WO2006075682A1 - 遺伝子マーカー及びその利用 - Google Patents

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WO2006075682A1
WO2006075682A1 PCT/JP2006/300336 JP2006300336W WO2006075682A1 WO 2006075682 A1 WO2006075682 A1 WO 2006075682A1 JP 2006300336 W JP2006300336 W JP 2006300336W WO 2006075682 A1 WO2006075682 A1 WO 2006075682A1
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WO
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gene
marker
expression level
immunosuppressant
blood
Prior art date
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PCT/JP2006/300336
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yusuke Tanigawara
Maiko Nomoto
Kiyoshi Mihara
Osamu Iketani
Minoru Tanabe
Ken Hoshino
Motohide Shimazu
Yasuhide Morikawa
Original Assignee
Keio University
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Publication date
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease

Definitions

  • the present invention relates to a genetic marker, a method for diagnosing rejection, a method for determining the presence or absence of immune tolerance, a method for evaluating the efficacy of an immunosuppressive agent, a method for identifying an immunosuppressive agent, a kit, and immunosuppression
  • the present invention relates to a screening method for agents or immune tolerance inducers.
  • Tissue biopsy needle biopsy
  • injection biopsy needle biopsy
  • this method involves invasion and is a heavy burden on patients. Therefore, frequent inspections are not possible, and skillful techniques and sufficient facilities are required for implementation, so it cannot be performed easily.
  • blood test eg WBC (white blood cell count), CRP (C reactive protein), organ damage marker (AST (aspartate aminotransferase; GOT), ALT (aminotransferase) in blood) GPT), pyrilvin, ⁇ GTP (guanosine triphosphate), creatine, or ⁇ UN (blood urea nitrogen)
  • WBC white blood cell count
  • CRP C reactive protein
  • AST aspartate aminotransferase
  • GOT organ damage marker
  • ALT aminotransferase
  • GPT aspartate aminotransferase
  • pyrilvin eg., ⁇ GTP (guanosine triphosphate), creatine, or ⁇ UN (blood urea nitrogen)
  • Doppler ultrasonography observation of blood flow
  • an immunosuppressant is administered to the transplanted patient in order to suppress such rejection.
  • cyclosporine see, for example, Japanese Patent No. 3382656
  • FK506 Tecrolimus; see, for example, US Pat. No. 4,894,366
  • these immunosuppressive agents are excessive. Since there is a risk of side effects such as infection due to inadequate administration, it is indispensable to strictly set the dosage (dosage and administration interval) of the immunosuppressive agent (administration method).
  • the dose of the immunosuppressant is set by monitoring whether the drug concentration in the blood is within the effective blood concentration range (drug blood concentration monitoring: TDM (Therapeutic drug moni tiring). This force is set empirically and has no scientific basis, so it is not necessarily an indicator of drug efficacy.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and includes genetic markers capable of diagnosing rejection, evaluating the efficacy of immunosuppressive agents, and determining the presence or absence of immune tolerance.
  • a method for diagnosing rejection a method for evaluating the efficacy of an immunosuppressant, a method for identifying an immunosuppressant, a method for determining the presence or absence of immunological tolerance, a kit that can be performed quickly and easily using a genetic marker as an index.
  • a screening method of an immunosuppressive agent or an immune tolerance inducer is provided.
  • the present inventors use a microarray to analyze the expression pattern of genes in peripheral blood at the initial acute rejection reaction and at the time of administration of an immunosuppressive agent, using the rejection model rat that solves the above problems.
  • genes (Bcl211, Best5, Igilbp, Gbp2, etc.) whose expression level was increased by rejection and whose expression level was suppressed by administration of immunosuppressants were identified. These genes were found to be useful as early markers because their expression increased earlier than when pathological rejection was observed.
  • the present inventors have completed the present invention.
  • the gene marker according to the present invention is an indicator of rejection, and the gene marker is related to any gene selected from the group consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2. It is a gene-related substance.
  • the gene marker serves as an indicator of rejection due to transplantation of tissues or organs such as the liver.
  • the gene marker according to the present invention is an index of immune tolerance, and the gene marker is related to any gene selected from the group consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2. It is a gene-related substance.
  • the gene marker serves as an index of immune tolerance against transplantation of tissues or organs such as the liver.
  • the gene marker according to the present invention serves as an index of the efficacy of an immunosuppressant, and the gene marker is any gene selected from the group consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2. It is a gene-related substance related to.
  • the gene marker 1 serves as an index of the efficacy of an immunosuppressant for transplantation of tissues or organs such as the liver.
  • the method for diagnosing rejection according to the present invention is a method for diagnosing rejection by measuring a change in the expression level of each gene in blood collected from a vertebrate.
  • the gene marker is selected from the group consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2.
  • a gene-related substance related to any gene is used.
  • the method for diagnosing rejection according to the present invention can examine the presence or absence of rejection due to transplantation of tissues or organs such as liver.
  • the rejection diagnostic kit according to the present invention includes a primer or an antibody for measuring a change in the expression level of a gene marker in blood, and the gene marker includes Bcl211, cig5, I118bp, and A gene-related substance related to any gene selected from the group consisting of Gbp2 is used.
  • the diagnostic kit for rejection according to the present invention can examine the presence or absence of rejection due to transplantation of tissues or organs such as the liver, for example.
  • the method for determining the presence or absence of immune tolerance comprises determining the presence or absence of immune tolerance by measuring changes in the expression level of gene markers in blood collected from vertebrates transplanted with tissues or organs.
  • a gene marker a gene-related substance related to any gene selected from the group force consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2 is used.
  • the tissue or organ is, for example, a liver.
  • the method for determining the presence or absence of immunological tolerance reduces the dose of an immunosuppressive agent administered after transplantation in a vertebrate transplanted with a tissue or organ.
  • the expression level of the gene marker in the blood collected from the vertebrate force is also monitored, and when the dose decreases, the expression level does not change significantly, and immune tolerance is achieved when the immunosuppressant can be withdrawn. Determining that it has occurred.
  • the gene marker for example, a gene-related substance related to any gene selected from the group consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2 can be used.
  • the tissue or organ is, for example, a liver.
  • the kit for determining the presence or absence of immune tolerance includes a primer or an antibody for measuring a change in the expression level of a gene marker in blood, and the gene marker includes Bcl211, A gene-related substance related to any gene selected from the group consisting of cig5, I118bp, and Gbp2 is used.
  • the present invention may be a kit for determining the presence or absence of immunological tolerance for transplantation of tissues or organs such as the liver.
  • the method for evaluating the drug efficacy of the immunosuppressive agent according to the present invention is a method of using blood by using an immunosuppressive agent.
  • a gene-related substance related to any gene is used.
  • the present invention may be, for example, a method for evaluating the efficacy of an immunosuppressive agent for transplantation of tissues or organs such as the liver.
  • the method for identifying an immunosuppressive agent according to the present invention is a method for identifying an effective immunosuppressive agent in a vertebrate that requires administration of an immunosuppressive agent, and comprises a plurality of individuals belonging to the vertebrate.
  • the method for selecting an immunosuppressive agent according to the present invention is the use of an immunosuppressive agent or blood prepared for each of a plurality of immunosuppressive agents in a vertebrate individual that requires administration of the immunosuppressive agent.
  • a calibration curve showing the correlation between the medium concentration and the expression level of the gene marker is used.
  • V ⁇ is the most effective immunosuppressive agent for an individual who needs the immunosuppressive agent among the plurality of immunosuppressive agents.
  • the gene marker a gene-related substance related to any gene selected from the group force consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2 is used.
  • the individual is preferably one that has undergone transplantation of a tissue or organ such as the liver, for example.
  • the method for determining the dose of an immunosuppressive agent comprises collecting blood from the vertebrate in a vertebrate associated with a disease or rejection requiring administration of the immunosuppressant, and in the blood Using the calibration curve showing the correlation between the amount of immunosuppressant used or the concentration of immunosuppressant in blood and the amount of gene marker expressed, the gene marker expression level was measured and preliminarily created.
  • Expression levels of genetic markers in vertebrate blood Any of the methods for determining the dose of an immunosuppressive agent required to reduce the expression level to a predetermined level, wherein the gene marker is selected from the group consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2.
  • Gene-related substances related to genes are used.
  • the individual is preferably one that has undergone transplantation of a tissue or organ such as the liver.
  • the kit for evaluating the efficacy of the immunosuppressive agent according to the present invention comprises a primer or an antibody for measuring a change in the expression level of a gene marker in blood due to the use of the immunosuppressive agent.
  • a gene marker a gene-related substance related to any gene selected from the group force consisting of Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2 is used.
  • the immunosuppressive agent may be used, for example, after transplantation of a tissue or organ such as the liver.
  • the screening method according to the present invention may be a screening method for an immunosuppressant or a screening method for an immune tolerance inducer, and a spine that causes immune rejection by transplanting a tissue or organ.
  • the tissue or organ is, for example, a liver.
  • the expression level of the gene marker is measured while monitoring the blood concentration of the immunosuppressive agent, and the immunosuppressive agent or immune tolerance inducing agent is used until a predetermined value is reached. It is characterized by administering. This makes it possible to effectively suppress rejection caused by tissue or organ transplantation.
  • the expression level of the gene marker is measured while monitoring the blood concentration of the immunosuppressant, and the immunosuppressant or immunity is maintained until a predetermined value is reached. It is characterized by administering a tolerance inducer. This makes it possible to effectively improve or treat immune diseases such as autoimmune diseases, allergic diseases, atopic diseases, rheumatic diseases, and hay fever.
  • gene marker refers to evaluation of the state or action of a certain object.
  • it refers to a gene-related substance when it correlates with the expression level of a gene.
  • the gene itself includes mRNA as a transcript, peptide as a translation, protein as a final product of gene expression, and the like.
  • the expression level of the gene marker is the expression level at the transcription level of the gene from which the genetic marker is derived (when the marker is a transcript, etc.) or the translation level (when the marker is a polypeptide, Meaning protein).
  • each gene described above is not limited to the species from which it is derived, and includes all its homologs and orthologs.
  • the term “vertebrate” means humans and vertebrates such as mice and rats other than humans.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression levels of gene markers (Best5 and Bcl211) in 7P OD of non-rejection group, immunosuppression group, and rejection group in one example according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in the expression level of the gene marker (Best5) in the blood of the non-rejection group, the immunosuppression group, and the rejection group in one example according to the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in the expression level of the gene marker (Bcl211) in the blood of the non-rejection group, the immunosuppression group, and the rejection group in one example according to the present invention.
  • FIG. 4 In one example according to the present invention, the highest value among the data up to 3POD, the value indicating the gene (Best5) expression level was picked up, and the average value of each group was examined.
  • FIG. 5 In one example according to the present invention, the highest value among the data up to 3POD, the value indicating the gene (Bcl211) expression level was picked up, and the average value of each group was examined.
  • FIG. 7 An example according to the present invention! It is a figure which shows the expression fluctuation
  • FIG. 8 In an example according to the present invention, B at the time of acute rejection in a living liver transplant case.
  • FIG. 9 shows an example according to the present invention! IL at the time of acute rejection in a living liver transplant case
  • FIG. 10 shows an example according to the present invention.
  • the gene marker of the present invention is a gene-related substance related to a gene whose expression is changed by administration of a rejection reaction or an immunosuppressive agent.
  • a gene-related substance related to any gene selected from Bcl211, cig5, I118bp, and Gbp2 The expression level of these genetic markers increases in the blood before rejection, which is diagnosed pathologically by needle biopsy or the like, and decreases in the blood by immunosuppressants. . Therefore, the gene marker according to the present invention is useful as an early marker (indicator) of rejection, and is also useful as an index of immune tolerance or an index of the efficacy of an immunosuppressive agent.
  • the expression level of the gene marker according to the present invention is considered to vary depending on the degree of rejection, the dose of the immunosuppressant, and the blood concentration. From this, it is considered that the expression levels of these gene markers have a correlation with the degree of rejection, the dose of the immunosuppressant, and the blood concentration. Note that the expression level of the gene marker and the rejection or immunosuppressant may have an inverse correlation.
  • the expression level of the genetic marker can be measured easily and regularly. This allows a quick diagnosis of whether rejection occurs before a pathologically diagnosed rejection occurs. This early diagnosis is very important because it allows for early response to rejection, minimizing the damage caused by rejection of the transplanted tissue or organ.
  • a blood sample can be easily obtained because it does not require an advanced technique such as a needle biopsy that is less invasive than a needle biopsy.
  • the evaluation of drug efficacy and the diagnosis of immune tolerance according to the present invention can be performed quickly, frequently and simply.
  • the measurement (quantification) of the expression level of the gene marker is, for example, Northern plotting, dot blotting, quantitative RT-PCR ( Quantitative RT-PC in that the amount of mRNA can be measured using a very small amount of RNA (isolated from blood). It is preferable to use the R method.
  • the primer used in the quantitative RT-PCR method is not particularly limited as long as it can specifically detect a gene marker, but an oligonucleotide consisting of 12 to 26 bases is preferable.
  • Its base sequence is Bcl211 (BCL 2—like 1), cig5 (additional U name R3 ⁇ 4AD2 (Radical 3 ⁇ 4—adenosyl metnionine domain containing 2); best 5 in foot), I118bp (lnterleukin 18 binding protein) ; Foot is determined based on sequence information of each gene of Igilbp (Interferon gamma inducing factor binding protein)) and Gbp2 (Guanylate binding protein 2).
  • a primer having the determined sequence can be prepared using, for example, a DNA synthesizer. Specifically, for example, if the animal is a human, it is registered with NM001191 and NM138578 (BCL2Ll), NM080657 (cig5), NM005699 and NM173042 to NM173044 (IL18BP), NM004120 (GBP2)! Primers can be prepared based on the sequence information. If the animal is a rat, it is registered with NM031535 (Bcl211), NM138881 (Best5), NM053374 (Igilbp), or NM133624 (Gbp2). Based on this, a primer can be prepared.
  • the gene marker is a translation product (polypeptide) or final product (protein) of the gene
  • a Western blot method using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody specific to the gene marker for example, a Western blot method using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody specific to the gene marker.
  • the ability to measure the expression level of genes by ELISA or ELISA method S is not limited to these methods.
  • RIA radioimmunoassay ⁇ radiation assay
  • EIA enzyme immunoassay ⁇ enzyme immunity
  • Vertebrate Strength After the collected blood is homogenized, it is sonicated, centrifuged, and the supernatant is collected to obtain a crude extract containing protein. Then, using an ELISA plate (for example, using a 96-well plate) to which a polyclonal antibody that specifically binds to the gene marker is adsorbed, put the crude protein extract into the well of the plate and transfer the gene. It is reacted with a marker, and subsequently reacted with a primary antibody and a secondary antibody (for example, an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme, etc.).
  • an ELISA plate for example, using a 96-well plate
  • a primary antibody and a secondary antibody for example, an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme, etc.
  • the ELISA plate is washed, developed with a substrate for the enzyme, and the absorbance is measured with a microplate reader. Measure and quantitate the expression level of protein using a calibration curve. In this way, the expression level of the gene marker can be measured.
  • the enzyme used as a label for the secondary antibody include, but are not limited to, peroxidase (HRP) derived from horseradish rust, alkaline phosphatase and the like.
  • the expression level of the genetic marker in blood collected from a vertebrate animal transplanted with a tissue or organ is periodically measured, and the gene in blood collected before the tissue or organ transplantation is measured.
  • the expression level of the marker it is possible to diagnose the rejection reaction at an early stage. That is, as a result of measuring the expression level of the gene marker, if the expression level of the gene marker after transplantation has changed significantly compared to before transplantation, or if it has changed significantly over time, rejection has occurred. It is determined that there is a possibility of refusal or rejection.
  • the gene marker is a gene-related substance related to any gene selected from Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (Igilbp), and Gbp2
  • the expression level is significantly increased compared to that before transplantation. If it is caloric or has a tendency to increase significantly over time, it is judged as such.
  • the expression level of the gene marker after transplantation is significantly increased as compared with that before transplantation. In some cases, it is judged that no rejection has occurred.
  • the vertebrate to be diagnosed may be, for example, a human or a non-human vertebrate such as a mouse or a rat.
  • the expression level of the gene marker according to the present invention is useful not only as an indicator of rejection but also as an indicator when evaluating the efficacy of an immunosuppressive agent. If it is possible to evaluate the efficacy of an immunosuppressive drug by measuring the expression level of a gene marker, the administration method of the immunosuppressive drug based on scientific evidence should be easily determined for each disease. Can do. For example, an effect can be obtained with a small amount of use, and an immunosuppressive agent or its administration method with few side effects can be selected.
  • the target diseases of immunosuppressants include autoimmune diseases, allergic diseases (including allergic dermatitis, atopic diseases, hay fever), rheumatic diseases, and the like. There are immune diseases such as patients.
  • the immunosuppressant may be any drug that suppresses abnormal immune reactions such as rejection of a living body after transplantation, or a drug that suppresses immunity in various diseases.
  • CN inhibitors such as steroids (prednisolone, methylprednisolone, etc.), IL-2 antibodies, IL-2 secretion inhibitors (rapamycin, etc.), cyclosporine or FK506 (also called tacrolimus or prograft), antimetabolites (Mofethyl mycofenolate), cyclophosphamide, OKT3 (also called muromonab CD3), anti-lymphocyte globulin (anti-thymocyte immunoglobulin), anti-CD4 antibody, anti-TNF- ⁇ antibody, azathioprine, mizoribine, sulfa-salazine, 6— Mercaptopurine (6-MP), methotrexate, cytoxazone, dasperimus hydrochloride, or a combination of these drugs Combined
  • Immunosuppressant While monitoring the dosage of the immunosuppressive agent or the blood concentration of the immunosuppressive agent for vertebrate individuals who have received the above-mentioned disease or have undergone transplantation and then administered the immunosuppressive agent, Immunosuppressant until the expression level of the gene marker in the blood (or peripheral blood) is measured until the expression level of the gene marker reaches a predetermined value (for example, decreases to about 20% of the difference from the normal value) can be used to improve or treat the above-mentioned immune diseases and suppress rejection, by using minimal immunosuppressive agents. As a result, side effects such as infections caused by excessive use of immunosuppressants can be effectively prevented.
  • a predetermined value for example, decreases to about 20% of the difference from the normal value
  • a standard curve showing the correlation between the expression level of the gene marker and the dose or blood concentration of the immunosuppressant is created. The effectiveness of the agent can be evaluated.
  • a calibration curve for a plurality of immunosuppressive agents is prepared, and the immunosuppressant that produces the normal expression level of the gene marker in the smallest amount, or the amount that causes side effects and the expression level of the gene marker becomes normal values.
  • the administration method of the immunosuppressive agent includes, for example, administration by injection such as affected area, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, etc., oral administration, parenteral administration by application or application.
  • the same calibration is applied to immune diseases such as autoimmune diseases, allergic diseases, atopic diseases, rheumatic diseases, hay fever and animals with rejection reactions that require immunosuppressants. It is also possible to set the optimal dose of immunosuppressant for each disease using the line. For example, for a patient or livestock, the difference between the gene expression level before administration of an immunosuppressive agent and the expression level of a normal gene marker is calculated, and the gene marker is expressed by a predetermined percentage. The dose of the immunosuppressant that can reduce the expression level can be determined.
  • the presence or absence of immune tolerance is determined by measuring the change in the expression level of the gene marker in the collected blood of the vertebrate transplanted with the tissue or organ. Can be determined.
  • the dose of an immunosuppressant is decreased in a vertebrate transplanted with a tissue or organ, and the expression level of a gene marker in blood collected from the vertebrate
  • the method of monitoring can be mentioned. That is, as a result of measuring the expression level of the gene marker, the expression level of the gene marker shows a change similar to that judged to have caused a rejection reaction as the dose of the immunosuppressant is decreased. Is considered to be immune tolerance! /, And when the dose of the immunosuppressive agent is decreased, the gene marker expression level does not change significantly, and the immunosuppressant can be withdrawn. It is determined that immune tolerance has occurred.
  • the gene marker is a gene-related substance related to any gene selected from Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (lgilbp), and Gbp2, the dose of the immunosuppressant will be reduced. If the expression level of the gene marker increases, immunological tolerance has occurred. Even if the dose of the immunosuppressive agent decreases, the expression level of the gene marker does not increase significantly, and immunosuppression occurs. Can withdraw from the drug If it is determined that immune tolerance has occurred.
  • the vertebrate to be diagnosed may be, for example, a human or a non-human vertebrate such as a mouse or a rat.
  • the method for determining the presence or absence of immune tolerance according to the present invention can also be used in the development of a method for inducing immune tolerance and in screening for an immune tolerance inducing agent.
  • a tissue or organ is transplanted into a vertebrate such as a mouse or a rat, and a test substance is administered or treated by a test method, and then blood is collected to express a gene marker. Monitor the amount.
  • a test substance is administered or treated by a test method, and then blood is collected to express a gene marker. Monitor the amount.
  • T cell desensitization can be performed by administering a partial peptide of a peptide to be induced for immune tolerance.
  • various partial peptides are screened, An effective partial peptide can be selected. It can also be used in screening methods for compounds that selectively inhibit the auxiliary signal pathways ICOS / B7h pathway and CD28-CTLA4 / B7 pathway.
  • administration of immunosuppressive agents to vertebrates transplanted with tissues or organs for example, by administering one or more immunosuppressive agents, such as by changing the usage and administration method of the administered immunosuppressive agents.
  • an effective immune tolerance induction method can be developed.
  • the gene marker for example, a gene-related substance related to any gene for which Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (Igilp), and Gbp2 force are also selected can be used.
  • Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (Igilp), and Gbp2 force are also selected can be used.
  • vertebrates for example, vertebrates such as mice and rats can be used.
  • the kit according to the present invention may be any kit as long as it contains a reagent or instrument for measuring the expression level of the gene marker.
  • the kit used in the quantitative RT-PCR method examples include limers and reagents, antibodies used in Western blotting and ELISA.
  • the enzyme for example, peroxidase (HRP) derived from horseradish rust, alkaline phosphatase, etc. can be used.
  • HRP peroxidase
  • Cy2 FluorX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 FITC (fluorescein isothiocyanate), rhodamine and the like can be used, and 3 H, 32 P, 35 S, m I, 125 I and the like can be used as radioactive substances.
  • primers examples include primers for one or more genes selected from the group power of Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (Igil p), and Gbp2.
  • the antibody for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that specifically reacts with a gene marker (polypeptide or protein) such as Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (Igilbp), and Gbp2 is used. be able to.
  • the kit according to the present invention may include one or more kinds of antibodies.
  • cyclosporine manufactured by Norpateis Pharma Co., Ltd .; dissolved in physiological saline
  • the two strains of rats were 8 to 10 weeks old and males weighing 200-300 g.
  • This cDNA was hybridized with Atlas Glass Rat 3.8 I Microarray (BD Biosciences Clontech) and the microarray was scanned with GenePix Pro3.0 Microarray analysis software (Axon Instruments) using Axon GenePix4000A (Axon Instruments). The data was analyzed (global correction). As a result, compared with non-rejection group or immunosuppression group, The gene (Bcl211 and Best5) was selected because the expression level was significantly increased.
  • mRNA was quantified in order to examine the change in the expression level strictly.
  • the mRNA of Bcl211 and Best5 was quantified by 25 ng of extracted mRNA and each primer and probe (900 nM and 200 nM at final concentrations, respectively; TaqMan Gene Expression Assays Rn00580568-gl (Bcl211) or Rn00594081-ml (Applied Biosystems) Using Best5), cDNA was synthesized using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosy stems) and ABI PRISM 79 00HT (Applied Biosystems) with rat ⁇ -actin as an internal standard. .
  • Rat j8-actin (NM0311 44) probe ((VIC) -CCATCACACCCTGGTGCC- (MGB); SEQ ID NO: 1) and primer (5'-GCCGTCTTCCCCTCCAT (SEQ ID NO: 2) and 5'-AGGAGTCCTTCTGA CCCATACC (SEQ ID NO: 3)
  • the final concentrations of were 100 nM and 200 nM, respectively.
  • the expression level of the gene marker before surgery is used as a reference (“1”), and the expression level of the gene marker after surgery is relatively quantified by the ⁇ A Ct method. It was.
  • immunosuppression group 5
  • From the jugular vein of each rat 200 ⁇ l of blood was collected daily before liver transplantation and until 6 days after transplantation, and the rats were laparotomized on the 7th day after transplantation. ; ⁇ Sampled and genetic The expression level of each one (Best5 and Bcl211) was measured.
  • the expression level of the gene marker was measured by collecting peripheral blood force mRNA and quantifying the mRNA in the same manner as in the method described in Example 1.
  • peripheral blood about 200 1 of jugular vein force was collected from 3 individuals each in the non-rejection group, the rejection group, and the immunosuppression group. Thereafter, mRNA was extracted using QIAamp RNA Blood Mini (manufactured by QIAGEN), and DNA was removed by DNase treatment. Using 5 ⁇ g of mRNA in the obtained peripheral blood, hybridization was performed according to the protocol of Rat Expression Array 230A (manufactured by Afiym etrix), scanning, and data were analyzed (global correction).
  • the gene (Igil p and Gbp2) was selected with significantly increased expression levels in the rejection group compared to the non-rejection group or the immunosuppression group.
  • the mRNA expression level was 25 ng of mRNA extracted from peripheral blood and each primer and probe (900 nM and 200 nM at final concentrations respectively; TaqManuene Expression Assays Rn00584495_gl (Igif bp) or Rn00592467-ml (Gbp2 ) was used to synthesize cDNA using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) and ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) using rat ⁇ -actin as an internal standard as described in Example 1. Was quantified. In this quantitative analysis of mRNA, the gene marker expression level after surgery was relatively quantified by the ⁇ A Ct method with reference to the expression level of the gene marker before surgery as “1”.
  • each gene was determined by extracting mRNA from peripheral blood using QIAamp RNA Blood Mini (manufactured by QIAGEN), removing the DNA by DNase treatment, and then obtaining 25 ng of the resulting mRNA and each primer and probe ( Using TaqMan Gene Expresion Assays from Applied Biosystems, cDNA was synthesized by faqMan Reverse 1'ranscription Reagents (Applied Biosystems), and ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) with human j8-actin as an internal standard ).
  • the primer for cig5 gene (900 nM at the final concentration) is 5'- GGTGCCTGAATCTAACCAGAAGA (SEQ ID NO: 4) and 5, -ACTTGGAAGGGTCCT TCCGT (SEQ ID NO: 5) are used as probes for cig5 gene (200 nM at final concentration), respectively (FAM) -ATGAATATATGCGCTTTCT- (MGB) (SEQ ID NO: 6) It was.
  • Each primer and probe of BCL2L1, IL18BP and GBP2 genes are 900nM ⁇ 200nM (TaqMan Gene Expression Assays Hs00236329_ml (BCL2L1), Hs00271720_ml (IL18BP), Hs00269759_ml (GBP2)) manufactured by Applied Biosystems. did.
  • As a probe for human j8-actin (NM001101) final concentration: 100 nM
  • (FAM) -CAGGCACCAGGGCGTGATGGT- (TAMRA) was used as a primer for human / 3-actin (200 nM each at final concentration).
  • FIG. 7 ⁇ On the day indicated by LO, blood of patient force was collected, and liver function test (concentration measurement of AST, ALT, and total bilirubin in blood) was also performed. The rejection diagnosis was performed by liver biopsy.
  • the expression levels of cig5 gene, BCL2L1 gene, IL18BP gene and GBP2 gene in peripheral blood increased earlier than when pathologically diagnosed as rejection in liver biopsy It became clear to do.
  • the expression of ci g5 gene, BCL2L1 gene, and IL18BP gene in peripheral blood was suppressed by steroid pulse therapy for the purpose of treating acute rejection. (See the expression level of each gene after the 25th day after transplantation).
  • the expression level of GBP2 gene in peripheral blood was found to be temporarily reduced by the steroid pulse therapy.
  • liver function tests showed that AST, ALT, and total bilirubin levels in the blood increased non-specifically, regardless of the pathologic rejection period.
  • genetic markers such as Bcl211, cig5 (Best5), I118bp (Igil p), Gbp2, etc. can be used for early diagnosis of rejection, determination of presence or absence of immune tolerance, rejection or tolerance It was suggested that it is useful for predicting the performance or as an index of the efficacy of the immunosuppressive agent.
  • a genetic marker capable of diagnosing rejection, evaluating the efficacy of an immunosuppressive agent, and determining the presence or absence of immune tolerance, and a gene marker as an index can be quickly and easily performed.
  • a method for diagnosing rejection, a method for evaluating the efficacy of an immunosuppressant, a method for identifying an immunosuppressant, a method for determining the presence or absence of immune tolerance, a kit, and a screening method for an immunosuppressant or an immune tolerance inducer. Can be provided.

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Abstract

【課題】拒絶反応の診断、免疫抑制剤の薬効の評価、及び免疫寛容の有無の判定を行うことができる遺伝子マーカー、並びに、遺伝子マーカーを指標として迅速かつ簡便に行うことができる、拒絶反応の診断方法、免疫抑制剤の薬効を評価する方法、免疫抑制剤の同定方法、免疫抑制剤の選択方法、免疫抑制剤の用量決定方法、免疫寛容の有無を判定する方法、キット、及び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法を提供すること。 【解決手段】拒絶反応により発現量が上昇し、免疫抑制剤により発現量が抑制された遺伝子を遺伝子マーカーとして同定した。その遺伝子マーカーの発現量を指標とすることにより、拒絶反応の診断、免疫抑制剤の薬効の評価、及び免疫寛容の有無の判定を迅速かつ簡便に行うことが可能になる。

Description

明 細 書
遺伝子マーカー及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子マーカー、並びに、拒絶反応の診断方法、免疫寛容の有無を判 定する方法、免疫抑制剤の薬効を評価する方法、免疫抑制剤の同定方法、キット、 及び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 重症臓器不全患者に対して、救命したり QOL (クォリティー 'ォブ'ライフ）を向上さ せたりする治療方法として臓器移植が行われて ヽるが、重篤な合併症である拒絶反 応により移植臓器が失われ、移植が成功しないことがある。そのため、拒絶反応に対 する早期対処を行うための、拒絶反応の迅速な診断方法や、拒絶反応の制御剤 (免 疫抑制剤）などの開発が求められている。
[0003] 臓器移植後の拒絶反応の診断方法としては、局所麻酔下の組織生検 (針生検)が 最も信頼性が高いとされているが、この方法は侵襲を伴い、患者に多大な負担を強 いるため、頻回の検査が不可能であり、また、施行には熟練した技術と十分な設備が 必要であるため、容易に行うことができない。現在では、針生検の代わりに、血液検 查（例えば、血中における WBC (白血球数）、 CRP (C reactive protein)、臓器障害 マーカー（AST (ァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ； GOT)、 ALT (アミノトランス フェラーゼ； GPT)、ピリルビン、 γ GTP (グアノシン三リン酸）、クレアチュン、又は Β UN (血中尿素窒素) )などの濃度の変化を測定する方法)や、ドップラー超音波検査 (血流量の観察)などの方法が用いられているが、これらの方法は補助的に過ぎず、 単独で拒絶反応の有無を診断することができない。そのため、針生検に代わって拒 絶反応の有無を診断するためのバイオマーカーの開発が求められている。
[0004] 従来、移植組織の拒絶反応を評価するためのバイオマーカーとして、パーフォリン ( perforin)、グランザィム B (granzymeB)、 Fasリガンドなどが見出されて!/、る（特表 200 1 517459号公報参照)。
[0005] 移植後、このような拒絶反応を抑制するため、移植患者に対し、免疫抑制剤が投与 される。現在、免疫抑制剤として、シクロスポリン (例えば、特許第 3382656号公報参 照）、 FK506 (タクロリムス;例えば、米国特許第 4894366号公報参照）などが用いら れているが、これらの免疫抑制剤は過剰な投与により感染などの副作用の危険性が 生じることから、免疫抑制剤の用法 (投与方法） '用量 (投与量や投与間隔)の厳密な 設定が必要不可欠となって 、る。
[0006] 免疫抑制剤の用量設定は、血中における薬物の濃度が有効血中濃度の範囲内で あるか否かをモニタリング（薬物血中濃度モニタリング： TDM (Therapeutic drug moni tiring)することにより行われている力 この有効血中濃度は経験的に設定されたもの であり、科学的に根拠がないため、必ずしも薬効の指標となっていない。
[0007] 一方、臓器移植後に、免疫抑制剤を必要としな!/、レベルにまで拒絶反応が低下し 、免疫抑制剤力 離脱できる患者が少数存在する。このような免疫寛容誘導が生じる のは、一つには、免疫抑制剤に免疫寛容誘導活性があるためであると考えられてい る。このように免疫寛容を獲得した患者においては、免疫抑制剤から離脱することが できるので、免疫抑制剤の長期投与に伴う、感染症や悪性腫瘍のリスクや臓器障害 などの副作用力も解放されることになる。そこで、近年、例えばナイーブ T細胞に発現 している CD28補助刺激分子を抗体や遺伝子組み換えタンパク質投与により阻害す るというような、人為的に免疫寛容を誘導する方法の開発が試みられている。あるい は、免疫抑制剤の投与方法を工夫したり、複数の免疫抑制剤を投与することにより、 免疫寛容を誘導することも試みられてきた (この場合、免疫抑制剤を免疫寛容誘導剤 としても用いていることになる。 ) o
[0008] しかしながら、免疫寛容の獲得の有無の判断は、免疫寛容の科学的な指標が無 、 ため正確に行うことができず、免疫寛容の獲得の有無を判断する際の免疫抑制剤投 与の中断には、常に拒絶の危険性を伴うという問題があった。そのため、免疫寛容の 有無を迅速かつ簡便に判定することができる方法の開発が求められている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、拒絶反応の診断、免疫抑制剤 の薬効の評価、及び免疫寛容の有無の判定を行うことができる遺伝子マーカー、並 びに、遺伝子マーカーを指標として迅速かつ簡便に行うことができる、拒絶反応の診 断方法、免疫抑制剤の薬効を評価する方法、免疫抑制剤の同定方法、免疫寛容の 有無を判定する方法、キット、及び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング 方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決すベぐ拒絶反応モデルラットを用い、急性拒絶反 応初期及び免疫抑制剤投与時の末梢血液中の遺伝子の発現パターンをマイクロア レイにより解析することにより、拒絶反応により発現量が上昇し、免疫抑制剤の投与に より発現量が抑制された遺伝子（Bcl211、 Best5、 Igilbp、 Gbp2など）を同定した。これら の遺伝子は、病理学的に拒絶が認められる時期より早く発現量が増加することから、 早期マーカーとして有用であることが明らかになった。このようにして、本発明者らは 本発明を完成するに至った。
[0011] すなわち、本発明に係る遺伝子マーカーは、拒絶反応の指標となるものであって、 前記遺伝子マーカーは、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ば れるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。前記遺伝子マーカーは 、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植による拒絶反応の指標となる。
[0012] また、本発明に係る遺伝子マーカーは、免疫寛容の指標となるものであって、前記 遺伝子マーカーは、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれる いずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。前記遺伝子マーカーは、例 えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫寛容の指標となる。
[0013] さらに、本発明に係る遺伝子マーカーは、免疫抑制剤の薬効の指標となるものであ つて、前記遺伝子マーカーは、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから 選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。前記遺伝子マーカ 一は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫抑制剤の薬効の指標と なる。
[0014] 本発明に係る拒絶反応の診断方法は、脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マ 一力一の発現量の変化を測定することにより、拒絶反応を診断する方法であって、前 記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選 ばれる ヽずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明に係る 拒絶反応の診断方法は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植による拒絶反応の 有無を調べることができる。
[0015] また、本発明に係る拒絶反応の診断キットは、血液中の遺伝子マーカーの発現量 の変化を測定するためのプライマー又は抗体を備え、前記遺伝子マーカーとしては 、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるいずれかの遺伝子 に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明に係る拒絶反応の診断キットは、 例えば、肝臓等の組織又は器官の移植による拒絶反応の有無を調べることができる
[0016] 本発明に係る免疫寛容の有無を判定する方法は、組織又は器官が移植された脊 椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定することにより 、免疫寛容の有無を判定する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループ力 選ばれるいずれかの遺伝子に関連す る遺伝子関連物質が用いられる。前記組織又は器官は、例えば、肝臓等である。
[0017] また、本発明に係る免疫寛容の有無を判定する方法は、組織又は器官が移植され た脊椎動物において、移植後投与されている免疫抑制剤の投与量を減少させるとと もに、前記脊椎動物力も採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリング し、前記投与量の減少に伴い、前記発現量の有意な変化が起こらず、前記免疫抑制 剤から離脱できた場合に免疫寛容が生じたと判定することを含んでなる。前記遺伝 子マーカーとしては、例えば、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから 選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質を用いることができる。前記 組織又は器官は、例えば、肝臓等である。
[0018] また、本発明に係る免疫寛容の有無を判定するキットは、血液中の遺伝子マーカ 一の発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体を備え、前記遺伝子マー カーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるいずれ かの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。本発明は、例えば、肝臓等の 組織又は器官の移植に対する免疫寛容の有無を判定するキットであってもよい。
[0019] 本発明に係る免疫抑制剤の薬効を評価する方法は、免疫抑制剤の使用による、血 液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定することにより、免疫抑制剤の薬効を 評価する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gb p2からなるグループ力 選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が 用いられる。本発明は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植に対する免疫抑制剤 の薬効を評価する方法であってもかまわな 、。
[0020] 本発明に係る免疫抑制剤の同定方法は、免疫抑制剤の投与を必要とする脊椎動 物において、有効な免疫抑制剤を同定する方法であって、前記脊椎動物に属する 複数の個体の各々において、等量の異なる免疫抑制剤を投与する前後で、前記個 体から血液を採取し、前記血液中の遺伝子マーカーの発現量を測定し、前記免疫 抑制剤を投与する前後で、前記個体力 採取した血液中の遺伝子マーカーの発現 量を比較し、前記免疫抑制剤の投与により、前記遺伝子マーカーの発現量が最も減 少した免疫抑制剤を同定すること、を含み、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 ci g5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループ力 選ばれるいずれかの遺伝子に関連する 遺伝子関連物質が用いられる。本発明は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植 に対する有効な免疫抑制剤を同定する方法であっても力まわない。
[0021] 本発明に係る免疫抑制剤の選択方法は、免疫抑制剤の投与を必要とする脊椎動 物個体において、複数の免疫抑制剤の各々について作成された、免疫抑制剤の使 用量又は血中濃度と、遺伝子マーカーの発現量との相関関係を示す検量線を用 Vヽ 、前記複数の免疫抑制剤の中から、前記免疫抑制剤を必要とする個体に対して最も 有効な免疫抑制剤を選択する方法であって、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループ力 選ばれるいずれかの遺伝子に関連す る遺伝子関連物質が用いられる。前記個体は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移 植を受けて 、るものであることが好まし 、。
[0022] 本発明に係る免疫抑制剤の用量決定方法は、免疫抑制剤の投与を必要とする疾 患又は拒絶反応を伴う脊椎動物において、前記脊椎動物から血液を採取し、前記血 液中における遺伝子マーカーの発現量を測定し、あら力じめ作成した、免疫抑制剤 の使用量又は免疫抑制剤の血中濃度と、遺伝子マーカーの発現量との相関関係を 示す検量線を用いて、前記脊椎動物の血液中における遺伝子マーカーの発現量を 、所定の発現量まで減少させるために必要な免疫抑制剤の用量を決定する方法で あって、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグル 一プカも選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いられる。前 記個体は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植を受けているものであることが好 ましい。
[0023] また、本発明に係る免疫抑制剤の薬効を評価するためのキットは、免疫抑制剤の 使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー 又は抗体を備え、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2から なるグループ力も選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質が用いら れる。前記免疫抑制剤は、例えば、肝臓等の組織又は器官の移植後に使用するもの であってもかまわない。
[0024] さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、免疫抑制剤のスクリーニング方法であ つても、免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法であってもよぐ組織又は器官を移植 することにより免疫拒絶を生じる脊椎動物に対して被検物質を投与する工程と、前記 脊椎動物から血液を採取する工程と、前記血液中における遺伝子マーカーの発現 量をモニタリングする工程とを含み、前記遺伝子マーカーとしては、 Bcl211、 dg5、 1118 bp、及び Gbp2からなるグループ力 選ばれる 、ずれかの遺伝子に関連する遺伝子 関連物質を用いることができる。前記組織又は器官は、例えば、肝臓等である。
[0025] 本発明に係る拒絶反応の抑制方法は、免疫抑制剤の血中濃度をモニタリングしな がら、遺伝子マーカーの発現量を測定し、所定値になるまで免疫抑制剤又は免疫寛 容誘導剤を投与することを特徴とする。これにより、組織又は器官の移植により生じる 拒絶反応を有効に抑制することが可能になる。
[0026] また、本発明に係る免疫疾患の改善又は治療方法は、免疫抑制剤の血中濃度を モニタリングしながら、遺伝子マーカーの発現量を測定し、所定値になるまで免疫抑 制剤又は免疫寛容誘導剤を投与することを特徴とする。これにより、自己免疫性疾患 、アレルギー性疾患、アトピー性疾患、リウマチ性疾患、花粉症などの免疫疾患を有 効に改善又は治療することが可能になる。
[0027] なお、本発明において「遺伝子マーカー」とは、ある対象物の状態又は作用の評価 の指標となるものであって、ここではある遺伝子の発現量と相関するときの遺伝子関 連物質をいう。例えば、遺伝子それ自体、転写物である mRNA、翻訳物であるぺプ チド、遺伝子発現の最終産物であるタンパク質などが含まれる。「遺伝子マーカーの 発現量」とは、遺伝子マーカーが遺伝子以外の場合は、遺伝子マーカーの由来する 遺伝子の転写レベル (マーカーが転写物などの場合)または翻訳レベルにおける発 現量 (マーカーがポリペプチド、タンパク質などの場合)を意味する。なお、上記各遺 伝子は、その由来となる生物種について限定されず、そのホモログ (homolog)ゃォー ソログ（ortholog)もすベて含むものとする。また、本発明において脊椎動物とは、ヒト および、ヒト以外のマウス、ラットなどの脊椎動物を意味する。
[0028] '関連文献とのクロスリファレンス
本願は、 2005年 1月 13日付けで出願した日本国特願 2005-6728号に基づく優先権 を主張する。この文献を本明細書に援用する。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1]本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の 7P ODにおける遺伝子マーカー（Best5及び Bcl211)の発現量を示す図である。
[図 2]本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の血 液中における遺伝子マーカー（Best5)の発現量の経時変化を示す図である。
[図 3]本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の血 液中における遺伝子マーカー（Bcl211)の発現量の経時変化を示す図である。
[図 4]本発明にかかる一実施例にお!、て、 3PODまでのデータのうち最も高 、遺伝子（ Best5)発現量を示した値をピックアップし、各群の平均値を調べた結果を示す図で ある。
[図 5]本発明にかかる一実施例にお!、て、 3PODまでのデータのうち最も高 、遺伝子（ Bcl211)発現量を示した値をピックアップし、各群の平均値を調べた結果を示す図で ある。
[図 6]本発明にかかる一実施例において、非拒絶群、免疫抑制群、及び拒絶群の 5P
ODにおける遺伝子マーカー（Igilbp及び Gbp2)の発現量を示す図である。
[図 7]本発明にかかる一実施例にお!ヽて、生体肝移植症例における急性拒絶時の d g5遺伝子の発現変動 (上図)及び肝機能検査値 (下図)を示す図である。
[図 8]本発明にかかる一実施例にお!、て、生体肝移植症例における急性拒絶時の B
CL2L1遺伝子の発現変動 (上図)及び肝機能検査値 (下図)を示す図である。
[図 9]本発明にかかる一実施例にお!ヽて、生体肝移植症例における急性拒絶時の IL
18BP遺伝子の発現変動 (上図)及び肝機能検査値 (下図)を示す図である。
[図 10]本発明にかかる一実施例にお!ヽて、生体肝移植症例における急性拒絶時の
GBP2遺伝子の発現変動 (上図)及び肝機能検査値 (下図)を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0030] 以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳 細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、 J. Sambrook, E . F. Frits ch & T. Maniatis (Εα. , Molecular cloning, a laboratory manual \0ra edition ), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロ トコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、 市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それら に添付のプロトコルを用いる。
[0031] なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、 当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を 再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発 明の好まし 、実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されて 、るので あって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発 明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾がで きることは、当業者にとって明らかである。
[0032] = =遺伝子マーカーの有用性 = =
本発明の遺伝子マーカーは、拒絶反応や免疫抑制剤の投与により発現が変化す る、遺伝子に関連する遺伝子関連物質である。例えば、遺伝子マーカーが、 Bcl211、 cig5、 I118bp、及び Gbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質 である場合、それら遺伝子マーカーの発現量は、針生検などによって病理学的に診 断される拒絶が生じる前に血液中にぉ 、て増加し、免疫抑制剤により血液中にぉ 、 て減少する。従って、本発明に係る遺伝子マーカーは、拒絶反応の早期マーカー（ 指標）として有用であり、免疫寛容の指標としてあるいは免疫抑制剤の薬効の指標と しても有用である。また、本発明に係る遺伝子マーカーの発現量は、拒絶反応の程 度及び免疫抑制剤の用量及び血中濃度によって変化するものと考えられる。このこと から、これらの遺伝子マーカーの発現量は、拒絶反応の程度及び免疫抑制剤の用 量及び血中濃度に対して相関関係を有するのではないかと考えられる。なお、遺伝 子マーカーの発現量と拒絶反応または免疫抑制剤は、逆の相関であってもよい。
[0033] また、複数の遺伝子マーカーを用いて、総合的に拒絶反応の早期診断を行ったり 、免疫抑制剤の薬効の指標としたり、免疫寛容の有無を判定したりしてもよぐその場 合、より精密に拒絶反応を診断でき、より厳密に薬効を評価でき、より正確に免疫寛 容の有無を判定できることが期待される。
[0034] また、血液中の遺伝子マーカーを用いることにより、血液をサンプルとして用いるこ とができるため、遺伝子マーカーの発現量を定期的に簡便に測定することができる。 これは、病理学的に診断される拒絶が生じる前に拒絶反応が起こるかどうかの診断 を迅速に行うことを可能にする。この早期診断は、拒絶反応に対して早期に対処する ことができるようになるため、移植した組織又は器官の拒絶反応による障害を最小限 に抑えることができ、非常に重要である。また、血液サンプルの取得は、針生検に比 ベて侵襲が少なぐ針生検のような高度な技術も必要としないので、簡便に行うことが できる。同様に、血液をサンプルとして用いることから、本発明に係る薬効の評価や 免疫寛容の診断も、迅速、頻回、且つ簡便に行うことができる。
[0035] = =遺伝子マーカーの定量 = =
本実施の形態において、遺伝子マーカーが遺伝子または遺伝子の転写物 (mRNA )である場合、遺伝子マーカーの発現量の測定 (定量）は、例えば、ノーザンプロット 法、ドットブロット法、定量的 RT—PCR (quantitative reverse transcription— polymerase chain reaction)法などによって mRNA量を測定することにより行うことができる力 微量 の RNA (血液から単離）を用いて mRNA量を測定することができる点で定量的 RT-PC R法を用いて行うことが好まし 、。
[0036] 定量的 RT-PCR法に用いるプライマーとしては、遺伝子マーカーを特異的に検出 することができるものであれば特に制限されるものではないが、 12〜26塩基からなる オリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、対象となる脊椎動物の Bcl211 (BCL 2— like 1)、 cig5 (另 U名 R¾AD2 (Radical ¾— adenosyl metnionine domain containing 2)；フ ットでは Best5)、 I118bp (lnterleukin 18 binding protein;フットでは Igilbp (Interferon ga mma inducing factor binding protein) )、及び Gbp2 (Guanylate binding protein 2)の 各遺伝子の配列情報に基づいて決定する。そして、決定した配列を有するプライマ 一を、例えば、 DNA合成機を用いて作製することができる。具体的には、例えば、動 物がヒトである場合には、 NM001191及びNM138578 (BCL2Ll)、NM080657 (cig5)、N M005699及び NM173042〜NM173044 (IL18BP)、 NM004120 (GBP2)で登録されて!ヽ る配列情報に基づいてプライマーを作製することができ、動物がラットである場合に は、 NM031535 (Bcl211)、 NM138881 (Best5)、 NM053374 (Igilbp)、 NM133624 (Gbp2) で登録されて 、る配列情報に基づ 、てプライマーを作製することができる。
[0037] 一方、遺伝子マーカーが遺伝子の翻訳物（ポリペプチド)又は最終産物（タンパク 質)である場合、例えば、遺伝子マーカーに対して特異的なポリクローナル抗体、モ ノクローナル抗体等を用いたウェスタンブロット法や ELISA法などによって遺伝子マ 一力一の発現量の測定を行うことができる力 S、これらの方法に限定されるものではなく
、 RIA (radioimmunoassay ^ 射免 測定法)、 EIA (enzyme immunoassay ^酵素免 疫法)等、様々な手法を用いることができる。以下、ポリクローナル抗体を用いた ELI SA法を例に挙げて遺伝子マーカーの発現量の測定について説明する。
[0038] 脊椎動物力 採取した血液をホモジナイズした後、超音波処理を行!、、遠心分離し て上清を回収し、タンパク質を含む粗抽出液を得る。その後、遺伝子マーカーに対し て特異的に結合するポリクローナル抗体を吸着させた ELISAプレート（例えば 96穴プ レートを用いたもの）を用いて、タンパク質の粗抽出液をプレートのゥエルに入れて遺 伝子マーカーと反応させ、引き続き一次抗体及び二次抗体 (例えば、酵素で標識さ れた抗免疫グロブリン抗体など）とそれぞれ反応させる。反応後、 ELISAプレートを洗 浄し、酵素に対する基質を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーにより吸光度を 測定し、あら力じめ作成した検量線を用いてタンパク質の発現量を定量する。このよう にして、遺伝子マーカーの発現量を測定することができる。なお、二次抗体の標識と して用いられている酵素としては、例えば、西洋ヮサビ由来のペルォキシダーゼ (HR P)、アルカリホスファターゼなどを挙げることができる力 これらに限定されるものでは ない。
[0039] = =拒絶反応の診断方法 = =
このような遺伝子マーカーを用いれば、例えば、組織又は器官を移植した脊椎動 物から採取した血液における遺伝子マーカーの発現量を定期的に測定し、組織又 は器官の移植前に採取した血液における遺伝子マーカーの発現量と比較することに より、拒絶反応の診断を初期段階力も行うことが可能になる。即ち、遺伝子マーカー の発現量を測定した結果、移植後の遺伝子マーカーの発現量が移植前と比べて有 意に変化している力、または経時的に有意に変化している場合、拒絶反応が起こつ ている又は拒絶反応の可能性有りと判断される。例えば、遺伝子マーカーが、 Bcl211 、 cig5 (Best5)、 I118bp (Igilbp)、及び Gbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連す る遺伝子関連物質である場合、その発現量が移植前と比べて有意に増カロしているか 、または経時的に有意に増加傾向にある場合、そのように判断される。一方、移植後 の遺伝子マーカーの発現量が移植前のものと比べて有意に増加して 、な 、場合に は、拒絶反応が起こっていないと判断される。なお、診断対象となる脊椎動物として は、例えば、ヒトでもよく、マウス、ラット等のヒト以外の脊椎動物でもよい。
[0040] = =免疫抑制剤の薬効の評価方法 = =
上述したように、本発明に係る遺伝子マーカーの発現量は、拒絶反応の指標として のみならず、免疫抑制剤の薬効を評価する際の指標として有用である。遺伝子マー カーの発現量を測定することにより、免疫抑制剤の薬効を評価することが可能になれ ば、個々の疾患に対して科学的根拠に基づく免疫抑制剤の投与方法を容易に決定 することができる。例えば、少ない使用量で効果が得られ、副作用の少ない免疫抑制 剤又はその投与方法の選択などを行うことができるようになる。
[0041] なお、免疫抑制剤の対象疾患は、拒絶反応以外にも、自己免疫性疾患、アレルギ 一性疾患 (アレルギー性皮膚炎、アトピー性疾患、花粉症などを含む）、リウマチ性疾 患等の免疫疾患がある。
[0042] また、免疫抑制剤としては、移植後の生体の拒絶反応などの異常免疫反応を抑制 する薬剤、各種疾患にぉ 、て免疫を抑制する薬剤などであればどのようなものでもよ く、例えば、ステロイド剤（プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなど）、 IL-2の抗体、 IL -2分泌抑制剤（ラパマイシン等）、シクロスポリン若しくは FK506 (タクロリムス又はプロ グラフともいう）などの CN抑制剤、代謝拮抗薬（ミコフエノール酸モフエチル）、シクロ ホスフアミド、 OKT3 (ムロモナブ CD3ともいう）、抗リンパ球グロブリン (抗胸腺細胞免 疫グロブリン）、抗 CD4抗体、抗 TNF— α抗体、ァザチォプリン、ミゾリビン、スルファ サラジン、 6—メルカプトプリン（6— MP)、メソトレキサート、サイトキサゾン、塩酸ダス ペリムス、又はこれらの薬剤の組み合わせなどを挙げることができる。
[0043] = =免疫抑制剤の投与方法の決定 = =
前記疾患に罹患したり、移植手術を受けたりした後、免疫抑制剤を投与された脊椎 動物個体に対して、免疫抑制剤の投与量又は免疫抑制剤の血中濃度をモニタリン グしながら、動物の血中（又は末梢血液）における遺伝子マーカーの発現量を測定し 、遺伝子マーカーの発現量が所定値になる（例えば、正常値との差の 2割程度にま で減少する)まで免疫抑制剤を投与することにより、上記免疫疾患の改善又は治療 や、拒絶反応の抑制を、最小限の免疫抑制剤の使用によって行うことが可能になる。 これにより、免疫抑制剤の過剰使用による感染症などの副作用を有効に予防するこ とができる。なお、免疫抑制剤の最初の投与には、例えば、以下に述べる検量線によ り設定された最小限の免疫抑制剤の用量を用いることが考えられる。
[0044] = =検量線の作成とその応用 = =
免疫抑制剤を投与された脊椎動物個体に対して、遺伝子マーカーの発現量と、免 疫抑制剤の用量又は血中濃度との相関を示す検量線を作成すると、様々な面から、 この免疫抑制剤の有効性を評価することができるようになる。
[0045] 例えば、複数の免疫抑制剤の検量線を作成し、最も少量で遺伝子マーカーの発現 量が正常値になる免疫抑制剤や、副作用が生じる量と遺伝子マーカーの発現量が 正常値になる量を比較した時その量の差が最も大きい免疫抑制剤を選択することに より、免疫疾患や拒絶反応を伴う各種脊椎動物に対して、最も有用な免疫抑制剤を 選択することが可能となる。
[0046] また、免疫抑制剤の複数の投与方法に対し、同様に作成した検量線を用いること により、最も有効な投与方法を選択することも可能となる。なお、免疫抑制剤の投与 方法としては、例えば、患部、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内等の注射による投与、 経口投与、塗布や貼付等による非経口投与などが挙げられる。
[0047] さらに、免疫抑制剤を必要とする、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、アトピー 性疾患、リウマチ性疾患、花粉症などの免疫疾患や、拒絶反応を伴う動物に対して、 同様に検量線を用い、各疾患に対する免疫抑制剤の最適投与量を設定することも 可能になる。例えば、ある患者や患畜に対し、免疫抑制剤を投与する前の遺伝子マ 一力一の発現量に対し、正常な遺伝子マーカーの発現量との差を算出し、所定の割 合だけ遺伝子マーカーの発現量を減少させられるような免疫抑制剤の投与量を決定 することができる。
[0048] = =免疫寛容の有無の判定方法 = =
本発明にかかる免疫寛容の有無を判定する方法によると、組織又は器官が移植さ れた脊椎動物力 採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するこ とにより、免疫寛容の有無を判定することができる。
[0049] 免疫寛容の有無の判定方法の一例として、組織又は器官を移植した脊椎動物に 対して免疫抑制剤の投与量を減少させるとともに、当該脊椎動物から採取した血液 中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングする方法を挙げることができる。即ち、 遺伝子マーカーの発現量を測定した結果、免疫抑制剤の投与量の減少に伴って遺 伝子マーカーの発現量が、拒絶反応を起こしていると判定されるのと同様な変化を 示す場合は免疫寛容が生じて!/、な 、と判定し、免疫抑制剤の投与量が減少しても遺 伝子マーカーの発現量の有意な変化が起こらず、免疫抑制剤から離脱できた場合 に免疫寛容が生じたと判定する。例えば、遺伝子マーカーが、 Bcl211、 cig5 (Best5)、 I 118bp (lgilbp)、及び Gbp2から選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物 質である場合には、免疫抑制剤の投与量の減少に伴って遺伝子マーカーの発現量 が増加する場合は免疫寛容が生じて 、な 、と判定し、免疫抑制剤の投与量が減少 しても遺伝子マーカーの発現量の有意な増加が起こらず、免疫抑制剤から離脱でき た場合に免疫寛容が生じたと判定する。
[0050] 以上のように、免疫寛容の有無を判定することにより、本来は必要のない免疫抑制 剤の投与を中断することが可能となり、免疫抑制剤の長期投与に伴う感染のリスクや 免疫抑制剤の副作用を回避することができるようになる。なお、診断対象となる脊椎 動物としては、例えば、ヒトでもよく、マウス、ラット等のヒト以外の脊椎動物でもよい。
[0051] また、本発明にかかる免疫寛容の有無の判定方法は、免疫寛容誘導方法の開発 や免疫寛容誘導剤のスクリーニングの際にも利用できる。
[0052] 例えば、マウス、ラット等の脊椎動物に対して組織又は器官を移植して、被検物質 を投与するか、または被検方法で処理し、その後、血液を採取して遺伝子マーカー の発現量をモニタリングする。多数の被検物質ゃ被検方法に対し、この方法を繰り返 し行うことにより、免疫抑制剤や免疫抑制方法のスクリーニングだけでなぐ免疫寛容 誘導剤や免疫寛容誘導方法のスクリーニングを行うことができる。
[0053] 例えば、免疫寛容誘導剤としては、免疫寛容を誘導する対象となるペプチドの部分 ペプチドを投与することにより、 T細胞脱感作し得るが、その際、様々な部分ペプチド をスクリーニングし、有効な部分ペプチドを選択できる。また、補助シグナル経路であ る ICOS/B7h経路、 CD28-CTLA4/B7経路を選択的に阻害する化合物に対するスク リー-ング法などにも用いることができよう。また、組織又は器官を移植した脊椎動物 に対して、例えば、 1又は 2種以上の免疫抑制剤を投与するなど、投与する免疫抑制 剤の使用形態や投与方法を変化させて免疫抑制剤を投与し、前記脊椎動物から採 取した血液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングすることにより、有効な免疫 寛容誘導方法を開発することができる。
[0054] なお、前記遺伝子マーカーとしては、例えば、 Bcl211、 cig5 (Best5)、 I118bp (Igil p) 、及び Gbp2力も選ばれるいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質を用いるこ とができる。また、脊椎動物としては、例えば、マウス、ラット等の脊椎動物を用いるこ とがでさる。
[0055] = = =キット = = =
本発明に係るキットは、遺伝子マーカーの発現量を測定するための試薬又は器具 が含まれていればどのようなものでもよぐ例えば、定量的 RT- PCR法に用いられるプ ライマーや試薬、ウェスタンブロット法や ELISA法に用いられる抗体などが挙げられる 。その他、血液から RNAを単離するための試薬、遺伝子マーカーに対するハイブリダ ィゼーシヨン用プローブ、酵素 ·蛍光物質 '放射性物質などにより標識された抗免疫 グロブリン二次抗体、前記酵素に対する基質などを含ませることとしてもよい。なお、 酵素としては、例えば、西洋ヮサビ由来のペルォキシダーゼ（HRP)、アルカリホスファ ターゼなどを用いることができ、蛍光物質としては、 Cy2、 FluorX、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、 Cy7、 FITC (イソチォシアン酸フルォレセイン）、ローダミンなどを用いることが でき、放射性物質としては、例えば、 3H、 32P、 35S、 mI、 125Iなどを用いることができる。
[0056] 前記プライマーとしては、 Bcl211、 cig5 (Best5)、 I118bp (Igil p)、及び Gbp2からなる 群力も選ばれる 1又は 2以上の遺伝子に対するプライマーを挙げることができる。また 、前記抗体としては、例えば、 Bcl211、 cig5 (Best5)、 I118bp (Igilbp)、及び Gbp2などの 遺伝子マーカー（ポリペプチド又はタンパク質）に対して特異的に反応するポリクロー ナル抗体やモノクローナル抗体などを用いることができる。なお、本発明に係るキット は、 1又は 2種以上の抗体が含まれて 、ることとしてもよ 、。
実施例
[0057] 以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。
[0058] [実施例 1]
Lewis系ラットをドナーとし、同種同系（Lewis系）ラットをレシピエントとして同所性肝 移植を施行した (非拒絶群; n= 3)。また、 BN系ラットをドナーとし、同種異系（Lewis 系）ラットをレシピエントとして同所性肝移植を施行した 6匹のうち、 3匹のラット (免疫 抑制群; n= 3)に対して、移植当日（0日目）にシクロスポリン (ノルパテイスファーマ株 式会社製;生理食塩水に溶解)を体重 lkg当たり 3 mg筋肉内注射し、その後、毎日、 同量のシクロスポリンを筋肉内注射した。残りの 3匹には、免疫抑制剤を投与しなかつ た（拒絶群； n= 3)。なお、上記 2系統のラットは、 8〜10週齢、体重 200-300gの雄性 のものを使用した。
[0059] 病理学的に拒絶反応が認められる移植後 7日目（7POD)に、非拒絶群、拒絶群、 及び免疫抑制群の各群 3個体を開腹し、下大静脈より末梢血液 (約 5 ml)を採取した 。その後、 QIAamp RNA Blood Mini (QIAGEN社製）を用いて mRNAを抽出し、 DNase 処理により DNAを除去した。得られた末梢血液中の mRNA 20 μ gを用いて、 Label Sta r Array kit (QIAGEN社製）により Cy5色素でラベル化した cDNAを得た。この cDNAを Atlas Glass Rat 3.8 I Microarray (BD Biosciences Clontech社製）とハイブリダィズさ せ、 Axon GenePix4000A (Axon Instruments社製）を用いて GenePix Pro3.0 Microarr ay analysis software (Axon Instruments社製)によりマイクロアレイをスキャンし、テー タを解析した (グローバル補正)。その結果、非拒絶群又は免疫抑制群と比較して拒
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、て著しく発現量が増加して 、た遺伝子 (Bcl211及び Best5)を選択した。
[0060] ここで選択された各遺伝子に関し、厳密に発現量の変化を調べるため、 mRNAの定 量を行った。なお、 Bcl211及び Best5の mRNAの定量は、抽出した mRNA 25ng並びに 各プライマー及びプローブ（それぞれ最終濃度で 900nM、 200nM ; Applied Biosystem s社製の TaqMan Gene Expression Assays Rn00580568— gl(Bcl211)又は Rn00594081— ml(Best5)を使用)を用 ヽて、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosy stems社製）により cDNAを合成し、ラット β—ァクチンを内部標準として ABI PRISM 79 00HT (Applied Biosystems社製）を用いて行った。なお、ラット j8—ァクチン（NM0311 44)のプローブ（(VIC)- CCATCACACCCTGGTGCC- (MGB)；配列番号 1)及びプラ イマ一（5 ' - GCCGTCTTCCCCTCCAT (配列番号 2)及び 5 ' - AGGAGTCCTTCTGA CCCATACC (配列番号 3) )の最終濃度はそれぞれ 100nM及び 200nMとした。また、 この mRNAの定量解析にぉ 、ては、手術前の遺伝子マーカーの発現量を基準として (「1」として）、手術後の遺伝子マーカーの発現量を Δ A Ct法により相対的に定量し た。
[0061] その結果、図 1に示すように、病理学的に拒絶と判断される 7PODにおいて、 Bcl211 や Best5の mRNAの発現量は、同所性肝移植により引き起こされた拒絶反応により上 昇し、免疫抑制剤の投与により抑制することが明らかになった。
[0062] [実施例 2]
実施例 1により得られた遺伝子が、拒絶反応又は免疫抑制剤の薬効の指標となる 力どうかを調べるため、非拒絶群 (n= 7)、拒絶群 (n= 5)、免疫抑制群 (n= 5)の各 ラットの頸静脈から、肝移植前、及び移植後 6日後まで毎日、血液 200 μ 1を採取し、 移植後 7日目にラット個体を開腹し、下大静脈より血液を 200； ^採取して、遺伝子マ 一力一（Best5及び Bcl211)の発現量を測定した。なお、遺伝子マーカーの発現量は、 実施例 1に記載の方法と同様に末梢血液力 mRNAを採取し、 mRNAの定量を行うこ とにより測定した。
[0063] 図 2 (Best5の結果)及び図 3 (Bcl211の結果）に示すように、免疫抑制群では、拒絶 群に比べて遺伝子マーカーの発現量が抑制され、非拒絶群のものと同等又はそれ 以下の発現量まで抑制するのに対し、拒絶群では、拒絶と診断される 7PODよりも早 期（2POD〜3POD)に遺伝子マーカー Best5および Bcl211の発現量が上昇することが 明らかになった。このことから、 Best5や Bcl211は拒絶反応の早期マーカーとなりうるの ではないかと考え、 3PODまでのデータのうち最も高い遺伝子発現を示した日の発現 量をピックアップし、各群の平均値を得た。図 4 (Best5の結果)及び図 5 (Bcl211の結 果）に示すように、 Best5、 Bcl211ともに、拒絶群では、肝移植後 3日までに発現量の上 昇が認められ、拒絶反応の早期マーカーとなりうることが示された。
[0064] [実施例 3]
次に、 Lewis系ラットをドナーとし、同種同系（Lewis系）ラットをレシピエントとして同 所性肝移植を施行した (非拒絶群; n= 3)。また、 ACI系ラットをドナーとし、同種異系 (Lewis系）ラットをレシピエントとして同所性肝移植を施行した 6匹のうち、 3匹のラット (免疫抑制群; n= 3)に対して、移植当日（0日目）にタクロリムス (藤沢薬品工業社製 ；生理食塩水に溶解)を体重 lkg当たり 0.64 mg筋肉内注射し、その後、毎日、同量の タクロリムスを筋肉内注射した。残りの 3匹には、免疫抑制剤を投与しなかった (拒絶 群； n= 3)。なお、上記 2系統のラットは、 8〜10週齢、体重 200-300gの雄性のものを 使用した。
[0065] 拒絶反応の兆候が見られる移植後 5日目に、非拒絶群、拒絶群、及び免疫抑制群 の各群 3個体の頸静脈力 末梢血液 (約 200 1)を採取した。その後、 QIAamp RNA Blood Mini (QIAGEN社製）を用いて mRNAを抽出し、 DNase処理により DNAを除去し た。得られた末梢血液中の mRNA 5 μ gを用いて、 Rat Expression Array 230A(Afiym etrix社製）のプロトコルに従ってハイブリダィズさせ、スキャンし、データを解析した（ グローバル補正)。その結果、非拒絶群又は免疫抑制群と比較して拒絶群において 著しく発現量が増加して!/、た遺伝子 (Igil p及び Gbp2)を選択した。 [0066] これらの遺伝子が、拒絶反応又は免疫抑制剤の薬効の指標となるかどうかを調べ るため、非拒絶群 (n= 6)、拒絶群 (n= 5)、免疫抑制群 (n= 3)の各ラットの頸静脈 から、肝移植前、及び移植後 7日後まで毎日、末梢血液 200 μ 1を採取して、 Igil p及 び Gbp2の mRNAの発現量を測定した。なお、 mRNAの発現量は、末梢血液から抽出 した mRNA 25ng並びに各プライマー及びプローブ（それぞれ最終濃度で 900nM、 200 nM ; Applied Biosystems社製の TaqMan uene Expression Assays Rn00584495_gl(Igif bp)又は Rn00592467— ml(Gbp2)を使用）を用いて、 TaqMan Reverse Transcription Re agents (Applied Biosystems社製）により cDNAを合成し、実施例 1に記載のようにラット β—ァクチンを内部標準として ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems社製）を用い て定量した。なお、この mRNAの定量解析においては、手術前の遺伝子マーカーの 発現量を基準として（「1」として）、手術後の遺伝子マーカーの発現量を Δ A Ct法に より相対的に定量した。
[0067] その結果、病理学的に拒絶と診断される 7PODより 2日早い 5PODにおいて、 Igilbp や Gbp2の mRNAの発現量が、同所性肝移植により引き起こされた拒絶反応により上 昇し、免疫抑制剤の投与により抑制することが明らかになった（図 6参照)。
[0068] [実施例 4]
次に、 ABO · Rhが適合した肝臓を移植した先天性胆道閉鎖症の患者 (13歳；男性； 37kg)に対して、図 7〜10に示される日に、シクロスポリンを投与する前に肘静脈から 末梢血液 (約 200 μ 1)を採取し、肝移植による末梢血液中の cig5遺伝子（RSAD2 (NM 080657)；ラット Best5遺伝子の相同遺伝子）、 BCL2L1遺伝子、 IL18BP遺伝子（ラット1 gil p遺伝子の相同遺伝子）、及び GBP2遺伝子の発現量の変化をそれぞれ調べた。 なお、各遺伝子の発現量は、 QIAamp RNA Blood Mini (QIAGEN社製）を用いて末梢 血液から mRNAを抽出し、 DNase処理により DNAを除去した後、得られた mRNA 25ng 並びに各プライマー及び各プローブ（Applied Biosystems社製の TaqMan Gene Expr ession Assaysを用 ヽて、 faqMan Reverse 1'ranscription Reagents (Applied Biosystem s社製）により cDNAを合成し、ヒト j8—ァクチンを内部標準として ABI PRISM 7900HT ( Applied Biosystems社製）を用いて行った。
[0069] なお、 cig5遺伝子に対するプライマー（最終濃度でそれぞれ 900 nM)としては、 5 ' - GGTGCCTGAATCTAACCAGAAGA (配列番号 4)及び 5， -ACTTGGAAGGGTCCT TCCGT (配列番号 5)を、 cig5遺伝子に対するプローブ (最終濃度で 200 nM)として は、 (FAM)-ATGAATATATGCGCTTTCT-(MGB) (配列番号 6)をそれぞれ用いた。
BCL2L1遺伝子、 IL18BP遺伝子および GBP2遺伝子の各プライマー及びプローブは 、それぞれ最終濃度で 900nMゝ 200nM (Applied Biosystems社製の TaqMan Gene Exp ression Assays Hs00236329_ml (BCL2L1)、 Hs00271720_ml (IL18BP)、 Hs00269759_ ml (GBP2) )とした。また、ヒト j8—ァクチン (NM001101)に対するプローブ (最終濃度 で 100nM)としては、 （FAM)- CAGGCACCAGGGCGTGATGGT- (TAMRA) (配列番 号 7)を、ヒト /3ーァクチンに対するプライマー（最終濃度でそれぞれ 200nM)としては 、 5， -GCCGCCAGCTCACCAT (配列番号 8)及び 5， - AGGAATCCTTCTGACCCA TGC (配列番号 9)をそれぞれ用いた。さらに、この mRNAの定量解析においては、 B D qPCR Human Reference cDNA(BD Biosciences社製）をコントロールとして各遺伝 子の発現量を Δ A Ct法により相対的に定量した。
[0070] また、図 7〜： LOに示される日に患者力 血液を採取し、肝機能検査 (血中における AST, ALT,及び総ビリルビンの濃度測定)も行った。なお、拒絶診断は肝生検によ り行った。
[0071] 図 7〜10に示すように、末梢血液中の cig5遺伝子、 BCL2L1遺伝子、 IL18BP遺伝 子および GBP2遺伝子の発現量は、肝生検で病理学的に拒絶と診断される時期より 早く上昇することが明らかになった。また、病理学的に拒絶が認められた移植後 23日 目に、急性拒絶の治療目的に行われたステロイドパルス療法により、末梢血液中の ci g5遺伝子、 BCL2L1遺伝子、及び IL18BP遺伝子の発現が抑制されることが明らかに なった (移植後 25日目以降の各遺伝子の発現量を参照)。これに対して末梢血液中 の GBP2遺伝子は、上記ステロイドパルス療法により発現量が一時的に減少すること が明らかになった。さらに、肝機能検査では、病理学的に拒絶が認められる時期とは 関連せず、非特異的に血中における AST、 ALT,及び総ビリルビンの濃度が上昇 することがわかった。
[0072] 以上の実施例から、 Bcl211、 cig5 (Best5)、 I118bp (Igil p)、 Gbp2等の遺伝子マーカ 一は、拒絶反応の早期診断、免疫寛容の有無の判定、拒絶反応又は免疫寛容の可 能性の予測、又は免疫抑制剤の薬効の指標として有用であることが示唆された。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、拒絶反応の診断、免疫抑制剤の薬効の評価、及び免疫寛容の 有無の判定を行うことができる遺伝子マーカー、並びに、遺伝子マーカーを指標とし て迅速かつ簡便に行うことができる、拒絶反応の診断方法、免疫抑制剤の薬効を評 価する方法、免疫抑制剤の同定方法、免疫寛容の有無を判定する方法、キット、及 び免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 拒絶反応の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー
[2] 拒絶反応の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする遺伝子マーカー。
[3] 肝移植による拒絶反応の指標となる遺伝子マーカーであることを特徴とする請求項
1又は 2に記載の遺伝子マーカー。
[4] 免疫寛容の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー
[5] 免疫寛容の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする遺伝子マーカー。
[6] 肝移植に対する免疫寛容の指標となる遺伝子マーカーであることを特徴とする請 求項 4又は 5に記載の遺伝子マーカー。
[7] 免疫抑制剤の薬効の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー
[8] 免疫抑制剤の薬効の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする遺伝子マーカー。
[9] 肝移植に対する免疫抑制剤の薬効の指標となる遺伝子マーカーであることを特徴 とする請求項 7又は 8に記載の遺伝子マーカー。
[10] ヒト以外の脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定 することにより、拒絶反応を診断する方法であって、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする拒絶反応の診 断方法。
[11] ヒト以外の脊椎動物から採取した血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定 することにより、拒絶反応を診断する方法であって、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする拒絶反応の診断方法。
[12] 肝移植による拒絶反応を診断する方法であることを特徴とする請求項 10又は 11に 記載の拒絶反応の診断方法。
[13] 血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体 を備え、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする拒絶反応の診 断キット。
[14] 血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体 を備え、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする拒絶反応の診断キット。
[15] 肝移植による拒絶反応を診断するキットであることを特徴とする請求項 13又は 14に 記載の拒絶反応の診断キット。
[16] 組織又は器官が移植されたヒト以外の脊椎動物力も採取した血液中の遺伝子マー カーの発現量の変化を測定することにより、免疫寛容の有無を判定する方法であつ て、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする免疫寛容の有 無を判定する方法。
[17] 組織又は器官が移植されたヒト以外の脊椎動物力も採取した血液中の遺伝子マー カーの発現量の変化を測定することにより、免疫寛容の有無を判定する方法であつ て、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする免疫寛容の有無を判定する方法。
[18] 前記組織又は器官が、肝臓であることを特徴とする請求項 16又は 17に記載の免 疫寛容の有無を判定する方法。
[19] 組織又は器官が移植されたヒト以外の脊椎動物において、移植後投与されている 免疫抑制剤の投与量を減少させるとともに、前記ヒト以外の脊椎動物から採取した血 液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングし、前記投与量の減少に伴い、前記 発現量の有意な変化が起こらず、前記免疫抑制剤から離脱できた場合に免疫寛容 が生じたと判定することを含み、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする免疫寛容の有 無を判定する方法。
[20] 組織又は器官が移植されたヒト以外の脊椎動物において、移植後投与されている 免疫抑制剤の投与量を減少させるとともに、前記ヒト以外の脊椎動物から採取した血 液中の遺伝子マーカーの発現量をモニタリングし、前記投与量の減少に伴い、前記 発現量の有意な変化が起こらず、前記免疫抑制剤から離脱できた場合に免疫寛容 が生じたと判定することを含み、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする免疫寛容の有無を判定する方法。
[21] 前記組織又は器官が、肝臓であることを特徴とする請求項 19又は 20に記載の免 疫寛容の有無を判定する方法。
[22] 血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体 を備え、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする免疫寛容の有 無を判定するキット。
[23] 血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するためのプライマー又は抗体 を備え、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする免疫寛容の有無を判定するキット。
[24] 肝移植に対する免疫寛容の有無を判定するキットであることを特徴とする請求項 22 又は 23に記載の免疫寛容の有無を判定するキット。
[25] 免疫抑制剤の使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するこ とにより、免疫抑制剤の薬効を評価する方法であって、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする、免疫抑制剤の 薬効を評価する方法。
[26] 免疫抑制剤の使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定するこ とにより、免疫抑制剤の薬効を評価する方法であって、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする、免疫抑制剤の薬効を評価する方法。
[27] 肝移植に対する免疫抑制剤の薬効を評価する方法であることを特徴とする請求項
25又は 26に記載の免疫抑制剤の薬効を評価する方法。
[28] 免疫抑制剤の投与を必要とする脊椎動物において、有効な免疫抑制剤を同定す る方法であって、
前記脊椎動物に属する複数の個体の各々において、等量の異なる免疫抑制剤を 投与する前後で、前記個体から血液を採取し、
前記血液中の遺伝子マーカーの発現量を測定し、
前記免疫抑制剤を投与する前後で、前記個体から採取した血液中の遺伝子マー カーの発現量を比較し、
前記免疫抑制剤の投与により、前記遺伝子マーカーの発現量が最も減少した免疫 抑制剤を同定すること、を含み、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする免疫抑制剤の 同定方法。
[29] 免疫抑制剤の投与を必要とする脊椎動物において、有効な免疫抑制剤を同定す る方法であって、
前記脊椎動物に属する複数の個体の各々において、等量の異なる免疫抑制剤を 投与する前後で、前記個体から血液を採取し、
前記血液中の遺伝子マーカーの発現量を測定し、
前記免疫抑制剤を投与する前後で、前記個体から採取した血液中の遺伝子マー カーの発現量を比較し、
前記免疫抑制剤の投与により、前記遺伝子マーカーの発現量が最も減少した免疫 抑制剤を同定すること、を含み、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする免疫抑制剤の同定方法。
[30] 肝移植に対する、有効な免疫抑制剤を同定する方法であることを特徴とする請求 項 28又は 29に記載の免疫抑制剤の同定方法。
[31] 免疫抑制剤の使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定する ためのプライマー又は抗体を備え、
前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする免疫抑制剤の 薬効を評価するためのキット。
[32] 免疫抑制剤の使用による、血液中の遺伝子マーカーの発現量の変化を測定する ためのプライマー又は抗体を備え、
前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とする免疫抑制剤の薬効を評価するためのキット。
[33] 前記免疫抑制剤は肝移植後に使用することを特徴とする請求項 31又は 32に記載 の免疫抑制剤の薬効を評価するためのキット。
[34] 免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法であって、
組織又は器官を移植することにより免疫拒絶を生じる脊椎動物に対して被検物質 を投与し、
前記脊椎動物から血液を採取し、
前記血液中における遺伝子マーカーの発現量をモニタリングすることを含み、 前記遺伝子マーカーが、 cig5、 I118bp、及び Gbp2からなるグループから選ばれるい ずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とするスクリ一二ング方 法。
[35] 免疫抑制剤又は免疫寛容誘導剤のスクリーニング方法であって、
組織又は器官を移植することにより免疫拒絶を生じる脊椎動物に対して被検物質 を投与し、
前記脊椎動物から血液を採取し、
前記血液中における遺伝子マーカーの発現量をモニタリングすることを含み、 前記遺伝子マーカーが、 Bcl211の遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを 特徴とするスクリーニング方法。
[36] 前記組織又は器官が、肝臓であることを特徴とする請求項 34又は 35に記載のスク リーニング方法。
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