WO2006080483A1 - 新規樹状細胞膜分子及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

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WO2006080483A1
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Hiroshi Watarai
Etsuko Sekine
Masaru Taniguchi
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    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a membrane molecule of mouse or human rodent cell (hereinafter also referred to as DC), DNA encoding the membrane molecule, an antibody against the membrane molecule, and a mature DC separation method using the antibody And to mature DC detection methods.
  • DC mouse or human rodent cell
  • autoimmune diseases includes (1) genetic background, (2) exposure to self-antigens that have not been exposed to the immune system released due to inflammatory reactions, and viruses Local environment derived from inflammatory reactions such as bacteria, that is, so-called cross-reactivity due to the homology of the recognition peptide of activated T cells, changes in local environment due to T cell activity, and (3) on the cell membrane It is assumed that there are powerful factors such as the presence of self-reactive T cells induced by the failure of tolerance due to abnormal expression of costimulatory molecules in
  • TLR TolHike Receptor
  • Innate immunity is a system in which acquired immunity is completed at the individual level (specificity of antibodies and T cell receptors is acquired by individual gene rearrangement and is not transmitted to offspring), whereas innate immunity is shared in the genome It is a record of evolution. In other words, it is natural immunity that directs which specificity should be reacted among the various specificities of acquired immunity, and TLR is considered to be the most important group of molecules.
  • the role of TLR in innate immunity is the expression of costimulatory molecules and site force-in production by recognition and signaling of adjuvant. Proteins that are the target of acquired immunity themselves have low immunogenicity, whereas pathogen-derived glycolipids (such as lipopolysaccharide (LPS)) strongly activate the immune system. For example, it is a good example that not only antigens but also adjuvants are required for antibody production. In other words, the control of acquired immunity is triggered by TLR recognition! /, And it is no exaggeration! /.
  • LPS lipopoly
  • the main role in determining and controlling acquired immunity is the rod-shaped cell (DC). Thl / Th2 skewing, cytotoxic T cell (CTL) and induced macrophage induction (cellular immunity), antibody production Involved in (humoral immunity). This induced immune response varies depending on the type of pathogen. Cellular immunity predominates in the case of bacterial infections, but humoral immunity predominates in certain parasites and viruses. In addition, in the case of Ajuvant, antibody production dominates like Alumina Hydroxide (Alum). This may be due to qualitative or quantitative changes in recognition by TLR and DC immunity.
  • Alum Alumina Hydroxide
  • TLR is a type I membrane protein having a leucine_rich repeat related to protein interaction called LRR outside the cell.
  • TLR domain (Toll / IL-1R homology domain) is a domain related to signal transduction. (Trends Cell Biol., 11 ⁇ , 304-31 1 (2001)). So far, 10 types of TLR molecules have been reported in humans (TLR1 -TLR10), and at the same time, identification of ligands is progressing.
  • TLR2 is a bacterial peptide darican (PG) lipoprotein (J. Biol.
  • TLR4 is LPS of Gram-negative bacteria and lipotic acid (LTA) of Gram-positive bacteria (Science, 282 ⁇ , 2085-2088 (1998))
  • TLR5 Is a bacterial flagellar constituent protein (Nature, 410 ⁇ , 1099-1103 (2001))
  • TLR2 / 6 is a mycoplasma-derived lipopeptide or yeast-derived zymosan (Int.
  • TLR7 and TLR8 are bacterial single-stranded RNA (Science, 303 ⁇ , 1529-31 (2004)), TLR9 is bacterial CpG DNA (Nature, 408 ⁇ , 740-745 ( 2000)), and each has been reported to recognize.
  • TLR ! For signal transduction from TLR !, mainly macrophages or rod cells, mainly TLR 2 (MALP-2 stimulation, etc.), TLR4 (LPS stimulation, etc.), TLR9 (CpG DNA stimulation, etc.) It has been analyzed.
  • TLR 2 MALP-2 stimulation, etc.
  • TLR4 LPS stimulation, etc.
  • TLR9 CpG DNA stimulation, etc.
  • MyD88 an adapter molecule essential for signal transduction in the IL-1R family as a molecule associated with the TIR domain, clearly reveals that it is an essential molecule for TLR4 signaling and is induced by LPS. Production of cytodynamic force from macrophages, B cell blasting, induction of shock symptoms, etc. were completely absent (Immunity, 11 ⁇ , pp. 115-122 (1999)).
  • TIRAP / MAL reported as a novel TLR4 adapter molecule inhibits DC maturation by TLR4, suggesting that it may be involved in the pathway required for ⁇ ⁇ IJ hypermolecule expression in DC (Nat. Immunol. 2 pp. 835-841 (2001); and Nature 413 p. 78-83 (2001)).
  • IRF3 required for the expression of IFN-inducible genes such as IP-10 and ISRE is activated in macrophages derived from MyD88-deficient mice and DC (J. Immunol, 167 ⁇ , 5887). -5894 (2001)).
  • TREMdriggering Receptor Expressed by Myeloid Cells is known as a molecule that enhances the acquired immune response upon receiving an innate immune response (J. Immunol., 164 ⁇ , 4991-4995 (2000)).
  • TREM-1 is a type I cell membrane protein with a single immunoglobulin domain that is expressed on CD14 strongly positive monocytes and neutrophils, and is known to associate with the adapter molecule DAP12 and transmit signals. ing.
  • TREM-1 expression is enhanced in CD14 strongly positive monocytes and neutrophils stimulated by bacteria, fungi or their constituents.
  • anti-TREM-1 ago-stick antibody is allowed to act on neutrophils, large amounts of IL-8 and myelin peroxidase are produced, and monocytes produce IL-lbeta, TNF-alpha, or MCP-1. It has been known.
  • adhesion molecules such as ICAM-1, CDllb, CD49e, and CD29 and costimulatory molecules such as CD40 and CD86 are also enhanced.
  • the expression of these inflammatory cytokines chemokines is enhanced in concert with LPS stimulation, causing septic shock. It has been shown that TREM-1 plays an important function in a model of septic shock (Nature, 410, 1103-1107 (2001)).
  • DCs rod-shaped cells
  • APCs antigen-presenting cells
  • DC Monocyte-derived DC
  • MoDC human monocytes
  • GM-CSF GM-CSF
  • IL-4 GM-CSF
  • IL-4 GM-CSF
  • DC can be divided into two types, immature DC and mature DC, according to the stage of separation.
  • Antigens taken into immature DCs are processed in cells and presented as antigen-derived peptides on MHC class II molecules on the DC surface.
  • CD4-positive antigen-specific helper T cells recognize antigen-derived peptides and MHC class II molecule complexes as antigen receptors, and are sensitized and activated by the addition of stimuli from costimulatory molecules.
  • DCs also stimulate and activate CD8-positive cytotoxic T cells (CTLs) via MHC class I molecules. Phagocytosis Immature MoDC is stronger Mature MoDC is weaker.
  • DC which is a powerful APC present in the living body, highly expresses CD80 / CD86 belonging to the B7 family when it matures upon stimulation with active acupuncture.
  • CD80 / CD86 is abnormally expressed in DCs present in the joint fluid of rheumatoid arthritis, the lesion tissue of psoriasis, and the skin tissue of allergic contact dermatitis. It ’s known!
  • CD28 has a feature that strongly enhances the activity of naive T cells.
  • the presence of a signal by CD28 enhances IL-2 production and IL-2 receptor expression, thereby enhancing the proliferative response and consequently enhancing various effector functions of T cells.
  • CD28 signal not only enhances IL-2 but also enhances the production of various site forces such as IL-4, IL-5, IL-13, IFN-gamma, TNF-alpha, and GM-CSF. It is also involved in the expression of T cell-active antigens such as CD40 ligand and chemokines such as IL-8 and RANTES.
  • CD80 or CD86 are involved in the induction of CD4 positive T cells to Thl or Th2.
  • differentiation direction of naive CD4-positive T cells which is not a single aspect such as Thl for CD80 and Th2 for CD86, is determined by antigens or APC itself in addition to CD28 and CD152 signals. It may be affected by various factors.
  • the CD28 signal plays an important role that is not compensated by the function of other molecules, particularly in the Th2 differentiation 'activity of na ⁇ ve T cells.
  • Th2 site force-in dependence in CD28 knockout mice (2) D011-10TCR transgenic mouse CD4-positive T cells and CD80 / CD86 double cells (Science, 261 ⁇ , pages 609-612 (1993)) and (2) D011-10TCR transgenic mice This is supported by the results of selective inhibition of Th2 protein by antigen stimulation with knockout mouse-derived APC (J. Immunol., 161, 2762-2771 (1998)).
  • Another important role of the CD28 signal is to enhance the expression of survival factors such as be ⁇ xL and suppress apoptosis of T cells after antigen stimulation.
  • CD28 is constitutively expressed in T cells
  • the expression of CD80 / CD86 is regulated in yarn and tissue cells, so that there are T cells that respond to autoantigens.
  • This tolerance guidance system If the system fails, there is a possibility of causing various diseases such as autoimmune diseases and allergic diseases.
  • Inflammatory lymphocyte infiltration into the spleen is observed only by forced expression of CD80 or CD86 in the islet beta cells, but it does not lead to the development of insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), which is an autoimmune diabetes.
  • IDDM with beta-cell disruption can only develop after matching antigen (MHC) class II molecules, TNF-alpha, or viral proteins as self-antigens with CD80.
  • MHC antigen
  • TNF-alpha TNF-alpha
  • CD80 / CD86 In several human organ-specific autoimmune diseases, expression of CD80 / CD86 is a professional APC. In this way, CD80 / CD86, which is under control of APC in normal tissues, has been observed to be abnormally expressed in the local area of the disease! An association has been suggested.
  • the treatment of autoimmune diseases is mainly non-specific immunosuppressive agents with many side effects.
  • Inhibition of costimulation has antigen-specific suppression and a sustained effect after the end of administration, and can be expected to reduce side effects and maintain an immune response against infection by shortening the administration period. It is expected that more effective treatment will be performed as the interactions and functions of immune system cells become clear.
  • ICOS indble T cell co-stimulator
  • PD-1 have been found as CD28 family molecules that are expressed in activated T cells.
  • the present inventors have focused on the maturation of DC, which is important for the expression of DC functions. Therefore, exploratory research centered on the identification of membrane molecules with increased expression levels has been carried out based on the comprehensive identification of membrane molecules whose expression is regulated by DC maturation by Proteomics.
  • Proteomics is a term corresponding to the genomics of proteins, and is used to conduct large-scale research on proteins. Study the properties of protein expression, post-translational modifications and interactions, for example, what happens at the level of expressed protein in normal cells and cancer cells, the overall force, intracellular network and processes, etc. To obtain biological information. If a membrane molecule that exists specifically in DC is identified, it will be possible to produce an antibody against the membrane molecule and use the antibody in the medical field.
  • An object of the present invention is to control infectious diseases, control of autoimmune diseases, and the like by controlling the function of DC targeting the present molecule expressed on mature DC, which is a powerful APC.
  • the molecule is expressed on APC such as mature DC and is expected to be involved in T cell activity. Therefore, an antibody that specifically recognizes the molecule is used to isolate APC such as mature DC. And provide a way to detect.
  • DC is a heterogeneous cell population and there are several subsets [Stem Cells, 15 ⁇ , 409-419 (1997)], (2) DC Subsets have different functions in T cell activity (induction of apoptosis, induction of T cell differentiation into Thl, Th2, etc.) [Science, 283, 1183-1186 (1999)], (3 ) Suppresses immune response via DC It has become clear that it is possible to control (DC therapy, DC-specific drugs, antibodies, cyto force-in, etc.).
  • Human DC subsets are roughly classified into myeloid DCs and lymphoid DCs.
  • Myeoid DCs have been shown to have two differentiation pathways [J. Exp. Med., 184 ⁇ , pp. 695-706 (1996)], and CD34-positive hematopoietic stem cells are GM- CD14-positive CDla-negative and CD14-negative CDla-positive progenitors appear in the CSF and TNF-alpha culture system, and the former can be divided into dermal DC and the latter into epidermal Langeron cells.
  • the MoDC used by the present inventors is similar to the former DC in vivo and is considered to belong to the myeloid DC.
  • Peripheral blood has at least two DC subsets, which are lineage markers (CD3, CD19, CD56, CD14) negative, HLA-DR positive, CDllc positive and lineage markers (CD3, CD19, CD56, CD14).
  • lineage markers CD3, CD19, CD56, CD14
  • HLA-DR positive, CDllc negative, CD123 strong phenotype After maturation, the former is an MDC that produces a large amount of IL-12, the naive T cell is a Thl, the latter is a PD that produces a large amount of type I IFN / NIPC (natural type I interferon producing cell) That's what S knows [Science, 284, 1835-1837 (1999)].
  • the present membrane molecule is also expected as a target molecule for controlling the immune response, based on the knowledge that the expression is remarkably increased with the maturation of MoDC.
  • an amino acid sequence comprising a deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4, and capable of controlling an immune response;
  • a DNA encoding the protein of the present invention is provided.
  • DNA having any one of the following nucleotide sequences is provided.
  • a base sequence that encodes an amino acid sequence that is capable of controlling an immune response is a base sequence that is hybridized under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 or its complementary sequence:
  • a recombinant vector containing the DNA of the present invention is provided.
  • a transformant having the DNA or recombinant vector of the present invention is provided.
  • an antibody that specifically immunocombines with the protein of the present invention or a fragment thereof.
  • the antibody of the present invention immunologically recognizes rod cells.
  • the antibody of the present invention recognizes the extracellular region of the protein of the present invention.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a method for isolating human or other animal-derived immunocompetent cells using the antibody of the present invention is provided.
  • rod cells are isolated.
  • rod-shaped cells are detected.
  • the present invention is based on the knowledge that the expression of the present membrane molecule increases as DC matures.
  • the human and mouse rod-shaped cell membrane molecule of the present invention stimulates mouse bone marrow-derived immature rod-like cells (DC) induced by culturing mouse bone marrow cells in the presence of GM-CSF with lipopolysaccharide, After obtaining mature DC based on the possibility, the cell membrane is prepared, and the soluble protein is subjected to membrane protein using techniques such as concanaparin A sepharose chromatography, wheat germ agglutinin sepharose chromatography, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Were identified by microanalysis using LC / MS (particularly QTRAP manufactured by Applied Biosystems) (see Examples 1 to 5 below).
  • DC mouse bone marrow-derived immature rod-like cells
  • primers based on multiple partial amino acid sequences identified by the LC / MS method were synthesized, and a polymerase chain reaction (PCR) was performed using a mouse mature DC-derived cDNA library as a cage.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a clone containing the gene of the membrane molecule (A) of the present invention was selected by colony hybridization using this gene fragment as a probe, and its base sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence ( SEQ ID NO: 2) was determined (see Example 6 below).
  • BLAST is based on the base sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the molecule (A) identified in the mouse.
  • Human monocyte-derived immature DC obtained by culturing in the presence of M-CSF and IL-4 or human monocyte-derived mature rod induced by stimulation with lipopolysaccharide
  • a cDNA library was prepared, and a clone containing the gene of the membrane molecule of the present invention was selected by the same colony hybridization as described above, and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) were selected. 4) was determined.
  • the membrane molecules (A) and (B) of the present invention were analyzed by Hydeguchi Passy plot analysis [J. Exp. Med., 157 ⁇ , pp. 105-132, 1982], signal sequence prediction analysis [Protein Eng. , 10 ⁇ , p. 1-6, 1997], all suggested that it is a type I membrane protein with a signal sequence.
  • This membrane molecule has a force of 209 amino acid residues. From the results of Hyde mouth path plot analysis (Fig. 1) and signal sequence prediction analysis, a signal sequence of 17 amino acid residues, an extracellular region of 140 amino acid residues, 21 amino acids It is thought to be composed of a transmembrane region of residues and an intracellular region of 31 amino acid residues. Furthermore, from the results of homology search and motif search, it is predicted to have one Ig domain (IgV set) from the position of cysteine (Cys) residue necessary for disulfide bond formation, and potential isparagine-linked glycosylation There are two sites (asparagine residues at positions 84 and 97). In addition, since a lysine (Lys) residue exists in the transmembrane region, it is expected to associate with some adapter molecule by ionic bond.
  • Ig domain IgV set
  • This membrane molecule has a force of 201 amino acid residues.
  • a signal sequence of 17 amino acid residues, an extracellular region of 134 amino acid residues, 21 amino acids It is thought to be composed of a transmembrane region of residues and an intracellular region of 29 amino acid residues.
  • IgV set Ig domain from the position of cysteine (Cys) residue necessary for disulfide bond formation, and potential isparagine-linked glycosylation The site does not exist in the extracellular domain.
  • the membrane molecules (A) and (B) are considered to have an ortholog relationship, and as a result of analysis by CLUSTAL-W, the entire extracellular region has 55% homology with amino acid match. (Fig. 2).
  • the membrane molecule group of the present invention uses gene cloning and DNA recombination techniques. Enables mass synthesis. As a general technique for this purpose, for example, Sambrook et al., Molecular loning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Old bpnng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Standard techniques such as those described in Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989) can be used.
  • human mature DC force is extracted from mRNA to prepare a cDNA library.
  • the target cDNA can be obtained by screening the library using a specific probe synthesized based on the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • sense and antisense primers for amplifying a sequence containing the mature sequence of the target molecule are synthesized based on the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3, and the cDNA library is used as a saddle for PCR.
  • the target cDNA can be amplified. PCR is preferably performed using an automated thermal cycler, which can be performed by denaturing DNA (eg, 94 ° C) in the presence of thermostable polymerases (eg, Taq), saddle DNA and primers.
  • primer annealing eg 55 ° C, 30 seconds to 1 minute
  • extension reaction in the presence of four substrates (dNT P) (eg 72 ° C, 30 seconds to 10 minutes) ) Is carried out for about 25 to 40 cycles as one cycle and further heated at 70 to 75 ° C for 5 to 15 minutes.
  • the size of the primer is usually at least 15 nucleotides.
  • the DNA encoding the membrane molecules (A) and (B) of the present invention can be cloned.
  • Specific examples of the DNA encoding the membrane molecules (A) and (B) of the present invention include DNA having a base sequence ability described in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the present invention further includes one or more amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • An amino acid sequence comprising a group deletion, substitution, insertion and / or addition and capable of controlling an immune response, and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 and 80% or more, preferably 90% or more, and more
  • a protein hereinafter also referred to as a mutant protein
  • the “one or more” amino acid residues referred to in the present specification are preferably 1 to 20, more preferably 1 to: LO, still more preferably 1 to 8, and particularly preferably 1. Means ⁇ 5, most preferably 1-3 amino acid residues.
  • homology means sequence identity or similarity between two or more amino acid sequences or base sequences. Comparison can be made by a conventional method including a distribution method.
  • the term "can control an immune response” refers to the same or substantially the same T cell activity ability as the native membrane molecules (A) and (B) of the present invention. Or may have the ability to suppress or inhibit the activity of T cells.
  • DNA encoding the mutant protein as described above is also within the scope of the present invention.
  • Such DNA includes, for example, an amino acid sequence that includes one or more base deletions, substitutions, insertions and / or additions in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3, and can control the immune response.
  • a nucleotide sequence that is hybridized under stringent conditions with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 or its complementary sequence, and a nucleotide sequence that can control an immune response An example is DNA consisting of sequences.
  • the "one or more" bases referred to in the present specification are preferably 1 to 20, more preferably 1 to: LO, further preferably 1 to 8, and particularly preferably 1 to 5. Means, most preferably 1 to 3 bases.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, hybridization performed at 0.5M NaHPO, 7% SDS, ImM EDTA, 65 ° C,
  • Examples include nucleotide sequences that are detected after washing with O.l X SSC / 0.1% SDS at 68 ° C.
  • the mutant protein of the present invention may have all or part of the function of a natural membrane molecule.
  • antibodies are produced against certain exogenous antigens that have invaded, in which antigen-presenting cells, T cells, and B cells are involved.
  • Antigen-presenting cells take the antigen into the cell and reduce it to read the nature of the antigen.
  • the antigen is a component other than self In other words, a signal is transmitted to a T cell for antibody production and the T cell is activated.
  • the mutants of the present invention can be used to activate ⁇ cells during antibody production.
  • a gene encoding the mutant is incorporated into an appropriate expression vector (for example, an adenovirus vector) and then introduced into the genome of the target DC by homologous recombination. Then, it is conceivable that the gene is expressed to obtain DC having the membrane molecule mutant in the DC membrane.
  • an appropriate expression vector for example, an adenovirus vector
  • the mutant can be used to inhibit or suppress the activity of T cells.
  • the mutant should be able to antagonize membrane molecules on natural DC membranes, such as those having defects in domains essential for T cell activity. Can be mentioned.
  • Any mutant is within the scope of the present invention as long as it has high homology (over 80%) with a native membrane molecule and has the ability to control the activity of T cells. .
  • Such mutants can be produced, for example, by introducing desired modifications (deletions, substitutions, insertions and / or additions) into natural membrane molecules using site-directed mutagenesis, PCR, etc. (See my Molecular Cloning and urrent Protocols in Molecular Biology).
  • Such modifications include, for example, conservative amino acid substitutions, such as between acidic amino acids (aspartic acid and gnoretamic acid), between basic amino acids (lysine and anoleginine), and hydrophobic 'amino acids (leucine, isoleucine, non- ⁇ And the like).
  • the mutant of the present invention is also obtained from a natural source
  • a probe is prepared based on the nucleotide sequence, and after a medium or high degree of stringent conditions, a high level is obtained.
  • a gene encoding the desired mutant is taken out, incorporated into an appropriate vector, and expressed, whereby the desired mutant can be obtained.
  • high stringency conditions include 0.5M NaHPO, 7% SDS, ImM EDTA,
  • the noise hybridization condition can be determined by appropriately selecting the temperature and the ionic strength, but generally the higher the temperature and the lower the ionic strength, the higher the stringency. Accordingly, those skilled in the art can select suitable conditions for the hybridization.
  • the nucleotide sequence and 80 Also encompassed are DNAs encoding the above variants having a homology of at least%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, most preferably 98%.
  • the DNA of the present invention can be used by inserting it into an appropriate vector.
  • the type of the vector used in the present invention is not particularly limited.
  • the vector may be a self-replicating vector (for example, a plasmid), or may be incorporated into the genome of the host cell when introduced into the host cell. It can be replicated along with the chromosomes.
  • the vector used in the present invention is an expression vector.
  • the gene of the present invention is operably linked to an appropriate transcription / translation regulatory sequence (for example, a promoter).
  • a promoter is a DNA sequence exhibiting transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • Transcriptional / translational regulatory sequences can include promoters and enhancers selected for the host / vector system used.
  • a promoter for example, P, P, Ptrp, Plac, etc. in bacterial systems, for example, PH05, GAP, ADH, AOX1 promoters in yeast systems
  • animal cells include SV40 early promoter, retrovirus promoter, heat shock promoter and the like. Promoters that can operate in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographer 'California force, polyhedosis basic protein promoter, Bakiurovirus immediate early gene 1 promoter, or Bakiurovirus 39K delay Type early gene promoter.
  • the DNA of the present invention may be operably linked to an appropriate terminator as necessary.
  • the recombinant vector of the present invention may further have elements such as a polyadhesion signal (for example, derived from SV40 or adenovirus 5Elb region), a transcription enhancer sequence (for example, SV40 enhancer), and so on! /.
  • the recombinant vector of the present invention may further comprise a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell.
  • a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell.
  • the SV40 origin of replication when the host cell is a mammalian cell.
  • the recombinant vector of the present invention may further contain a selection marker.
  • Selection marker For example, dihydrofolate reductase (DHFR) or Schizosaccharomyces pombe TPI gene and its complement such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, Mention may be made of drug resistance genes such as neomycin or hygromycin. Methods of ligating the gene, promoter, and optionally terminator and Z or secretory signal sequence of the present invention and inserting them into an appropriate vector are well known to those skilled in the art.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • Schizosaccharomyces pombe TPI gene and its complement such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol
  • drug resistance genes such as neomycin or hygromycin.
  • a transformant can be prepared by introducing the DNA or recombinant vector of the present invention into an appropriate host.
  • any cell can be used as long as it can express the protein of the present invention.
  • host cells prokaryotic cells, yeasts, animal cells, fungal cells, insect cells or plant cells can be used.
  • prokaryotic cells include, for example, the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, and the like. Transformation of these bacteria may be performed by using competent cells by a protoplast method or a known method.
  • yeast cells include cells of the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces or Pichia, such as Saccharomyces cer evislae or Saccharomyces kluyveri.
  • Examples of the method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electoporation method, a sphere blast method, and a lithium acetate method.
  • animal cells include human fetal kidney cells, human leukemia cells, African green monkey kidney cells, Chinese hamster ovary cells (CHO), and the like. Methods for transforming mammalian cells and expressing the DNA sequences introduced into the cells are also known, and for example, the erect mouth pole method, the calcium phosphate method, the lipofuxion method, and the like can be used.
  • filamentous fungi such as Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Ma Or a cell belonging to Trichoderma.
  • transformation can be performed by obtaining a recombinant host cell by integrating the DNA construct into the host chromosome. Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed according to known methods, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-introduced into the insect cell to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further used. It can infect insect cells and express proteins (eg, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual; and Current 'Frotocols' in' Molecular ⁇ ⁇ Biology, Bio / Technology, 6, 47 ( 1988) etc.)
  • the baculovirus can be, for example, an autographa californica nuclear polyhedrosis virus or the like, which is a virus that infects Drosophila insects, such as Autographa californica nuclear polyhedrosis virus .
  • Insect cells include Spodoptera frugiperda ovarian cells Sf9, Sf21 [Baculovirus. Expression. Vectors, Laboratories ⁇ . w. H. F reeman and Company) , New York (New York), (1992) ],! use the ovarian cell of Trichoplusia ni HiFive (manufactured by Invitrogen), and the like /, can Rukoto.
  • Examples of a method for co-introducing a recombinant gene introduction vector into insect cells and the above baculovirus for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method and a lipofusion method.
  • the transformed or transformed host cell is cultured in an appropriate culture medium to express the target gene, and the produced membrane molecule of the present invention is recovered from the medium or the host cell force.
  • the cells are separated by centrifugation or the like, suspended in an aqueous buffer, and disrupted by sonication, French press, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • Isolation and purification of membrane molecules can be performed by general methods used for protein purification, such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, HPLC, electrophoresis, etc. , Desalting method, organic solvent precipitation method and the like can be arbitrarily combined.
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically immunologically binds to the protein of the present invention described in (1) above or a fragment thereof.
  • the term "specifically immunologically binds" with respect to the antibody of the present invention means that the antibody of the present invention immunologically cross-reacts with an epitope possessed only by the membrane molecule, and TREM Does not cross-react with other proteins such as family.
  • epitopes are obtained by, for example, aligning the amino acid sequence of the membrane molecule of the present invention with the amino acid sequence of another protein, so that an essentially different sequence portion (sequential at least 5 amino acids, preferably at least 8 amino acids). And more preferably at least 15 amino acids).
  • the antigen epitope for obtaining the target antibody is a region having a high antigenicity in the amino acid sequence of the membrane molecule group.
  • the region having high antigenicity can be estimated by the method of Parker et al. [Biochemistry, 25 ⁇ , 5425-5432 (1986)].
  • the superficial region can be estimated, for example, by calculating and plotting a noropathic index.
  • Regions that may not have secondary structure can be estimated by, for example, the method of Chou and Fasman [Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 ⁇ 45-148 (1978)]. . Further, the region that is not homologous or low in particular with other proteins to which each membrane molecule belongs can be estimated by comparing the homology between the amino acid sequence of each membrane molecule and the amino acid sequence of the other protein.
  • a peptide synthesis method is used. By utilizing this, a peptide having the amino acid sequence ability can be synthesized.
  • the peptide of interest is synthesized, for example, using a commercially available peptide synthesizer based on solid phase peptide synthesis developed by RB Merrifield [Science, 232 ⁇ , 341-347 (1986)] After removal of the protecting group, purification is carried out by ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, reverse-phase chromatography, etc. alone or in combination. The resulting purified peptide can be used as an immunogen by binding to keyhole limpet hemocyanin (KLH) or a carrier protein such as albumin.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against the present membrane molecule can be prepared by a known technique using the recombinant present membrane molecule as an immunogen.
  • the term “recombinant” as used with respect to the present membrane molecule, monoclonal antibody, polyclonal antibody, or other protein means that these proteins are produced by recombinant DNA in the host cell.
  • any of prokaryotes for example, bacteria such as enterococci
  • eukaryotes for example, yeast, CHO cells, insect cells, etc.
  • the "antibody” of the present invention may be a peptide antibody, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody! /, Or a deviation.
  • Antibodies are used to produce antibodies that will specifically bind to the protein used to immunize mice or other suitable host animals or to elicit lymphocytes that will be produced subcutaneously. Or by immunization with antigen or antigen-expressing cells by intraperitoneal or intramuscular route.
  • a desired human antibody may be obtained by administering an antigen or an antigen-expressing cell to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • lymphocytes may be immunized in vitro.
  • a polyclonal antibody can be obtained by collecting and purifying fractions that bind to the antigen from serum obtained from the host animal.
  • Monoclonal nano f cells can also be prepared by fusing lymphocytes with myeloma cells using a suitable fusion reagent such as polyethylene glycol to form hyperpridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals a nd Practice ⁇ 59-103, Academic press ⁇ 1986).
  • the monoclonal of the present invention Antibodies can be produced using the Hypridoma method [Nature, 256 ⁇ , 495 (1975)] or using the recombinant DNA method (Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567).
  • the antigen protein can be prepared by expressing DNA encoding all or a partial sequence of the protein of the membrane molecule in E. coli, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the recombinant membrane molecule is purified by a method such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, Genore filtration chromatography, reverse phase chromatography, etc., alone or in combination, and this purified sample is used as an immunogen. Use.
  • the antibody of the present invention may be an intact antibody, and is, such as (Fab ') or Fab.
  • a chimeric antibody in which the constant region is replaced with a human constant region eg, mouse-human chimeric antibody; Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 p. 6851 ( 1984)
  • human variable antibody Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci
  • all the variable regions except the constant region and the hypervariable region (or CDR) were replaced with human sequences. USA 89, 4285, 1992 and Carter et al., BioTechnolgy, 10 163, 1992
  • an antibody against the antibody of the present invention that is, an anti-idiotype antibody is also included in the present invention.
  • Various antibodies against the present membrane molecule thus obtained can be used in various applications that can make use of the characteristics. Labeling this antibody with a fluorescent substance (rhodamine, fluoresamine, etc.) using the fact that this membrane molecule is a molecule that is specifically expressed in mature DC, and detecting the target DC using the well-known FACS 'Separate or check the in vitro distribution of mo-DC. Furthermore, since this membrane molecule is a protein whose expression level increases markedly with the maturation of DC, immature DC and mature DC can also be separated by FACS using this antibody. The detection of this membrane molecule is not limited to detection with FACS! /.
  • the antibody can be detected as a primary antibody by Western blotting, and the expression can be confirmed at the protein level.
  • this antibody can be bound to a solid phase (polystyrene beads, microtiter well surfaces, latex beads, etc.) in a heterogeneous system or in a homogeneous system with an immunological reaction. It is possible to detect and quantify homologous membrane molecules (using fluorescent antibody method, ELISA, radioimmunoassay, etc.).
  • the immunological reaction may be a competitive reaction, V, or a noncompetitive reaction! /.
  • a sandwich method using two or more antibodies can also be used.
  • any immunological technique known in the art can be used.
  • Mature DC is a potent A PC that can stimulate CD4 positive T cells via MHC class II molecules and CD8 positive cytotoxic T cells via MHC class I molecules.
  • MHC class II molecules CD4 positive T cells
  • CD8 positive cytotoxic T cells via MHC class I molecules.
  • allogeneic MLR Mated Lymphocyte Reaction
  • CTL CTL is induced specifically for antigen. It can also be used for in vitro assays such as confirmation of the ability to suppress the function and confirmation of the molecular ability involved in DC antigen presentation.
  • the antibodies of the present invention can also be used to control immune responses in vivo.
  • this membrane molecule group is expected to be a molecule involved in costimulation, and is expected to be a membrane molecule involved in T cell activity. Therefore, if the antibody of the present invention is an antibody that inhibits the binding between the membrane molecule group and a ligand on T cells, it is expected to suppress T cell activity.
  • the immune response by controlling the function of DC and further the function of T cells can be controlled by the action of the antibody capable of controlling the function of this membrane molecule group.
  • the membrane molecule and soluble ligand molecules of this membrane molecule are expected to have an activity to control the immune response. .
  • a ligand of the present membrane molecule using the antibodies of the present invention or a soluble type molecule of the present membrane molecule.
  • the soluble membrane-type membrane molecule ligand acts directly on the membrane molecule and can control the signal through the membrane molecule on DC.
  • Low molecular weight substances that can modulate the interaction between the membrane molecule ligand and the membrane molecule, and low molecular weight substances that modulate the ligand of the membrane molecule and the intracellular signal pathways associated with the membrane molecule are also useful for signal control. It is.
  • the antibodies of the present invention or soluble molecules of the present membrane molecule, soluble molecules of the ligand of the present membrane molecule, or the above small molecules are used for treatment, for example, cancer, autoimmune disease It can be applied to the treatment of diseases such as organ transplantation, infections and allergies.
  • the administration method and dosage form are not particularly limited, and include intravenous, intraarterial administration, intramuscular administration, oral administration, suppository administration, etc., and is combined with a pharmaceutically acceptable excipient or diluent.
  • Power that can be formulated for oral or parenteral use is preferably parenteral administration. Dosing is done once a day or divided into several doses per day, and the dosage is determined according to the patient's severity, age, sex, weight, and other conditions and does not cause side effects.
  • bone marrow cell-derived immature DCs were prepared in large quantities by culturing bone marrow cells in the presence of GM-CSF to collect large amounts of mouse DCs. did. With and without LPS (lipopolysaccharide) stimulation, the same number of cells was applied to obtain the same number (5 ⁇ 10 8 cells) of immature DC and mature DC.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Proteins were detected by silver staining according to the method of Mann et al. [Anal. Chem., 68 ⁇ , 850-858 (1996)].
  • the enzyme digestion method was carried out by the in gel digestion method using trypsin [Anal. Chem., 224 ⁇ , pp. 451-455 (1995)], and the analysis sample used below was used.
  • Cell membrane proteins were solubilized from the cell membrane obtained in Example 1 using a surfactant. Thereafter, it was applied to Concananoline A Sepharose and washed with a surfactant-containing buffer. These passing fractions were called ConA FT.
  • ConA FT was eluted with a buffer containing methyl-alpha-D-darcoviranoside and a surfactant (C. nA EL).
  • ConA FT was reapplied to wheat germ darchun sepharose and washed with detergent-containing buffer. These passing fractions were called WGA FT.
  • the adsorbed fraction was eluted with a buffer containing N-acetyl darcosamine and a surfactant (WGA EL).
  • ConA EL, WGA EL, and WGA FT were used as molecular identification samples. After developing these fractions by SDS-PAGE, the protein was detected by the method of Example 2, and the gel cut into strips was subjected to in gel digestion to obtain an analysis sample.
  • Example 3 The sample obtained in Example 3 was analyzed using LC / MS (QTRAP manufactured by Applied Biosystems). Forced against a PepMap reversed phase column (0.075 mm ID x 150 mm length) (LC Packings) equilibrated with 95% solution A (0.1% formic acid) and 5% solution B (0.08% formic acid, 80% acetonitrile) Then, after washing for 5 minutes at a flow rate of 180 nanoliters / minute, the ratio of solution B was linearly increased to 50% over 67.5 minutes, and then eluted and introduced into the MS. Samples introduced into MS were acquired in the next repeated cycle, and their sequence information was obtained. 1.
  • LC / MS QTRAP manufactured by Applied Biosystems
  • Zoom MS Scan Observation of the valence of the parent ion identified by Full MS Scan.
  • MS / MS Scan Observation of daughter ions generated when He gas is applied to molecules measured by Zoom MS Scan. Scoring and ranking the number of strengths that match the theoretical b, y series and how many of them are identified by the identification method (SEQUEST algorithm) [American Society for Mass Mass Spectrometry , 5 ⁇ , 976-989 (1994)].
  • this membrane molecule which is a novel molecule, was identified.
  • DTMSTSNQLPWPTVDGSTDMV SSDLQK SEQ ID NO: 5
  • human orthologues were obtained in the same manner using a human monocyte-derived rod-shaped cDNA library as a cage.
  • the primers were 28 mer and 30 mer, respectively, and sense primer 5 and ATGTGCAGAAGGTGCAAGCCAGAGCTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 8) and antisense primer 5′-CTAAGTGGCCATGTCTTTAGTCAGAGG TTC-3 ′ (SEQ ID NO: 9) were used.
  • the predicted open reading frame structure is shown in SEQ ID NO: 3
  • the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the resulting gene corresponds to N W174892.
  • Hyde mouth pacity plot analysis was performed (Fig. 1). As a result, it became clear that this membrane molecule is a type I transmembrane protein with a signal sequence at the N-terminus.
  • the membrane molecules (A) and (B) also have (A) 209 and (B) 201 amino acid residues, respectively. From the results of Hyde mouth path plot analysis, the 17-residue signal sequence, (A) 140 residues, ( B) Expected to have an extracellular region of 134 residues, a transmembrane region of 21 residues, (A) 31 residues, (B) an intracellular region of 29 residues.
  • the extracellular region is (A) 2 places, (B) 0 places asparagine Conjugated glycosylation site, one immunoglobulin-like structure with cysteine residues necessary for the formation of two immunoglobulin (Ig) domains. It was also inferred that this extracellular Ig domain has a V set structure. Furthermore, although (A) and (B) do not have a motif capable of transmitting a signal to the intracellular region, both (A) and (B) have a lysine residue in the transmembrane region, so they associate with the adapter molecule. And was expected to transmit signals through this associated adapter molecule.
  • this membrane molecule is structurally homologous to TREM-1 because it has one IgV set outside the cell and has a lysine residue with a positive charge in the transmembrane region. Is expected.
  • the mouse membrane molecule has 26% amino acid identity to mouse TREM-1, and the human membrane molecule has 26% amino acid identity to human TREM-1, and the cysteine residues necessary for IgV set formation are conserved. RU
  • a recombinant was constructed in which the region considered to be the extracellular domain and the Fc region of human IgGl were combined.
  • the HcGl Fc region was substituted with three amino acids to prevent binding to Fc gamma receptors present on the surface of various cells. Specifically, amino acids up to amino acid 157 of SEQ ID NO: 1 in (A) were selected as the extracellular region.
  • the amino acid sequence of this solubilized recombinant is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid substitution sites in the Fc region correspond to positions 177 (Ala ⁇ Leu), 178 (Glu ⁇ Leu), and 344 (Asp ⁇ Val) shown in SEQ ID NO: 10.
  • This gene was transiently expressed in 293T cells under the control of the CMV promoter, and the resulting culture supernatant was subjected to affinity-take-matography using a rosin with protein A bound to the Fc region. The expression product was purified ( Figure 3).
  • a phycoerythrin-labeled F (ab ′)-conjugated anti-HgG Fc region antibody (manufactured by Beckman Coulter) is used as a secondary antibody.
  • the present invention it is possible not only to separate DCs with high purity, but also to separate mature DCs from immature DCs.
  • the cell can be supplied.
  • the isolated DC is expected to be used as a cancer vaccine by pulsing the antigen and then returning it to the patient again. It is also expected that the immune response can be controlled by inhibiting the interaction between DCs and T cells using antibodies against this membrane molecule or soluble molecules of this membrane molecule.
  • Fig. 1 shows the results of Hyde mouth pacity plot analysis of this membrane molecule using the Kyte and Doolittle method.
  • FIG. 2 shows the results of alignment analysis between mouse and human of this membrane molecule by CLUSTAL W.
  • FIG. 3 shows the expression and purification of the recombinant. Purification using Protein A Sepharose: Silver Stain: 5Z20 gradient gel: 1: Input 2: Flow-through 3: Eluate
  • FIG. 4 shows the search for endogenous ligands using recombinants.

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Abstract

　本発明の目的は、強力なAPCである成熟DC上に発現している本発明の分子を標的としてDCの機能制御による感染症防御、自己免疫疾患等を制御することである。本発明によれば、以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質が提供される。 （ａ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列において1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列；又は （ｃ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列：

Description

明 細 書
新規樹状細胞膜分子及びそれをコードする DNA
技術分野
[0001] 本発明は、マウス又はヒト榭状細胞（Dendritic Cell;以下 DCともいう）の膜分子、該 膜分子をコードする DNA、該膜分子に対する抗体、並びに該抗体を用いた成熟 DC 分離法および成熟 DC検出法に関する。
背景技術
[0002] 自己免疫疾患の発症には（1)遺伝的背景、（2)糸且織炎症反応のため遊離された本 来免疫系にさらされることのな力つた自己抗原の曝露や、ウィルス '細菌などの炎症 反応から派生する局所環境、すなわち活性化された T細胞の認識ペプチドの相同性 によるいわゆる交差反応性 T細胞の活性ィ匕などからくる局所環境の変化、さらには（3 )細胞膜上での副刺激分子（costimulatory molecule)の異常発現によるトレランスの 破綻が起こり誘導された自己反応性 T細胞の存在、など力 なる要素が関わっている と想定される。
[0003] 正常組織の刺激を受けて 、な 、抗原提示細胞は、自己抗原を提示して!/、たとして も副刺激分子の発現が制御されているため、 T細胞はァナジ一に陥っており活性ィ匕 されず自己寛容が維持されている。しかし、免疫異常状態においては過剰あるいは 継続する副刺激分子の発現異常により自己反応性 T細胞の活性ィヒが生じた結果、 自己免疫疾患が生じるのではないかという可能性が示唆されている。特に CD28/CD 152と CD80/CD86間で生じるシグナルは T細胞活性化のコントロールに重要かつュ ニークな働きをしており、このシグナルを調節することによる免疫治療がマウス実験モ デルにぉ 、て試行され、実際ヒトに対する治験も行なわれ始めて！/、る。
[0004] このような抗原ペプチドを認識する機構を基本とする所謂獲得免疫の機構が力なり 解明されているのに対して、外来の糖脂質や蛋白質、 DNA、 RNAを認識する機構を 基本とするいわゆる自然免疫は現在分子レベルで明らかにされつつある段階にある 。また自然免疫から獲得免疫を繋ぐ分子機構にっ 、ても不明な点が多!ヽ。
[0005] 現在の哺乳類における自然免疫に対する理解はハエや植物の発生学'遺伝学に ぉ ヽて解析された感染防御機構に始まる。すなわちショウジヨウバエの病原体認識分 子 Tollの哺乳類のホモログ TolHike Receptor (TLR)が発見され、自然免疫における 病原体認識を司ることが明らかとなった（Science、 284卷、 1313-1318頁（1999年））。 この事実は自然免疫がハエ力もヒトまで共通する病原体認識機構であるという概念が 成立することを意味する。獲得免疫が個体レベルで完結するシステムである（抗体や T細胞レセプターの特異性は個々に遺伝子を再構成することで獲得され、子孫に伝 達されない）のに対して、自然免疫はゲノムに共有している進化の記録である。つまり 獲得免疫の多様な特異性の中で、どの特異性に対して反応すればよいのかという方 向付けをするのが自然免疫であり、最も重要な分子の一群が TLRであると考えられる 。自然免疫における TLRの役割はアジュヴアントの認識およびシグナル伝達による副 刺激分子の発現やサイト力イン産生である。獲得免疫において対象となるタンパク質 自身は免疫原性が低 、のに対し、病原体由来糖脂質 (リポポリサッカライド (LPS)な ど）は免疫系を強く活性化する。例えば、抗体作製時に抗原のみでなくアジュヴアント が必要なのはよい例である。つまり獲得免疫発動の制御は TLRによる認識が入口に なって 、ると!/、つても過言ではな!/、。
[0006] 獲得免疫発動の決定，制御の主役は榭状細胞 (DC)であり、 Thl/Th2 skewingと細 胞傷害性 T細胞 (CTL)や活性化マクロファージの誘導 (細胞性免疫）、抗体産生 (体 液性免疫）に関わる。この誘導される免疫反応は病原体の種類によって異なる。細菌 感染の場合には細胞性免疫優位であるが、ある種の寄生虫やウィルスの場合には体 液性免疫優位の場合もある。またアジュヴアントの場合にも水酸ィ匕アルミニウム (Alum )のように抗体産生優位になったりする。これには TLRによる認識と DCによる獲得免 疫の質的ある 、は量的な変化が制御されて 、る可能性が考えられる。
[0007] TLRは細胞外に LRRと呼ばれる蛋白質相互作用に関係する leucine_rich repeatを 有する I型膜タンパク質で、細胞内には TIR domain (Toll/IL- 1R homology domain)と 呼ばれるシグナル伝達に関係するドメインを有する（Trends Cell Biol.、 11卷、 304-31 1頁（2001年））。これまでにヒトにおいては 10種類の TLR分子が報告されており（TLR1 -TLR10)、同時にリガンドの同定も進んでいる。例えば TLR2は細菌由来ペプチドダリ カン（PG)ゃリポ蛋白質を（J. Biol. Chem.、 274卷、 17406-17409頁（1999年）；及び J. Immunol.、 163卷、 2382-2386頁（1999年））、 TLR4はグラム陰性細菌の LPSやグラム 陽性細菌のリポティコ酸（LTA)を（Science, 282卷、 2085-2088頁（1998年）） TLR5は 細菌鞭毛構成タンパク質を（Nature、 410卷、 1099- 1103頁（2001年））、 TLR2/6はマ ィコプラズマ由来リポペプチドや酵母由来ザィモザンを（Int. Immunol, 13卷、 933-94 0頁（2001年））、 TLR7と TLR8は細菌由来一本鎖 RNAを（Science, 303卷、 1529- 31頁 (2004年） )、 TLR9は細菌由来 CpG DNAを（Nature、 408卷、 740-745頁（2000年） )、 それぞれ認識することが報告されて 、る。
[0008] TLRからのシグナル伝達につ!、てはマクロファージあるいは榭状細胞にぉ 、て TLR 2 (MALP- 2刺激など）、 TLR4 (LPS刺激など）、 TLR9 (CpG DNA刺激など）を中心に 解析されてきている。まず TIR domainと会合する分子として IL-1R familyにおけるシグ ナル伝達において必須のアダプター分子である MyD88が TLR4のシグナル伝達にお いても必須の分子であることが明ら力となり、 LPSにより誘導されるマクロファージから のサイト力イン産生、 B細胞ブラスト化、ショック症状の惹起等が全く欠如していた (Im munity、 11卷、 115- 122頁（1999年））。し力し、 MyD88欠損マウス由来マクロファージ にお!/、て LPS刺激に対して NF-kappaBの活性化が見られることから、 MyD88に依存し な 、NFkappaB経路の存在が示唆された。この経路に対する説明として MyD88欠損 マウスにおける DCの解析結果がひとつの答えである。すなわち CDllc陽性の DCに おける LPS刺激による IL-12産生は MyD88欠損マウスにおいては全く見られなくなる 力 CD40, CD80, CD86といった副刺激分子の発現上昇に関しては影響を受けない (J. Immunol, 166卷、 5688-5694頁（2001年））。 TLR4新規アダプター分子として報告 された TIRAP/MALは TLR4による DCの成熟化を阻害することから、 DCにおける畐师 IJ 激分子発現に必要な経路に関与する可能性が示唆される (Nat. Immunol.、 2卷、 835 -841頁（2001年）；及び Nature、 413卷、 78-83頁（2001年））。またこの報告とは別に M yD88欠損マウス由来マクロファージおよび DCにおいて IP-10や ISREといった IFN誘導 遺伝子群の発現に必要な IRF3が活性化することが明らかとなった (J. Immunol, 167 卷、 5887- 5894頁（2001年））。
[0009] 一方 TLR2および TLR9のシグナル伝達に関しては MyD88欠損マウスにおける解析 結果ではサイト力イン産生、 NF-kappaB活性化ともに MyD88は必須であった (J. Immu nol.、 164卷、 554-557頁（2000年））。これとは別に PI3K familyに属し、 SCIDマウスの 原因遺伝子としても知られて 、る DNA-PKcs欠損マウスが CpG DNAに不応答性であ るとの報告もある（Cell、 103卷、 909-918頁（2000年））。 TLR9下流に DNA-PKcsが存 在する、あるいは細胞の活性化には TLR9、 DNA-PKcsの両者が必要である可能性 が示唆される。シグナル伝達に関しては、 TLR欠損マウス及び MyD88欠損マウスを用 V、た解析が中心である。ヒトにつ 、ては MoDCにお!/、て TLR2および TLR4刺激により 異なるサイト力イン、ケモカインが誘導されるという報告もあり（J. Biol. Chem.、 276卷、 37692-37699頁（2001年））、ヒト DCにおける TLR発現特異性を考えると、ヒトでの解析 結果に興味が持たれる。
[0010] 上記のように TLRからのシグナルが自然免疫の発動に重要であることは言を待たな いが、 TLRの自然免疫シグナルとは別に自然免疫の発動を受けて獲得免疫発動に 必要な分子の存在があることが予想される。自然免疫反応を受けて獲得免疫反応を より高める分子として TREMdriggering Receptor Expressed by Myeloid Cells)- 1が知 られている（J. Immunol.、 164卷、 4991-4995頁（2000年））。 TREM-1は CD14強陽性 の単球及び好中球に発現する細胞外に 1つのィムノグロブリンドメインを有する I型細 胞膜蛋白質で、アダプター分子 DAP12と会合してシグナルを伝えることが知られてい る。細菌や真菌あるいはその構成成分により刺激を受けた CD14強陽性の単球及び 好中球において TREM-1の発現は増強される。好中球に抗 TREM-1ァゴ-スティック 抗体を作用させると大量の IL-8やミエ口ペルォキシダーゼが産生され、単球からは IL -lbetaや TNF-alphaあるいは MCP-1が産生されることが知られている。同時に ICAM- 1、 CDllb、 CD49e、 CD29といった接着分子や CD40、 CD86といった副刺激分子の発 現も増強される。また、これらの炎症性サイトカインゃケモカインの発現は LPS刺激と 協調性をもって増強され、敗血症ショックを引き起こす。敗血症ショックのモデルにお いては TREM-1が重要な機能を果たしていることが明らかにされている（Nature、 410 卷、 1103- 1107頁（2001年））。
[0011] 榭状細胞 (DC)は、生体内では骨髄に存在する CD34陽性細胞を前駆細胞として 分化 '成熟し、抗原提示細胞 (APC)として、免疫応答の誘導、維持、拡大、調節にお いて重要な役割を担っていることが知られている。プロフェッショナル APCである DC は、自然免疫反応による刺激を受けて活性化し、抗原特異的獲得免疫反応を惹起 するばかりでなぐ自ら様々なサイト力インを産生することによって感染時の自然免疫 反応においても重要な役割を果たす。 DCにおいては各 TLRの発現は、 MoDC、末梢 血中の myeloid DC (MDC)、 plasmacytoid DC (PDC)間で明らかに異なり、リガンドを 作用させた場合に産生されるサイトカインゃケモカインレセプターの発現も異なること が明ら力となっている（J. Exp. Med., 194卷、 863-869頁（2001年）；及び Eur. J. Immu nol.、 31卷、 3388- 3393頁（2001年））。また PDCにおいて CpG+CD40Lで大量の IL- 12 p70を産生するという報告もあり（Eur. J. Immunol.、 31卷、 3026-3037頁（2001年））、 実際の生体内において、どの DCサブセットがどのような自然免疫反応を受けて、 auto crine/paracrineに作用するサイト力インの影響でどのような phenotypeを有する DCへと 成熟化していくのか、興味力もたれるところである。
[0012] 1990年代に入って、 DCを前駆細胞力もサイト力インで分化'誘導できるようになり、 大量の DCを扱えるようになって分子 ·細胞 ·生体レベルにぉ 、て DCの免疫応答にお ける役割の重要性が明らかになってくると共に、免疫制御の標的として注目されるよう になった。
[0013] これまでの生物学的研究成果から、ヒト単球 (Monocyte ; Moともいう)を GM-CSF及び IL- 4存在下で培養することにより DC (Monocyte- derived DC ;MoDCともいう）を誘導 することが可能であることが明ら力となっている（J. Leucocyte Biol.、 59卷、 208-218頁 (1996年)）。この in vitro分ィ匕誘導系は人工的な部分があるものの、実際に DCとして の機能を有することが明らかとなってきた。 DCの重要な機能は、自然免疫反応を受 けるとともに抗原の細胞内への取り込み作用（食作用）及びその抗原の情報を T細胞 に伝えて T細胞を刺激活性ィ匕することである。また、 DCは分ィ匕の段階によって未成熟 DC (Immature DC)と成熟 DC (Mature DC)の二つに分別することができる。未成熟 D C内に取りこまれた抗原は細胞内でプロセシングを受け、抗原由来のペプチドとして DC表面の MHCクラス II分子上に提示される。 CD4陽性の抗原特異的ヘルパー T細 胞は、抗原受容体で抗原由来のペプチドと MHCクラス II分子の複合体を認識し、副 刺激分子からの刺激なども加わり、感作、活性化される。また、 DCにより MHCクラス I 分子を介して CD8陽性の細胞傷害性 T細胞 (CTL)も刺激、活性化される。食作用は 未成熟 MoDCで強ぐ成熟 MoDCでは弱くなる。 T細胞への抗原提示能は、それに関 与する CD40、 CD80、 CD86、 MHCクラス I分子、 MHCクラス II分子の発現の程度と一 致して、未成熟 MoDCでは弱ぐ成熟 MoDCになると強くなる。マウスに関しては骨髄 細胞を GM-CSF存在下培養することによりミエロイド系の榭状細胞を (J. Immunol.、 16 1卷、 3096- 3102頁（1998年））、 Fit- 3リガンド存在下培養することによりミエロイド系の 榭状細胞およびプラズマサイトイド榭状細胞を (J. Exp. Med., 195卷、 953-958頁（20 02年)）誘導することが可能であることが明らかとなっている。ミエロイド系の榭状細胞 に関しては、上記ヒト MoDCとほぼ相同の機能を有することが知られている。
[0014] この DCにおける抗原取込能から抗原提示能という機能変化は、前述の自然免疫の 反応を受けて獲得免疫を発動する部分を担って 、ると言っても過言ではな 、。この 機能変化に伴って細胞表面上に提示される膜分子の変化が起こることは想像に難く ないが、この成熟化（maturation)の過程でどのような事象が起こっているかを考えた 場合に、細胞膜表面上に新たに発現した分子の発現はすべて mRNAの発現から起 こるとは限らな 、と 、う事実が存在する。例えば未熟な (Immature)段階から発現が見 られる HLA-DRが成熟化に伴って mRNA及びタンパク質の発現量の変化をほとんど 伴わずに細胞内力 細胞膜表面上に移動 (translocation)するということが知られて いる。また、実際の mRNAの発現量とタンパク質の発現量を比較した場合にほとんど 相関がな 、場合や、 mRNAは発現して 、るのにタンパク質として翻訳されて ヽな ヽ場 合も存在する（Biochem. Biophys. Res. Commun.ゝ 231卷、 1-6頁（1997年））。これま で遺伝子側からは増幅可能なこと、大量に解析することが可能なこと、ハンドリングが 容易なこと、数々の手法が編み出せることなど力 精力的に解析がなされてきたが、 実際に発現しているタンパク質の変化を追うことができれば、そのような変化は細胞 内の事象をよりよく反映しており現実に近 、ものと!/、うことができると!、うのも事実であ る。
[0015] DCに関しては、上述の知見に加えて、 DCにいくつかのサブセットが存在することも 明らかになっているが、そのようなサブセットは成熟、未成熟で機能が異なることが知 られている。しかしサブセット間でのそのような機能の違いが何に起因するの力、その 答えは得られていない。少なくとも細胞内シグナリングに関与すると考えられる膜分 子、特に DCの成熟化に伴って発現する膜分子、の解明が待たれるところである。
[0016] 前述のように、生体内に存在する強力な APCである DCは活性ィ匕刺激に伴い成熟 化すると、 B7ファミリーに属する CD80/CD86を高発現することが知られている。 自己 免疫疾患との関わりについては、例えば慢性関節リウマチの関節液や乾癬の病巣部 組織内、アレルギー性接触性皮膚炎の皮膚組織に存在する DCは CD80/CD86が異 常発現になって ヽることが知られて!/ヽる。
[0017] CD28は、ナイーブ T細胞の活性ィ匕を強力に増強させる特徴を有する。この CD28に よるシグナルの存在により IL-2の産生及び IL-2レセプターの発現が増強され、増殖 反応が亢進し、結果的に T細胞の様々なエフェクター機能が増強されることになる。 C D28シグナルは IL- 2だけでなく IL- 4, IL- 5, IL- 13, IFN- gamma, TNF- alpha, GM-CSF など様々なサイト力イン産生も増強させる。また CD40リガンドのような T細胞活性ィ匕抗 原や IL-8, RANTESなどのケモカイン発現にも関与している。 CD80あるいは CD86の CD28への結合が CD4陽性 T細胞の Thlあるいは Th2への分ィ匕誘導に関与して 、るこ とを示す多くの報告がある。し力し、 CD80は Thl、 CD86は Th2といったような一面的な ものではなぐナイーブ CD4陽性 T細胞の分化方向の決定は、 CD28および CD152シ グナル以外にも抗原あるいは APCそのものから規定されてくる様々な因子によって影 響を受けると考えられる。し力しながら、 CD28シグナルが特にナイーブ T細胞の Th2 分化'活性ィ匕において他の分子の機能によって代償されない重要な役割を担ってい ることが、（1) CD28ノックアウトマウスにおける Th2サイト力イン依存性の免疫グロブリ ンである IgGl, IgG2bの選択的産生障害（Science, 261卷、 609-612頁（1993年））や（ 2) D011- 10TCRトランスジエニックマウス CD4陽性 T細胞と CD80/CD86ダブルノック アウトマウス由来 APCによる抗原刺激による Th2分ィ匕の選択的阻害 (J. Immunol.、 161 卷、 2762-2771頁（1998年））などの結果から裏付けられている。また、 CD28シグナル のもうひとつの重要な役割として、 be卜 xLのようなサバイバル因子の発現を増強させ、 抗原刺激を受けた後の T細胞のアポトーシスを抑制することが挙げられる。
[0018] CD28が恒常的に T細胞に発現しているにもかかわらず、糸且織細胞において CD80/ CD86の発現が制御されているために、たとえ自己抗原に反応する T細胞が存在して も過剰な免疫反応が起こらな 、ような仕糸且みになって 、る。このトレランス誘導システ ムが破綻した場合には、自己免疫疾患やアレルギー疾患等の様々な疾患が引き起 こされる可能性を秘めている。脾島 beta細胞に CD80あるいは CD86を強制発現させ ただけでは脾臓への炎症性リンパ球浸潤は認められるが、自己免疫性糖尿病である インスリン依存性糖尿病 (IDDM)の発症には至らず、主要組織適合抗原 (MHC)クラス I I分子、 TNF-alpha、あるいは自己抗原としてのウィルスタンパク質を CD80とともに発 現させてはじめて beta細胞の破綻を伴う IDDMを発症させることができる。このことは C D28-CD80/CD86シグナルに加え、 T細胞レセプター (TCR)シグナルの強化を促すよ うな環境下に置かれてはじめて自己免疫疾患が発症する可能性が示唆されている。
[0019] いくつかのヒト臓器特異的自己免疫疾患において CD80/CD86の発現がプロフェツ ショナル APCである DCにおける発現が報告されて!、る。このように正常組織の APCに お!、ては制御下にある CD80/CD86が、疾患局所にお!、ては異常発現して 、る例が 数多く見つかつてきており、自己免疫疾患との関連が示唆されている。
[0020] 現在、自己免疫疾患の治療は副作用の多い非特異的な免疫抑制剤が中心である 。副刺激 (costimulation)阻害では、抗原特異的な抑制及び投与終了後における持 続効果があり、投与期間短縮による副作用の軽減や感染症防御免疫反応の維持が 期待できる。免疫系細胞の相互作用や機能が明らかになっていくのにしたがってより 効果的な治療が行なわれることが期待される。活性化 T細胞に発現がみられる CD28 ファミリーの分子として ICOS (indudble T cell co- stimulator)や PD-1が見つかつてき ている。これらはそれぞれ B7ファミリーに属する B7-H2、 B7-H1がそのリガンドであるこ とが明ら力となり、複数の B7ファミリーと CD28ファミリーを介した APCによる T細胞 costi mulationの作用の差異の解明が待たれるところである。
[0021] また、感染症等に対する生体防御の観点から、自然免疫と獲得免疫を繋ぐ分子メ 力-ズムの解明が待たれるところである。すなわち、 LPSや CpGなどは IL-12の大量産 生や CD40ある!/、は CD80/CD86の発現増強を伴って、 DCの maturationを誘導するが 、これに関わる詳細な分子メカニズムは明らかにされて ヽな 、。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0022] 本発明者らは、 DCの機能発現に重要となる DCの成熟化に着目し、 DCの成熟によ つて発現量が上昇する膜分子の同定を中心とした探索研究を、プロテオミクス (Prote omics)による DCの成熟に伴い発現が調節される膜分子の網羅的同定を基に実施し てきた。プロテオミタスとは、タンパク質について、遺伝子のゲノミタス（Genomics)に対 応した言葉であり、タンパク質の大規模研究を行うものである。タンパク質の発現量、 翻訳後の修飾や相互作用などの性質を研究し、例えば正常細胞とがん細胞にぉ 、 て発現タンパク質レベルで何が起こって 、る力、細胞内ネットワークやプロセスなどの 全体的な生物学的情報を得るものである。 DCに特異的に存在する膜分子が同定さ れるならば、該膜分子に対する抗体の作製や、医療分野での該抗体の利用が可能と なるだろう。
[0023] 本発明の目的は、強力な APCである成熟 DC上に発現している本分子を標的として DCの機能制御による感染症防御、自己免疫疾患等の制御である。また、該分子は 成熟 DCなどの APCに発現し、 T細胞活性ィ匕に関わる分子と予想されることから、該分 子を特異的に認識する抗体を使用して成熟 DC等の APCを分離する方法、および検 出する方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0024] 本発明者らは、 DCの成熟化により発現が調節される膜分子を探索研究した結果、 未成熟 DCと成熟 DCとの間で、発現がみられる新規膜分子を同定し、この分子が DC の成熟化に伴 、、そのタンパク質レベルでの発現が顕著に上昇することを今回見出 した。この膜分子は従来知られているマクロファージゃ好中球で発現の見られる TRE M-1にホモロジ一を有して!/、ることが明らかとなつた。また本膜分子は TREMファミリ一 に特徴的な 1つのィムノグロブリン（Ig)ドメインを有することが推定されており、立体構 造の保持に必須の S-S結合に関わる Cys残基の位置が保存されて 、た。 これらの事 実力ゝら本膜分子群は自然免疫と獲得免疫を繋ぐ主役たる DCにおいて発現の見られ る TREMファミリーに属する新規膜分子と考えられる。
[0025] 最近の研究成果から（1) DCは不均一な細胞集団でありいくつかのサブセットが存 在すること [Stem Cells, 15卷、 409- 419頁（1997年）]、 (2) DCサブセットは T細胞活 性ィ匕において異なる機能 (アポトーシス誘導、 T細胞の Thl, Th2への分ィ匕誘導など） を持つこと [Science、 283卷、 1183-1186頁（1999年）]、（3) DCを介して免疫応答を制 御することが可能であること (DC療法、 DC特異的な薬剤、抗体、サイト力インなど）、 が明らかになつてきた。
[0026] ヒト DCサブセットとしては大別して、ミエロイド系 DCとリンパ球系 DCとがある。ミエ口 イド系 DCには 2つの分化経路が存在することが示されており [J. Exp. Med., 184卷、 6 95-706頁（1996年） ]、 CD34陽性の造血幹細胞を GM- CSFと TNF-alphaで培養する 系では CD14陽性 CDla陰性および CD14陰性 CDla陽性の前駆細胞が出現し、前者 からは真皮（dermal) DC、後者からは表皮ランゲルノヽンス細胞に分ィ匕することが知ら れている。本発明者らが用いた MoDCは生体内では前者由来の DCと類似しており、 ミエロイド系 DCに属すると考えられている。一方、ヒトリンパ球系 DCは、形質細胞様の CD4陽性 T細胞が IL-3存在下で未熟な DC (CDllc陰性、 CD14陰性)へと分ィ匕し、 IL -3と CD40リガンドの刺激により DCとして機能的に成熟することが知られている [J. Exp . Med., 185卷、 1101- 1111頁（1997年）]。また、 MoDCは CD40リガンドあるいはエンド トキシンによる刺激により大量の IL-12を産生し、ナイーブ T細胞を Thlに分化'誘導 する機能を有する DCに分化するという報告がある [Science、 283卷、 1183-1186頁（19 99年）]。このように本発明者らが用いた MoDCは少なくともナイーブ T細胞を Thlタイ プに分ィ匕し得る一群であることがわかる。また、末梢血には少なくとも 2つの DCサブ セットが存在しており、系統マーカー（CD3、 CD19、 CD56、 CD14)陰性、 HLA-DR陽 性、 CDllc陽性と系統マーカー（CD3、 CD19、 CD56、 CD14)陰性、 HLA- DR陽性、 C Dllc陰性、 CD123強陽性の表現型を示す。それら DCは成熟後、前者は大量の IL-1 2を産生する MDC、ナイーブ T細胞を Thlに、後者は大量の type I IFNを産生する PD し/ NIPC (natural type I interferon producing cell)であること力 S知りれて ヽる [science 、 284卷、 1835-1837頁（1999年）]。
[0027] このように、本膜分子は MoDCの成熟化に伴 、発現が顕著に上昇して 、ることなど の知見から、免疫応答を制御するための標的分子としても期待される。
[0028] 一方、抗原をパルスした自己の末梢血 DCを用いた癌ワクチンのパイロットスタディも 行なわれており [Nature Med., 2卷、 52-58頁（1996年）]、本膜分子の成熟 DCでの発 現の特異性を利用して、特異的抗体を用いてパルス後の DCの成熟化を確認するこ とができる。また、その際の成熟 DCと未成熟 DCとの分離、成熟 DCの検出などにも 有用である。
[0029] 本発明は上記の知見に基いて完成したものである。即ち、本発明によれば、以下の 何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質が提供される。
(a)配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列；
(b)配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1個もしくは複数個のアミノ酸残 基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御し得るァミノ 酸配列；又は
(c)配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつ免疫 応答を制御し得るアミノ酸配列：
[0030] 本発明の別の側面によれば、本発明の蛋白質をコードする DNAが提供される。
[0031] 本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列力 なる DNAが提 供される。
(a)配列番号 1又は 3に記載の塩基配列；
(b)配列番号 1又は 3に記載の塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基の欠失、 置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列をコ ードする塩基配列；又は
(c)配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジ ンな条件下 でノ、イブリダィズする塩基配列であって、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列を コードする塩基配列：
[0032] 本発明のさらに別の側面によれば、本発明の DNAを含む組み換えベクターが提 供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の DNA又は組み換えベクターを有する 形質転換体が提供される。
[0033] 本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛋白質又はその断片に特異的に免 疫結合する抗体が提供される。
好ましくは、本発明の抗体は、免疫学的に榭状細胞を認識する。
好ましくは、本発明の抗体は、本発明の蛋白質の細胞外領域を認識する。
[0034] 好ましくは、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。 [0035] 本発明のさらに別の側面によれば、本発明の抗体を用いてヒトまたは他の動物由 来の免疫担当細胞を分離する方法が提供される。
好ましくは、榭状細胞が分離される。
[0036] 本発明のさらに別の側面によれば、本発明の抗体を用いて免疫担当細胞を検出す る方法が提供される。
好ましくは、榭状細胞を検出する。
発明を実施するための最良の形態
[0037] 以下に本発明をさらに詳細に説明する。
Π )本 明の新親.蹲分早及びそれ コードする DNA
上述したように、本発明は、本膜分子が DCにおいて成熟化に伴って発現が上昇す ると 、う知見に基づ!/、て 、る。
[0038] 本発明のヒトおよびマウス榭状細胞膜分子は、マウス骨髄細胞を GM-CSF存在下 培養することにより誘導したマウス骨髄由来未成熟榭状細胞 (DC)をリポポリサッカラ イドで刺激し、その可否に基いて成熟 DCを得たのち、細胞膜を調製し、その可溶性 タンパク質についてコンカナパリン Aセファロースクロマトグラフィー、小麦胚ァグルチ ニンセファロースクロマトグラフィー、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの手法 を用いて膜タンパク質を分画し、 LC/MS (特に Applied Biosystems社製 QTRAP)による 微量分析にかけて同定された (後述の実施例 1〜5参照)。さらに LC/MS法で同定さ れた複数の部分アミノ酸配列に基づくプライマーを合成し、マウス成熟 DC由来 cDNA ライブラリーを铸型にしてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行 ヽ本発明の膜分子の遺伝 子断片を増幅し取得し、この遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダィゼー シヨンにより本発明の膜分子 (A)の遺伝子を含むクローンを選抜し、その塩基配列（ 配列番号 1)およびアミノ酸配列 (配列番号 2)を決定した (後述の実施例 6参照)。
[0039] またヒトのオルソログと考えられる分子（B)につ 、ては、マウスで同定された分子 (A) の塩基配列（配列番号 1)およびアミノ酸配列（配列番号 2)をもとに BLAST法による データベース検索を実施することにより、候補となるオルソログを同定し、ヒト単球を G
M-CSFおよび IL-4存在下培養することにより得られるヒト単球由来未成熟 DCあるい はこれをリポポリサッカライドにより刺激することにより誘導したヒト単球由来成熟榭状 細胞力も cDNAライブラリーを作製し、上記に記したと同じコロニーハイブリダィゼーシ ヨンにより本発明の膜分子の遺伝子を含むクローンを選抜し、塩基配列 (配列番号 3) およびアミノ酸配列（配列番号 4)を決定した。
[0040] 本発明の膜分子（A)および（B)は、ハイド口パシープロット解析 [J. Exp. Med., 157 卷、 105-132頁、 1982年]、シグナル配列予測解析 [Protein Eng., 10卷、 1-6頁、 1997 年]の結果、いずれもシグナル配列を有する I型膜蛋白質であることが示唆された。
[0041] 膜分子 (A)
本膜分子は 209アミノ酸残基力 なり、ハイド口パシープロット解析（図 1)及びシグナ ル配列予測解析の結果から、 17アミノ酸残基のシグナル配列、 140アミノ酸残基の細 胞外領域、 21アミノ酸残基の膜貫通領域、 31アミノ酸残基の細胞内領域から構成さ れていると考えられる。さらにホモロジ一検索並びにモチーフ検索の結果から、ジス ルフイド結合形成に必要なシスティン (Cys)残基の位置から 1つの Igドメイン (IgV set) を有すると予想され、潜在的なァスパラギン結合型糖鎖付加部位が 2ケ所存在する（ 84位および 97位のァスパラギン残基)。また細胞膜貫通領域にはリジン (Lys)残基が 存在することからイオン結合により何らかのアダプター分子と会合していることが予想 される。
[0042] 蹬分子 (B)
本膜分子は 201アミノ酸残基力もなり、ハイド口パシープロット解析（図 1)及びシグナ ル配列予測解析の結果から、 17アミノ酸残基のシグナル配列、 134アミノ酸残基の細 胞外領域、 21アミノ酸残基の膜貫通領域、 29アミノ酸残基の細胞内領域から構成さ れていると考えられる。さらにホモロジ一検索並びにモチーフ検索の結果から、ジス ルフイド結合形成に必要なシスティン (Cys)残基の位置から 1つの Igドメイン (IgV set) を有すると予想され、潜在的なァスパラギン結合型糖鎖付加部位は細胞外ドメインに は存在しない。
[0043] 本膜分子 (A)および (B)は、オルソログの関係にあると考えられ、 CLUSTAL-Wによ る解析の結果、細胞外領域全体にわたってはアミノ酸一致で 55%のホモロジ一を有す ることが明らかとなった（図 2)。
[0044] 本発明の膜分子群は、遺伝子クローユングおよび DNA組換え技術を利用すること によって、大量合成が可能である。そのための一般的な技術として、例えば Sambrook ら, Molecularし loning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., し old bpnng Harbor Laborato ry Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)や Ausubelら, Current Protocols in Molecu lar Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載 されるような標準技術を使用できる。
[0045] 上記標準技術によりヒト成熟 DC力も mRNAを取り出し cDNAライブラリーを作製する。
配列番号 1又は 3に記載された配列に基き合成した特異的プローブを用いて該ライ ブラリーをスクリーニングし目的の cDNAを得ることができる。あるいは、配列番号 1又 は 3に記載された配列に基づいて目的分子の成熟配列を含む配列を増幅するため のセンスおよびアンチセンスプライマーを合成し、該 cDNAライブラリーを铸型にして P CRを行い、 目的の cDNAを増幅することができる。 PCRは自動サーマルサイクラ一 (au tomated thermal cycler)を用いて実施するのがよぐその反応は、耐熱性ポリメラーゼ (Taqなど）、铸型 DNAおよびプライマーの存在下、 DNAの変性（例えば 94°C, 15〜30 秒）、プライマーのアニーリング（例えば 55°C,30秒〜 1分）、および 4種類の基質（dNT P)の共存下での伸長反応（例えば 72°C,30秒〜 10分）を 1サイクルとして約 25〜40サ イタル実施し、さらに 70〜75°Cで 5〜15分加熱することによって行うことができる。プラ イマ一のサイズは通常少なくとも 15ヌクレオチドである。
[0046] 上記した手法により、本発明の膜分子 (A)および (B)をコードする DNAをクロー- ングすることができる。本発明の膜分子 (A)および (B)をコードする DNAの具体例と しては、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列力 なる DNAが挙げられる。
[0047] 変異体
上記した配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するマウス又はヒト榭状細胞 膜分子に加えて、本発明はさらに、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1個もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、か つ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列、並びに配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配 列と 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98% 以上の相同性を有し、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列から成る蛋白質 (以下 、変異体蛋白質とも称する)を提供する。 [0048] 本明細書で言う「1個もしくは複数個」のアミノ酸残基とは、好ましくは 1〜20個、より 好ましくは 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜8個、特に好ましくは 1〜5個、最も好ましく は 1〜3個のアミノ酸残基を意味する。
[0049] 本明細書中で使用する「相同性」という用語は、 2つ以上のアミノ酸配列または塩基 配列間での配列の同一性または類似性を意味し、配列は例えば対角線図形法ゃ頻 度分布法などを含む慣用的方法で比較しうる。
[0050] 本明細書中で使用する「免疫応答を制御し得る」という用語は、本発明の天然型膜 分子 (A)および (B)と同じ力または実質的に同じ T細胞活性ィ匕能を有して 、てもよ ヽ し、あるいは、 T細胞の活性ィ匕を抑制もしくは阻害する能力を有していてもよいことを 意味する。
[0051] 上記したような変異体蛋白質をコードする DNAも本発明の範囲内である。このよう な DNAとしては、例えば、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列において 1個もしくは 複数個の塩基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御 し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は配列番号 1又は 3に記載の塩基配列 又はその相補配列とストリンジェンな条件下でノヽイブリダィズする塩基配列であって、 かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる DNAが挙げ られる。
[0052] 本明細書で言う「1個もしくは複数個」の塩基とは、好ましくは 1〜20個、より好ましく は 1〜： LO個、さらに好ましくは 1〜8個、特に好ましくは 1〜5個、最も好ましくは 1〜3 個の塩基を意味する。
[0053] 本明細書で言う「ストリンジェンな条件下でハイブリダィズする塩基配列」とは、例え ば、 0.5M NaHPO , 7% SDS, ImM EDTA, 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行い、その
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後に O.l X SSC/0.1% SDS, 68°Cで洗浄を行った場合に検出される塩基配列などが挙 げられる。
[0054] 本発明の変異体蛋白質は天然型膜分子の機能の全部または一部を有することが できる。生体内では侵入したある種の外因性抗原に対し抗体の産生が起こるが、この とき抗原提示細胞と T細胞、 B細胞が関与する。抗原提示細胞は抗原を細胞内に取 り込み、これを小さくして抗原の性質を読み取る。抗原が自己以外の成分である場合 には、抗体産生のために T細胞にシグナルを伝達し T細胞を活性ィ匕する。本発明の 変異体は抗体産生過程の τ細胞を活性ィ匕するために使用することができる。このよう な変異体の実際の応用例としては、変異体をコードする遺伝子を適当な発現べクタ 一（例えばアデノウイルスベクター）に組み込んだのち、相同組換えにより対象の DC 内のゲノムに遺伝子導入し、該遺伝子を発現させて DC膜中に該膜分子変異体をも つ DCを得ることが考えられる。
[0055] 或いは逆に、本変異体を T細胞の活性ィ匕を阻害もしくは抑制するために用いること も可能である。この場合、変異体は天然の DC膜上の膜分子と拮抗可能であるべきで あり、例えばそのような変異体としては T細胞の活性ィ匕に必須のドメインに欠陥を有し ているものが挙げられる。
[0056] 天然型膜分子と高い相同性 (80%以上)を有し、かつ T細胞の活性ィ匕を制御する能 力を有している限り、いかなる変異体も本発明の範囲内である。このような変異体は 例えば、部位特異的突然変異法、 PCR法などを用いて天然型膜分子に対し所望の 改変 (欠失、置換、挿入および/または付加）を導入することによって製造することが でさる (上 己の Molecular Cloning、およびし urrent Protocols in Molecular Biology 参照)。そのような改変として、例えば保存的アミノ酸間の置換、例えば酸性アミノ酸（ ァスパラギン酸とグノレタミン酸）間、塩基'性アミノ酸 (リジンとァノレギニン）間、疎水'性ァ ミノ酸 (ロイシン、イソロイシン、ノ《リンなど）間の置換が挙げられる。
[0057] 本発明の変異体を天然源等力も得る場合には、塩基配列に基づいてプローブを作 製し、中度または高度のストリンジヱント条件化でのノ、イブリダィゼーシヨンの後、高ス トリンジェント条件下で洗浄することによって目的の変異体をコードする遺伝子を取り 出し、これを適当なベクターに組み込み、発現させることによって目的の変異体を得 ることができる。高ストリンジェント条件の例は、 0.5M NaHPO , 7% SDS, ImM EDTA,
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65°Cでのハイブリダィゼーシヨン、その後の 0.1 X SSC/0.1% SDS, 68°Cでの洗浄であ る（上記の Current Protocols in Molecular Biologyを参照）。ノヽイブリダィゼーシヨン条 件は温度およびイオン強度を適宜選択することによって決定できるが、通常、温度が 高いほど、またイオン強度が低いほどストリンジエンシーが高まる。したがって当業者 は適するノ、イブリダィゼーシヨン条件を選択可能である。本発明には、塩基配列と 80 %以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%の相同 性を有する、上記変異体をコードする DNAも包含される。
[0058] (2)本発明の組み換えベクター及び形質転換体
本発明の DNAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用 いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えば プラスミド等)でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに 組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよ 、。
[0059] 好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて 本発明の遺伝子は、適当な転写/翻訳調節配列 (例えば、プロモーター等）に機能的 に連結されている。発現ベクターの種類としては、例えばプラスミド、ファージ、コスミ ド、ウィルスなどが挙げられる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示す D NA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
[0060] 転写/翻訳調節配列には、使用する宿主/ベクタ一系に応じて選択されたプロモー ターおよびェンハンサーを含めることができる。プロモーターとして、細菌系では例え ば P , P , Ptrp, Placなど、酵母系では例えば PH05, GAP, ADH, AOX1プロモーター
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など、動物細胞では SV40初期プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ヒートショッ クプロモーターなどを挙げることができる。昆虫細胞で作動可能なプロモーターとして は、ポリヘドリンプロモータ、 P10プロモータ、オートグラファ'カリホル二力 ·ポリへドロ シス塩基性タンパクプロモータ、バキユウロウィルス即時型初期遺伝子 1プロモータ、 またはバキユウロウィルス 39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。
[0061] また、本発明の DNAは必要に応じて、適切なターミネータ一に機能的に結合され てもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデ-レーシヨンシグナル (例えば SV40またはアデノウイルス 5Elb領域由来のもの)、転写ェンハンサー配列（例えば SV40ェンハンサ）などの要素を有して!/、てもよ！/、。
[0062] 本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可 能にする DNA配列を具備してもよぐその一例としては SV40複製起点（宿主細胞が 哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
[0063] 本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカー としては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR)またはシゾサッカロマイセス'ポ ンべ TPI遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けて 、る遺伝子、または例えば アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフエ二コール、ネオマイシン若し くはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、 プロモータ、および所望によりターミネータおよび Zまたは分泌シグナル配列をそれ ぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
[0064] 発現ベクターは、宿主に応じて種々のものが巿販または寄託されており、あるいは 文献等の刊行物に記載されており、それらを使用できる。例えば細菌用として pQE ( キアゲン社）、 pBluescript II SK+ (ストラタジーン社）、 pET (ノバジェン社）などである。
[0065] 本発明の DNA又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転 換体を作製することができる。
本発明の DNAまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の蛋白 質を発現できれば任意の細胞を使用できる。宿主細胞としては、原核細胞、酵母類、 動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞又は植物細胞などが使用可能である。
[0066] 原核細胞の例としては、例えば、ェシエリヒア属、バチルス属、シユードモナス属など が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコン ピテント細胞を用いることにより行えばよい。
[0067] 酵母細胞の例としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属またはピチア 属などの細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス 'セレビシェ (Saccharomyces cer evislae)またはサッカロマイセス ·クルイベリ (Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる 。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクト口ポレーショ ン法、スフエロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
[0068] 動物細胞の例としては、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞 (CHO)などが挙げられる。哺乳類細胞を形 質転換し、該細胞に導入された DNA配列を発現させる方法も公知であり、例えば、 エレクト口ポーレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等を用いることが できる。
[0069] 真菌細胞の例は、糸状菌、例えばァスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、ま たはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、 DNA構 築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うこ とができる。 DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例え ば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
[0070] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュ口 ウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（ 例 ば、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual；及びカレント 'フ—ロト コールズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、 Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）
[0071] バキュロウィルスとしては、例えば、ョトウガ科昆虫に感染するウィルスであるアウト グラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica n uclear polyhedrosis virusノ等 用 、ること; 0できる。
[0072] 昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf9、 Sf21〔バキュロウ ィルス.エクスプレッション.ベクターズ、ァ 'ラボラトリ^ ~ ·マ-ユアル、ダブリュ ~ ·エイ チ.フリーマン.アンド.カンパ-一 (w. H. Freeman and Company),ニューヨーク (New York), (1992)]、 Trichoplusia niの卵巣細胞である HiFive (インビトロジェン社製)等を 用!/、ることができる。
[0073] 組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上 記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフエ クシヨン法等を挙げることができる。
[0074] 形質転換またはトランスフ タトされた宿主細胞は適当な培養培地中で培養されて 目的遺伝子を発現させ、産生した本発明の膜分子を培地中から、または宿主細胞中 力も回収する。細胞力も回収する場合には、培養終了後、細胞を遠心分離等により 分離し、水性緩衝液に懸濁し、音波処理、フレンチプレス、ダイノミルなどにより細胞 を破砕し、無細胞抽出液を得る。膜分子の単離精製は、タンパク質の精製に用いら れる一般的方法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-テイクロマ トグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、 HPLC、電気泳動法 、脱塩法、有機溶媒沈殿法などを任意に組合わせて行うことができる。
[0075] (3)本発明の抗体
本発明の抗体は、上記（1)に記載した本発明の蛋白質又はその断片に特異的に 免疫結合する抗体である。
[0076] 本明細書中で使用する本発明の抗体に関する「特異的に免疫結合する」という用 語は、本発明の抗体が本膜分子のみが有するェピトープと免疫学的に交差反応し、 TREMファミリーなどの他のタンパク質と交差反応しな 、ことを意味する。このようなェ ピトープは、例えば本発明の膜分子のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列と を整列比較することによって、本質的に異なる配列部分 (連続する少なくとも 5ァミノ 酸、好ましくは少なくとも 8アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも 15アミノ酸)を選択する こと〖こよって決定できる。
[0077] TREMファミリーに属する膜分子は主に活性ィ匕に伴い発現が上昇し、前記記載のよ うにファミリーの性質力も推測して成熟 DC、活性ィ匕マクロファージ、活性化単球、活 性化 B細胞等にも本膜分子の発現が見られることが予想される。この知見を利用する ことにより活性ィヒ抗原提示細胞 (APC)を特異的に認識する本膜分子に対する抗体を 得ることができる。
[0078] 上記の特性を有する!/ヽずれの抗体も本発明に包含されるが、 目的の抗体を得るた めの抗原ェピトープは、本膜分子群のアミノ酸配列において抗原性の高い領域、表 在性がある領域、二次構造をとらない可能性のある領域、他のタンパク質 (特に各膜 分子が属するファミリーの他のタンパク質）とホモロジ一がな 、か又は低 、領域から選 択されうる。ここで抗原性の高い領域は、 Parkerらの方法 [Biochemistry, 25卷、 5425- 5432頁（1986年) ]によって推定可能である。表在性がある領域は、例えばノヽイドロパ シーインデックスを計算しプロットすることによって推定可能である。二次構造をとらな い可能性のある領域は、例えば、 Chouと Fasmanの方法 [Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.、 47卷 45-148頁（1978年）]によって推定可能である。さらに、特に各膜 分子が属する他のタンパク質とホモロジ一がな 、か又は低 、領域は、各膜分子のァ ミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列との相同性比較によって推定可能である。
[0079] 上記の手法で推定された本膜分子の部分アミノ酸配列を基に、ペプチド合成法を 利用することによって該アミノ酸配列力もなるペプチドを合成することができる。目的 のペプチドは、例えば、 R.B. Merrifield [Science, 232卷、 341- 347頁（1986年）]によつ て開発された固相ペプチド合成に基いた市販のペプチド合成機を使用して合成し、 保護基を脱離後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相ク 口マトグラフィ一等を単独もしくは組合わせた方法により精製する。得られた精製ぺプ チドはキーホールリンペットへモシァ-ン（KLH)やアルブミンなどのキヤリャタンパク 質と結合し免疫原として使用することができる。
[0080] さらに、遺伝子組換え本膜分子を免疫原として本膜分子に対するポリクローナル抗 体あるいはモノクローナル抗体を公知の手法により作製することもできる。この場合、 本膜分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または他のタンパク質に関して 用いられる「組換え」という用語は、これらのタンパク質が宿主細胞内で組換え DNAに よって生産されたものであることを意味する。宿主細胞としては、原核生物（例えば大 腸菌のような細菌)及び真核生物（例えば酵母、 CHO細胞、昆虫細胞等）のいずれも 使用され得る。
[0081] 本発明の「抗体」はペプチド抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体!/、ずれ でもよい。「抗体」は、マウスまたは他の適した宿主動物を免疫に用いられたタンパク 質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、産生するであろうリンパ球を引き 出すために、皮下、腹腔内、または筋肉内の経路によって、抗原あるいは抗原発現 細胞により免疫化することによって得られる。さらに宿主動物としてはヒト抗体遺伝子 のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、 所望のヒト抗体を取得してもよい [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97卷、 722-727頁（200 0年）、国際公開 W096/33735、 WO97/07671, W097/13852, W098/37757参照]。 そのかわりに、リンパ球を in vitroで免疫化してもよい。宿主動物から得られた血清か ら、抗原に結合する画分を集め、精製することにより、ポリクローナル抗体を取得する ことができる。また、ハイプリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールの ような適当な融合試薬を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノ クローナノレ f几体を作製することができる (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals a nd Practiceゝ 59- 103頁、 Academic pressゝ 1986年）。例えば本発明のモノクローナル 抗体は、ハイプリドーマ法 [Nature、 256卷、 495頁（1975年）]を用いても、組換え DNA 法 (Cabillyら、米国特許第 4816567号)を用いても作製することができる。
[0082] 抗原タンパク質は本膜分子のタンパク質の全てまたは部分配列をコードする DNAを 、大腸菌や酵母、昆虫細胞、動物細胞などで発現させることにより調製することがで きる。遺伝子組換え本膜分子は、ァフィ-ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマト グラフィー、ゲノレ濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは糸且合 わせた方法により精製し、この精製標品を免疫原として用いる。
[0083] また、本発明の抗体は、無傷の抗体であってもよ 、し、ある 、は (Fab')や Fabなどの
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抗体断片であってもよい。
[0084] また、定常領域をヒトの定常領域に置き換えたキメラ抗体 (例えばマウス-ヒトキメラ 抗体； Cabillyら、米国特許 4816567及び Morrisonら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 卷、 6851頁（1984年））、定常領域および超可変領域（または、 Complementary- deter mining region ; CDR)を除く全ての可変領域をヒトの配列に置き換えたヒトイ匕抗体（Car terら， Proc. Natl. Acad. Sci. USAゝ 89卷、 4285頁、 1992年及び Carterら、 BioTechnol ogy、 10卷、 163頁、 1992年)も本発明の抗体に含まれる。
[0085] また、このようにして得られた本発明の抗体に対する抗体、すなわち抗イディォタイ プ抗体もまた本発明に含まれる。
[0086] このようにして得られた本膜分子に対する各種抗体は、その特徴を生かすことがで きる様々な用途に使用可能である。本膜分子が成熟 DCに特異的に発現が見られる 分子であることを利用して、本抗体を蛍光性物質 (ローダミン、フルォレサミンなど)で 標識し、周知の FACSを用いて目的の DCを検出'分離したり、 mo-DCの in vitroでの 分ィ匕を確認することができる。さらに、本膜分子は DCの成熟化に伴って発現量が顕 著に上昇するタンパク質であることから、本抗体を用いて FACSにより未成熟 DCと成 熟 DCを分離することもできる。本膜分子の検出に関しては、 FACSでの検出にとどま るものではな!/、。例えばウェスタンブロッテイングにぉ ヽて本抗体を 1次抗体として作 用させることにより検出可能であることが予想されるし、タンパク質レベルでの発現確 認を行うことができる。また本抗体を固相 (ポリスチレンビーズ、マイクロタイターゥエル 表面、ラテックスビーズなど)に結合して不均一系で、あるいは均一系で、免疫学的反 応を行って相同な膜分子を検出、定量 (蛍光抗体法、 ELISA、ラジオィムノアツセィな どの方法使用）することができる。この場合、免疫学的反応は競合反応であってもよ V、し非競合反応であってもよ!/、。また 2つ以上の抗体 (モノクローンまたはポリクローン) を用いるサンドイッチ法による反応も使用できる。上記における検出、定量のために は、当業界で公知の 、ずれの免疫学的手法も用いることができる。
[0087] その他、本膜分子の機能を評価する用途にも使用可能である。成熟 DCは強力な A PCであり、 MHCクラス II分子を介した CD4陽性の T細胞を刺激活性ィ匕及び MHCクラス I分子を介した CD8陽性細胞障害性 T細胞を刺激活性ィ匕することが知られて ヽる。こ れら機能を制御し得るか否かを確認するために、ァロジェニック MLR (Mixed Lymphoc yte Reaction)での機能を抑制しうるカゝ否かの確認、抗原特異的に CTLを誘導した場 合にその機能を抑制しうる力否かの確認、さらに DCの抗原提示に関わる分子力否か の確認等の in vitroでのアツセィにも使用可能である。
[0088] 本発明の抗体はさらに、 in vivoで免疫応答を制御するために使用することもできる 。本膜分子群は、前述したとおり、副刺激に関与する分子であると予想され、 T細胞 活性ィ匕に関わる膜分子であると予想される。このため、本発明の抗体が本膜分子群 と T細胞上のリガンドとの結合を阻害する抗体であれば T細胞活性ィヒを抑制すること が期待される。このように本膜分子群の機能制御可能な抗体を作用させることで DC の機能さらには T細胞の機能を制御することによる免疫応答を制御し得ることが期待 される。
[0089] さらには本膜分子および本膜分子のリガンドの可溶ィ匕型分子 (すなわち、細胞外領 域に相当する分子)およびこれら分子に対する抗体にも免疫応答を制御する活性が 期待される。
[0090] 本発明の抗体類または本膜分子の可溶ィ匕型分子を用いて本膜分子のリガンドを取 得することも可能である。可溶ィ匕型本膜分子リガンドは直接本膜分子に作用し、 DC 上の本膜分子を介したシグナルを制御し得る。また、本膜分子のリガンドと本膜分子 の相互作用をモジュレートできる低分子物質や本膜分子のリガンド及び本膜分子に 関わる細胞内シグナル経路をモジュレートする低分子物質もシグナルの制御に有用 である。 [0091] 本発明の抗体類または本膜分子の可溶ィ匕型分子、本膜分子のリガンドの可溶ィ匕型 分子、上記低分子を治療に用いる場合には、例えば癌、自己免疫疾患、臓器移植、 感染症、アレルギーなどの疾患の治療に適用可能である。
[0092] 投与法および投与剤型は特に制限されないが、静脈、動脈内投与、筋内投与、経 口投与、座剤投与などであり、薬学的に許容可能な賦形剤や希釈剤と組合わせて経 口用または非経口用に処方することができる力 好ましくは非経口投与である。投与 は 1日あたり 1回力または数回に分けて行い、投与量は患者の重篤度、年齢、性別、 体重などの条件に応じて決定され、副作用を併発しない範囲である。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって限定され ないものとする。
実施例
[0093] ¾細 DCの細qflfの調製
細胞膜タンパク質の場合、元々発現量が低いこと、またハンドリングが難しいことが 挙げられる。これを解決する手段の一つとして、より純度の高い細胞膜を取得する方 法を確立することが必要である。細胞膜表面をコートし、これを均一に破砕することで 、比重の重くなつた細胞膜を密度勾配遠心により取得する方法で純度の高い細胞膜 を調製した [J. Biol. Chem.、 258卷、 10062-10072頁（1983年）]。
[0094] ターゲットとしている膜分子の発現量の少なさとハンドリングの難しさから、大量のマ ウス DCを集めるために骨髄細胞を GM-CSF存在下培養することで骨髄細胞由来未 成熟 DCを大量調製した。 LPS (リポポリサッカライド)刺激あり、なしを同数の細胞で実 施し、同数 (5 X 108細胞）の未成熟 DCと成熟 DCを得た。
[0095] 実施例 2 タンパク質の高感度検出と in gel digestion
Mannら [Anal. Chem.、 68卷、 850-858頁（1996年）]の手法に従って銀染色によりタ ンパク質を検出した。酵素消化法についてはトリプシンを用いた in gel digestion法 [A nal. Chem.、 224卷、 451- 455頁（1995年）]により行い、以下で使用する分析サンプル とした。
[0096] ¾細13 蹬タンパク皙の分画
実施例 1で得られた細胞膜より界面活性剤を用いて細胞膜タンパク質を可溶ィ匕した 後、コンカナノ リン Aセファロースにアプライし、界面活性剤含有緩衝液にて洗浄した 。これら素通り画分を ConA FTと称した。吸着画分はメチル -alpha-D-ダルコビラノシ ドと界面活性剤を含有した緩衝液で溶出した (C。nA EL)。 ConA FTは小麦胚ァダル チュンセファロースに再度アプライし、界面活性剤含有緩衝液にて洗浄した。これら 素通り画分を WGA FTと称した。吸着画分は N-ァセチルダルコサミンと界面活性剤を 含有した緩衝液で溶出した (WGA EL)。 ConA EL、 WGA EL、 WGA FTを分子同定 サンプルとした。これら画分を SDS-PAGEにて展開した後、実施例 2の手法によりタン パク質を検出し、短冊状に切ったゲルを in gel digestionして分析サンプルとした。
[0097] 実施例 4 LC/MSによる微量分析
LC/MS(Applied Biosystems社製 QTRAP)を用いて、実施例 3で得たサンプルを分析 した。 95%溶液 A (0.1%ギ酸）および 5%溶液 B (0.08%ギ酸、 80%ァセトニトリル)で平 衡化した PepMap逆相カラム（内径 0.075mm X長さ 150mm) (LCパッキングス社製）に 力け、 180ナノリットル/分の流速で、 5分洗浄後、 67.5分かけて溶液 Bの比率を 50%ま で直線的に上げることにより順次溶出し MSに導入した。 MSに導入されたサンプルは 次の繰り返しサイクルでデータ取得を行い、その配列情報を得ることとした。 1. Full M S Scan:m/z=0〜2000のレンジでの親イオンの分子量の観測。 2. Zoom MS Scan: Full MS Scanで同定された親イオンの価数の観測。 3. MS/MS Scan: Zoom MS Scanで測 定された分子に Heガスをあてた場合に生じる娘イオンの観測。理論的な b,yシリーズ とどれだけの本数がどれだけの強度でマッチングするかをスコア化してランクをつける 同定法（SEQUESTアルゴリズム）により同定した [アメリカン ·ソサイァティ ·フォ一 ·マス 'スぺタトロメトリー、 5卷、 976- 989頁（1994年）]。
[0098] 実飾 15 本膜分子の同定
実施例 4の手法により同定された分子のうち、新規分子である本膜分子が同定され た。同定対象となったフラグメントは m/z=1470.67の 2価イオンであり、その MS/MSの パターンは本膜分子の部分アミノ酸配列（27残基） DTMSTSNQLPWPTVDGSTDMV SSDLQK (配列番号 5)に非常に良く帰属された。これら部分配列の non-redundant D NA databaseに対するホモロジ一サーチの結果、これら部分配列を有する塩基配列 は他に存在しないことが明ら力となった。 [0099] 実施例 6 本膜分子の遣伝子クローユング
実施例 5で同定された部分アミノ酸配列（配列番号 5)をマウス遺伝子データベース に対してサーチを実施したところ、唯一 N W199221が完全に一致する部分配列を有 する遺伝子であることが判明した。そこで、実施例 5で明らかとなった部分アミノ酸配 列に対応する遺伝子配列をもとにプライマーを合成し、マウス成熟 DCの cDNAライブ ラリーを铸型として RT- PCRを実施した。プライマーはそれぞれ 30merおよび 40merで 、センスプライマー 5し ATGAGTAAGACACTCAGAGGCAACCTGGAC -3' (配列番 号 6)とアンチセンスプライマー 5し CTAAGGAGAAATGTCTTTAGCTAGAAGTTCA GAGTCCAAA -3' (配列番号 7)を用いた。この結果、約 800bp弱の本膜分子の遺伝 子断片を取得した。この遺伝子断片をプローブとしてコロニーハイブリダィゼーシヨン により本膜分子の遺伝子を含むクローンを選抜し、塩基配列を決定した。推定 open r eading frame構造を配列番号 1に、推定されるアミノ酸配列を配列番号 2に示す。得ら れた遺伝子配列は既知遺伝子として報告のある NM#199221と同じであるものの、報 告とは 1塩基欠失していることから、読み枠がずれており、途中力 アミノ酸配列が異 なっていることが明らかとなった。またヒト単球由来榭状細胞の cDNAライブラリーを铸 型として同様の手法でヒトオルソログを取得した。プライマーはそれぞれ 28merおよび 30merで、センスプライマー 5し ATGTGCAGAAGGTGCAAGCCAGAGCTCA -3' (配 列番号 8)とアンチセンスプライマー 5'- CTAAGTGGCCATGTCTTTAGTCAGAGG TTC -3' (配列番号 9)を用いた。推定 open reading frame構造を配列番号 3に、推定 されるアミノ酸配列を配列番号 4に示す。得られた遺伝子は N W174892に一致する。
[0100] 本膜分子の推定アミノ酸配列の一次構造について Kyteと Doolittleの方法 (J. Exp.
Med., 157卷、 105-132頁、 1982年）に従い、ハイド口パシープロット解析を行なった（ 図 1)。その結果、本膜分子は N末端にシグナル配列を有する I型の細胞膜貫通タン ノ ク質であることが明ら力となった。本膜分子 (A)および (B)はそれぞれ (A) 209、 ( B) 201アミノ酸残基力もなり、ハイド口パシープロット解析結果から 17残基のシグナ ル配列、（A) 140残基、（B) 134残基の細胞外領域、 21残基の膜貫通領域、 (A) 3 1残基、（B) 29残基の細胞内領域を有していると予想される。さらにホモロジ一検索 並びにモチーフ検索の結果力 細胞外領域は (A) 2ケ所、（B) 0ケ所のァスパラギン 結合型糖鎖付加部位、 2ケ所のィムノグロブリン (Ig)ドメイン形成に必要なシスティン 残基を持つ 1つのィムノグロブリン様の構造を有していた。また、この細胞外の Igドメイ ンは V set構造であることが類推された。さらに、（A)、（B)ともに細胞内領域にシグナ ルを伝達し得るモチーフを有しないものの、（A)、（B)ともに膜貫通領域にリジン残基 を有することから、アダプター分子と会合していることが予想され、この会合したァダ プター分子を介してシグナルを伝達することが予想された。また、本膜分子は細胞外 に IgV setをひとつ有すること、細胞膜貫通領域にポジティブチャージを有するリジン 残基を有すること、などから構造的に TREM-1と相同ある 、は類似のファミリ一に属す ることが予想される。本マウス膜分子のマウス TREM-1に対するアミノ酸一致は 26%、 本ヒト膜分子のヒト TREM-1に対するアミノ酸一致は 26%、であり、 IgV setの形成に必 要なシスティン残基は保存されて 、る。
[0101] 施例 7 本蹬分早の可溶化型鉬.橼 体の作製
ノ、イド口パシープロット解析（図 2)の結果から、細胞外ドメインと考えられる領域とヒト IgGlの Fc領域を結合させた組換え体を作製した。なおヒ HgGlの Fc領域は各種細胞 表面上に存在する Fc gamma receptorへの結合を防ぐために 3ケ所のアミノ酸置換を 行った。具体的には細胞外領域として (A)の配列番号 1のアミノ酸 157位までを選択 した。この可溶化型組換え体のアミノ酸配列を配列番号 10に示す。 Fc領域でァミノ 酸置換を行った部位は配列番号 10に示す 177位 (Ala→Leu)、 178位（Glu→Leu)、 3 44位 (Asp→Val)〖こ相当する。この遺伝子を CMVプロモータ制御下 293T細胞で一過 性に発現させ、得られた培養上清カゝら Fc領域に結合性を有するプロテイン Aを結合 させた榭脂を用いたァフィ-テイク口マトグラフィにより発現産物を精製した（図 3)。
[0102] 実飾 18 本膜分早に針する内 件リガンドの枪索
実施例 7に記載の組換え体を用いてマウス脾細胞上に本膜分子と結合する分子が 存在する力否かをフローサイトメーターを用いて検索した。具体的にはフィコエリスリ ン標識 F(ab')化抗ヒ HgG Fc領域抗体 (ベックマンコールター社製)を二次抗体として
2
該組換え体を認識させる。その結果、 CD3陽性 T細胞、 CD19陽性 B細胞、 NK1.1陽 性 NK細胞、 CD1 lc陽性榭状細胞など確認した全ての細胞にぉ ヽて本膜分子が結合 することが確認された。（図 4) 産業上の利用可能性
[0103] 本発明により、 DCを他の血球系細胞力 選択的に高い純度で分離することができ るのみならず、成熟 DCと未成熟 DCとの分離も可能とすることから、 DC療法への該細 胞の供給を可能とする。分離された DCは、抗原をパルスしたのち、再び患者に戻す ことにより癌ワクチンとして利用するなどの用途が期待される。 また、本膜分子に対す る抗体、あるいは本膜分子の可溶ィ匕型分子を用いて DCと T細胞との相互作用を阻害 することで免疫応答を制御し得ることも期待される。
図面の簡単な説明
[0104] [図 1]図 1は、 Kyteと Doolittleの方法を用いた本膜分子のハイド口パシープロット解析 の結果を示す。
[図 2]図 2は、 CLUSTAL Wによる本膜分子のマウスとヒトとの間でのァライメント解析 結果を示す。
[図 3]図 3は、組換え体の発現と精製を示す。 Protein A Sepharoseを用いた精製:銀 染色： 5Z20グラジェントゲル： 1 :インプット 2 :フロースルー 3 :溶出液
[図 4]図 4は、組換え体を用いた内因性リガンドの検索を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 以下の何れかのアミノ酸配列からなる蛋白質。
(a)配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列；
(b)配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1個もしくは複数個のアミノ酸残 基の欠失、置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御し得るァミノ 酸配列；又は
(c)配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつ免疫 応答を制御し得るアミノ酸配列：
[2] 請求項 1に記載の蛋白質をコードする DNA。
[3] 以下の何れかの塩基配列からなる DNA。
(a)配列番号 1又は 3に記載の塩基配列；
(b)配列番号 1又は 3に記載の塩基配列において 1個もしくは複数個の塩基の欠失、 置換、挿入および/または付加を含み、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列をコ ードする塩基配列；又は
(c)配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又はその相補配列とストリンジ ンな条件下 でノ、イブリダィズする塩基配列であって、かつ免疫応答を制御し得るアミノ酸配列を コードする塩基配列：
[4] 請求項 2又は 3に記載の DNAを含む、組み換えベクター。
[5] 請求項 2又は 3に記載の DNA又は請求項 4に記載の組み換えベクターを有する、形 質転換体。
[6] 請求項 1に記載の蛋白質又はその断片に特異的に免疫結合する抗体。
[7] 免疫学的に榭状細胞を認識する、請求項 6に記載の抗体。
[8] 請求項 1に記載の蛋白質の細胞外領域を認識する、請求項 6に記載の抗体。
[9] ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項 6から 8のいずれかに記 載の抗体。
[10] 請求項 6から 9の何れかに記載の抗体を用いてヒトまたは他の動物由来の免疫担当 細胞を分離する方法。
[II] 榭状細胞を分離する、請求項 10に記載の方法。
[12] 請求項 6から 9の何れかに記載の抗体を用いて免疫担当細胞を検出する方法。
[13] 榭状細胞を検出する、請求項 12に記載の方法。
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