RCPG / Ga pair or a given RCPG / G ⁇ pair. This signal is therefore highly specific since it is generated by a single pair necessarily composed of a GPCR of interest and one of the Ga or G ⁇ subunits of the corresponding G protein.
  • This signal of the proximity effect transfer can be modulated, positively or negatively, when the receptor is specifically stimulated by a pharmacological agent (agonist, inverse agonist, antagonist or allosteric regulator).
  • the invention also provides an advantage in terms of response specificity since it considers an early event in the activation pathway of the GPCR of interest. In contrast to previously known methods, it is located well in advance of the GPCR signaling pathway and takes into account the close interactions between GPCR / G protein in the absence or presence of potential pharmacological agents.
  • the subject of the present invention is a method for detecting the interactions between a receptor and one of the Ga or G ⁇ subunits of a G protein, which comprises the steps of:
  • the method of the invention which makes it possible to detect the interactions between a receptor and one of the Ga or G ⁇ subunits of a G protein, is particularly suitable for;
  • the contacting of the labeled receptor with one of the Ga or G ⁇ subunits of a G protein can be done in different ways, for example by coexpression in nucleic acid cells coding for the receptor of a part and for one of the Ga and G ⁇ subunits on the other hand, or by reconstitution of a functional GPCR (comprising the subunits forming the GPCR and the G protein subunits) obtained by heterologous expression of nucleic acids encoding said subunits forming the receptor on the one hand and the subunits encoding the subunits of the G proteins on the other, or after purification from tissue extracts (see for example Florio et al. JBC 1985, vol.260 No. 8, pp. 3477-3483, Haga K.
  • the bringing into contact is carried out initially, in the presence of a natural ligand of said GPCR which triggers the activation of said receptor, then in the presence of a potential pharmacological agent or any other molecule to be tested, capable of modulating the activity of said receptor.
  • the contacting is performed in the presence of a natural ligand of a known receptor which will, if there is interaction, identify said orphan receptor.
  • the detection of a potential pharmacological agent or any other test molecule capable of modulating the activity of said orphan receptor is carried out as indicated above for a known receptor.
  • the members of the donor / acceptor pair used in the process of the invention are chosen according to the mode of transfer by proximity effect that it is desired to measure.
  • the donor / acceptor pair will consist of an energy donor fluorophore and an energy acceptor fluorophore.
  • Suitable fluorophores for the purposes of the invention are fluorescent molecules chosen from fluorescent proteins or organic fluorophores.
  • fluorescent molecules are rhodamines, cyanines, squaraines, fluorophores known under the name BODIPYs, such as, for example, difluoroboradiazaindacene derivatives, fluoresceins, compounds known under the name AlexaFluor, rare earth chelates, rare earth cryptates, nano-crystals of the Quantum dots type, fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) or its variants, fluorescent proteins extracted from corals, phycobiliproteins, such as B-phycoerythrin, R- phycoerythrin, C-phycocyanin, allophycocyanines, in particular those known under the name XL665 or the fluorescent compounds described in WO 2003/104685.
  • GFP green fluorescent protein
  • proximity effect transfer is an electron transfer
  • those described in Anal will be used as a donor / acceptor pair. Biochem., 1987, Mar., 161 (2), 494-500.
  • the receptor used in the method of the invention is advantageously a known GPCR, such as the muscarinic receptor, the vasopressin receptor, the GABA receptor (gamma-amino-butyric acid) or a GPCR whose character is to be characterized. function, namely an orphan receiver.
  • GPCR such as the muscarinic receptor, the vasopressin receptor, the GABA receptor (gamma-amino-butyric acid) or a GPCR whose character is to be characterized. function, namely an orphan receiver.
  • DNA sequences coding for these receptors may be amplified by PCR according to conventional molecular biology techniques known to those skilled in the art (see Sambrook et al., Below) or are commercially available (Invitrogen).
  • the Ga and G ⁇ subunits to be used in the process of the invention may be the Gi, Gs, Gq or G12 / G13, G14, G15 or G16 subunits or chimeric G proteins (with a structure of the type Gqx (x being essentially s, i, o) (see Conklin et al., Nature, 1993, v363 pp274-6, Milligan and Rees Trends Pharmacol ScL, 1999, v20 ppl 18-24), the sequences and properties of which are known. of the skilled person.
  • DNA sequences encoding subunits can be amplified by PCR according to conventional molecular biology techniques known to those skilled in the art (see Sambrook et al., Below) or are commercially available (Invitrogen).
  • the labeling of the receptor and of one of the Ga or G ⁇ subunits is carried out either directly by one or more covalent bonds according to techniques well known to those skilled in the art (Janetopoulos et al., Methods (2002) 27: 366 373 and Vilardaga et al., Nat Biotechnol (2003) 21, 807-812, for example), or indirectly via tag-like binding partners (anti-tag antibody).
  • tag tag
  • antigen / antibody avidin or streptavidin / biotin; hapten / antibodies.
  • the measurement of the proximity effect transfer signal is carried out according to the standard methods well known to those skilled in the art and described for example in the articles mentioned above.
  • variations in the FRET signal can be measured quantitatively by conventional fluorescence detectors commonly used by those skilled in the art in high throughput screening laboratories (RUBYSTAR, BMG labtech).
  • the measurement of the FRET signal variations makes it possible to directly report on the activation or inactivation state of a GPCR and therefore has a solution adapted to the search for molecules modulating the function of these receptors in a high-throughput screening. debit.
  • step 1) of the process of the invention is carried out by transfection of the cells with a nucleic acid coding for a receptor and with a nucleic acid coding for a Ga or G ⁇ subunit of a G protein, the receptor and the Ga or G ⁇ subunit being coupled with one member of a donor / acceptor pair and the other with the second member of said donor / acceptor pair.
  • step 1) of the method consists in bringing preparations of transfected cells into contact with a nucleic acid coding for a receptor and with a nucleic acid coding for a Ga or G ⁇ subunit of a G protein, the receptor and the Ga or G ⁇ subunit being coupled one with a member of a donor / acceptor pair and the other with the second member of said donor / acceptor pair, with a test substance.
  • step 2) of the process of the invention is carried out as follows:
  • the signal obtained in the presence of a specific ligand of this GPCR which will trigger the activation of this receptor is optionally compared to the basal signal;
  • the donor / acceptor pair is a pair consisting of a donor fluorophore and of an acceptor fluorophore and the measured signal is the FRET signal emitted after light excitation of the measurement medium at the excitation wavelength of the donor fluorophore.
  • the subject of the present invention is also the cells transfected with a nucleic acid sequence coding for a GPCR and with a nucleic acid sequence coding for a Ga or G ⁇ subunit of the corresponding G protein, the GPCR receptor and the GFP subunit.
  • -unit Ga or G ⁇ being coupled one with a donor fluorophore and the other with an acceptor fluorophore.
  • the subject of the invention is also the membrane preparations of transfected cells as defined above, which are obtained according to the standard methods well known to those skilled in the art.
  • the subject of the invention is a kit which comprises the transfected cell preparations as defined above, as well as the means necessary for the measurement of the FRET signal.
  • transfected cells refers to the transfected cells themselves, the transfected cells permeabilized according to the methods known to those skilled in the art and illustrated by Example 1 as well as cell membrane preparations. transfected or membrane preparations obtained by reconstituting Ga and G ⁇ receptors and subunits in artificial plasma membranes.
  • the cells can be stably transfected, that is to say that the sequences coding for the receptor or the Ga or G ⁇ subunits are integrated in the genomic ADIM of the cells.
  • the cells may also be transiently transfected with a plasmid-like expression vector containing the nucleic acid sequence encoding the receptor and the nucleic acid sequence encoding one of the subunits. Ga or G ⁇ .
  • the cells used are eukaryotic cells, such as, for example, HEK 293 or COS cells.
  • Transfection can also be performed by heterologous expression in artificial plasma membranes.
  • the invention can be implemented on membrane preparations of transfected cells, the preparation of which is in the general knowledge of those skilled in the art, and essentially comprises steps of bursting the cells by hypo-osmotic buffer, sonication, polytron, and recovery of membrane fractions of interest. These membrane preparations can be further enriched by additional differential centrifugation steps or by sedimentation gradient. b) Fluorophores.
  • Fluorophores (fluorescent compounds) donors or acceptors which are suitable for the purposes of the invention are fluorescent substances chosen for example from rhodamines, cyanines, squaraines, fluorophores known under the name BODIPYs, fluoresceins, fluorophores known under the name AlexaFluor denomination, rare earth chelates, rare earth cryptates, quantum dots, fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) or its variants, fluorescent proteins extracted from corals, phycobiliproteins, such as B-phycoerythrin , R-phycoerythrin, C-phycocyanin, allophycocyanins, in particular those known under the name XL665.
  • GFP green fluorescent protein
  • the donor fluorophores may be any of the above fluorophores which, when excited at a given wavelength, transfer energy to an acceptor fluorophore.
  • the acceptor fluorophores are any of the above fluorophores capable of emitting a FRET signal upon energy transfer from the donor fluorophore.
  • the selection of the fluorophore donor / acceptor couple to obtain a FRET signal is within the abilities of those skilled in the art.
  • the excitation spectrum of the acceptor must cover at least part of the emission spectrum of the donor compound, and the transition dipoles of the donor and acceptor compounds must be parallel.
  • Donor-acceptor pairs that can be used to study the FREET phenomena are described in particular in Joseph R. Lakowicz's book (Principles of fluorescence spectroscopy, 2 nd edition 338), to which the person skilled in the art can refer.
  • the donor fluorophore is a rare earth complex, in particular terbium or europium.
  • the rare earth complex is a chelate or a cryptate, preferably a pyridine-patterned cryptate.
  • Rare earth chelates are described in particular in patents US 4,761,481, US 5,032,677, US 5,055,578, US 5,106,957, US 5,116,989, US 4,761,481, US 4,801,722 and US 4,794,191. , US 4,637,988, US 4,670,572, US 4,837,169, US 4,859,777.
  • Other chelates are composed of a nonadentant ligand such as terpyridine (EP 403,593, US 5,324,825, US 5,202,423). , US 5,316,909).
  • the rare earth cryptates are described in particular in the patents EP 0 180 492, EP 0 601 113 and the application WO 01/96 877.
  • the acceptor fluorophore is advantageously selected from cyanines or allophycocyanin, optionally crosslinked. c) The coupling of fluorophores.
  • the fluorophores are coupled to the Ga or G ⁇ receptor or subunits, either directly by one or more covalent bonds, or indirectly via tag (“tag”) / anti-antibody binding partners.
  • tag anti-tag
  • antigen / antibody avidin or streptavidin / biotin; hapten / antibodies.
  • the fluorescent compounds are conjugated to an antibody specifically recognizing said receptor, the Ga subunit, or the G ⁇ subunit;
  • TAGs Ga subunit or G ⁇ subunit bearing different labels
  • the fluorescent compounds are conjugated to antibodies specifically directed against said labels (TAGs).
  • the direct coupling of a fluorophore by expression of a fusion protein between the GPCR, the Ga subunit or the G ⁇ subunit with a protein having an irreversible enzymatic activity advantageously uses, as an active protein irreversible enzymatic, an O 6 -alkylguanine-DNA alkyl transferase (AGT) (see WO 02/083937) or a dehalogenase.
  • GAT O 6 -alkylguanine-DNA alkyl transferase
  • the cells are transfected with a nucleic acid encoding the GPCR, with a nucleic acid encoding the Ga subunit or the G ⁇ subunit and with a nucleic acid encoding said irreversibly enzymatic activity protein. They are then placed in the presence of the specific substrate of said enzymatically active protein, which is covalently bound to a fluorophore that is to be coupled to the receptor or to one of the Ga or G ⁇ subunits.
  • a fusion protein is expressed between the receptor, the Ga subunit or the G ⁇ subunit. and a peptide sequence called "tag” or “tag”, the fluorescent compounds being in this case conjugated to an antibody specifically recognizing the tag.
  • the peptide sequences commonly used in molecular biology, such as for example the "Myc” or “FLAG” labels mentioned below, are used.
  • ligand-receptor pair refers to two binding partners such as the pairs: hapten / antibody; DNP / anti-DNP antibody, in which DNP is dinitrophenol; GST / anti-GST antibody in which GST represents glutathione S-transferase; biotin / avidin; 6HIS / anti-6HIS antibody in which 6HIS is a peptide consisting of 6 histidines; Myc / anti-Myc antibody in which Myc is a peptide consisting of amino acids 410-419 of the human Myc protein; FLAG® / anti-FLAG® antibody in which FLAG® is a peptide having the 8 amino acids DYKDDDDK below; HA / anti-HA antibody in which HA is an epitope of the influenza hemagglutinin, consisting of the 9 amino acids hereinafter YPYDVPDYA.
  • Other couples can be used.
  • the FRET signal can be measured in different ways: measurement of the fluorescence emitted by the donor alone, by the donor and the acceptor or measurement of the polarization variation of the light transmitted in the medium due at FREIGHT. It is also possible to include the measurement of FRET by observing the change in lifetime at the donor level which is facilitated by the use of a donor with a long fluorescence lifetime such as rare earth complexes (especially on simple apparatus like plate readers).
  • the FRET signal will be measured in time resolved (TR-FRET signal).
  • the selectivity of the measurement of energy transfer can be improved by using the polarization properties of the donor and acceptor fluorophores.
  • the fluorescence emitted at the wavelength ⁇ 3 is measured in a plane of polarization different from the plane of polarization of the exciting light, ⁇ 3 being the wavelength at which the light of the acceptor fluorophore is emitted.
  • the measurement of the signal emitted at the emission wavelength of the acceptor fluorophore in a different (i.e. non-parallel) plane of the polarization plane of the exciting light makes it possible to promote the measurement of the signal emitted by the species strongly depolarized, and in particular the signal of the acceptor engaged in the transfer of energy.
  • the plane in which the measurement is made is preferably the plane orthogonal to the plane of polarization of the exciting light. Measurements in other plans may also be appropriate.
  • the technique using the polarization properties further comprises the following steps:
  • This correction may for example consist of a calculation of the ratio of the intensity of the fluorescence measured at the wavelength ⁇ 3 by that measured at the wavelength ⁇ 1.
  • this measurement can be carried out in a parallel or different plane, preferably orthogonal to the plane of the exciting light.
  • the polarization properties of the donor and acceptor fluorophores are used to improve the selectivity of the measurement of energy transfer, in a method for determining the polarization variation due to the energy transfer.
  • this method makes it possible to improve the selectivity of the measurement, which will thus be better correlated with the energy transfer phenomenon that one wishes to detect.
  • A represents the proportionality factor between the fluorescence emitted at the wavelengths X1 and ⁇ 3 by the donor alone, in a plane parallel to the plane of the excitatory light
  • G is a factor that makes it possible to correct the sensitivity difference of the detection in the parallel and orthogonal planes. This factor is either provided by the manufacturer, or easily determined by those skilled in the art by measuring the polarization of known polarization substances.
  • a and B are calculated as follows:
  • the measurements made in a plane different from the plane of polarization of the exciting light are preferably carried out in the plane orthogonal to the plane of polarization of the exciting light. Measurements in other planes could also be appropriate, as long as the chosen plane is not the plane parallel to the plane of polarization of the exciting light.
  • the method according to the invention thus makes it possible to improve the selectivity of the measurement of a phenomenon of energy transfer between a donor compound and an acceptor compound. This is particularly advantageous in the case where the spectral selectivity between the donor and the acceptor is not optimal, that is to say in the following cases:
  • the methods according to the invention are particularly effective in the case where 5nm ⁇ 3- ⁇ 2 ⁇ 100 nm, ⁇ 3- ⁇ 2 representing the difference between the wavelengths ⁇ 3 and ⁇ 2.
  • the donor and acceptor fluorophores have a high polarization, in particular greater than 50 mP, preferably greater than 10OmP.
  • Donor and acceptor compounds whose intrinsic polarization is less than 50 mP can be coupled or adsorbed to carrier molecules (organic molecules, proteins, peptides, antibodies, or other molecules as described below), which will have the effect of increase the apparent polarization of the fluorophore and allow it to be used in the processes according to the invention.
  • the donor and acceptor fluorophores are chosen such that, following excitation at the donor excitation length ⁇ 1, no emission of the acceptor is detected at the emission wavelength. of the donor ⁇ 2.
  • Labels were inserted by PCR at the C-terminal portions of the two GB x and GB 2 subunits (Myc tag: EQKLISEEDL), after the E916 residue for GB1 and after the E793 residue for GB2, forming the GABA functional receptor.
  • Myc tag: EQKLISEEDL Myc tag: EQKLISEEDL
  • B residues V93 and E94 in the ⁇ subunit of the Go protein (FLAG tag: DYKDDDDK).
  • the different constructs are expressed in transiently transfected HEK293 cells by electroporation (BioRad electroporator) at 10 million cells per experimental condition, electric shock at 260 volts for a capacitance of 1 mF.
  • the cells are then taken up in complete DMEM culture medium containing 10% fetal calf serum.
  • the cells are then distributed at a rate of 100,000 cells / well in a 96-well plate.
  • the cells are then incubated, after rinsing in PBS buffer, for at least 5 hours at 4 ° C. (to reach a state of equilibrium) with a mixture of anti-Myc antibodies (3 nM final) and anti-FLAG (1 nM final), labeled with I ⁇ IexaFluor647 (molecular probes) (acceptor) and labeled with europium cryptate (PyridineBispyridine PBP) (donor), respectively.
  • the reaction medium containing the antibodies is as follows; 5mM HEPES, HmM EGTA, 2mM MgCl 2 , 10mM NaCl, 12mM KCl, ImM CaCl 2 , pH 7.3, Triton X100 0.01%).
  • This medium has an isoosmotic composition with respect to the intracellular medium.
  • the low concentration of Triton X100 ensures a gentle permeabilization of the cells which allows the antibodies to access the intracellular epitopes without having to fix the cells beforehand.
  • the FRET signal measurements represented by the signal ⁇ 665 (emission at 665 nm of the background noise-corrected acceptor), between the C-terminal Myc tags of GB 1 or GB 2 and the Go-FLAG protein, highlighting a specific interaction between the two proteins.
  • the FRET signal can be measured quantitatively on a fluorescence reader (Rubystar).
  • the FRET signal of transfected cells was also measured with the same final amount of plasmids as in the experimental points. In this condition, called "mock", the plasmid does not contain coding sequences for either GB1, GB2 or GB protein.
  • the coding sequences for the SNAPTag and HaloTag enzymes have been inserted, respectively, by molecular biology, at the C-terminal end of the GB 1 or GB 2 subunits (forming the GABA functional receptor 6 ), as well as at the level of the of loops identified in the G ⁇ subunits of the Go protein. These constructs were expressed in the transiently transfected HEK293 cells as indicated in Example 1. 24 hours after transfection, the cells are incubated in a 37 ° C oven. C.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques d'un récepteur (RCPG) couplé à une protéine G, qui comprend les étapes consistant à ; 1) mettre en contact un récepteur marqué avec un membre d'un couple donneur / accepteur avec une sous-unité Ga ou GβϜ d'une protéine G marquée avec l'autre membre du couple donneur / accepteur ; 2) mesurer le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur. Application : criblage de nouveaux médicaments.

Description

Procédé de détection des interactions entre un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) et l'une des sous-unités Galpha ou Galpha/gamma d'une protéine G.
Domaine de l'invention.
La présente invention concerne un procédé de détection des interactions entre un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) et l'une des sous-unités Ga ou Gβγ d'une protéine G par transfert par effet de proximité entre les deux membres d'un couple donneur / accepteur et ses applications, telles que notamment le criblage de nouveaux médicaments et l'identification de récepteurs orphelins.
Dans la présente description, on désigne par "transfert par effet de proximité" un transfert d'énergie caractérisé par un signal de FRET (technologie HTRF®, CIS BIO INTERNATIONAL), un transfert d'oxygène singulet (technologie Alphascreen®, PerkinElmer, voir par exemple Beaudet et al., Génome Res., 2001 Apr. 11 (4), 600-8), un transfert d'électron (technologie SPA, Amersham Biosciences, voir par exemple Udenfriend et al., Anal. Biochem,, 1987, Mar., 161(2), 494-500).
Dans les techniques de transfert d'énergie non-radiative de fluorescence couramment dénommées techniques de FRET, la technique de TR-FRET (Time- Resolved Fluorescence résonance energy transfer) permet une mesure de fluorescence en temps résolu et en milieu homogène. La mise en œuvre de cette technique avec des chélates ou des cryptâtes de terres rares, développée notamment par G. Mathis et al. (voir notamment « Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptâtes as a tool for probing molecular interactions in biology », Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197- 2211) présente de nombreux avantages qui ont déjà permis plusieurs applications dans le domaine du diagnostic in vitro et dans celui du criblage à haut débit dans l'industrie pharmaceutique.
Cette technique, également connue sous le nom de HTRF® (Homogenous Time Resolved Fluorescence), met en œuvre un premier composé fluorescent donneur et un second composé fluorescent accepteur.
Après excitation lumineuse à la longueur d'onde du donneur, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur s'ils sont proches l'un de l'autre ; ce transfert d'énergie se caractérise par une émission de lumière par l'accepteur (signal de FRET) qui peut être mesurée à l'aide d'un fluorimètre. Les récepteurs, en particulier les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (ci-après dénommés RCPG) sont impliqués dans de nombreux processus pathologiques. Les RCPG sont des protéines transmembranaires responsables de la reconnaissance et du transfert de l'information de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. Ces protéines représentent des cibles thérapeutiques importantes et plus de 50 % des médicaments actuels ciblent ces récepteurs ou leur cascade de transduction.
Les mécanismes d'activation des RCPG en présence d'un ligand sont représentés schématiquement sur la figure 1 annexée.
La fixation d'un ligand agoniste à un RCPG modifie la structure tertiaire de celui-ci, qui, à son tour, active la protéine G couplée au RCPG. L'activation de la protéine G provoque, suivant le cas, Pactivation ou l'inhibition d'un effecteur qui produit un second messager intracellulaire comme PAMPc ou I1IP3.
Dans la présente description, on désigne par "récepteurs orphelins", des récepteurs transmembranaires dont la séquence d'ADN laisse penser qu'il s'agit de RCPG mais dont on ne connaît pas le ligand naturel spécifique.
La caractérisation des voies de signalisation (seconds messagers et effecteurs) ainsi que l'identification de ligands pour des RCPG dits "récepteurs orphelins" revêt une importance considérable dans la compréhension du rôle physiologique de ces RCPG ainsi que pour l'élaboration de nouveaux médicaments.
Etat de la technique.
Il existe différents procédés pour la détection des interactions récepteurs / protéine G qui utilisent l'un des acteurs du processus d'activation des RCPG, notamment pour la détection de ligands spécifiques.
Par exemple, une méthode de détection de ligands utilise un dérivé radioactif non-hydrolysable du GTP, à savoir le GTPy[35S] qui se fixe sur la protéine Ga lorsque le RCPG est activé. Les paramètres cinétiques de la fixation de l'analogue de GTP sont dépendants du type de protéine G. Cette méthode radioactive n'est pas adaptée au criblage à haut débit de médicaments.
D'autres méthodes classiques sont basées sur l'activation des effecteurs par les sous-unités des protéines G trimériques activées.
Comme indiqué sur la figure 1, l'activation des effecteurs et la production de seconds messagers tels que I1AMPc ou PIP3 sont produits après la stimulation du RCPG et de la protéine G. Cette méthode s'intéresse donc à des substances produites en aval du processus d'actïvation du RCPG.
Des méthodes, adaptées au criblage à haut débit de médicaments, utilisent des systèmes recombinants basés sur la mesure d'une activité enzymatique, telle que l'activité de la β-galactosidase ou de la luciférase, dont l'expression est contrôlée par les seconds messagers produits par Pactivation du RCPG. Il s'agit des méthodes indirectes de mesure de l'activité du RCPG, qui s'intéressent également aux substances produites en aval du processus d'activation du RCPG.
Une autre méthode de détection de ligands se focalise sur la translocation de l'arrestine-GFP.
L'arrestine intervient dans la machinerie de régulation qui éteint la voie d'activation déclenchée par la fixation du ligand sur le RCPG. Elle permet de déclencher le processus d'internalisation du récepteur dans la cellule, étape nécessaire à sa dégradation ou à son recyclage sur la membrane cellulaire. La technologie développée par NORAK BIOSCI (Transfluor) utilise de Parrestine fusionnée à une protéine fluorescente (GFP) (arrestine-GFP) qui est exprimée dans des cellules. Dans les conditions normales, l'arrestine-GFP est distribuée dans le cystosol. Après activation du RCPG, l'arrestine-GFP va interagir avec le RCPG présent à la membrane et stimulé par un agoniste. Sa distribution cellulaire va donc être modifiée. Elle va quitter le cytosol pour être redistribuée à la membrane plasmique (phénomène de translocation) et participer au phénomène d'internalisation (disparition des récepteurs de la surface cellulaire). Au cours du temps, la fluorescence de l'arrestine-GFP accrochée à son récepteur pourra également être mesurée à proximité de vésicules internes (endosomes) à la cellule qui témoignent du phénomène d'endocytose de certains récepteurs. Ces variations de distributions de l'arrestine-GFP se fait grâce à des techniques de microscopie et de traitement de l'image. Pour ces raisons, cette technique n'est pas adaptée au criblage à haut débit (HTS).
Les travaux récents de Janetopoulos et al. [Science (2001) 291: 2408-2411 ; Methods (2002) 27: 366-373] ont permis de visualiser un signal de FRET entre les sous-unités G0C2-CFP et Gβ-YFP chez D. discoideum. Les travaux de Azpiazu et Gautam [J_?C(2004) 279 (26) : 27709-27718] montrent des résultats analogues de variation du signal FRET entre Gα-CFP et Gβ-YFP dans le modèle de stimulation des récepteurs muscariniques M2 et M3 exprimés dans les cellules CHO. L'équipe de Berlot [JBC (2004) 279 (29) : 30279-30286] a mis en évidence, in vivo et en microscopie, les interactions entre Gβ et Gγ, marquées par des fragments d'une protéine fluorescente (YFP). L'association Gβγ restaure la fluorescence de la protéine YFP.
Ces observations suggèrent que l'activation des protéines G hétérotrimériques peut être analysée par la technique de FREET. Ces techniques montrent de façon indirecte l'activation d'un récepteur par mesure de FRET entre les sous-unités des protéines G mais ne montrent en aucun cas, et de façon directe, l'état d'activation du RCPG mesuré par un signal de FREET spécifique entre lui-même, récepteur d'intérêt, et l'une ou l'autre des sous-unité des protéines G à laquelle il est couplé.
Une autre méthode consiste à insérer par biologie moléculaire des protéines fluorescentes (CFP et YFP) dans un RCPG, au niveau de la 3eme boucle intracellulaire et de la partie C-terminale respectivement, et à mesurer, par variation d'un signal de FREET, l'activation du récepteur. Cette méthode est décrite par Vilardaga et al. [NaL Biotechnol. (2003) 21 : 807-812 ; WO 2004 057333 Al] Elle ne prend pas en compte directement les interactions RCPG-protéines G et les modulations de ces interactions suite à l'activation du RCPG.
Une autre méthode consiste à détecter l'oligomérisation des RCPG par la technique de FRET (brevet US 6 824 990 Bl).
Aucune de ces méthodes ne permet de rendre compte, par mesure d'un signal de FRET, de l'état d'activation précoce d'un récepteur RCPG, dit récepteur d'intérêt, et de l'une ou l'autre des sous-unités des protéines G à laquelle il est couplé.
Résumé de l'invention.
On a maintenant trouvé, de manière surprenante, qu'il est possible de détecter l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) à un stade précoce du processus d'activation en mesurant le signal de fluorescence basé sur un transfert d'effet de proximité entre un récepteur et l'une des sous-unités Ga ou Gβγ d'une protéine G.
La mesure du signal de transfert d'effet de proximité tient compte de l'état d'activation d'un couple RCPG/ Ga ou d'un couple RCPG/ Gβγ donné. Ce signal est donc hautement spécifique puisqu'il est généré par un couple unique composé obligatoirement d'un RCPG d'intérêt et d'une des sous-unités, Ga ou Gβγ de la protéine G correspondante. Ce signal du transfert d'effet de proximité peut être modulé, positivement ou négativement, lorsque le récepteur est spécifiquement stimulé par un agent pharmacologique (agoniste, agoniste inverse, antagoniste ou régulateur allostérique).
L'invention apporte également un avantage sur le plan de la spécificité de réponse puisqu'elle considère un événement précoce dans la voie d'activation du RCPG d'intérêt. Contrairement aux méthodes déjà connues, elle se situe très en amont de la voie de signalisation des RCPG et tient compte des interactions étroites entre RCPG/protéine G, en l'absence ou en présence d'agents pharmacologiques potentiels.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de détection des interactions entre un récepteur et l'une des sous-unités Ga ou Gβγ d'une protéine G, qui comprend les étapes consistant à :
1) mettre en contact dans un milieu biologique un récepteur marqué avec un membre d'un couple donneur / accepteur avec une sous-unité Ga ou Gβγ d'une protéine G marquée avec l'autre membre du couple donneur / accepteur ;
2) mesurer le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur. Le procédé de l'invention, qui permet de détecter les interactions entre un récepteur et l'une des sous-unités Ga ou Gβγ d'une protéine G, est particulièrement approprié pour ;
1) la mise en évidence du couplage récepteur / protéine G,
2) l'étude des propriétés des récepteurs ;
3) la détection de ligands agonistes ou antagonistes des récepteurs et le criblage de nouveaux médicaments ;
4) l'identification de récepteurs orphelins.
La mise en contact du récepteur marqué avec l'une des sous-unités Ga ou Gβγ d'une protéine G peut se faire de différentes manières, par exemple par co- expression dans des cellules d'acides nucléiques codant pour le récepteur d'une part et pour l'une des sous-unités Ga et Gβγ d'autre part, ou par reconstitution d'un RCPG fonctionnel (comprenant les sous-unités formant le RCPG et les sous-unités des protéines G) obtenu par expression hétérologue d'acides nucléiques codant pour lesdites sous-unités formant le récepteur d'une part et les sous-unités codant pour les sous-unités des protéines G d'autre part, ou après purification à partir d'extraits tissulaires (voir par exemple Florio et al. JBC 1985, vol.260 n°8, pp. 3477-3483 ; Haga K. et al. JBC 1986, vol.261 n°22, pp. 10103-10140 ; Devesa F. et al. 2002 Eur. J. Biochem, 269, pp 5163-5174 ; Stenlund et al. Anal. Biochem. 2003, 316, 243-250 and Park PSH.2004 FEBS Letters, 567, 344-348) dans des membranes plasmatiques artificielles.
Avantageusement, lorsque le RCPG mis en œuvre est un récepteur connu, la mise en contact est réalisée dans un premier temps, en présence d'un ligand naturel dudit RCPG qui déclenche l'activation dudît récepteur, puis en présence d'un agent pharmacologique potentiel ou toute autre molécule à tester, susceptible de moduler l'activité dudit récepteur.
Lorsque le RCPG est un récepteur orphelin, la mise en contact est réalisée en présence d'un ligand naturel d'un récepteur connu qui permettra, s'il y a interaction, d'identifier ledit récepteur orphelin.
La mise en évidence d'un agent pharmacologique potentiel ou toute autre molécule à tester, susceptible de moduler l'activité dudit récepteur orphelin est effectuée comme indiqué ci-dessus pour un récepteur connu.
Les membres du couple donneur / accepteur mis en œuvre dans le procédé de l'invention sont choisis selon le mode de transfert par effet de proximité que l'on souhaite mesurer.
Ainsi, si le transfert par effet de proximité est un transfert d'énergie par fluorescence, le couple donneur / accepteur sera constitué d'un fluorophore donneur d'énergie et d'un fluorophore accepteur d'énergie.
Les fluorophores appropriés aux fins de l'invention sont des molécules fluorescentes, choisies parmi les protéines fluorescentes ou de fluorophores organiques. Des exemples de ces molécules fluorescentes sont les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPYs, tels que par exemple les dérivés de difluoroboradiazaindacènes, les fluorescéines, les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les chélates de terre rare, les cryptâtes de terre rare, les nano-cristaux de type Quantum dots, les protéines fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B- phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665 ou encore les composés fluorescents décrits dans WO 2003/104685. L'homme du métier est à même de choisir les couples donneurs / accepteurs photocompatibles appropriés pour des mesures de FREET ou TR-FREET. Dans le cas d'un transfert d'oxygène singulet, on utilisera par exemple comme couple donneur / accepteur les réactifs associés à la technologie Alphascreen® commercialisés par la société Perkin Elmer (voir Beaudet et al., Génome Res., 2001 Apr. 11 (4), 600-8).
Si le transfert par effet de proximité est un transfert d'électrons, on utilisera comme couple donneur / accepteur, ceux décrits dans Anal. Biochem., 1987, Mar., 161(2), 494-500.
Le récepteur mis en œuvre dans le procédé de l'invention est avantageusement un RCPG connu, tel que le récepteur muscarinique, le récepteur à la vasopressine, le récepteur au GABA (acide gamma-amino-butyrique) ou un RCPG dont on veut caractériser la fonction, à savoir un récepteur orphelin.
Les séquences d'ADN codant pour ces récepteurs peuvent être amplifiées par PCR selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier (voir Sambrook et al. ci-après) ou sont disponibles dans le commerce (Invitrogen).
Les sous-unités Ga et Gβγ à mettre en œuvre dans le procédé de l'invention peuvent être les sous-unités Gi, Gs, Gq ou G12/G13, G14, G15, G16 ou des protéines G chimériques (avec une structure de type Gqx (x pouvant être s, i, o essentiellement) (voir Conklin et al. Nature, 1993, v363 pp274-6 ; Milligan and Rees Trends Pharmacol ScL, 1999, v20 ppl 18-24) dont les séquences et les propriétés sont connues de l'homme du métier.
Les séquences d'ADN codant pour des sous-unités peuvent être amplifiées par PCR selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier (voir Sambrook et al. ci-après) ou sont disponibles dans le commerce (Invitrogen).
Le marquage du récepteur et de l'une des sous-unités Ga ou Gβγ est réalisé soit directement par une ou plusieurs liaisons covalentes selon des techniques bien connues de l'homme du métier (Janetopoulos et al., Methods (2002) 27 : 366-373 et Vilardaga et al., Nat. Biotechnol. (2003) 21 ; 807-812 par exemple), soit indirectement par l'intermédiaire de partenaires de liaison de type étiquette ("tag") / anticorps anti-étiquette (anti-tag), antigène / anticorps, avidine ou streptavidine / biotine ; haptène / anticorps. La mesure du signal de transfert d'effet de proximité est effectuée selon les méthodes classiques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans les articles mentionnés précédemment.
Par exemple, les variations du signal de FRET peuvent être mesurées de manière quantitative par des détecteurs de fluorescence classiques couramment utilisés, par l'homme du métier, dans les laboratoires spécialisés dans le criblage à haut débit (RUBYSTAR, BMG labtech). La mesure des variations du signal de FRET permet de rendre compte directement de l'état d'activation ou d'inactivation d'un RCPG et présente donc une solution adaptée à la recherche de molécules modulant la fonction de ces récepteurs dans un criblage à haut débit.
Avantageusement, l'étape 1) du procédé de l'invention est réalisée par transfection des cellules avec un acide nucléique codant pour un récepteur et avec un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gβγ d'une protéine G, le récepteur et la sous-unité Ga ou Gβγ étant couplés l'un avec un membre d'un couple donneur / accepteur et l'autre avec le second membre dudit couple donneur / accepteur.
Selon une variante de mise en œuvre, l'étape 1) du procédé consiste à mettre en contact des préparations de cellules transfectées avec un acide nucléique codant pour un récepteur et avec un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gβγ d'une protéine G, le récepteur et la sous-unité Ga ou Gβγ étant couplés l'un avec un membre d'un couple donneur / accepteur et l'autre avec le second membre dudit couple donneur / accepteur, avec une substance à tester.
Avantageusement, l'étape 2) du procédé de l'invention est réalisé comme suit:
1) on mesure le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur en l'absence de ligand, d'agents pharmacologiques dudit récepteur et de molécules à tester (signal basai) ;
2) on compare éventuellement au signal basai le signal obtenu en présence d'un ligand spécifique de ce RCPG qui va déclencher l'activation de ce récepteur (signal de référence) ;
3) on compare aux signaux basaux et de référence, le signal obtenu en présence d'agents pharmacologiques ou de molécules chimiques qui sont susceptibles de moduler l'activité dudît récepteur.
Selon une variante préférée de mise en œuvre du procédé de l'invention, le couple donneur / accepteur est un couple constitué d'un fluorophore donneur et d'un fluorophore accepteur et le signal mesuré est le signal de FRET émis après excitation lumineuse du milieu de mesure à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore donneur.
La présente invention a également pour objet les cellules transfectées avec une séquence d'acide nucléique codant pour un RCPG et avec une séquence d'acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gβγ de la protéine G correspondante, le récepteur RCPG et la sous-unité Ga ou Gβγ étant couplés l'un avec un fluorophore donneur et l'autre avec un fluorophore accepteur.
L'invention a également pour objet les préparations membranaires de cellules transfectées telles que définies ci-dessus, qui sont obtenues selon les procédés classiques bien connus de l'homme du métier.
Enfin, l'invention a pour objet une trousse qui comprend les préparations de cellules transfectées telles que définies ci-dessus, ainsi que les moyens nécessaires pour la mesure du signal de FRET.
Description détaillée de l'invention.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail en référence à la technique de FRET sans pour autant limiter la présente demande à cette seule technique. a) Les préparations de cellules transfectées.
Dans la présente description, on désigne par "préparation de cellules transfectées", les cellules transfectées elles-mêmes, les cellules transfectées perméabilisées selon les procédés connus de l'homme du métier et illustrés par l'exemple 1 ainsi que les préparations membranaires de cellules transfectées ou les préparations membranaires obtenues par reconstitution dans des membranes plasmiques artificielles des récepteurs et des sous-unités Ga et Gβγ.
Les cellules peuvent être transfectées de manière stable, c'est-à-dire que les séquences codant pour le récepteur ou les sous-unités Ga ou Gβγ sont intégrées dans l'ADIM génomique des cellules.
Les cellules peuvent également être transfectées de manière transitoire à l'aide d'un vecteur d'expression de type plasmide contenant la séquence d'acide nucléique codant pour le récepteur et la séquence d'acide nucléique codant pour l'une des sous-unités Ga ou Gβγ.
Les techniques de transfection des cellules, bien connues de l'homme du métier, sont décrites par exemple dans l'ouvrage de Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; 2nd édition ; CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N.Y. (1989). Les cellules utilisées sont des cellules eucaryotes, telles que par exemple les cellules HEK 293 ou COS.
La transfection peut également être effectuée par expression hétérologue dans des membranes plasmiques artificielles.
Enfin, l'invention peut être mise en oeuvre sur des préparations membranaires de cellules transfectées, dont la préparation relève des connaissances générales de l'homme du métier, et comprend essentiellement des étapes d'éclatement des cellules par tampon hypo-osmotique, sonication, polytron, et récupération des fractions membranaires d'intérêt. Ces préparations membranaires peuvent être en outre enrichies par des étapes additionnelles de centrifugation différentielles ou par gradient de sédimentation. b) Les fluorophores.
Les fluorophores (composés fluorescents) donneurs ou accepteurs qui conviennent aux fins de l'invention sont des substances fluorescentes choisies par exemple parmi les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPYs, les fluorescéines, les fluorophores connus sous la dénomination AlexaFluor, les chélates de terre rare, les cryptâtes de terre rare, des quantum dots, des protéines fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobilïprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665.
Les fluorophores donneurs peuvent être l'un quelconque des fluorophores ci- dessus qui, lorsqu'ils sont excités à une longueur d'onde donnée, transfèrent de l'énergie à un fluorophore accepteur.
Les fluorophores accepteurs sont l'un quelconque des fluorophores ci-dessus, capable d'émettre un signal de FRET lors du transfert d'énergie à partir du fluorophore donneur.
La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. De manière générale, pour que le FRET ait lieu, le spectre d'excitation de l'accepteur doit recouvrir au moins en partie le spectre d'émission du composé donneur, et les dipôles de transition des composés donneurs et accepteurs doivent être parallèles. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FREET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition 338), auquel l'homme du métier pourra se référer.
De préférence, le fluorophore donneur est un complexe de terre rare, en particulier de terbium ou d'europium.
Avantageusement, le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptate, de préférence un cryptate à motif pyridine.
Des chélates de terres rares sont décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. D'autres chélates sont composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine (EP 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909).
Les cryptâtes de terres rares sont décrits notamment dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 601 113 et la demande WO 01/96 877.
Parmi ces cryptâtes, on préfère tout particulièrement les cryptâtes à motif trisbipyridine, éventuellement substitués par des motifs carboxylates, ou les cryptâtes pyridine bisbipyridine de formule :
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Lorsque le fluorophore donneur est un complexe de terre rare, le fluorophore accepteur est avantageusement choisi parmi les cyanines ou l'allophycocyanine, éventuellement réticulée. c) Le couplage des fluorophores.
Comme indiqué précédemment, les fluorophores sont couplés au récepteur ou aux sous-unités Ga ou Gβγ, soit directement par une ou plusieurs liaisons covalentes, soit indirectement par l'intermédiaire de partenaires de liaison de type étiquette ("tag") / anticorps anti-étiquette (anti-tag), antigène / anticorps, avidine ou streptavidine / biotine ; haptène / anticorps.
Le couplage direct des fluorophores peut être réalisé :
1) par expression d'une protéine de fusion entre ledit récepteur, ladite sous- unité Ga, ou ladite sous-unité Gβγ et une protéine fluorescente ; ou
2) par expression d'une protéine de fusion entre ledit récepteur, ladite sous- unité Ga, ou ladite sous-unité Gβγ et une protéine ayant une activité enzymatique irréversible (couramment dénommée enzyme suicide) qui transfère le fluorophore sur le RCPG, la sous-unité Ga, ou la sous-unité Gβγ ;
3) par épissage avec une intéine.
Cette technique de couplage par épissage avec une intéine est décrite par exemple dans The Journal of Biological Chemistry, vol. 273, n°26, pp 15887-15890, 26 juin 1998 et J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7180-7181.
Le couplage indirect des fluorophores peut être réalisée :
1) par l'intermédiaire d'un couple "ligand-récepteur" ou "tag / antitag".
2) par expression des récepteur, sous-unité Ga, ou sous-unité Gβγ « natifs », dans ce cas les composés fluorescents sont conjugués à un anticorps reconnaissant spécifiquement ledit récepteur, la sous-unité Ga, ou la sous-unité Gβγ ; ou
3) par expression des récepteur, sous-unité Ga, ou sous-unité Gβγ couplés à une protéine fluorescente ou à une enzyme suicide qui transfère le fluorophore sur ledit RCPG, ladite sous-unité Ga, ou la sous-unité Gβγ.
4) par expression des récepteur, sous-unité Ga, ou sous-unité Gβγ portant différentes étiquettes (TAGs), dans ce cas les composés fluorescents sont conjugués à des anticorps dirigés spécifiquement contre lesdites étiquettes (TAGs).
Ces méthodes de couplage direct et indirect de fluorophores utilisent les techniques d'ADN recombinant bien connues de l'homme du métier.
Le couplage direct d'un fluorophore par expression d'une protéine de fusion entre le RCPG, la sous-unité Ga ou la sous-unité Gβγ avec une protéine ayant une activité enzymatîque irréversible utilise avantageusement, comme protéine à activité enzymatique irréversible, une O6-alkylguanine-DNA alkyl transférase (AGT) (voir WO 02/083937) ou une déhalogénase.
Dans ce cas, les cellules sont transfectées avec un acide nucléique codant pour le RCPG, avec un acide nucléique codant pour la sous-unité Ga ou la sous- unité Gβγ et avec un acide nucléique codant pour ladite protéine à activité enzymatique irréversible. Elles sont ensuite mises en présence du substrat spécifique de ladite protéine à activité enzymatique, qui est lié de façon covalente à un fluorophore que l'on veut coupler au récepteur ou à l'une des sous-unités Ga ou Gβγ.
Dans le couplage indirect d'un fluorophore par l'intermédiaire d'un couple "ligand-récepteur" ou "tag / antitag", on fait exprimer une protéine de fusion entre le récepteur, la sous-unité Ga ou la sous-unité Gβγ et une séquence peptidique dite "étiquette" ou "tag", les composés fluorescents étant dans ce cas conjugués à un anticorps reconnaissant spécifiquement l'étiquette. On utilise les séquences peptidiques couramment utilisées en biologie moléculaire, telles que par exemple les étiquettes "Myc" ou "FLAG" mentionnées ci-après.
Le terme "couple ligand-récepteur" désigne deux partenaires de liaison tels que les couples : haptène/anticorps ; DNP/ anticorps anti-DNP, dans lequel DNP représente le dinitrophénol ; GST/anticorps anti-GST dans lequel GST représente la glutathion S-transférase ; biotine/avidine ; 6HIS/anticorps anti-6HIS dans lequel 6HIS est un peptide constitué de 6 histidines ; Myc/anticorps anti-Myc dans lequel Myc est un peptide constitué des acides aminés 410-419 de la protéine Myc humaine ; FLAG®/anticorps anti-FLAG ® dans lequel FLAG ® est un peptide ayant les 8 acides aminés ci-après DYKDDDDK ; HA/anticorps anti-HA dans lequel HA est un épitope de l'hémagglutinine dinfluenza, constitué des 9 acides aminés ci-après YPYDVPDYA. D'autres couples peuvent être utilisés.
Les séquences d'ADN des couples couramment dénommés en langue anglaise "tag/antitag" sont bien connues de l'homme du métier. Ces séquences sont incluses dans des plasmides ou mises en fusion, par PCR, avec les ADN codant pour les protéines d'intérêt. d) La mesure du signal de FRET.
Le signal de FRET peut être mesuré de différentes façons : mesure de la fluorescence émise par le donneur seul, par le donneur et l'accepteur ou encore mesure de la variation de la polarisation de la lumière transmise dans le milieu due au FRET. On peut aussi inclure la mesure du FRET en observant la variation de durée de vie au niveau du donneur ce qui est facilité par l'utilisation d'un donneur à durée de vie de fluorescence longue tel que les complexes de terre rare (notamment sur de l'appareillage simple comme des lecteurs de plaques).
De façon préférée, on mesurera le signal de FRET en temps résolu (signal TR- FRET).
Au sujet de la mesure du signal de FRET ou du signal de TR-FRET, on pourra avantageusement se référer aux documents ci-après incorporés dans la présente description à titre de références :
- Mathis G. "Rare Earth Cryptâtes and Homogeneous Fluoroîmmunoassays with Human Sera", Clin. Chem. (1993) 39, n°9, 1953-1959 ;
- Mathis G. "Probing Molecular Interactions With Homogeneous Techniques Based on Rare Earth Cryptâtes and Fluorescence Energy Transfer", Clin. Chem. (1995) 41, n°9, 1391-1397 ;
- H.Bazin et al., "Time resolved amplification of cryptate emission,a versatile technology to probe biomolecular interactions", Reviews in Molecular Biotechnology (2002) 82, 233-250 ;
- ainsi qu'aux brevets ou demandes de brevets ci-après EP 321 353 ; EP 232 348 ; EP 539 477 ; EP 539 435 ; EP 569 496 ; EP 1 161 685 ; EP 1 166 119 ; WO 20044013348.
Enfin, on notera que la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie pourra être améliorée en utilisant les propriétés de polarisation des fluorophores donneur et accepteur.
Ainsi, lorsqu'on utilise les propriétés de polarisation des fluorophores donneur et accepteur, on procède comme suit ;
(i) on excite le milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde λl, λl étant la longueur d'onde à laquelle ledit fluorophore donneur est excité, et
(ii) on mesure la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3 dans un plan de polarisation différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore accepteur.
La mesure du signal émis à la longueur d'onde d'émission du fluorophore accepteur dans un plan différent (c'est-à-dire non parallèle) du plan de polarisation de la lumière excitatrice, permet de favoriser la mesure du signal émis par les espèces fortement dépolarisées, et en particulier le signal de l'accepteur engagé dans le transfert d'énergie. Le plan dans lequel est effectué la mesure est préférentîellement le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans peuvent également convenir.
Selon un aspect préféré, la technique utilisant les propriétés de polarisation comprend en outre les étapes suivantes :
(iii) mesure de la fluorescence émise à la longueur d'onde Xl1 Xl étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore donneur, et
(iv) correction du signal émis par le fluorophore accepteur à la longueur d'onde λ3 par le signal émis par le fluorophore donneur à la longueur d'onde Xl.
Cette correction peut par exemple consister en un calcul du ratio de l'intensité de la fluorescence mesurée à la longueur d'onde λ3 par celle mesurée à la longueur d'onde Xl.
Dans le cas où l'on effectue une mesure de fluorescence à la longueur d'onde d'émission du donneur (λ2), cette mesure peut être effectuée dans un plan parallèle ou différent, de préférence orthogonal au plan de la lumière excitatrice.
Selon un second mode de réalisation, les propriétés de polarisation des fluorophores donneur et accepteur sont utilisées pour améliorer la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie, dans un procédé visant à déterminer la variation de polarisation due au transfert d'énergie. Comme le premier procédé décrit ci-dessus, ce procédé permet d'améliorer la sélectivité de la mesure, qui sera ainsi mieux corrélée au phénomène de transfert d'énergie que l'on veut détecter.
Ce second mode de réalisation comprend les étapes suivantes :
(i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde λl, λl étant la longueur d'onde à laquelle ledit fluorophore donneur est excité,
(ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It//)λ2 émise à la longueur d'onde Xl dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, Xl étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore donneur,
(iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itj_)χ2 émise à la longueur d'onde Xl dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It//)^ émise à la longueur d'onde λ3 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, X3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du fluorophore accepteur, (v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It1)J13 émise à la longueur d'onde λ3 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur selon la formule suivante :
[(It7/)λ3 - (It//)λ2 x A)] - G[(Itx)λ3 - (ItOu x B)] P=
[(It//)λ3 - (It/,42 x A)] + nG[(Itx)λ3 - (ItJu x B)]
dans laquelle :
- A représente le facteur de proportionnalité entre la fluorescence émise aux longueurs d'onde Xl et λ3 par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice,
- B représente le facteur de proportionnalité entre la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, n= 1 ou 2. Lorsque n = 1, on parle de mesure de polarisation ; lorsque n = 2, il est question d'anisotropie.
- G est un facteur permettant de corriger la différence de sensibilité de la détection dans les plans parallèle et orthogonal. Ce facteur est soit fourni par le constructeur, soit aisément déterminable par l'homme du métier en mesurant la polarisation de substances de polarisation connue. Dans une mise en œuvre particulière, G est compris entre 0,1 et 2, de préférence G est compris entre 0,8 et 1,2, et en particulier G=I ; et
(vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie.
Selon un mode préféré de mise en œuvre, A et B sont calculés de la manière suivante :
A = (IdZzW (Id^2
B = (IdxK3 Z (IdA2
(Id//)λ3, (Id//)λ2/ (Id±)λ3, (Idl)λ2 correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 ou λ3, dans les plans parallèles ou différents du plan de polarisation de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure contenant ledit fluorophore donneur mais ne contenant pas le fluorophore accepteur.
Comme dans le premier procédé décrit, les mesures effectuées dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice sont effectuées préférentiel lement dans le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans pourraient également convenir, du moment que le plan choisi n'est pas le plan parallèle au plan de polarisation de la lumière excitatrice.
Le procédé selon l'invention permet donc d'améliorer la sélectivité de la mesure d'un phénomène de transfert d'énergie entre un composé donneur et un composé accepteur. Cela est particulièrement avantageux dans le cas où la sélectivité spectrale entre le donneur et l'accepteur n'est pas optimale, c'est-à-dire dans les cas suivants :
- cas où les spectres d'émission du donneur et de l'accepteur se chevauchent. Les procédés selon l'invention sont particulièrement efficaces dans le cas où 5nm < λ3-λ2 < 100 nm, λ3-λ2 représentant la différence entre les longueurs d'onde λ3 et λ2.
- cas où une excitation parasite directe de l'accepteur est possible à la longueur d'onde d'excitation du donneur (λl).
Dans un aspect préféré, les fluorophores donneur et accepteur ont une polarisation élevée, en particulier supérieure à 50 mP, de préférence supérieure à 10OmP. Les composés donneur et accepteur dont la polarisation intrinsèque est inférieure à 50 mP peuvent être couplés ou adsorbés à des molécules porteuses (molécules organiques, protéines, peptides, anticorps, ou autres molécules telle que décrites ci-après), ce qui aura pour effet d'augmenter la polarisation apparente du fluorophore et permettra de l'utiliser dans les procédés selon l'invention.
Dans un autre aspect préféré, les fluorophores donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur λl, aucune émission de l'accepteur n'est détectée à la longueur d'onde d'émission du donneur λ2.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratïfs mais non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1
Des étiquettes ont été insérées par PCR au niveau des parties C-terminales des deux sous-unités GBx et GB2 (étiquette Myc : EQKLISEEDL), après le résidu E916 pour GBl et après le résidu E793 pour GB2, formant le récepteur fonctionnel GABAB, ainsi qu'entre les résidus V93 et E94 dans la sous-unité α de la protéine Go (étiquette FLAG : DYKDDDDK).
Les différentes constructions sont exprimées dans des cellules HEK293 transfectées de façon transitoire par électroporation (électroporateur BioRad) à raison de 10 millions de cellules par conditions expérimentales, choc électrique à 260 volts pour une capacitance de 1 mF. Les cellules sont ensuite reprises en milieu de culture DMEM complet contenant 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules sont alors réparties à raison de 100 000 cellules/puits dans une plaque de 96 puits.
24 heures après électroporation, les cellules sont ensuite incubées, après rinçage en tampon PBS, pendant au moins 5 heures à 4°C (pour atteindre un état d'équilibre) avec un mélange d'anticorps anti-Myc (3 nM final) et anti-FLAG (1 nM final), marqués à IΑIexaFluor647 (molecular probes) (accepteur) et marqués au cryptate d'europium (PyridineBispyridine PBP) (donneur), respectivement. Le milieu réactionnel contenant les anticorps est le suivant ; 5mM HEPES, HmM EGTA, 2mM MgCI2, 1OmM NaCI, 12OmM KCI, ImM CaCI2, pH 7.3 , Triton X100 0.01%). Ce milieu a une composition isoosmotique par rapport au milieu intracellulaire. La faible concentration en Triton X100 assure une perméabilisation ménagée des cellules qui permet aux anticorps d'accéder aux épitopes intracellulaires sans avoir à fixer les cellules au préalable.
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 2 annexée.
Les mesures de signal de FRET, représentées par le signal Δ665 (émission à 665 nm de l'accepteur corrigé du bruit de fond), entre les étiquettes Myc en C-terminal de GB1 ou GB2 et la protéine Go-FLAG, mettent en évidence une interaction spécifique entre les deux protéines. Le signal de FRET peut être mesuré de façon quantitative sur un lecteur de fluorescence (Rubystar).
A titre de comparaison, on a également mesuré le signal de FRET de cellules transfectées avec la même quantité finale de plasmides que dans les points expérimentaux. Dans cette condition, appelée "mock", le plasmide ne contient pas de séquences codantes pour l'une ou l'autre des protéines GBl, GB2 ou Go. EXEMPLE 2
Les séquences codantes pour les enzymes SNAPTag et HaloTag ont été insérées, respectivement, par biologie moléculaire, au niveau de la partie C- Terminale des sous-unités GB1 ou GB2 (formant le récepteur fonctionnel GABA6), ainsi qu'au niveau de boucles identifiées dans les sous-unités Gβγ de la protéine Go. Ces constructions ont été exprimées dans les cellules HEK293 transfectées de façon transitoire comme indiqué dans l'exemple 1. 24 heures après transfection, les cellules sont incubées dans une étuve à 37 0C, 5% CO2, pendant 30 minutes avec du milieu de culture contenant 5 μM de chaque substrat spécifique des enzymes SNAPTag et HaloTag, marqués avec un fluorophore accepteur (A) et marqués avec un fluorophore donneur (D), respectivement. Après lavages les cellules sont à nouveau incubées 30 minutes dans leur milieu de culture dans une étuve à 37 0C, 5% CO2 avant de réaliser la détection du signal. Le résultat des activités enzymatiques SNAPTag et HaloTag est une incorporation, de manière covalente, des fluorophores donneur et accepteur sur le RCPG fonctionnel d'intérêt et sur la sous-unité Gβγ de la protéine Go, respectivement. Les mesures de signal peuvent être réalisées de manière quantitative à l'aide d'un lecteur de fluorescence (RubyStar) ou de façon qualitative et semi quantitative à l'aide d'un microscope à épifluorescence.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection des interactions entre un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) et l'une des sous-unités Ga ou Gβγ d'une protéine G, qui comprend les étapes consistant à :
1) mettre en contact un récepteur marqué avec un membre d'un couple donneur / accepteur avec une sous-unité Ga ou Gβγ d'une protéine G marquée avec l'autre membre du couple donneur / accepteur ;
2) mesurer le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en contact est réalisée par transfection de cellules avec un acide nucléique codant pour un récepteur et avec un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gβγ d'une protéine G, le récepteur et la sous-unité Ga ou Gβγ étant couplés l'un avec un membre d'un couple donneur / accepteur et l'autre avec le second membre dudit couple donneur / accepteur.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en contact est réalisée soit en présence d'un ligand naturel du RCPG, soit en présence d'un agent pharmacologique potentiel ou d'une molécule à tester.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la mesure du transfert par effet de proximité est réalisée comme suit :
1) on mesure le transfert par effet de proximité entre le donneur et l'accepteur en l'absence de ligand, d'agents pharmacologiques dudit récepteur et de molécules à tester (signal basai) ;
2) on compare éventuellement au signal basai le signal obtenu en présence d'un ligand spécifique de ce RCPG qui va déclencher l'activation de ce récepteur (signal de référence) ;
3) on compare aux signaux basaux et de référence, le signal obtenu en présence d'agents pharmacologiques ou de molécules chimiques qui sont susceptibles de moduler l'activité dudit récepteur.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les membres du couple donneur / accepteur sont des fluorophores, en ce que le transfert de proximité est un transfert d'énergie de fluorescence et en ce que la mesure du transfert d'énergie est effectuée par la mesure du signal fluorescent résultant d'un transfert entre le donneur et l'accepteur (signal de FRET).
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur sont choisis parmi les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorophores connus sous la dénomination BODIPY, les fluorescéines, les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les chélates de terre rare, les cryptâtes de terre rare, des quantum dots, des protéines fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B- phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que le fluorophore donneur est un complexe de terre rare.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le complexe de terre rare est un complexe de terbium ou d'europium.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptate.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le cryptate de terre rare est un cryptate ayant un motif pyridine.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le cryptate a un motif pyridine.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le fluorophore accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les cyanines, les rhodamines, les squaraines, les BODIPYs, les fluorescéines, les Alexas.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le fluorophore accepteur est une protéine fluorescente verte (GFP) ou l'un de ses variants la protéine fluorescente jaune (YFP) ou la protéine fluorescente bleue (CFP), les protéines fluorescentes extraites de coraux.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 13, caractérisé en ce que le couplage entre le récepteur RCPG ou la sous-unité Ga ou Gβγ et le fluorophore donneur ou le fluorophore accepteur est un couplage direct par liaison covalente ou un couplage indirect.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le couplage par liaison covalente est réalisé par fusion avec une séquence protéique ayant une activité enzymatique irréversible ("suicide") ou par épissage à l'aide d'une intéine.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le récepteur RCPG, la sous-unité Ga ou les sous-unités Gβγ comportent en fusion une séquence peptidique appelée étiquette extra-cellulaire ou intra-cellulaire pour le RCPG et intracellulaire pour la sous-unité Ga ou les sous-unités Gβγ, et en ce que le couplage par liaison indirecte est réalisé par l'intermédiaire d'anticorps reconnaissant spécifiquement lesdites étiquettes portées par ledit récepteur RCPG, ladite sous-unité Ga ou lesdites sous-unités Gβγ.
17. Préparation de cellules transfectées de façon stable ou transitoire avec un acide nucléique codant pour un RCPG et avec un acide nucléique codant pour une sous-unité Ga ou Gβγ de la protéine G correspondante, le récepteur RCPG et la sous-unité Ga ou Gβγ étant couplés l'un avec un fluorophore donneur et l'autre avec un fluorophore accepteur.
18. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 17, caractérisée en ce que le fluorophore donneur est un complexe de terre rare.
19. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 18, caractérisée en ce que le complexe de terre rare est un complexe de terbium ou d'europium.
20. Préparation de cellules transfectées selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisée en ce que le complexe de terre rare est un chélate ou un cryptate.
21. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 20, caractérisée en ce que le cryptate de terre rare est un cryptate ayant un motif pyridine.
22. Préparation de cellules transfectées selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, caractérisée en ce que le fluorophore accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les cyanines, les rhodamines, les squaraines, les BODIPYs, les fluorescéines, les Alexas.
23. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 22, caractérisée en ce que le fluorophore accepteur est la protéine fluorescente jaune (YFP) ou la protéine fluorescente verte (GFP).
24. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 23, caractérisée en ce que le couplage entre le récepteur RCPG ou la sous-unité Ga ou Gβγ et le fluorophore donneur ou le fluorophore accepteur est un couplage direct par liaison covalente.
25. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 24, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est réalisé par fusion.
26. Préparation de cellules transfectées selon la revendication 25, caractérisée en ce que le récepteur RCPG comporte une étiquette extra-cellulaire ou intra-cellulaire et en ce que le couplage par liaison covalente est réalisé par l'intermédiaire de l'anticorps reconnaissant l'étiquette extra-cellulaire ou intracellulaire dudit récepteur.
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