KR101209835B1 - 동위원소 희석-매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법을 이용한 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 정량방법 - Google Patents

동위원소 희석-매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법을 이용한 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 정량방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 신속하고 정확한 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명은 혈청으로부터 선천성 부신과형성증에 의해 변화되는 대표적인 부신호르몬인 17α-하이드록시프로게스테론을 정량곡선을 작성하지 않으면서도, 효과적으로 정량 분석할 수 있는 방법을 제공하므로, 선천성 부신과형성증의 발병 여부를 신속, 정확하게 평가할 수 있다.

Description

동위원소 희석-매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법을 이용한 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 정량방법{Quantification of 17α-hydroxyprogesterone in serum by isotope dilution-matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry}
본 발명은 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 신속하고 정확한 정량 방법에 관한 것이다.
최근 유전체학과 단백체학의 연구영역에 더불어 생체 내 생리활성 화합물을 총체적으로 이해할 수 있는 대사체학 기술을 통하여, 생체 내 호르몬의 변화를 측정함으로써, 질병을 진단, 예방할 수 있는 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 소량의 혈장 내에 존재하는 스테로이드 호르몬의 농도를 측정하는 경우, 뛰어난 감도와 분리도를 나타내는 액체/기체 크로마토그래피가 주로 사용되고 있지만, 복잡한 생체시료 내에 존재하는 방해물질로부터 분석 대상화합물을 분리하는데 시간이 소요되며, 이로 인하여 분석물질의 안정성이 낮아질 수 있다[Rapid Commun Mass Spectrom., 2009, 23:1783-1791; Anal Chem., 2007, 79:6020-6026]. 따라서, 시료전처리 후 분석물질을 짧은 시간에 다량의 시료를 분석할 수 있는 매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법을 적용할 수 있다[Anal Chem., 2006, 78:164-173]. 하지만, 이는 정량분석에 있어 기존의 방법들에 비해 재현성이 저하되는 문제가 있어 그 적용에 문제가 있다.
한편, 선천성 부신과형성증(congenital adrenal hyperplasia, CAH)의 경우, 부신피질에서 코티솔이 형성되는 과정에 장애가 발생하는 질환으로, 사이토크롬 P450계 효소인 스테로이드 21-하이드록실라제(hydroxylase)의 기능저하에 의한 발병율이 95% 이상을 나타낸다. 21-하이드록실라제의 결핍은 부신에서 생성되는 코티솔과 알도스테론의 생성을 저하시키는 동시에 부신피질자극호르몬(ACTH)의 과분비로 인하여 부신피질이 과형성되어 부신에서 남성호르몬의 생성을 촉진시켜 남성화를 진행시킨다[Endo. Rev., 2000, 21:245-279]. 현재까지 21-하이드록실라제 결핍의 진단은 도 1에서와 같이 21-하이드록시화(hydroxylation)의 전구 단계에서 생성되는 17α-하이드록시프로게스테론(17α-hydroxyprogesterone, 17α-OHP)의 농도를 혈청 내에서 측정하여 이루어지고 있다.
일반적으로 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 농도가 20 ~ 100 ng/mL 이상일 경우, 선천성 부신과형성증으로 진단할 수 있으며, 검사방법으로는 방사선면역법(radioimmunoassays, RIA), 형광면역법 (fluoroimmunoassays, FIA), 효소상관면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, EIA)등이 주로 사용된다. 이와 같은 효소의 활성 측정을 위한 효소면역친화성 방법들은 다양한 실험조건 등 여러 조건들에 의해 실험결과의 재현성이 낮은 단점을 지니고 있다[Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2007, 16:1004-1008; Ann. Clin. Biochem., 2008, 45:380-388]. 또한, 이러한 검사방법은 출생체중, 제태기간, 미숙아, 감염, 인공호흡기 치료 여부 등에 의한 검사결과의 변화가 많아 재검사가 필요한 경우가 늘어나고 있고 있다[Rev. Endocr. Metab. Disord., 2007, 8:349-363]. 따라서 혈청 내에서의 17α-하이드록시프로게스테론을 신속하면서도 정확하게 측정하는 정량 분석 기술이 요구되는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론을 보다 신속하고 정확하게 측정하고자 연구, 노력한 결과, 동위원소가 치환된 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 내부표준물질로서 첨가한 혈청으로부터 고체상 추출과정, 액체-액체 추출법을 통해 재추출한 후, 추출물을 레이져 탈착/이온화 질량분석기를 이용하여 선택적으로 검출하면 17α-하이드록시프로게스테론을 정량 분석할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론을 신속하고 정확하게 정량적으로 평가하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은,
혈청에 내부표준물질로서 동위원소가 치환된 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 첨가하는 단계;
친유성과 친수성을 갖는 공중합체 흡착제로 상기 혈청으로부터 호르몬을 추출한 뒤, 유기 용매로 재추출하는 단계; 및
상기 재추출된 분석물질과 α-시아노-4-하이드록시 시나믹산(α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid)을 혼합하여 결정화시키고, 레이져 탈착/이온화 질량분석기를 이용하여 선택적으로 호르몬을 검출하는 단계
를 포함하는 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 혈청으로부터 선천성 부신과형성증에 의해 변화되는 대표적인 부신호르몬인 17α-하이드록시프로게스테론을 정량곡선을 작성하지 않으면서도, 효과적으로 정량 분석할 수 있는 방법을 제공하므로, 선천성 부신과형성증의 발병 여부를 신속, 정확하게 평가할 수 있다.
도 1은 선천성 부신과형성증의 주요원인인 21-하이드록실라제에 의하여 생체 내에서 17α-하이드록시프로게스테론의 대사가 진행되는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 실시예의 매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법을 통하여 확인한 분석물질 및 동위원소가 치환된 내부표준물질의 질량분석 스펙트럼이며, m/z 253.15와 277.22는 각각 17α-하이드록시프로게스테론과 17α-하이드록시프로게스테론-d 8의 정량이온을 나타낸다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 동위원소가 치환된 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 내부표준물질로서 첨가한 혈청으로부터 고체상 추출과정, 액체-액체 추출법을 통해 호르몬을 추출한 후, 이를 레이져 탈착/이온화 질량분석기로 검출함으로써 17α-하이드록시프로게스테론을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.
먼저, 분석 대상 혈청에 동위원소가 치환된 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 내부표준물질로서 첨가한다.
이 때 사용되는 혈청의 양은 0.1 ~ 2.0 mL이 사용될 수 있으나, 분석감도와 시료채취의 문제점을 고려할 때 0.2 ~ 1.0 mL 이 바람직하다.
또한 상기 내부표준물질은 혈청 내 20 ~ 200 ng/mL의 농도로 첨가되는 것이 바람직한데, 선천성 부신과형성증으로 진단되는 환자들의 평균 농도가 약 100 ng/mL 인 점을 고려할 때 80 ~ 120 ng/mL의 농도로 첨가되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 내부표준물질이 첨가된 혈청을 pH 4 ~ 7 의 완충용액에 넣고 1 ~ 60 분간 상온에서 보관하여 단백질을 유리시키는 것이 바람직하다. 상기 단백질을 유리시키는 단계는 단백질과 비선택적으로 결합되어 있는 분석화합물을 유리시켜 보다 정확한 혈청 내 정량 분석을 가능하게 한다.
이후 친유성과 친수성을 갖는 공중합체 흡착제로 상기 혈청으로부터 호르몬을 고체상 추출법으로 추출한 뒤, 유기 용매로 pH 8 ~ 12 조건에서 액체-액체 추출법을 이용하여 재추출한다. 이때, 사용될 수 있는 유기 용매는 그 종류가 제한되지 아니하나, 바람직하게는 메틸-터셔리-부틸 에테르(methyl-tert-butyl ether, MTBE), 에틸아세테이트, 그리고 n-헥산 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용하는 것이 좋다.
상기 재추출물을 증발, 건조시킨 분석물질과 지방성화합물의 분석에서 주로 사용되는α-시아노-4-하이드록시 시나믹산(α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid)을 혼합하고 상온에서 1 ~ 20 분간 방치하여 결정화시킨다. 상기 결정화는 분석물질과 α-시아노-4-하이드록시 시나믹산의 혼합용액을 원심분리한 후 상온에서 건조하여 이루어지는 것이 바람직하다.
이후, 레이져 탈착/이온화 질량분석기를 이용하여 선택적으로 17α-하이드록시프로게스테론을 검출한다.
상기 과정을 통하여 별도의 정량 보정 곡선 등을 사용하지 않으면서도, 분석물질과 내부표준물질의 분석 감도를 직접적으로 비교하여 17α-하이드록시프로게스테론을 신속하게 정량 분석할 수 있다.
이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석
1) 내부표준물질의 첨가
17α-하이드록시프로게스테론을 포함하여 모든 스테로이드 호르몬이 제거된 혈청(Scipac사, Sittingbourne, UK)을 구입하여, 이 중 0.4 mL의 혈청에 17α-하이드록시프로게스테론(17α-OHP, 2 μg/mL) 및 동위원소가 치환된 내부표준물질(17α-OHP-d 8 , 2 μg/mL)을 각각 20 μL 첨가하여, 혈청 내 17α-OHP와 17α-OHP-d 8 의 농도가 100 ng/mL이 되도록 준비하였다.
2) 혈청 시료 내 단백질의 유리화
동위원소가 치환된 내부표준물질이 첨가된 혈청 시료 0.4 mL에 0.2 M 소디움 아세테이트 완충용액(sodium acetate buffer) 2.6 mL를 넣어 pH를 5.7 ~ 6.0 로 조절하였다. 그리고, 혈청 내 단백질을 유리시키기 위해 10분간 상온에서 보관하였다.
3) 고체상 추출법
고체상 추출방법에는 Oasis HLB 카트리지를 사용한다[Oasis HLBTM, 60 mg, Waters, Co., Milford, MA, USA]. 카트리지에 메탄올과 증류수 2 mL을 각각 흘려주고 상기 2)의 과정을 거친 혈청 시료를 카트리지에 흘려주었다. 불순물의 제거를 위해서 증류수를 2 mL 흘려주고, 이 후 메탄올 4 mL를 흘려주어 카트리지에 흡착되어있는 상기 2)의 분해물을 용출(elution)시키고, 용출액은 깨끗한 시험관에 받았다. 시험관에 받은 메탄올 용출액은 40 ℃에서 감압증류기(rotary evaporator)를 통하여 증발시켰다.
4) 액체-액체 추출법
증발된 3)의 시험관에 0.2 M 소디움 아세테이트 완충용액(sodium acetate buffer) 1 mL 를 첨가한 후, 에틸아세테이트과 노르말 헥산의 혼합 용매(2:3, v/v) 2.5 mL을 넣고, 10분간 교반하여 유기 용매층을 분취하였다. 분취된 용액을 40 ℃에서 질소기체를 사용하여 증발시킨 후, 이를 다시 P2O5/KOH를 이용하여 진공건조기(vacuum desiccator)에서 30분 이상 충분히 건조시켰다.
5) 매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법
매트릭스기반 레이져 탈착/이온화 질량분석법을 활용하여 혈청 내에 존재하는 17α-OHP를 분석하고자, α-시아노-4-하이드록시 시나믹산(CHCA) 매트릭스를 재조하였다.
상기 CHCA 매트릭스는 0.2%의 트리플루오로아세트산이 포함된 70% 아세토니트릴을 사용하여 CHCA의 농도가 10 mg/mL가 되도록 첨가하여 제조하였다. 상기 제조된 CHCA 매트릭스 10 μL를 상기 4)에서 준비된 시료 10 μL와 혼합하여 분석 시료를 얻었다.
상기 분석 시료를 결정화함에 있어 균일한 결정을 형성시키기 위하여, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane) 필터(0.1 μm)가 장착된 1.5 mL 의 원심분리튜브(Durapore PVDF; Millipore, Billerica, MA, USA)에 분석 시료를 첨가한 후, 1000 rpm에서 30초간 원심분리 하였으며, 이후 원심분리된 분석 시료 중 0.5 μL을 시료 주입판에 주입하여 상온에서 10분이상 건조하였다.
분석 대상인 17α-OHP과 내부표준물질인 17α-OHP-d 8 의 분석을 위하여 Linear Ion Trap Quadrupole Mass Analyzer를 연결한 Thermo MALDI (Thermo Fisher, San Jose, CA, USA)를 이용하여 펄스형 UV/MALDI（nitrogen)의 레이져로 하기 표 1과 같은 조건에서 분석하였다.
이온화조건 양이온화(positive ionization)
이온선택조건 선택이온탐지법 (selected reaction monitoring, SRM)
정량이온 17α-OHP (m/z 253)
17α-OHP-d 8 (m/z 277)
이온화충돌에너지 17α-OHP (70%)
17α-OHP-d 8 (75%)
질량스캔범위 m/z 200 ～ 400
6) 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석
상기 과정에 의하여 얻은 질량분석 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. 상기 질량분석 스펙트럼에서 분석물질인 17α-OHP의 농도는 질량값의 차이를 나타내는 17α-OHP와 17α-OHP-d 8 각 화합물의 정량이온이 나타내는 강도(intensity)를 절대적으로 비교하여, 내부표준물질의 농도로부터 신속하게 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 1
상기 실시예의 분석방법을 사용하여 스테로이드가 제거된 혈청에 분석물질인 17α-OHP 및 17α-OHP-d 8 을 각각 20, 30, 50, 100 그리고 200 ng/mL 농도로 첨가하여 분석하였다.
17α-OHP 농도 측정의 재현성 여부를 확인하고자 분석물질과 내부표준물질의 검출비율을 측정하되, 재현성 실험을 동일한 날(intra-day) 3회, 그리고 서로 다른 3일(inter-day)동안 수행하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112010080624308-pat00001
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 몰비율이 1이 되도록 17α-OHP 및 17α-OHP-d 8 을 5가지 서로 다른 농도로 첨가하여 정량분석한 결과, 반복된 실험에 의하여 농도를 측정하는데 있어 재현성 있는 결과가 나타났으며, 특히 100 ng/mL의 농도로 17α-OHP-d 8 을 첨가한 경우 가장 재현성 있는 결과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 2
상기 실시예의 분석방법을 사용, 효소상관면역흡착법에 의하여 선천성 부신과형성증(CAH)으로 의심되는 10명의 환자로부터 채취한 혈청에서, 상기 실시예의 과정을 통하여 17α-OHP 농도를 측정한 결과, 한명의 환자로부터 112.3 ng/mL 농도의 17α-하이드록시프로게스테론이 측정되었으며, 이는 일반적으로 알려진 선천성 부신과형성증 환자의 17α-OHP 농도 범위에 해당하였다.

Claims (4)

  1. 혈청에 내부표준물질로서 동위원소가 치환된 17α-하이드록시프로게스테론- d 8을 첨가하는 단계;
    친유성과 친수성을 갖는 공중합체 흡착제로 상기 혈청으로부터 17α-하이드록시프로게스테론과 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 추출한 뒤, 유기 용매로 재추출하는 단계; 및
    상기 재추출된 분석물질과 α-시아노-4-하이드록시 시나믹산(α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid)을 혼합하여 결정화시키고, 레이져 탈착/이온화 질량분석기를 이용하여 17α-하이드록시프로게스테론과 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 검출하는 정량분석 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 내부표준물질이 첨가된 혈청을 pH 4 ~ 7 의 완충용액에 넣고 1 ~ 60 분간 상온에서 보관하여 단백질을 유리시키는 단계를 포함하는 혈청 내 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 결정화는 분석물질과 α-시아노-4-하이드록시 시나믹산의 혼합물을 원심분리한 후 상온에서 건조하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 내부표준물질인 17α-하이드록시프로게스테론-d 8을 혈청 내 20 ~ 200 ng/mL의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 17α-하이드록시프로게스테론의 정량 분석 방법.
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