WO2006070815A1 - フザリウム毒抵抗性形質転換植物 - Google Patents

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WO2006070815A1
WO2006070815A1 PCT/JP2005/023928 JP2005023928W WO2006070815A1 WO 2006070815 A1 WO2006070815 A1 WO 2006070815A1 JP 2005023928 W JP2005023928 W JP 2005023928W WO 2006070815 A1 WO2006070815 A1 WO 2006070815A1
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WO
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vpe
plant
processing enzyme
endogenous gene
gene encoding
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PCT/JP2005/023928
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Inventor
Ikuko Nishimura
Miwa Kuroyanagi
Mikio Nishimura
Kenji Yamada
Original Assignee
Kyoto University
National Institutes Of Natural Sciences
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Definitions

  • the present invention relates to a fusarium toxin-resistant transformed plant and a background art relating to a method for producing the plant.
  • Non-patent Document 1 Plants lacking macrophages must break down the substances on their own in programmed cell death (PCD). Therefore, plants have evolved a unique cell death mechanism induced by vacuole breakdown (Non-patent Document 1). However, the key molecules involved in vacuole-mediated cell death have not yet been identified.
  • Fusarium genus bacteria have been a fungus that has long been a problem of susceptibility to useful plants as phytopathogenic fungi. Contamination of grains, etc., indication of carcinogenicity, It has been attracting attention as a result of poisoning accidents. Fusarium moniliforme, one of the bacteria, is capable of producing fumosin Bl (FBI). FBI induces PCD in the leaves of Arabidopsis thaliana. It is known to do.
  • Non-patent literature 1 Lam, E., Controlled cell death, plant survival and development., Nat. Rev. Mol. Cell biol. 5, 305-315 (2004)
  • the present invention provides a fusarium toxin-resistant transformed plant that exhibits resistance to fusarium poisons produced by Fusarium bacteria and does not cause PCD due to fusarium poisons, and a method for producing the plants The purpose is to do.
  • the present invention provides:
  • A or a step of obtaining a vector comprising DNA encoding RNA that can bring about suppression of expression of an endogenous gene encoding a vacuolar processing enzyme
  • step (1) (2) introducing the vector obtained in step (1) into a plant cell to obtain a plant cell lacking the function of a vacuolar processing enzyme;
  • the method further comprises the step of crossing the transformant and product obtained in step (3). Described method,
  • a method of screening for an agent for imparting resistance to fusarium poisons against plants and
  • a method for expressing fusarium poison resistance in a plant comprising a step of treating the plant with a fusarium poison resistance-imparting agent obtainable by the method according to [7],
  • a fusarium toxin-resistant transformed product that exhibits resistance to fusarium poisons produced by Fusarium bacteria and does not cause PCD due to fusarium poisons can be obtained.
  • the plant can be expected to increase the yield, and has the advantage that the damage caused by Fusarium bacteria is reduced. Therefore, by applying the present invention to useful plants such as cereals such as corn, millet, and wheat, and wheat, it is possible to increase their production efficiency or prevent adverse effects on human livestock caused by Fusarium bacteria. be able to.
  • FIG. 1 shows that JL ⁇ EE is essential for FBI-induced PCD in Arabidopsis leaves.
  • a FBI was infiltrated into leaves of wild type (WT) and VPE-null mutant (null) plants grown on agar plates. In the VPE-null mutant, no FBI-induced disease formation was observed. Plants were photographed 5 days after infiltration. The asterisk is the site of FBI infiltration.
  • b FBl was infiltrated into the right half of the harvested leaves of wild-type (WT) and VPE-null mutant (null) plants. Changes in the development of lesions in the leaves were monitored from day 5 to day 7 after infiltration.
  • c FBI was collected from various VPE mutants including wild type (WT), a VPE-3, fi VPE-5, / VPE-L ⁇ VPE-1 and VPE-null mutant (null) Soaked in the right half of the leaf. On day 6 after infiltration, the cocoon plant was photographed.
  • d RT- showing changes in mRNA levels of a VPE, B VPE. ⁇ ⁇ . ⁇ VPE and ACT2 (actin) in FBI-infiltrated leaves of various VPE mutants described in wild type (WT) and c PCR. 3 independent experiments Similar results were obtained.
  • VPE deficiency is a figure showing that vacuole membrane disruption and DNA degradation are suppressed between FBI-induced PCDs.
  • a-d Electron micrographs of wild-type (WT) and VPE-null mutant (null) leaves 3 and 5 days after FBI infiltration. The inserted images a and d show high-magnification images of the enclosed areas. Black arrow, intact part of vacuolar membrane; white arrow, disrupted part of vacuolar membrane; V, vacuole; V *, disrupted vacuole; asterisk, cell without vacuolar membrane; Ch, chloroplast; CW , Cell wall; PM, plasma membrane.
  • the bars a and b are 2 ⁇ m, the bars c and d are 5 m, and the bars in the a and d insets are 0.5 ⁇ m.
  • e Pulsed field gel electrophoresis of total DNA from 7 days FBI-treated (+) or untreated (-) wild-type (WT) leaves and VPE-null mutant (null) leaves.
  • FIG. 3 shows that yVPE is a proteinase exhibiting caspase 1-like activity.
  • a To determine Km values, proteinase activity against the indicated substrates was measured with recombinant Arabidopsis ⁇ ⁇ (see method) expressed in insect cells. n.d. indicates that no force was detected.
  • b Effects of various inhibitors on VPE activity (top) and caspase-like activity (bottom). The numbers above represent the respective inhibitors used (20 ⁇ M): 1, none; 2, Ac-YVAD-CHO; 3, Ac-xVAD-fink; 4, Ac-YVAD-cmk; 5, E 64-d; 6, antipine; 7, leupeptin.
  • Thread-replacement ⁇ VPE precursor (proVPE) (lanes 1, 2, 7 and 8) is intermediate GVPE) (lanes 3, 4, 9 and 10), then mature form (mVPE) (lanes 5, 6, 11) And 12).
  • ⁇ VPE Thread-replacement ⁇ VPE precursor
  • GVPE intermediate GVPE
  • mVPE mature form
  • Each type of ⁇ VPE was incubated in the absence (-) or presence (+) of a caspase inhibitor (Piotin-xVAD-foik) and subjected to SDS-PAGE, followed by Western blotting with anti- ⁇ VPE antibody ( Lanes 1-6, anti-gamma VPE) or streptavidin-conjugated western sabi peroxidase (lanes? -12, inhibitors) and 7 inhibitor plots.
  • FIG. 4 shows that both VPE inhibitor and caspase 1 inhibitor suppress FBI-induced pathogenesis.
  • a Imbi cystine proteinase inhibitors with or without VPE inhibitors (Ac-ESEN-CHO) or caspase 1 inhibitors (Piotin-YVAD-fink) The right half was infiltrated. 4 days after infiltration I took a picture of the leaves in my eyes.
  • b VPE-null mutant does not have VPE activity and caspase 1-like activity. These proteinase activities were measured in wild type (WT) or VPE-null mutant (null) FBI-infiltrated leaves with or without caspase 1 inhibitor.
  • VPE vacuolar processing enzyme
  • VPE has four types of VPE, a VPE, j8 VPE, ⁇ VPE, and ⁇ VPE.
  • the present inventors have produced mutant plants lacking these genes, and obtained FBI-induced PCD and VPE.
  • VPE is involved in FB1-induced PCD in Arabidopsis, and that ⁇ ⁇ is essential, and that VPE expression is induced by FBI.
  • VPE exhibits the same enzyme activity as caspase-1, which is known as a key molecule for cell death in animals. This activity is inhibited by an inhibitor of caspase-1, and further, Arabidopsis thaliana is inhibited by the inhibitor.
  • FBI-induced PCD was blocked by treating leaves.
  • the term "fusarium toxin” refers to an FBI analog that causes plant PCD by inducing the expression of FBI or VPE produced by Fusarium bacteria.
  • Examples of “Fusarium bacteria” include Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, and the like.
  • the fusarium toxin-resistant transformed plant of the present invention is one that lacks the function of VPE.
  • VPE function means that a plant completely lacks VPE function or substantially lacks the enzyme function to such an extent that PCD cannot be induced.
  • the mode of lacking the function of plant-powered VPE is not particularly limited, and examples thereof include modification of an endogenous gene encoding VPE or suppression of expression of an endogenous gene encoding VPE. It is done.
  • endogenous gene refers to a gene originally present in a plant to be transformed.
  • genes are used without distinction of exogenous.
  • modification of an endogenous gene encoding VPE may be a genetic modification capable of losing the original function of expressing VPE.
  • opening of an endogenous gene encoding VPE A genetic modification that destroys the reading frame of the reading frame.
  • genetic modifications that destroy the open reading frame include introduction of mutations that cause frameshift mutations. More specifically
  • the "other polynucleotide” refers to a polynucleotide that is heterogeneous in terms of a gene that encodes VPE but does not encode VPE.
  • Examples of the gene encoding VPE include nucleic acids having the base sequences described in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7. They are genes that in turn encode a VPE, j8 VPE, ⁇ VPE and ⁇ VPE. Genetic modification may be present in all endogenous genes encoding VPE, but should be present in at least the endogenous gene encoding ⁇ . Therefore, taking the endogenous gene encoding ⁇ ⁇ as an example, the (a) to (c) are, for example,
  • each region of SEQ ID NO: 5 As the equivalent to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, positions 1663 to 1845, 2261 to 2425, 2505 to 2661, 2748 to 2833, 2908 to 3156, 2271 to 3480, 3271 to 3480, 3576 to 3379 And an endogenous gene encoding each region force j8 VPE at positions 4005 to 4184, corresponding to each region of SEQ ID NO: 5, 181 to 384 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 , 678-842, 1327-1483, 1590-1675, 1768-1967, 2045-2093, 2187-2390, 2496-2696, and 2780-2965 As for the endogenous gene to be encoded, the base described in SEQ ID NO: 7 is assumed to
  • a part of an endogenous gene encoding VPE refers to a part responsible for the functional expression of VPE, preferably a gene part encoding an active center, a substrate binding site, and the like.
  • a gene part corresponding to each region indicated by the base number in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 can be exemplified.
  • the "corresponding region” refers to, for example, a sequence based on multi-nozzle alignment by the ClustalW method by Higgins et al. (F column, Gap penalty 5, Fixed Gap penalty 10 ⁇ windows size 5, Floating Gap 10), etc. Number: Refers to the region corresponding to the base sequence described in 1, 3, 5 or 7 when aligned optimally. [0019] The base sequences of the other polynucleotides in (b ') and (c') are as long as the open reading frame of the endogenous gene encoding ⁇ can be destroyed.
  • Examples include base sequences having stop codons that match the reading frame, base sequences consisting of a number of bases other than multiples of 3, or independent genes such as drug resistance genes that serve as markers. The same applies to the endogenous gene encoding a VPE,
  • the gene encoding VPE includes a nucleic acid having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7. Examples of the gene include, for example, those nucleotide sequences. It may be a nucleic acid encoding a polypeptide having a base sequence substituted with at least one base and having VPE enzyme activity. In this specification, “at least one” means one or several.
  • VPE genes encoding VPE include nucleic acids encoding the polypeptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8.
  • the amino acid sequences are ⁇ VPE, ⁇ VPE, ⁇ VPE, and ⁇ VPE in that order.
  • a gene encoding VPE encodes a polypeptide having an amino acid sequence ability in which at least one amino acid is substituted, deleted, added, or inserted in the amino acid sequence, and the polypeptide is a VPE. It may be a nucleic acid having an enzymatic activity.
  • the gene encoding VPE includes a nucleic acid consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. It may be a nucleic acid that can hybridize with a nucleic acid encoding a sequence under stringent conditions and encodes a polypeptide having the enzyme activity of VPE.
  • VPE encodes a nucleic acid comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8.
  • Nucleic acid variants, derivatives, Norient or homologues are included. These are similarly used in the present invention.
  • the "enzyme activity of VPE” refers to, for example, adding Ac-ESEN-MCA or Z-AAN-MCA as a substrate to an aqueous solution of an activity measurement target (eg, polypeptide, protein), Increase the fluorescence intensity of the reaction mixture at 25 ° C using a fluorescence spectrophotometer or fluorescence probe. It can be evaluated by measuring at an excitation wavelength of 380 nm and an emission wavelength of 460 nm using a rate reader.
  • Such substrates are also available, for example, from peptide laboratories.
  • “Ac” represents a acetyl group
  • Z represents a benzyloxycarbonyl group
  • MCA represents 4-methylcoumaryl mono-amide
  • the others represent amino acids in one letter code. It is.
  • a step of removing the non-specifically hybridized probe by washing where washing is performed under conditions of low ionic strength and Z or higher temperature than the viewpoint power to improve accuracy.
  • Tm is, for example, the following formula:
  • Tm 81.5 + 16.6 (loglO [Na +]) + 0.41 (% G + C) — (600 / N)
  • N is the length of the oligonucleotide and% G + C is the content of guanine and cytosine residues in the oligonucleotide
  • suppression of expression of an endogenous gene encoding VPE means suppression of transcription of the gene, suppression of translation into a protein, complete stop of expression of the gene, and This refers to a decrease in expression, and includes that the translated protein does not perform its original function in plant cells.
  • One of the powers selected from the group of powers is Koyochi.
  • the expression of an endogenous gene encoding VPE in a plant (hereinafter sometimes referred to as a target gene) is expressed as an antisense RNA complementary to a part or all of the transcription product of the gene. It is intended to suppress by introducing DNA encoding.
  • the antisense RNA of the present invention may suppress the expression of a target gene by any of the actions described above.
  • DNA encoding antisense RNA complementary to part or all of the target gene transcript (mRNA) is an example of an endogenous gene encoding at least part of the target gene mRNA, for example, ⁇ ⁇ .
  • DNA encoding an antisense RNA complementary to a part of the transcript of the gene from a region corresponding to at least one region selected from the group consisting of positions 4297 to 4503 and 4812 to 4991 can be mentioned.
  • the base sequence of the antisense RNA is preferably complementary to part or all of the target gene transcript, but is not completely complementary as long as the target gene expression can be effectively suppressed. Also good.
  • sequence identity between the complementary DNA strand of DNA encoding antisense RNA and the target gene is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the endogenous gene encoding a VPE corresponds to each region of SEQ ID NO: 5 and positions 1663 to 1845 and 2261 to 2425 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1. 2505-2661, 2748-2833, 2908-3156, 3271-3480, Regarding the endogenous gene encoding each region force j8 VPE at positions 3576 to 3779 and 4005 to 4184, it is assumed that it corresponds to each region of SEQ ID NO: 5 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3.
  • sequence identity means that at least two sequences to be compared are appropriately aligned, the same residue present in each sequence is determined, and the number of matching sites is calculated. A value that can be calculated by dividing the number of matching sites by the total number of residues in the sequence region to be compared and then multiplying the resulting value by 100. Specifically, such sequence identity can be calculated by a BLAST algorithm that is generally available, for example, at the home page address http: ZZwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. The length of the DNA encoding the antisense RNA may be appropriately determined as desired without any particular limitation.
  • (m) is intended to suppress the expression of an endogenous gene encoding VPE in a plant by introducing a DNA encoding a ribozyme that cleaves the transcription product of the gene.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule that has catalytic activity. Although ribozymes have various activities, it is possible to design a DNA encoding a ribozyme that cleaves a target gene mRNA in a site-specific manner according to a known method.
  • RNA interferance a phenomenon in which when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and endogenous target gene are both suppressed. .
  • RNA that suppresses the expression of the endogenous gene encoding VPE due to the RNAi effect during expression
  • the DNA to be encoded for example, the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 as described above, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 are encoded. DNA, mutants, derivatives, Noriant or homologues of those DNAs.
  • the base sequence of DNA used for RNAi does not need to be completely identical to the target gene.
  • Power Preferably 90% or more, more preferably 95% or more of sequence identity. Sequence identity is determined by the method described above.
  • (o) is a co-suppression caused by introducing into a plant a DNA having a sequence identical or similar to the base sequence of the gene, expressing the endogenous gene encoding VPE in the plant. Is to try to suppress.
  • “Co-suppression” is a phenomenon in which when a gene having the same or similar sequence as an endogenous target gene is introduced into a plant by transformation, the expression of the introduced foreign gene and endogenous target gene are both suppressed. That means.
  • Examples of DNA encoding RNA that suppresses the expression of an endogenous gene encoding VPE due to a co-suppression effect during expression include, for example, the base described in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 as described above.
  • DNA having sequence ability examples thereof include DNA having sequence ability, DNA encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and variants, derivatives, variants or homologues of those DNAs.
  • the base sequence of DNA used for co-suppression need not be completely identical to the target gene, but preferably has 90% or more, more preferably 95% or more sequence identity. Sequence identity is determined by the method described above.
  • the fusarium toxin-resistant transformed plant of the present invention has, for example, a polynucleotide or DNA (hereinafter referred to as mutagenesis DNA) that lacks the function of VPE, that is, VPE, in the manner described above.
  • DNA that can cause modification of the encoding endogenous gene or RNA that can cause suppression of expression of the endogenous gene encoding VPE is inserted into an appropriate vector, introduced into a plant cell, It can be produced by regenerating transformed plants from cells.
  • a step of regenerating a transformed plant from the plant cell obtained in step (2) can be produced by a method comprising:
  • step (1) DNA for mutagenesis is prepared.
  • the gene encoding VPE should be isolated, for example, using PCR or screening of plant-derived gene libraries based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7. I can do it.
  • the modification of the base sequence can be performed by recombinant nucleic acid techniques commonly used in the art such as ligation of amplified nucleic acids by PCR and site-specific mutation.
  • any polynucleotide chain can be synthesized by a conventional method.
  • the mutation-introducing DNA may include a part of the gene coding for VPE that is partially deleted. It may be a force obtained by substitution with another polynucleotide, or a nucleic acid obtained by inserting another polynucleotide, or another polynucleotide that causes substitution or insertion in a gene encoding VPE.
  • the other polynucleotide may be T-DNA itself from which the tumor gene was removed from Ti plasmid derived from Agrobacterium.
  • the mutation-introducing DNA is inserted into the vector.
  • the vector is not particularly limited as long as it is a vector that can introduce the mutation-introducing DNA into a plant. Examples thereof include plasmid vectors derived from E. coli and binary vectors such as pBI101 and pBI121.
  • the DNA for introducing the mutation into the vector may be inserted using the restriction enzyme site or the cloning site of the vector to be used.
  • the mutation-introducing DNA may be inserted into a vector so as to be expressed under the control of an appropriate promoter.
  • enhancer terminator 1 may be present in the vector.
  • the vector may contain a gene resistant to antibiotics such as kanamycin and neomycin as a selection marker.
  • the DNA for mutagenesis into the genome of the plant to be introduced by homologous recombination, for example, on both sides of the desired target insertion site of the DNA for mutagenesis in the genome.
  • Mutation-introducing DNA may be placed between flanking sequences each having homology to a certain base sequence.
  • the mutation-introducing DNA has a deletion of a part of the gene encoding VPE, or a force obtained by substituting a part thereof with another polynucleotide, or another polynucleotide.
  • the former encodes the nucleic acid and the VPE of the plant from the viewpoint of enhancing the target gene destruction efficiency.
  • a vector capable of producing homologous recombination with an endogenous gene and in the latter, a vector capable of producing homologous recombination between the polynucleotide and a desired site in an endogenous gene encoding a plant VPE, It is preferable to use each.
  • the plant from which the plant cell into which the vector obtained in step (1) is introduced in step (2) is not particularly limited.
  • Examples of the plant include Arabidopsis thaliana, corn, chestnut, wheat, and the like.
  • Plant cells include various forms of plant cells, such as suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and callus.
  • a known method such as a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation method), a method using an agrobatterium, or a particle gun method can be used.
  • Plant cells into which the vector has been introduced can be selected, for example, based on the selection marker used.
  • VPE Whether or not the function of the selected plant cell force VPE is deficient is examined, for example, for the plant cell extract by examining that VPE is not expressed by ELISA or Western blotting, This can be confirmed by examining the absence of VPE enzyme activity.
  • the mutation-introducing DNA is a gene obtained by deleting a part of the VPE-encoding gene, a force obtained by substituting a part thereof with another polynucleotide, or another polynucleotide inserted. If the desired homologous recombination has occurred in the cell, the plant cell has lost the function of VPE. Therefore, plant cells lack VPE function by confirming whether homologous recombination has occurred, for example, by conventional methods such as Southern blotting and PCR. It can be confirmed that there is.
  • the transformed plant is regenerated from the plant cell obtained in the step (2).
  • Character Regeneration of the plant body from the transferred cell may be performed by a known method depending on the type of the plant cell.
  • For the regeneration of transformed plants see, for example, the cell engineering separate volume “Experimental Protocols for Model Plants Rice * Arabidopsis Edition” (first edition, published by Shujunsha Co., Ltd.) and address h ttp: z / www. Gene, mie ac. jpz Protocol / Original / fransform-Nicoti (Agro).
  • the introduction of a DNA for introducing a mutation into a plant can also be carried out using hybridization in addition to the method of introducing a predetermined vector into a plant as described above. For example, first, by introducing a vector, a plant that retains the DNA for mutagenesis in the genome is prepared, and then the plant is crossed with a natural plant of the same kind or for mutagenesis in the genome. Mutation-introducing DNA can be introduced into a plant by crossing with a plant that holds a DNA for mutagenesis different from the plant that holds the DNA.
  • the method for producing a fusarium toxin-resistant transformed plant of the present invention may further include a step of crossing the transformed product obtained in step (3) as step (4).
  • a transformed plant into which the mutation-introducing DNA is introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. Further, it is also possible to obtain a propagation material (eg, seed, strain, callus, protoplast, etc.) and mass-produce the plant on the basis of the plant, its progeny or clonal power. All the progeny obtained in this way are also included in the transformed plant of the present invention. Since the transformed plant of the present invention lacks the function of VPE, it is resistant to fusarium toxin and does not produce PCD.
  • a propagation material eg, seed, strain, callus, protoplast, etc.
  • the transformed plant of the present invention has a higher production efficiency than the conventional corresponding plant, and the transformed product of the present invention can be ingested in place of the conventional corresponding plant. It can also prevent adverse effects on human livestock caused by Fusarium spp. Such as the occurrence of equine cerebral leukomalacia, pulmonary edema in pigs, liver and kidney damage in higgies.
  • the present invention also provides, as one aspect, a method for screening a fusarium poison resistance-imparting agent for plants.
  • VPE the causative molecule of plant fusarium poison-inducing PCD
  • a substance that inhibits the enzyme activity of the enzyme can function as a fusarium poison resistance-imparting agent for plants. Therefore, the imparting agent can be screened by evaluating whether the test substance inhibits the enzyme activity of VPE.
  • the screening method of the present invention specifically includes
  • the enzymatic reaction by VPE in the step (1) may be carried out in the same manner as in the evaluation method for "enzymatic activity of VPE" except that the reaction is carried out in the presence of an appropriate amount of the test substance. As a control, perform the enzyme reaction in the same way except that the test substance is not present.
  • step (2) the enzyme activity of VPE is measured, for example, the activity is expressed as specific activity (pmol / min Zmg protein), and the value of the specific activity of VPE is higher than that in the absence of the test substance.
  • the test substance that decreases in its presence is selected as a fusarium poison resistance-imparting agent for plants.
  • plant VPE exhibits enzyme activity similar to that of animal caspase 1, and this activity is inhibited by caspase-1 inhibitors. Therefore, as the fusarium poison resistance-imparting agent obtained by the screening method of the present invention, for example, Ac-ES EN-CHO, which is a VPE inhibitor, Ac- YVAD-CHO, piotine, which is an inhibitor of caspase 1, -xVAD-fmk, biotin—YVAD—fmk, and biotin—YVAD—cmk.
  • Ac represents an aldehyde group
  • x represents an arbitrary amino acid
  • fmk represents a fluoromethyl ketone group
  • cmk represents a chloromethyl ketone group.
  • the others indicate amino acids in one-letter code.
  • the present invention provides, as one aspect, a step of treating a plant with a fusarium poison resistance-imparting agent.
  • a method for expressing Fusarium poison resistance in a plant is provided.
  • the imparting agent include substances that can be obtained by the screening method.
  • the treatment method of the plant is not particularly limited.
  • the treatment with the fusarium poison resistance-imparting agent of the plant is performed in a solid state such as a powder or a liquid state such as a suspension according to the physical properties of the imparting agent Alternatively, it can be carried out by bringing the agent into contact with the leaves, roots, flowers, stems, etc. of the plant in a gaseous state such as a spray solution or gas of the liquid.
  • Powerful imparting agents inhibit plant VPE enzyme activity, resulting in resistance to fusarium poisons in plants.
  • VPE-3 was obtained from Syngenta Biotechnology and VPE-1 was prepared according to Shimada et al. [J. Biol. Chem. 278, 32292-32299 (2003)]. Both are T-DNA insertion mutants.
  • _ ⁇ £ ⁇ has a GA insertion in the first exon and was prepared according to Shimada et al.
  • VPE-1 is also a T-DNA insertion mutant, but from the group of Arabidopsis plants provided by Kazusa DNA Institute (Kazusa DNA Institute), the following primers:
  • VPE-kFW 5 -TCATGCAAGGTGCTTATGTGTGA-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • VPE- kRV 5,-CGTCCGTACCGTACAGTTGGTA-3'
  • P06RB 5 -TTCCCTTAATTCTCCGCTCATGATC-3 '(SEQ ID NO: 11, T-DNA light ho', for orderer)
  • the reaction volume was subjected to reverse transcription with SuperScriptll (Invitrogen).
  • This reaction solution (0.41) was used for PCR in a 40 1 reaction solution containing Takara Ex Taq polymerase (Takara Bio Inc.).
  • Primer sets for yVPE and ACT2 (actin2) were used (see Shimada et al. for the former and Ratcliffe, 0. J. et al., Plant Cell 15, 1159-1169 (2003) for the latter).
  • Primer set is as follows: a VPE forward framer: 5'—TCTAGAATGACCACCGTCGTTTCCTTTCT CG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • 5 VPE forward framer: 5′— TCTAGAATGGCTAAGTCTTGCTATTTCAG AC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
  • PCR was performed for 25 cycles at an annealing temperature of 55 ° C (VPE) or 60 ° C (ACT2).
  • Sf21 insect cells expressing ⁇ were prepared as described in Kuroyanagi, et al. [Plant Cell Physiol. 43, 143-151 (2002)]. This cell is then neutralized to obtain a proprotein precursor of ⁇ VPE [20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1 mM phenol methylsulfur fluoride (PMSF)], or acidic solution (50 mM sodium acetate, pH 5.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1 to obtain both intermediate and mature forms of ⁇ ⁇ ) Incubation for 1 hour on ice. These forms of ⁇ VPE were partially purified.
  • recombinant ⁇ VPE (1.6-4.0 g ) was preincubated in 100 mM sodium acetate, pH 5.5, and 100 mM dithiothreitol mononore.
  • the increase in fluorescence intensity was measured at 460 nm using a fluorescence spectrophotometer (RF-5000, Shimadzu Corporation). Km values were determined using each substrate from 80 to 400 / ⁇ M.
  • recombinant ⁇ VPE and each inhibitor (20 ⁇ ) were used: three caspase 1 inhibitors [Piotin-xVAD-ftnk and Piotin-YVA D- cmk (Calbiochem), and Ac-YVAD-CHO (Peptide Laboratories)], one force Spurase 3 inhibitor [Ac-DEVD-CHO (Peptide Laboratories)] and three cysteine proteinase inhibitors [E64 -d, antipine and leupeptin (Peptide Institute).
  • the leaf extract was mixed with 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, and 100 ⁇ M E64-d [(L-3-trans-ethoxycarbonyloxirane-2-ethoxycarbonyloxirane) -L -Prepared using 100 mM sodium acetate (pH 5.5) containing leucine (3-methylbutyl) amide], VPE activity against Z-AAN-MCA (1 mM) was measured using a fluorescent microplate reader. ) (GENios, TECAN).
  • a sample solution containing recombinant ⁇ VPE was incubated with 20 ⁇ ⁇ iotin-xVAD-fink.
  • the resulting enzyme-inhibitor complex was subjected to SDS-PAGE and transferred to a GVHP membrane (0.22 / zm; manufactured by Millipore, Japan).
  • the membrane was treated with blocking solution and then with 20 ⁇ streptavidin-conjugated horse radish peroxidase (Amersham Pharmacia Biotech) for 1 hour.
  • Detection was performed using an amplification chemiluminescence kit (ECL system, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • ECL system amplification chemiluminescence kit
  • the agarose plug containing the extract from the FBI-treated leaves was incubated in 10 mM Tris-HC1, pH 8.0, 0.5 M EDTA, 1.0% sarkosyl and 1 mg / ml proteinase K for 18 hours at 55 ° C. (Nalkfield gel electrophoresis was performed as described in (Balk, J.; ⁇ [Plant J. 34, 573-583 (2003)]).
  • VPE-null mutant arabidopsi Mutant (VPE-null mutant) was prepared.
  • the leaves of wild type and VPE-null mutant plants were treated with fungal toxin (FBI) which causes plant PCD.
  • FBI fungal toxin
  • each VPE single mutant leaf was examined for FB1-induced disease formation. Three single mutants, a VPE-3. 5-5, and ⁇ VPE-1, formed lesions as well as wild-type plants,
  • ⁇ ⁇ is considered to function mainly in FBI-induced PCD.
  • vacuolar proteinase ⁇ ⁇ ⁇ is essential for FBI-induced PCD in Arabidopsis leaves.
  • vacuoles The morphological changes of vacuoles during FBI-induced PCD were investigated. Three days after FBI infiltration, vacuoles partially collapsed in wild type leaves and formed several membrane blisters (indicated by arrows, FIGS. 2a and b). On the other hand, the plasma membrane, cell wall and other organelles remained intact (Fig. 2a). Various organelles moved away from the plasma membrane, indicating a loss of turgor pressure in the cells. On the fifth day, the vacuolar and plasma membranes are completely disrupted and other organelles are It was roughly distributed in the vesicle (Fig. 2c).
  • caspase-like activity is related to plant cell death [Lam, E and del Pozo, O., Plant Mol. Biol. 44, 417-428 (2000), Woltering, EJ et al., Plant Physiol. 130, 1764-1769 (2002)].
  • no peptinase showing caspase activity has yet been identified in plants.
  • the present inventors have reported that VPE shows activity against aspartic acid as well as caspase even though it is an asparaginyl endopeptidase [Hiraiwa, N. et al, FEBS Lett. 447, 213. -216 (1999)].
  • the Km value for caspase-1 substrate (44.2 ⁇ ⁇ ) is comparable to the value reported for mammalian caspase-1 (11-23 ⁇ ).
  • Inactive procaspase 1 has been shown to be converted to an autocatalytically active mature enzyme.
  • the precursor of ⁇ ((pro VPE, lane 1) is autocatalytically intermediate (iVPE, lane 3), then mature (mVPE, lane 5). ).
  • ProVPE, iVPE, and mVPE were subjected to inhibitor plots to determine whether each type of ⁇ VPE binds to piotin-xVAD-ftnk.
  • VPE and caspase 1-1-like activity are associated with FBI-induced PCD.
  • both VPE and caspase 1-like activity were found in the extract from FBI-treated leaves.
  • the caspase-1 inhibitor decreased VPE activity to 67% at a concentration of 10 / z M and inhibited VPE activity at a concentration of 100 M (FIG. 4b, left panel).
  • the caspase 1 inhibitor also completely inhibited caspase 1-like activity at a concentration of 100 ⁇ M (FIG. 4b, right).
  • neither VPE activity nor caspase 1-like activity was detected in the leaves of the VPE-null mutant (Fig. 4b).
  • SEQ ID NO: 9 is the base sequence of the primer used in the examples.
  • SEQ ID NO: 10 is the base sequence of the primer used in the examples.
  • SEQ ID NO: 11 is the primer used in the Examples, one base sequence.
  • SEQ ID NO: 12 is the primer used in the Examples, one base sequence.
  • SEQ ID NO: 13 is the primer used in the examples, one base sequence.
  • SEQ ID NO: 14 is the base sequence of the primer used in the examples.
  • SEQ ID NO: 15 is the primer used in the Examples and one base sequence.
  • SEQ ID NO: 16 is the base sequence of the primer used in the examples.
  • SEQ ID NO: 17 is the base sequence of the primer used in the examples.
  • the present invention provides a fusarium toxin-resistant transformed plant that exhibits resistance to fusarium venom produced by a bacterium belonging to the genus Fusarium and does not cause PCD due to fusarium venom, and a method for producing the plant.

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Abstract

　本発明は、液胞プロセシング酵素の機能を欠損したフザリウム毒抵抗性形質転換植物、ならびに（１）液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子に改変をもたらし得るＤＮＡ、または液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の発現抑制をもたらし得るＲＮＡをコードするＤＮＡを含有してなるベクターを得る工程、（２）工程（１）で得られたベクターを植物細胞に導入し、液胞プロセシング酵素の機能を欠損した植物細胞を得る工程、および（３）工程（２）で得られた植物細胞から形質転換植物を再生させる工程、 を含む、液胞プロセシング酵素の機能を欠損したフザリウム毒抵抗性形質転換植物の作製方法を提供する。    

Description

技術分野
[0001] 本発明は、フザリウム毒抵抗性形質転換植物、および該植物の作製方法に関する 背景技術
[0002] マクロファージを欠く植物は、プログラム細胞死（PCD)にお 、て物質を独力で分解 しなければならない。そこで、植物は、液胞崩壊によって誘発される独特な細胞死機 構を進化させている (非特許文献 1)。しかしながら、液胞を媒介する細胞死に関与す る鍵分子は未だ同定されて ヽな 、。
[0003] 一方、フザリウム (Fusarium)属細菌は植物病原菌として古くから有用植物への罹病 性が問題となる菌類であり、穀物などの汚染、発ガン性の指摘、カビ被害穀物を摂取 した人畜の中毒事故が契機となって注目されてきた。該細菌の 1種であるフザリウム' モ-リフオルメ (Fusarium moniliforme)はフモ-シン Bl (FBI)を産生する力 FBIはシ ロイヌナズナ〔ァラビドプシス ·サリアナ (Arabidopsisthaliana)〕の葉にお 、て PCDを誘 導することが知られている。
非特干文献 1： Lam, E., Controlled cell death, plant survival and development., Nat. Rev. Mol. Cell biol. 5, 305-315 (2004)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、フザリウム属細菌が産生するフザリウム毒に対して抵抗性を示し、フザリ ゥム毒による PCDを生じな 、フザリウム毒抵抗性形質転換植物、および該植物の作 製方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] すなわち、本発明は、
〔1〕 液胞プロセシング酵素の機能を欠損したフザリウム毒抵抗性形質転換植物、 〔2〕 液胞プロセシング酵素の機能の欠損力 液胞プロセシング酵素をコードする内 因性遺伝子の改変、または液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の発現 抑制によるものである、前記〔1〕記載の植物、
〔3〕 前記改変が、
(a)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の一部または全ての欠失、
(b)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の一部または全ての他のポリヌ クレオチドによる置換、および
(c)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子中への他のポリヌクレオチドの 挿入、
力もなる群より選ばれるものである、前記〔2〕記載の植物、
〔4〕 前記発現抑制が、
(1)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の転写産物の一部または全てと 相補的なアンチセンス RNAをコードする DNAの導入、
(m)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の転写産物を切断するリボザ ィム活性を有する RNAをコードする DNAの導入、
(n)発現時に、 RNAi効果により、液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子 の発現を抑制する RNAをコードする DNAの導入、および
(o)発現時に、共抑制効果により、液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子 の発現を抑制する RNAをコードする DNAの導入、
力らなる群より選ばれるもの〖こよるものである、前記〔2〕記載の植物、
[5] (1)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子に改変をもたらし得る DN
A、または液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の発現抑制をもたらし得 る RNAをコードする DNAを含有してなるベクターを得る工程、
(2)工程（1)で得られたベクターを植物細胞に導入し、液胞プロセシング酵素の機能 を欠損した植物細胞を得る工程、および
(3)工程 (2)で得られた植物細胞から形質転鎌物を再生させる工程、
を含む、液胞プロセシング酵素の機能を欠損したフザリウム毒抵抗性形質転換植物 の作製方法、
〔6〕 （4)工程 (3)で得られた形質転,物を交雑する工程をさらに含む、前記〔5〕 記載の方法、
〔7〕 （1)被験物質の存在下、液胞プロセシング酵素による酵素反応を基質 Ac— ES
EN - MCAまたは Z— AAN - MCAに対して行う工程、および
(2)酵素活性を測定し、被験物質の非存在下に比べて該活性を減少させる被験物 質を植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤として選択する工程、
を含む、植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤のスクリーニング方法、ならびに
〔8〕 前記〔7〕に記載の方法で得られ得るフザリウム毒抵抗性付与剤で植物を処理 する工程を含む、植物におけるフザリウム毒抵抗性の発現方法、
に関する。
発明の効果
[0006] 本発明によれば、フザリウム属細菌が産生するフザリウム毒に対して抵抗性を示し、 フザリウム毒による PCDを生じないフザリウム毒抵抗性形質転 ^¾物が得られる。該 植物は、対応する一般の植物と比べて、収量増加が期待でき、また、フザリウム属細 菌による被害が減少する等の利点を有する。従って、例えば、トウモロコシ、キビ、コ ムギ等の穀類、麦類等の有用植物に本発明を適用することにより、それらの生産効 率を高めたり、フザリウム属細菌による人畜への悪影響を防いだりすることができる。 図面の簡単な説明
[0007] [図 1]JL^EEがァラビドプシス葉における FBI誘導 PCDに不可欠であることを示す図で ある。 a : FBIを、ァガープレート上に生育した野生型（WT)および VPE-null変異体（ null)植物の葉に浸潤させた。 VPE-null変異体では、 FBI誘導病班形成は見られな かった。浸潤後 5日目に植物を写真撮影した。アスタリスクは、 FBI浸潤部位である。 b : FBlを、野生型（WT)および VPE-null変異体（null)植物力 採取した葉の右半 分に浸潤させた。葉における病班の発生変化を、浸潤後 5日目力ら 7日目までモニタ 一した。 c : FBIを野生型（WT)ならて に a VPE— 3、 fi VPE - 5、 / VPE-L δ VPE- 1 および VPE-null変異体（null)を含む各種 VPE変異体カゝら採取した葉の右半分に浸 潤させた。浸潤後 6日目〖こ植物を写真撮影した。 d：野生型（WT)および cに記載し た各種 VPE変異体の FBI浸潤葉における、 a VPE, B VPE. Ύ ΥΡΕ. δ VPEおよび A CT2(ァクチン）の、 mRNAレベルの変化を示す RT- PCR。 3回の独立した実験におい て、同様の結果が得られた。
圆 2]VPE欠損は、 FBI誘導された PCD間で液胞膜の崩壊および DNA分解を抑制す ることを示す図である。 a-d: FBI浸潤後 3および 5日目における、野生型（WT)およ び VPE-null変異体（null)葉の電子顕微鏡像。 aおよび dの挿入画は、それぞれ囲ま れた領域の高倍率像を示す。黒色矢印、液胞膜のインタタトな部分； 白色矢印、液 胞膜の崩壊部分； V、液胞； V*、崩壊した液胞；アスタリスク、液胞膜の無い細胞； Ch 、葉緑体； CW、細胞壁； PM、原形質膜。 aと bのバーは 2 μ m、 cと dのバーは 5 m、 a と dの挿入画におけるバーは 0.5 μ mを示す。 e: 7日間 FBI処理をした（+)または、処 理をしない（-)野生型（WT)葉および VPE-null変異体（null)葉由来の、全 DNAのパ ルスフィールドゲル電気泳動。
[図 3] y VPEはカスパーゼー 1様活性を示すプロティナーゼであることを示す図である 。 a: Km値を決定するために、示された基質に対するプロティナーゼ活性を、昆虫 細胞において発現させた組換えァラビドプシス γ νΡΕ (方法参照）で測定した。 n.d. は検出されな力 たことを示す。 b： VPE活性（上図）およびカスパーゼ一 1様活性 ( 下図）における各種阻害剤の影響。上の数字は、使用したそれぞれの阻害剤 (20 ^ M)を表す： 1、無し； 2、 Ac-YVAD-CHO; 3、 Ac- xVAD- fink; 4、 Ac- YVAD- cmk; 5、 E 64-d; 6、アンチパイン； 7、ロイぺプチン。 カスパーゼ 1阻害剤と γ VPEの各型と のインヒビタープロット。糸且換え γ VPE前駆体 (proVPE) (レーン 1、 2、 7および 8)は、 中間体 GVPE) (レーン 3、 4、 9および 10)、次いで成熟型（mVPE) (レーン 5、 6、 11およ び 12)に変換された。 γ VPEの各型を、カスパーゼ阻害剤（ピオチン- xVAD-foik)の 非存在 (-)または存在（+)下でインキュベートし、 SDS- PAGEに供した後、抗 γ VPE 抗体とのウェスタンブロット（レーン 1〜6、抗- γ VPE)またはストレプトアビジン結合西 洋ヮサビペルォキシダーゼ（レーン？〜 12、インヒビター）とのインヒビタープロットを行 つ 7こ。
圆 4]VPE阻害剤およびカスパーゼ 1阻害剤はどちらも、 FBI誘導病班形成を抑制 することを示す図である。 a: ImMのシスティンプロティナーゼ阻害剤である、 VPE阻 害剤（Ac-ESEN- CHO)またはカスパーゼ 1阻害剤（ピオチン- YVAD-fink)と共に 、またはこれらの阻害剤無しに、 FBIを野生型葉の右半分に浸潤させた。浸潤後 4日 目に葉を写真撮影した。 b： VPE-null変異体は、 VPE活性およびカスパーゼー 1様 活性を有さない。カスパーゼ 1阻害剤と共に、またはこの阻害剤無しで、野生型（W T)または VPE-null変異体（null)の FBI浸潤葉におけるこれらプロティナーゼ活性を 測定した。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、植物の PCDにおける鍵分子が液胞プロセシング酵素（VPE)であるとの 発見に基づいて完成されたものである。
[0009] シロイヌナズナは a VPE、 j8 VPE、 γ VPEおよび δ VPEの 4種の VPEを有するが 、本発明者らは、それらの遺伝子を欠損した変異体植物を作製し、 FBI誘導 PCDと VPEとの関係について検討した結果、シロイヌナズナにおける FB 1誘導 PCDには V PEの関与が、中でも γ νΡΕの関与が不可欠であること、 VPEの発現は FBIにより誘 導されることを見出した。また、 VPEは、動物での細胞死の鍵分子として知られるカス パーゼ— 1と同様の酵素活性を示し、該活性はカスパーゼ— 1の阻害剤により阻害さ れること、さらには該阻害剤でシロイヌナズナの葉を処理することにより FBI誘導 PC Dが阻止されることを見出した。
[0010] なお、本明細書において「フザリウム毒」とは、フザリウム属細菌が産生する FBIま たは VPEの発現誘導を介して植物の PCDを生起せしめる FBI類似物を 、う。「フザ リウム属細菌」としては、例えば、フザリウム ·モ -リフオルメ (Fusarium moniliforme),フ ザリウム ·プロリフエラツム (Fusarium proliferatum)等が举げられる
[0011] 本発明のフザリウム毒抵抗性形質転換植物は VPEの機能を欠損したものである。
従って、フザリウム属細菌が産生するフザリウム毒に対して抵抗性を示し、フザリウム 毒による PCDを生じない。本明細書において「VPEの機能を欠損した」とは、植物が VPEの機能を完全に欠くか、または PCDを誘導し得ない程度に該酵素の機能を実 質的に欠くことをいう。
[0012] 植物力VPEの機能を欠損する態様としては、特に限定されないが、例えば、 VPE をコードする内因性遺伝子の改変、または VPEをコードする内因性遺伝子の発現抑 制〖こよるものが挙げられる。本明細書において「内因性遺伝子」とは、形質転換対象 の植物に元より存在する遺伝子をいう。一方、単に「遺伝子」という場合、内因性また は外因性の区別なく使用される。
[0013] 本明細書において「VPEをコードする内因性遺伝子の改変」とは VPEを発現すると いう本来の機能を失い得る遺伝的改変であればよぐ例えば、 VPEをコードする内因 性遺伝子のオープンリーディングフレームの読み枠を破壊する遺伝的改変が挙げら れる。オープンリーディングフレームの読み枠を破壊する遺伝的改変としては、例え ば、フレームシフト変異を起こさせるような変異の導入が挙げられる。より具体的には
(a) VPEをコードする内因性遺伝子の一部または全ての欠失、
(b) VPEをコードする内因性遺伝子の一部または全ての他のポリヌクレオチドによる 置換、および
(c) VPEをコードする内因性遺伝子中への他のポリヌクレオチドの挿入、
力らなる群より選ばれるものが挙げられる。
[0014] ここで、前記「他のポリヌクレオチド」とは、 VPEをコードする遺伝子に対して、 VPE をコードするものでな 、点で異質なポリヌクレオチドを 、う。
[0015] VPEをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号： 1、 3、 5および 7に記載の塩 基配列からなる核酸が挙げられる。それらは、順に a VPE、 j8 VPE、 γ VPEおよび δ VPEをコードする遺伝子である。遺伝的改変は、 VPEをコードする内因性遺伝子 の全てにおいて存在してよいが、少なくとも γ νΡΕをコードする内因性遺伝子におい て存在すべきである。そこで、 γ νΡΕをコードする内因性遺伝子を例にとると、前記（ a)〜（c)としては、例えば、それぞれ、
(a' ) γ VPEをコードする内因性遺伝子において、配列番号： 5に記載の塩基配列中 の 2402〜2617位、 2874〜3038位、 3120〜3275位、 3352〜3438位、 3518 〜3717位、 3831〜3879位、 3993〜4202位、 4297〜4503位、および 4812〜4 991位力もなる群より選ばれた少なくとも 1つの領域に対応する領域の欠失、 (b' ) γ VPEをコードする内因性遺伝子において、配列番号： 5に記載の塩基配列中 の 2402〜2617位、 2874〜3038位、 3120〜3275位、 3352〜3438位、 3518 〜3717位、 3831〜3879位、 3993〜4202位、 4297〜4503位、および 4812〜4 991位力もなる群より選ばれた少なくとも 1つの領域に対応する領域と他のポリヌクレ ォチドとの置換、
(c ' ) γ νΡΕをコードする内因性遺伝子において、配列番号： 5に記載の塩基配列中 の 2402〜2617位、 2874〜3038位、 3120〜3275位、 3352〜3438位、 3518 〜3717位、 3831〜3879位、 3993〜4202位、 4297〜4503位、および 4812〜4 991位力もなる群より選ばれた少なくとも 1つの領域に対応する領域への他のポリヌク レオチドの挿入、
であり得る。
[0016] なお、（a' )〜（c' )においては γ νΡΕをコードする内因性遺伝子の場合について 示したが、 a VPEをコードする内因性遺伝子に関しては、前記配列番号： 5の各領域 に相当するものとして、配列番号： 1に記載の塩基配列中の 1663〜1845位、 2261 〜2425位、 2505〜2661位、 2748〜2833位、 2908〜3156位、 3271〜3480 位、 3576〜3779位、および 4005〜4184位の各領域力 j8 VPEをコードする内因 性遺伝子に関しては、前記配列番号： 5の各領域に相当するものとして、配列番号： 3 に記載の塩基配列中の 181〜384位、 678〜842位、 1327〜1483位、 1590〜1 675位、 1768〜1967位、 2045〜2093位、 2187〜2390位、 2496〜2696位、 および 2780〜2965位の各領域力 δ VPEをコードする内因性遺伝子に関しては、 前記配列番号： 5の各領域に相当するものとして、配列番号： 7に記載の塩基配列中 の 1700〜1888位、 1985〜2149位、 2239〜2395位、 2489〜2574位、 2661 〜2860位、 2970〜3228位、 3306〜3512位、および 3606〜3740位の各領域 力 それぞれ挙げられる。
[0017] 本明細書において「VPEをコードする内因性遺伝子の一部」とは、 VPEの機能発 現を担う部分、好ましくは、活性中心や基質結合部位等をコードする遺伝子部分を いう。例えば、配列番号： 1、 3、 5または 7に記載の塩基配列中の塩基番号で示した 前記各領域に対応する遺伝子部分を挙げることができる。
[0018] 前記「対応する領域」とは、例えば、 Higginsらによる ClustalW法によるマルチプ ノレアライメント (f列 ば、 Gap penalty 5、 Fixed Gap penalty 10^ windows si ze 5、 Floating Gap 10)等により、配列番号： 1、 3、 5または 7に記載される塩基 配列と最適な状態にァライメントされたときに対応する領域をいう。 [0019] 前記（b' )および（c' )における他のポリヌクレオチドの塩基配列としては、 γ νΡΕを コードする内因性遺伝子のオープンリーディングフレームの読み枠を破壊することが 可能なものであればよぐ読み枠に合ったストップコドンを持つ塩基配列、 3の倍数以 外の塩基数からなる塩基配列、あるいはマーカーとなる薬剤耐性遺伝子などの独立 した遺伝子等の塩基配列が挙げられる。 a VPE、 |8 VPEまたは δ VPEをコードする 内因性遺伝子についても同様である。
[0020] VPEをコードする遺伝子としては前記配列番号： 1、 3、 5または 7に記載の塩基配 列からなる核酸が挙げられる力 当該遺伝子としては、例えば、それらの塩基配列に お!ヽて少なくとも 1つの塩基が置換された塩基配列カゝらなり、かつ VPEの酵素活性を 有するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。なお、本明細書中において「少 なくとも 1つ」とは、 1または数個の意である。
[0021] VPEをコードする遺伝子としては、その他、配列番号： 2、 4、 6および 8に記載のァ ミノ酸配列力 なるポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。それらのアミノ酸配列 は、順に α VPE、 β VPE, γ VPE,および δ VPEのアミノ酸配列である。また、 VP Eをコードする遺伝子としては、それらのアミノ酸配列において少なくとも 1つのアミノ 酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列力 なるポリペプチドをコード し、かつ該ポリペプチドが VPEの酵素活性を有するものである核酸であってもよ 、。
[0022] さらに、 VPEをコードする遺伝子としては、配列番号： 1、 3、 5若しくは 7に記載され る塩基配列からなる核酸、または配列番号： 2、 4、 6または 8に記載されるアミノ酸配 列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得、かつ VPEの酵 素活性を有するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
[0023] すなわち、 VPEをコードする遺伝子には、配列番号： 1、 3、 5または 7に記載の塩基 配列からなる核酸、配列番号： 2、 4、 6または 8に記載されるアミノ酸配列をコードする 核酸の変異体、誘導体、ノリアントまたはホモログが含まれる。これらはいずれも同様 にして本発明に用いられる。
[0024] なお、前記「VPEの酵素活性」は、例えば、活性測定対象物（例えば、ポリペプチド 、タンパク質）の水溶液中に Ac - ESEN - MCAまたは Z - AAN - MCAを基質と して加え、 25°Cで反応混合物の蛍光強度の増加を、蛍光分光光度計または蛍光プ レートリーダーを用いて励起波長 380nm、発光波長 460nmで測定することにより評 価することができる。上記基質は、例えば、ペプチド研究所力も入手可能である。基 質中、「Ac」はァセチル基を、「Z」はべンジルォキシカルボ-ル基を、「MCA」は 4 メチルクマリル一 7—アミドをそれぞれ示し、その他はアミノ酸を一文字コードで示した ものである。
[0025] 本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、モレキュラー 'クローユング： ァ 'ラボラトリーマニュアル第 2版〔ザンブルーク（Sambrook)ら編、コールドスプリング ハーバーラボラトリープレス刊、 1989〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、 例えば、
1) 6 X SSC ( 1 X SSC( ,|lj¾¾： 0. 15M NaCl、 0. 015M クェン酸ナトリウム、 pH 7. 0)と 0. 5% SDSと 5 Xデンハルトと 100 /z gZml 変性断片化サケ精子 DNAと 50% ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに 42°Cでー晚保温するステップ、
2) 非特異的にハイブリダィズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、よ り精度を高める観点力 より低イオン強度および Zまたはより高温の条件下での洗浄 を行うこと等が挙げられる。
[0026] なお、 Tmは、例えば、下記式：
Tm=81.5 + 16.6 (loglO[Na+ ]) + 0.41 (%G + C)— (600/N)
(式中、 Nはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％G + Cはオリゴヌクレオチド中のグァ ニンおよびシトシン残基の含有量である）
により求められる。
[0027] 一方、本明細書において「VPEをコードする内因性遺伝子の発現抑制」とは、該遺 伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制、該遺伝子の発現の完全な停 止および発現の減少をいい、さら〖こ、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の 機能を発揮しな ヽことも含まれる。
[0028] VPEをコードする内因性遺伝子の発現抑制の具体的な態様としては、
(1) VPEをコードする内因性遺伝子の転写産物の一部または全てと相補的なアンチ センス RNAをコードする DNAの導入、
(m) VPEをコードする内因性遺伝子の転写産物を切断するリボザィム活性を有する RNAをコードする DNAの導入、
(n)発現時に、 RNAi効果により、 VPEをコードする内因性遺伝子の発現を抑制する RNAをコードする DNAの導入、および
(o)発現時に、共抑制効果により、 VPEをコードする内因性遺伝子の発現を抑制す る RNAをコードする DNAの導入、
力らなる群より選ばれるちの〖こよるちのが挙げられる。
[0029] 前記 (1)は、植物における VPEをコードする内因性遺伝子（以下、標的遺伝子とい う場合がある）の発現を、該遺伝子の転写産物の一部または全てと相補的なアンチセ ンス RNAをコードする DNAを導入して抑制しょうとするものである。
[0030] アンチセンス RNAが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成によ る転写開始阻害等、複数のものが知られており、転写、スプライシングまたは翻訳な ど様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する。
[0031] 本発明のアンチセンス RNAは、上記いずれの作用により標的遺伝子の発現を抑 制してもよい。例えば、標的遺伝子の転写産物 (mRNA)の一部または全てと相補的 なアンチセンス RNAをコードする DNAとしては、標的遺伝子の mRNAの少なくとも 一部、例えば、 γ νΡΕをコードする内因性遺伝子を例にとると、配列番号： 5に記載 の塩基配列中の 2402〜2617位、 2874〜3038位、 3120〜3275位、 3352~34 38位、 3518〜3717位、 3831〜3879位、 3993〜4202位、 4297〜4503位、お よび 4812〜4991位力もなる群より選ばれた少なくとも 1つの領域に対応する領域か らの該遺伝子の転写産物の一部に相補的なアンチセンス RNAをコードする DNAが 挙げられる。アンチセンス RNAの塩基配列は、標的遺伝子の転写産物の一部また は全てと相補的な配列であるのが好ま 、が、標的遺伝子の発現を有効に抑制でき る限り、完全に相補的でなくともよい。例えば、アンチセンス RNAをコードする DNA の相補的 DNA鎖と標的遺伝子との配列同一性は好ましくは 90%以上、より好ましく は 95%以上である。
[0032] 一方、 a VPEをコードする内因性遺伝子に関しては、前記配列番号： 5の各領域に 相当するものとして、配列番号： 1に記載の塩基配列中の 1663〜1845位、 2261〜 2425位、 2505〜2661位、 2748〜2833位、 2908〜3156位、 3271〜3480位、 3576〜3779位、および 4005〜4184位の各領域力 j8 VPEをコードする内因性 遺伝子に関しては、前記配列番号： 5の各領域に相当するものとして、配列番号： 3に 記載の塩基配列中の 181〜384位、 678〜842位、 1327〜1483位、 1590~167 5位、 1768〜1967位、 2045〜2093位、 2187〜2390位、 2496〜2696位、およ び 2780〜2965位の各領域力 δ VPEをコードする内因性遺伝子に関しては、前 記配列番号： 5の各領域に相当するものとして、配列番号： 7に記載の塩基配列中の 1700〜1888位、 1985〜2149位、 2239〜2395位、 2489〜2574位、 2661〜2 860位、 2970〜3228位、 3306〜3512位、および 3606〜3740位の各領域力 それぞれ挙げられる。
[0033] なお、本明細書において配列同一性とは、比較対象の少なくとも 2つの配列につい て適切に整列化させ、それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位 の数を決定し、次いで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の 数を割り、得られた数値に 100をかけることにより算出されうる値をいう。かかる配列同 一'性は、具体的には、例えば、ホームページアドレス http : ZZwww. ncbi. nlm. n ih. gov/BLAST/において、一般に利用可能である BLASTアルゴリズムにより算 出されうる。アンチセンス RNAをコードする DNAの長さは、特に限定はなぐ所望に より適宜決定すればよい。
[0034] 前記 (m)は、植物における VPEをコードする内因性遺伝子の発現を該遺伝子の転 写産物を切断するリボザィムをコードする DNAを導入して抑制しょうとするものである 。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子をいう。リボザィムには種々の活性を有 するものが存在するが、公知の方法に従って、標的遺伝子の mRNAを部位特異的 に切断するリボザィムをコードする DNAの設計が可能である。
[0035] 前記 (n)は、植物における VPEをコードする内因性遺伝子の発現を該遺伝子の塩 基配列と同一若しくは類似した配列を有する二本鎖 RNAによる RNA interferance (RNAi)によって抑制しょうとするものである。 RNAiとは、標的遺伝子配列と同一も しくは類似した配列を有する二本鎖 RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝 子および内因性の標的遺伝子の発現がいずれも抑制される現象をいう。発現時に、 RNAi効果により、 VPEをコードする内因性遺伝子の発現を抑制する RNAをコード する DNAとしては、例えば、上記したような、配列番号： 1、 3、 5または 7に記載の塩 基配列からなる DNA、配列番号： 2、 4、 6または 8に記載されるアミノ酸配列をコード する DNA、それらの DNAの変異体、誘導体、ノリアントまたはホモログが挙げられる 。 RNAiに用いる DNAの塩基配列は、標的遺伝子と完全に同一である必要はない 力 好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の配列の同一性を有する。配列の 同一性は前記方法により求められる。
[0036] また、前記 (o)は、植物における VPEをコードする内因性遺伝子の発現を該遺伝 子の塩基配列と同一もしくは類似した配列を有する DNAを植物に導入することによ つて生ずる共抑制によって抑制しょうとするものである。「共抑制」とは、植物に内因 性の標的遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入 すると、導入した外来遺伝子および内因性の標的遺伝子の発現がいずれも抑制され る現象のことをいう。発現時に、共抑制効果により、 VPEをコードする内因性遺伝子 の発現を抑制する RNAをコードする DNAとしては、例えば、上記したような、配列番 号： 1、 3、 5または 7に記載の塩基配列力 なる DNA、配列番号： 2、 4、 6または 8に 記載されるアミノ酸配列をコードする DNA、それらの DNAの変異体、誘導体、バリア ントまたはホモログが挙げられる。共抑制に用いる DNAの塩基配列は、標的遺伝子 と完全に同一である必要はないが、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の 配列の同一性を有する。配列の同一性は前記方法により求められる。
[0037] 本発明のフザリウム毒抵抗性形質転換植物は、例えば、上記するような態様で、 V PEの機能を欠損せしめるポリヌクレオチドまたは DNA (以下、変異導入用 DNAとい う）、すなわち、 VPEをコードする内因性遺伝子に改変をもたらし得る DNA、または V PEをコードする内因性遺伝子の発現抑制をもたらし得る RNAをコードする DNAを 適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、該細胞から形質転換植物を 再生させること〖こよって作製することができる。
[0038] 具体的には、
(1)変異導入用 DNAを含有してなるベクターを得る工程、
(2)工程（1)で得られたベクターを植物細胞に導入し、 VPEの機能を欠損した植物 細胞を得る工程、および (3)工程 (2)で得られた植物細胞から形質転換植物を再生させる工程、 を含む方法により作製することができる。
[0039] 工程（1)にお ヽては、まず変異導入用 DNAを作製する。 VPEをコードする遺伝子 は、例えば、配列番号： 1、 3、 5または 7の塩基配列に基づいて、 PCRを利用してま たは植物由来の遺伝子ライブラリーのスクリーニング等の方法により単離することがで きる。また、その塩基配列の改変は、 PCRによる増幅核酸の連結や部位特異的変異 等の当該分野で慣用の組換え核酸技術により行うことができる。さらに、任意のポリヌ クレオチド鎖も慣用の方法により合成することができる。
[0040] なお、前記 (a)〜（c)により遺伝的改変を行う場合、変異導入用 DNAとしては、 VP Eをコードする遺伝子において、その一部を欠失してなる力 その一部を他のポリヌク レオチドで置換してなる力、若しくは他のポリヌクレオチドを挿入してなる核酸、または VPEをコードする遺伝子中に置換若しくは挿入を生ぜしめる他のポリヌクレオチドで あってよい。他のポリヌクレオチドとしてはァグロバタテリゥム由来の Tiプラスミド中の、 腫瘍ィ匕遺伝子を除去した T—DNAそのものであってもよい。
[0041] 次いで、変異導入用 DNAをベクターに挿入する。ここでベクターとは、植物に変異 導入用 DNAを導入し得るベクターであれば特に限定はない。例えば、大腸菌由来 のプラスミドベクターや、 pBI101、 pBI121等のバイナリーベクターが挙げられる。変 異導入用 DNAのベクターへの挿入は、使用するベクターの制限酵素部位やマルチ クロー-ングサイトを利用して行えばよい。
[0042] 変異導入用 DNAは所望により、ベクター中、適当なプロモーターの制御下に発現 されるように挿入してもよい。また、遺伝子の転写効率を高めるため、プロモーターや 転写開始部位と協同する他の調節因子、例えば、ェンハンサーゃターミネータ一が ベクター中に存在してもよい。さらに、ベクターには選択マーカーとしてカナマイシン 、ネオマイシン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が含まれていてもよい。また、変異 導入用 DNAを相同組換えにより導入対象の植物のゲノム中に挿入することを目的と して、ベクター中、例えば、該ゲノムにおける変異導入用 DNAの所望の標的挿入部 位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列力 なるフランキング配列 の間に変異導入用 DNAを配置させてもよい。 [0043] なお、変異導入用 DNAが、 VPEをコードする遺伝子において、その一部を欠失し てなるか、その一部を他のポリヌクレオチドで置換してなる力、若しくは他のポリヌクレ ォチドを挿入してなる核酸、または VPEをコードする遺伝子中に置換若しくは挿入を 生ぜしめる他のポリヌクレオチドである場合、標的遺伝子の破壊効率を高める観点か ら、前者では、該核酸と植物の VPEをコードする内因性遺伝子との相同組換えを生 じ得るベクターを、後者では、該ポリヌクレオチドと植物の VPEをコードする内因性遺 伝子中の所望の部位との相同組換えを生じ得るベクターを、それぞれ用いるのが好 ましい。
[0044] 工程（2)において工程（1)で得られたベクターを導入する植物細胞が由来する植 物としては特に限定はない。当該植物としては、シロイヌナズナの他、例えば、トウモ 口コシ、キビ、コムギ等が挙げられる。植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例え ば、懸濁培養細胞、プロトプラストの他、葉の切片、カルス等も含まれる。
[0045] 植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法 (エレク トロポレーシヨン法）、ァグロバタテリゥムを介する方法、パーティクルガン法など、公知 の方法を用いることができる。ベクターが導入された植物細胞は、例えば、使用した 選択マーカーに基づいて選抜することができる。
[0046] 選抜された植物細胞力VPEの機能を欠損したものであるか否かは、例えば、植物 細胞抽出液について、 ELISA法やウェスタンブロッテイング法により VPEの発現が な 、ことを調べたり、 VPEの酵素活性がな 、ことを調べたりすることで確認することが できる。
[0047] 変異導入用 DNAが、 VPEをコードする遺伝子において、その一部を欠失してなる 力 その一部を他のポリヌクレオチドで置換してなる力、若しくは他のポリヌクレオチド を挿入してなる核酸、または VPEをコードする遺伝子中に置換若しくは挿入を生ぜし める他のポリヌクレオチドである場合、細胞内で所望の相同組換えが生じていれば植 物細胞は VPEの機能を欠損したものであるといえるため、相同組換えが生じている か否かを、例えば、サザンブロッテイング法や PCR法等の慣用の方法で確認すること により、植物細胞が VPEの機能を欠損したものであると確認できる。
[0048] 工程 (3)では工程 (2)で得られた植物細胞から形質転換植物を再生させる。形質 転 ^¾物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて公知の方法により 行えばよい。形質転換植物の再生については、例えば、細胞工学別冊「モデル植物 の実験プロトコール イネ *シロイヌナズナ編」〔初版、（株)秀潤社発行〕や、アドレス h ttp : z / www. gene, mie— u. ac. jpz Protocol/ Original/ fransf orm― Nic oti (Agro) . htmlを参照すればよい。
[0049] 植物への変異導入用 DNAの導入はまた、前記のように所定のベクターを植物に導 入する方法以外に、交雑を利用して行うこともできる。例えば、まず、ベクターの導入 によりゲノム内に変異導入用 DNAを保持する植物を作製し、次いで、該植物と、同 種の天然の植物とを交雑させることにより、または前記ゲノム内に変異導入用 DNAを 保持する植物とは異なる変異導入用 DNAを保持する植物とを交雑させることにより、 植物への変異導入用 DNAの導入を行うことができる。後者の例としては、例えば、ベ クタ一を導入することにより、 4種の VPEをコードする各遺伝子の少なくとも 1つに関し てへテロ接合体またはホモ接合体の植物を得、それらの植物を互いに交雑させる態 様を挙げることができる。力かる交雑を繰り返すことで、 4種の VPEをコードする各遺 伝子の全てが欠損した VPE— null変異体植物を作出することが可能である。よって 、本発明のフザリウム毒抵抗性形質転換植物の作製方法は、工程 (4)として、工程（ 3)で得られた形質転,物を交雑する工程をさらに含んでもよい。
[0050] ー且、ゲノム内に変異導入用 DNAが導入された形質転換植物が得られれば、該 植物から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物 やその子孫あるいはクローン力も繁殖材料 (例えば、種子、株、カルス、プロトプラスト 等）を得て、それらを基に該植物を量産することも可能である。このようにして得られる 子孫等も全て本発明の形質転換植物に包含される。本発明の形質転換植物は VPE の機能を欠損しているため、フザリウム毒に対して抵抗性を示し PCDを生ずることが ない。従って、例えば、本発明の形質転換植物は従来の対応する植物と比較して生 産効率が高ぐまた、本発明の形質転 ^¾物を従来の対応する植物に換えて摂取さ せることで、フザリウム属細菌による人畜への悪影響、例えば、ゥマの大脳白質脳軟 化症、ブタの肺水腫、ヒッジの肝臓および腎臓障害の発生を防いだりすることができ る。 [0051] 本発明はまた一態様として植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤のスクリーニン グ方法を提供する。
[0052] 前記の通り、植物のフザリウム毒誘導 PCDの原因分子は VPEであることから、当該 酵素の酵素活性を阻害する物質は植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤として機 能することができる。従って、被験物質が VPEの酵素活性を阻害するか否かを評価 することにより、前記付与剤をスクリーニングすることができる。
[0053] 本発明のスクリーニング方法は、具体的には、
(1)被験物質の存在下、 VPEによる酵素反応を基質 Ac— ESEN MCAまたは Z AAN— MCAに対して行う工程、および
(2)酵素活性を測定し、被験物質の非存在下に比べて該活性を減少させる被験物 質を植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤として選択する工程、
を含む。
[0054] 工程（1)における VPEによる酵素反応は、被験物質を適量存在させて反応を行う 以外は前記「VPEの酵素活性」の評価方法と同様にして行えばよい。また、対照とし て、被験物質を存在させないこと以外は同様にして酵素反応を行う。
[0055] 工程 (2)では、 VPEの酵素活性を測定し、例えば、該活性を比活性 (pmol/min Zmg protein)として表し、被験物質の非存在下に比べて VPEの比活性の値がそ の存在下に減少する被験物質を植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤として選択 する。
[0056] 前記の通り、植物の VPEは動物のカスパーゼー 1と同様の酵素活性を示し、カスバ ーゼ— 1の阻害剤により該活性が阻害される。よって、本発明のスクリーニング方法 で得られるフザリウム毒抵抗性付与剤としては、例えば、 VPE阻害剤である Ac— ES EN— CHOの他、カスパーゼー 1の阻害剤である、 Ac— YVAD— CHO、ピオチン -xVAD-fmk,ビォチン—YVAD—fmk、およびビォチン—YVAD— cmkが挙 げられる。なお、「Ac」は前記の通り、「CHO」はアルデヒド基を、「x」は任意のァミノ 酸を、「fmk」はフルォロメチルケトン基を、「cmk」はクロロメチルケトン基をそれぞれ 示し、その他はアミノ酸を一文字コードで示したものである。
[0057] また、本発明は一態様として、フザリウム毒抵抗性付与剤で植物を処理する工程を 含む、植物におけるフザリウム毒抵抗性の発現方法を提供する。該付与剤としては、 前記スクリーニング方法により得られ得る物質を挙げることができる。植物の処理方法 は特に限定はないが、例えば、植物のフザリウム毒抵抗性付与剤による処理は、該 付与剤の物性に応じて、粉末等の固体状態で、懸濁液等の液体状態で、または該 液体の噴霧液やガス等の気体状態で、植物の葉、根、花、茎等に該付与剤を接触さ せることにより行うことができる。力かる付与剤により植物の VPEの酵素活性が阻害さ れ、その結果、植物でフザリウム毒抵抗性が発現される。
実施例
[0058] 以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は力かる実施例の みに限定されるものではない。なお、以下の実施例、参考例で使用した実験方法を、 以下にまとめて示す。
[0059] (l) VPE- null変異体の作製
ァラビドプシス.サリアナ（Arabidopsis thaliana)ェコタイプコロンビア (Columbia)(Col -0)の 4つのホモ接合性単一変異体； a VPE -3/ β VPE— 5/ y VPE— 1お Jび δ VPE— 1 カゝら null変異体を作製した (図 la)。 a VPE-3を VPE-1と交雑し、 β VPE- 5を δ VPE- 1と交雑した。 2つの二重変異体 ( a VPE-3/ y VPE- 1および β VPE- 5/ δ VPE- 1)を F 2子孫から PCRによる遺伝子型決定により単離した。二重変異体を互いに交雑させ、 VPE-null変異体 ( a VPE-3/ β VPE- 5/ y VPE- 1/ δ VPE-1)を単離した。
[0060] (2)ホモ接合性単一 VPE変異体の作製
ァラビドプシス .サリアナェコタイプコロンビア（ColumbiaXCoH))の 4つのホモ接合性 単一変異体を得た。 a VPE-3は Syngenta Biotechnology社から入手し、 VPE - 1は シマダ（Shimada)ら〔J. Biol. Chem. 278, 32292-32299 (2003)]に従って作製した。両 者は T-DNA挿入変異体である。 _ Λ£Ε≥は第 1のェクソンに GA挿入を有しており、 前記シマダらに従って作製した。 δ VPE-1も T-DNA揷入変異体であるが、かずさ DN A研究所（Kazusa DNA Institute)提供の一群のァラビドプシス植物の中から、以下 のプライマー：
δ VPE-kFW： 5 -TCATGCAAGGTGCTTATGTGTGA-3' (配列番号： 9) δ VPE- kRV: 5，- CGTCCGTACCGTACAGTTGGTA- 3' (配列番号： 10) P06RB： 5 -TTCCCTTAATTCTCCGCTCATGATC-3' (配列番号： 11、 T- DNAラ イトホ'、ーダー用）
を用いた PCRによるスクリーニングにより単離した。
[0061] (3)逆転写（RT)-PCR
RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen社製）を用いて葉から全 RNAを抽出し、 DNaseで処 理した。この RNA (0.5 μ g)を、 Oligo(dT) プライマー（Invitrogen社製）を含む 20 μ 1
12-18
反応容量において、 SuperScriptll (Invitrogen社製）による逆転写に供した。この反応 液（0.4 1)を Takara Ex Taqポリメラーゼ (タカラバイオ株式会社製)を含む 40 1反応 液中での PCRに使用した。 y VPEおよび ACT2 (actin2)それぞれに対するプライマー セットを使用した (前者については前記シマダらを、後者については Ratcliffe, 0. J. e t al.， Plant Cell 15, 1159-1169 (2003)参照）。プライマーセットは以下の通り： a VPE フォワードフ°ライマー： 5'— TCTAGAATGACCACCGTCGTTTCCTTTCT CG-3' (配列番号： 12)
リノヾ、一スフ。ライマー： 5し AGATCTTCAAGCACTGAATCCAC- 3' (配列番号
: 13)
5 VPE—フォワードフ°ライマー： 5'— TCTAGAATGGCTAAGTCTTGCTATTTCAG AC-3' (配列番号： 14)
リノヾ、一スフ。ライマー： 5し AGATCTTCAGGCGCTATAGCCTAAGAT— 3' (配 列番号： 15)
δ VPE—フォワードフ。ライマー： 5し ATGTCTAGTCCTCTTGGTCA- 3' (配列番号： 16)
リノヾ、一スフ。ライマー： 5'— GTTTTGCAAATCATTACATCGAACAAGCT— 3' ( 配列番号： 17)
PCRは 55°C (VPE)または 60°C (ACT2)のアニーリング温度で 25サイクル行った。
[0062] (4) FBI処理
ムラシゲ -スターグ（Murashige-Skoog)培地および 1%スクロースを含んだ 0.4%ァガ 一上に種子を播き、連続光の下、 22°Cで生育させた。 5週間育てた植物力も採取した 葉を、細胞死を引き起こすための誘導因子として 0.1%メタノールに溶解した FBI (10 M)中に浸潤させた。 FBIの溶媒として使用したメタノールは、病班形成にほとんど 影響を与えな力つた（図 lbおよび c)。この葉を、病班形成を誘導するため 12時間明 Z12時間暗の条件下、 7日間、 22°Cでインキュベートした。他方、 RNAの調製、電子 顕微鏡およびパルスフィールドゲル電気泳動のため、 4週間育てた植物から採取した 葉を使用した。プロティナーゼ阻害剤の影響を調べるため、 FBIと共に VPE阻害剤 ( Ac-ESEN-CHO,ペプチド研究所製）およびカスパーゼ— 1阻害剤（ピオチン- YVAD -fink)を葉に浸潤させた。
[0063] (5)組換えァラビドプシス γ VPE
γ νΡΕを発現する Sf21昆虫細胞を、クロャナギ（Kuroyanagi, \1.)ら [Plant Cell Physi ol. 43, 143-151 (2002)〕に記載されているようにして調製した。この細胞を、前記クロ ャナギらに記載されて 、るようにして、 γ VPEのプロタンパク質前駆体を得るために中 性溶液〔20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTAおよび 1 mMフエ-ル メチルスルホ -ルフルオライド（PMSF)〕、または γ νΡΕの中間体および成熟型の両 方を得るために酸性溶液（50 mM酢酸ナトリウム， pH5.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA および 1 mM PMSF)のいずれかにおいて、氷上で 1時間インキュベートした。これら の型の γ VPEを一部精製した。
[0064] (6)酵素アツセィ
Ac- ESEN- MCA、 Ac- ESED- MCA、 Ac- YVAD- MCA、および Ac- DEVD- MCA (ぺ プチド研究所製)の各蛍光性基質を加える前に、組換え γ VPE (1.6-4.0 g)を 100 mM酢酸ナトリウム、 pH 5.5、および 100 mMジチオトレイト一ノレ内でプレインキュベー トした。蛍光強度の増加を、蛍光分光光度計（RF-5000,島津製作所）を用い 460 nm で測定した。 Km値は 80〜400 /ζ Mの各基質を使用して決定した。
[0065] 各種の阻害剤の影響を決定するために、組換え γ VPEおよび各阻害剤 (20 μ Μ) を使用した： 3つのカスパーゼ 1阻害剤〔ピオチン- xVAD-ftnkおよびピオチン- YVA D-cmk (Calbiochem社製)、および Ac- YVAD- CHO (ペプチド研究所製）〕 、 1つの力 スパーゼー3阻害剤〔Ac-DEVD-CHO (ペプチド研究所製）〕および 3つのシスティン プロティナーゼ阻害剤〔E64-d、アンチパインおよびロイぺプチン（ペプチド研究所 製)〕。 [0066] 葉抽出液を、 100 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1 mM PMSFおよび 100 μ M E64- d〔(L- 3- trans-エトキシカノレボニノレロキシレン (ethoxycarbonyloxirane) -2-カノレボニノレ)- L- ロイシン（3-メチルブチル）アミド〕を含む 100 mM酢酸ナトリウム（pH5.5)を用いて調 製し、 Z-AAN-MCA (1 mM)に対する VPE活性を、蛍光マイクロプレートリーダー（flu orescence microplate reader) (GENios, TECAN社）を用いて測定した。
[0067] (7)インヒビタープロットおよびウェスタンブロット
組換え Ί VPEを含む試料溶液を、 20 μ Μピオチン- xVAD- finkとインキュベートした 。生じた酵素—阻害剤複合体を SDS-PAGEに供し、 GVHPメンブレン (0.22 /z m; 日本 ミリポア社製)に転写した。メンブレンをブロッキング溶液で、次いで 20 μ Μのストレプト アビジン結合西洋ヮサビペルォキシダーゼ（Amersham Pharmacia Biotech社製）で 1 時間処理した。増幅化学発光キット（ECLシステム、 Amersham Pharmacia Biotech社 製）を用いて検出した。ウェスタンプロット法は原則的に前記クロャナギらの方法に従 つた o
[0068] (8)電子顕微鏡観察
野生型および null変異体植物の FBI浸潤葉を、マツシマ（Matsushima, ）ら [Plant Physiol. 130, 1807-1814 (2002)〕に記載のように、 1時間真空浸潤し、固定し、乾燥し 、エボン (Epon)榭脂内に包埋した。薄切片を 4%酢酸ゥラ -ルおよびクェン酸鉛で染 色し、透過性電子顕微鏡 [model 1200EX; 日本電子 (JEOL)社製〕を用いて観察し た。
[0069] (9)パルスフィールドゲル電気泳動
FBI処理葉からの抽出液を含むァガロースプラグを、 55°Cで 18時間、 10 mM Tris- HC1、 pH8.0、 0.5 M EDTA、 1.0%サルコシルおよび 1 mg/mlプロティナーゼ K中でィ ンキュペートし、バルタ（Balk, J.;^〔Plant J. 34, 573-583 (2003)〕に記載のようにして 、ノ ルスフィールドゲル電気泳動を実施した。
[0070] 実施例 1
ァラビドプシスゲノムは、 q VPE, νΡΕ、 VPE,および δ VPEの 4つの VPE遺伝 子を有する。 VPEが植物 PCDに不可欠であるかどうかを明らかにするために、 4つの V PE遺伝子を全て欠く VPE-3./ 3 VPE-5ノ VPE-1/ δ VPE-1；図 la)ァラビドプシ ス変異体（VPE-null変異体）を作製した。野生型植物および VPE-null変異体植物の 葉を、植物 PCDを引き起こす真菌毒素（FBI)で処理した。 PCDを示す典型的な病 班が野生型葉において FBI浸潤後 5日目に形成されたが、 VPE-null変異体葉では形 成されなかった（図 la)。野生型葉における病班は 5日目から 7日目までさらに進行し 、細胞死を導いた（図 lb、左図)。一方、 VPE-null変異体植物葉では、 FBI浸潤後 7 日目でも病班は形成されなかった（図 lb、右図)。 4つの VPEホモログのうち、どの VPE 力 SPCDに不可欠であるかを決定するため、それぞれの VPE単一変異体葉について F B1誘導病班形成を調べた。 3つの単一変異体、 a VPE-3. ΥΡΕ- 5、および δ VPE- 1は野生型植物と同様に病班を形成したのに対し、
Figure imgf000022_0001
異体と同様に病班形成が抑制された（図 lc)。従って、 γ νΡΕは FBI誘導 PCDにおい て主要に機能すると考えられる。
[0071] そこで、 FBIで処理した場合の 4つの VPE遺伝子の発現誘導を調べた。 FBIで処理 した野生型葉では γ VPE mRNAのみが誘導され、他の VPE mRNAは誘導されなかつ た（図 ld)。同様に、 3つの単一 VPE変異体 ( a VPE- 3、 fi VPE- 5、および、 δ VPE- 1) で γ VPE mRNAが誘導されたが（図 ld)、 δ VPE— 1【こお ヽて【ま γ VPE mRNAレベル は急速に減少した。対照的に、
Figure imgf000022_0002
いずれの VPE mRNAも誘導されなかった（図 lcおよび d)。この結果から、 FBI処理葉における 病班形成は γ VPE遺伝子発現に関連することが示唆された。 γ VPE mRNAは FBI浸 潤後 1日で急速に増加し（図 ld)、葉における病班は FBI浸潤後約 3日で現れ始めた (データ示さず)。 γ VPEの遺伝子発現は、葉における病班形成の前に生ずる。これら の結果は、液胞プロティナーゼ γ νΡΕが、ァラビドプシス葉における FBI誘導 PCDに 不可欠であることを示す。
[0072] 実施例 2
FBI誘導された PCD間の液胞の形態学的変化を調べた。 FBI浸潤後 3日目に、野 生型葉において液胞は部分的に崩壊し、いくつかの膜水泡を形成した（矢印で示す 、図 2aおよび b)。一方、原形質膜、細胞壁および他の細胞小器官は完全なままであ つた（図 2a)。様々な細胞小器官が原形質膜から離れ、細胞における膨圧の損失を 示した。 5日目には、液胞膜および原形質膜は完全に崩壊し、他の細胞小器官は細 胞内に大まかに分布していた（図 2c)。対照的に、 VPE-null変異体葉においては、 F B1浸潤後 5日目においても、液胞および液胞膜は完全なままであり、完全な細胞小 器官が膨圧により原形質膜に密接して位置していた（図 2d)。これらの結果は、 VPE 欠損は、液胞を崩壊力 防ぐことにより細胞死を抑制することを示す。野生型葉にお ける核 DNAは、 FBI浸潤後 7日目で 50 kbの断片に切断された力 非処理葉ではこの 切断は起こらな力つた（図 2e)。対照的に、 7日目の VPE-null変異体の FBI処理葉お よび非処理葉において、断片化は検出されな力つた。 FBI誘導細胞死は、 DNAの断 片化を伴う。この結果により、 VPE力 ¾NAの断片化に関与し、液胞崩壊による細胞死 力 S起こることが示唆された。
[0073] 実施例 3
カスパーゼ様活性は植物細胞死に関係するという報告がある〔Lam, E and del Pozo , O., Plant Mol. Biol. 44, 417—428 (2000)、 Woltering, E. J. et al., Plant Physiol. 130 , 1764-1769 (2002)〕。しかしながら、植物においては未だカスパーゼ活性を示すプ 口ティナーゼの同定はなされていない。以前、本発明者らは、 VPEはァスパラギニル エンドべプチダーゼであるにも関わらず、カスパーゼ同様、ァスパラギン酸に対して 活性を示すことを報告した〔Hiraiwa, N. et al, FEBS Lett. 447, 213-216 (1999)〕。
[0074] 図 3aに要約されるように、組換え γ VPEはカスパーゼ一 1基質（Ac- YVAD- MCA, Km=44.2 μ Μ)および VPE基質（Ac- ESEN- MCA, Km=30.3 μ M)に対して活性を示 すが、カスパーゼー 3基質（Ac-DEVD- MCA)または VPE基質誘導体 (Ac-ESED- MC A)に対しては活性を示さないことを見出した。カスパーゼ一 1基質に対する Km値 (44 .2 μ Μ)は、哺乳動物カスパーゼ 1に対して報告されている値（11- 23 Μ)に匹敵 する。 VPE活性およびカスパーゼ 1様活性は、カスパーゼ 1阻害剤、 Ac-YVAD- CHO、ピオチン- xVAD-ftnkおよびピオチン- YVAD-cmkのそれぞれにより同様に減 少することを見出した（図 3b)。 VPE基質に対して決定されたピオチン- xVAD-ftnkの K i値は 0.1 nMであり、カスパーゼー 1基質に対する値は 3.0 nMであった。これらの値は 、ヒトおよびマウスカスパーゼー 1に対して報告された Ki値（それぞれ 0.76および 3.0 n M)と一致する。システィンプロティナーゼ阻害剤（E64-d、アンチパインまたはロイべ プチン）はどれも、 VPEまたはカスパーゼ— 1様活性を阻害しな力つた。 [0075] 以上より、ァラビドプシス葉における FBI誘導 PCDに不可欠であることが示された γ VPEの酵素活性がカスパーゼ一 1阻害剤により阻害されることが明ら力となった。後 述するようにカスパーゼ 1阻害剤はァラビドプシス葉における FBI誘導 PCDを阻害 することから、 γ νΡΕの酵素活性の阻害物質をスクリーニングすることで、植物のフザ リウム毒抵抗性付与剤を得ることができる。従って、以上の内容は、被験物質の存在 による VPE酵素活性の減少に基づいて該物質を植物に対するフザリウム毒抵抗性付 与剤として選択する、植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤のスクリーニングに相 当する。
[0076] 参考例 1
不活性なプロカスパーゼ 1は、自己触媒的に活性のある成熟した酵素に変換さ れることが示されている。同様に図 3c (上図）に示されるように、 γ νΡΕの前駆体（pro VPE、レーン 1)は自己触媒的に中間体（iVPE、レーン 3)、次いで成熟型（mVPE、レ ーン 5)に変換された。 γ VPEのそれぞれの型がピオチン- xVAD-ftnkに結合するかど うかを明らかにするため、 proVPE、 iVPE、および mVPEをインヒビタープロット法に供し た。図 3c (下図）に示されるよう〖こ、 iVPE (レーン 10)および mVPE (レーン 12)の両方 が阻害剤に結合した一方で、 pr0VPE (レーン 8)は結合しなかった。これは、 proVPE が不活性型であり、 iVPEおよび mVPEの両方が活性型であることを示す。従って、 VP Eはカスパーゼ— 1と同様の特徴を有する。これは VPEが植物 PCDにおいて、カスバ ーゼ一 1の機能ホモログとして働くことを意味する。
[0077] 実施例 4
VPEおよびカスパーゼ— 1様活性が FBI誘導 PCDに関連することをイン'ビボ（in viv o)で実証するために、葉の右半分に対し、 FBIを各プロティナーゼ阻害剤と共に浸 潤させ、浸潤後 4日目に葉における病班形成を調べた。プロティナーゼ阻害剤で処 理しなかった葉においては顕著な病班が形成された（図 4a、左図)。 VPE阻害剤は葉 におけるこのような FBI誘導病班形成を完全に抑制した（図 4a、中央図)。これは、 VP E-null変異体および γ VPE変異体の結果と一致する（図 laおよび c)。同様に、カス パーゼ— 1阻害剤も病班形成を抑制した（図 4a、右図)。これらの結果は、 VPEおよび カスパーゼ一 1様活性の両方が、 FBI誘導 PCDに関連していることを示す。 [0078] また、 FBI処理葉からの抽出液中に VPEおよびカスパーゼ 1様活性の両方を見 出した。カスパーゼ— 1阻害剤は 10 /z Mの濃度で VPE活性を 67%まで減少させ、 100 Mの濃度で VPE活性を阻害した（図 4b、左図)。カスパーゼー 1阻害剤もまた、 100 μ Μの濃度でカスパーゼ 1様活性を完全に阻害した（図 4b、右図)。一方、 VPE活 性およびカスパーゼー 1様活性のどちらも、 VPE-null変異体の葉においては検出さ れなかった（図 4b)。これらの結果は、 VPEがカスパーゼ 1様活性を示すプロティナ ーゼであることを示す。
[0079] 以上の結果、植物 VPEの阻害剤で植物を処理することにより、植物に対しフザリウム 毒抵抗性を付与でき、植物の PCDを阻止できることが分力る。
[0080] 配列表フリーテキスト
配列番号: 9は、実施例で使用したプライマーの塩基配列である。
配列番号: 10は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 11は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 12は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 13は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 14は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 15は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 16は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
配列番号: 17は、実施例で使用したプライマ、一の塩基配列である。
産業上の利用可能性
本発明は、フザリウム属細菌が産生するフザリウム毒に対して抵抗性を示し、フザリ ゥム毒による PCDを生じな 、フザリウム毒抵抗性形質転換植物、および該植物の作 製方法を提供する。

Claims

請求の範囲
[1] 液胞プロセシング酵素の機能を欠損したフザリウム毒抵抗性形質転換植物。
[2] 液胞プロセシング酵素の機能の欠損が、液胞プロセシング酵素をコードする内因性 遺伝子の改変、または液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の発現抑制 によるものである、請求項 1記載の植物。
[3] 前記改変が、
(a)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の一部または全ての欠失、
(b)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の一部または全ての他のポリヌ クレオチドによる置換、および
(c)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子中への他のポリヌクレオチドの 挿入、
力もなる群より選ばれるものである、請求項 2記載の植物。
[4] 前記発現抑制が、
(1)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の転写産物の一部または全てと 相補的なアンチセンス RNAをコードする DNAの導入、
(m)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の転写産物を切断するリボザ ィム活性を有する RNAをコードする DNAの導入、
(n)発現時に、 RNAi効果により、液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子 の発現を抑制する RNAをコードする DNAの導入、および
(o)発現時に、共抑制効果により、液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子 の発現を抑制する RNAをコードする DNAの導入、
力もなる群より選ばれるものによるものである、請求項 2記載の植物。
[5] (1)液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子に改変をもたらし得る DNA、 または液胞プロセシング酵素をコードする内因性遺伝子の発現抑制をもたらし得る R NAをコードする DNAを含有してなるベクターを得る工程、
(2)工程（1)で得られたベクターを植物細胞に導入し、液胞プロセシング酵素の機能 を欠損した植物細胞を得る工程、および
(3)工程 (2)で得られた植物細胞から形質転換植物を再生させる工程、 を含む、液胞プロセシング酵素の機能を欠損したフザリウム毒抵抗性形質転換植物 の作製方法。
[6] (4)工程 (3)で得られた形質転,物を交雑する工程をさらに含む、請求項 5記載 の方法。
[7] (1)被験物質の存在下、液胞プロセシング酵素による酵素反応を基質 Ac— ESEN
MCAまたは Z— AAN— MCAに対して行う工程、および
(2)酵素活性を測定し、被験物質の非存在下に比べて該活性を減少させる被験物 質を植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤として選択する工程、
を含む、植物に対するフザリウム毒抵抗性付与剤のスクリーニング方法。
[8] 請求項 7に記載の方法で得られ得るフザリウム毒抵抗性付与剤で植物を処理する 工程を含む、植物におけるフザリウム毒抵抗性の発現方法。
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