WO2006081791A1 - Anordnung und verfahren zur mikroskop-optischen erfassung von anisotropien - Google Patents

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WO2006081791A1
WO2006081791A1 PCT/DE2006/000070 DE2006000070W WO2006081791A1 WO 2006081791 A1 WO2006081791 A1 WO 2006081791A1 DE 2006000070 W DE2006000070 W DE 2006000070W WO 2006081791 A1 WO2006081791 A1 WO 2006081791A1
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rotation
elements
influenceable
beam path
approximately
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PCT/DE2006/000070
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Thomas Schimming
Klaus Rink
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Octax Microscience Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/21—Polarisation-affecting properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J4/00—Measuring polarisation of light
    • G01J4/04—Polarimeters using electric detection means
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation

Definitions

  • the invention relates to an arrangement and a method for the microscopic optical detection of anisotropies in microscopic objects which influence the polarization properties of light.
  • the invention relates to an arrangement for the microscopy of biological cells and their anisotropies.
  • Anisotropies are usually detected by detecting changes in the properties in the optical beam path from the illumination through or through the object to be examined to an image sensor by means of elements which in turn influence the polarization properties of light and whose parameters are electrically adjustable.
  • Suitable adjustable elements are, for example, liquid crystal cells.
  • Polarization microscopy and its microbiological application have been known for a long time.
  • the change of the optical beam path by means of mechanical change is achieved by suitable elements, either manually or by motors.
  • a mechanical motion dispensing system which is preferably based on the use of voltage-variable variable optical delay liquid crystal cells, is described in US Pat. No. 5,521,705.
  • the parameter "optical delay” is usually used. This is defined as the phase shift between the x and y components of polarized light after passing through an anisotropic material, i. a material with directional refractive index.
  • the extraction of the optical delay is carried out either manually or by image processing on the basis of several microscopic images of the object to be examined in different configurations of the beam path.
  • image processing on the basis of several microscopic images of the object to be examined in different configurations of the beam path.
  • at least three images of the object in different configurations of the beam path are necessary to determine all the interesting parameters: the local light transmittance of the object and the orientation of the anisotropic property, characterized by its orientation angle in the Image plane and by their amount, usually measured in nanometers.
  • variable configuration of the beam path for isotropic objects or isotropic object areas does not have the necessary invariance. Since the isotropic regions, i. the areas of the analyzed objects which do not have anisotropies usually fill the majority of the image section, the missing invariance results in a disturbing flickering, i. the basic brightness of the microscopic image changes cyclically.
  • this considerably complicates the use of image sensors for the automatic detection and evaluation of the images of the object since the brightness fluctuations have to be subsequently corrected by computation, whereby such calculations always result in a worsened signal-to-noise ratio.
  • the use of technically conventional image sensors with adaptive brightness control is prevented, which can not follow the rapid flicker.
  • An arrangement according to the invention has a beam path which extends between a light source and an optical sensor, wherein the object is arranged in this beam path.
  • In the beam path are also an element for polarization-optical analysis and at least one influenced by a control element arranged, which causes a controllable with respect to a rotation angle rotation of the polarization properties of penetrating light.
  • a control of the arrangement has means by which at least three different angles of rotation can be predetermined and means for detecting an image of the object for each of the at least three angles of rotation by means of the optical sensor. The arrangement is such that the images of an isotropic region of the object are substantially equal in angle of rotation.
  • a light source can be provided which generates approximately monochromatic, circularly polarized light.
  • a linear polarization filter is used as the element for polarization-optical analysis.
  • an influenceable element For generating three angles of rotation, an influenceable element can be provided, in which, with appropriate control, at least three different angles of rotation can be set.
  • an element is used which allows angles of rotation of approximately 0 °, 60 ° and 120 ° or 0 °, 120 ° and 240 °.
  • two influenceable elements can also be provided, which each have two rotational angle states and are arranged so that at least three different angles of rotation can be set by controlling the two influenceable elements.
  • influenceable elements are used which have angles of rotation of 0 ° and 60 ° or 0 ° and 120 °. These elements are then arranged so that at least three different resulting rotation angles of approximately 0 °, 60 ° and 120 ° or 0 °, 120 ° and 240 ° are adjustable by influencing the two elements.
  • employable elements are used which are designed so as not to cause an optical delay or an optical delay corresponding to a multiple of the wavelength of the light generated by the light source.
  • elements are used which, in a drive-free state, cause a rotation about an angle of rotation as well as an optical delay and, in a controlled state, cause almost no rotation and almost no delay.
  • an optical compensation element for example a delay element, is arranged in the beam path whose parameters, for example delay and arrangement angle, are chosen with respect to the influenceable elements such that the images of an isotropic region of the object do not differ or only minimally differ in the different resulting rotation angles.
  • This delay element is preferably arranged in the beam path between the influenceable elements.
  • advantageously influenceable elements can be used, which are designed so that the rotation angle in the drive-free state is approximately 90 °.
  • Such elements are available inexpensively from various manufacturers and are often used as optical valves or shutters.
  • TN (Twist Nematic) liquid crystal cells are suitable as influenceable elements since these cells are also sufficiently fast for the detection with frame rates of 10-50 images per second and thus allow the detection of anisotropies of moving or moving objects.
  • the invention further relates to a method for microscopically detecting the isotropic properties of an object by means of a microscope arrangement with the following method steps: providing at least one light source; Providing at least one optical sensor;
  • An advantage of the present invention can be seen in the fact that the different (at least three) images of the object to be examined in different configurations of the beam path do not differ or only slightly differ in brightness in image regions without anisotropies, ie in isotropic image regions Image reproduction (in an eyepiece of the microscope and on the image sensor) outside the possibly existing anisotropic regions of the object to be examined is not or only minimally different from classical microscopic image reproduction.
  • Another important advantage of a system having such an invariance is the maintenance of a largely uniform temporal brightness, in particular when microscoping biological cells having large isotropic object areas.
  • This uniform basic brightness is advantageous for an automatic, time-independent adjustment of the image sensor to the illumination conditions in order to ensure optimum precision and in particular a low signal-to-noise ratio of the image pickup.
  • a uniform basic brightness is also advantageous for technically customary image sensors with adaptive brightness control, since the adaptive methods used there are designed for quasi-static, ie only slowly changing, lighting conditions.
  • the single figure shows a schematic representation of a microscope
  • a beam path 106 which extends between the light source 102 and the sensor 104.
  • An object 108 to be microscoped is usually brought into the beam path 106 by means of a specimen slide 110.
  • the microscope assembly 100 will also often include an objective 114 in practice.
  • the illumination of the object 108 to be analyzed is effected by suitably polarized light, which is immutable in time.
  • the illumination of the object 108 with circularly polarized light which is generated by inserting a circular polarizing filter 112 in the beam path between the light source 102 of the microscope and object 108.
  • a model mathematical consideration of the problem shows that (only) lighting with circular polarized light allows a complete analysis of the anisotropies independent of their orientation angle in the viewing plane.
  • An invariant arrangement for isotropic object areas which provides uniform basic brightness, is achieved by arranging in the beam path 106 between the object 108 to be analyzed and the sensor 104 one or more elements 116 which can electrically adjust the polarization properties of the light in the beam path 106 , Particularly advantageous are influenceable elements 116, which in turn thereby produce no optical delay or anisotropy. It is advantageous that those portions of the circularly polarized light from the light source 102, which were not changed by anisotropies in the object 108 in their polarization properties, which are therefore still circularly polarized, are not influenced by polarization optically measurable rotation. Therefore, a polarization-optical analysis following the beam path 106, which advantageously takes place by means of a linear polarization filter 120, will have the desired invariance properties.
  • a controller 122 shown schematically in the figure, is provided to electrically energize the element or elements 116 to adjust the optical rotation caused by element (s) 116 to a desired angle of rotation. Furthermore, it can be provided to couple the controller to the sensor 104 in order to capture an image or trigger the detection after setting a rotation angle by means of the sensor 104.
  • At least three images of the object are detected using at least three different configurations.
  • the different configurations are achieved by three different rotation angles. This may be done by one element 116A having three different rotational configurations or by two consecutive elements 116A 5 116B, each with two different rotational configurations. Of the four possible constellations resulting from two elements, three advantageous ones can be selected. If only one element 116A is provided, three different voltages corresponding to the three different angles of rotation of the element 116A are supplied by the controller 122. If, on the other hand, two elements 116A, 116B are provided, the controller supplies one of two voltage values respectively corresponding to one of the two angles of rotation to the two elements 116A, 116B for setting one of the desired three angles of rotation.
  • Suitable inexpensive elements which cause a rotation of the polarization properties of light are so-called TN (twist-nematic) liquid crystal cells whose liquid crystal in the inactive state causes a rotation of the polarization properties of light.
  • the angle of rotation can be influenced by the construction.
  • the optical delay reaches an integer multiple of the wavelength and is thus not detectable or measurable.
  • a suitable narrow wavelength band pass or interference filter can be inserted in the beam path directly after the light source 106;
  • TN liquid crystal cells By applying an electrical voltage by means of the controller 122, it is possible to convert these TN liquid crystal cells into an isotropic state in that - at least to a good approximation - neither a rotation nor an optical delay occurs. In such TN liquid cells, moreover, the transition from the inactive to the active state (and back) in a particularly short time is possible.
  • TN liquid crystal cells are much faster than the liquid crystal cells known from US Pat. No. 5,521,705 cited in the introduction, the effect of which is based on an electrical change in the optical delay and where no rotation occurs.
  • the switching times of TN liquid crystal cells allow a pseudo moving picture analysis with relevant frame rates in the order of 10-50 frames per second, which is not achievable with different liquid crystal cells due to their considerably slower electrical controllability with the necessary precision.
  • an optimal arrangement comprises two influenceable elements 116A, 116B, which can each be switched between 60 ° rotation and 0 ° rotation and are arranged in the beam path 106 one behind the other between object 108 and sensor 104 followed by an arbitrarily oriented linear polarizer 120.
  • Three configurations are used for object analysis: (a) rotation in the first element: 60 °, in the second element 60 °, (b) rotation in the first element: 60 °, in the second element 0 °, (c) rotation in the first element: 0 °, in the second element 0 °.
  • a similar effect can be achieved if in each element 116A, 116B, a rotation of 120 ° or 0 ° instead of 60 ° or 0 °.
  • Brightness information in the case of existing anisotropies is the average of the three images taken.
  • the strength of the anisotropy i. the optical local optical retardation of the object at a point in the image plane results from the difference images of (a) and (b) or (b) and (c), which are advantageously obtained by subtracting the image data in a digital image processing system (not shown) ) are obtained from the three raw images.
  • An important advantage of this exemplary arrangement is an angle-independent determination of the strength of the
  • TN liquid crystal elements with 60 ° or 120 ° rotation and vanishing optical delay in the inactive state are technically possible but not marketable and a corresponding purpose-optimized production may be too expensive.
  • TN liquid crystal elements with 90 ° rotation are customary in the market, since with such cells optical valves (so-called shutters) can be produced without problems and wavelength-independently.
  • shutters optical valves
  • even with commercially available elements with 90 ° rotation is ensured that in the electrically active state, i. after application of a sufficiently high voltage by the controller 122, both the rotation and the optical delay at least approximately disappear.
  • the optical arrangement 100 in the beam path 106 now consisting of light source 102, color filter (not shown), circular polarization filter 112th , object 108 to be analyzed, first TN liquid crystal element 116A, second TN liquid crystal element 116B, linear Polarization filter 120 and image sensor 104 are suitably compensated by an optical compensation element 118 to allow for isotropic objects or isotropic object areas three configurations with at least approximately identical image output.
  • This compensation can be achieved, for example, by inserting a suitable, preferably invariable, optical delay element 118 of suitable commercial delay into the beam path 106 between the first liquid crystal element 116A and the second liquid crystal element 116B, using as free parameters the relative orientation angles of the various ones involved in the optical analysis Components of the system 100 (first TN liquid crystal element 116A, delay element 118, second liquid crystal element 116B, linear polarization filter 120) are to be optimized.
  • compensating element 118 a compensating element or a group of elements composed of two or more elements, for example in a sandwich construction, may be provided without deviating from the present invention.
  • the arrangement of the compensation element 118 between the influenceable elements 116 represents only one of numerous possible arrangements.
  • the element may be placed elsewhere in the beam path, for example between the object and the first influenceable element 116A or between the second influenceable element 116B and the sensor 104. It is also conceivable to combine the analysis element 120 and the compensation element in one element - not shown.
  • the arrangement in accordance with the present invention may comprise further active or passive optical elements in the beam path 106, for example, the improvement of Beam path 106, the protection of the object 108 from excessive heat, magnification or image sharpness improvement can serve.
  • suitable high resolution sensors 104 are available with sufficient imaging performance, magnifying optics such as the lens 114 may be eliminated.
  • a semipermeable sensor can be provided followed by an eyepiece - not shown.
  • a prism or the like can be provided in the beam path in front of the sensor, which divides the beam path into a beam path to the sensor and a further beam path to an eyepiece - not shown.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur mikroskop-optischen Erfassung von Anisotropien in mikroskopisch kleinen Objekten, welche die Polarisationseigenschaften von Licht beeinflussen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Anordnung, die einen Strahlengang (106) aufweist, der sich zwischen einer Lichtquelle (102) und einem optischen Sensor (104) erstreckt, wobei das Objekt (108) in diesem Strahlengang (106) angeordnet ist. Im Strahlengang (106) sind ferner ein Element (120) zur polarisationsoptischen Analyse sowie mindestens ein durch eine Steuerung (122 beeinflußbares Element (116) angeordnet, welches eine hinsichtlich eines Rotationswinkels steuerbare Rotation der Polarisationseigenschaften durchdringenden Lichtes hervorruft. Die Steuerung (122) der Anordnung (100) weist Mittel auf, durch welche mindestens drei verschiedene Rotationswinkel vorgebbar sind sowie Mittel, um mittels des optischen Sensors (104) für jeden der mindestens drei Rotationswinkel ein Abbild des Objekts (108) zu erfassen. Die Anordnung (100) ist so ausgestaltet, daß die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts (108) bezüglich der Rotationswinkel im wesentlichen gleich sind.

Description

Beschreibung
Anordnung und Verfahren zur mikroskop-optischen Erfassung von Anisotropien
Die Erfindung betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur mikroskop-optischen Erfassung von Anisotropien in mikroskopisch kleinen Objekten, welche die Polarisationseigenschaften von Licht beeinflussen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Anordnung zum Mikroskopieren biologischer Zellen und deren Anisotropien.
Die Erfassung von Anisotropien mikroskopisch kleiner Objekte ist unter anderem auf dem Gebiet der Mikrobiologie von Interesse, da insbesondere die Erbinformation in biologischen Zellen unter günstigen Bedingungen zu anisotropen Zellbereichen führt.
Anisotropien werden üblicherweise erfaßt, indem Veränderungen der Eigenschaften im optischen Strahlengang von der Beleuchtung über bzw. durch das zu untersuchende Objekt hin zu einem Bildsensor mit Hilfe von Elementen erfaßt werden, die ihrerseits die Polarisationseigenschaften von Licht beeinflussen und deren Parameter elektrisch einstellbar sind. Geeignete einstellbare Elemente sind beispielsweise Flüssigkristall-Zellen.
indem von einem zu untersuchenden Objekt mehrere Abbilder mit unterschiedlich konfiguriertem Strahlengang erzeugt werden, ist genügend Information vorhanden, um zusätzlich zu der bei der klassischen Lichtmikroskopie ermittelten geometrischen Verteilung der Lichtdurchlässigkeit des Objekts in einer gewählten Ebene (Fokusebene) die geometrische Verteilung der optischen Anisotropie (insbesondere der optischen Verzögerung) des Objekts in derselben Ebene zu erfassen.
ERSATZBLATT Dabei ist für die mikrobiologische Anwendung insbesondere der Fall von minimalen Anisotropien technisch anspruchsvoll, da in diesem Fall eine hohe Genauigkeit der Untersuchung erforderlich ist.
Die Polarisationsmikroskopie und ihre mikrobiologische Anwendung sind seit langem bekannt. In der klassischen Methode wird dabei die Veränderung des optischen Strahlengangs mit Hilfe mechanischer Veränderung (meist Rotation) von geeigneten Elementen, entweder von Hand oder durch Motoren angetrieben, erreicht. Ein auf mechanische Bewegung verzichtendes System, welches vorzugsweise auf der Verwendung von Flüssigkristall-Zellen mit spannungsabhängig variabler optischer Verzögerung beruht, ist in US Patentschrift 5,521,705 beschrieben.
Zur Charakterisierung der Anisotropie wird üblicherweise der Parameter "optische Verzögerung" genutzt. Dieser ist definiert als Phasenverschiebung zwischen den x- und y-Komponenten polarisierten Lichts nach Durchqueren eines anisotropen Materials, d.h. eines Materials mit richtungsabhängigem Brechungsindex. Die Extraktion der optischen Verzögerung erfolgt dabei entweder manuell oder mittels Bildverarbeitung auf der Basis von mehreren mikroskopischen Aufnahmen des zu untersuchenden Objektes in verschiedenen Konfigurationen des Strahlengangs. Bei einer modellhaften mathematischen Betrachtung des Problems stellt sich dabei heraus, daß mindestens drei Abbilder des Objektes in verschiedenen Konfigurationen des Strahlengangs nötig sind, um alle interessanten Parameter zu ermitteln: die lokale Lichtdurchlässigkeit des Objekts sowie die Orientierung der Anisotropieeigenschaft, charakterisiert durch ihren Orientierungswinkel in der Bildebene sowie durch ihren Betrag, meist in Nanometer gemessen.
In der Praxis zeigen sich allerdings einige Unzulänglichkeiten der bekannten
Systeme, die insbesondere die Analyse bewegter bzw. sich bewegender Objekte verhindern. Denn für die Anisotropie-Analyse bewegter Objekte ist es erforderlich, daß die nötigen mindestens drei Abbilder des Objektes in verschiedenen Konfigurationen des Strahlengangs in schneller zeitlicher Abfolge erstellt werden. Ein derartiger Meßzyklus sollte dabei so schnell ablaufen können, daß die bewegten Objekte während eines Meßzyklus näherungsweise als unbeweglich angesehen werden können.
Bei bekannten Systemen ist weist die variable Konfiguration des Strahlengangs für isotrope Objekte oder isotrope Objektbereiche nicht die notwendige Invarianz auf. Da die isotropen Bereiche, d.h. die Bereiche der analysierten Objekte, die keine Anisotropien aufweisen, üblicherweise den überwiegenden Anteil des Bildausschnitts ausfüllen, resultiert die fehlende Invarianz in einem störenden Flackern, d.h. die Grundhelligkeit des mikroskopierten Bildes ändert sich zyklisch. Dies erschwert jedoch die Nutzung von Bildsensoren zur automatischen Erfassung und Auswertung der Abbildungen des Objekts erheblich, da die Helligkeitsschwankungen nachträglich rechentechnisch korrigiert werden müssen, wobei derartige Berechnungen stets einen verschlechterten Signal-Rausch- Abstand zur Folge haben. Ferner wird die Anwendung von technisch üblichen Bildsensoren mit adaptiver Helligkeitssteuerung verhindert, die dem raschen Flackern nicht folgen können.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Anordnung und ein Verfahren zur mikroskop-optischen Erfassung von Anisotropien in mikroskopisch kleinen Objekten anzugeben, welche die Erfassung von Anisotropien bewegter oder sich bewegender Objekte zuläßt.
Diese Aufgabe wird durch eine Anordnung zum mikroskop-optischen Erfassen von Anisotropien in Objekten gemäß Anspruch 1 gelöst. Eine erfindungsgemäße Anordnung weist einen Strahlengang auf, der sich zwischen einer Lichtquelle und einem optischen Sensor erstreckt, wobei das Objekt in diesem Strahlengang angeordnet ist. Im Strahlengang sind ferner ein Element zur polarisationsoptischen Analyse sowie mindestens ein durch eine Steuerung beeinflußbares Element angeordnet, welches eine hinsichtlich eines Rotationswinkels steuerbare Rotation der Polarisationseigenschaften durchdringenden Lichtes hervorruft. Eine Steuerung der Anordnung weist Mittel auf, durch welche mindestens drei verschiedene Rotationswinkel vorgebbar sind sowie Mittel, um mittels des optischen Sensors für jeden der mindestens drei Rotationswinkel ein Abbild des Objekts zu erfassen. Die Anordnung ist so ausgestaltet ist, daß die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts bezüglich der Rotationswinkel im wesentlichen gleich sind.
Vorteilhaft kann eine Lichtquelle vorgesehen werden, die annähernd monochromatisches, zirkulär polarisiertes Licht erzeugt.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird als Element zur polarisationsoptischen Analyse ein lineares Polarisationsfilter genutzt.
Zum Erzeugen von drei Rotationswinkeln kann ein beeinflußbares Element vorgesehen werden, bei welchem bei entsprechender Ansteuerung mindestens drei verschiedene Rotationswinkel einstellbar sind. Vorzugsweise wird ein Element genutzt, das Rotationswinkel von annähernd 0°, 60° und 120° oder 0°, 120° und 240° zuläßt.
Anstelle des einen Elements mit mindestens drei Zuständen können auch zwei beeinflußbare Elemente vorgesehen werden, die jeweils zwei Rotationswinkelzustände aufweisen und so angeordnet sind, daß zumindest drei verschiedene Rotationswinkel durch Ansteuerung der beiden beeinflußbaren Elemente einstellbar sind. Vorzugsweise werden dann beeinflußbaren Elemente genutzt, die Rotationswinkel von 0° und 60° oder 0° und 120° aufweisen. Diese Elemente werden dann so angeordnet sind, daß durch Beeinflussung der beiden Elemente zumindest drei verschiedene resultierende Rotationswinkel von annähernd 0°, 60° und 120° oder 0°, 120° und 240° einstellbar sind. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden beeinflußbaren Elemente eingesetzt, die so gestaltet sind, daß sie keine optische Verzögerung oder eine optische Verzögerung, die einem Vielfachen der Wellenlänge des von der Lichtquelle erzeugten Lichts entspricht, hervorrufen.
In einer alternativen Ausgestaltung werden Elemente genutzt, die in einem ansteuerungsfreien Zustand eine Rotation um einen Rotationswinkel sowie eine optische Verzögerung hervorrufen und in einem angesteuerten Zustand annähernd keine Rotation und annähernd keine Verzögerung hervorrufen. Zusätzlich wird ein optisches Kompensationselement, beispielsweise ein Verzögerungselement, im Strahlengang angeordnet, dessen Parameter, beispielsweise Verzögerung und Anordnungswinkel, bezüglich der beeinflußbaren Elemente so gewählt werden, daß sich die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts in den verschiedenen resultierenden Rotationswinkeln nicht oder nur minimal unterscheiden. Dieses Verzögerungselement wird vorzugsweise im Strahlengang zwischen den beeinflußbaren Elementen angeordnet. Dabei können vorteilhaft beeinflußbare Elemente verwendet werden, die so ausgestaltet sind, daß der Rotationswinkel im ansteuerungsfreien Zustand annähernd 90° beträgt. Solche Elemente sind von verschiedenen Herstellern preiswert erhältlich und werden häufig als optische Ventile bzw. Shutter eingesetzt.
Als beeinflußbare Elemente sind beispielsweise TN (Twist Nematic) Flüssigkristallzellen geeignet, da diese Zellen hinreichend schnell auch für die Erfassung mit Bildraten von 10-50 Bildern pro Sekunde sind und somit die Erfassung von Anisotropien sich bewegender oder bewegter Objekte zulassen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum mikroskop-optischen Erfassen der Isotropieeigenschaften eines Objekts mittels einer Mikroskopieranordnung mit folgenden Verfahrensschritten: - Vorsehen zumindest einer Lichtquelle; - Vorsehen zumindest eines optischen Sensors;
- Vorsehen eines Strahlengangs, der sich zwischen der Lichtquelle und dem optischen Sensor erstreckt, wobei das Objekt in diesem Strahlengang angeordnet wird; - Vorsehen zumindest eines im Strahlengang angeordneten Elements zur polarisationsoptischen Analyse;
- Vorsehen mindestens eines durch eine Steuerung beeinflußbaren Elements im Strahlengang, welches eine hinsichtlich eines Rotationswinkels steuerbare Rotation der Polarisationseigenschaften durchdringenden Lichtes hervorruft; — Vorgeben eines von mindestens drei verschiedenen Rotationswinkeln durch die Steuerung; und
- Erfassen eines Abbilds des Objekts mittels des optischen Sensors für jeden der mindestens drei Rotationswinkel; wobei die Mikroskopieranordnung so ausgestaltet ist, daß die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts bezüglich der Rotationswinkel im Wesentlichen gleich sind.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen angegeben.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, daß die verschiedenen (mindestens drei) Aufnahmen des zu untersuchenden Objektes in verschiedenen Konfigurationen des Strahlengangs sich in Bildbereichen ohne Anisotropien, d.h. in isotropen Bildbereichen, nicht oder nur minimal in der Helligkeit unterscheiden, wodurch sich die Bildwiedergabe (in einem Okular des Mikroskops sowie auf dem Bildsensor) außerhalb der eventuell vorhandenen anisotropen Regionen des zu untersuchenden Objektes nicht oder nur minimal von einer klassischen mikroskopischen Bildwiedergabe unterscheidet. Ein weiterer wichtiger Vorteil eines Systems, welches eine derartige Invarianz aufweist, ist die Beibehaltung einer zeitlich weitgehend gleichmäßigen Grundhelligkeit, insbesondere beim Mikroskopieren biologischer Zellen, die große isotrope Objektbereiche aufweisen. Diese gleichmäßige Grundhelligkeit ist für eine automatische zeitunabhängige Einstellung des Bildsensors auf die Beleuchtungsverhältnisse vorteilhaft, um eine optimale Präzision und insbesondere einen geringen Rauschabstand der Bildaufhahme zu gewährleisten. Eine gleichmäßige Grundhelligkeit ist auch für technisch übliche Bildsensoren mit adaptiver Helligkeitssteuerung von Vorteil, da die dort verwendeten adaptiven Verfahren für quasistatische, d.h. sich nur langsam verändernde, Beleuchtungsverhältnisse ausgelegt sind.
Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung anhand einer
Zeichnung näher erläutert.
Die einzige Figur zeigt in schematischer Darstellung eine Mikroskopieranordnung
100 mit einer Lichtquelle 102 und einem optischen Sensor 104. Dargestellt ist ferner ein Strahlengang 106, der sich zwischen Lichtquelle 102 und Sensor 104 erstreckt.
Ein zu mikroskopierendes Objekt 108 wird üblicherweise mittels eines Objektträgers 110 in den Strahlengang 106 gebracht. Die Mikroskopieranordnung 100 wird ferner in der Praxis häufig ein Objektiv 114 aufweisen.
Für die Anwendung ist es von Vorteil, wenn die Beleuchtung des zu analysierenden Objekts 108 durch geeignet polarisiertes Licht, welches zeitlich unveränderlich ist, erfolgt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel erfolgt die Beleuchtung des Objekts 108 mit zirkulär polarisiertem Licht, welches durch Einfügen eines zirkulären Polarisationsfilters 112 in den Strahlengang zwischen Lichtquelle 102 des Mikroskops und Objekt 108 erzeugt wird. Eine modellhafte mathematische Betrachtung des Problems zeigt, daß (nur) eine Beleuchtung mit zirkulär polarisiertem Licht eine vollständige Analyse der Anisotropien unabhängig von deren Ausrichtungswinkel in der Betrachtungsebene ermöglicht.
Eine für isotrope Objektbereiche invariante Anordnung, die eine gleichmäßige Grundhelligkeit liefert, wird erreicht, indem im Strahlengang 106 zwischen dem zu analysierenden Objekt 108 und dem Sensor 104 ein oder mehrere Elemente 116 angeordnet werden, welche die Polarisationseigenschaften des Lichts im Strahlengang 106 elektrisch einstellbar rotieren können. Besonders vorteilhaft sind beeinflußbare Elemente 116, die ihrerseits dabei keine optische Verzögerung bzw. Anisotropie zu erzeugen. Dabei ist von Vorteil, daß jene Anteile des zirkulär polarisierten Lichts von der Lichtquelle 102, welche nicht durch Anisotropien im Objekt 108 in ihren Polarisationseigenschaften verändert wurden, die also immer noch zirkulär polarisiert sind, durch Rotation nicht polarisationsoptisch meßbar beeinflußt werden. Daher wird eine im Strahlengang 106 folgende polarisationsoptische Analyse, die vorteilhaft mittels eines linearen Polarisationsfilters 120 erfolgt, die gewünschten Invarianzeigenschaften besitzen.
Eine in der Figur schematisch dargestellte Steuerung 122 wird vorgesehen, um das oder die Elemente 116 elektrisch anzusteuern und so die durch Element(e) 116 hervorgerufene optische Rotation auf einen gewünschten Rotationswinkel einzustellen. Ferner kann vorgesehen sein, die Steuerung mit dem Sensor 104 zu koppeln, um nach dem Einstellen eines Rotationswinkels mittels des Sensors 104 ein Bild zu erfassen bzw. die Erfassung auszulösen.
Um eine effiziente Quantisierung der Anisotropien außerhalb der invarianten (isotropen) Objektbereiche zu erreichen, werden mindestens drei Abbilder des Objekts mittels mindestens dreier verschiedener Konfigurationen erfaßt. Die verschiedenen Konfigurationen werden durch drei verschiedene Rotationswinkel erreicht. Dies kann durch ein Element 116A mit drei verschiedenen Rotationskonfigurationen oder durch zwei aufeinander folgende Elemente 116A5 116B mit je zwei verschiedenen Rotationskonfigurationen erfolgen. Von den sich bei zwei Elementen ergebenden vier möglichen Konstellationen können drei vorteilhafte ausgewählt werden. Wird nur ein Element 116A vorgesehen, werden von der Steuerung 122 drei verschiedene Spannungen entsprechend den drei verschiedenen Rotationswinkeln des Elements 116A geliefert. Werden hingegen zwei Elemente 116A, 116B vorgesehen, liefert die Steuerung jeweils einen von zwei Spannungswerten jeweils entsprechend einem der beiden Rotationswinkel an die beiden Elemente 116A, 116B zum Einstellen eines der gewünschten drei Rotationswinkel.
Geeignete preiswerte Elemente, die eine Rotation der Polarisationseigenschaften von Licht bewirken, sind sogenannte TN (twist-nematic) Flüssigkristallzellen, deren Flüssigkristall im inaktiven Zustand eine Rotation der Polarisationseigenschaften von Licht bewirkt. Der Rotationswinkel kann dabei durch die Konstruktion beeinflußt werden. Durch geeignete Dimensionierung ist es ferner möglich, die Anisotropieeigenschaften der TN-Zellen für bestimmte Wellenlängen des benutzten Lichts verschwinden zu lassen. Die optische Verzögerung erreicht dabei ein ganzzahliges Vielfaches der Wellenlänge und ist damit nicht nachweisbar bzw. meßbar. Um dies sicherzustellen, kann ein geeignetes Färb- oder Interferenzfilter mit engem Wellenlängendurchlaßbereich in den Strahlengang direkt nach der Lichtquelle 106 eingefügt werden;
Durch Anlegen einer elektrischen Spannung mittels der Steuerung 122 ist es möglich, diese TN-Flüssigkristallzellen in einen isotropen Zustand zu überführen, indem - zumindest in guter Näherung - weder eine Rotation noch eine optische Verzögerung auftritt. Bei derartigen TN-Flüssigkeitszellen ist überdies der Übergang vom inaktiven in den aktiven Zustand (und zurück) in besonders kurzer Zeit möglich. Insbesondere sind TN-Flüssigkristallzellen wesentlich schneller als die aus der eingangs zitierten US Patentschrift 5,521,705 bekannten Flüssigkristallzellen, deren Wirkung auf einer elektrischen Veränderung der optischen Verzögerung beruhen und bei denen keine Rotation auftritt. Die Umschaltzeiten von TN-Flüssigkristallzellen ermöglichen dabei eine Pseudo-Bewegtbild-Analyse mit relevanten Bildraten in der Größenordnung von 10-50 Bildern pro Sekunde, was mit andersartigen Flüssigkristallzellen infolge deren erheblich langsamerer elektrischer Steuerbarkeit mit der nötigen Präzision nicht erreichbar ist.
Aus einer modellhaften mathematischen Betrachtung der Mikroskopieranordnung 100 läßt sich ableiten, daß eine optimale Anordnung zwei beeinflußbare Elemente 116A, 116B aufweist, die jeweils zwischen 60° Rotation und 0° Rotation umgeschaltet werden können und im Strahlengang 106 hintereinander zwischen Objekt 108 und Sensor 104 angeordnet werden, gefolgt von einem beliebig orientierten linearen Polarisator 120. Für die Objektanalyse werden drei Konfigurationen herangezogen: (a) Rotation im ersten Element: 60°, im zweiten Element 60°, (b) Rotation im ersten Element: 60°, im zweiten Element 0°, (c) Rotation im ersten Element: 0°, im zweiten Element 0°. Eine gleiche Wirkung kann erreicht werden, wenn in jedem Element 116A, 116B eine Rotation von 120° bzw. 0° anstelle von 60° bzw. 0° erfolgen.
Mit dem im Strahlengang 106 folgenden Bildsensor 104 wird für jede der Konfigurationen (a) bis (c) jeweils ein Bild aufgenommen. Die
Helligkeitsinformation im Falle vorhandener Anisotropien ergibt sich als Mittelwert der drei aufgenommenen Bilder. Die Stärke der Anisotropie, d.h. die optische lokale optische Verzögerung des Objektes an einem Punkt in der Bildebene, ergibt sich aus den Differenzbildern von (a) und (b) bzw. (b) und (c), die vorteilhaft durch Subtraktion der Bilddaten in einem digitalen Bildverarbeitungssystem (nicht dargestellt) aus den drei Rohbildern gewonnen werden. Ein wichtiger Vorteil dieser beispielhaften Anordnung ist eine winkelunabhängige Ermittlung der Stärke der
Anisotropie direkt aus den Differenzbildern mittels weniger mathematischer
Operationen, die sich für Bildanalysesysteme mit 10-50 Bildern pro Sekunde in Echtzeit auf modernen handelüblichen Computern durchführen läßt. Es sei angemerkt, daß sich im Falle sehr schwacher Anisotropien - wie in der Mikrobiologie typisch - aufgrund der relativ langsamen zu erwartenden Objektbewegung mittels eines zeitlichen Gleitmittelwertes der berechneten Differenzbilder eine Verbesserung der Meßgenauigkeit erreichen läßt, ohne daß die korrekte zeitliche Bildwiedergabe der isotropen Bestandteile des wiedergegebenen Bildes dadurch verschlechtert wird.
Ein alternatives Ausführungsbeispiel der beschriebenen Erfindung ist von besonderem technischem Interesse, da TN-Flüssigkristallelemente mit 60° oder 120° Rotation und verschwindender optischer Verzögerung im inaktiven Zustand technisch zwar möglich, aber marktunüblich sind und eine entsprechend zweckoptimierte Herstellung möglicherweise zu teuer ist. Demgegenüber sind TN- Flüssigkristallelemente mit 90° Rotation marktüblich, da mit solchen Zellen optische Ventile (sogenannte Shutter) problemlos und wellenlängenunabhängig hergestellt werden können. Allerdings ist bei solchen Elementen im Normalfall nicht davon auszugehen, daß im inaktiven Zustand eine geeignete optische Verzögerung vorliegt, die ein Verschwinden der Anisotropie bewirkt. Vielmehr ist es häufig erforderlich, die zutreffende optische Verzögerung im Einzelfall zu messen, um das Element optisch vollständig zu charakterisieren. Allerdings ist auch bei handelsüblichen Elementen mit 90° Rotation gewährleistet, daß im elektrisch aktiven Zustand, d.h. nach dem Anlegen einer genügend hohen Spannung durch die Steuerung 122, sowohl die Rotation als auch die optische Verzögerung zumindest näherungsweise verschwinden.
Um die vorteilhafte Invarianzeigenschaft auch mit solchen 90°-Elementen 116 gewährleisten zu können und überdies eine optimale Analysewirkung (Meßgenauigkeit) zu erreichen, muß die optische Anordnung 100 im Strahlengang 106, nunmehr bestehend aus Lichtquelle 102, Farbfilter (nicht dargestellt), zirkulärem Polarisationsfilter 112, zu analysierendem Objekt 108, erstem TN- Flüssigkristallelement 116A, zweitem TN-Flüssigkristallelement 116B, linearem Polarisationsfilter 120 sowie Bildsensor 104 durch ein optisches Kompensationselement 118 geeignet kompensiert werden, um für isotrope Objekte oder isotrope Objektbereiche drei Konfigurationen mit zumindest näherungsweise identischer Bildausgabe zu ermöglichen. Diese Kompensation kann zum Beispiel durch das Einfügen eines geeigneten, vorzugsweise unveränderlichen optischen Verzögerungselements 118 geeigneter handelsüblicher Verzögerung in den Strahlengang 106 zwischen dem ersten Flüssigkristallelement 116A und dem zweiten Flüssigkristallelement 116B erreicht werden, wobei als freie Parameter die relativen Orientierungswinkel der verschiedenen an der optischen Analyse beteiligten Komponenten des Systems 100 (erstes TN-Flüssigkristallelement 116A, Verzögerungselement 118, zweites Flüssigkristallelement 116B, lineares Polarisationsfilter 120) zu optimieren sind. Natürlich kann als Kompensationselement 118 ein — beispielsweise in Sandwich-Bauweise — aus zwei oder mehr Elementen zusammengesetztes Kompensationselement oder eine Gruppe von Elementen vorgesehen werden, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Dabei läßt sich für handelsübliche 90°-TN-Flüssigkristallzellen 116A, 116B, bei denen also gilt: (P1 = Cp3 = O0/^0 die eine spezifische optische Verzögerungseigenschaft von 105 nm mit Winkelorientierung der Verzögerungseigenschaft 20° aufweisen und die mit einem relativen Orientierungswinkel von 0° zueinander angeordnet sind, eine optimale Kompensation mit einem handelsüblichen 140nm- Verzögerungselement 118 erreichen, wenn dies mit einem relativen Winkel von φ2 = -3° zu den Flüssigkristallzellen 116A, 116B angeordnet wird und das lineare Polarisationsfilter 120 im relativen Winkel von φ4 = 10° zu den Flüssigkristallzellen 116A, 116B angeordnet wird. Eine Berechnung der relevanten Orientierungswinkel in Abhängigkeit von den Parametern der Flüssigkristallzellen 116A, 116B (Rotationswinkel und optische Verzögerung mit Betrag und Orientierungswinkel) und dem Betrag der optischen Verzögerung des Kompensationselements 118 ist dabei problemlos möglich, indem der Strahlengang 106 mathematisch mit Hilfe der für polarisationsoptische Berechnungen geeigneten Müller-Matrix-Methode modelliert wird und die gewünschten Eigenschaften des gesamten Systems 100 mit Hilfe numerischer Optimierungsverfahren über die vier freien Parameter (relative Winkel zwischen den genannten Elementen, in der Figur schematisch dargestellt als die Winkel Cp1-(P4) berechnet wird. Die Optimierungskriterien sind dabei die Abweichung von der gewünschten Invarianz für einen gegebenen Parametersatz in den drei relevanten Konfigurationen (Minimierung) sowie die erreichte Betragsdifferenz bei der Differenzbildung bei vorgegebener Anisotropie des Objektes (in verschiedenen Winkelanordnungen) (Maximierung). In der Regel läßt sich dadurch eine sehr gute Invarianz erreichen, wobei die Winkelabhängigkeit der Anisotropiebestimmung unter Umständen im Vergleich zur Realisierung mit 60°/ 120° Elementen weniger vorteilhaft sein kann, in der Praxis jedoch ausreichend ist. Eine verbesserte Genauigkeit der numerischen Optimierung ist weiterhin bei Kenntnis der genauen optischen Eigenschaften der TN-Flüssigkeitszellen 116A, 116B im aktiven (spannungsbeaufschlagten) Zustand möglich, wobei die näherungsweise Annahme von 0° Rotation und optischer Verzögerung 0 nm auch bereits befriedigende Resultate zuläßt.
Es sei darauf hingewiesen, daß die Anordnung des Kompensationselements 118 zwischen den beeinflußbaren Elementen 116 nur eine von zahlreichen Anordnungsmöglichkeiten darstellt. Das Element kann an anderen Stellen im Strahlengang angeordnet werden, beispielsweise zwischen Objekt und erstem beeinflußbaren Element 116A oder zwischen zweitem beeinflußbaren Element 116B und Sensor 104. Es ist auch denkbar, das Analyseelement 120 und das Kompensationselement in einem Element zu vereinigen — nicht dargestellt.
Es sei ferner darauf hingewiesen, daß die eine Anordnung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung weitere aktive oder passive optische Elemente im Strahlengang 106 aufweisen kann, die beispielsweise der Verbesserung des Strahlengangs 106, dem Schutz des Objekts 108 vor zu starker Hitzeeinwirkung, der Vergrößerung oder der Bildschärfeverbesserung dienen können. Andererseits können, falls geeignete hochauflösende Sensoren 104 mit ausreichender Abbildungsleistung zur Verfügung stehen, vergrößernde Optiken wie das Objektiv 114 entfallen.
Um die vom Sensor 104 erzeugte Abbildung durch einen Nutzer der Vorrichtung kontrollierbar zu gestalten, kann ein halbdurchlässiger Sensor vorgesehen werden, dem ein Okular folgt - nicht dargestellt. Alternativ kann im Strahlengang vor dem Sensor ein Prisma oder ähnliches vorgesehen werden, welches den Strahlengang aufteilt in einen Strahlengang zum Sensor und einen weiteren Strahlengang zu einem Okular - nicht dargestellt. Um eine bessere Farbwiedergabe zu erreichen, ist es außerdem möglich, den Strahlengang mittels Prismen in die drei Farbanteile Rot, Grün und Blau aufzuteilen und für jede dieser Grundfarben einen gesonderten Sensor vorzusehen — nicht dargestellt.
Schließlich sei erwähnt, daß auch Anwendungen der erfindungsgemäßen Anordnungen vorstellbar sind, die mehr als drei verschiedene Polarisationskonfigurationen erfordern. Eine Vielzahl solcher Konfigurationen kann durch Vorsehen beliebig vieler Rotationswinkel erreicht werden, die entweder durch ein Element mit einer Vielzahl von Rotationswinkelzuständen einstellbar sind oder durch die geeignete Kombination von Elementen, die beispielsweise jeweils zwei oder drei Zustände aufweisen.

Claims

Patentansprüche
1. Anordnung (100) zum mikroskop-optischen Erfassen der Isotropieeigenschaften eines Objekts (108), die zumindest folgendes aufweist: - zumindest eine Lichtquelle (102);
- zumindest einen optischen Sensor (104);
- einen Strahlengang (106), der sich zwischen der Lichtquelle (102) und dem optischen Sensor (104) erstreckt, wobei das Objekt (108) in diesem Strahlengang (106) angeordnet ist; - zumindest ein im Strahlengang (106) angeordnetes Element (120) zur polarisationsoptischen Analyse;
- mindestens ein durch eine Steuerung (122) beeinflußbares Element (116A) im Strahlengang (106), welches eine hinsichtlich eines Rotationswinkels steuerbare Rotation der Polarisationseigenschaften durchdringenden Lichtes hervorruft, wobei
- die Steuerung (122) Mittel aufweist, durch welche mindestens drei verschiedene Rotationswinkel vorgebbar sind;
- die Steuerung (122) ferner Mittel aufweist, um mittels des optischen Sensors (104) für jeden der mindestens drei Rotationswinkel ein Abbild des Objekts (108) zu erfassen; und
- die Anordnung (100) so ausgestaltet ist, daß die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts (108) bezüglich der Rotationswinkel im Wesentlichen gleich sind.
2. Anordnung nach Anspruch 1, bei der die Lichtquelle (102) annähernd monochromatisches, zirkulär polarisiertes Licht erzeugt.
3. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei der das Element (120) zur polarisationsoptischen Analyse ein lineares Polarisationsfilter ist.
4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der ein beeinflußbares Element (116A) vorgesehen ist, mit welchem drei verschiedene Rotationswinkel einstellbar sind, von denen zwei um jeweils annähernd 60° oder annähernd 120° von dem dritten Rotationswinkel abweichen.
5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der zwei beeinflußbare Elemente (116A, 116B) im Strahlengang (106) vorgesehen sind, wobei jedes dieser zwei beeinflußbare Elemente (116A, 116B) zwei Rotationswinkelzustände aufweist und die beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so angeordnet sind, daß zumindest drei verschiedene Rotationswinkel durch Ansteuerung der beiden beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) einstellbar sind.
6. Anordnung nach Anspruch 5, bei der jedes der beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) einen um annähernd 60° oder annähernd 120° vom ersten Rotationswinkelzustand abweichenden zweiten Rotationswinkelzustand aufweist, wobei die beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so angeordnet sind, daß durch Beeinflussung der beiden Elemente (116A, 116B) zumindest drei verschiedene resultierende Rotationswinkel einstellbar sind, von denen zwei um jeweils annähernd 60° oder annähernd 120° von dem dritten Rotationswinkel abweichen.
7. Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, bei der die beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so gestaltet sind, daß sie keine optische Verzögerung oder eine optische Verzögerung, die einem Vielfachen der Wellenlänge des von der Lichtquelle (102) erzeugten Lichts entspricht, hervorrufen.
8. Anordnung nach Anspruch 5, bei der jedes der beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) in einem ansteuerungsfreien Zustand eine Rotation um einen Rotationswinkel sowie eine optische Verzögerung hervorruft und in einem angesteuerten Zustand annähernd keine Rotation und annähernd keine Verzögerung hervorruft, wobei zusätzlich ein optisches Kompensationselement (118) im Strahlengang (106) angeordnet wird, dessen Parameter bezüglich der beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so gewählt werden, daß sich die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts in den verschiedenen resultierenden Rotationswinkeln nicht oder nur minimal unterscheiden.
9. Anordnung nach Anspruch 8, bei der das optische Kompensationselement (118) ein Verzögerungselement ist, welches im Strahlengang (106) zwischen den beeinflußbaren Elementen (116 A, 116B) angeordnet wird.
10. Anordnung nach einem der Ansprüche 8 oder 9, bei der die beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so ausgestaltet sind, daß der Rotationswinkel im ansteuerungsfreien Zustand annähernd 90° beträgt.
11. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die beeinflußbaren Elemente (116 A, 116B) TN-Flüssigkristallelemente sind.
12. Verfahren zum mikroskop-optischen Erfassen der Isotropieeigenschaften eines Objekts (108) mittels einer Mikroskopieranordnung (100) mit folgenden Verfahrensschritten: - Vorsehen zumindest einer Lichtquelle (102);
- Vorsehen zumindest eines optischen Sensors (104);
- Vorsehen eines Strahlengangs (106), der sich zwischen der Lichtquelle (102) und dem optischen Sensor (104) erstreckt, wobei das Objekt (108) in diesem Strahlengang (106) angeordnet wird; - Vorsehen zumindest eines im Strahlengang (106) angeordneten Elements (120) zur polarisationsoptischen Analyse;
- Vorsehen mindestens eines durch eine Steuerung (122) beeinflußbaren Elements (116) im Strahlengang (116), welches eine hinsichtlich eines Rotationswinkels steuerbare Rotation der Polarisationseigenschaften durchdringenden Lichtes hervorruft; - Vorgeben eines von mindestens drei verschiedenen Rotationswinkeln durch die Steuerung (122); und
- Erfassen eines Abbilds des Objekts (108) mittels des optischen Sensors (104) für jeden der mindestens drei Rotationswinkel; wobei die Mikroskopieranordnung (100) so ausgestaltet ist, daß die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts (108) bezüglich der Rotationswinkel im Wesentlichen gleich sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem durch die Lichtquelle (102) annähernd monochromatisches, zirkulär polarisiertes Licht erzeugt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, bei dem zur polarisationsoptischen Analyse ein lineares Polarisationsfilter vorgesehen wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem ein beeinflußbares Element (116A) vorgesehen wird, mit welchem drei verschiedene Rotationswinkel einstellbar sind, von denen zwei um jeweils annähernd 60° oder annähernd 120° von dem dritten Rotationswinkel abweichen.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem zwei beeinflußbare Elemente (116A, 116B) im Strahlengang vorgesehen werden, wobei jedes dieser zwei beeinflußbare Elemente (116A, 116B) zwei Rotationswinkelzustände aufweist und die beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so angeordnet sind, daß zumindest drei verschiedene Rotationswinkel durch Ansteuerung der beiden beeinflußbaren Elemente ( 116A, 116B) einstellbar sind.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem beeinflußbare Elemente (116A, 116B) vorgesehen werden, die jeweils einen um annähernd 60° oder annähernd 120° vom ersten Rotationswinkelzustand abweichenden zweiten Rotationswinkelzustand aufweisen, wobei die beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so vorgesehen werden, daß durch Beeinflussung der beiden Elemente (116A, 116B) zumindest drei verschiedene resultierende Rotationswinkel einstellbar sind, von denen zwei um jeweils annähernd 60° oder annähernd 120° von dem dritten Rotationswinkel abweichen.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, bei dem beeinflußbare Elemente (116A, 116B) vorgesehen werden, die keine optische Verzögerung oder eine optische Verzögerung, die einem Vielfachen der Wellenlänge des von der Lichtquelle erzeugten Lichts entspricht, hervorrufen.
19. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem beeinflußbare Elemente (116A, 116B) vorgesehen werden, die in einem ansteuerungsfreien Zustand eine Rotation um einen Rotationswinkel sowie eine optische Verzögerung hervorrufen und in einem angesteuerten Zustand annähernd keine Rotation und annähernd keine Verzögerung hervorrufen, wobei zusätzlich ein optisches Kompensationselement (118) im Strahlengang vorgesehen wird, dessen Parameter bezüglich der beeinflußbaren Elemente (116A, 116B) so gewählt werden, daß sich die Abbilder eines isotropen Bereichs des Objekts in den verschiedenen resultierenden Rotationswinkeln nicht oder nur minimal unterscheiden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem als Kompensationselement (118) ein Verzögerungselement im Strahlengang (106) zwischen den beeinflußbaren Elementen (116 A, 116B) angeordnet wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, bei dem beeinflußbare Elemente (116A, 116B) vorgesehen werden, deren Rotationswinkel im ansteuerungsfreien Zustand annähernd 90° beträgt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, bei dem als beeinflußbare Elemente (116A, 116B) TN-Flüssigkristallelemente vorgesehen werden.
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