WO2006070040A1 - Extractos proteicos con amplio espectro de actividad antibacteriana y cepas del genero bifidobacterium que los producen - Google Patents

Extractos proteicos con amplio espectro de actividad antibacteriana y cepas del genero bifidobacterium que los producen Download PDF

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Definitions

  • This patent belongs to the technical sector of the Food and Pharmaceutical Industry. More specifically, this invention falls within the field of functional feeding (probiotics) and food preservation technologies by biological methods, through the use of microorganisms with antimicrobial activity and their metabolites.
  • the patent includes six strains of the genus Bifidobacterium, of human intestinal origin, the protein metabolites with broad-spectrum anti-bacterial activity they produce, and their use against gastrointestinal pathogenic bacteria and pathogenic and food-altering bacteria.
  • Probiotics are one of the most important functional food subgroups for their functional versatility and great acceptance by consumers, which has aroused a growing commercial interest, both in the pharmaceutical and food industries.
  • a probiotic is a dietary supplement consisting of viable microorganisms that, administered in adequate amounts, is capable of modifying the microflora of a host compartment, thus exerting a beneficial effect on the health of the host (Schrezenmeir, et al., 2001. Probiotics, prebiotics, and symbiotics-approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr. 73: 361 S-364S).
  • the main probiotics are the bacteria that form the Lactobacillus and Bifidobacterium genera, diners of the gastrointestinal tract and traditionally used in various food fermentations.
  • Bifidobacterium genus strains are particularly important as they selectively colonize the intestinal tract of newborns, representing up to 91% of their flora, and in adults between 3 and 7% (Harmsen, ei al. 2000. Analysis of intestinal flora development in breast-feed and formula-feed infants by using molecular identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol Nutr. 30: 61-67; Biavati, et al. 2001. The family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.), The Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, New York).
  • the microorganisms of the genus Bifidobacterium are usually included within the group of lactic bacteria, physiologically defined by their ability to produce lactic acid as one of the main metabolites resulting from carbohydrate fermentation.
  • its DNA has a higher G + C content (55-64%), which is why phylogenetically are included in the Actinobacteria class (O ' Riordan, et al. 1997. Determination of genetic diversity within the genus Bifidobacterium and estimation of chromosomal size. FEMS Microbiol. Lett. 156: 259-264).
  • Probiotics have been marketed in a wide variety of ways: (i) conventional fermented foods to which probiotics are added and consumed primarily for nutritional purposes (milk, cheese, etc.); (ii) cultured and fermented milks, basically used as vehicles for probiotic bacteria (acidophilic milk, bifidus milk, etc.), and (iii) dietary supplements or lyophilized pharmaceutical preparations.
  • bifidobacteria are consumed mostly incorporated into food and, mainly, dairy products; although the number of products (juices, porridge, meat products, cereals, mayonnaise, etc.) that constitute a possible vehicle for their contribution is being expanded.
  • probiotics include the improvement of lactose intolerance; The prevention and treatment of gastrointestinal and urogenital infections, the restoration of the intestinal ecosystem after antibiotic and chemotherapy treatments, the prevention of cholerectal cancer and the stimulation of the immune system (Salminen, ei al. 1998. Functional food science and gastrointestinal physiology and function Br J Nutr; 80: 147S-171; Tannock, 1999. A fresh look at the intestinal microflora In GW Tannock (ed.), Probiotics A critical review, pp. 5-14 Horizon Scientific Press, Wymondham, Norfolk , England).
  • the genus Bifidobacterium is essential in maintaining the balance of the intestinal ecosystem and the displacement of potentially harmful microorganisms, for which reason an important protective function is attributed.
  • strains of this genus have beneficial effects in the treatment of traveler's diarrhea, rotavirus infections and diarrhea associated with the use of antibiotics (McNaught, ei. 2001. Probiotics in clinical practice: a critical review of the evidence. Nutr. Res. 21: 343-353). Its antagonistic effects have also been described against pathogens of the genera Listeria, Clostridium, Salmonella, Campylobacter, Shigella, Proteus, and Escher ⁇ chia (Gibson, ei al. 1994.
  • probiotic strains their origin to gastrointestinal and technological stress conditions and their susceptibility to antibiotics are key selection criteria for the development of new probiotics prior to their introduction into the market.
  • probiotics may be dependent on the species and the use of strains of human origin has been recommended (Lee, ei al. 1995. The coming age of probiotics. Trends Food Sci.
  • the bile concentration in the intestine ranges between 1, 5 and 2.0% in the first hour of digestion, subsequently decreasing to 0.3% (Sjovall, 1959. On the concentration of bile acids in the human intestine during absorption of bile acids and steroids 74. Acta Physiol. Scand. 46: 339-345). Therefore, tolerances to acidic pH and high concentrations of bile salts are two of the desirable properties in a probiotic microorganism. In addition, for incorporation into food and use as supplements, it is advisable that these strains resist other stress conditions to which they are subjected during industrial processes (freezing, drying, lyophilization, salting, fermentation and refrigeration temperatures, etc.) .
  • the antimicrobial compounds produced by lactic bacteria are divided into two large groups: (i) low molecular weight compounds (less than 1000 Da) that include organic acids and have a broad spectrum of action and (ii) antimicrobial proteins or bacteriocins (greater than 1000 Da) whose spectrum of action is restricted to closely related microorganisms and other Gram-positive bacteria.
  • low molecular weight compounds less than 1000 Da
  • antimicrobial proteins or bacteriocins greater than 1000 Da
  • bacteriocins The production of bacteriocins has been studied in strains of various genera of the group of lactic bacteria and, especially, in Lactobacillus, Pediococcus and Enterococcus for their diversity in species and habitats and their industrial applications (Riley e ⁇ al. 2002. Bacteriocins: Evolution, Ecology, and Application Ann. Rev. Microbiol. 56: 117-137). Specifically, the strains of the genus Lactobacillus are considered the main producers of bacteriocins and, in the case of probiotic strains, are supposed to be involved in the colonization of the intestinal tract and in the displacement of pathogens (Majhenic, ei. 2004.
  • B Bacteriocin B
  • the present invention provides a group of strains of the genus Bifidobacterium of human origin and, consequently, expands the small number of strains of bifidobacteria of said origin (whose use has been recommended) existing in the market of probiotics. These bacteria are producers of protein metabolites with broad-spectrum antibacterial activity (active against Gram-positive and Gram-negative). Another advantage of the present invention is the resistance to the conditions of gastrointestinal and technological stress. Another added advantage is the antibiotic sensitivity profile that guarantees its safety.
  • Bifidobacterium BIR-0304 Bifidobacterium BIR-0307
  • Bifidobacterium B I R-0312 Bifidobacterium B I R-0324
  • Bifidobacterium B I R-0326 Bifidobacterium BIR-0349.
  • strains have been isolated from feces of healthy individuals (adults and children), and are producers of compounds of a protein nature with characteristics similar to bacteriocins but with a broader spectrum of action comprising bacteria, both Gram-positive, and Gram-negative This broad spectrum of inhibition is not a characteristic common to all human bifidobacteria of fecal origin since only six of the total isolates have this property.
  • strains are highly resistant to acidic pH.
  • the selection and isolation of the strains by prior incubation of the faecal samples in an acid medium has allowed the direct selection of isolates resistant to the pH of the gastric juices, which constitutes the main biological barrier that can limit the survival of the probiotics to their It passes through the gastrointestinal tract and during the fermentation processes of food and its storage period.
  • Selected strains of the genus Bifidobacterium are also resistant to high concentrations of bile salts and sodium chloride and at high temperatures, the method of selective isolation used by pre Incubation of the faecal samples at acidic pH, allowed the direct selection of strains resistant to acidic pH and could favor the development of other cross-resistance, obtaining strains tolerant to the conditions of gastrointestinal and technological stress. Therefore, these strains are more likely to survive and be functional than the probiotic strains currently marketed.
  • Selected strains of the genus Bifidobacterium have a resistance-sensitivity profile to antibiotics common to this genus that guarantees their safety.
  • the performance of systematic tests of antibiotic sensitivity is essential as a criterion for the selection of new probiotics and protective cultures for use in food in order to guarantee the absence of resistance to transmissible antibiotics.
  • the present invention further provides antibacterial compounds derived from the metabolism of bifidobacteria, in the form of extracts. These antibacterial compounds derived from the metabolism of bifidobacteria constitute an additional object of the present invention and are claimed in the present invention.
  • the metabolites are secreted to the culture medium during the growth of the bifidobacteria and the extracts containing them are obtained from the cell-free supernatants of these cultures by lyophilization, centrifugation, precipitation, extraction or filtration.
  • the spectrum of activity includes Gram-positive and Gram-negative bacteria responsible for alterations in food and potentially pathogenic belonging to the genera (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Brochothrix, Listeria, Clostridium, Staphylococcus Escher ⁇ chia, Salmonella, Aeromonas, Aeromonas, Vibomonas Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.).
  • the compounds responsible for the antibacterial activity secreted to the culture media by the six bifidobacteria and present in the neutralized extracts tested are substances of a protein nature and have biochemical characteristics similar to those of the bacteriocins of lactic bacteria, but do not meet the criteria of their definition since they have an exceptionally broad spectrum of inhibition including, not only bacteria Gram-positive, but also to a large number of Gram-negative bacteria.
  • antibacterial compounds derived from the metabolism of these bacteria as well as the use of these compounds as antibacterial agents against gastrointestinal pathogens or against pathogenic and food altering bacteria, are also claimed in the present invention.
  • the process for obtaining the extracts containing the aforementioned compounds is also claimed in the present invention. Since the selected strains of the genus Bifidobacterium synthesized compounds with broad-spectrum antibacterial activity, against Gram-positive and Gram-negative bacteria, under the conditions to which they are exposed in the intestinal tract, they can act as probiotics with protective function to this level and be used for medical purposes.
  • the use of the strains of the present invention as probiotics is another object of the present invention.
  • the selected bifidobacteria grow and remain viable in various foods and beverages, thus constituting suitable vehicles for their contribution.
  • suitable vehicles for their contribution.
  • the strains of the selected Bifidobacterium genus, as well as their added metabolites in the form of extracts act as inhibitors of the development of Gram-positive and Gram-negative bacteria in food and beverages. That is, they act as bioprotective cultures in foods such as milk.
  • the use of these strains and their extracts as bioprotective agents of food constitutes another object of the present invention.
  • An object of the present invention constitutes an isolated bacterial strain useful as a probiotic product, hereinafter isolated bacterial strain of the present invention, characterized in that it is an isolated strain of feces from healthy humans belonging to the genus Bifidobacterium, because it produces antibacterial compounds of a peptide nature with characteristics similar to bacteriocins with a broad spectrum of action that include Gram-positive and Gram-negative bacteria, and because it is resistant to conditions of gastrointestinal and technological stress, belonging to the following group: gastric juice conditions, high concentrations of bile salts and sodium chloride and high temperatures.
  • this strain has been isolated from feces of healthy individuals (adults and children), and is a producer of protein-like compounds with characteristics similar to bacteriocins but with a broader spectrum of action that includes bacteria, both Gram - positive, such as Gram-negative. This broad spectrum of inhibition is not a characteristic common to all human bifidobacteria of fecal origin since only six of the total isolates have this property.
  • the strains of the genus Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0312 and BIR-0349 were assigned to the species B. longum inf antis; The strain BIR-0324 to the species B. catenulatum and the strain BIR-0326 to B. bifidum.
  • strains of the genus Bifidobacterium are highly resistant to acidic pH.
  • the strain selection procedure By prior incubation of the faecal samples in an acid medium, it allows the direct selection of isolates resistant to the pH of the gastric juices, which constitutes the main biological barrier that can limit the survival of the probiotics as they pass through the gastrointestinal tract and during food fermentation processes and their storage period (Example 1). All strains were resistant to the conditions of gastric juices maintaining their viability around 10 6 -10 8 CFU / ml after prolonged incubation.
  • strains of the genus Bifidobacterium are resistant to high concentrations of bile salts and sodium chloride. All strains studied showed the ability to grow at bile concentrations between 1 and 5% (Figure 1A) and NaCl levels between 2 and 10% ( Figure 1B). In addition, these strains have very good growth capacity at temperatures above the optimum (up to 60 0 C) including those commonly used in the processes of making fermented milk (For example 42-45 0 C).
  • the method of selective isolation used by pre-incubation of the faecal samples at acidic pH allowed the direct selection of strains resistant to acidic pH and could favor the development of other cross-resistance, obtaining strains tolerant to gastrointestinal stress conditions and technological (high concentrations of sodium chloride, high temperatures included in the technological processes of manufacturing various foods such as dairy products and lyophilization processes).
  • the invention provides resistant and stable strains under the conditions of the gastrointestinal tract and technological processes with greater possibilities of survival and being functional than the probiotic strains currently marketed (Example 1).
  • a particular object of the present invention constitutes a strain of the genus Bifidobacterium belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, to the following group: Bifidobacterium BIR-0304 (CECT 7039), Bifidobacterium BIR-0307 ( CECT 7040), Bifidobacterium BIR-0312 (CECT 7041), Bifidobacterium BIR-0324 (CECT 7042), Bifidobacterium BIR-0326 (CECT 7043) and Bifidobacterium BIR-0349 (CECT 7044).
  • antibiotic sensitivity is an essential criterion for the selection of new probiotics and, in general, of bacterial strains that will be used for food (human and animal) in order to guarantee their safe use and, in the case of probiotics, its compatibility with the administration of antibiotics in combination therapies and in the treatment of disorders caused by their consumption.
  • Selected strains of the genus Bifidobacterium have a resistance-sensitivity profile to antibiotics common to this genus that guarantees their safety.
  • the strains studied were resistant to metronidazole, gentamicin, nalidixic acid, trimethoprim, kanamycin, vancomycin and polymyxin.
  • the intrinsic resistance to certain antibiotics presented by the strains of the present invention are useful for combined therapies that include these probiotics and antibiotics, for example in the treatment of Helicobacter pylori and Clostridium difficile infections.
  • Only the strain Bif ⁇ dobacterium BIR -0349 was sensitive to gentamicin and the strain Bif ⁇ dobacterium BIR-0324 to trimethoprim. However, all were sensitive to rifampin, amoxicillin, penicillin G, chloramphenicol, erythromycin, tetracycline and clarithromycin. (Example 1 ).
  • Another object of the present invention constitutes antibacterial compounds, in the form of an extract, derived from the metabolism of the bifidobacteria of the present invention.
  • the metabolites are secreted into the culture medium during the growth of said bifidobacteria and the extracts containing them are obtained from the cell-free supernatants of these cultures, for example by lyophilization.
  • the process of obtaining the extracts is also claimed in the present invention.
  • This procedure is as follows: (i) inoculation of a 1% culture medium (between 0.01 and 50%) with each bifidobacterium and incubation thereof, (ii) recovery of the culture supernatant by centrifugation at the end of The exponential phase of growth (either during the exponential or stationary phase of growth) (iii) concentration of the supernatant by lyophilization (or by precipitation with ammonium sulfate or organic solvents and subsequent dialysis or evaporation, by extraction with organic solvents or by filtration ) and (iv) lipophilic suspension in a buffer volume that represents 10% (between 90 and 0.5%) of the initial volume of the culture medium and neutralization or not of the extract obtained and sterilization by filtration.
  • the antimicrobial activity is detected in the extracts, neutralized (in which the effect of organic acids is eliminated) and without neutralizing (in which the effect of organic acids is added to that of compounds of another nature; see Example 2 and 3 ).
  • the spectrum of activity includes Gram-positive and Gram-negative bacteria responsible for alterations in food and potentially pathogenic belonging to the genera Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacter ⁇ um, Brochothrix, Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Aeromonas, Vibomrio, Aeromonas, Vibomrio Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.
  • the antimicrobial activity of these compounds was determined by the double layer technique and the diffusion in agar against two Gram-positive indicator microorganisms, L. innocua and L. lactis, this allowed the selection of eight strains of the genus Bifidobacterium from the 24 isolated feces. Subsequently, the study was directed towards the detection of the anti bacterial activity due exclusively to the secretion of compounds of a protein nature, so that only the technique of diffusion in agar and neutralized extracts was used, and the number of indicator microorganisms was increased, including both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Finally, the six strains that showed the broadest spectrum of inhibition were selected (see Table I).
  • the Bifidobacterium BIR-0312 strain was the one that inhibited a greater number of indicator microorganisms.
  • the inhibition profiles of the Bifidobacterium BIR -0304, BIR-0307, BIR-0312, BIR-0324 and BIR-0326 strains were similar while the BIR-0349 strain showed a more restricted spectrum.
  • the majority of potentially Gram-positive pathogenic bacteria Clostridium difficile, L.
  • the compounds responsible for the antibacterial activity secreted to the culture media by the six bifidobacteria and present in the neutralized extracts tested are substances of a protein nature whose Production or release to the medium is maximum at the end of the exponential growth phase and stationary phase, when MRS broth is used as culture medium, containing cysteine and agents such as Tween (0.1-10.0%).
  • the protein nature is confirmed by the destruction of its activity after treatment with all the proteinases tested. Only the incubation with proteinase K increased the inhibitory effect on Helicobacter pylori, because the proteinase itself acted as a growth inhibitor of this microorganism and, depending on the concentration, synergistically together with other compounds of the bifidobacterial extracts.
  • the compounds responsible for the inhibition are thermostable maintaining their activity after incubation at 8O 0 C for at least 3 min and at 100 0 C for at least 1 min. They are also stable and active in a wide pH range (2-11) (Example 2). Therefore, its activity is compatible with the conditions of the gastrointestinal tract and with those of a large number of technological processes (fermentation and maturation of dairy products, meat, etc.).
  • the apparent molecular mass of the antibacterial compounds is less than 100 kDa, determined by ultrafiltration (Example 2).
  • the compounds responsible for the anti bacterial activity have biochemical characteristics similar to those of lactic acid bacteriocins, but do not meet the criteria of their definition since they have an exceptionally broad inhibition spectrum including, not only Gram-positive bacteria , but also to a large number of gram-negative bacteria.
  • the antimicrobial activity of the extracts against Gram-positive (for example Listeria innocua) and Gram-negative bacteria is destroyed after treatment with various proteases (trypsin, protease A, pepsin and cathepsin B), but not with amylases and lipases (Example 2).
  • Antibacterial compounds of a protein nature produced by the selected strains of the genus Bifidobacterium are capable of inhibiting strains of Helicobacter pylori (multi) -resistant to antibiotics commonly used for their treatment (for example metronidazole and clarithromycin), and may constitute an alternative therapy to said treatment pharmacist.
  • the selected strains of the genus Bifidobacterium of the present invention synthesized compounds with broad-spectrum antibacterial activity, against Gram-positive and Gram-negative bacteria, under the conditions to which they are exposed in the intestinal tract, presence of bile salts and pancreatin, Therefore, they can act as probiotics with protective function at this level and be used for medical purposes.
  • This antibacterial activity was due to compounds secreted to the culture medium and, in large part, to compounds of a protein nature since the inhibition halos due to the effect of the neutralized extracts were only slightly lower (between 1 and 3 mm) to those of un neutralized extracts (see Figure 3-B, wells A and B) (Example 3).
  • milk and milk-based media were determined as a substrate for the growth of bifidobacteria and vehicles for their contribution in the form of viable cells.
  • all bifidobacteria selected and inoculated at 1% were able to grow, reaching levels of 10 6 -10 9 CFU / ml, after incubation periods of between 24 and 48 h.
  • the pH of the milk was reduced from initial values of 6.4 to values between 4.0 and 5.2 and some degree of coagulation was observed, especially important in the samples inoculated with the Bifidobacterium BIR-0324 strain and its aroma was the typical of yogurt.
  • the strains of the genus Bifidobacterium of the present invention selected grow and remain viable in various foods constituting suitable vehicles for their contribution. Fermented and unfermented milks are examples of foods that support the maintenance of their viability (Example 4); In addition, they are among the most suitable products for the administration of probiotic strains, because milk and its derivatives are habitual members of the diet in developed countries, have high nutritional value, are easy to digest and enjoy great acceptance in various population groups
  • Selected strains of the genus Bifidobacterium can ferment the milk and coagulate its proteins; Therefore, they can be used for the elaboration of fermented milks, bifidus milks and other dairy derivatives such as, for example, yogurt (Example 4).
  • the selected bifidobacteria acted as bioprotective cultures in milk, reducing the viability of Salmonella in at least two logarithmic units and Listeria in at least six (see Table II).
  • another object of the present invention constitutes the use of the bacterial strain isolated in the present invention in the preparation of a probiotic food or beverage, and that in a concrete way fulfills prophylactic or therapeutic functions against gastro-intestinal pathogens .
  • said use of the bacterial strain in the preparation of a probiotic food consists in the preparation of a fermented milk, a bifidus milk and other dairy derivatives.
  • Another object of the present invention constitutes the use of the bacterial strain isolated in the present invention as a starter ferment or culture and bioprotective culture of food or beverages against bacteria of alteration and of sanitary interest and preferably in foods such as fermented milks. Bifidus milk and other dairy products.
  • Another object of the present invention is the use of the bacterial strain isolated in the present invention as a bioprotective culture of food or beverages against altering bacteria of food and health interest.
  • Another object of the present invention constitutes the use of protein extracts of the present invention as therapeutic compounds against gastrointestinal pathogens or other type of pathogenic bacteria, preferably The gastrointestinal pathogen is a strain of the multi-resistant Helicobacter pylor ⁇ species.
  • Another object of the present invention constitutes the use of the protein extracts of the present invention as biological preservatives against altering bacteria and of health interest in food or beverages and preferably in a fermented milk, a bifidus milk and other dairy derivatives.
  • a Bifidobacterium BIR-0304 crop has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), based in Burjasot (Valencia), on December 21, 2004, corresponding to the CECT deposit number 7039.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Valencia Burjasot
  • Bifidobacterium BIR-0307 has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), based in Burjasot (Valencia), on December 21, 2004, corresponding to the CECT deposit number 7040.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Valencia Burjasot
  • Bifidobacterium BIR-0312 has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), based in Burjasot (Valencia), on December 21, 2004, corresponding to the CECT deposit number 7041.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Valencia Burjasot
  • Bifidobacterium BIR-0324 Another crop of Bifidobacterium BIR-0324 has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), based in Burjasot (Valencia), on December 21, 2004, corresponding to the deposit number CECT 7042. Another crop of Bifidobacterium BIR -0326 has been deposited in Ia
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Figure 1 Representation of the tolerance of the Bifidobacterium strains to intestinal and technological stress conditions.
  • An example of the growth capacity of one of the selected strains (Bifidobacterium BIR-0314) is shown in the presence of high concentrations of bile (Oxgel; Fig. 1A) and salt (NaCI; Fig. 1 B), in broth MRS-C, to 37 0 C. The growth was monitored using absorbance measurements at 655 nm on a multiwell plate spectrophotometer.
  • Figure 2. Representation of the inhibitory effect of strains of the genus Bifidobacterium against Helicobacter pylor ⁇ by means of agar diffusion technique.
  • the arrows indicate the inhibition halos caused by the antibacterial compounds present in the extracts obtained from the cultures of the selected bifidobacteria.
  • the negative control (C) shows the absence of inhibition of the extract obtained from the culture medium that was not fermented by the bifidobacteria.
  • Figure 3.- A Representation of the inhibitory effect of strains of the genus Bifidobacterium grown in different culture media on Salmonella typhimurium by the double layer technique.
  • the means used to grow the bifidobacteria were: MRSC-OX-P, MRSC with 0.5% bile salts (Ox-gall) and 0.1 g / l pancreatin; L, milk; L-EL-G, milk with 0.5% yeast extract and 1% glucose; PCL, P ⁇ ate Count milk.
  • the inhibitory effect was determined by measuring the inhibition halos and is expressed in millimeters (mm) ⁇ B.
  • EXAMPLE 1 PROCEDURE FOR SELECTIVE INSULATION OF BIFIDOBACTERIUM GENDER STRINGS RESISTANT TO VARIOUS STRESS CONDITIONS AND CHARACTERIZATION OF ISOLATED. Selective isolation and identification of isolates.
  • Strains of the genus Bifidobacterium were isolated from feces of healthy individuals (adults between 25-35 years of age and children between 6 and 12 months) who had not ingested food containing bifidobacteria for at least the month prior to analysis and that they had not undergone antibiotic treatments during the last six months. The samples were kept at 4 o C and analyzed without more than two hours elapsed since their collection. Two grams of each were diluted in 10 mM phosphate buffer containing a concentration of 130 mM NaCl (PBS) and homogenized in a Lab-Blender 400 stomacher (Seward Medical, London, UK), for 3 min.
  • samples of 1 ml were taken from each of the homogenates and inoculated in MRS broth (from Man Rogosa and Sharpe; Scharlau, Barcelona) containing 0.05% of cysteine (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), adjusted to pH 2 with HCI. These samples were incubated at 37 0 C for 16 h in anaerobiosis (AnaeroGen, Oxoid, UK).
  • the strains of the genus Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0312 and BIR-0349 were assigned to the species B. longum infantis; The strain BIR-0324 to the species B. catenulatum and the strain BIR-0326 to B. bifidum.
  • Antibiotic sensitivity The sensitivity of the strains under study was determined through the use of antibiotic discs (Oxoid, Basingstoke, UK) and the method of diffusion in agar and, in the case of metronidazole and clarithromycin through the use of E- test (AB Biodisk, Solna, Sweden). 100 ⁇ l of a 24 h culture were inoculated into 9 ml of MRS-C containing 0.7% molten agar and poured onto a layer of solid agar. A solidified once the upper layer, discs or strips antibiotic were placed on its surface and, after incubating at 37 0 C for 24 h, the inhibition halos were measured.
  • EXAMPLE 2 PROCEDURE FOR THE SELECTION OF BIFIDOBACTERIES ABLE TO PRODUCE ANTIBACTERIAL PROTEINS OF LARGE SPECTRUM AND EXTRACTS WITH SUCH ACTIVITY.
  • the antibacterial activity of each strain was evaluated globally by means of the double layer technique using as indicator microorganisms two Gram-positive bacteria (Listeria innocua and Lactococcus lactis). Potentially active bifidobacteria were plated on MRS-C plates in lines of about 2 cm and incubated under optimal conditions for 16 h and their subsequent development was inhibited with chloroform.
  • the indicator microorganism was inoculated at a concentration of 10 4 -10 5 CFU / ml in 10 ml of suitable semi-solid agar, poured onto the agar layer of the protective microorganism and incubated under optimal conditions for the first.
  • Listeria innocua was cultured in Brain Herat (BH) and L. lactis in M17 and both were incubated in aerobiosis at 3O 0 C. After 24 h the possible inhibition halos around the protective culture lines were measured.
  • the agar diffusion technique was used. 10 ml of MRS-C broth were inoculated at 1% with a 24 h culture of each bifidobacteria and incubated for 16 h at 37 0 C. The supernatants were obtained by centrifugation (12,000 g, 15 min, 4 0 C) and were concentrated by lyophilization. The lyophiles were resuspended in 1 ml of 50 mM phosphate buffer at pH 6.5, neutralized with NaOH to reach a pH of 6.5 to eliminate the effects of the organic acids generated by fermentation, and sterilized by filtration.
  • the indicator microorganism was inoculated at a concentration of 10 4 -10 5 cells / ml in 10 ml of suitable semi-solid agar and poured onto a solid layer of agar of the same medium. After solidification, 5 mm wells were perforated, to which 40 ⁇ l of the cell-free extract and neutralized of each bifidobacterium was added. It was allowed to diffuse 1 h at 4 0 C and, subsequently, it was incubated under the optimal conditions for each indicator microorganism.
  • indicator microorganisms As indicator microorganisms, initially, two Gram-positive bacteria (Listeria innocua and Lactococcus lactis) were used and, subsequently, the spectrum was broadened, including a large number of Gram-positive and Gram-negative pathogens. Among these, the following indicators were studied: (i) altering strains of the Lactobacillus and Leuconostoc genera that were grown in MRS, and of the Carnobacterium genus that were grown in APT agar and incubated at 3O 0 C and in microaerophilic; (ii) disruptive strains of the genus Brochothrix that were grown on STAA agar and incubated at 3O 0 C and in aerobiosis; (iii) the genus Enterococcus strains that were grown in BH and incubated at 37 0 C, aerobically; (iv) the genus Clostridium strains were cultured in RCM 37 0 C, in anaerobio
  • Table I Representation of the inhibition spectrum of the Bifidobacterium strains selected by means of agar diffusion technique.
  • Lactobacillus fermentum 9.2 - 9.1 - 11, 1 14.4
  • the Bifidobacterium BIR-0312 strain was the one that inhibited a greater number of indicator microorganisms.
  • the inhibition profiles of the Bifidobacterium BIR -0304, BIR-0307, BIR-0312, BIR-0324 and BIR-0326 strains were similar while the BIR-0349 strain showed a more restricted spectrum.
  • the majority of potentially Gram-positive pathogenic bacteria Clostridium difficile, L.
  • Gram-positive (L. innocua and L. lactis) and Gram-negative (H. pylor ⁇ ) bacteria were used as indicator microorganisms.
  • the ability of selected strains of the genus Bifidobacterium to produce antibacterial compounds in the conditions of the intestinal tract was determined by the double layer technique and the diffusion in agar.
  • the selected strains were inoculated into MRS-C agar lines containing 0.5% bile (Ox-gall, sigma, St. Louis, MO) and 0.1 g / l pancreatin (Sigma, St. Louis, MO), and they incubated at 37 0 C for 16 h. Cultures of the indicator microorganism (Listeria innocua and Salmonella typhimurium) were poured onto these agar plates and incubated for 24 hours at optimum temperature for the indicator.
  • MRS-C agar lines containing 0.5% bile (Ox-gall, sigma, St. Louis, MO) and 0.1 g / l pancreatin (Sigma, St. Louis, MO)
  • bifidobacteria The ability of bifidobacteria to grow, ferment and coagulate milk was determined by inoculating 1% 24 h cultures of each of them in 10% skim milk (L) and 10% skim milk, containing 0.5% extract of yeast and 1% glucose (L-EL-G). The cultures were incubated at 37 0 C the viability and different times was determined by bifidobacteria counts on agar plates MRS-C, the pH, the consistency and flavor of fermented milks.
  • the ability of the selected strains to produce anti-bacterial compounds in situ in milk-based media was determined by the double layer technique and by agar diffusion.
  • the selected strains were inoculated in lines in the described milk-based media and incubated at 37 ° C for 16 h.
  • Cultures of the indicator microorganism Listeria innocua and Salmonella typhimurium were poured onto these agar plates and incubated, for 24 hours, at an optimum temperature for the indicator.
  • skim milk was used as a model of a food in which the selected strains could play a bioprotective role against altering and pathogenic bacteria.
  • Milk previously sterilized, they were inoculated with the bioprotective bifidobacteria, so that they reached levels of 10 7 CFU / ml, and were contaminated with cultures of Listeria innocua and Salmonella typhimurium, so that they reached final levels of 10 4 -10 5 CFU / ml, and were incubated at 37 0 C, for 48 h.
  • controls were analyzed in which only the contaminating bacteria were inoculated.
  • the selected bifidobacteria acted as bioprotective cultures in milk, reducing the viability of Salmonella by at least two logarithmic units and Listeria by at least six (see Table II).
  • Table II - Representation of the inhibitory effect of the selected bifidobacteria on Listeria innocua and Salmonella typhimurium in co-cultures in milk and by direct addition of the extracts, obtained from the supernatants of the bifidobacteria cultures, to simple cultures of each One of the microorganisms in milk.

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Abstract

La presente invención aporta seis cepas del género Bifidobaterium y los extractos resultantes de su metabolismo que contienen proteínas antibacterianas. Estas proteínas presentan un amplio espectro de actividad que incluye bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Las cepas de la presente invención son estables en las condiciones de estrés gastrointestinal (pH ácido, alta concentración de sales) y en las condiciones de los procesos tecnológicos de conservación y elaboración de alimentos. Además, presentan un perfil de sensibilidad a antibióticos que garantiza su seguridad. Estas cepas y sus extractos pueden ser empleados como probióticos con propiedades protectoras frente a patógenos gastrointestinales y como bioprotectores o conservantes de alimentos frente a bacterias patógenas y alterantes.

Description

TITULO
EXTRACTOS PROTEICOS CON AMPLIO ESPECTRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y CEPAS DEL GÉNERO BIFIDOBACTERIUM QUE LOS PRODUCEN.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta patente pertenece al sector de Ia técnica de Ia Industria Alimentaria y Farmacéutica. Más concretamente, esta invención se enmarca dentro del campo de Ia alimentación funcional (probióticos) y de las tecnologías de conservación de alimentos por métodos biológicos, a través del uso de microorganismos con actividad antimicrobiana y de sus metabolitos. La patente incluye seis cepas del género Bifidobacterium, de origen intestinal humano, los metabolitos proteicos con actividad anti bacteriana de amplio espectro que producen, y su uso frente a bacterias patógenas gastrointestinales y bacterias patógenas y alterantes de alimentos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los probióticos constituyen uno de los subgrupos de alimentos funcionales más destacados por su versatilidad funcional y gran aceptación por los consumidores, Io que ha despertando un creciente interés comercial, tanto en Ia industria farmacéutica como en Ia alimentaria.
Un probiótico es un suplemento dietético constituido por microorganismos viables que, administrado en cantidades adecuadas, es capaz de modificar Ia microflora de un compartimento del huésped, ejerciendo así un efecto beneficioso sobre Ia salud de éste (Schrezenmeir, et al., 2001. Probiotics, prebiotics, and symbiotics-approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr. 73: 361 S- 364S). Los principales probióticos son las bacterias integrantes de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, comensales del tracto gastrointestinal y tradicionalmente utilizadas en diversas fermentaciones alimentarias. Las cepas del género Bifidobacterium son particularmente importantes ya que colonizan selectivamente el tracto intestinal de los recién nacidos, representando hasta el 91% de su flora, y en adultos entre el 3 y el 7% (Harmsen, eí al. 2000. Analysis of intestinal flora development in breast-feed and formula-feed infants by using molecular identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30: 61-67; Biavati, et al. 2001. The family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.), The Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, Nueva York). Los microorganismos del género Bifidobacterium se incluyen habitualmente dentro del grupo de bacterias lácticas, definido fisiológicamente por su capacidad para producir ácido láctico como uno de los principales metabolitos resultantes de Ia fermentación de carbohidratos. No obstante, su ADN posee un contenido en G + C más alto (55-64%) por Io que filogenéticamente se incluyen dentro de Ia clase Actinobactería (O'Riordan, et al. 1997. Determination of genetic diversity within the genus Bifidobacterium and estimation of chromosomal size. FEMS Microbiol. Lett. 156: 259-264).
Los probióticos se han comercializado en una gran variedad de formas: (i) alimentos fermentados convencionales a los que se les adicionan probióticos y que se consumen principalmente con fines nutritivos (leche, quesos, etc.); (ii) las leches cultivadas y fermentadas, utilizadas básicamente como vehículos de bacterias probióticas (leche acidófila, leche bifidus, etc.), y (iii) los suplementos dietéticos o preparaciones farmacéuticas liofilizadas. En Ia actualidad, las bifidobacterias se consumen mayoritariamente incorporadas a alimentos y, principalmente, a derivados lácteos; aunque se está ampliando el número de productos (zumos, papillas, productos cárnicos, cereales, mayonesas, etc.) que constituyen un posible vehículo para su aporte.
Entre los efectos beneficiosos que se atribuyen a los probióticos se incluyen Ia mejora de Ia intolerancia a Ia lactosa; Ia prevención y tratamiento de infecciones gastrointestinales y urogenitales, el restablecimiento del ecosistema intestinal tras los tratamientos con antibióticos y quimioterapia, Ia prevención del cáncer coleorrectal y Ia estimulación del sistema inmune (Salminen, eí al. 1998. Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr; 80: 147S-171S; Tannock, 1999. A fresh look at the intestinal microflora. In G.W. Tannock (ed.), Probiotics. A critical review, pp. 5-14. Horizon Scientific Press, Wymondham, Norfolk, England). Concretamente, se considera que el género Bifidobacterium es esencial en el mantenimiento del equilibrio del ecosistema intestinal y el desplazamiento de microorganismos potencialmente perjudiciales, por Io que se Ie atribuye una importante función protectora. Se considera que cepas de este género ejercen efectos beneficiosos en el tratamiento de Ia diarrea del viajero, las infecciones por rotavirus y Ia diarrea asociada al uso de antibióticos (McNaught, eí al. 2001. Probiotics in clinical practice: a critical review of the evidence. Nutr. Res. 21 : 343-353). También se han descrito sus efectos antagónicos frente a patógenos de los géneros Listeria, Clostridium, Salmonella, Campylobacter, Shigella, Proteus, y Escheríchia (Gibson, eí al. 1994. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 77: 412-420; Lee, eí al. 2003. Identification and screening for antimicrobial activity against Clostridium difficile of Bifidobacterium and Lactobacillus species isolated from healthy infant faeces. Int. J. Antimicrob. Agents 21 : 340-346; Touré et al. 2003. Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria monocytogenes. J. Appl. Microbiol. 95: 1058-1069; Gagnon, eí al. 2004. In vitro inhibition of Escheríchia coli 0157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. Int. J. Food Microbiol. 92: 69-78).
No obstante, no siempre existen evidencias claras sobre los efectos beneficiosos ejercidos por las cepas probióticas y por los productos cultivados con ellas y, en muchos casos, los resultados son contradictorios. En parte esto es debido a Ia aplicación de deficientes criterios de evaluación en el proceso de selección de nuevas cepas probióticas y a Ia falta de estudios científicos sobre sus mecanismos de acción.
Concretamente, el origen de las cepas probióticas, su resistencia a las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico y su susceptibilidad a los antibióticos son criterios de selección claves para el desarrollo de nuevos probióticos previo a su introducción en el mercado.
Se considera que Ia función e implantación de los probióticos puede ser dependiente de Ia especie y se ha recomendado el uso de cepas de origen humano (Lee, eí al. 1995. The coming age of probiotics. Trends Food Sci.
Technol. 6: 241-245); pese a ello, actualmente el número de cepas de bifidobacterias de origen humano existente en el mercado es escaso.
Entre los factores que condicionan Ia supervivencia de las cepas probióticas durante el tránsito gastrointestinal, el pH ácido del estómago y Ia elevada concentración de sales biliares en el intestino son las barreras fisiológicas más importantes. Durante Ia digestión, el tiempo medio de permanencia de los alimentos en el estómago es de 90 minutos a un pH próximo a 2,0 (HiII. 1990. Factors controlling the microflora of the health upper gastrointestinal tract. In HiII MJ. y Marsh, P. D. (eds), Human Microbial Ecology pp. 57-85. CRC Press, Boca Ratón, Florida; Berrada, eí al. 1991. Bifidobacteríum from fermented milk: survival during acid transit. J. Dairy Sci. 74:409-414). La concentración de bilis en el intestino oscila entre 1 ,5 y 2,0% en Ia primera hora de Ia digestión, disminuyendo posteriormente hasta el 0,3% (Sjovall, 1959. On the concentration of bile acids in the human intestine during absorption of bile acids and steroids 74. Acta Physiol. Scand. 46: 339-345). Por ello, las tolerancias al pH ácido y a altas concentraciones de sales biliares son dos de las propiedades deseables en un microorganismo probiótico. Además, para su incorporación a alimentos y utilización como suplementos, es aconsejable que estas cepas resistan otras condiciones de estrés a las que son sometidas durante los procesos industriales (congelación, secado, liofilización, salado, temperaturas de fermentación y de refrigeración, etc.). Hasta ahora el proceso de selección de las cepas probióticas no siempre ha asegurado su resistencia a los tratamientos tecnológicos y a su paso por el tracto gastrointestinal por Io que su viabilidad y estabilidad en los productos comercializados a menudo no cumple los criterios deseables para garantizar su efectividad (Fasoli, eí al. 2003. Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis. Int. J. Food Microbiol. 82: 59- 70; Temmerman, eí al. 2003. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Int. J. Food Microbiol. 81 : 1-10; Temmerman, eí al. 2003. Culture-independent analysis of probiotic products by denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 69: 220-226).
El conocimiento de Ia susceptibilidad de las cepas probióticas a los antibióticos es también esencial, tanto para asegurar Ia ausencia de elementos de resistencia transferibles, como para establecer Ia compatibilidad de los probióticos con antibióticos para su uso en terapias combinadas y en diarreas debidas a tratamientos con antibióticos. Por otro lado, los mecanismos de acción de los probióticos frente a patógenos gastrointestinales se desconocen, en gran medida, Io que dificulta Ia definición de Ia especificidad de su acción frente a patologías concretas. Entre los posibles mecanismos, se pueden citar: Ia competición por nutrientes y sitios de adhesión, Ia degradación de toxinas, Ia estimulación del sistema inmune y Ia síntesis de compuestos antimicrobianos (Fooks, eí al. 1999. Prebiotics, probiotics and human gut microecology. Int. Dairy J. I 9: 53-61).
Los compuestos antimicrobianos producidos por las bacterias lácticas se dividen en dos grandes grupos: (i) los compuestos de bajo peso molecular (menores de 1000 Da) que incluyen los ácidos orgánicos y que poseen un amplio espectro de acción y (ii) los proteínas antimicrobianas o bacteriocinas (mayores de 1000 Da) cuyo espectro de acción se restringe a microorganismos próximamente relacionados y otras bacterias Gram-positivas. En los últimos años, en Lactobacillus spp. también se ha detectado Ia producción de otros compuestos de naturaleza proteica, denominados "bacteriocin-like compounds", que no encajan con los criterios que definen las bacteriocinas y que tienen un espectro de acción más amplio (Bruno, eí al. 2002. Inhibition of pathogenic and putrefactive microorganisms by Bifidobacteríum sp. Milchwissenschaft 57: 617-621 ). La capacidad de las bacterias lácticas para competir e inhibir el desarrollo de otros microorganismos se debe fundamentalmente a Ia producción de ácidos orgánicos, principalmente láctico y acético; aunque, en las últimas décadas, se ha demostrado que Ia producción de bacteriocinas también desempeña una función importante (Niku-Paavola, eí al. 1999. New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol. 86: 29-35). Esto ha permitido el uso de cepas de bacterias lácticas como cultivos protectores y sus metabolitos como conservantes en un gran número de fermentaciones alimentarias. La producción de bacteriocinas se ha estudiado en cepas de diversos géneros del grupo de bacterias lácticas y, muy especialmente, en Lactobacillus, Pediococcus y Enterococcus por su diversidad en especies y hábitats y sus aplicaciones industriales (Riley eí al. 2002. Bacteriocins: Evolution, Ecology, and Application. Ann. Rev. Microbiol. 56: 117- 137). Concretamente, las cepas del género Lactobacillus se consideran las principales productoras de bacteriocinas y, en el caso de cepas probióticas, se suponen implicadas en Ia colonización del tracto intestinal y en el desplazamiento de patógenos (Majhenic, eí al. 2004. DNA analysis of the genes encoding acidocin LF221A and acidocin LF221 B, two bacteriocins produced by Lactobacillus gassen LF221. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 705- 714). Por el contrario, los efectos inhibitorios de las bifidobacterias frente a Ia flora competitiva se han atribuido básicamente a Ia producción de ácidos orgánicos y sideróforos (Bruno, eí al. 2002. Inhibition of pathogenic and putrefactive microorganisms by Bifidobacteríum sp. Milchwissenschaft 57: 617-62; Asahara, et al. 2001. Increased resistance of minee to Salmonella entérica serovar Thyphimurium infection by synbiotic administration of Bifidobacteria and transgalactosylated oligosaccharides. J. Appl. Microbiol. 91 : 985-996; O'Sullivan, eí al. 2001. Isolated bifidobacteria that produce siderophores which inhibit growth of Lactococcus lactis. US Patent Number 884894; Levchenko, eí al. 2001. Strain bifidobacterium breve 79-88 used for preparing curative- prophylactic fermented-milk, nonfermented-milk food-stuffs, biologically active supplements and bacterial preparations. Número de patente: RU2176270; Neeser, eí al. 2001. New bifidobacteria preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria. International Patent Number WO 01/11015 A1 ) y no existen evidencias claras de su capacidad para sintetizar compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica y de amplio espectro. Tan sólo se ha demostrado que algunas bifidobacterias aisladas de heces de niños producen péptidos antimicrobianos activos frente a Listeria monocytogenes y sólo se ha purificado una bacteriocina (Bifidocina B) de B. bifídum NCFB 1454, que posee un espectro de inhibición restringido a bacterias Gram-positivas (Yildirim, eí al. 1998. Characterization and antimicrobial spectrum of Bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifídum NCFB 1454. J. Food Prot. 61 : 47-51 ; Yildirim, eí al. 1999. Purification, amino acid sequence and mode of action of Bifidocin B produced by Bifidobacterium bifídum NCFB 1454. J. Appl. Microbiol. 86: 45-54. Touré, eí al. 2003. Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria monocytogenes. J. Appl. Microbiol. 95: 1058-1069). La presente invención aporta un grupo de cepas del género Bifídobacterium de origen humano y, por consiguiente, amplía el escaso número de cepas de bifidobacterias de dicho origen (cuyo uso ha sido recomendado) existente en el mercado de los probióticos. Estas bacterias son productoras de metabolitos proteicos con actividad antibacteriana de amplio espectro (activos frente a Gram-positivas y Gram-negativas). Otra ventaja de Ia presente invención es Ia resistencia a las condiciones de estrés grastrointestinal y tecnológico. Otra ventaja añadida es el perfil de sensibilidad a antibióticos que garantiza su seguridad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve
En Ia presente invención han sido seleccionadas seis cepas del género Bifídobacterium: Bifídobacterium BIR-0304, Bifídobacterium BIR-0307, Bifídobacterium B I R-0312 , Bifídobacterium B I R-0324 , Bifídobacterium B I R-0326 y Bifídobacterium BIR-0349.
Las cepas han sido aisladas a partir de heces de individuos sanos (adultos y niños), y son productoras de compuestos de naturaleza proteica con características similares a las bacteriocinas pero con un espectro de acción más amplio que comprende bacterias, tanto Gram-positivas, como Gram- negativas. Este espectro de inhibición tan amplio no es una característica común a todas las bifidobacterias humanas de origen fecal ya que sólo seis del total de aislados presentan esta propiedad.
Estas cepas son altamente resistentes al pH ácido. La selección y aislamiento de las cepas mediante incubación previa de las muestras fecales en un medio ácido ha permitido Ia selección directa de aislados resistentes al pH propio de los jugos gástricos, que constituye Ia principal barrera biológica que puede limitar Ia supervivencia de los probióticos a su paso por el tracto gastrointestinal y durante los procesos de fermentación de alimentos y su período de almacenamiento.
Las cepas del género Bifídobacterium seleccionadas son también resistentes a altas concentraciones de sales biliares y cloruro sódico y a altas temperaturas, el método de aislamiento selectivo utilizado mediante pre- incubación de las muestras fecales a pH ácido, permitió Ia selección directa de cepas resistentes al pH ácido y pudo favorecer el desarrollo de otras resistencias cruzadas, obteniéndose cepas tolerantes a las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico. Por Io tanto, estas cepas cuentan con mayores posibilidades de sobrevivir y ser funcionales que las cepas probióticas actualmente comercializadas.
Las cepas seleccionadas del género Bifidobacterium presentan un perfil de resistencia-sensibilidad a antibióticos común a este género que garantiza su seguridad. La realización de pruebas sistemáticas de sensibilidad a antibióticos es esencial como criterio de selección de nuevos probióticos y cultivos protectores para su uso en alimentación a fin de garantizar Ia ausencia de resistencias a antibióticos transmisibles.
La presente invención proporciona además compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de las bifidobacterias, en forma de extractos. Estos compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de las bifidobacterias constituyen un objeto adicional de Ia presente invención y son reivindicados en Ia presente invención.
Los metabolitos son secretados al medio de cultivo durante el crecimiento de las bifidobacterias y los extractos que los contienen se obtienen a partir de los sobrenadantes libres de células de estos cultivos mediante liofilización, centrifugación, precipitación, extracción o filtración. El espectro de actividad incluye a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas responsables de alteraciones en alimentos y potencialmente patógenas pertenecientes a los géneros (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Brochothrix, Listeria, Clostridium, Staphylococcus Escheríchia, Salmonella, Aeromonas, Vibrio, Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.). Los compuestos responsables de Ia actividad antibacteriana secretados a los medios de cultivo por las seis bifidobacterias y presentes en los extractos neutralizados ensayados son sustancias de naturaleza proteica y poseen características bioquímicas similares a las de las bacteriocinas de bacterias lácticas, pero no cumplen los criterios de su definición ya que poseen un espectro de inhibición excepcionalmente amplio incluyendo, no sólo a bacterias Gram-positivas, sino también a un amplio número de bacterias Gram- negativas.
Los compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de estas bacterias, así como el uso de estos compuestos como agentes antibacterianos frente a patógenos gastrointestinales o frente a bacterias patógenas y alterantes de alimentos, están también reivindicados en Ia presente invención.
El procedimiento de obtención de los extractos que contienen los compuestos arriba mencionados también se reivindica en Ia presente invención. Puesto que las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium sintetizaron compuestos con actividad antibacteriana de amplio espectro, frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, en las condiciones a las que están expuestas en el tracto intestinal, pueden actuar como probióticos con función protectora a este nivel y ser utilizados con fines médicos. El uso de las cepas de Ia presente invención como probióticos es otro objeto de Ia presente invención.
Las bifidobacterias seleccionadas crecen y se mantienen viables en diversos alimentos y bebidas constituyendo, por tanto, vehículos idóneos para su aporte. Por ejemplo, en las leches fermentadas y no fermentadas se comprobó su capacidad para secretar compuestos antimicrobianos al medio de cultivo durante su crecimiento. Las cepas del género Bifídobacterium seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas en alimentos y bebidas. Es decir, actúan como cultivos bioprotectores en alimentos como Ia leche. El uso de estas cepas y de sus extractos como agentes bioprotectores de alimentos constituye otro objeto de Ia presente invención.
Puesto que pueden fermentar y coagular Ia leche, podrían ser utilizadas para Ia elaboración de leches fermentadas y otros derivados lácteos. Este uso también ha sido reivindicado en Ia presente invención. Descripción detallada
Un objeto de Ia presente invención Io constituye una cepa bacteriana aislada útil como producto probiótico, en adelante cepa bacteriana aislada de Ia presente invención, caracterizada porque es una cepa aislada de heces de humanos sanos perteneciente al género Bifidobacterium, porque produce compuestos antibacterianos de naturaleza peptídica con características similares a las bacteriocinas de amplio espectro de acción que comprende bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y porque es resistente a condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico, pertenecientes al siguiente grupo: a condiciones del jugo gástrico, altas concentraciones de sales biliares y cloruro sódico y altas temperaturas .
Hay que destacar que esta cepa ha sido aislada a partir de heces de individuos sanos (adultos y niños), y es productora de compuestos de naturaleza proteica con características similares a las bacteriocinas pero con un espectro de acción más amplio que comprende bacterias, tanto Gram- positivas, como Gram-negativas. Este espectro de inhibición tan amplio no es una característica común a todas las bifidobacterias humanas de origen fecal ya que sólo seis del total de aislados presentan esta propiedad.
Debido a que experiencias previas demostraron que mediante aislamientos convencionales tan sólo un 40% de las cepas de bifidobacterias de origen fecal eran resistentes a pH ácido, se utilizó un procedimiento de aislamiento más selectivo que permitiera mejorar este porcentaje y aislar directamente sólo las cepas ácido-resistentes. Tras pre-incubación de las muestras fecales a pH ácido durante 16 h, 60 aislados fueron asignados al género Bifidobacterium. De acuerdo con los resultados del análisis por RAPDs, 24 del total de aislados fueron cepas distintas. La identificación a nivel de especie de las cepas de mayor interés por su amplio espectro de actividad antibacteriana se realizó utilizando PCRs específicas de especie. La cepas del género Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0312 y BIR-0349 se asignaron a Ia especie B. longum inf antis; Ia cepa BIR-0324 a Ia especie B. catenulatum y Ia cepa BIR- 0326 a B. bifidum.
Por tanto, las cepas del género Bifidobacterium seleccionadas son altamente resistentes al pH ácido. El procedimiento de selección de las cepas, mediante incubación previa de las muestras fecales en un medio ácido, permite Ia selección directa de aislados resistentes al pH propio de los jugos gástricos, que constituye Ia principal barrera biológica que puede limitar Ia supervivencia de los probióticos a su paso por el tracto gastrointestinal y durante los procesos de fermentación de alimentos y su período de almacenamiento (Ejemplo 1 ). Todas las cepas fueron resistentes a las condiciones propias de los jugos gástricos manteniendo su viabilidad en torno a 106-108 UFC/ml tras incubación prolongada.
Además, Las cepas del género Bifídobacterium seleccionadas son resistentes a altas concentraciones de sales biliares y cloruro sódico. Todas las cepas estudiadas mostraron capacidad para crecer a concentraciones de bilis de entre 1 y 5% (Figura 1A) y de NaCI de entre 2 y 10% (Figura 1B). Además, estas cepas presentan muy buena capacidad de crecimiento a temperaturas superiores a Ia óptima (hasta 60 0C) incluyendo las habitualmente utilizadas en los procesos de elaboración de leches fermentadas (Por ejemplo 42-45 0C). Por tanto, el método de aislamiento selectivo utilizado mediante pre-incubación de las muestras fecales a pH ácido, permitió Ia selección directa de cepas resistentes al pH ácido y pudo favorecer el desarrollo de otras resistencias cruzadas, obteniéndose cepas tolerantes a las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico (altas concentraciones de cloruro sódico, altas temperaturas incluidas en los procesos tecnológicos de elaboración de diversos alimentos como los productos lácteos y procesos de liofilización). Globalmente, Ia invención proporciona cepas resistentes y estables en las condiciones propias del tracto gastrointestinal y de los procesos tecnológicos con mayores posibilidades de sobrevivir y ser funcionales que las cepas probióticas actualmente comercializadas (Ejemplo 1 ).
Así, un objeto particular de Ia presente invención Io constituye una cepa del género Bifídobacterium perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, al siguiente grupo: Bifídobacterium BIR-0304 (CECT 7039), Bifídobacterium BIR-0307 (CECT 7040), Bifídobacterium BIR- 0312 (CECT 7041 ), Bifídobacterium BIR-0324 (CECT 7042), Bifídobacterium BIR-0326 (CECT 7043) y Bifídobacterium BIR-0349 (CECT 7044). La determinación de Ia sensibilidad a antibióticos es un criterio esencial para Ia selección de nuevos probióticos y, en general, de cepas bacterianas que vayan a ser utilizadas para alimentación (humana y animal) a fin de garantizar su uso seguro y, en el caso de probióticos, su compatibilidad con Ia administración de antibióticos en terapias combinadas y en el tratamiento de trastornos originados por el consumo de éstos. Las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium presentan un perfil de resistencia-sensibilidad a antibióticos común a este género que garantiza su seguridad. Las cepas estudiadas fueron resistentes al metronidazol, gentamicina, ácido nalidíxico, trimethoprim, kanamicina, vancomicina y polimixina. Las resistencias intrínsecas a ciertos antibióticos que presentan las cepas de Ia presente invención, como el metronidazol y Ia vancomicina, son útiles para terapias combinadas que incluyan estos probióticos y antibióticos, por ejemplo en el tratamiento de las infecciones por Helicobacter pylorí y Clostrídium difficile. Sólo Ia cepa Bifídobacterium BIR -0349 fue sensible a Ia gentamicina y Ia cepa Bifídobacterium BIR-0324 al trimethoprim. Sin embargo, todas fueron sensibles a Ia rifampicina, amoxicilina, penicilina G, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina y claritromicina. (Ejemplo 1 ).
Otro objeto de Ia presente invención Io constituyen compuestos antibacterianos, en forma de extracto, derivados del metabolismo de las bifidobacterias de Ia presente invención. Los metabolitos son secretados al medio de cultivo durante el crecimiento de las mencionadas bifidobacterias y los extractos que los contienen se obtienen a partir de los sobrenadantes libres de células de estos cultivos por ejemplo mediante liofilización. El procedimiento de obtención de los extractos también se reivindica en Ia presente invención. Este procedimiento de obtención es el siguiente: (i) inoculación de un medio de cultivo al 1% (entre el 0.01 y el 50%) con cada bifidobacteria e incubación del mismo, (ii) recuperación del sobrenadante del cultivo por centrifugación al final de Ia fase exponencial del crecimiento (o bien durante Ia fase exponencial o estacionaria de crecimiento) (iii) concentración del sobrenadante por liofilización (o bien por precipitación con sulfato amónico o solventes orgánicos y posterior diálisis o evaporación, por extracción con solventes orgánicos o por filtración) y (iv) suspensión del liófilo en un volumen de tampón que represente el 10% (entre el 90 y el 0.5% ) del volumen inicial del medio de cultivo y neutralización o no del extracto obtenido y esterilización por filtración. La actividad antimicrobiana se detecta en los extractos, neutralizados (en los que se elimina el efecto de los ácidos orgánicos) y sin neutralizar (en los que el efecto de los ácidos orgánicos se suma al de compuestos de otra naturaleza; ver Ejemplo 2 y 3). El espectro de actividad incluye a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas responsables de alteraciones en alimentos y potencialmente patógenas pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacteríum, Brochothrix, Listería, Clostridium, Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Aeromonas, Vibrio, Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.
La actividad antimicrobiana de estos compuestos fue determinada por Ia técnica de Ia doble capa y Ia de difusión en agar frente a dos microorganismos indicadores Gram-positivos, L. innocua y L. lactis, esto permitió Ia selección de ocho cepas del género Bifidobacterium de entre las 24 aisladas de heces. Posteriormente, el estudio se orientó hacia Ia detección de Ia actividad anti bacteriana debida exclusivamente a Ia secreción de compuestos de naturaleza proteica, por Io que se utilizó sólo Ia técnica de difusión en agar y extractos neutralizados, y se amplió el número de microorganismos indicadores, incluyendo bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Se seleccionaron, finalmente, las seis cepas que mostraron el espectro de inhibición más amplio (ver Tabla I). Entre ellas, Ia cepa Bifidobacterium BIR- 0312 fue Ia que inhibió un número mayor de microoganismos indicadores. Los perfiles de inhibición de las cepas Bifidobacterium BIR -0304, BIR-0307, BIR- 0312, BIR-0324 y BIR-0326 fueron similares mientras que Ia cepa BIR-0349 mostró un espectro más restringido. La mayoría de las bacterias potencialmente patógenas Gram-positivas (Clostridium difficile, L. monocytogenes y Staphylococcus aureus) y Gram-negativas (Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori, Campylobacter coli y Arcobacter butzleri) fueron inhibidas por, al menos, cuatro de las bifidobacterias seleccionadas.
Los compuestos responsables de Ia actividad antibacteriana secretados a los medios de cultivo por las seis bifidobacterias y presentes en los extractos neutralizados ensayados son sustancias de naturaleza proteica cuya producción o liberación al medio es máxima al final de Ia fase de crecimiento exponencial y fase estacionaria, cuando se utiliza como medio de cultivo caldo MRS, conteniendo cisteína y agentes como el Tween (0,1-10,0%). La naturaleza proteica se confirma por Ia destrucción de su actividad tras su tratamiento con todas las proteinasas ensayadas. Tan sólo Ia incubación con proteinasa K incrementó el efecto inhibidor sobre Helicobacter pylori, debido a que Ia propia proteinasa actuaba como inhibidor del crecimiento de este microorganismo y, dependiendo de Ia concentración, de forma sinérgica junto a otros compuestos de los extractos de las bifidobacterias. Los compuestos responsables de Ia inhibición son termoestables manteniendo su actividad tras su incubación a 8O0C durante al menos 3 min y a 1000C durante al menos 1 min. También son estables y activos en un amplío intervalo de pH (2-11 ) (Ejemplo 2). Por tanto, su actividad es compatible con las condiciones propias del tracto gastrointestinal y con las de un amplio número de procesos tecnológicos (fermentación y maduración de productos lácteos, cárnicos, etc.).
La masa molecular aparente de los compuestos antibacterianos es menor de 100 kDa, determinada por ultrafiltración (Ejemplo 2).
Por tanto, los compuestos responsables de Ia actividad anti bacteriana poseen características bioquímicas similares a las de las bacteriocinas de bacterias lácticas, pero no cumplen los criterios de su definición ya que poseen un espectro de inhibición excepcionalmente amplio incluyendo, no sólo a bacterias Gram-positivas, sino también a un amplio número de bacterias Gram- negativas. Así, Ia actividad antimicrobiana de los extractos frente a bacterias Gram-positivas (por ejemplo Listeria innocua) y Gram-negativas (por ejemplo Salmonella typhimurium y Helicobacter pylori) se destruye tras su tratamiento con diversas proteasas (tripsina, proteasa A, pepsina y catepsina B), pero no con amilasas y lipasas (Ejemplo 2). El hecho de que el espectro de inhibición se amplíe a patógenos Gram-negativos es una característica inusual en las bacteriocinas convencionales de bacterias Gram-positivas y confiere a Ia cepa aislada de Ia presente invención y a sus metabolitos grandes ventajas como probióticos y bioprotectores frente a microorganismos que no estén próximamente relacionados. Los compuestos antibacterianos de naturaleza proteica producidos por las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium son capaces de inhibir cepas de Helicobacter pylori (multi) -resistentes a antibióticos habitualmente utilizados para su tratamiento (por ejemplo metronidazol y claritromicina), pudiendo constituir una terapia alternativa a dicho tratamiento farmacéutico.
Las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium de Ia presente invención sintetizaron compuestos con actividad antibacteriana de amplio espectro, frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, en las condiciones a las que están expuestas en el tracto intestinal, presencia de sales biliares y pancreatina, por Io que pueden actuar como probióticos con función protectora a este nivel y ser utilizados con fines médicos. Dicha actividad antibacteriana fue debida a compuestos secretados al medio de cultivo y, en gran parte, a compuestos de naturaleza proteica ya que los halos de inhibición debidos al efecto de los extractos neutralizados fueron sólo ligeramente inferiores (entre 1 y 3 mm) a los de los extractos sin neutralizar (ver Figura 3-B, pocilios A y B) (Ejemplo 3).
Se determinó el posible uso de leche y medios basados en leche como sustrato para el crecimiento de las bifidobacterias y vehículos para su aporte en forma de células viables. En leche, todas las bifidobacterias seleccionadas e inoculadas al 1% fueron capaces de crecer, alcanzando niveles de 106-109 UFC/ml, tras períodos de incubación de entre 24 y 48 h. El pH de Ia leche se redujo de valores iniciales de 6,4 a valores entre 4,0 y 5,2 y se observó cierto grado de coagulación, especialmente importante en las muestras inoculadas con Ia cepa Bifídobacterium BIR-0324 y su aroma fue el típico del yogur. En L- EL-G, todas las bifidobacterias seleccionadas fueron capaces de crecer, y el aumento en el número de viables fue ligeramente superior (entre 1 y 0,5 unidades logarítmicas) al obtenido en L. El grado de acidificación alcanzado también fue mayor, obteniéndose valores finales de pH entre 3,0 y 4,6. Se observó también un mayor grado de coagulación y, este fue especialmente importante, en las muestras inoculadas con las cepas Bifídobacterium BIR - 0312, BIR-0324 y BIR-0326 y su aroma fue el típico de leches fermentadas azucaradas. Las bifidobacterias seleccionadas fueron capaces de sintetizar compuestos con actividad antibacteriana frente a microorganismos Gram- positivos y Gram-negativos en leche y medios basados en leche, como se demuestra por Ia técnica de Ia doble capa. Se obtuvieron halos de inhibición de 3 a 12 mm, excepto en el caso de Ia cepa Bifidobacterium BIR-0349 (ver Figura 3-A). La capacidad para secretar compuestos antimicrobianos al medio de cultivo durante su crecimiento en estos medios se verificó mediante el análisis de Ia actividad de sus extractos. Concretamente, en Ia Figura 3-B se observa el efecto inhibidor de los extractos neutralizados y sin neutralizar de Ia cepa Bifidobacterium BIR-0324 crecida en L-EL-G frente a S. typhimuríum, detectándose halos muy similares, sólo 3 mm mayor en el extracto no neutralizado. Estos resultados confirman, por tanto, que dicha actividad es debida a compuestos de naturaleza proteica y que son secretados in situ durante su crecimiento en medios basados en leche. Por Io tanto, las cepas del género Bifidobacterium de Ia presente invención seleccionadas crecen y se mantienen viables en diversos alimentos constituyendo vehículos idóneos para su aporte. Las leches fermentadas y no fermentadas, constituyen ejemplos de alimentos que sirven de soporte para el mantenimiento de su viabilidad (Ejemplo 4); además, se encuentran entre los productos más adecuados para Ia administración de cepas probióticas, debido a que Ia leche y sus derivados son integrantes habituales de Ia dieta en países desarrollados, tienen alto valor nutritivo, son fáciles de digerir y gozan de gran aceptación en los diversos grupos de población.
Las cepas del género Bifidobacterium seleccionadas pueden fermentar Ia leche y coagular sus proteínas; por tanto, pueden ser utilizadas para Ia elaboración de leches fermentadas, leches bífidus y otros derivados lácteos como por ejemplo, el yogur (Ejemplo 4).
Las cepas del género Bifidobacterium de Ia presente invención seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas en alimentos y bebidas. Las bifidobacterias seleccionadas actuaron como cultivos bioprotectores en leche, reduciendo Ia viabilidad de Salmonella en, al menos, dos unidades logarítmicas y de Listeria en, al menos, seis (ver Tabla II). Los efectos protectores consecuencia directa de los metabolitos secretados por las bifidobacterias, se confirmaron por adición exclusiva a Ia leche contaminada de sus extractos. La adición de extractos no neutralizados, en los que se sumarían los efectos de los ácidos orgánicos y los de compuestos de naturaleza proteica, produjeron una reducción de los niveles de Listeria a valores inferiores a 100 UFC/ml y Ia adición de extractos neutralizados, con los que se evaluaría inicialmente el efecto de compuestos de naturaleza proteica, provocó reducciones de Ia bacteria contaminante de, al menos, dos unidades logarítmicas. Por tanto, los compuestos de naturaleza proteica en forma de extractos así como los cultivos de las cepas del género Bifidobacterium que los producen pueden actuar, en alimentos como Ia leche, como bioprotectores o conservantes naturales inhibiendo el desarrollo de microorganismos contaminantes (Ejemplo 5).
Por Io tanto, otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia cepa bacteriana aislada en Ia presente invención en Ia elaboración de un alimento o bebida probiótica, y que de una forma concreta cumpla funciones profilácticas o terapéuticas frente a patógenos gastro-intestinales. De forma preferente dicho uso de Ia cepa bacteriana en Ia elaboración de un alimento probiótico consiste en Ia elaboración de una leche fermentada, una leche bífidus y otros derivados lácteos.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia cepa bacteriana aislada en Ia presente invención como fermento o cultivo iniciador y cultivo bioprotector de alimentos o bebidas frente a bacterias de alteración y de interés sanitario y de forma preferente en alimentos como leches fermentadas una leche bífidus y otros derivados lácteos.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia cepa bacteriana aislada en Ia presente invención como cultivo bioprotector de alimentos o bebidas fre nte a bacterias alterantes de alimentos y de interés sanitario. Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de los extractos proteicos de Ia presente invención como compuestos terapéuticos frente a patógenos gastrointestinales u otro tipo de bacteria patógena, preferentemente el patógeno gastrointestinal es una cepa de Ia especie Helicobacter pylorí multi- resistente.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de los extractos proteicos de Ia presente invención como conservantes biológicos frente a bacterias alterantes y de interés sanitario en alimentos o bebidas y de forma preferente en una leche fermentada, una leche bífidus y otros derivados lácteos.
Un cultivo de Bifidobacterium BIR-0304 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7039.
Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0307 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT ), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7040.
Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0312 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7041.
Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0324 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7042. Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0326 ha sido depositado en Ia
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7043.
Por último, otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0349 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7044. DESCRIPCIONES DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Representación de Ia tolerancia de las cepas del género Bifidobacterium a condiciones de estrés intestinales y tecnológicas. Se muestra un ejemplo de Ia capacidad de crecimiento de una de las cepas seleccionadas (Bifidobacterium BIR-0314) en presencia de altas concentraciones de bilis (Ox- gall; Fig. 1A) y sal (NaCI; Fig. 1 B), en caldo MRS-C, a 37 0C. El crecimiento se monitorizó mediante medidas de absorbancia a 655 nm en un espectrofotómetro de placas de multipocillo. Figura 2.- Representación del efecto inhibidor de las cepas del género Bifidobacterium frente a Helicobacter pylorí mediante Ia técnica de difusión en agar. Las flechas señalan los halos de inhibición causados por los compuestos anti bacterianos presentes en los extractos obtenidos a partir de los cultivos de las bifidobacterias seleccionadas. El control negativo (C) muestra Ia ausencia de inhibición del extracto obtenido a partir del medio de cultivo que no fue fermentado por las bifidobacterias.
Figura 3.- A. Representación del efecto inhibidor de las cepas del género Bifidobacterium crecidas en distintos medios de cultivo sobre Salmonella typhimurium por Ia técnica de Ia doble capa. Los medios utilizados para crecer las bifidobacterias fueron: MRSC-OX-P, MRSC con un 0,5 % de sales biliares (Ox-gall) y 0,1 g/l de pancreatina; L, leche; L-EL-G, leche con un 0,5% de extracto de levadura y un 1% de glucosa; PCL, Píate Count leche. El efecto inhibidor se determinó midiendo los halos de inhibición y está expresado en milímetros (mm)\ B. Representación del efecto inhibidor de los extractos de las cepas del género Bifidobacterium crecidas en distintos medios de cultivo sobre Salmonella typhimurium por Ia técnica de difusión en agar. A= MRSC-OX-P, neutralizado; B= MRSC-OX-P, sin neutralizar; C=MRSC, sin neutralizar; D=MRSC, neutralizado; E=MRSC sin inocular, control negativo; F= L-EL-G sin neutralizar; G= L-EL-G neutralizado; H= L-EL-G sin inocular, control negativo. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1 . PROCEDIMIENTO DE AISLAMIENTO SELECTIVO DE CEPAS DEL GÉNERO BIFIDOBACTERIUM RESISTENTES A DIVERSAS CONDICIONES DE ESTRÉS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS AISLADOS. Aislamiento selectivo e identificación de los aislados.
Se procedió al aislamiento de cepas del género Bifidobacterium a partir de heces de individuos sanos (adultos de entre 25-35 años de edad y niños de entre 6 y 12 meses) que no hubieran ingerido alimentos que contuvieran bifidobacterias durante al menos el mes anterior al análisis y que no hubieran sido sometidos a tratamientos con antibióticos durante los últimos seis meses. Las muestras se mantuvieron a 4o C y se analizaron sin que transcurrieran más de dos horas desde su recogida. Dos gramos de cada una de ellas se diluyeron en tampón fosfato 10 mM conteniendo una concentración de NaCI 130 mM (PBS) y se homogeneizaron en un stomacher Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres, UK), durante 3 min. A fin de aislar directamente sólo cepas resistentes a las condiciones acidas de los jugos gástricos, de cada uno de los homogeneizados se tomaron muestras de 1 mi y se inocularon en caldo MRS (de Man Rogosa and Sharpe; Scharlau, Barcelona) conteniendo un 0.05% de cisteína (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), ajustado a pH 2 con HCI. Estas muestras se incubaron a 37 0C durante 16 h en condiciones de anaerobiosis (AnaeroGen, Oxoid, UK). Posteriormente, se hicieron diluciones decimales y alícuotas de 100 μl se sembraron en placas de agar de dos medios selectivos para el aislamiento de bifidobacterias: BSM (Fluka, Buchs, Suiza) y BFM (Nebra y Balnch, 1999). Después de tres días de incubación, se seleccionaron entre 8 y 10 colonias características de las diluciones más altas de cada medio y se analizó su morfología bajo tinción de Gram.
La identidad de los aislados se confirmo mediante PCR específica de género, de acuerdo con Ia metodología descrita por Kaufman et al. (1997. Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targeted probes by colony hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273). Se utilizaron cebadores (LM26 y LM3) que amplifican un fragmento de 1.35 kb del gen del ARN ribosómico 16S. La diferenciación de los aislados a nivel de cepa se realizó por Ia técnica de RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA)-PCR, utilizando el cebador Bif y Ia metodología descrita por Tynkynen et al. (1999. Comparison of ribotyping, randomly amplified polymorphic DNA analysis, and pulsed-field gel electrophoresis in typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei strains. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3908-3914). De los 60 aislados, 24 fueron cepas distintas. La identificación a nivel de especie de las cepas de mayor interés por su amplio espectro de actividad antibacteriana (ver ejemplo 2) se realizó mediante el uso de PCRs múltiples y simples utilizando cebadores específicos de especie basados en secuencias del gen del ARN ribosómico 16S (Matsuki eí al. 2003. Genus- and species-specific PCR primers for the detection and identification of Bifidobacteria Curr. Issues Intest. Microbiol. 4: 61-69).
La cepas del género Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0312 y BIR- 0349 se asignaron a Ia especie B. longum infantis; Ia cepa BIR-0324 a Ia especie B. catenulatum y Ia cepa BIR-0326 a B. bifidum.
Resistencia a condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológicas
La resistencia de las bifidobacterias aisladas a las condiciones acidas de los jugos gástricos, que constituyen Ia primera barrera biológica que limita Ia viabilidad de los probióticos tras su ingestión, se confirmó para cada una de las cepas recuperadas. Para ello, se prepararon suspensiones de células (108 células/ml) de cada cepa en PBS, conteniendo 3 g/l de pepsina (Sigma, St. Louis, MO) y ajustada a pH 2 con HCI y se incubaron a 37 0C durante un total de 120 min. A distintos tiempos (0, 90 y 120 min), incluyendo el tiempo medio de vaciado gástrico (90 min), se tomaron alícuotas para determinar Ia viabilidad mediante recuentos en placas de agar MRS-C. Posteriormente, se estudió Ia tolerancia de las cepas resistentes al pH ácido a otras condiciones de estrés, como Ia bilis, el NaCI y las altas temperaturas. Para conocer Ia tolerancia de las cepas objeto de estudio a Ia bilis, se evaluó su capacidad para crecer en MRS- C, al que se adicionaron diversas concentraciones (0,5-1 ,5 %) de Ox-gall (Sigma, St. Louis, MO). Alícuotas de 200 μl de cada medio, inoculadas al 1% con cultivos de 24 h, se cargaron en placas multipocillo y se incubaron a 37 0C. El crecimiento se monitorizó mediante medidas de absorbancia a 655 nm en un espectrofotómetro 550 Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA). Del mismo modo, se determinó Ia tolerancia de las cepas a altas concentraciones de NaCI (3-10%) y a altas temperaturas (42-60 0C).
Sensibilidad a antibióticos La sensibilidad de las cepas objeto de estudio se determinó mediante el uso de discos de antibióticos (Oxoid, Basingstoke, UK) y el método de difusión en agar y, en el caso del metronidazol y Ia claritromicina mediante el uso de E- test (AB Biodisk, Solna, Suecia). 100 μl de un cultivo de 24 h se inocularon en 9 mi de MRS-C conteniendo un 0.7% de agar fundido y se vertió sobre una capa de agar sólido. Una vez solidificada Ia capa superior, se colocaron los discos o tiras de antibiótico en su superficie y, tras incubar a 370C durante 24 h, se midieron los halos de inhibición.
EJEMPLO 2. PROCEDIMIENTO DE SELECCIÓN DE BIFIDOBACTERIAS CAPACES DE PRODUCIR PROTEÍNAS ANTIBACTERIANAS DE AMPLIO ESPECTRO Y DE EXTRACTOS CON DICHA ACTIVIDAD.
Detección de actividad antibacteriana en cultivos y extractos obtenidos a partir de ellos y análisis del espectro de inhibición.
La actividad antibacteriana de las cepas del género Bifidobacterium aisladas selectivamente por el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 , se determinó mediante dos métodos: (i) por Ia técnica de Ia doble capa y (ii) por Ia técnica de difusión en agar.
La actividad antibacteriana de cada cepa se evaluó globalmente mediante Ia técnica de Ia doble capa utilizando como microorganismos indicadores dos bacterias Gram-positivas (Listeria innocua y Lactococcus lactis). Las bifidobacterias potencialmente activas se sembraron en placas de MRS-C en líneas de unos 2 cm y se incubaron en condiciones óptimas durante 16 h y su desarrollo posterior se inhibió con cloroformo. El microorganismo indicador se inoculó a una concentración de 104-105 CFU/ml en 10 mi de agar semisólido adecuado, se vertió sobre Ia capa de agar del microorganismo protector y se incubó en condiciones óptimas para el primero. Listeria innocua se cultivó en Brain Herat (BH) y L. lactis en M17 y ambos se incubaron en aerobiosis a 3O0C. Tras 24 h se midieron los posibles halos de inhibición alrededor de las líneas del cultivo protector.
A fin de evaluar Ia actividad antibacteriana debida a Ia secreción de compuestos de naturaleza proteica se utilizó Ia técnica de difusión en agar. 10 mi de caldo MRS-C se inocularon al 1% con un cultivo de 24 h de cada bifidobacteria y se incubaron durante 16 h a 370C. Los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (12.000 g, 15 min, 40C) y se concentraron por liofilización. Los liófilos se resuspendieron en 1 mi de tampón fosfato 50 mM a pH 6.5, se neutralizaron con NaOH hasta alcanzar un pH de 6,5 para eliminar los efectos de los ácido orgánicos generados por fermentación, y se esterilizaron por filtración. Estas muestras constituyeron los extractos crudos en los que se determinó Ia posible actividad de proteínas antibacterianas producidas por las bifidobacterias. El microorganismo indicador se inoculó a una concentración de 104-105 células/ml en 10 mi de agar semisólido adecuado y se vertió sobre una capa sólida de agar del mismo medio. Tras solidificar, se perforaron pocilios de 5 mm, a los que se añadieron 40 μl del extracto libre de células y neutralizado de cada bifidobacteria. Se dejó difundir 1 h a 40C y, posteriormente, se incubó en las condiciones óptimas para cada microorganismo indicador. Como microorganismos indicadores, inicialmente, se utilizaron dos bacterias Gram-positivas (Listeria innocua y Lactococcus lactis) y, posteriormente, se amplio el espectro incluyendo un amplio número de bacterias alterantes y patógenos Gram-positivos y Gram-negativos. Entre estos se estudiaron los siguientes indicadores: (i) cepas alterantes de los géneros Lactobacillus y Leuconostoc que se cultivaron en MRS, y del género Carnobacterium que se cultivaron en agar APT y se incubaron a 3O0C y en microaerofilia; (ii) cepas alterantes del género Brochothrix que se cultivaron en agar STAA y se incubaron a 3O0C y en aerobiosis; (iii) cepas del género Enterococcus que se cultivaron en BH y se incubaron a 37 0C, en aerobiosis; (iv) cepas del género Clostridium que se cultivaron en RCM a 370C, en anaerobiosis; (v) cepas del género Listeria y Enterobacter que se cultivaron en BH e incubaron a 30 0C, en aerobiosis; (vi) cepas de los géneros Staphylococcus, Escherichia, Salmonella y Vibrio, que se cultivaron en BH y se incubaron a 37 0C, en aerobiosis; (vii) cepas del género Aeromonas que se cultivaron en BH y se incubaron a 2O0C, en aerobiosis; (viii) cepas de los géneros Helicobacter y Campylobacter, que se cultivaron en agar sangre de caballo (ASC) y de oveja (ASO), respectivamente, y se incubaron a 37 0C en microaerofilia; y (ix) cepas del género Arcobacter que se cultivaron en agar ASO y se incubaron a 3O0C, en aerobiosis. También se incluyó como indicador una cepa del mismo género y de Ia especie B. bifidum, que se cultivó en agar TPY y se incubó a 370C, en anaerobiosis. Todos los medios de cultivo fueron de Oxoid (Basingstoke, UK) excepto el agar MRS y STAA que fue de Scharlau (Barcelona, España).
Tabla I.- Representación del espectro de inhibición de las cepas del género Bifidobacterium seleccionadas mediante Ia técnica de difusión en agar.
Espectro de inhibición (mm)* de las cepas Bifidobacterium
Bacteria
BIR-0304 BIR-0307 BIR-0312 BIR-0324
Indicadora BIR-0326 BIR-0349
Lactobacillus fermentum 9,2 - 9,1 - 11 ,1 14,4
Lactococcus lactis 10,1 9,2 14,3 10,1 10,5 19,2
Leuconostoc spp. - - - - - 10.3
Enterococcus faecium - - - - - -
Carnobacterium 10,1 - 9,0 9,2 - - piscícola
Bifidobacterium bifídum - - 9,0 - - -
Brochothrix 16,3 15,1 14,3 12,1 - - thermosphacta
Listeria innocua 17,1 18,2 16,6 15,5 10,3 10,1
Listeria monocytogenes 15,3 - 11 ,2 10,3 11 ,2 -
Clostridium difficile 9,3 13,3 12,3 9,2 10,0 -
Staphylococcus aureus 10,2 9,1 15,2 - 19,4 -
Escherichia coli 13,5 18,0 14,0 15,2 15,3 10,4
E. coli O157:H7 - - - - - 10,2
Salmonella typhimurium 14,0 15,2 12,0 14,2 9,0 -
Enterobacter aerogenes - - - - - 9,2
Aeromonas salmonicida - - 9,0 - 9,0 10,0
Vibrio parahaemolyticus - - - - 9,3 9,0
Helicobacter pylori 10,0 9,1 9,3 12,3 9,0 -
Campylobacter coli 9,1 9,2 13,2 10,1 15,3 -
Arcobacter butzleri 13,3 9,0 10,2 11 ,5 12,4 -
*, El efecto inhibidor de los extractos, libres de células y neutralizados, obtenidos a partir de los cultivos de las bifidobacterias seleccionadas frente a bacterias Gram -positivas y Gram- negativas se determinó mediante medidas de los halos de inhibición y está expresado en milímetros (mm)*. El signo (-) indica ausencia de inhibición. Posteriormente, el estudio se orientó hacia Ia detección de Ia actividad anti bacteriana debida exclusivamente a Ia secreción de compuestos de naturaleza proteica, por Io que se utilizó sólo Ia técnica de difusión en agar y extractos neutralizados, y se amplió el número de microorganismos indicadores, incluyendo bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Se seleccionaron, finalmente, las seis cepas que mostraron el espectro de inhibición más amplio (ver Tabla I). Entre ellas, Ia cepa Bifídobacterium BIR- 0312 fue Ia que inhibió un número mayor de microoganismos indicadores. Los perfiles de inhibición de las cepas Bifídobacterium BIR -0304, BIR-0307, BIR- 0312, BIR-0324 y BIR-0326 fueron similares mientras que Ia cepa BIR-0349 mostró un espectro más restringido. La mayoría de las bacterias potencialmente patógenas Gram-positivas (Clostridium difficile, L. monocytogenes y Staphylococcus aureus) y Gram-negativas (Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori, Campylobacter coliy Arcobacter butzleri) fueron inhibidas por, al menos, cuatro de las bifidobacterias seleccionadas.
Caracterización de los compuestos responsables de Ia actividad antibacteriana La caracterización de los compuestos responsables de Ia actividad anti bacteriana de los extractos neutralizados, obtenidos por el procedimiento descrito en el apartado anterior, se realizó mediante los siguientes ensayos:
(i) Sensibilidad a diversos enzimas proteolíticos (tripsina, proteinasa K, proteasa A, pepsina y catepsina B) lipolíticos (lipasa A) y amilolíticos (α-amilasa) suministrados por Sigma (St. Louis, MO). Los extractos se incubaron en presencia de 2 mg/ml de cada enzima y fueron incubados en condiciones óptimas de actuación para cada una de ellas, durante 2 h. Tras cada tratamiento se determinó Ia actividad residual utilizando como control los extractos no incubados con ningún enzima.
(ii) Estabilidad a Ia temperatura y pH. Los extractos se incubaron a distintas temperaturas (80 y 100 0C) durante 10-30 min y a distintos pH (3-10), durante 1 h. Tras cada tratamiento se determinó Ia actividad residual utilizando controles no tratados. (iii) Masa molecular aparente. Se determinó mediante el uso de sistemas de filtración-centrifugación (Millipore, Bedford, Mass) con membranas de límites de exclusión entre 3 y 100 kDa. Los extractos se fraccionaron de forma progresiva con filtros de distinto límite de exclusión y se determinó en que fracciones (retenido y filtrado) se concentraba Ia actividad.
Como microorganismos indicadores se utilizaron bacterias Gram-positivas (L. innocua y L. lactis) y Gram-negativas (H. pylorí).
EJEMPLO 3. PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS DE NATURALEZA PROTEICA EN CONDICIONES INTESTINALES.
La capacidad de las cepas seleccionadas del género Bifidobacterium para producir compuestos antibacterianos en las condiciones propias del tracto intestinal se determinó por Ia técnica de Ia doble capa y Ia de difusión en agar. En el primer caso las cepas seleccionadas se inocularon en líneas en agar MRS-C conteniendo 0.5 % de bilis (Ox-gall, sigma, St. Louis, MO) y 0,1 g/l de pancreatina (Sigma, St. Louis, MO), y se incubaron a 37 0C, durante 16 h. Sobre estas placas de agar se vertieron los cultivos del microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimurium) y se incubaron durante 24 h a temperatura óptima para el indicador. En el segundo ensayo, se estudió el efecto inhibidor de los extractos obtenidos a partir de cultivos de las seis bifidobacterias crecidas en caldo MRS-C, conteniendo 0.5 % de bilis y 0,1 g/l de pancreatina. Alícuotas (40 μl) de estos extractos se adicionaron a los pocilios perforados en placas de agar semisólido en las que estaba inoculado el microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimuríum), se dejaron difundir a 4 0C, durante 1 h y, posteriormente, se incubaron en condiciones óptimas para cada indicador durante 24 h. Tras el período de incubación se midieron los halos de inhibición alrededor de las líneas o los pocilios. EJEMPLO 4. CAPACIDAD PARA CRECER, FERMENTAR Y COAGULAR LA LECHE Y PARA PRODUCIR COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS DE NATURALEZA PROTEICA EN ESTE MEDIO.
La capacidad de las bifidobacterias para crecer, fermentar y coagular Ia leche se determinó inoculando al 1% cultivos de 24 h de cada una de ellas en leche desnatada al 10% (L) y leche desnatada al 10 %, conteniendo un 0.5% de extracto de levadura y un 1% de glucosa (L-EL-G). Los cultivos se incubaron a 37 0C y a distintos tiempos se determinó Ia viabilidad de las bifidobacterias mediante recuentos en placas de agar MRS-C, el pH, Ia consistencia y el aroma de las leches cultivadas.
La capacidad de las cepas seleccionadas para producir compuestos anti bacterianos In situ en los medios basados en leche (L, L-EL-G y PCL) se determinó por Ia técnica de Ia doble capa y por Ia de difusión en agar. En el primer caso, las cepas seleccionadas se inocularon en líneas en los medios basados en leche descritos y se incubaron a 37 °c, durante 16 h. Sobre estas placas de agar se vertieron los cultivos del microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimurium) y se incubaron, durante 24 h, a temperatura óptima para el indicador. En el segundo ensayo, se estudió el efecto inhibidor de los extractos obtenidos a partir de cultivos de las bifidobacterias en L y L-EL- L tras su incubación durante 16 h a 37 0C, en anaerobiosis. Alícuotas (40 μl) de los extractos, neutralizados y sin neutralizar, se adicionaron a los pocilios perforados en placas de agar semisólido en las que estaba inoculado el microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimurium), se dejaron difundir a 4 0C, durante 1 h y, posteriormente, se incubaron en condiciones óptimas para cada indicador durante 24 h. Tras el período de incubación se midieron los halos de inhibición alrededor de las líneas de siembra y de los pocilios, en cada caso.
EJEMPLO 5. FUNCIÓN BIOPROTECTORA DE LAS CEPAS DEL GÉNERO Bifidobacterium Y DE SUS EXTRACTOS EN LECHE.
Se utilizó leche descremada al 10% como modelo de un alimento en el que las cepas seleccionadas podrían desempeñar una función bioprotectora frente a bacterias alterantes y patógenas. La leche, previamente esterilizada, se inoculó con las bifidobacterias bioprotectoras, de modo que alcanzaran niveles de 107 UFC/ml, y se contaminaron con cultivos de Listeria innocua y Salmonella typhimurium, de modo que alcanzaran niveles finales de 104-105 UFC/ml, y se incubaron a 370C, durante 48 h. Paralelamente, se analizaron controles en los que sólo se inoculó Ia bacteria contaminante. A distintos tiempos se tomaron alícuotas y se evaluó comparativamente Ia viabilidad de los microorganismos contaminantes en presencia o ausencia de Ia bifidobacteria bioprotectora. Los recuentos de Listeria se hicieron en agar Palcam (Merck, Darmstadt, Alemania) y los de Salmonella en agar Hektoen (Scharlau, Barcelona, España) incubando en aerobiosis a 30 y 370C, respectivamente, durante 48 h.
A fin de estudiar el efecto bioprotector de los compuestos antimicrobianos secretados al medio por las bifidobacterias y adicionados, en forma de extractos a Ia leche, previamente inoculada con el microorganismo contaminante (Listeria innocua; 105 UFC/ml), se Ie añadieron 0.2 volúmenes del extracto obtenido en MRS-C, neutralizado y sin neutralizar. Se incubó a 370C durante 48 h. Paralelamente, se analizaron controles en los que se inoculó Ia bacteria contaminante y un volumen equivalente de medio no fermentado. Como en el caso anterior se evaluó Ia viabilidad del microorganismo contaminante a distintos tiempos mediante recuentos en placa.
Las cepas del género Bifidobacterium de Ia presente invención seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas en alimentos. Las bifidobacterias seleccionadas actuaron como cultivos bioprotectores en leche, reduciendo Ia viabilidad de Salmonella en, al menos, dos unidades logarítmicas y de Listeria en, al menos, seis (ver Tabla II). Los efectos protectores consecuencia directa de los metabolitos secretados por las bifidobacterias, se confirmaron por adición exclusiva a Ia leche contaminada de sus extractos. La adición de extractos no neutralizados, en los que se sumaría los efectos de los ácidos orgánicos y los de compuestos de naturaleza proteica, produjeron una reducción de los niveles de Listeria a valores inferiores a 100 UFC/ml y Ia adición de extractos neutralizados, con los que se evaluaría inicialmente el efecto de compuestos de naturaleza proteica, provocó reducciones de Ia bacteria contaminante de, al menos, dos unidades logarítmicas. Por tanto, los compuestos de naturaleza proteica en forma de extractos así como los cultivos de las cepas del género Bifidobacterium que los producen pueden actuar, en alimentos como Ia leche, como bioprotectores inhibiendo el desarrollo de microorganismos contaminantes (Ejemplo 5).
Tabla II.- Representación del efecto inhibidor de las bifidobacterias seleccionadas sobre Listeria innocua y Salmonella typhimurium en co- cultivos en leche y por adición directa de los extractos, obtenidos a partir de los sobrenadantes de los cultivos de las bifidobacterias, a cultivos simples de cada uno de los microorganismos en leche.
Inoculo en leche Viabilidad del microorganismo contaminante (UFC/ml)
Tiempo de Incubación (h) O h 48 h
L.innocua 1 ,3x105 5,5 x107
L.innocua+Bifidobacterium BIR-0326 1 ,3x105 <102
L.innocua+ medio no inoculado 6,0x105 4,4 x108
L.innocua+ extracto neutralizado de
6,0x105 2,0x106 Bifidobacterium BIR-0326 L.innocua+ extracto sin neutralizar de 6,0x105 <102 Bifidobacterium BIR-0326
S. typhimurium 4,5x104 1 ,5x105
S. typhimurium + Bifidobacterium BIR-
4,5x104 <102 0324

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Cepa bacteriana aislada útil como producto probiótico caracterizada porque es una cepa aislada de heces de humanos sanos perteneciente al género Bifidobacterium, porque produce compuestos antibacterianos de naturaleza proteica con características similares a las bacteriocinas de amplio espectro de acción que comprende bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y porque es resistente a condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico, pertenecientes al siguiente grupo: a condiciones del jugo gástrico, altas concentraciones de sales biliares, altas concentraciones de cloruro sódico y altas temperaturas.
2.- Cepa bacteriana aislada según Ia reivindicación 1 caracterizada por Ia resistencia a las condiciones del jugo gástrico.
3.- Cepa bacteriana aislada según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia tolerancia a altas concentraciones sales biliares se encuentra entre 1-5% de bilis.
4.- Cepa bacteriana aislada según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia tolerancia a altas concentraciones de cloruro sódico se encuentra entre el 2- 10%.
5. Cepa bacteriana aislada según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia tolerancia a altas temperaturas se encuentra entre 42-6O0C.
6.- Cepa bacteriana aislada según las reivindicaciones 1 a Ia 5 caracterizada porque pertenece al siguiente grupo: Bifidobacterium BIR-0304 (CECT 7039), Bifidobacterium BIR-0307 (CECT 7040), Bifidobacterium BIR-0312 (CECT 7041 ), Bifidobacterium BIR-0324 (CECT 7042), Bifidobacterium BIR-0326 (CECT 7043) y Bifidobacterium BIR-0349 (CECT 7044).
7.- Extracto proteico derivado del metabolismo de Ia cepa bacteriana de las reivindicaciones 1 a Ia 6 caracterizado porque contiene compuestos de naturaleza proteica con características similares a las bacteriocinas con propiedades antibacterianas de amplio espectro (frente a Gram-positivas y Gram-negativas).
8.- Extracto proteico según Ia reivindicación 7 caracterizado porque contiene compuestos con actividad antimicrobiana que: a) tienen una masa molecular aparente menor de 100 kDa b) son termoestables c) presentan estabilidad y actividad en un intervalo de pH de 2-11 d) son sensibles a enzimas proteolíticas e) son resistentes a enzimas lipolíticas y amilolíticas
9.- Procedimiento de obtención de extracto proteico según las reivindicaciones 7 y 8 caracterizado porque se obtiene a partir de los sobrenadantes libres de células de cultivos de las cepas bacterianas aisladas según las reivindicaciones 1 a Ia 6 en condiciones adecuadas.
10.- Procedimiento de obtención de extracto proteico según Ia reivindicación 9 caracterizado porque se obtiene mediante liofilización, centrifugación, precipitación, extracción o filtración.
11.- Uso de Ia cepa bacteriana aislada según las reivindicaciones 1 a Ia 6 en Ia elaboración de un alimento o bebida probiótica.
12.- Uso de Ia cepa bacteriana aislada según Ia reivindicación 11 caracterizado porque el alimento o bebida probióica cumple funciones profilácticas o terapéuticas frente a patógenos gastro-intestinales.
13.- Uso de Ia cepa bacteriana aislada según las reivindicaciones 11 y 12 caracterizado porque el alimento o bebida probióica consiste, entre otros, en una leche fermentada, leche bifidus y otros derivados lácteos.
14.- Uso de Ia cepa bacteriana aislada según las reivindicaciones 1 a Ia 6 como fermento o cultivo iniciador y cultivo bioprotector de alimentos o bebidas frente a bacterias de alteración y de interés sanitario.
15.- Uso de Ia cepa bacteriana aislada según Ia reivindicación 14 caracterizado porque el fermento se utiliza para Ia elaboración de, entre otros, leches fermentadas, leches bifidus y otros derivados lácteos.
16.- Uso del extracto proteico según las reivindicaciones 7 y 8 como conservante biológico de alimentos o bebidas frente a bacterias alterantes de alimentos y de interés sanitario.
17.- Uso del extracto proteico según las reivindicaciones 7 y 8 como compuesto terapéutico frente a patógenos gastrointestinales u otro tipo de bacteria patógena.
18.- Uso del extracto proteico según Ia reivindicación 17 caracterizado porque el patógeno gastrointestinal es una cepa de Ia especie Helicobacter pylorí (multi)-resistente.
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