WO2006068132A1 - 細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラストの培養方法および培養システム - Google Patents

細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラストの培養方法および培養システム Download PDF

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a protoplast culture technique for continuously producing cell wall constituent components. More specifically, the present invention relates to a culture method and a culture system that continuously produce cell wall constituent components while suppressing cell wall regeneration of protoplasts.
  • Protoplast is a protoplasm obtained by removing a cell wall by enzymatic treatment (eg, lysozyme treatment) of a cell wall of bacteria, fungi, mold, algae, plant cells, etc. in an isotonic solution. Is the body.
  • This protoplast consists only of a cell membrane and a cytoplasm component, and maintains the same activity as a cell under an appropriate osmotic pressure condition. Therefore, it has been used as a material for cell fusion and gene transfer.
  • this protoplast has poor mass transfer! When it is embedded and cultured in a gel or the like, it produces cell wall constituents, which accumulate and deposit on the protoplast surface layer. It has the property of returning to the cell after completing the regeneration and starting to grow.
  • cell wall constituents contain useful components applicable to pharmaceuticals and foods (for example, polysaccharides such as ⁇ -D glucan).
  • useful components for example, polysaccharides such as ⁇ -D glucan.
  • a technology for efficiently and mass-producing components is desired from related industries.
  • Patent Document 1 discloses a technique for culturing a protoplast obtained by removing a cell wall of yeast in a culture solution and producing a cell surface substance in the culture solution, in particular, a protoplast by a comprehensive method.
  • the immobilized protoplasts thus obtained are cultured in a culture solution to which a cell wall synthesis inhibitor (antifungal agent / acleasin ⁇ ) is added, and the cell surface material is continuously added to the culture solution.
  • the technology to produce is disclosed.
  • the purpose of this technology is to produce a cell wall material that also has a group of enzyme proteins that exist between the cell wall and the cell membrane, which does not inherently produce cell wall components. Because of this In the invention, a system that does not forcibly produce cell wall constituents using a cell wall synthesis inhibitor is employed.
  • Patent Document 2 discloses a technique for providing a stable protoplast having resistance to inflow of calcium by coating a cell membrane with a hydrophobized polysaccharide.
  • Patent Document 1 JP-A-8-103271.
  • Patent Document 2 JP-A-8-56654.
  • the present invention realizes protoplast culture under mild culture conditions, and enables continuous production of natural cell wall components that are not returned to the cell from the protoplast.
  • the main purpose is to provide technology.
  • the present inventor In order to prevent the cell wall component from accumulating on the surface layer of the protoplast and returning the protoplast to the cell, the present inventor first cultivated the protoplast in a liquid culture and diffused the cell wall component in the culture solution.
  • the “protoplast” in the present invention is defined as a concept including “sphere plast”.
  • the cell wall regeneration of the protoplast can be more reliably prevented. It is possible to efficiently produce cell wall constituents from protoplasts into the culture medium. If the degree of flow of the culture solution is reduced within the above range, the cell wall constituents are recovered in the form of a sheet. It becomes possible to increase the amount of cell components produced by increasing the degree of flow of the culture solution.
  • any protoplast according to the present invention can be used that has been produced by cell force selected from, for example, bacteria, yeasts, molds, mushrooms, algae, and plants. That is, the present invention can be utilized as a production technique for useful cell wall constituents of bacteria, yeasts, molds, mushrooms, algae, and plants.
  • Cell wall constituents in bacteria are peptide dallicans, ticoic acid, chitin, ⁇ -D dulcan, mannan, lipoproteins, lipopolysaccharides (especially gram-negative bacteria), various enzymes, etc.
  • cellulose In the case of plants, cellulose, hemicellulose (xylan, mannan, galactan, glucan, etc.), glycopeptide, pectin (pectin oligosaccharide), cellooligosaccharide, lignin, various enzymes, medicinal ingredients, and the like.
  • the protoplast having a property sensitive to physical impact is protected by encapsulating or fixing the protoplast.
  • it protects the protoplasts from external forces when the culture medium is powered.
  • envelope means that a protoplast is covered with a thin membrane and the protoplast is suspended in a solution in the membrane, and “immobilization” is a gel or the like. This means that the individual protoplasts are fixed individually.
  • the protoplast is cultured in the envelope or fixed membrane material by performing the envelope or immobilized template using a material that permeates the culture solution and does not permeate the cell wall constituents.
  • the method can be achieved by continuously accumulating the cell wall constituents in the liquid. According to this method, cell wall constituent components can be accumulated in the culture solution held in the envelope or in the fixed silkworm material, so that the collection and extraction of useful cell wall constituent components can be performed. It becomes easy.
  • the material used for the envelope or the immobilizing agent that permeates the culture solution and does not permeate the cell wall constituents includes, for example, alginic acid, pectin, chitosan, agar, agarose, gellan gum, gelatin , Collagen, Kappa Laguinan, Polybulal alcohol, Optical rack Examples thereof include a bridge resin, a photosensitive resin, and a composite containing a part of these components.
  • the material used for the envelope or immobilization is a material having a property of permeating the cell wall constituent component, so that it exists outside the envelope or the immobilization material.
  • a method for continuously producing the cell wall constituents in a culture solution is provided.
  • the cell wall constituents can be continuously released into the culture solution existing outside the envelope or the immobilized material while the protoplast is physically protected by the envelope or the immobilized material. it can. Therefore, with this method, it is possible to accumulate cell wall constituents in a narrow culture medium region within the envelope or fixed material, and to produce a larger amount of cell wall constituents continuously than in the method. It becomes.
  • Examples of the material having the property of permeating the cell wall constituents include, for example, high molecular mass transfer ability (used in electrophoresis of polymer substances), agarose gel, alginic acid, Gels such as pectin, chitosan, agar, gellan gum, gelatin, collagen, kappa riki ginnan, polyvinyl alcohol, photocrosslinkable rosin, photosensitive rosin, and complexes containing some of these components
  • high molecular mass transfer ability used in electrophoresis of polymer substances
  • agarose gel alginic acid
  • Gels such as pectin, chitosan, agar, gellan gum, gelatin, collagen, kappa riki ginnan, polyvinyl alcohol, photocrosslinkable rosin, photosensitive rosin, and complexes containing some of these components
  • the present invention is a system for culturing protoplasts in liquid, a culture solution storage unit for storing a culture solution, and the protoplast is not destroyed, and deposition of cell wall components on the surface of the protoplast can be prevented.
  • a protoplast culture system comprising at least means for moving the culture medium with a strength within a range and means for recovering cell wall constituents produced in the culture liquid.
  • the means for moving the culture solution is a range that effectively prevents the cell wall constituents produced from protoplasts from accumulating and depositing on the surface layer of the protoplast and regenerating the cell wall, and does not destroy the protoplasts. Any means can be used as long as the medium can be moved, vibrated, stirred, etc.
  • protoplasts can be liquefied under mild culture conditions with low environmental impact.
  • the protoplast state can be maintained and the culture can be continued. That is, useful cell wall components can be continuously produced in the culture solution during the culturing process while effectively preventing the cell wall components from accumulating on the surface layer of the protoplast and returning the protoplasts to the cells.
  • FIG. 1 shows a state in which a culture solution 1 prepared for liquid culture of a protoplast indicated by the symbol P is accommodated in a culture vessel 2.
  • This culture solution 1 is adjusted to isotonic solution conditions suitable for the protoplast.
  • the culture vessel 2 for example, a vessel having a petri dish shape can be adopted, but the vessel shape is not particularly limited and can be freely selected according to the purpose.
  • the culture solution 1 may be gently moved by shaking the culture vessel 2 at a strength that does not destroy the protoplast P.
  • the culture solution 1 is moved by placing the culture vessel 2 on a shaking table or stirring with a magnetic stirrer.
  • This protoplast P normally produces a cell wall component W, and the cell wall component W accumulates and deposits on the surface layer of the protoplast P, so that the cell wall regenerates and returns to the cell and starts cell proliferation. It has the property.
  • the culture solution 1 by appropriately moving the culture solution 1 around the protoplast P, it is possible to effectively prevent the cell wall constituent component W produced from the protoplast P from accumulating and depositing on the surface layer of the protoplast P. . As a result, cell wall regeneration on the surface of protoplast P can be more reliably prevented.
  • the protoplast P that does not undergo cell wall regeneration continues to produce the cell wall component W, so that the cell wall component W accumulates in the culture solution 1. Therefore, if the culture medium 1 with a high concentration of the cell wall constituent W is collected and the cell wall constituent W is extracted from the culture medium 1, the useful cell wall constituent W can be easily mass-produced. Can do. For example, a polysaccharide such as j8-D glucan can be mass-produced.
  • FIG. 2 is a diagram showing a concept of another embodiment of the present invention.
  • a capsule-like envelope (or a fixed membrane) M is formed in a state where the culture medium la is encapsulated around the protoplast P, and the culture medium lb is present outside the envelope M.
  • RU capsule-like envelope
  • the envelope M is formed of a material having a certain property that permeates the culture medium 1 and does not permeate the cell wall constituent W, it encloses the cell wall constituent W produced from the protoplast P. film
  • the material permeability of the envelope M it is possible to select a substance to be accumulated in the envelope M and a substance to be discharged out of the envelope M.
  • a material for the envelope M for example, sodium alginate can be employed.
  • the cell wall component W produced from protoplast P stays and accumulates in the culture solution la of the envelope M that does not diffuse widely into the culture solution lb. Therefore, the operation of recovering the cell wall constituent component W is facilitated.
  • FIG. 3 is a view for explaining the concept of a modified embodiment in which the protoplast P is enveloped or fixed.
  • This embodiment is characterized in that the envelope M is formed of a material that can permeate the cell wall constituent W produced from protoplast P. Therefore, in this embodiment, the cell wall component W produced from the protoplast P passes through the envelope M from the culture solution la in the envelope M, the gel for fixation, etc., and is outside the envelope M. It is released into the culture medium lb.
  • the present embodiment has an advantage that the cell wall constituent W can be continuously produced from the protoplast P over a longer period of time than the embodiment shown in FIG.
  • This system S includes a culture solution storage part S1 (for example, a culture vessel 2) that contains a culture solution 1 that can be used for liquid culture of protoplast P, and the protoplast P that is strong enough to prevent protoplast P from being destroyed.
  • a means S2 that can power the culture medium 1 within a range that can prevent the deposition of the cell wall constituent W on the surface layer, and a means S3 that recovers the cell wall constituent W produced in the culture medium 1.
  • the cell wall constituent component W is extracted from the collected culture medium 1.
  • the means S2 capable of driving the culture medium 1 is not particularly limited, and a twisting device, a magnetic stirrer device, a stirring device, or a device in which these are enlarged can be appropriately employed. This means is that if the stationary liquid culture is carried out without moving the culture solution 1, the means S2 should not be driven! /.
  • the concentration of the protoplast used for the culture in an appropriate range.
  • concentration of the protoplast used for the culture in an appropriate range.
  • IX 10 6 to 1 X li ⁇ cells ZmL is optimal. If the concentration is outside this range, cell wall components cannot be produced satisfactorily.
  • YPD medium Gibcose 20g Repolipeptone 20g / Yeast extract 10gZ, pH 5.
  • yeast cells were grown at 30 at 200 rpm for 14 hours.
  • Yeast cells obtained by culturing were collected, cell wall lysing enzyme solution (lytic enzyme: Zymolyase 20T (manufactured by Seikagaku Corporation)) was 30 UZmL, accelerator: 2— Mercaptoethanol 100 mM, osmotic pressure regulator: 0. 9M mannitol, buffer solution: HEPES (pH7, 5) was allowed to act, and the mixture was gently shaken for 1.5 hours with mild cheer at the condition of 30 to prepare protoplasts.
  • lytic enzyme Zymolyase 20T (manufactured by Seikagaku Corporation)
  • accelerator 2— Mercaptoethanol 100 mM
  • osmotic pressure regulator 0. 9M mannitol
  • buffer solution HEPES (pH7, 5) was allowed to act, and the mixture was gently shaken for 1.5 hours with mild cheer at the condition of 30 to prepare protoplasts.
  • Protoplasts obtained in this way were prepared in liquid medium (YPMP medium (glucose 20 gZL, corrected; paper (J ⁇ J91) Dipeptone 20 g /: L, yeast extract 10 g /: L, mannini monole 0.85 M, pH 5.7) placed in a shrimp dish and liquid culture was performed at 30 ° C. The same experiment was performed when the culture solution was gently shaken with a mild shaker.
  • YPMP medium glucose 20 gZL, corrected; paper (J ⁇ J91) Dipeptone 20 g /: L, yeast extract 10 g /: L, mannini monole 0.85 M, pH 5.7
  • Eschrichia coli cells were grown under conditions of 37 ° C, 10 Orpm, 10-12 hours using a 500 mL Erlenmeyer flask containing 200 mL of tryptic soy bouillon medium.
  • Eschrichia coli cells obtained by culturing were collected, cell wall lysing enzyme solution (lysing enzyme: Ly sozyme (derived from chicken egg white) lmgZL, outer membrane disrupting agent: EDTA 5 mM, osmotic pressure adjusting agent: mannitol 0.9 M, Buffer: Tris-HCl (pH 8.0)) was allowed to act, and the mixture was gently shaken for 1.5 hours under mild conditions at 30 ° C to produce protoplasts.
  • lysing enzyme Ly sozyme (derived from chicken egg white) lmgZL
  • outer membrane disrupting agent EDTA 5 mM
  • osmotic pressure adjusting agent mannitol 0.9 M
  • Buffer Tris-HCl (pH 8.0)
  • the obtained protoplasts were subjected to liquid culture under conditions of 37 ° C using a petri dish containing a liquid medium (tryptoso-bouillon medium containing 0.9 M mannitol). .
  • the same experiment was performed when the culture solution was gently shaken with a mild shaker.
  • Catharanthus roseus L. cells were grown at 120 rpm for 7 days.
  • Catharanthus roseus L cells obtained by culturing, cell wall lysing enzyme solution (lytic enzyme: pectinase ⁇ 23 (manufactured by Seikagaku Corporation) 1.
  • lytic enzyme pectinase ⁇ 23 (manufactured by Seikagaku Corporation) 1.
  • OgZL Cellulase Onozuka RS ( 10.
  • the obtained protoplasts were used in a petri dish containing a liquid medium (Murashige-Skoog medium component, glucose 30 g / L, 2, 4 DO. 5 mgZL, mannitol 100 g / L, pH 6.2). Liquid culture was performed under the condition of ° C. . The same experiment was performed when the culture solution was slowly shaken with a mild shaker.
  • a liquid medium Merashige-Skoog medium component, glucose 30 g / L, 2, 4 DO. 5 mgZL, mannitol 100 g / L, pH 6.2.
  • CZAPEK Dox medium + 0.5% casamino acid medium was allowed to stand still at 30 ° C. for several days using a 500 mL triangular flask containing lOOmL to proliferate Aspergillus oryzae cells.
  • Aspergillus oryzae cells obtained by culturing were collected, cell wall lytic enzyme solution (lytic enzyme: FUNCELASE (manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) 2%, Yatalase (manufactured by Takara Bio Inc.) 1%, Zymolyase 20T0. 2% Then, osmotic pressure adjusting agent: 0.8M NaCL, buffer solution: 10mM phosphate buffer pH6.0) was allowed to act, and the mixture was gently shaken on a mild shaker for 3 hours at 30 ° C to prepare a protoplast.
  • the obtained protoplasts were subjected to stationary liquid culture at 25 ° C using a petri dish containing a liquid medium (Czapek-Dox medium + 0.5% casamino acid medium + 0.8M NaCl). . . The same experiment was performed when the culture solution was slowly shaken with a mild shaker.
  • the core liquid inside the envelope was used.
  • the method for producing the envelope is as follows. 1) Drip the core solution into the membrane liquid stirred with a stirrer, and continue stirring for 10 minutes to form the envelope. 2) Dilute the whole solution twice with the buffer solution with adjusted osmotic pressure, collect the envelope with a mesh, and wash the envelope with the same buffer. 3) Stir the envelope in 1% (w / v) CaCl solution for 30 minutes to reinforce the envelope. 4) CaCl
  • Solution 1 Protoplasts with various cell forces of any concentration, 2% sodium alginate (G-rich, BDH), MES buffer (pH 5.7), osmotic pressure regulator: 1M mannitol.
  • Solution 2 0.1 M SrCl, MES buffer (pH 5.7), 0.7 M mannitol.
  • YPD medium YPMP medium containing 0.8M mannitol.
  • the volume of solution 2 should be 4-5 times that of solution 1. After removing Solution 2, add the above medium and let stand for 15 minutes. Incubate while changing the medium and adding shaking.
  • YPMP medium Using YPMP medium, prepare a 1.5% agarose S-LM-3 (Cosmo Bio) solution. And autoclaved. After that, it was kept warm in a 45 ° C water bath. Protoplasts with the desired concentration of yeast suspended in YPMP medium were placed in an agarose solution and mixed gently, and then cooled to gel. Next, cut the solidified gel with a scalpel to make a 5mm block. The medium was added to the medium and cultured while shaking.
  • S-LM-3 Cosmo Bio
  • the present invention is based on the fact that cell wall constituents contain useful ingredients applicable to pharmaceuticals and foods (for example, polysaccharides such as ⁇ -D glucan). It can be used as a technology for making them produce.
  • peptide dallicans for example, in bacteria, peptide dallicans, ticoic acid, chitin, ⁇ -D glucan, mannan, lipoprotein, lipopolysaccharide (especially Gram-negative bacteria), various enzymes, etc.
  • yeast In the case of yeast, ⁇ -1, For algae, such as 3-glucan, mannan, and various enzymes, different forces depending on the type, for example, cellulose, xylan, mannan fibrils, alginic acid, fucoidin, laminaran, agar, various enzymes, etc.For plants, cellulose, hemicellulose (Xylan, mannan, galactan, glucan, etc.), glycopeptide, pectin (pectin oligosaccharide), cello-oligosaccharide, lignin, various enzymes, medicinal ingredients, etc.
  • pectin pectin oligosaccharide
  • cello-oligosaccharide lignin
  • various enzymes medicinal ingredients, etc.
  • the present invention may be applicable to the detection of a minute amount of cell wall constituents.
  • Cell wall constituents include various carbohydrates and glycoproteins. Some of these components play important roles as temperature, osmotic pressure, pathogen recognition sensors, and so on.
  • these components can be obtained easily and in large quantities while remaining relatively free. Therefore, for example, a lectin (sugar binding protein) or the like is fixed to an electrode, a specific cell wall constituent component is bound to a lectin or the like, and the binding is electrically charged.
  • a lectin sucgar binding protein
  • a specific cell wall constituent component is bound to a lectin or the like, and the binding is electrically charged.
  • specific fine cell wall components can be detected with high accuracy by detecting changes in air resistance. For example, by acquiring in advance the change in electrical resistance when a specific cell wall constituent component and lectin are bound, there is a possibility that the component can be quantitatively detected.
  • the present invention may be applicable to an assembly process of electronic circuit components.
  • the cell wall component can be attached to an electrode or the like relatively easily, for example, by applying an electric field.
  • cell wall components have the property of specific mutual adsorption between cell walls of the same species. Therefore, there is a possibility that a part can be assembled in a desired form by attaching cell wall components to each part to be joined and adsorbing both cell walls. In this method, by utilizing the specific mutual adsorption between the cell walls, it is possible to precisely assemble complex and fine parts, and the assembly requires complicated equipment and processes. If it can be done without using it, there is an advantage.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the basic concept of a protoplast continuous culture method for continuously producing cell wall constituents according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the structure of a protoplast (P) encapsulated.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the concept of another embodiment of a configuration in which protoplast P is enveloped or fixed.
  • FIG. 4 is a diagram showing a basic configuration of a protoplast continuous culture system (S) that continuously produces cell wall constituents according to the present invention.

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Abstract

【課題】マイルドな培養条件の下でのプロトプラストの連続培養を実現し、細胞壁構成成分の連続生産を可能とする技術を提供すること。 【解決手段】プロトプラストを液体培養して細胞壁成分を培養液中に拡散させることにより、該プロトプラストの状態を維持しながら培養液中へ細胞壁構成成分を連続生産させる。例えば、培養液を適度に動かすなどして、細胞壁再生を抑制しながらプロトプラストＰを液体培養し、該プロトプラストＰから培養液１中へ細胞壁構成成分Ｗを連続産生させるプロトプラスト連続培養方法、並びにプロトプラスト連続培養システムを提供する。

Description

明 細 書
細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラストの培養方法および培 養システム 技術分野
[0001] 本発明は、細胞壁構成成分を連続産生するプロトプラストの培養技術に関する。よ り詳しくは、プロトプラストの細胞壁再生を抑制しながら、細胞壁構成成分を連続的に 産生させる培養方法および培養システムに関する。
背景技術
[0002] プロトプラスト（Protoplast)は、細菌、菌類、カビ、藻類、植物細胞などの細胞壁を 、等張溶液中で酵素処理 (例えば、リゾチーム処理)することによって細胞壁を除去 することで得られる原形質体である。このプロトプラストは、細胞膜と細胞質成分のみ からなり、適当な浸透圧条件下では、細胞と同様の活性を維持するので、これまで、 細胞融合や遺伝子導入の素材として用いられてきた。
[0003] また、このプロトプラストは、物質移動の悪!、ゲルなどに包埋して培養すると、細胞 壁構成成分を産生し、プロトプラスト表層に細胞壁構成成分が蓄積、沈着すること〖こ よって、細胞壁の再生が完了して細胞に戻り、増殖を開始するという性質を有する。
[0004] 現在、前記細胞壁構成成分には医薬品や食品に適用できる有用成分 (例えば、 β —Dグルカンなどの多糖体）が含まれていることが明らかになってきているため、該細 胞壁構成成分を効率的かつ大量に産生させるための技術が関連産業界から望まれ ている。
[0005] ここで、特許文献 1には、酵母の細胞壁を除去して得られるプロトプラストを培養液 中で培養し、該培養液中に細胞表層物質を産生させる技術、特に、プロトプラストを 包括法によって固定ィ匕し、これにより得られた固定ィ匕プロトプラストを、細胞壁合成阻 害剤 (抗真菌剤 ·ァクレアシン Α)を添加した培養液で培養し、前記細胞表層物質を 連続的に培養液中に産出させる技術が開示されている。この技術は、本来的に細胞 壁構成成分を産生させるのではなぐ細胞壁や細胞壁と細胞膜の間に存在する酵素 タンパク群力もなる細胞表層物質を産生させることを目的としている。このため、この 発明では、細胞壁合成阻害剤を用いて、強制的に細胞壁構成成分を産生させない システムが採用されて 、る。
[0006] 特許文献 2には、細胞膜を疎水化された多糖で被覆することによって、カルシウム の流入に対する耐性などを有する安定なプロトプラストを提供する技術が開示されて いる。
特許文献 1 :特開平 8— 103271号公報。
特許文献 2：特開平 8— 56654号公報。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 細胞から細胞壁構成成分を産生する従来の技術は、細胞を過酷な条件 (高温、高 圧、酸、アルカリ、薬剤処理など）の下で抽出処理するため、工程が煩雑で、かつ環 境への負荷も問題となっていた。また、従来の抽出処理では細胞壁成分の変性も著 しかった。
[0008] そこで、本発明は、マイルドな培養条件下でのプロトプラストの培養を実現し、プロト プラストから細胞に戻すことなぐ自然のままの細胞壁構成成分を連続的に産生させ る事を可能とする技術を提供することを主な目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、まず、プロトプラストの表層に細胞壁成分が蓄積してプロトプラストが 細胞に戻るのを防ぐため、プロトプラストを液体培養して細胞壁成分を培養液中に拡 散させることによって、プロトプラストから培養液中へ細胞壁構成成分を連続産生させ るプロトプラスト培養方法を提供する。この方法は、有用な細胞壁構成成分を大量生 産するための方法として好適である。なお、本発明における「プロトプラスト」は、「スフ エロプラスト」を含む概念として定義する。
[0010] この方法において、プロトプラストが破壊されない程度で、かつプロトプラスト表層へ の細胞壁構成成分の沈着を防止できる範囲で培養液を動かすようにすれば、プロト プラストの細胞壁再生をより確実に阻止しながら、プロトプラストから培養液中へ細胞 壁構成成分を効率的に産生させることが可能となる。なお、前記範囲内において、培 養液の流動の度合 ヽを少なくすると、細胞壁構成成分をシート状の形態で回収する ことが可能となり、培養液の流動の度合いを大きくすると細胞構成成分の産生量を増 大させることが可會 になる。
[0011] なお、本発明に係るプロトプラストは、例えば、細菌、酵母、カビ、キノコ、藻類、植 物のいずれかから選択される細胞力 作製されたものを、いずれも採用できる。即ち 、本発明は、細菌、酵母、カビ、キノコ、藻類、植物の有用な細胞壁構成成分の生産 技術として活用できる。
[0012] 「細胞壁構成成分」は、細菌では、ペプチドダリカン、ティコ酸、キチン、 β— Dダル カン、マンナン、リポタンパク質、リポ多糖類 (特にグラム陰性菌）、各種酵素などであ り、酵母では、 j8 - l , 3—グルカン、マンナン、各種酵素など、藻類では、種類によつ て異なるが、例えば、セルロース、キシラン、マンナンフィブリル、アルギン酸、フコィ ジン、ラミナラン、寒天質、各種酵素などであり、植物の場合は、セルロース、へミセル ロース（キシラン、マンナン、ガラクタン、グルカンなど）、グリコペプチド、ぺクチン（ぺ クチンオリゴ糖)、セロオリゴ糖、リグニン、各種酵素、薬用成分などである。
[0013] 次に、本発明では、プロトプラストを包膜又は固定ィ匕することによって、物理的衝撃 に弱い性質を有するプロトプラストを保護する。特に、培養液を動力したときの外力か らプロトプラストを保護する。本発明において、「包膜」とは、薄い膜でプロトプラストが 被われ、該膜中の溶液内にプロトプラストが懸濁した状態となっていることを意味し、「 固定化」は、ゲルなどで個々のプロトプラストが個別に固定された状態となっているこ とを意味する。
[0014] さらに、プロトプラストを包膜又は固定ィ匕を、培養液を透過し、かつ前記細胞壁構成 成分を透過しない性質の材料を用いて行うことによって、該包膜又は固定ィ匕素材内 の培養液中へ、前記細胞壁構成成分を連続的に蓄積させると ヽぅ方法を達成できる 。この方法によれば、包膜内あるいは固定ィ匕素材中に保持されている培養液内へ細 胞壁構成成分を蓄積させていくことができるため、有用な細胞壁構成成分の回収、 抽出作業が容易になる。
[0015] 培養液を透過し、かつ前記細胞壁構成成分を透過しな!ヽ性質の包膜あるいは固定 ィ匕に用いる素材としては、例えば、アルギン酸、ぺクチン、キトサン、寒天、ァガロース 、ゲランガム、ゼラチン、コラーゲン、 κ一力ラギーナン、ポリビュルアルコール、光架 橋性榭脂、感光性榭脂ゃこれらの成分の一部を含む複合体などを挙げることができ る。
[0016] また、本発明では、前記包膜又は固定化に用いる材料として、前記細胞壁構成成 分を透過する性質の材料を採用することにより、該包膜あるいは固定ィ匕素材の外側 に存在する培養液中へ前記細胞壁構成成分を連続的に産生させる方法を提供する
[0017] この方法によれば、包膜あるいは固定ィ匕素材によってプロトプラストを物理的に保 護しながら、包膜あるいは固定化素材外に存在する培養液中へ細胞壁構成成分を 放出させ続けることができる。従って、この方法では、包膜あるいは固定ィ匕素材内部 の狭小な培養液領域へ細胞壁構成成分を蓄積させて!/、く方法に比べて、より大量の 細胞壁構成成分を連続産生させることが可能となる。
[0018] 細胞壁構成成分を透過する性質の材料としては、例えば、高分子物質の電気泳動 に用いられて 、る、物質移動能が高 、（ゲルの編み目が大き、、）ァガロースゲルや、 アルギン酸、ぺクチン、キトサン、寒天、ゲランガム、ゼラチン、コラーゲン、 κ一力ラギ 一ナン、ポリビニルアルコール、光架橋性榭脂、感光性榭脂などのゲルやこれらの成 分の一部を含む複合体を、任意の方法で処理、加工することによって、編み目を大き くした材料を挙げることができる。
[0019] 次に、本発明は、プロトプラストを液体培養するシステムであり、培養液を収容する 培養液収容部と、プロトプラストが破壊されず、かつ該プロトプラスト表層への細胞壁 構成成分の沈着を防止できる範囲の強さで前記培養液を動かす手段と、該培養液 中に産生された細胞壁構成成分を回収する手段と、を少なくとも備えるプロトプラスト 培養システムを提供する。
[0020] 培養液を動かす手段は、プロトプラストから産生される細胞壁構成成分がプロトプラ ストの表層に蓄積及び沈着して細胞壁が再生されてしまうことを有効に阻止し、かつ プロトプラストを破壊しない程度の範囲で、培養液を流動、振動、攪拌等して動かす ことができる手段であれば、特に限定されな!、。
発明の効果
[0021] 本発明によれば、環境負荷の少な!/、マイルドな培養条件下で、プロトプラストを液 体培養して細胞壁成分を培養液中に拡散させることで、プロトプラストの状態を維持 して培養し続けることができる。即ち、プロトプラストの表層に細胞壁成分が蓄積して プロトプラストが細胞に戻るのを有効に防ぎながら、培養過程で、有用な細胞壁構成 成分を培養液中に連続的に産生させることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、図 1から図 3に基づいて、本発明に係る方法の好適な実施形態により、本発 明の基本的な概念を説明する。
[0023] 図 1には、符号 Pで示されたプロトプラストを液体培養するために調製された培養液 1が、培養容器 2に収容されている状態が示されている。この培養液 1は、当該プロト プラストに適する等張液条件に調整されている。なお、培養容器 2は、例えば、シヤー レゃシャーレ状を呈する容器を採用できるが、容器形状は、特に限定されず、目的に 応じて自由に選択できる。
[0024] プロトプラスト Pを前記培養容器 2内で静置液体培養した場合は、培養容器 2の底 部に、細胞壁構成成分 Wが集積するので、該細胞壁構成成分 Wをシート状の形態 で回収することが可能となる。
[0025] また、プロトプラスト Pが破壊されな 、程度の強さで、培養容器 2を振とうすることで、 培養液 1を緩やかに動かすようにしてもよい。例えば、培養容器 2を振とう台の上に設 置したり、マグネットスターラーで攪拌したりすることで、培養液 1を動かすようにする。
[0026] このプロトプラスト Pは、通常、細胞壁構成成分 Wを生産し、プロトプラスト Pの表層 に該細胞壁構成成分 Wが蓄積及び沈着することで、細胞壁が再生して細胞に戻り、 細胞増殖を開始するという性質を有する。しかし、本発明では、プロトプラスト P周辺 の培養液 1を適度に動かすことによって、該プロトプラスト Pから産生される細胞壁構 成成分 Wがプロトプラスト Pの表層に蓄積及び沈着してしまうことを有効に防止できる 。この結果、プロトプラスト Pの表面での細胞壁の再生をより確実に阻止できる。
[0027] この結果、培養液 1中では、細胞壁再生が起こることなぐプロトプラスト Pが細胞壁 構成成分 Wを産生し続けるため、該培養液 1中へ細胞壁構成成分 Wが蓄積する。従 つて、この細胞壁構成成分 W濃度の高い培養液 1を回収し、この培養液 1中から細胞 壁構成成分 Wを抽出すれば、有用な細胞壁構成成分 Wを容易に大量生産すること ができる。例えば、 j8—Dグルカンなどの多糖体を大量生産することができる。
[0028] 図 2は、本発明の他の実施形態の概念を示す図である。この形態では、プロトプラ スト Pの周囲に培養液 laを内包した状態でカプセル状の包膜 (又は固定ィ匕膜) Mが 形成され、さらに該包膜 Mの外側に培養液 lbが存在して 、る。
[0029] 包膜 Mは、培養液 1を透過し、かつ前記細胞壁構成成分 Wを透過しな ヽ性質の材 料で形成されているため、プロトプラスト Pから産生される細胞壁構成成分 Wを、包膜
Mの内部に蓄積させる機能を発揮する。
[0030] なお、包膜 Mの物質透過性を適宜設計することによって、包膜 M内に蓄積させた い物質と包膜 M外へ排出させたい物質を選別することができる。なお、包膜 Mの材 料としては、例えば、アルギン酸ナトリウムを採用することができる。
[0031] この実施形態では、プロトプラスト Pそれ自体は、その周囲に形成された包膜 Mによ つて外力から保護されているため、培養液 l (la, lb)を動かす工程を採用した場合 であっても、プロトプラスト Pが破壊させることなぐ包膜 M内に細胞壁構成成分 Wを 産生させ続けることができる。
[0032] また、この実施形態では、プロトプラスト Pから産生された細胞壁構成成分 Wは、培 養液 lbへ広く拡散することなぐ包膜 Mの培養液 la内に滞留し、蓄積する。従って、 細胞壁構成成分 Wを回収する作業が容易となる。
[0033] 次に、図 3は、プロトプラスト Pを包膜又は固定ィ匕する構成の変形実施形態の概念 を説明するための図である。
[0034] この実施形態では、包膜 Mが、プロトプラスト Pから産生された細胞壁構成成分 Wを 透過可能な材料で形成されていることが特徴である。従って、この実施形態では、プ ロトプラスト Pから産生された細胞壁構成成分 Wは、包膜 M内の培養液 laや固定ィ匕 用のゲルなどから、包膜 Mを通り抜けて、包膜 M外の培養液 lbへ放出されていく。
[0035] 包膜 M外の培養液 lbの体積は、包膜 M内の培養液 laの体積よりも大きいので、細 胞壁構成成分 Wの収容能力が大きい。このため、本実施形態では、図 2に示す実施 形態と比較して、より長時間にわたり、プロトプラスト Pから細胞壁構成成分 Wを連続 的に産生させることができるという利点がある。
[0036] 以上の方法は、図 4に示すような基本構成のプロトプラスト培養システム Sによって 実施できる。
[0037] このシステム Sは、プロトプラスト Pを液体培養可能な培養液 1を収容する培養液収 容部 S1 (例えば、培養容器 2)と、プロトプラスト Pが破壊されることなぐ力っ該プロト プラスト Pの表層への細胞壁構成成分 Wの沈着を防止できる範囲で前記培養液 1を 動力ゝすことができる手段 S2と、培養液 1中に産生された細胞壁構成成分 Wを回収す る手段 S3と、を少なくとも備えており、回収された培養液 1から細胞壁構成成分 Wを 抽出する。
[0038] 培養液 1を動力すことができる手段 S2は、捩とう装置、マグネットスターラー装置、 視拌装置、あるいはこれらを大型化した装置などを適宜採用でき、特に限定されない 。この手段は、培養液 1を動かさずに、静置液体培養を実施する場合では、該手段 S 2を駆動させなレ、ようにすればよ!/、。
[0039] なお、本発明においては、培養に用いるプロトプラストの濃度を適切な範囲に設定 することが重要である。一例を挙げると、酵母プロトプラストの場合では、 I X 106〜1 X li^cellsZmLが最適である。この範囲以外の濃度であると良好に細胞壁成分が 生産できない。
[0040] また、プロトプラストの濃度に加え、培養温度、栄養源、浸透圧おょぴ振とう速度の 制御、酸素の供給や疎外物質の除去などを適切に行うことが重要である。
実施例 1
[0041] く酵母（Saccharomyces cerevisiae)を用いた培養試験 >。
[0042] YPD培地（グノレコース 20g レポリペプトン 20g/ 、酵母エキス 10gZし、 pH5.
7)を 200ml入れた 500ml三角フラスコを用いて、 30で、 200rpm、 14時間の条件で 酵母細胞を増殖させた。
[0043] 培養して得られた酵母細胞を集め、細胞壁溶解酵素液 (溶菌酵素: Zymolyase 2 0T (生化学工業社製））を 30UZmL、促進剤： 2— Mercaptoethanolを 100mM、 浸透圧調整剤： 0. 9Mマンニトール、緩衝液： HEPES (pH7, 5)を作用させ、30で 条件で、マイルドシェ一力一により 1. 5時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製し た。
[0044] これにより得られたプロトプラストを液体培地 (YPMP培地（グルコース 20gZL、ポ 訂正された; 紙 ( J【J91) ジペプトン 20g/:L、酵母エキス 10g/:L、マンニ卜一ノレ 0. 85M、 pH5. 7)力 S人ったシ ヤーレに入れ、 30°C条件で液体培養を行った。また、マイルドシェーカーにより培養 液をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。
[0045] この結果、培養に伴 、、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌さ れ、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェ一 カーによりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構 成成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
実施例 2
[0046] <細菌（Escherichia coli IFO 330)を用いた液体培養試験 >。
[0047] トリプトソィブイヨン培地を 200mL入れた 500mL三角フラスコを用いて、 37°C、 10 Orpm、 10— 12時間の条件で、 Eschrichia coli細胞を増殖させた。
[0048] 培養して得られた Eschrichia coli細胞を集め、細胞壁溶解酵素液 (溶菌酵素： Ly sozyme (鶏卵白由来） lmgZL、外膜破壊剤： EDTA5mM、浸透圧調整剤：マンニ トール 0. 9M、緩衝液: Tris- HCl (pH8. 0) )を作用させ、 30°C条件で、マイルドシェ 一力一によつて 1. 5時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製した。
[0049] 得られたプロトプラストを液体培地（0. 9Mマン-トールを含むトリプトソィブイヨン培 地）が入ったシャーレを用いて、 37°C条件で、液体培養を行った。。また、マイルドシ エーカーにより培養液をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。
[0050] その結果、培養に伴!ヽ、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌し 、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェ一力 一によりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成 成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
実施例 3
[0051] く植物（Catharanthus roseus L. )を用いた液体培養試験〉。
[0052] Murashige— Skoog培地を lOOmL入れた 500mL三角フラスコを用いて、 25°C、
120rpm、 7日間の条件で、 Catharanthus roseus L.細胞を増殖させた。
[0053] 培養して得られた Catharanthus roseus L.細胞^^め、細胞壁溶解酵素液（ 溶菌酵素：ぺクトリアーゼ Υ23 (生化学工業社製） 1. OgZL、セルラーゼオノズカ RS ( ヤクルト薬品工業社製） 10. OgZL、細胞膜保護剤： Potassium Dextran Sulfat e5. Og/ 緩衝液: MESO. 2g/L (pH5. 5))を作用させ、 25°C条件下、マイルド シェーカーで 1時間ゆっくりと振とうし、プロトプラストを作製した。
[0054] 得られたプロトプラストを液体培地（Murashige - Skoog培地成分、グルコース 30 g/L、 2, 4 DO. 5mgZL、マン-トール 100g/L、 pH6. 2)が入ったシャーレを 用いて、 25°C条件下で液体培養を行った。。また、マイルドシェーカーにより培養液 をゆっくりと振とうした場合についても、同様の実験を行った。
[0055] その結果、培養に伴!ヽ、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌し 、細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェ一力 一によりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成 成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
実施例 4
[0056] くカビ（Aspergillus oryzae IF05239)を用いた液体培養試験〉。
[0057] CZAPEK— Dox培地 + 0. 5%カザミノ酸培地を、 lOOmL入れた 500mL三角フラ スコを用いて、 30°C条件下で数日間静置培養し、 Aspergillus oryzae細胞を増殖 させた。
[0058] 培養して得られた Aspergillus oryzae細胞を集め、細胞壁溶解酵素液 (溶菌酵素 ： FUNCELASE (ヤクルト薬品工業社製） 2%、 Yatalase (タカラバイオ社製） 1%、 Z ymolyase 20T0. 2%、浸透圧調整剤： 0. 8M NaCL、緩衝液： 10mMリン酸緩 衝液 pH6. 0)を作用させ、 30°C条件下、マイルドシェーカーで 3時間ゆっくりと振とう し、プロトプラストを作製した。
[0059] 得られたプロトプラストを液体培地（Czapek— Dox培地 + 0. 5%カザミノ酸培地 + 0. 8M NaCl)が入ったシャーレを用いて、 25°C条件下で静置液体培養を行った。 。また、マイルドシェーカーにより培養液をゆっくりと振とうした場合についても、同様 の実験を行った。
[0060] この結果、培養に伴!ヽ、培養液中に細胞壁構成成分が大量かつ継続的に分泌し、 細胞壁構成成分がシート状に蓄積されることが確認できた。また、マイルドシェ一力 一によりゆっくりと振とうしながらプロトプラストを培養した場合、粉体状の細胞壁構成 成分が培養液中に大量かつ継続的に分泌産生された。
実施例 5
[0061] <プロトプラストの包膜方法 >。
[0062] 各種の細胞から得られた任意の濃度のプロトプラストを 2% (w/w) CaC12、 40% ( w/w) PEG6000 (av. MW= 7500、和光純薬株式会社製）に懸濁し、包膜内部 の芯液とした。包膜の部分 (膜液）は、 1. 92% (wZv)アルギン酸ナトリウム（300— 4 00cP、和光純薬株式会社製）、 0. l% (vZv)Tween80を用いた。
[0063] 包膜の作製方法は下記の通りである。 1)スターラーで攪拌している膜液へ芯液を 滴下し、そのまま 10分間攪拌を続けて包膜を形成させる。 2)浸透圧を調整した緩衝 液で液全体を 2倍希釈し、メッシュで包膜を回収して同じ緩衝液で包膜を洗浄する。 3)包膜を 1% (w/v) CaCl液中で、 30分間攪拌し、該包膜を強化する。 4) CaCl
2 2 液を除去し、包膜を培地で洗浄する。 5) 0. 25% (w/v) CaClを含む培地に包膜
2
を移し、培養を開始する。
[0064] 培養の結果、培養に伴って包膜内（内部は液状）に多量の細胞壁構成成分が継続 的に生産され、蓄積することを確認した。
実施例 6
[0065] <ゲルビーズとゲルブロックの固定化法 >。
[0066] アルギン酸ストロンチウムゲルビーズへの固定化法。まず、次の溶液 1、 2と培地を 用意する。溶液 1 :任意の濃度の各種の細胞力も作製したプロトプラスト、 2%アルギ ン酸ナトリウム（G- rich、 BDH社）、 MES緩衝液 (pH5. 7)、浸透圧調整剤： 1Mマン 二トール。溶液 2 : 0. 1M SrCl、 MES緩衝液（pH5. 7)、 0. 7Mマン-トール。培地
2
： 0. 85Mマン-トールを含む YPD培地（YPMP培地）。
[0067] 次に、前記溶液 1を前記溶液 2に滴下し、 60分静置してゲルビーズを形成させた。
溶液 2の容量は、溶液 1の 4— 5倍とする。そして溶液 2を除去した後、上記培地を加 えて 15分間静置する。培地を入れ替えて、振とうを加えながら、培養を行う。
実施例 7
[0068] <ァガロースゲルブロックへの固定化法（酵母の場合） >。
[0069] YPMP培地を用いて 1. 5%ァガロース S—LM— 3 (コスモ'バイオ社製）溶液を調 製し、オートクレーブ滅菌する。その後、 45°Cのウォーターバスで保温した。 YPMP 培地に懸濁した任意の濃度の酵母力も作製したプロトプラストをァガロース溶液にカロ えて穏やかに混合した後、冷却してゲル化させた。次に、固まったゲルをメスで切断 し、 5mm程度のブロックを作製する。培地に添加し、振とうをカ卩えながら、培養を行つ た。
[0070] この結果、振とう培養を行ってもプロトプラストは破壊される事なぐ培養に伴って多 量の細胞壁構成成分が培養液中に効率的に分泌産生された。また、一部の細胞壁 成分はゲルブロック内にも蓄積した。
産業上の利用可能性
[0071] 本発明は、細胞壁構成成分には医薬品や食品に適用できる有用成分 (例えば、 β —Dグルカンなどの多糖体）が含まれていることを踏まえ、該細胞壁構成成分を効率 的かつ大量に生産させるための技術として利用できる。
[0072] 例えば、細菌では、ペプチドダリカン、ティコ酸、キチン、 β— Dグルカン、マンナン 、リポタンパク質、リポ多糖類 (特にグラム陰性菌）、各種酵素など、酵母の場合は、 β -1,3-グルカン、マンナン、各種酵素など、藻類では、種類によって異なる力 例えば 、セルロース、キシラン、マンナンフィブリル、アルギン酸、フコィジン、ラミナラン、寒 天質、各種酵素など、植物の場合は、セルロース、へミセルロース（キシラン、マンナ ン、ガラクタン、グルカンなど）、グリコペプチド、ぺクチン（ぺクチンオリゴ糖）、セロオリ ゴ糖、リグニン、各種酵素、薬用成分などの大量生産技術として利用できる。
[0073] 近年注目されて!/、るカビ（例えば、コウジカビ、ァォカビ、ケカビ、クモノスカビ、ツチ ァォカビなど)ゃキノコ（例えば、ヒメマツタケ、霊芝、ハナビラタケ、マイタケ、シィタケ など)の有用な細胞壁構成成分の大量生産技術としても利用できる。
[0074] 力!]えて、本発明は、微量な細胞壁構成成分の検出などに応用できる可能性がある 。細胞壁構成成分には、種々の糖質や糖タンパク質などが含まれている。それらの 成分の中には、温度、浸透圧、病原菌の認識センサー等として、重要な役割を果た しているものもある。一方、本発明により、それらの成分を、比較的遊離した状態のま ま、簡易かつ大量に取得できる。そこで、例えば、レクチン (糖結合性タンパク質)等 を電極に固定し、特定の細胞壁構成成分とレクチン等とを結合させ、その結合を電 気抵抗の変化などにより検出することにより、特定の微細な細胞壁構成成分を高精 度に検出できる可能性がある。なお、例えば、特定の細胞壁構成成分とレクチンとが 結合した場合の電気抵抗の変化を予め取得しておくことにより、その成分の定量的な 検出ができる可能性がある。
[0075] その他、本発明は、電子回路用部品等の組立プロセス等にも応用できる可能性が ある。細胞壁成分は、例えば、電場を付加することにより、比較的容易に、電極など に付着させることができる。一方、細胞壁成分は、同種生物の細胞壁間などで特異 的に相互吸着する性質を有する。そこで、接合したい部品のそれぞれに細胞壁成分 を付着させ、両細胞壁を吸着させることにより、目的の態様に部品を組み立てること ができる可能性がある。なお、この方法には、細胞壁間の特異的な相互吸着性を利 用することにより、複雑で微細な部品の組立てを精密に行うことができ、かつ、その組 立てを複雑な装置 ·工程を用いずに行うことができると 、う利点がある。
図面の簡単な説明
[0076] [図 1]本発明に係る細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラスト連続培養方法 の基本概念を説明するための図である。
[図 2]包膜されたプロトプラスト (P)の構成を模式的に示す図である。
[図 3]プロトプラスト Pを包膜又は固定ィ匕する構成の他の実施形態の概念を説明する ための図である。
[図 4]本発明に係る細胞壁構成成分を連続的に産生するプロトプラスト連続培養シス テム（S)の基本構成を示す図である。
符号の説明
[0077] 1 培養液
2 培養容器
P プロトプラスト
M 包膜又は固定化材料
W 細胞壁構成成分

Claims

請求の範囲
[1] プロトプラストの液体培養の際、プロトプラストが破壊されず、かつ該プロトプラスト表 層への細胞壁構成成分の沈着を防止できる範囲で培養液を動かすことにより、該プ ロトプラストの状態を維持しながら培養液中へ細胞壁構成成分を連続産生させるプロ トプラストの培養方法。
[2] 前記プロトプラストを包膜又は固定ィ匕することを特徴とする請求の範囲第 1項記載 のプロトプラスト培養方法。
[3] 前記包膜又は固定化に用いる材料は、培養液を透過し、かつ前記細胞壁構成成 分を透過しない性質の材料であって、該包膜あるいは固定ィ匕素材内に存在する培 養液中へ前記細胞壁構成成分を連続的に産生させることを特徴とする請求の範囲 第 2項記載のプロトプラスト培養方法。
[4] 前記包膜又は固定化に用いる材料は、前記細胞壁構成成分を透過する性質の材 料であって、該包膜ある!/ヽは固定化素材外に存在する培養液中へ前記細胞壁構成 成分を連続的に産生させることを特徴とする請求の範囲第 2項記載のプロトプラスト 培養方法。
[5] 前記プロトプラストは、細菌、酵母、カビ、キノコ、藻類、植物のいずれかから選択さ れる細胞から生成されたものであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のプロト プラスト培養方法。
[6] プロトプラストを液体培養可能な培養液を収容する培養液収容部と、プロトプラスト が破壊されず、かつ該プロトプラスト表層への細胞壁構成成分の沈着を防止できる 範囲の強さで前記培養液を動かすことができる手段と、該培養液中に産生された細 胞壁構成成分を回収する手段と、を少なくとも備えるプロトプラスト培養システム。
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