WO2006073144A1 - Ｍａｌｄｉ質量分析用試料の調製方法及びそのための試薬組成物 - Google Patents

Ｍａｌｄｉ質量分析用試料の調製方法及びそのための試薬組成物 Download PDF

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Hiroshi Hirota
Miwako Asanuma
Seketsu Fukuzawa
Shigeyuki Yokoyama
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Riken
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • H01J49/0409—Sample holders or containers
    • H01J49/0418—Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI] plates or surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a sample in mass spectrometry, particularly matrix-assisted laser desorption ion mass spectrometry (MALDI-MS), and a reagent composition for performing this sample preparation.
  • MALDI-MS matrix-assisted laser desorption ion mass spectrometry
  • a polymer sample such as protein is mixed with a matrix (for example, sinapinic acid) and co-crystallized.
  • the matrix has the role of absorbing the laser light and transferring the energy to the co-crystallized polymer sample.
  • Polymer samples ionize and typically produce (M + H) + type ionic species. Through this soft laser desorption process, the polymer sample moves to the gas phase.
  • the detector is a time-of-flight (TOF) type and the polymer sample is ionized, the ions are accelerated in the electric field and reach the detector, and the time from ionization to detection is measured and calculated with high accuracy. . Since the ion flight time depends on the momentum and the square root of the mass-to-charge ratio (mZz), the mass can be calculated accurately.
  • TOF time-of-flight
  • the ESI method is a high-performance liquid chromatography (HPLC) column! /, A liquid containing a polymer sample that elutes from a syringe pump in a minute amount of Z time is atomized into an electrospray ion Inject into the source and ionize.
  • the ESI method is becoming the mainstream of proteomics analysis because sample preparation is ahead of the MALDI method.
  • a sample preparation method used in the MALDI method a method in which a sample is purified by simple chromatography using reversed-phase particles and then a matrix co-crystal is formed on a target plate is mainly used.
  • technical skills are also required, and there are many problems to automate.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 there is a report that the surface of the target plate is modified with a self-assembled film and impurities are removed on the target plate (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2). Both of these methods are based on the concept of removing contaminants before making the matrix co-crystal.
  • a method of adding a chromatographic medium mainly for the purpose of removing salts on the target plate for example, see Non-Patent Document 3
  • a lower layer matrix prepared using a reagent that creates an ion pair with SDS for example, see Non-Patent Document 3
  • Non-Patent Document 4 Two-layer methods (Ion-pair assisted recovery, for example, see Non-Patent Document 4) have also been reported to create an upper layer matrix using a sample containing SDS, but these are complicated operations and suitable for automation. In other words, sufficient effects may not always be obtained, and there is a need for a simpler and more effective sample preparation method.
  • Non-Patent Document 1 Adam H. Brockman, Brian S. Dodd and Ron Orlando, Anal. Chem., 6 9, 4716-4720 (1997)
  • Non-Patent Document 2 Maria E. Warren, Adam H. Brockman and Ron Orlando, Anal. Chem., 70, 3757-3761 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Jason C. Rouse and James E. Vath, Analytical Biochemistry 238, 82- 92 (1996)
  • Non-Patent Document 4 Rajendram V. Rajnarayanan and Kuan Wang, J. Mass Spectrom. 39, 7 9-85 (2004)
  • the present invention has been made in order to solve an enormous problem, and is a target plate in which a washing operation is not performed in a method for preparing a sample for mass spectrometry containing a surfactant such as SDS.
  • An object of the present invention is to provide a method for obtaining a high-quality mass spectrum by the simple operation described above.
  • the sample preparation method for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS) of the present invention co-crystallizes an analyte and matrix molecules in the presence of porous fine particles. It is characterized by that.
  • the cocrystallization is preferably performed by bringing the analyte, matrix molecules, and porous fine particles into contact with each other on a target plate, and then drying the mixture.
  • the porous fine particles are ion exchangers having an average particle diameter of at most m, preferably strongly basic anion exchangers.
  • Preferred embodiments of the strongly basic anion exchanger include crushed silica gel modified with a quaternary ammonium group or a bur polymer modified with a quaternary ammonium group.
  • the sample comprises an analyte, a matrix material, one or more salts or a surfactant.
  • a reagent for preparing a sample for measurement by a matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI-MS) method characterized by containing a matrix molecule and porous fine particles A composition is provided.
  • a reagent composition includes one in a state of being suspended in the porous fine particle force matrix solution.
  • the matrix molecules and the porous fine particles may be provided separately in separate containers, and may be mixed and used immediately before use.
  • a biopolymer containing a surfactant such as SDS is prepared using the sample preparation method or the reagent composition, and matrix-assisted laser desorption / ionization mass is performed.
  • Methods for analysis by analytical (MALDI-MS) methods are provided. The invention's effect
  • the method of the present invention since it is not necessary to highly purify the analyte in advance, MALDI-MS measurement can be performed with a simple operation with no loss of sample.
  • the MALDI-MS method is suitable for multi-analyte and high-speed measurement because the sample can be ionized by laser irradiation.
  • the sample protein ion from which the electrophoresis gel force is also cut is an indispensable step in the field of proteome analysis, and can be efficiently operated by the method of the present invention.
  • the reagent composition of the present invention contains porous fine particles, the sample is uniformly dispersed when mixed with the analyte, and a uniform co-crystal is prepared on the target plate.
  • Cocrystals in which the analyte and matrix molecules are uniformly dispersed are ionized by a single laser irradiation, and a high-quality mass spectrum can be obtained by simple operation.
  • FIG. 1 2. The effect of adding 10 / z m crushed silica gel to the MALDI-MS spectrum in the presence of 5% SDS is shown.
  • A is the result of adding no silica gel
  • B is the addition of silica gel
  • C is the addition of silica gel with a cation exchange group
  • D is the result of adding a silica gel with an anion exchange group.
  • the symbol ⁇ indicates cytochrome C, and the symbol ⁇ indicates myoglobin.
  • FIG. 2 Shows the effect of water dilution (B) on the MALDI-MS spectrum (A) in the presence of 5% SDS.
  • the symbol ⁇ indicates cytochrome C, and the symbol ⁇ indicates myoglobin.
  • FIG. 3 Shows the difference in the effect of ion-exchange groups Q (A) and D EAE (B) on the MALDI-MS spectrum in the presence of 1% SDS.
  • the symbol ⁇ indicates cytochrome C, and the symbol ⁇ indicates myoglobin.
  • target plate in the present specification is an instrument having a site (spot) for placing a sample for MALDI-MS analysis, and may be simply referred to as “plate” or “sample plate”.
  • the target plate is not particularly limited as long as it can be used for mass spectrometry measurement by the MALDI-MS method, and a commercially available metal or plastic plate can be used.
  • the target plate of the present invention is preferably made of a highly washable metal, such as stainless steel, and a plate whose surface is protected by gold or gold plating may be used. .
  • porous microparticle in the present specification is a particle having a sufficiently large surface area, and penetrates a selected molecule such as a salt, a solvent, and a surfactant into the inside of the particle. Or it refers to a material that adsorbs while other selected molecules, such as analytes and matrix molecules, can be retained on the surface of the particles. Specifically, silica gel and zeolite are included. As a result, the analyte is concentrated on the surface of the particles, and low molecular weight impurities such as salts and surfactants are taken into the pores of the particles.
  • ion exchanger is one aspect of the "porous fine particles" and is a generic name for substances that exhibit ion exchange phenomenon. Typical examples include ion exchange resin, ion exchange membrane, and ion exchange cellulose. Others that undergo cation exchange include natural products such as zeolites, acid clay, peat, lignite, synthetic zeolite, palm chit, zirconium tungstate, etc., basic dolomite, hydrated to those that undergo anion exchange. There are gels such as acid iron and hydrated acid zirconium.
  • ion exchange resin is a general term for an insoluble and porous synthetic resin having exchangeable ions.
  • the present invention relates to a sample preparation method for MALDI-MS.
  • the analyte and matrix molecules are mixed and co-crystallized, the analyte is highly purified to remove porous impurities, which does not remove impurities.
  • Analytes include biopolymers such as proteins, peptides, and nucleic acids, but are preferably proteins or peptides having a molecular weight of 1000 or more.
  • a co-crystal is formed with porous fine particles such as an anion exchanger, a co-crystal film cannot be formed on the basic surface.
  • Normal matrix co-crystals are two-dimensionally developed on the target plate.
  • a crystal coating is formed on the anion exchanger surface, it can be developed three-dimensionally, and the surface area of the co-crystal coating is dramatically increased. Can be expected to increase. In other words, it should be able to receive more molecular force S ionization energy.
  • the negative ion mode corresponds to a combination of a basic matrix such as rho, lumine and the cation exchanger.
  • the porous fine particles dispersed in the matrix solution are uniformly dispersed when mixed with the analyte on the target plate, the sample in which the solvent evaporates from these mixtures is crystallized from the analyte and matrix molecules. And can be prepared as a uniform co-crystal.
  • the method of the present invention can be suitably used for a sample containing one or more salts or surfactants as contaminants.
  • These salts and surfactants are known to remarkably suppress ionic defects due to MALDI-MS under normal conditions.
  • a typical example is sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • SDS is a powerful solubilizer of proteins, lipids, and other biomolecules, and is used in a wide range of life science technologies. For example, it is used to separate protein mixtures by electrophoresis or chromatography.
  • salts or surfactants include sodium deoxycholate, CHAPS (3 [— holamidopropyl) dimethylammonio] — 1—propanesulfonate), octylu j8—D-darcobilanoside (OG), and poly (1000 molecular weight or less).
  • examples include, but are not limited to, oxyethylene surfactants (eg, Triton X-100, Brij30, etc.). Yes.
  • the present invention relates to a sample preparation reagent composition for measurement by the MALDI-MS method.
  • This reagent composition contains matrix molecules and porous fine particles, and the porous fine particles used for adsorbing and removing contaminants may be chromatographic carriers that are usually used for the purpose of purifying the tannin. Any of them can be used, and examples thereof include silica gel, anion exchanger, and cation exchanger. Depending on the type of salt or surfactant contained as a contaminant, it can be selected and used as appropriate, and one kind of porous fine particles can be used alone or in combination of two or more kinds.
  • Silica gel which is the most common chromatographic carrier, is a porous silica gel having a large number of pores on the surface. There are two types of particles, spherical and crushed (indeterminate), and it is the mainstream for adsorption chromatography with high packing efficiency on the spherical force S column.
  • the most common type of silica gel surface with various functional groups bonded to silanol groups is ODS (Octadecyl Silica) with an alkyl chain of 18 carbon atoms on the silica surface.
  • Some of the alkyl groups to be bonded are reduced in number, such as octyl, butyl, and methyl groups.
  • a phenol group, a diol group, a nitrile group, an amino group, or the like may be added as a functional group.
  • ion exchanger such as 3 3 2 3 2.
  • ion exchange resin using organic polymer gel instead of silica gel may be used.
  • Polymer gels such as polymetatalylate, polyhydroxymetatalylate, polyvinyl alcohol gel and dextran are preferred! /.
  • porous fine particles are preferably fine particles having an average particle size of at most 50 ⁇ m in order to obtain a large surface area, more preferably 20 m or less, and even more preferably an average particle size of m or less. It is.
  • the shape and uniformity of the particles are not particularly limited. Various shapes such as a spherical shape, a columnar shape, and a crushed shape are included, but a crushed shape (indefinite shape) is preferable, and a quaternary ammonia is more preferable. It is a crushed silica gel modified with a dimethyl group. This reason The reason for this is not clear, but it is thought that the molecular sieving effect of adsorbing the surfactant on the irregular dents on the surface of the particles and the moderately sized dents between the particles is thought to affect.
  • the matrix molecule contained in the reagent composition of the present invention it is preferable to use a highly purified compound as the matrix molecule contained in the reagent composition of the present invention.
  • a highly purified compound for example, sinapinic acid recrystallized at least twice using a solvent such as acetonitrile can be used in a 50% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) solution for a long period of time for at least 6 months.
  • the reagent composition of the present invention in one embodiment is provided as a suspension in a matrix solution in which the porous microparticles are highly purified.
  • the porous fine particles and the matrix solution may be dispensed and provided in separate containers.
  • the matrix solution selected according to the properties of the analyte can be selected from various anion exchangers and cation exchangers.
  • a sample can be prepared by adding a suspension to a suitably selected porous fine particle before use, and then mixing with a predetermined analyte.
  • These reagent compositions or kits may include instructions describing how to prepare the sample to obtain optimal mass spectrometry results.
  • a sample is prepared by the method of the present invention, and the sample is used for matrix-assisted laser desorption.
  • the present invention relates to a mass spectrometric method characterized by performing separated ion mass spectrometry (MALDI-MS).
  • MALDI-MS separated ion mass spectrometry
  • the present invention involves subjecting an analyte containing a surfactant such as SDS to co-crystallization using the reagent composition of the present invention, and then subjecting the analyte to MALDI as it is.
  • the present invention provides a method capable of performing MALDI-MS measurement without the need for washing and removal of porous fine particles.
  • Sinapic acid was manufactured by Tokyo Chemical Industry (TCI, Tokyo) and recrystallized twice with acetonitrile to give a 50% acetonitrile 0.1% TFA solution at a concentration of 10 mg / mL.
  • Myoglobin and Cytochrome C were purchased from Sigma and used for experiments without purification.
  • the solid phase supports are Wakogel (registered trademark) LC-SAX-10H (10 ⁇ m crushed quaternary ammonium group-modified silica gel, Wako Pure Chemicals, Osaka), Nucleosil (registered trademark) 100-SB10 (10 m spherical quaternary ammonium group modified silica gel, GL-Science, Tokyo), Par tisil (registered trademark) 10 SCX (10 ⁇ m crushed sulfone group modified silica gel, GL-Science, Tokyo), Partisil ( (Registered trademark) 10 (10 m crushed silica gel, GL-Science, Tokyo), Nucleosil (registered trademark) 100-SB5 (5 ⁇ m spherical quaternary ammonium group-modified silica gel, GL-Science, Tokyo) , TOYOPEARL SuperQ- 650S (20-50 m spherical quaternary ammonia group modified bur polymer, Tosohichi,
  • the sample to be measured is 400 ⁇ myoglobin and cytochrome C40 M (100 mM NaCl, 50 mM Tris—HC1) [Use a mixture of SDS at a concentration of 20, 50, 100, 200 mg / mL on a one-to-one basis! .
  • the final concentration is 200 ⁇ myoglobin, cytochrome C20 M (50 mM NaCl, 25 mM Tris—HC1, 1, 2.5, 5, 10% SDS).
  • the MALDIZTOF mass spectrometer was a Voyager DE-STR manufactured by Applied Biosystems, and the target plate was inserted and irradiated with a laser (la ser power 1900, 100shots). The same experiment was performed four times or more to confirm reproducibility.
  • the target plate was subjected to ultrasonic cleaning for at least 10 minutes in pure water. After drying, the protein sample (sample) was returned to 0. Calorie. lOmgZmL sinapinic acid solution with solid support 0.5 L of the mixture (50 mgZmL) was added and allowed to air dry at room temperature (25 ⁇ 2 ° C., 40-60%).
  • FIG. 1 shows the measurement results of various samples prepared in the presence of 2.5% SDS according to the above experimental method.
  • FIG. 1A myoglobin and cytochrome C were directly co-crystallized with a synaptic acid solution, and ions of these analytes were not observed.
  • FIG. 1B when silica gel was added to the sample and co-crystallized, a slight amount of cytochrome was observed.
  • FIG. 1C shows that the ionic strength of force cytochrome C, which is cocrystallized by adding the cation exchanger Partisil (registered trademark) 10 SCX to the sample, is increased. Furthermore, in Fig.
  • an anion exchanger Wakogel (registered trademark) LC-SAX-10H was co-crystallized, and the cytochrome C ions were further increased in strength and could not be observed at all. Tsutano myoglobin was also observed with good SZN ratio.
  • FIG. Figure 3A shows a quaternary alkyl group as an ion exchange group in the presence of 1% SDS. This is the case when the n-um (Q) group is used, and monovalent ions of cytochrome C and myoglobin can be clearly detected.
  • Q n-um
  • Q monovalent ions of cytochrome C and myoglobin
  • FIG. 3B shows the result when a jetylaminoethyl (DEAE) group was used in the presence of 1% SDS.
  • the quaternary ammonia group was able to achieve the target protein ionization even in the presence of higher concentrations of SDS.
  • the SDS concentration in the crystalline film on the surface decreased relatively, and as a result, it was considered that it was used in the direction of promoting the ion energy of the target substance by the irradiation energy force. This was supported by the fact that SDS cluster ions were clearly reduced when a broken anion exchanger was added when only SDS was ionized.

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Abstract

　マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）法による測定において、試料中に存在する無機塩、界面活性剤などの夾雑物によるイオンサプレッションを抑止し、簡便かつ効率的なサンプル調製方法を提供する。分析対象物と、マトリックス分子とを、多孔性微粒子の存在下で共結晶化する。前記共結晶化は、ターゲットプレート上にて、分析対象物と、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを接触させ、次いで該混合物を乾燥して行うことが好ましい。前記多孔性微粒子は、大きくとも５０μｍの平均粒子径を有するイオン交換体であり、好ましくは、強塩基性陰イオン交換体である。

Description

明 細 書
MALDI質量分析用試料の調製方法及びそのための試薬組成物 技術分野
[0001] 本発明は、質量分析法、特に、マトリックス支援レーザー脱離イオンィ匕質量分析 (M ALDI-MS)法におけるサンプルの調製方法、及びこのサンプル調製を行うための 試薬組成物に関する。
背景技術
[0002] ポストゲノム時代においてタンパク質の網羅的解析の意義はますます大きくなり、迅 速かつ正確なタンパク質の同定技術の向上が求められている。多くの研究者により 使用されている 1つの方法として、多種類のタンパク質の中から二次元電気泳動によ り目的のタンパク質を単離し、これを質量分析法により解析する技術がある。質量分 析法については、エレクトロスプレ一'イオン化（ESI)法、マトリックス支援レーザー脱 離イオン化 (MALDI)法の開発によって生体高分子のソフトイオンィ匕技術が確立さ れ、プロテオミクス研究が革新的に進展した。
[0003] MALDI質量分析法は、タンパク質等の高分子試料をマトリックス (例えば、シナピ ン酸）と一緒に混ぜて、共結晶化させる。マトリックスはレーザー光を吸収し、そのェ ネルギーを共結晶化した高分子試料に移行させる役割をもつ。高分子試料はイオン 化し、典型的には (M + H) +タイプのイオンィ匕学種を生ずる。このソフトレーザー脱着 過程を通して、高分子試料は気相に移行する。検出器が飛行時間 (TOF)型の場合 、高分子試料がイオン化すると、そのイオンは電場の中で加速されて検出器に到達 し、イオン化から検出までの時間が高精度に測定、計算される。イオンの飛行時間は 運動量、質量対電荷比 (mZz)の平方根に依存するので、質量を正確に算出するこ とがでさる。
[0004] ESI法は、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)のカラムある!/、はシリンジポンプか ら微小量 Z時間で溶出する高分子試料を含んだ液体を霧状にして、エレクトロスプレ 一'イオン源に注入してイオン化させる。 ESI法はサンプル調製の自動化が MALDI 法よりも先行しているため、プロテオミクス解析の主流を占めつつある。 [0005] 一方、 MALDI法に用いるサンプル調製方法としては、逆相系粒子を用いた簡単 なクロマトグラフィーでサンプルを精製した後に、ターゲットプレート上でマトリックス共 結晶をつくらせる方法が主に用いられているが、技術的な熟練も必要であり、自動化 するためには問題点が多い。あるいは、ターゲットプレート表面を自己組織化膜で修 飾し、ターゲットプレート上で夾雑物の除去を行うという報告もある（例えば、非特許 文献 1及び 2参照)。これらいずれの方法もマトリックス共結晶を作成する前に夾雑物 を取り除くという概念に基づいている。この他、ターゲットプレート上で主に塩類の除 去を目的としてクロマトグラフィー媒体を添加する方法 (例えば、非特許文献 3参照） や、 SDSとイオンペアを作る試薬を用いて作成した下層マトリックスの上に、 SDSを 含むサンプルを用いて上層マトリックスを作成する 2層法 (Ion- pair assisted recovery, 例えば、非特許文献 4参照)なども報告されているが、いずれも操作が煩雑で自動化 に適さな力つたり、必ずしも十分な効果が得られない場合もあり、さらなる簡便かつ効 果的なサンプル調製方法が求められて 、る。
[0006] 非特許文献 1： Adam H. Brockman, Brian S. Dodd and Ron Orlando, Anal. Chem., 6 9, 4716-4720 (1997)
非特許文献 2 : Maria E. Warren, Adam H. Brockman and Ron Orlando, Anal. Chem., 70, 3757-3761 (1998)
非特許文献 3 : Jason C. Rouse and James E. Vath, Analytical Biochemistry 238, 82- 92 (1996)
非特許文献 4 : Rajendram V. Rajnarayanan and Kuan Wang, J. Mass Spectrom. 39, 7 9-85 (2004)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 質量分析法における最大の課題は、試料中に存在する無機塩、界面活性剤など の夾雑物によるイオンサブレッシヨンである。質量分析用サンプルを調製する前に夾 雑物を除去して分析対象物を高度に精製する方法は、手間と時間が力かるだけでな ぐ例えば、シリカゲルに吸着させた後に洗浄工程を必要とすることから、この洗浄過 程で夾雑物と共に分析対象物までが取り除かれ、試料の目減りが生じ、感度が低下 し、結果として分析精度の低下を招くという問題がある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は、力かる問題点を解決するためになされたものであって、 SDSなどの界面 活性剤を含む質量分析用サンプルの調製方法において、洗浄操作を行うことなぐタ 一ゲットプレート上での簡便な操作によって、良質な質量スペクトルが得られる方法を 提供することにある。
[0009] すなわち、本発明のマトリックス支援レーザー脱離イオンィ匕質量分析 (MALDI— MS)用のサンプル調製方法は、分析対象物と、マトリックス分子とを、多孔性微粒子 の存在下で共結晶化することを特徴とする。前記共結晶化は、ターゲットプレート上 にて、分析対象物と、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを接触させ、次いで該混合 物を乾燥して行うことが好まし 、。
[0010] 本発明の 1つの実施形態において、前記多孔性微粒子は、大きくとも mの平 均粒子径を有するイオン交換体であり、好ましくは、強塩基性陰イオン交換体である 。前記強塩基性陰イオン交換体の好ましい実施形態として、 4級アンモニゥム基で修 飾された破砕状のシリカゲル又は 4級アンモ-ゥム基で修飾されたビュルポリマーが 挙げられる。
[0011] 本発明の 1つの実施形態において、前記サンプルは、分析対象物、マトリックス材 料、 1以上の塩又は界面活性剤を含む。
[0012] 本発明の異なる観点において、マトリックス分子と、多孔性微粒子とを含むことを特 徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオンィ匕質量分析 (MALDI— MS)法による 測定のためのサンプル調製用試薬組成物が提供される。かかる試薬組成物の 1つの 実施形態としては、前記多孔性微粒子力 マトリックス溶液に懸濁した状態にあるも のが挙げられる。あるいは、前記マトリックス分子と、前記多孔性微粒子とが、それぞ れ別の容器に分注されて提供され、使用直前に混ぜ合わせて用いてもよい。
[0013] 本発明のさらに異なる観点において、 SDS等の界面活性剤を含む生体高分子物 質を、上記サンプル調製方法、又は上記試薬組成物を用いて調製し、マトリックス支 援レーザー脱離イオン化質量分析 (MALDI— MS)法により分析する方法が提供さ れる。 発明の効果
[0014] 本発明の方法によれば、分析対象物を予め高度に精製する必要がないため試料 の損失がなぐかつ簡便な操作で MALDI— MS測定することができる。 MALDI- MS法はレーザー照射でサンプルをイオン化できるので多検体、高速測定に適した 測定方法であるが、従来は分析対象物とマトリックスとの共結晶化の段階に種々の問 題点があり自動化測定を困難にしていた。特に、電気泳動ゲル力も切り出した試料タ ンパク質のイオンィヒにつ 、ては、プロテオーム解析の分野では必要不可欠な工程で あり、本発明の方法により効率的な操作が可能となる。
[0015] また、本発明の試薬組成物は多孔性の微粒子が含まれて 、るため分析対象物と混 合した際にサンプルが均一に分散し、ターゲットプレート上で均一な共結晶を調製す ることができる。分析対象物とマトリックス分子とが均一に分散された共結晶はレーザ 一照射によってイオン化されやすぐ簡便な操作により良質の質量スぺ外ルを得るこ とがでさる。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]2. 5%SDS存在下における MALDI— MSスペクトルへの 10 /z m破砕状シリカ ゲルの添加効果を示す。 Aはシリカゲル無添加、 Bはシリカゲル添加、 Cは陽イオン 交換基の結合したシリカゲル添加、及び Dは陰イオン交換基の結合したシリカゲルを 添カロした結果である。なお、記号☆はチトクローム Cを、記号參はミオグロビンを示す
[図 2]5%SDS存在下における MALDI— MSスペクトル (A)への水希釈効果（B)を 示したものである。なお、記号☆はチトクローム Cを、記号參はミオグロビンを示す。
[図 3]1%SDS存在下における MALDI— MSスペクトルへのイオン交換基 Q (A)と D EAE (B)の効果の差を示す。なお、記号☆はチトクローム Cを、記号參はミオグロビ ンを示す。
[図 4]2. 5%SDS存在下における球状粒子 (Aは平均粒子径 5 /ζ πι、 Βは平均粒子 径 10 m)の添加効果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0017] (定義） 本明細書における用語「ターゲットプレート」は、 MALDI— MS分析用にサンプル を配置する部位 (スポット）を備えた器具であり、単に「プレート」や「サンプルプレート」 と称する場合もある。ターゲットプレートは、 MALDI— MS法による質量分析測定に 用いることができるものであれば特に限定されず、市販されている金属製やプラスチ ック製のものを使用することができる。 1つの実施形態として、本発明のターゲットプレ ートは高度に洗浄可能な金属製、例えばステンレス鋼力 なることが好ましぐまた白 金や金メッキによって表面が保護されたプレートを用いてもょ 、。
[0018] 本明細書における用語「多孔性微粒子」は、十分に大きな表面積を持った粒子で あって、選択された分子、例えば、塩、溶媒、及び界面活性剤等を粒子の内部に浸 透または吸着する一方、他の選択された分子、例えば分析対象物及びマトリックス分 子は粒子の表面に保持することができるような材料をいう。具体的にはシリカゲルや ゼォライト等を含む。これにより、粒子の表面に分析対象物が濃縮されると共に塩や 界面活性剤などの低分子量の不純物は粒子の孔内に取り込まれる。
[0019] また、用語「イオン交換体」とは、上記「多孔性微粒子」の 1つの態様であって、ィォ ン交換現象を示す物質の総称である。代表的なものには、イオン交換榭脂、イオン 交換膜、イオン交換セルロース等がある。その他、陽イオン交換を行うものに沸石類、 酸性白土、泥炭、亜炭などの天然物や、合成ゼォライト、パームチット、タングステン 酸ジルコニウムなどがあり、陰イオン交換を行うものに塩基性のドロマイト、水和酸ィ匕 鉄や水和酸ィ匕ジルコニウムなどのゲルがある。用語「イオン交換榭脂」は、交換能の あるイオンを持つ、不溶性で多孔質の合成樹脂の総称である。
[0020] (質量分析用サンプルの調製方法）
第一の観点において、本発明は、 MALDI— MS用のサンプル調製方法に関する 。このサンプル調製方法は、分析対象物と、マトリックス分子とを混合して共結晶化さ せる際に分析対象物を高度に精製して夾雑物を除くのではなぐ多孔性微粒子を添 カロして、サンプル中に共存させることによって夾雑物による悪影響を防止し、積極的 に分析対象物のイオン化を促進するものである。分析対象物としては、タンパク質、 ペプチド、核酸等の生体高分子物質が含まれるが、好ましくはタンパク質、又は分子 量が 1000以上のペプチドである。 [0021] 一方、正イオンモードにおけるマトリックス分子としては、シナピン酸 (Sinapinic acid) ゝ a—シァノ一 4—ヒドロキシ桂皮酸 ( a— cyano— 4— hydroxy— cinnamic acid)ゝフエノレラ 酸 (ferulic acid),ゲンチシン酸 (gentisic acid), 3—ヒドロキシピコリン酸 (3- hydroxypicol inic acid), 2, 5—ジヒドロキシ安息香酸 (2,5-dihydroxybenzoic acid)などが含まれるが これらに限定されない。なお、マトリックスに用いられるこれらの化合物は全て酸性物 質である。もしマトリックス共結晶の表面積を広くとることによってより多くの照射エネ ルギーを効率良くイオンィ匕に結びつけることができればより SZN比の良いスペクトル を得ることができる力もしれない。本発明者らはマトリックスが酸性であることに着目し 、陰イオン交換体のような多孔性微粒子と共結晶をつくればその塩基性表面に共結 晶の被膜を形成させることができるのではな 、かと考えた。通常のマトリックス共結晶 はターゲットプレート上に二次元的に展開した状態であるが陰イオン交換体表面に 結晶被膜を形成させればそれを三次元的に展開でき、共結晶被膜の表面積は飛躍 的に増大させることが期待できる。すなわちより多くの分子力 Sイオン化エネルギーを 受け取ることができるはずである。また、負イオンモードにおいては、ノ、ルミンなどの 塩基性マトリックスと陽イオン交換体との組み合わせに相当する。マトリックス溶液中 に分散した多孔性微粒子は、ターゲットプレート上で分析対象物と混合したときに均 一に分散するため、これらの混合物から溶媒が蒸発して結晶化したサンプルは分析 対象物とマトリックス分子との均一な共結晶として調製することができる。
[0022] 本発明の方法は、夾雑物として、 1以上の塩又は界面活性剤を含むサンプルにつ いて好適に用いることができる。これらの塩や界面活性剤は、通常の条件下におい て、 MALDI— MSによるイオンィ匕を著しく抑制することが知られている。その典型的 な例としてドデシル硫酸ナトリウム（SDS)が挙げられる。 SDSは、タンパク質や脂質、 及び他の生体分子の強力な可溶化剤であり、生命科学の領域での幅広!/、技術に使 用されている。例えば、電気泳動やクロマトグラフィーによるタンパク質混合物を分離 する際に用いられる。その他の塩又は界面活性剤としては、デォキシコール酸ナトリ ゥム、 CHAPS(3 [ —し holamidopropyl)dimethylammonio]— 1— propanesulfonate)、ォク チルー j8— D—ダルコビラノシド（OG)、及び分子量 1000以下のポリオキシエチレン 界面活性剤（例えば、トリトン X— 100、 Brij30等）が挙げられるがこれらに限定されな い。
[0023] (試薬組成物）
他の観点において、本発明は、 MALDI— MS法による測定のためのサンプル調 製用試薬組成物に関する。この試薬組成物は、マトリックス分子と、多孔性微粒子と を含むものであるが、夾雑物の吸着除去に用いる多孔性微粒子としては、通常タン ノ^質の精製を目的として使用されるクロマトグラフィー担体であればいずれも使用 可能であり、例えば、シリカゲル、陰イオン交換体、陽イオン交換体などが挙げられる 。夾雑物として含まれる塩や界面活性剤の種類に応じて適宜選択して用いることが でき、また 1種類の多孔性微粒子を単独で、あるいは 2種以上を組み合わせて用いて ちょい。
[0024] 最も一般的なクロマトグラフィー担体であるシリカゲルは、細孔を表面に多数有する 多孔性シリカゲルである。粒子の形状には球状と破砕状 (不定形)があり、球状の方 力 Sカラムへの充填効率が高ぐ吸着クロマトグラフィー用には主流となっている。シリカ ゲル表面のシラノール基に種々の官能基をィ匕学結合させたものでもよぐ最も一般的 なものは、シリカ表面に炭素数 18 (C )のアルキル鎖を付けた ODS(Octadecyl Silica
18
)ゲルである。結合させるアルキル基の炭素数をォクチル基、ブチル基、メチル基など のように減らしたものもある。また、官能基としてフエ-ル基、ジオール基、二トリル基、 アミノ基などが付加されて 、てもよ 、。
[0025] 一方、シリカゲルにイオン交換基を結合させた場合には、例えば、強酸性（— SO
3
H)、強塩基性（一 N+ (CH ) )、弱酸性（一 COOH)、弱塩基性（一 N (CH CH ) )
3 3 2 3 2 などのイオン交換体となる。また、シリカゲルの代わりに有機系ポリマーゲルを用いた イオン交換榭脂でもよい。ポリマーゲルとしては、ポリメタタリレート、ポリヒドロキシメタ タリレート、ポリビニルアルコールゲル及びデキストランなどが好まし！/、。
[0026] これらの多孔性微粒子は、大きな表面積を得るために大きくとも 50 μ mの平均粒子 径の微粒子であることが好ましぐより好ましくは 20 m以下、さらに好ましくは m以下の平均粒子径である。粒子の形状や均一性は特に限定されるものではなぐ 球状、柱状、破砕状等、種々の形態が含まれるが、好ましくは破砕状 (不定形)であり 、より好ましくは、 4級アンモ-ゥム基で修飾された破砕状のシリカゲルである。この理 由は明らかではないが、おそらぐ粒子の表面の不定形の窪みや粒子間の適度なサ ィズの窪みに界面活性剤が吸着される分子ふるい効果が影響するものと考えられる
[0027] また、本発明の試薬組成物に含まれるマトリックス分子は、高度に精製した化合物 を用いることが好ましい。例えば、ァセトニトリル等の溶媒を用いて少なくとも 2回再結 晶したシナピン酸は 50%ァセトニトリル、 0. 1%トリフルォロ酢酸 (TFA)溶液中で長 期間、少なくとも 6ヶ月間は使用可能である。したがって、 1つの実施形態における本 発明の試薬組成物は、前記多孔性微粒子が、高度に精製されたマトリックス溶液中 における懸濁液として提供される。あるいは、前記多孔性微粒子とマトリックス溶液と が別々の容器に分注されて提供されていてもよい。さらに、種々のマトリックス溶液及 び多孔性微粒子がキットとして含まれていてもよぐ例えば、分析対象物の性質に合 わせて選択されるマトリックス溶液を種々の陰イオン交換体や陽イオン交換体力 適 宜選択される多孔性微粒子に使用前に加えて懸濁液とした後、所定の分析対象物と 混合してサンプルを調製することができる。これらの試薬組成物あるいはキットには、 最適な質量分析結果を得るためのサンプル調製方法を記載した使用説明書を含め ることがでさる。
[0028] (質量分析方法）
本発明は、また異なる観点において、 SDS等の界面活性剤を含むタンパク質等を 分析対象物とする質量分析方法において、上記本発明の方法によりサンプルを調製 し、該サンプルを用いてマトリックス支援レーザー脱離イオンィ匕質量分析 (MALDI- MS)を行うことを特徴とする質量分析方法に関する。これにより、分析対象物を精製 するための洗浄操作なしでも、良質な質量スぺ外ルが得られる。すなわち、本発明 は、 SDS等の界面活性剤を含む分析対象物を、本発明の試薬組成物を用いて共結 晶化した後、そのまま MALDIに付すものであり、分析対象物を水等で洗浄する必要 も、また、多孔性微粒子を除去する必要もなぐ MALDI— MS測定ができる方法を 提供するものである。
実施例
[0029] 以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、かか る実施例により何ら限定されるものではない。
[0030] [実施例 1]
(1)試薬
シナピン酸は東京化成 (TCI、東京)製を用い、ァセトニトリルで二回再結晶し、 10 mg/mLの濃度で 50%ァセトニトリル 0. 1%TFA溶液とした。ミオグロビン (Myoglobi n)とチトクローム C(Cytochrome C)はシグマ社から購入し、精製せずに実験に用いた 。固相担体はヮコーゲル (Wakogel、登録商標） LC- SAX- 10H (10 μ m破砕状 4級ァ ンモ-ゥム基修飾シリカゲル、和光純薬、大阪）、ヌクレオシル (Nucleosil、登録商標） 100- SB10 ( 10 m球状 4級アンモ-ゥム基修飾シリカゲル、 GL- Science、東京）、 Par tisil (登録商標） 10 SCX (10 μ m破砕状スルホン基修飾シリカゲル、 GL- Science、東 京）、 Partisil (登録商標） 10 (10 m破砕状シリカゲル、 GL- Science、東京）、ヌクレオ シル（Nucleosil、登録商標） 100-SB5 (5 μ m球状 4級アンモ-ゥム基修飾シリカゲル、 GL- Science、東京）、トヨパール (TOYOPEARL) SuperQ- 650S (20〜50 m球状 4級 アンモ-ゥム基修飾ビュルポリマー、東ソ一、東京）、トヨパール (TOYOPEARL) DEA E-650S (20〜50 μ m球状ジェチルァミノ基修飾ビュルポリマー、東ソ一、東京）、を 用い、タンパク試料と固相担体は購入した状態でそのまま使用した。測定試料はミオ グロビン 400 μ Μとチトクローム C40 M (100mMの NaCl, 50mMの Tris— HC1) 【こ 20、 50、 100、 200mg/mLの濃度の SDSを 1対 1混ぜたものを用!ヽた。最終的 な濃度はミオグロビン 200 μ Μ、チトクローム C20 M (50mMの NaCl、 25mMの T ris— HC1、 1、 2. 5、 5、 10%SDS)である。
[0031] (2)測定
MALDIZTOF型質量分析計にはァプライド 'バイオシステムズ社 (Applied Biosyst ems)の Voyager DE- STRを用い、ターゲットプレートを挿入し、レーザーを照射した（la ser power 1900、 100shots)。同一実験を 4回以上行なって再現性についての確認を した。
[0032] (3)実験手順
ターゲットプレートは純水中で最低 10分以上の超音波洗浄を行い、乾燥後タンパ ク質試料（サンプル）を 0. カロえた。 lOmgZmLシナピン酸溶液に固相担体を 混合したもの（50mgZmL)を 0. 5 L添加し、室温にて自然乾燥（25± 2°C、 40〜 60%)させた。
[0033] (4)結果と考察
上記実験方法に従って、 2. 5%SDS存在下で調製した種々のサンプルについて 測定した結果を図 1に示した。図 1Aは、ミオグロビン及びチトクローム Cを直接シナピ ン酸溶液で共結晶化したものであり、これらの分析対象物のイオンは観測されなかつ た。図 1Bは、サンプルにシリカゲルを添加して共結晶化したところ、チトクロームじが わずかに観測された。図 1Cはサンプルに陽イオン交換体 Partisil (登録商標） 10 SCX を添加して共結晶化したものである力 チトクローム Cのイオン強度が増加して 、るこ とが分かる。さらに、図 1Dでは、陰イオン交換体ヮコーゲル (Wakogel、登録商標） LC -SAX-10Hをカ卩えて共結晶化したところ、チトクローム Cのイオンがさらに強度を上げ 、かつ今まで全く観測できな力つたミオグロビンも SZN比良く観測できた。
[0034] 次に、 SDS濃度について調べるために、 5%SDS存在下、陰イオン交換体ヮコー ゲル (Wakogel、登録商標） LC-SAX- 10Hをカ卩えて共結晶化したサンプルを測定した ところ、図 2Aに示したように目的タンパク質のイオンを観測できな力 た。そこで、サ ンプルを水で二倍希釈した後に実験を行ったところ図 2Bに示したようにきれいなィォ ンが観測できた。
[0035] これらの結果は、 SDSのような不純物が混じって 、ても、クロマトグラフ媒体（多孔 性微粒子）の存在下で、良好なタンパク質のイオンィ匕が得られることを示しており、こ れまで MALDI— MS測定においてはできるだけ不純物（無機塩、界面活性剤、その 他のゴミ）を除き、きれ 、なマトリックス共結晶をつくらなければならな 、と 、う考え方と は異なったアプローチが可能であることを示している。特に、 10 mの破砕状シリカ ゲルを用いても表面力 級アンモ -ゥム基で修飾 (官能基化)されたものだけが高濃 度の SDS存在下でも目的タンパク質のイオンを SZN比良く観測できたことに着目し 、塩基性官能基の種類について、 4級アンモ-ゥム基と弱陰イオン交換基であるジェ チルアミノエチル（DEAE)基をそれぞれトヨパール (TOYOPEARL) SuperQ-650Sと、 トヨパール (TOYOPEARL) DEAE- 650Sとを用いて比較した。
[0036] その結果を図 3に示した。図 3Aは、 1%SDS存在下に、イオン交換基として 4級ァ ンモ -ゥム（Q)基を用いた場合であり、チトクローム Cとミオグロビンの一価のイオンが はっきりと検出できる。これに対し、同じく 1%SDS存在下、ジェチルアミノエチル（D EAE)基を用いた場合には図 3Bのような結果であった。この結果、 4級アンモ-ゥム 基の方が、より高濃度の SDS存在下でも目的タンパク質のイオンィ匕が達成できること が分力つた。このことは、用いたイオン交換体の表面に、より多くのマトリックス分子や 不純物である SDSを吸着した方が目的タンパク質のイオン化を促進することを意味し て 、る。また実際に Rouseらの研究グループの方法にそってイオン交換体をスパーテ ルで除去するとイオンが全く観測されな力つた。すなわちイオン交換体表面にはマト リックス共結晶被膜が形成されていることを強く支持するものである。
[0037] 次に陰イオン交換体表面にマトリックス共結晶の被膜が形成されているとするなら ばより小さい粒子を用いれば表面積が大きくなり、その効果が上がるのではないかと 考え 5 μ m (Nucleosil (登録商標） 100- SB5)及び 10 μ mの球状粒子（Nucleosil (登録 商標） 100-SB10)を用いた実験を行なった（5 μ mの破砕状粒子は市販されて ヽな ヽ
) o
[0038] その結果を図 4に示した。双方ともに 10 /z m破砕状粒子であるヮコーゲル (Wakogel 、登録商標） LC-SAX-10Hより劣る結果となった。これより粒子径が小さくなつて表面 積が増えてもそれほど効果がなぐむしろ破砕状のような凹凸の激しい形状が有効と いう結論になる。すなわち塩基性表面のみならず、粒子の形状も大きくイオンィ匕に寄 与することがわ力つた。凹凸の多い表面においては分子ふるい効果により、低分子 量の無機塩や界面活性剤は結晶化の過程で粒子内部の方に取り込まれる。これに よって表面の結晶被膜内の SDS濃度が相対的に下がり、この結果照射エネルギー 力 り目的物質のイオンィ匕を促進する方向に利用されたと考察した。このことは SDS のみをイオンィ匕した際に破碎状陰イオン交換体を入れたほうに明らかな SDSのクラス ターイオンの減少が認められたことにより支持された。
[0039] 以上まとめると強陰イオン交換基力 Sもたらす塩基性環境と破砕状粒子の表面積の 増大および分子ふるい効果が二大要因となって SDSによるイオンサブレッシヨンが大 きく抑止されたと考えられる。言 、換えれば塩基性表面積が大きくなることは酸性物 質であるシナピン酸マトリックスとの親和性が高いということであり、目的物質との共結 晶が広くシリカゲル粒子に分布することを意味し、照射レーザーのエネルギー吸収が 高効率で進むことである。そして破砕状粒子に由来する分子ふる 、効果で界面活性 剤などの低分子夾雑物は粒子内部に収容されることで目的物質のイオン化を促進で きると考えられる。

Claims

請求の範囲
[I] 分析対象物と、マトリックス分子とを、多孔性微粒子の存在下で共結晶化することを 特徴とするマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析 (MALDI MS)用のサ ンプル調製方法。
[2] 前記共結晶化は、ターゲットプレート上にて、分析対象物と、マトリックス分子と、多 孔性微粒子とを接触させ、次 ヽで該混合物を乾燥することを特徴とする請求項 1に記 載の方法。
[3] 前記多孔性微粒子が、大きくとも 50 μ mの平均粒子径を有するイオン交換体であ る請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 前記イオン交換体が、強塩基性陰イオン交換体である請求項 3に記載の方法。
[5] 前記強塩基性陰イオン交換体が、 4級アンモニゥム基で修飾された破砕状のシリカ ゲル又は 4級アンモ-ゥム基で修飾されたビニルポリマーカゝらなる請求項 4に記載の 方法。
[6] 前記サンプルが、分析対象物、マトリックス材料、 1以上の塩又は界面活性剤を含 んでなる請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。
[7] 前記塩又は界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、デォキシコール酸ナト リウム、 CHAPS、ォクチルー j8— D—ダルコビラノシド（OG)、及び分子量 1000以 下のポリオキシエチレン界面活性剤を含む請求項 6に記載の方法。
[8] 前記分析対象物が生体高分子物質を含む請求項 1〜7のいずれか一項に記載の 方法。
[9] 前記生体高分子物質が、タンパク質及び分子量 1000以上のペプチドから選択さ れるものである請求項 8に記載の方法。
[10] マトリックス分子と、多孔性微粒子とを含むことを特徴とするマトリックス支援レーザ 一脱離イオン化質量分析 (MALDI— MS)法による測定のためのサンプル調製用試 薬組成物。
[II] 前記多孔性微粒子が、大きくとも 50 mの平均粒子径を有するイオン交換体であ る請求項 10に記載の試薬組成物。
[12] 前記イオン交換体が、強塩基性陰イオン交換体である請求項 11に記載の試薬組 成物。
[13] 前記強塩基性陰イオン交換体が、 4級アンモニゥム基で修飾された破砕状のシリカ ゲル又は 4級アンモ-ゥム基で修飾されたビニルポリマー力もなる請求項 12に記載 の試薬組成物。
[14] 前記多孔性微粒子が、マトリックス溶液に懸濁した状態にある請求項 10〜13のい ずれか一項に記載の試薬組成物。
[15] 前記マトリックス分子と、前記多孔性微粒子とが、それぞれ別の容器に分注されて いる請求項 10〜 13のいずれか一項に記載の試薬組成物。
[16] 界面活性剤を含む生体高分子物質を分析対象物とする質量分析方法にお！ヽて、 請求項 1〜9のいずれか一項に記載の方法によりサンプルを調製し、該サンプルを 用いてマトリックス支援レーザー脱離イオンィ匕質量分析 (MALDI— MS)を行うことを 特徴とする質量分析方法。
[17] 前記界面活性剤が SDSを含む請求項 16に記載の質量分析方法。
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