WO2006064737A1

WO2006064737A1 - 遺伝子のメチル化検出方法及びメチル化検出による新生物の検査方法

Info

Publication number: WO2006064737A1
Application number: PCT/JP2005/022671
Authority: WO
Inventors: Takeshi Nagasaka; Nagahide Matsubara; Noriaki Tanaka
Original assignee: National University Corporation Okayama University
Priority date: 2004-12-13
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2006-06-22
Also published as: US20080118926A1; CA2592993C; CA2592993A1; EP1829978B1; EP1829978A4; EP1829978A1

Abstract

　生物学的試料中に含有される遺伝子のメチル化を簡便かつ経済的に検出する方法を提供することを課題とする。さらには、遺伝子のメチル化の検出方法を用いて新生物を検査する場合に、正確かつ感度の良い検査方法を提供することを課題とする。　遺伝子のメチル化を検出する場合に、重亜硫酸塩処理前に、生物学的試料に多糖類を添加すれば、タンパク質変性剤を添加せず、さらにDNAを精製しなくても、その後に重亜硫酸塩処理することができ、ウラシルに修飾されなかったメチル化シトシンを検出することが可能となる。さらに、生物学的試料に含有される複数種の遺伝子のメチル化を検出し、その総和を計算することで、より正確に新生物の検査を行うことができる。

Description

明細書

遺伝子のメチル化検出方法及びメチル化検出による新生物の検査方法技術分野

[oooi] 本発明は、生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチルイ匕を検出して、遺伝子を解析する方法において、生物学的試料に多糖類を添加し、タンパク質変性剤を添加しないことを特徴とする生物学的試料の前処理方法に関する。また、本発明は力かる前処理を施した生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z 又は遺伝子座のメチルイ匕の検出方法に関する。さら〖こは、該メチル化の検出方法を用いて特定の遺伝子のメチルイ匕を検出することによる新生物の検査方法に関する。

[0002] 本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願 2004— 3594 71号及び特願 2004— 360339号優先権を請求する。

背景技術

[0003] 生物学的試料中に存在する遺伝子を解析することにより、感染症の診断や遺伝子診断が可能となってきた。例えば、ほ乳類の血液や糞便中のウィルス、腸内細菌叢や病原性細菌、又は消化管粘膜細胞、悪性新生物細胞、新生物細胞、及び分泌液に存在する遺伝子断片を用いて、各種類の疾患の原因探求や診断を行うことは、個体の健康状態の把握や悪性新生物の早期発見のために非常に有用である。

[0004] 近年、新生物及び悪性新生物の特徴として、遺伝子の異常なメチル化の獲得と、う現象が多々認められることが報告されて！、る。

真核細胞では、グアノシンの 5'側に直に存在しているシトシン残基のメチルイ匕は、 C Gに乏しい領域で優先的に起こる (Bird,A.， Nature (1986) 321: 209 )。これに対して、 CpG領域と呼ばれる不連続な CGジヌクレオチド力もなる領域が遺伝子のプロモータ一領域に存在するが、常染色体では殆ど全ての遺伝子関連の CpG領域カチルイ匕力も保護されている。 CpG領域の広範にわたるメチルイ匕は、刷込み遺伝子の転写の不活性ィ匕及び雌の不活性 X染色体上の遺伝子の転写の不活性化と関連している。また、近年の研究により、ヒトの腫瘍における異常なメチルイ匕は様々な遺伝子のプロモーター領域に起きて、ることが報告されて、る（非特許文献 1〜3)。 [0005] CpG領域でのメチルイ匕シトシンの従来の検出は、メチル化感受性制限酵素又はメチルイ匕反応性ィ匕学物質を用いて行われていた。しかし、この方法ではメチルイ匕の可能性がある部位の限られた部分しか分析できな、ため、広く一般に適用できな、と、う欠点がある。また、当該制限酵素により認識可能な配列中の CpG領域についてしか解析できないという欠点もある。メチル化感受性制限酵素と核酸増幅反応とを組合せた方法でも、制限酵素切断が不完全なこととメチルイ匕対立遺伝子の数が少ないこととの区別が困難であるため、例えば少量の試料中における癌抑制遺伝子の高メチル化を検出する場合など、メチルイ匕対立遺伝子が集団のほんの一部でしかない場合には信頼'性がない。

[0006] 上記メチル化感受性制限酵素又はメチルイ匕反応性ィ匕学物質を用いずに、遺伝子のメチル化を感度よく検出する方法に、遺伝子を重亜硫酸塩 (bisulfite)処理する方法がある。遺伝子を重亜硫酸塩処理することによって、全てのメチルイ匕されていない非メチルイ匕シトシンをゥラシルに修飾し、この修飾核酸を用いて遺伝子のメチルイ匕を検出することができる。このような方法として、例えば、メチルイ匕特異 PCR(MSP)法 (特許文献 1)や COBRA(combined bisulfite restriction assay)法（非特許文献 4)、 Methyli ght法 (特許文献 2)等が挙げられる。しかしながら、これらの方法では重亜硫酸塩処理の前に DNAの抽出 ·精製をしなくてはならず、し力も比較的多くの DNAを必要とする。また、遺伝子を重亜硫酸塩処理した後、 PCR等により DNAを増幅して解析するために、再度 DNAの精製を行う必要がある。

[0007] DNAの抽出'精製方法は、フノール、クロ口ホルム等の有機溶媒が用いられる方法が一般的であり、市販のキットも数多く販売されている。また、有機溶媒を用いないものとして、 MagExtractor (東洋紡製）や QIAamp Stool DNA Isolation Kit (QIAGEN 製)が販売されている。前者はビーズで膜を破砕した後、ビーズに吸着した DNAを磁気ビーズで回収するものであり、後者は加熱により膜タンパクを変性させ、 DNAを単離するものである。

[0008] 有機溶媒を用いずに DNAを抽出'精製できる試薬キットとして、タンパク質分解酵素と、タンパク質変性剤、界面活性剤、キレート剤、及びタンパク質変性剤のうち少なくとも 1種を含む水溶液と、塩及び共沈剤と、タンパク質変性溶解剤を組合せたキット（特許文献 3)、タンパク質変性剤と、共沈剤と、タンパク質変性剤を含むキット (特許文献 4)が開示されている。これらのキットはタンパク質分解酵素やタンパク質変性剤を必須のものとし、 PCR等に使用可能な精製度の核酸を得ることを目的としている。

[0009] 上述の通り、 DNAメチル化検出のように、 DNA増幅反応等の解析の前に人為的に核酸を修飾する工程が必要な場合は、複数回の精製が行われるため、操作が煩雑で時間を要するという問題点があった。従来、核酸修飾前の抽出'精製にも、核酸増幅反応前と同様の高純度 DNAを得るための精製方法を用いて、た。

[0010] 糞便を用いた消化器の悪性新生物 (具体的には大腸癌)の検出方法に、便潜血反応（Fecal Occult-Blood Testing; FOBT)を調べる方法がある。欧米の無作為化比較試験 3研究により、便潜血検査を行ったところ、早期癌を発見することができ、その結果として死亡率減少効果 (検診群で 15〜35%低下）が示された。また、検診群では早期癌を発見することができたことによる罹患率、及び浸潤癌の減少も認められた (N E ngl J Med. (1993) 328:1365—71, Lancet (1996) 348:1472-7, Lancet (1996) 348:1467 -71 )。しかし、本検査方法は感度が低ぐ便潜血反応陽性患者における大腸癌の発見率は 2〜17%に留まる。また、先の欧米の無作為化比較試験 3研究において、大腸癌患者のうち、便潜血反応の検診にて大腸癌を発見された患者は 27%であり、満足の、くものとは言えな、。

[0011] 消ィ匕器での新生物及び悪性新生物についても、近年の分子生物学の発展により遺伝子変異の特徴が明らかにされてきている。大腸癌における遺伝子の変異は、例えば KRAS遺伝子の点突然変異、 APC (adenomatous polyposis coli)遺伝子の点突然変異、 P53遺伝子の点突然変異、 BRAF遺伝子の点突然変異が報告されている。しかし、これらの遺伝子の変異をすベて調べたとしても大腸癌すベてを検出できるわけではなぐまた検出方法及び技術はいまだ困難かつ高額な場合が多い。遺伝子の変異を、糞便力も検出することができれば、新生物及び悪性新生物の検出が可能となることが推測されている（Nat Rev Cancer.(2002) Mar;2(3):210- 9 )。また、ヒト糞便を加熱して膜タンパクを変性させ、その後 DNAを単離するキットを利用して DNAを抽出 ·精製し、次に DNAの重亜硫酸塩処理を行い、新生物に特徴的なメチルイ匕異常を検出し、大腸癌を診断する試みについて報告がある（非特許文献 5)。この方法では、 DNAの抽出'精製にキットを使用している力経済的でない。

非特許文献 1 : Jones, P.A. et al, Nat. Genet.,(1999) ;21: 163-167

非特許文献 2 : Issa et al., Ann. N. Y. Acad. Sci" (2000) ;910: 140-153

非特許文献 3 : Herman et al., N. Engl. J. Med.,(2003) ;349: 2042-2054

非特許文献 4 : Xiong et al., Nucleioc Acids Res (1997) ;25: 2532-2534

非特許文献 5 : Muller et al., The Lancet, (2004) ;363: 1283-1285,

特許文献 1：特表 2000-511776号公表公報

特許文献 2：特表 2002-543852号公表公報

特許文献 3：特開平 7-236499号公開公報

特許文献 4 :特開 2001-17173号公開公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0012] 本発明は、生物学的試料中に含有される遺伝子のメチルイ匕を簡便かつ経済的に検出する方法を提供することを課題とする。さら〖こは、遺伝子のメチル化の検出方法を用いて新生物を検査する場合に、正確かつ感度の良い検査方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0013] 上記課題を解決するために本発明者は鋭意研究を重ねた結果、遺伝子のメチル化を検出する場合に、メチル化されて、な、非メチルイ匕シトシンをゥラシルに修飾し、メチルイ匕シトシンと非メチルイ匕シトシンを区別する方法として重亜硫酸塩処理する方法が挙げられるが、試料に多糖類を添加すれば、タンパク質変性剤を添加せず、さらに DNAを精製しなくても、その後に重亜硫酸塩処理することができ、ゥラシルに修飾されなかったメチルイ匕シトシンを検出することが可能となることを見出し、本発明を完成した。さらに、生物学的試料に含有される複数種の遺伝子のメチルイ匕を検出し、その総和を計算することで、より正確に新生物を検査することができることを見出し、本発明を完成した。

[0014] すなわち本発明は、以下からなる。

1.生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチル化を検出する方法において、前記生物学的試料に多糖類を添加し、タンパク質変性剤を添加しな Vヽことを特徴とする生物学的試料の前処理方法。

2.多糖類が、グリコーゲンである前項 1に記載の生物学的試料の前処理方法。

3.重亜硫酸塩を、前項 1又は 2に記載の前処理方法により前処理した生物学的試料と接触させ、該生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座の非メチルイ匕シトシンをゥラシルに転換させ、ゥラシルに転換されてヽな、シトシンを検出することによる遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチル化の検出方法。

4.生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座のうち SFRP2遺伝子、 DCC遺伝子及び MGMT遺伝子のメチル化を検出し、メチル化遺伝子の総和を算出することによる新生物の検査方法。

5.さらに APC遺伝子及び Z又は hMLHl遺伝子のメチルイ匕を検出し、メチル化遺伝子の総和を産出することによる前項 4に記載の新生物の検査方法。

6.メチルイヒの検出力前項 3に記載の方法により行われる、前項 4又は 5に記載の新生物の検査方法。

発明の効果

[0015] 本発明の前処理方法により、極めて簡便かつ飛躍的に短時間で、生物学的試料中に含有される遺伝子及び/又は遺伝子座にっヽて、非メチルイ匕シトシンをゥラシルに転換させるための処理に供する試料を得ることができる。また、本発明の前処理方法は、操作が簡便であるため、試料の汚染や試料の損失を防ぐことができ、大量に前処理された試料を得ることができる。よって、微量しか採取できない試料や、大量の核酸を必要とする解析方法等に適用することが可能となる。

さらに、本発明の検査方法によると、正確かつ感度の良く新生物を検査することができる。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]生物学的試料が糞便の場合の前処理方法を含む一連の操作を示す図である。

(実施例 1)

[図 2]糞便溶解溶液の希釈例を示す図である。（実施例 1)

[図 3]糞便中の APC遺伝子の 1 Aプロモーター領域のメチルイ匕の有無の検討結果を示す図である。 SMはサイズマーカーを示し、各番号は試料番号を示す。また Mcはメチル化のコントロールを示し、 Mはメチル化が検出されたことを示し、 Uはメチル化が検出されなかったことを示す。（実施例 3)

[図 4]糞便中の DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕の有無の検討結果を示す図である。 SMはサイズマーカーを示し、各番号は試料番号を示す。また Mcはメチル化のコントロールを示し、 Mはメチル化が検出されたことを示し、 Uはメチルイ匕が検出されなカゝつたことを示す。（実施例 3)

[図 5]糞便中の MGMT遺伝子のプロモーター領域のメチル化の有無の検討結果を示す図である。 SMはサイズマーカーを示し、各番号は試料番号を示す。また Mcはメチル化のコントロールを示し、 Mはメチル化が検出されたことを示し、 Uはメチル化が検出されなかったことを示す。（実施例 3)

[図 6]糞便中の SFRP2遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕の有無の検討結果を示す図である。 SMはサイズマーカーを示し、各番号は試料番号を示す。また Mcはメチル化のコントロールを示し、 Mはメチル化が検出されたことを示し、 Uはメチルイ匕が検出されなカゝつたことを示す。（実施例 3)

符号の説明

[0017] a 試料 (糞便）

b 溶解緩衝液

c 試料溶液

cl 試料溶液沈殿

c2 試料溶液上澄み

d グリコーゲン

e 重亜硫酸ナトリウム

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本発明にお、て「生物学的試料」とは、生体力も採取した組織、血液、尿、血清、糞便、射出精液、喀痰、鼻汁、唾液、脳脊髄、涙等の体液が含まれる。本発明の生物学的試料としては、特に糞便が好適である。糞便中には、腸粘膜細胞、血液細胞、腸内細胞叢、病原微生物 (例えば細菌やウィルス）、腸内新生組織 (大腸癌やポリ一プを含む)などが存在する。糞便は各種疾患関連遺伝子や微生物関連遺伝子、例えば遺伝病等の原因遺伝子、大腸癌組織由来遺伝子、又は細菌由来遺伝子等の解析を行うための非侵襲 DNA材料として有効である。

[0019] まず採取した生物学的試料を、適当な溶解液に懸濁若しくは溶解させ、適宜希釈をして、試料溶液を作製することが好ましい。生物学的試料を懸濁若しくは溶解する溶解液は、タンパク質変性剤を含まない公知の液体から、生物学的試料の種類や量を考慮して適宜選択して用いることができる。本発明にお、て「タンパク質変性剤」とは、生物学的試料カゝら DNA等の核酸を抽出する場合に一般的に使用されるタンパク質変性剤をいい、具体的には尿素、グァ-ジン塩酸、グァニン硫酸塩、グァ-ジンチオシアン酸塩などが挙げられる。一方、当該溶解液には、プロティナ一ゼプロナーゼ、ズブチリシン等の非特異的タンパク質分解酵素を予め含有させておくこともできる。

[0020] 例えば生物学的試料が糞便の場合、前記溶解液は糞便に含まれる固形物を溶解することができ、かつ、タンパク質変性剤を含まないものであれば特に限定されない力例えば Tris-EDTA緩衝液であり、 pH値が 9前後の溶液が好ましい。該溶解液を糞便 1 mgに対し、 0.1〜100 μ L、好ましくは 1〜30 μ L、より好ましくは 3〜7 μ L前後を添加して試料溶液を調製することができる。例えば、 1.5 mLチューブに糞便を 100 mg取り、溶解液を 500 μ Lカ卩えて糞便を溶解することができる。

[0021] 糞便中の腸内細菌等の微生物の遺伝子の検出を目的とする場合は、微生物の膜タンパクを変性させるために、試料溶液を例えば 60〜95。C、 10分間〜 10時間加熱処理してもよい。上記のようにして得られた試料溶液は、適宜遠心分離を行うことができる。遠心分離は、 3,000〜8,000 rpm、好ましくは 4,000〜6,000 rpm、より好ましくは 5, 000 rpm前後の回転数で 1〜5分間行うことができる。試料が糞便の場合は、不必要な固形物等を除去するために遠心分離し、上澄み液を用いることが好ま、。

[0022] (前処理方法）

上記のようにして得られた試料溶液又は試料溶液の遠心分離後の上澄み液 (以降、両者のことを単に「試料液」という場合がある。）を、遺伝子の修飾処理に付す前に、前処理を行う。前処理として、多糖類を試料液に添加する。多糖類は、 DNAキャリアとしての機能を有し、後に行う重亜硫酸塩処理に影響を及ぼさないものであれば良いが、この様な多糖類として、具体的にはグリコーゲンが好適である。

[0023] 多糖類を DNAキャリアとして作用をするような量で添加する。例えば試料液 10 〜10 0 μ Lに対して、グリコーゲンを 2 〜200 μ g加えることができる。より好適には上記試料液 42 μ Lにグリコーゲンを 45 μ g加え、溶液を合計 45 μ Lとすることができる。ダリコーゲンは市販のものを用いることができる。グリコーゲンの粉末を試料液に直接添カロして溶解させてもょヽが、グリコーゲン溶液を調製したものを添加することが好ましい。グリコーゲン溶液の濃度は、試料の量等によって適宜調整され、例えば 15 〜20 mg/mLとすることができる。グリコーゲンが試料液中に存在する状態で、 37 °Cで 15 〜30分間インキュベーションする。

[0024] 次いで、試料液中の DNAをアルカリ変性させて、二本鎖から一本鎖 DNAにする反応を行うことが好ましい。アルカリ変性処理は、公知の方法により行うことができる。例えば水酸ィ匕ナトリウム溶液の添カ卩により行うことができる。さらに、 37°Cで 15 〜30分間インキュベーションすることができる。続いて行う解析に、市販のキットを用いる場合は、該市販のキットにアルカリ変性試薬が含まれている場合がある。この場合は、キットの使用説明書に記載の方法に従ってアルカリ変性を行ってもよい。

[0025] 例えば、糞便を溶解した試料溶液を遠心分離して得られた上澄み液 43 μ Lに、ダリコーゲン溶液（15〜20 mg/mL)を 2 μ L、水酸化ナトリウム溶液（例えば DNA methylat ion Kit™(ZYMO RESEARCH社)使用の場合は M- Dilution Buffer™)を 5 μ Lを加え、合計 50 μしとする。この場合インキュベーションは、グリコーゲンと水酸ィ匕ナトリウム溶液を添加した後に一度行えばよい。具体的には、 35〜40°C、好ましくは 37°Cで 15 〜30分間インキュベーションすれば良い。

[0026] (メチル化の検出方法）

本発明は、遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチル化の検出方法にも及ぶ。本発明において、「遺伝子及び/又は遺伝子座のメチルイ匕の検出」とは、生物学的試料に存在する特定の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域又は遺伝子座に関連する C pG島/ CpG配列のシトシンのメチルイ匕を検出することをいう。重亜硫酸塩を用いて試料液中の生物学的試料に存在する遺伝子の全ての非メチルイ匕シトシンを修飾し、ゥラシルに転換して行う。重亜硫酸塩を用いた修飾処理では、メチルイ匕シトシンはゥラシルに転換されないので、修飾処理後のシトシンが検出されれば、該シトシンはメチル化して!ヽると判断され、該シトシンを含む遺伝子及び Z又は遺伝子座もメチルイ匕していると判断される。

[0027] 非メチルイ匕シトシンの修飾は、前記前処理を施した試料液に対して、自体公知の方法により行うことができる。例えば、前処理した試料液に重亜硫酸塩を含む市販の修飾試薬を直接接触させることで、試料液に含有される遺伝子及び,又は遺伝子座中の非メチルイ匕シトシンを修飾し、ゥラシルに変換することができる。具体的には、 DNA メチル化検出用キットの市販品、例えば DNA methylation Kit™(ZYMO RESEARCH 社)、 MethylEasy (Human Genetic Signatures社)、 CpGenome DNA Modification Ki t™ (CHEMICON社)等を用いて行うことができる。

[0028] メチルイ匕の検出方法は、自体公知の方法を用いることができる。遺伝子中のメチルィ匕の有無の検出は、メチル化特異 PCR(MSP)法、 COBRA(combined bisulfite restricti on assay)法、 Methylight法等によることができる。例えば、 PCRで増幅した該増幅した DNA中の非メチル化シトシンがゥラシルへ転換されたか否かの確認は、非メチル化シトシンがゥラシルに転換した配列を増幅しうるプライマー及びメチルイ匕シトシンがゥラシルに転換されな、配列を増幅しうるプライマーを用いて核酸を増幅させ、該増幅産物を確認することにより行うことができる。試料の性質上、増幅される遺伝子は 200bp 以下が好ましぐより好ましくは 180bp以下である。

[0029] (新生物の検査方法）

本発明は、生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチルイ匕を検出することによる新生物を検査する方法にも及ぶ。本発明において、上記生物学的試料中に含有される遺伝子とは、具体的には SFRP2 (secreted apoptosis-relate d protein- 2j遺 1ZS子、 DCC (deleted in colorectal carcinomas)¾fe子及び MGMT (06 -Methylguanine-DNA methyltransferase)遺伝子が挙げられる。さらには、 APC (aden omatous polyposis coli)遺伝子及び Z又は hMLHl遺伝子を含めることができる。これらの遺伝子及び Z又は遺伝子座は、特に消化器の悪性新生物 (癌)や新生物 (腺腫 )に関連する遺伝子として知られている。上記に示す各遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチルイ匕の検出することにより、消ィ匕器に関連する新生物を検出することができる。

[0030] 新生物は、悪性新生物（癌)であっても良いし、新生物 (腺腫)であっても良い。この場合において、メチルイ匕を検出するための重亜硫酸塩処理を行う前の生物学的試料、例えば糞便の前処理として、上記説明した本発明の前処理方法、即ち多糖類を添加し、タンパク質変性剤を添加しない方法を施すのが簡便であり、好適であるが、特に限定されない。例えば MagExtractor (東洋紡製）や QIAamp Stool DNA Isolation Kit(QIAGEN製)などの市販品を用い、自体公知の方法により DNAを抽出する方法を施してちょい。

[0031] 本発明において、「メチルイ匕遺伝子の総和を算出する」とは、上記遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチル化の検出により検出した各遺伝子の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕を定量的に検出したものの値を定量的に加算して算出したものであってもよ!/、し、定量を伴わな、方法でメチルイ匕されて、る遺伝子数の総和を算出してもよい。例えば、 SFRP2、 DCC及び MGMT遺伝子のメチル化の総和を求めることにより、正確に消ィ匕器の新生物を検査することができる。さらには、 APC及び Z又は hMLHl遺伝子のメチル化の総和を含めてもよい。

[0032] 具体的には、 SFRP2遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンのメチル化、 DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンのメチル化、及び MGMT遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出し、それらの総和を求めることにより達成される。さらには、 APC遺伝子の 1Aプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンのメチル化及び Z又は DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出し、先に示す 3種の遺伝子由来メチルイ匕の総和にカロ算して総和を求めることができる。これにより消化器に存在する新生物を検出することができる。

[0033] 本発明の特定の遺伝子又は遺伝子座の塩基配列は、 SFRP2遺伝子については N C_000004に、 DCC遺伝子については同 No.NT_033905.3に、 MGMT遺伝子については同 No.HSU95038に示すとおりである。さらには、 APC遺伝子については Genebank Accession No.HSU02509に、 hMLHl遺伝子については同 No.AB017806に示すとおりである。また、 SFRP1遺伝子のメチル化もさらに検討してもよぐ該 SFRP1遺伝子につ

V、ては NC_000008に示すとおりである。

これらの遺伝子のプロモーター領域又は 5'領域に存在する CpG領域の核酸増幅用プライマーとして、以下のものを使用することができる。

[0034] APC遺伝子の 1Aプロモーター領域に存在する CpG領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。

APC1A-NF: 5 '-ATATTTTYGAGGGGTAYGGGGTTA (配列番号 1) APC1A-MF: 5'- TATTGCGGAGTGCGGGTC (配列番号 2)

APC1A-NR: 5 -ACRAAAATAAAAAACRCCCTAATC (配列番号 3) [0035] APC1A-NF (配列番号 1)と APC1A-NR (配列番号 3)はメチル化シトシンの存在するアレルにも非メチルイ匕シトシンの存在するアレルにもノ、イブリダィズするように設計されており、この 2つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、 148bp の増幅産物が得られる。

一方、 APC1A-MF (配列番号 2)はメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダィズするように設計されており、もしメチルイ匕シトシンが存在するならば APC1A-M

S (配列番号 2)と APC1A-NAS (配列番号 3)の 2つのプライマーにより、 84bpの増幅産物が得られる。

[0036] すなわち、 APC遺伝子の 1Aプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められる場合は 148bpと 84bpの 2つの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、 APC遺伝子の 1Aプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められない場合は 148bpの 1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる（図 1)。

APC遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号 1 〜3プライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、 APC遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンのメチルイ匕に応じて塩基数の異なる DNAの増幅を確認することができる。

[0037] DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。

DCC-NF: 5し AGGTGGAGAAAGAGGTGGAGGAA (配列番号 4)

DCC-MR: 5 -ACCAAAAATCGCGAACAACG (配列番号 5)

DCC-NR: 5 -TCAACCAACACCTTCRAAACCAAA (配列番号 6)

[0038] DCC-NF (配列番号 4)と DCC-NR (配列番号 6)はメチル化シトシンの存在するァレルにも非メチルイ匕シトシンの存在するアレルにもハイブリダィズするように設計されており、この 2つのプライマーセットにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、 151bp の増幅産物が得られる。

一方、 DCC- MR (配列番号 5)はメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダイズするように設計されており、もし、メチルイ匕シトシンが存在するならば DCC-MR( 配列番号 5)と DCC- NF (配列番号 4)の 2つのプライマーにより、 133bpの増幅産物が得られる。

[0039] すなわち、 DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められる場合は 151bpと 133bpの 2つの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、 DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められない場合は 151bpの 1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる（図 2)。

DCC遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号 4 〜6に表された配列力なるプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、 DCC遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンのメチルイ匕に応じて塩基数の異なる DNAの増幅を確認することができる。

[0040] MGMT遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。

MGMT3-NF: 5 -GYGTTTYGGATATGTTGGGAT (配列番号 7)

MGMT3-MF: 5'- ACGTTCGTAGGTTTTCGC (配列番号 8)

MGMT3-NR: 5 -AACTCCRCACTCTTCCRAAAACRA (配列番号 9) [0041] MGMT3-NF (配列番号 7)と MGMT3-NR (配列番号 9)はメチル化シトシンの存在するアレルにも非メチルイ匕シトシンの存在するアレルにもハイブリダィズするように設計されており、この 2つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、 134b Pの増幅産物が得られる。

一方、 MGMT3-MF (配列番号 8)はメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダィズするように設計されており、もし、メチルイ匕シトシンが存在するならば MGMT 3-MF (配列番号 8)と MGMT3-NR (配列番号 9)の 2つのプライマーにより、 82bpの増幅産物が得られる。

[0042] すなわち、 MGMT遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められる場合は 134bpと 82bpの 2つの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、 MGMT遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンにメチルィ匕が認められない場合は 134bpの 1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる（図 3)。

MGMT遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号 7〜9に表された配列からなるプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、 MGMT遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンのメチルイ匕に応じて塩基数の異なる DNAの増幅を確認することができる。

[0043] hMLHl遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。

hMLH15-NF: 5'- YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA (配列番号 10) hMLH15-MF: 5し CGTTCGTCGTTCGTTATATATC (配列番号 11) hMLH15-NR: 5'— TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA (配列番号 12)

[0044] hMLH15-NF (配列番号 10)と hMLH15-NR (配列番号 12)はメチル化シトシンの存在するアレルにも非メチル化シトシンの存在するアレルにもハイブリダィズするように設計されており、この 2つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、 149bpの増幅産物が得られる。

一方、 hMLH15-MF (配列番号 11)はメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダィズするように設計されており、もし、メチルイ匕シトシンが存在するならば hML H15- MF (配列番号 11)と hMLH15- NR (配列番号 12)の 2つのプライマーセットにより、 109bpの増幅産物が得られる。

[0045] すなわち、 hMLHl遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められる場合は 149bpと 109bpの 2つの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、 hMLHl遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められな、場合は 149bpの 1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる。

hMLHl遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号 10〜12に表された配列からなるプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、 hMLHl遺伝子のプロモーター領域に存在する CpG領域のシトシンのメチルイ匕に応じて塩基数の異なる DNAの増幅を確認することができる。

[0046] SFRP1遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。

S1-NF: 5し GYGTTTTTTTGTTYGTYGTATTTT (配列番号 13) S1-MF: 5'- TCGTAGCGTCGTTTTTTC (配列番号 14)

Sl-NR: 5 -AAAACRCAATCCCCAACRTTAC (配列番号 15)

[0047] S1-NF (配列番号 13)と S1-NR (配列番号 15)はメチル化シトシンの存在するアレルにも非メチルイ匕シトシンの存在するアレルにもハイブリダィズするように設計されており、この 2つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、 166bpの増幅産物が得られる。

一方、 S1-MF (配列番号 14)はメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダィズするように設計されており、もし、メチルイ匕シトシンが存在するならば S1-MF (配列番号 14)と S1-NR (配列番号 15)の 2つのプライマーにより、 120bpの増幅産物が得られる。

[0048] すなわち、 SFRP1遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められる場合は 166bpと 120bpの 2つの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、 SFRP1遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められない場合は 166bpの 1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる。

SFRP1遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号 13〜 15に表された配列からなるプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、 SFRP1遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG 領域のシトシンのメチルイ匕に応じて塩基数の異なる DNAの増幅を確認することができる。

[0049] SFRP2遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域を増幅しうるプライマーは以下のとおりである。

S2-NF: 5 -GGTTGTTAGTTTTTYGGGGTTT (配列番号 16)

S2-MF: 5し TCGTTTCGTTTTTTTTCGGTTTC (；配列番号 17)

S2-NR: 5 -CAACAACAACRAACCAAAACCCTAC (配列番号 18) [0050] S2-NF (配列番号 16)と S2-NR (配列番号 18)はメチル化シトシンの存在するアレルにも非メチルイ匕シトシンの存在するアレルにもハイブリダィズするように設計されており、この 2つのプライマーにより、メチル化シトシンの有無にかかわらず、 159bpの増幅産物が得られる。

一方、 S2-MF (配列番号 17)はメチル化シトシンの存在するアレルのみにハイブリダィズするように設計されており、もし、メチルイ匕シトシンが存在するならば S2-MF (配列番号 17)と S2-NR (配列番号 18)の 2つのプライマーにより、 87bpの増幅産物が得られる。

[0051] すなわち、 SFRP2遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められる場合は 159bpと 87bpの 2つの遺伝子増幅産物が認められることになり、また、 SFRP2遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG領域のシトシンにメチル化が認められない場合は 159bpの 1つのみの遺伝子増幅産物が認められることになる（図 4)。

SFRP2遺伝子の必要な領域を増幅しうるプライマーであれば、上記プライマーに限定されず、同様の機能を有するプライマーを用いることもできる。好ましくは、配列番号 16〜18に表された配列からなるプライマーをセットで使用することにより、一度の核酸増幅処理で、 SFRP2遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域に存在する CpG 領域のシトシンのメチルイ匕に応じて塩基数の異なる DNAの増幅を確認することができる。

[0052] 前記増幅産物の確認は、自体公知の方法により行うことができる。具体的には、ァガロースゲルにて電気泳動を行うことにより確認できる。また、メチル化の検出を行いたい遺伝子又は遺伝子座における遺伝子増幅の際に用いるプライマーを、メチル化シトシンの存在するアレルにも非メチル化シトシンの存在するアレルにもハイブリダィズするように設計されたプライマーのみを用いた場合は、 DNAチップによるハイブリダィゼーシヨン、クローンライブラリ一法、変性グラジェントゲル電気泳動法 (DGGE法）、温度ダラジエンドゲル電気泳動法 (TGGE法）、 Methylight法又は SSCP法を採用することができる。

[0053] (試薬及びキット）

本発明は、核酸の修飾前に使用する試薬であって、グリコーゲンを含み、タンパク質変性剤を含まな!/ヽことを特徴とする試料の前処理試薬、上記の前処理方法に用いるグリコーゲンを含みタンパク質変性剤を含まなヽ試料前処理試薬キット、及び上記の核酸修飾方法に用いる核酸修飾試薬キットにも及ぶ。

[0054] さらに、本発明は、消化器に存在する新生物の検査方法の他、上記のプライマー、プライマーセットにも及ぶ。さらに、本発明は消化器に存在する新生物の検査用試薬及び検出用試薬キットにも及ぶ。本発明の試薬には、上述の各プライマーを試薬とすることができ、また試薬キットにはプライマー若しくはプライマーセットを含めることができる。試薬キットには、上記プライマーの他、上述の試料前処理試薬、並びに核酸増幅用試薬、増幅産物の確認に使用する試薬等を含めることもできる。

実施例

[0055] 以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。

[0056] (実施例 1)生物学的試料が糞便の場合の試料の前処理方法

生物学的試料が糞便の場合の試料の前処理方法を、図 1及び図 2に従って説明する。

1)糞便を溶解するための溶液として、 500 mmol/L Tris- HC1、 16 mmol/L EDTA、 10 mmol/L NaCl、 pH 9.0の組成の溶液 (溶解緩衝液）を調製した。 1.5 mLチューブにサンプルナンバー 9の糞便を 78 mg、サンプルナンバー 12の糞便を 117 mg、サンプルナンバー 45の糞便を 162 mg、及びサンプルナンバー 51の糞便を 146 mgを各々カロえ、溶解緩衝液 1,000 μ Lに各糞便を溶解し、各糞便溶液を調製した。次に、各糞便溶液を 95 °Cで 10分間加熱処理した（図 1 :左上)。

[0057] 2)糞便溶液の遠心分離

得られた糞便溶液を、 5,000 rpmで 3分間遠心分離を行い、上澄み液と沈殿に分離した (図 1 :右上)。

[0058] 3)溶液へのグリコーゲンの添カロ

上記糞便溶液の上澄み液 (サンプルナンバー 45— 1、 51 - 1) (図 2) 43 Lにダリコーゲン溶液（15 mg/mL) 2 μ Lを加え、撹拌した。また、該上澄み液 100 μ Lを溶解緩衝液 500 Lにて希釈し (サンプルナンバー 45— 2、 51 - 2) (図 2)、得られた希釈溶液 43 Lにグリコーゲン溶液（15 mg/mL) 2 Lをカ卩え、攪拌した（図 1：右下)。

[0059] 4) DNAの一本鎖への変性

以下の工程は、 DNAメチル化キット（DNA methylation Kit, EZ:ZYMO RESEARCH 製）の手順に従って行った。キットに含まれる M-Dilution Buffer (水酸ィ匕ナトリウム溶液）を各サンプルに 5 μ L加えて、 37 °Cにて 15分間インキュベートを行った。

[0060] 5)非メチル化シトシンのゥラシルへの変換

DNAメチル化検出用キット DNA methylation Kit™(ZYMO RESEARCH社)を用いて非メチル化シトシンをゥラシルに変換させた。キットに含まれる CT Conversion reagent (重亜硫酸ナトリウム溶液）を上記サンプルナンバー 9、 12、 45— 1、 51— 1、 45— 2 、 51— 2の溶液に添カロしてインキュベートし、全ての非メチルイ匕シトシンを修飾し、ゥラシルに変換した（図 1：左下)。

[0061] 6) DNAの精製

得られた修飾遺伝子由来 DNAを、キットに含まれる Zymo-Spin I Columnを用いて、高純度にまで精製した。 [0062] (実施例 2)予備検討

250例の大腸癌患者、 10例の大腸腺腫患者、 85例の胃癌患者よりそれぞれ、新生物部分、又は正常粘膜部分の生物学的試料を得、以下の検討を行った。

外科手術切除及び内視鏡切除を施行された 250例の大腸癌組織 (遺伝性非腺腫性大腸癌を含む)、 10例の大腸腺腫組織 (家族性大腸腺腫症を含む)、 85例の胃癌組織、 225例の正常大腸粘膜組織、及び 85例の正常胃粘膜組織を生物学的試料をとし、各生物学的試料力も抽出された DNAについて重亜硫酸ナトリウム処理を行い、まず、合計 15種の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域及び遺伝子座 (SFRP1, S FRP2, DCC, APC, MGMT, hMLHl, MINT1, MINT2, MINT31, CACNA1G, pl4, pi 6, THBSl, DAPK, COX2)のメチル化の検討を 239症例の大腸癌を用いて行った。その結果より、メチル化の頻度の高い 6つの遺伝子 (SFRP1、 SFRP2、 APC, DCC, MGM T, hMLHl)を大腸癌及び消ィ匕器新生物の検出用マーカーとして選出した。

[0063] 次に、これら 6つの遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕の頻度及び傾向を、 250例の大腸癌組織 (遺伝性非腺腫性大腸癌を含む）、 10例の大腸腺腫組織 (家族性大腸腺腫症を含む）、 85例の胃癌組織、 225例の正常大腸粘膜組織、及び 85例の正常胃粘膜組織を用いて解析し、検討を行った。尚 SFRP1、 SFRP2, APC, DCC, MGMT, hMLHlの各遺伝子のメチル化の検出のために、表 1のプライマーを用いた。表 1のプライマーは、配列表の配列番号 1〜18に表された配列力もなるオリゴヌクレオチドからなる。各プライマーの各遺伝子における位置、塩基長及び Tm値についても表 1に示した。

[0064] [表 1]

遺伝子名ブライマー名位置配列（番号は配列表の配列を示す〕塩基長

ω

丌丌

[0065] 各遺伝子のメチル化の検出のために PCRによる DNA増幅反応を行った。 10 X PCR 緩衝液（Invirogen社）， 1.5 mM MgCl , 0.2 mMの各プライマー， O.lmM dNTP, 1 unit

2

の Taq polymerase (Platinum taq polymerase; Invirogen社)、糸且織力ら抽出された DN Aを重亜硫酸ナトリウム処理した溶液 2 Lを铸型に、合計 20 Lの PCR反応溶液を用いた。

増幅反応条件は 95°Cで 3分加温した後、 95°Cで 30秒、各 Tm温度で 30秒、 72°Cで 30 秒を 1サイクルとして、合計 36サイクル行い、その後に 72°Cを 5分間加温した。

[0066] 250症例の大腸癌試料、 10症例の大腸腺腫試料について各遺伝子のメチル化の有無を調べた結果、これらの 6種の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域にぉヽて 1つ以上のメチルイ匕を認めた大腸癌症例は 100% (250/250)、また大腸腺腫においても 100%(10/10)であった。また、 85症例の胃癌症例でも 100% (85/85)であった。

[0067] 各遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域にっヽて、メチル化の認められた遺伝子について 1ポイントを、メチル化を認めなかった遺伝子については 0ポイントという評価を与え、各試料について上記 6種の遺伝子又は遺伝子座についての合計を算出し、この合計値を M丄 (メチレーシヨンインデックス (Methylation Index))とした。大腸癌、大腸腺腫、胃癌、大腸正常粘膜、及び胃正常粘膜の Ml.の平均値、及び各遺伝子のメチルイ匕の頻度を表 2に示した。尚、各組織における M丄平均値の検定には分散分析を用い、 P値はその値を示す。また、 M丄平均値のカツコ内は 95%信頼区間を示す。

[表 2]

DNAメチル化頻度 ¾ チル化サンプル数)

f且¹ i*iL M丄平均値 SFR SFRP2 DCC APC GMT hMLH1

大腸

大腸癌（n=250) 3.59 (3.45 -3.73) 99.6 (249) 80.8 (202) 73.2 (183) 44.0 (110) 40.0 (100) 21.2 (53) 大腸腺腫 (n=10) 2.60 (2.00 - 3.20) 100 (10) 50.0 (5) 0 (0) 70.0 (7) 30.0 (3) 10.0 (1)

正常粘膜（n=225) 1.78 (1.66 - 1.90) 96.9 (218) 17.8 (40) 8.9 (20) 31.6 (71) 16.9 (38) 5.8 (13)

p 0.0001 胃癌（n=85) 3.84 (3.60 - 4.09) 95.3 (81) 88.2 (75) 52.9 (45) 92.9 (79) 22.4 (19) 32.9 (28) 正常粘膜 (n=85) 2.89 (2.68 - 3.11) 94.1 (80) 15.3 (13) 24.7 (21) 91.8 (78) 52.9 (45) 10.6 (9)

p<0.0001

[0069] 表 2に示すように、大腸癌、大腸腺腫、及び大腸正常粘膜における M丄の平均値は有為に差が認められた (Pく 0.0001)。また、胃癌及び胃正常粘膜における M上の平均値も有為に差が認められた (Pく 0.0001)。すなわち、消化器新生物と消化器正常粘膜の M丄の平均値には明らかな差が存在することが確認された。

例えば、大腸癌の場合は、正常粘膜の場合に比べ、特に SFRP2, DCC, MGMT各遺伝子のメチル化が有意に認められた。大腸腺腫の場合は、 SFRP2, APC, MGMT 各遺伝子のメチル化が有意に認められた。さら〖こ、胃癌の場合は、 SFRP2, DCC, hM LH1各遺伝子のメチルイ匕が有意に認められた。本結果より、糞便から、これら 6種類の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕を検出し、その M丄値により消ィ匕器新生物の存在を予測することが可能である力もしれないことが示唆された。

[0070] 予備検討より得られた結果により、理論上では、複数個の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域におけるメチルイ匕の有無の総和は新生物と正常組織で異なることが示された。この結果と同様に、糞便に含有される遺伝子から DNAメチル化を検出することにより、消ィ匕器における新生物の存在を検出可能かどうかの検討を行った。

[0071] (実施例 3)遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕の総和と病理診断との関係

インフォームド 'コンセントを得られた大腸内視鏡検査予定患者 60名から、検査施行前の糞便を生物学的試料として得た。得られた糞便を、実施例 1に記載の方法によりグリコーゲン処理及び重亜硫酸ナトリウム処理を行った。該重亜硫酸ナトリウム処理した溶液 2 μ Lについて、 SFRPl, SFRP2, DCC, APC, MGMT, hMLHl各遺伝子のプロモーター領域及び Z又は 5'領域のメチル化を、予備検討で行った方法と同じ方法で検出した。

[0072] 60症例の糞便に含有される遺伝子のメチル化を検出した結果、大腸内視鏡及び上部消化管内視鏡検査結果を表 3に示した。性別は女性を Fと表記し、男性を Mと表記した。 FOBTは便潜血反応検査 (fecal Occult-blood test)を示し、（+ )は便潜血反応検査陽性を、（一）は便潜血反応検査陰性を、 N.D.は便潜血反応検査を行ったかどうか確認不可能な症例を示した。また、メチルイ匕状況 (Methylation Status)は、遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域にメチルイ匕が認められた場合を 1と表記し、メチル化が認められない場合を 0と表記した。また、核酸増幅反応の認められな力つたものに対しては、 N.A.(Not Amplified)と表記した。 Ml.は、各遺伝子のプロモーター領域及び/又は 5'領域についてメチルイ匕の認められた場合を 1ポイントとして加算を行い、 N.A.は加算しな力つた (すなわち 0ポイントと同義である）。

[0073] [表 3]

表 3に示した 60症例を、悪性新生物（胃 adenocarcinoma,大腸 adenocarcinoma,十二旨月昜 carcinoidを含む)群、艮'性新生物 (胃 fundic gland polyp,胃 hyperplastic polyp ,大腸 tubular Adenomaを含む)群、及び W.N丄 (新生物（癌又は腺腫）が認められなかった症例）群の 3つに分類した。この 3つに分類された症例群と、 APC, DCC, MGM T, hMLHl, SFRP1, SFRP2各遺伝子のプロモーター領域若しくは 5'領域のメチル化頻度、及び M丄平均値との関係を表 4に示した。 P値は 3群間と M丄平均値との比較には分散分析を用いた。また、 3群間の M丄平均値の比較には分散分析を用いた。また、 3群間の各遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕頻度の比較については Pearsonの検定を用、た。

[表 4]

DNAメチル化頻度％ (メチル化/非メチル化/非増幅症例数) 内視鏡/病理症例 M.I.平均値

診断数 ±標準偏差 SFRP1 SFRP2 DCC APC MGMT hMLH1

93.3 80.0

悪性新生物 3.53± 1.30

( 14/1/0) (12/3/0)

73.3 66.7 26.7 6.7

良性新生物 2·47± 1· 19

(4/10/1) ( 1/6/8)

66.7 46.7 16.7 26.7 3.3 10.0

W.N丄 30 1 ·70± 1·34

(20/5/5) (14/8/8) (5/16/9) (8/10/12) ( 1/6/23) (3/15/12)

Ρ値 0.0002 0.3882 0.0328 0.0144 0.0015 0.0527 0.8603

[0076] その結果、糞便に含有される遺伝子のメチル化の検出によ ¾り、そのメチル化遺伝子の総和の値の平均値は悪性新生物を伴う症例及び良性新生物を伴う症例と新生物を伴わない (W.N丄)症例の間において有為に差が認められた。特に、悪性新生物の場合は SFRP2, DCC, MGMT及び APC遺伝子について、良性新生物の場 ¾合は SFRP 2及び APC遺伝子について、新生物が認められな力つた群と比較して有意差が認められた。この結果は、予備検討と同じ傾向であった。

[0077] SFRP2プロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕は、新生物（癌と腺腫)を検出することができ、 APC遺伝子の 1Aプロモーター領域のメチル化も同様の傾向であった。 DCCプロモーター領域若しくは 5'領域のメチルイ匕においては、悪性新生物を中心に検出可能であることが示され、この傾向は MGMTプロモーター領域のメチル化にも認められた。

[0078] 本実施例において、各遺伝子プロモーター領域及び Z又は 5'領域のメチル化を非定量的に検出した。表 4の結果を考慮し、 M丄値が 2以上の症例を検査陽性群 (すなわち消ィ匕器に新生物の存在が疑われる症例群）とし、また、 M丄値カ ^又は 0の症例を検査陰性群として、この検査方法における感度、及び特異度を算出した。その結果を表 5に示した。尚、 P値は Fisherの正確検定の値を示す。

[0079] [表 5]

[0080] 表 5に示したように、消化器に存在する新生物を検出する感度は 90.0%、特異度は 5 3.3%であった。また、悪性新生物については、 100%検出可能であることが示された。

[0081] (比較例 1)便潜血による確認

上記予備検討に示した症例のうち 60症例にっ、て便潜血反応を施行し、陽性を示した患者 20症例における大腸内視鏡による新生物の有無の関係を調べ、表 6に示した。 W.N丄は新生物（癌又は腺腫)が認められな力つた症例である。このように便潜血反応陽性の症例においても半数以上は新生物が認められな力つた。

[0082] [表 6]

[0083] 上記の結果より、便潜血反応では新生物の判断を行うことが殆ど不可能であると考えられた。一方、本発明の検査方法により、特に複数の遺伝子プロモーター領域若しくは 5'領域についてメチルイ匕を検出し、その総和 (M丄)を求めることで、正確、かつ簡便に新生物の検査を行うことができることが示唆された。

産業上の利用可能性

[0084] 以上説明したように、本発明の前処理方法により、タンパク質変性剤を使用しなくても、次の工程において遺伝子中に含まれる非メチルイ匕シトシンを修飾し、ゥラシルに変換させることができた。

また、本発明の SFRP2遺伝子、 DCC遺伝子及び MGMT遺伝子のメチル化を検出し、メチルイ匕の総和を求めることにより、生物学的試料、好ましくは糞便から、消化器に存在する新生物 (癌又は腺腫)を判定することが可能であることが確認された。さらには、 APC遺伝子及び Z又は hMLHl遺伝子のメチルイ匕を検出し、さらにメチルイ匕の総和を求めることで、より正確に大腸癌の検査ができることが示唆された。

実施例に示した糞便試料につ!ヽて、上記各遺伝子プロモーター領域及び/又は 5 '領域のメチルイ匕を調べた結果、糞便から大腸癌及び Z又は良性新生物の検査が可能であることを示した。

このように非侵襲 DNA材料である糞便を本発明の前処理法で処理することは実用的に利用可能であることが確認された。

さらに、各種疾患の診断上有用であるば力りではなぐ操作的に多数試料の処理が可能なことから、正常集団を対象とした大腸癌等の各種検診への応用も可能である。従って、本発明の方法により、消ィ匕器に関する新生物をある程度予測でき、本発明の検査方法により要注意と判断された患者について、内視鏡検査を行う等、患者への負担を軽減ィ匕することもできる。

Claims

請求の範囲

[1] 生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチル化を検出する方法において、前記生物学的試料に多糖類を添加し、タンパク質変性剤を添加しないことを特徴とする生物学的試料の前処理方法。

[2] 多糖類が、グリコーゲンである請求の範囲第 1項に記載の生物学的試料の前処理方法。

[3] 重亜硫酸塩を、請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の前処理方法により前処理した生物学的試料と接触させ、該生物学的試料中に含有される遺伝子及び Z又は遺伝子座の非メチルイ匕シトシンをゥラシルに転換させ、ゥラシルに転換されてヽなヽシトシンを検出することによる遺伝子及び Z又は遺伝子座のメチル化の検出方法。

[4] 生物学的試料中に含有される遺伝子及び/又は遺伝子座のうち SFRP2遺伝子、 DC C遺伝子及び MGMT遺伝子のメチル化を検出し、メチル化遺伝子の総和を算出することによる新生物の検査方法。

[5] さらに APC遺伝子及び Z又は hMLHl遺伝子のメチルイ匕を検出し、メチル化遺伝子の総和を産出することによる請求の範囲第 4項に記載の新生物の検査方法。

[6] メチルイ匕の検出が、請求の範囲第 3項に記載の方法により行われる、請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の新生物の検査方法。