WO2006059529A1 - Hla-a24拘束性腫瘍抗原ペプチド - Google Patents

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WO2006059529A1
WO2006059529A1 PCT/JP2005/021563 JP2005021563W WO2006059529A1 WO 2006059529 A1 WO2006059529 A1 WO 2006059529A1 JP 2005021563 W JP2005021563 W JP 2005021563W WO 2006059529 A1 WO2006059529 A1 WO 2006059529A1
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hla
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tumor
tumor antigen
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Kyogo Itoh
Mamoru Harada
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Definitions

  • the present invention relates to an HLA-A24-restricted tumor antigen peptide, and more specifically, to an E6 protein of human papillomavirus type 16 recognized by cytotoxic T lymphocytes and IgG antibodies of HLA-A24 positive cervical cancer patients.
  • the derived tumor antigen peptide is not limited to an HLA-A24-restricted tumor antigen peptide, and more specifically, to an E6 protein of human papillomavirus type 16 recognized by cytotoxic T lymphocytes and IgG antibodies of HLA-A24 positive cervical cancer patients.
  • the derived tumor antigen peptide The derived tumor antigen peptide.
  • Non-patent Document 1 In recent years, many genes encoding human cancer-related antigens recognized by T cells and antigen-derived peptides have been identified, and clinical trials for cancer vaccine therapy as immunotherapy have been conducted (Non-patent Document 1). -2). In addition, peptide vaccine therapy for various epithelial cancers has been carried out by the group of the present inventors (Non-patent Documents 3-7). Although cancer vaccine therapy has been tried for cervical cancer, and there are reports of effective cases, many of the cancer antigenic peptides used in the vaccine therapy are self-antigen proteins that are also expressed to some extent in normal cells. It was derived from. Therefore, in order to establish effective vaccine therapy against cervical cancer, it is necessary to identify useful novel antigenic peptides.
  • HPV16 human papillomavirus
  • HPV18 human papillomavirus
  • Non-Patent Documents 8 and 9 E6 and E7 proteins of these types of HPV are known to be involved in transformation to malignant transformation and their maintenance by inactivating p53 and RB tumor suppressor genes, respectively (non-patented) Reference 10, 11). Therefore, immunotherapy targeting the non-self antigen HPV16 or HPV18 E6 protein or E7 protein is considered to be a very effective treatment for cervical cancer.
  • HPV16-specific cytotoxic T lymphocytes have been identified in peripheral blood lymphocytes and tumor infiltrating lymphocytes of cervical cancer patients (Non-patent Documents 12-14).
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • HPV16 E7 protein-derived antigenic peptides presented in HLA-A2 molecules have been identified (Non-patent Documents 15-17).
  • HLA molecules Al, A2, A3, All, A24, A29, B7, B8, B18, B27, B35, B44, B51 and B62
  • the possibility of binding is suggested (special Permitted document 1, Patent document 2).
  • special Permitted document 1 Patent document 2 peptide-specific CTL induction by peptides suggested to bind to HLA-A24 molecule and the cytotoxic activity of induced CTL against cervical cancer cells were examined! ⁇ ⁇ .
  • HPV16-derived E6 or E7-derived antigenic peptides which are presented on HLA-A24 molecules expressed in approximately 60% of Japanese and approximately 20% of Caucasians, are capable of inducing cervical cancer-reactive CTLs. It has not yet been identified, and there is a strong demand for identifying such peptides for the development of cancer treatment.
  • Patent Document 1 US Patent No. 6,783,763
  • Patent Document 2 US Patent Publication 2005/0033025
  • Non-Patent Document 1 Boon ( ⁇ , ⁇ .), Immunol Today 81: p267-268,1997
  • Non-patent document 2 Rosenberg SA, Immunity 10: p281-287,1999
  • Non-patent document 3 Tanaka S, J Immunother 26: p357-366,2003
  • Non-Patent Document 4 Tsuda N et al., J. Immunother 27: p60-72,2004
  • Non-Patent Document 5 Noguchi M, Prostate 57: p80-92, 2003
  • Non-Patent Document 6 Mine T, Cancer Science 94: p548-556, 2003
  • Non-Patent Document 7 Sato Y et al., Cancer Science 94: p802-808, 2003
  • Non-patent literature 8 Walboomers JM et al., J Pathol 181: p253-254, 1997
  • Non-patent literature 9 Munoz N et al., N Engl J Med 348: p518-527, 2003
  • Non-Patent Document 10 Munger K et al., J Virol 63: p4417-4421, 1989
  • Non-Patent Document 11 von Knebel DM et al., Int J Cancer 51: p831-834, 1992
  • Non-patent Document 12 Borysiewicz LK et al., Lancet 347: pl523-1527, 1996
  • Non-Patent Document 13 Lessing ( Ressing ME), etc., Cancer Res 56: p582-588, 1996
  • Non-patent document 14 Evans EM, etc.
  • Cancer Res. 57 p2943- 2950, 1997
  • Non-patent document 15 Nijiman ( ⁇ ) & HW), etc.
  • J Immunother 14 pl21- 126, 1993
  • Non-patent document 16 Kast WM, etc.
  • J Immunol 152 p3904- 3912, 1994
  • Non-Patent Document 17 Lessing ME, J Immunol 154: p5934-5943, 1995 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to identify an HPV16 E6 protein-derived antigenic peptide capable of inducing cervical cancer-reactive cytotoxic T cells (CTL) in HLA-A24-positive cervical cancer patients. Let's say.
  • Another object of the present invention is to provide a means for preventing and treating cervical cancer using the above peptide.
  • the present invention provides the following tumor antigen peptides:
  • amino acids In addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, one or more amino acids have been deleted, substituted, and / or added, and have the ability to bind to the HLA-A24 molecule to cause cytotoxicity. Peptides that can be recognized by sex T cells.
  • the present invention also provides a composition for treating or preventing a tumor comprising the tumor antigen peptide as an active ingredient, a method for treating or preventing a tumor, comprising administering the tumor antigen peptide to a patient, and a tumor Use of the tumor antigen peptide for the manufacture of a therapeutic or prophylactic composition is provided.
  • the present invention provides a method for preparing an antigen-presenting cell comprising pulsing the tumor antigen peptide into an isolated antigen-presenting cell derived from an HLA-A24 positive tumor patient, and the method.
  • Antigen presenting cells are provided.
  • the present invention also provides a method for preparing cytotoxic T cells comprising stimulating isolated peripheral blood lymphocytes derived from an HLA-A24 positive tumor patient with the tumor antigen peptide, and the method. Provide cytotoxic T cells.
  • the tumor antigen peptide of the present invention forms a complex with the HLA-A24 molecule, and can effectively induce CTL that specifically recognizes the complex between the peptide and the HLA-A24 molecule.
  • the tumor antigen peptide of the present invention is HLA-A24-restricted, which is positive in many Asian races, particularly Japanese, diagnosis, prevention of HLA-A24-positive cervical cancer in these populations, Promote the development of effective means for treatment and even prevention of metastasis There is also an effect.
  • FIG. 1 Cervical cancer cells SKG-1, SKG-IIIb, and OMC-1 (squamous cell carcinoma), SK G-IIIa and OMC-4 (adenocarcinoma), ovarian cancer cells Photos showing the results of examination of the expression of HPV16 E6 protein in OMC-3 and esophageal cancer cell line KE-4 by PCR (A) and Western blot (B), and cervical cancer cells SKG-IIIa and OMC 1 is a graph (C) showing the result of analyzing the expression of HLA-A24 molecule of -1 by flow cytometry.
  • FIG.2 Three types of target cells (HLA-A24-positive HPV16-positive SKG-IIIa, HLA-A24-negative) induced by stimulating PBMC of 5 HLA-A24-positive cervical cancer patients with each peptide it is a graph showing the result of investigation with 51 Cr release test cytotoxic activity against H PV16 positive OMC-1 and HLA-A24-positive HPV16-negative PHA-stimulated T cells).
  • FIG. 3 Anti-HLA-class I (W6) in a 51 Cr release test in which PBMCs from two HLA-A24-positive cervical cancer patients were stimulated with each peptide and examined for cytotoxic activity against three target cells.
  • / 32 mouse IgG2a), anti-HLA—class ⁇ ( ⁇ —DR—1, mouse IgG2a), anti-CD4 (Nu—Th / I, mouse IgG2a) and anti-CD8 (Nu-Ts / c, mouse IgG2a)
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examining the effects of antibody at 10 / zg / ml.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of a non-radioactive inhibition test performed by labeling with Cr! /, Na! /, And C1R-A24 cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of confirming the peptide specificity of IgG by absorbing peptide-reactive IgG in plasma from two HLA-A24-positive cervical cancer patients with the corresponding peptide.
  • a tumor antigen peptide can be recognized by cytotoxic T cells (CTLs) in association with HLA-A24 molecules, ie, HLA-A24 positive. It refers to an HLA-A24-restricted tumor antigen peptide capable of inducing CTL effective against cervical cancer.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • cancer can bind to HLA-A24 molecule and be recognized by CTL
  • the tumor antigen peptide of the present invention binds to HLA-A24 molecule to form a complex, Such a complex It means that CTL can be recognized.
  • the tumor antigen peptide of the present invention has an activity of inducing peptide-specific CTL in the form of a complex with the HLA-A24 molecule and in the form of a complex with the HLA-A24 molecule. Means.
  • antigen-presenting cell refers to a cell that presents a complex of an HLA-A24-restricted antigen peptide and an HLA-A 24 molecule on the cell surface. Therefore, the antigen-presenting cell has a function of bringing about the activity of CTL by presenting the complex of the HLA-A24-restricted tumor antigen peptide of the present invention and the HLA-A24 molecule on the cell surface.
  • Such cells also include tumor cells that are targets for CTL cytotoxic activity.
  • the tumor antigen peptide of the present invention is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and a modification derived by deletion, substitution, and / or attachment of at least one amino acid in the sequence. And a peptide capable of being recognized by a specific CTL by binding to an HLA-A24 molecule.
  • the amino acid modification is specifically a deletion, substitution or addition in one to several, preferably one or two amino acids. If the variation includes substitutions or additions with other amino acids, the other amino acids may be natural amino acids or amino acid analogs, such as N-acylates, O-acylates, esters of various amino acids. Compounds, acid amidated products, alkylated products, and the like.
  • the tumor antigen peptide having an amino acid modification in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 is one or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, preferably 1 to several, more preferably 1 or 2
  • Ability to delete amino acid residues A candidate peptide substituted with or added with another amino acid residue or amino acid analog is synthesized, and the complex force between the candidate peptide and the HLA-A24 molecule is determined by CTL. It can be obtained by assessing the recognized power.
  • the sequence of the antigen peptide that is presented by binding to the HLA antigen has regularity (motif).
  • HLA-A24 antigen molecule 8 to: N-terminal of peptides consisting of L1 amino acids
  • the second amino acid is ferruleanine, tyrosine, methionine or tryptophan
  • the C-terminal amino acid is pheralin, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine (Parker KC), etc.
  • peptides obtained by substituting amino acids that can be taken on such motifs with amino acids having similar properties may be accepted as HLA-A24 antigen-binding peptides.
  • the tumor antigen peptide of the present invention contains a substitution with another amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, as an example of such a substitution, the 2nd position and / or the C-terminal of these sequences. Substitution of amino acid residues with other amino acid residues defined on the motif is included.
  • the length of the tumor antigen peptide of the present invention is the length necessary to form a complex with the HLA-A24 molecule and to be presented on the surface of the antigen-presenting cell to induce specific CTL. ⁇ 11 residues, preferably 9-10 residues.
  • the tumor antigen peptide of the present invention can be presented on the surface of an antigen-presenting cell using a longer peptide that can be fragmented in a target cell to give the tumor antigen peptide of the present invention. The use of is within the scope of the present invention.
  • the tumor antigen peptide of the present invention may be modified so as to facilitate introduction into the living body.
  • the tumor antigen peptide of the present invention can be prepared by ordinary peptide synthesis. Such methods include, for example, literature (Peptide Synthesis, Inc., New York, 1966; The Proteins, Vol2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basic and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 198 5; Can be mentioned. [0018] Whether the synthesized candidate peptide binds to the HLA-A24 molecule and is recognized by CTL can be examined according to the following general method.
  • the candidate peptide was Check whether CTLs that specifically recognize pulsed HLA-A24-positive cells are induced.
  • the presence or absence of CTL induction is determined, for example, by measuring the amount of various cytodynamic ins (for example, IFN- ⁇ ) produced by CTL in response to antigen peptide-presenting cells by enzyme immunoassay (ELISA) or the like. You can investigate.
  • 51 Cr-labeled antigen peptide presenting method for measuring the cytotoxicity of CTL against cell 51 Cr release Atsu Si, I nt J. Cancer, 58: . P317,1994) it can be examined by.
  • HLA-A24 positive cells used in the above-mentioned cervical cancer cell line SKG-IIIa (JCRB 0232; RCB1892), C1R — A24 cells (provided by Dr. M. Takiguchi (Kumamoto University, Japan)), esophageal cancer Examples include cells such as cell line KE-4 (FERM BP-5955).
  • the HLA-A24 cDNA expression plasmid was introduced into COS-7 cells (ATCC No. CRL1651) and VA-13 cells (RCB0251), and the obtained peptide was pulsed to the obtained cells.
  • -A24-restricted CTL strain (a CTL strain that specifically reacts with the peptide displayed on the HLA-A24 molecule) is reacted to measure the amount of various cytodynamic ins (eg IFN- ⁇ ) produced by the cells. (J. Exp. Med., 187: 277,1998) ⁇
  • cytodynamic ins eg IFN- ⁇
  • the binding affinity of the tumor antigen peptide to the HLA-A24 molecule is determined by competitive inhibition of binding of the peptide to a radioisotope-labeled standard peptide (SEQ ID NO: 1 or 2) to the HLA antigen. Can be easily measured in a cell-free system (RTKub 0 et al., J. Immunol, 152: 3913, 1994).
  • the tumor antigen peptide of the present invention is an antigen peptide derived from the E6 protein of HPV16, which is possessed by a wide range of human subjects (for example, about 60% of the Japanese) and binds to the HLA-A24 molecule. Since it is presented and recognized by CTL, it is useful for treatment, prevention, diagnosis, etc. of tumors, particularly cervical cancer, in vivo and in vitro.
  • the present invention provides a composition for treating or preventing tumors, which contains at least one tumor antigen peptide of the present invention as an active ingredient.
  • tumor antigen peptides of the present invention are combined, and if necessary, are combined with other tumor antigen peptides and administered to the patient.
  • the composition for treating or preventing tumor of the present invention is administered to a cervical cancer patient who is HLA-A 24 positive and positive for the tumor antigen protein (HPV16 E6 protein) derived from the tumor antigen peptide of the present invention
  • Tumor antigen peptides are presented at high density on the HLA-A24 molecule of antigen-presenting cells, and the displayed HLA-A24 antigen complex-specific CTLs proliferate and destroy the tumor cells.
  • the patient's tumor can be treated or the growth or metastasis of the tumor can be prevented.
  • composition for treating or preventing a tumor containing the tumor antigen peptide of the present invention is administered together with an adjuvant so that cellular immunity is effectively established, or is administered in a particulate dosage form. be able to.
  • an adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7:27 7-289, 1994) can be applied.
  • a preparation capable of efficiently presenting an exogenous antigenic peptide to the HLA antigen such as a ribosome preparation, a particulate preparation bound to beads having a diameter of several meters, a preparation bound to lipid, and the like are also used.
  • the administration method can be appropriately selected from intradermal administration, subcutaneous administration, intravenous injection and the like.
  • the dose of the tumor antigen peptide of the present invention can be adjusted appropriately according to the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient. Usually, 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 1000 mg, more preferably It is preferable to administer this once every few days to several weeks.
  • the tumor antigen peptide of the present invention can be used for inducing antigen-presenting cells in vitro, and such cells are useful for tumor therapy and the like.
  • the present invention provides a method for preparing an antigen-presenting cell, comprising pulsing the tumor antigen peptide of the present invention to an isolated antigen-presenting cell derived from an HLA-A24 positive tumor patient.
  • the “cell having antigen-presenting ability” is not particularly limited as long as it is a cell expressing the HLA-A24 antigen capable of presenting the tumor antigen peptide of the present invention on the cell surface. Preferred are rod cells that are considered to be high.
  • the present invention also provides an antigen-presenting cell prepared by the above method, which presents a complex of the HLA-A24 molecule and the tumor antigen peptide of the present invention on the cell surface.
  • the antigen-presenting cell of the present invention can be an active ingredient of a composition for treating tumors.
  • the therapeutic composition for tumors containing the antigen-presenting cells of the present invention as an active ingredient includes physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), culture medium and the like in order to stably maintain the antigen-presenting cells. It is preferable.
  • Administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the use of the tumor antigen peptide of the present invention at the in vitro mouth includes use in the following adoptive immunotherapy.
  • melanoma in melanoma, a therapeutic effect has been observed in adoptive immunotherapy in which the patient's own tumor-infiltrating T cells are cultured in large quantities outside the body and then returned to the patient (J. Natl. Cancer Inst., 86: 1159, 1994) 0
  • splenocytes are stimulated with tumor antigen peptide TRP-2 in vitro, CTL specific for tumor antigen peptide is propagated, and the CTL is administered to melanoma transplanted mice Therefore, suppression of metastasis has been observed Exp. Med., 185: 453, 1997).
  • the tumor antigen peptide of the present invention can be used to treat tumors by stimulating patient peripheral blood lymphocytes in vitro to increase tumor-specific CTLs and then returning these CTLs to the patient.
  • the present invention provides a method for preparing cytotoxic T cells, comprising stimulating isolated peripheral blood lymphocytes derived from an HLA-A24 positive tumor patient with the tumor antigen peptide of the present invention. To do.
  • the present invention also provides a cytotoxic T cell that specifically recognizes a complex of the HLA-A24 antigen and the tumor antigen peptide of the present invention prepared by the above method.
  • the cytotoxic T cell of the present invention can be an active ingredient of a composition for treating a tumor.
  • the therapeutic composition preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, and the like in order to maintain CTL stably.
  • Administration methods include intravenous administration, skin Intradermal administration and intradermal administration can be mentioned.
  • the CTL promotes the tumor cell damaging action of HLA-A24 positive and tumor antigen protein positive derived from the tumor antigen peptide of the present invention. By destroying tumor cells, the tumor can be treated and further metastasis can be prevented.
  • an antibody against the tumor antigen peptide is prepared according to a conventional method, and if necessary labeled appropriately, the tumor can be used using it.
  • the presence or absence of a tumor can be diagnosed by detecting the presence of an antigen in a sample obtained from a suspected patient (eg, blood, tumor tissue, etc.).
  • a suspected patient eg, blood, tumor tissue, etc.
  • it is also possible to diagnose the presence or absence of a tumor by using the tumor antigen peptide of the present invention itself as a diagnostic agent and detecting the presence of an antibody in a sample such as blood or tumor tissue.
  • the present invention also specifically recognizes the above-described tumor antigen peptide, an antigen-presenting cell that presents / represents the tumor antigen peptide, and a complex of the tumor antigen peptide and HLA-A24 antigen.
  • the tumor antigen peptide of the present invention is also useful as a research reagent in this technical field.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood lymphocytes and plasma were separated by Ficoll-Conrey specific gravity method to prepare PBMC.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • HPV16 positive and HLA-A24 positive cervical cancer cell line SKG-IIIa (RCB1892: RIKEN BioResource Center), HPV16 positive and HLA-A24 negative cervical cancer cell line OMC-1 ( RCB0753: RIKEN BioResource Center) was used.
  • esophageal cancer cell line KE-4 (Department of Surgery, Kurume University School of Medicine, Fukuoka, Japan) (FERM BP-5955) was used as an HPV16 negative and HLA-A24 positive cancer cell line.
  • HPV16-derived E6 protein-derived antigenic peptides were prepared. That is, positions 42-50 (VYDFAFQDL, SEQ ID NO: 3), positions 75-83 (EYR HYCYSL, SEQ ID NO: 1), positions 91-99 (QYNKPLCDL, SEQ ID NO: 4), and 91-100 of the amino acid sequence of HPV16-E6 This is a peptide having the amino acid sequence at position (Q YNKPLCDLL, SEQ ID NO: 2).
  • the amino acid sequence of HPV16-E6 is disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S.A.) data bank: AJ388058!
  • the HPV16 E6 protein-derived antigen peptide prepared was used to repeatedly stimulate PBMC of a cervical cancer patient (Hida N et al., Cancer Immunol Immunot her 51: 219-228, 2002). Specifically, peptide (10 ⁇ g / ml) was added on the first day and in the presence of IL-2 (100 U / ml, Shionogi Co., Osaka, Japan), 45% RPMI-1640, 45% AIM-V In culture medium consisting of medium (Gi bco BRL) and 10% FCS, start culture at 37 ° C, and then double the concentration of peptide (20 ⁇ g / ml) and IL on days 3, 6, and 9.
  • IL-2 100 U / ml, Shionogi Co., Osaka, Japan
  • 45% RPMI-1640 45% AIM-V In culture medium consisting of medium (Gi bco BRL) and 10% FCS
  • C1R-A24 cells C1R lymphoma HLA-A24 molecule-expressing subcell line (Oiso M, et al., Int. J. Cancer 81 : 387-394, 1999)
  • IFN- ⁇ in the culture supernatant after 18 hours was measured by ELISA method.
  • HIV peptides As control peptides, two HIV peptides, a peptide derived from Epstein-Barr virus (EBV) (TYGPVFMCL, SEQ ID NO: 5) and a peptide derived from influenza virus (Flu) (RFYIQMCYEL, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 5) that bind to HLA-A24 molecule 6) was used.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Flu influenza virus
  • anti-HLA-A24 antibody Cat # 0041HA, One Lambde Inc., Canoga Park, CA, USA
  • secondary antibody was used as the primary antibody.
  • the antibody was stained with fluorescein isothiocyanate (FITC) -binding anti-mouse IgG and examined by flow cytometry.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Antisense 5 '-GC AATGTAGGTGTATCTCC A-3' (SEQ ID NO: 8)
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • PCR was performed routinely using TaqDNA polymerase at 30 cycles (54 ° C) (Matsu eda S. et ai., Cancer Immunol Immunother., 53: 479-489, 2004).
  • Cytotoxic activity of CTL induced by peptide stimulation against HLA-A24-positive cervical cancer cell line infected with HPV16 was examined by 51 Cr release test.
  • anti-HLA-class I W6 / 32, mouse IgG2a
  • anti-HLA-class II H-DR-1, mouse IgG 2a
  • anti-CD4 Nu-Th / I, mouse
  • anti-CD8 Nu-Ts / c, mouse IgG2a
  • C1R not labeled with 51 Cr pulsed with the peptide used for stimulation or control HIV peptide -A non-radioactive inhibition assay was also performed using A24 cells.
  • Peptide-specific IgG antibodies were measured according to previously reported methods (Komatsu N et al., Scand J Clin Lab Invest 64: 1-11, 2004). Specifically, individual peptides are bound to colored carboxy beads (Luminex 100 (registered trademark)), and the peptide-bound beads and blood are bound. The plasma was reacted and further reacted with a piotin-labeled anti-HgG (y) antibody and streptavidin. After the reaction, it was measured by fluorescence flowmetry (xMAP technology). The specificity of the IgG antibody was confirmed by culturing plasma on a plate coated with the corresponding peptide, absorbing the IgG antibody in the plasma, and measuring the level of the IgG antibody after absorption.
  • PBMCs from 13 HLA-A24-positive cervical cancer patients (Pt # l to Pt # 13) and 6 healthy individuals (HD # 1 to HD # 6) were stimulated with each peptide, and the stimulating peptide specific Induction of CTL was examined using IFN- ⁇ production as an index.
  • Stimulation with PBMC peptide of HLA-A24-positive cervical cancer patients was performed according to the method described by Hida et al. After 14 days, the amount of IFN- ⁇ specific to the stimulated peptide released into the medium was examined by ELISA. Each peptide was examined at 4 uels. The results are shown in Table 1.
  • the score 1 in Table 1 indicates the strength of binding of individual peptides to the HLA-A24 molecule.
  • Cervical cancer cells SKG-1 (IFO 50308: JCRB Cell Bank), SKG-Ilb (IFO 50311: JCRB Cell Bank), and OMC-1 (squamous cell carcinoma), SKG-Ilia and OMC-4 (Dep artment of ubstencs ana Gynecology, usaka Medical ollege, Japan [Kotetsu A / j (adenocarcinoma), ovarian cancer cell OMC-3 (established at Department of Obsterics and Gynecology, Osaka Medical College, Japan)
  • the results of the HPV16-E6 protein expression in the esophageal cancer cell line KE-4 examined by PCR and Western blotting are shown in Figures 1A and B.
  • Fig. 1C shows the results of analysis of HLA-A24 molecule expression by flow cytometry.
  • HPV16 infection was confirmed in cervical cancer cell lines SKA-IIIa, SKG-mb and OMC-1.
  • HPV16 infection was not observed in the negative control esophageal cancer cell line KE-4.
  • SKG-IIIa was confirmed to be negative for HLA-A24 positive force OMC-1 (FIG. 1B).
  • cytotoxic activity of CTLs derived from cervical cancer patients induced by stimulation with HPV16-E6 75-83 peptide or HPV16-E6 91-100 peptide against cervical cancer cells was examined.
  • PBMCs from 5 HLA-A24 positive cervical cancer patients ( ⁇ # 2, ⁇ # 6, ⁇ # 7, ⁇ # 11, ⁇ # 12) were stimulated with individual peptides, and 3 types of target cells (HLA- Cytotoxic activity against A24 positive HPV16 positive SKG-IIIa, HLA-A24 negative HPV16 positive OMC-1, and HLA-A24 positive HPV16 negative PHA-stimulated T cells was examined in a 51 Cr release test. The result is shown in figure 2.
  • HPV16-E6 protein-derived peptides HPV16-E6 42-50, HPV16-E6 75-83, HPV16
  • IgG antibody strength specific to E6 91-99 and HPV16-E6 91-100 The ability to be identified in the plasma of cervical cancer patients and healthy individuals was measured by fluorescence flowmetry. The results are shown in Table 2. In the table, each numerical value indicates the fluorescence intensity.
  • cervical cancer-reactive CTLs are presented by antigen-presenting cells in combination with HLA-A24 molecules expressed in approximately 60% of Japanese and approximately 20% of Caucasians.
  • HPV16-E6 75-83 peptide and HPV16-E6 91-100 peptide were identified as antigen peptides derived from E6 protein of HPV16 capable of inducing HPV16. These peptides are useful for the purposes of the present invention.
  • IgG antibodies were induced against the vaccinated peptide
  • the tumor antigen peptide of the present invention induces HLA-A24-restricted CTLs and is useful for the treatment and prevention of cervical cancer.
  • HPV16-E6 91-100 peptide is an efficient CTL induction. It is predicted that it is extremely useful as an active ingredient in cancer vaccine therapy, which is highly likely to be an antigenic peptide that is capable of being recognized by IgG antibodies.
  • HLA-A24-positive cervical cancer in which almost 60% of Asian races, particularly Japanese, are positive and about 20% of whites are positive. And the development of methods to prevent metastasis can be greatly facilitated.

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Abstract

　本発明は、HLA-A24陽性子宮頸癌に有効な、以下の腫瘍抗原ペプチドに関する： （１）配列番号１若しくは２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または （２）配列番号１若しくは２に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつHLA-A24分子と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得るペプチド。

Description

明 細 書
HLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、 HLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドに関し、さらに詳しくは HLA-A24陽 性子宮頸癌患者の細胞傷害性 Tリンパ球と IgG抗体に認識されるヒトパピローマウイ ルスタイプ 16の E6蛋白に由来する腫瘍抗原ペプチドに関する。
背景技術
[0002] 近年、 T細胞により認識されるヒト癌関連抗原をコードする遺伝子や抗原由来ぺプ チドが多数同定され、免疫療法としての癌ワクチン療法の臨床試験が実施されてい る (非特許文献 1-2)。また、本発明者らのグループにより種々の上皮性癌に対するべ プチドワクチン療法が施行されている（非特許文献 3-7)。子宮頸癌に対しても癌ワク チン療法が試みられ、有効例の報告もあるが、それらワクチン療法に用いられた癌抗 原ペプチドの多くは、正常細胞にもある程度発現している自己抗原蛋白に由来する ものであった。従って、子宮頸癌に対する有効なワクチン療法を確立するには、有用 な新規抗原ペプチドを同定する必要がある。
[0003] 子宮頸癌の大部分は、ヒトパピローマウィルス (HPV)タイプ 16 (以下、「HPV16」と略 す)またはタイプ 18 (以下、「HPV18」と略す）に感染して 、ることが知られて 、る（非特 許文献 8、 9)。さらに、これらのタイプの HPVの E6と E7蛋白はそれぞれ p53および RB 腫瘍抑制遺伝子を不活化することにより、悪性化への形質変換やその維持に関与し ていることが知られている (非特許文献 10、 11)。よって、非自己抗原である HPV16また は HPV18の E6蛋白や E7蛋白を標的とした免疫療法は、子宮頸癌に対して非常に有 効な治療法になると考えられる。実際に、 HPV16特異的細胞傷害性 Tリンパ球 (CTL) が子宮頸癌患者の末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球中に同定されている（非特許 文献 12-14)。さらに、 HLA-A2分子に提示される HPV16の E7蛋白由来抗原ペプチド が数個同定されている (非特許文献 15-17)。また、 HPV16の E6および E7蛋白由来の ペプチド断片について、様々なタイプの HLA分子（Al、 A2、 A3、 All, A24、 A29、 B7 、 B8、 B18、 B27、 B35、 B44、 B51および B62)との結合の可能性が示唆されている（特 許文献 1、特許文献 2)。し力しながら、同文献中でも、 HLA-A24分子との結合能が示 唆されたペプチドによるペプチド特異的 CTLの誘導や誘導された CTLの子宮頸癌細 胞に対する細胞傷害活性は検討されて!ヽな ヽ。
[0004] このように、 日本人の約 6割および白人の約 2割が発現する HLA-A24分子に提示さ れ、子宮頸癌反応性 CTLを誘導できる HPV16由来の E6または E7由来抗原ペプチド は未だ同定されておらず、癌治療の発展のためには、そのようなペプチドを同定する ことが強く求められている。
[0005] 特許文献 1：米国特許第 6,783,763号明細書
特許文献 2：米国特許公開公報 2005/0033025
非特許文献 1 :ブーン（Βοοη,Τ.)等、 Immunol Today 81:p267- 268,1997
非特許文献 2 :ローゼンバーグ (Rosenberg SA)、 Immunity 10:p281-287,1999 非特許文献 3 :タナカ（Tanaka S)等、 J Immunother 26:p357- 366,2003
非特許文献 4:ッダ（Tsuda N)等、 J. Immunother 27: p60- 72,2004
非特許文献 5 :ノグチ（Noguchi M)等、 Prostate 57: p80-92, 2003
非特許文献 6 :ミネ（Mine T)等、 Cancer Science 94: p548- 556, 2003
非特許文献 7 :サトウ（Sato Y)等、 Cancer Science 94: p802- 808, 2003
非特許文献 8 :ウォルブ一マース（Walboomers JM)等、 J Pathol 181: p253- 254, 1997 非特許文献 9 :ムノズ (Munoz N)等、 N Engl J Med 348: p518- 527, 2003
非特許文献 10 :ミュンガー（Munger K)等、 J Virol 63: p4417-4421, 1989
非特許文献 11 :フォンネベル（von Knebel DM)等、 Int J Cancer 51: p831- 834, 1992 非特許文献 12 :ボルシービツチ（Borysiewicz LK)等、 Lancet 347: pl523- 1527, 1996 非特許文献 13 :レッシング（Ressing ME)等、 Cancer Res 56: p582- 588, 1996 非特許文献 14:エバンス（Evans EM)等、 Cancer Res. 57: p2943- 2950, 1997 非特許文献 15 :ニジマン（^』 & HW)等、 J Immunother 14: pl21- 126, 1993 非特許文献 16 :カスト（Kast WM)等、 J Immunol 152: p3904- 3912, 1994
非特許文献 17 :レッシング（Ressing ME)等、 J Immunol 154: p5934-5943, 1995 発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0006] 本発明は、 HLA-A24陽性子宮頸癌患者にぉ 、て子宮頸癌反応性の細胞傷害性 T 細胞 (CTL)を誘導しうる HPV16の E6蛋白由来抗原ペプチドを同定することを目的と する。
また、本発明は、上記ペプチドを用いる、子宮頸癌の予防および治療のための手 段を提供することを目的とする。
本発明のその他の目的は、明細書を通して明らかとなるであろう。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の腫瘍抗原ペプチドを提供する：
(1)配列番号 1若しくは 2に示されるアミノ酸配列力 なるペプチド、または
(2)配列番号 1若しくは 2に示されるアミノ酸配列にぉ 、て 1若しくは複数のアミノ酸が 欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ HLA-A24分子と結 合して細胞傷害性 T細胞により認識され得るペプチド。
また、本発明は、前記腫瘍抗原ペプチドを有効成分として含有する腫瘍の治療ま たは予防用組成物、前記腫瘍抗原ペプチドを患者に投与することを含む腫瘍の治 療または予防方法、および腫瘍の治療または予防用組成物を製造するための前記 腫瘍抗原ペプチドの使用、を提供する。
さらに、本発明は、 HLA-A24陽性腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する 細胞に前記腫瘍抗原ペプチドをパルスすることを含む抗原提示細胞を調製する方法 、および当該方法により調製された抗原提示細胞を提供する。
また、本発明は、 HLA-A24陽性腫瘍患者由来の単離された末梢血リンパ球を前記 腫瘍抗原ペプチドで刺激することを含む細胞傷害性 T細胞を調製する方法、および 当該方法により調製された細胞傷害性 T細胞を提供する。
発明の効果
[0008] 本発明の腫瘍抗原ペプチドは、 HLA-A24分子と複合体を形成し、該ペプチドと HL A-A24分子との複合体を特異的に認識する CTLを効果的に誘導することができる。 また、本発明の腫瘍抗原ペプチドは、アジア人種、特に日本人の多数が陽性である HLA-A24拘束性であることから、これらの集団における HLA-A24陽性の子宮頸癌の 診断、予防、治療、さらには転移の予防のための有効な手段の開発を促進するという 効果をも奏する。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]子宮頸癌細胞 SKG- 1、 SKG- IIIb、および OMC-1 (以上、扁平上皮癌）、同じく SK G-IIIaおよび OMC-4 (以上、腺癌）、卵巣癌細胞 OMC-3、並びに食道癌細胞株 KE- 4における HPV16 E6蛋白の発現を、 PCR法 (A)およびウェスタンブロット法（B)で検討 した結果を示す写真、および子宮頸癌細胞 SKG-IIIaと OMC-1の HLA-A24分子の発 現をフローサイトメトリー法で解析した結果を示すグラフ (C)である。
[図 2]5名の HLA-A24陽性子宮頸癌患者の PBMCを各ペプチドで刺激して誘導され る CTLの、 3種類の標的細胞（HLA- A24陽性 HPV16陽性 SKG- IIIa、 HLA- A24陰性 H PV16陽性 OMC-1と HLA-A24陽性 HPV16陰性 PHA刺激 T細胞）に対する細胞傷害 活性を51 Cr放出試験で検討した結果を示すグラフである。
[図 3] 2名の HLA-A24陽性子宮頸癌患者の PBMCを各ペプチドで刺激し、 3種類の標 的細胞に対する細胞傷害活性を検討する51 Cr放出試験において、抗 HLA-クラス I ( W6/32,マウス IgG2a)、抗 HLA—クラス Π (Η— DR— 1,マウス IgG2a)、抗 CD4 (Nu— Th/I,マ ウス IgG2a)および、抗 CD8 (Nu- Ts/c,マウス IgG2a)抗体を各 10 /z g/mlカ卩え、その影 響を検討した結果を示すグラフである。
[図 4]図 3と同様の試験において、子宮頸癌細胞に対する細胞傷害活性のペプチド 特異的 CTLへの依存を確認するために、刺激に用いたペプチド、または、コントロー ル HIVペプチドをパルスした51 Crで標識して!/、な!/、C1R-A24細胞を添カ卩して行う非放 射性阻害検定の結果を示すグラフである。
[図 5] 2名の HLA-A24陽性子宮頸癌患者由来の血漿中のペプチド反応性 IgGを対応 するペプチドで吸収し、 IgGのペプチド特異性を確認した結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 本明細書および請求の範囲にぉ 、て、「腫瘍抗原ペプチド」とは、 HLA-A24分子と 結合して細胞傷害性 T細胞 (CTL)により認識され得る、即ち、 HLA-A24陽性子宮頸 癌に対して有効な CTLを誘導し得る、 HLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドを指す。
[0011] 本発明に関連して、「HLA-A24分子と結合して CTLにより認識され得る」とは、本発 明の腫瘍抗原ペプチドが HLA-A24分子と結合して複合体を形成し、かかる複合体を CTLが認識できることをいう。換言すれば、本発明の腫瘍抗原ペプチドが、 HLA-A24 分子との結合活性を有し、かつ、 HLA-A24分子との複合体の形で、ペプチド特異的 な CTLを誘導する活性を有することを意味する。
[0012] 本発明に関連して、「抗原提示細胞」とは、 HLA-A24拘束性抗原ペプチドと HLA-A 24分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を指す。従って、抗原提示細胞は、 H LA-A24拘束性の本発明の腫瘍抗原ペプチドと HLA-A24分子との複合体を細胞表 面に提示することにより、 CTLの活性ィ匕をもたらす機能を有する。そのような細胞には 、 CTL細胞障害作用の標的である腫瘍細胞も含まれる。
[0013] 本発明の腫瘍抗原ペプチドは、配列番号 1若しくは 2に示されるアミノ酸配列を有 するペプチド、および該配列において少なくとも 1つのアミノ酸の欠失、置換、および /または付カ卩により導かれる改変されたアミノ酸配列を有し、 HLA-A24分子と結合して 特異的な CTLに認識され得るペプチドを含む。アミノ酸の改変は、具体的には、 1〜 数個、好ましくは 1個または 2個のアミノ酸における欠失、置換または付加である。変 異が他のアミノ酸による置換または付加を含む場合、他のアミノ酸は、天然のアミノ酸 またはアミノ酸アナログであってよぐアミノ酸アナログとしては、種々のアミノ酸の N— ァシル化物、 O—ァシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げ られる。配列番号 1または 2に示されるアミノ酸配列においてアミノ酸の改変を有する 腫瘍抗原ペプチドは、配列番号 1若しくは 2に記載のアミノ酸配列の 1以上、好ましく は 1〜数個、より好ましくは 1または 2個のアミノ酸残基が欠失している力 他のアミノ 酸残基またはアミノ酸アナログで置換された、またはそれが付加された候補ペプチド を合成し、該候補ペプチドと HLA-A24分子との複合体力 CTLにより認識されるカゝ否 力をアツセィすることにより、得ることができる。
[0014] HLA抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性 (モチーフ）があり 、 HLA-A24抗原（分子）の場合、 8〜： L 1アミノ酸よりなるペプチドのうちの N末端から 2 番目のアミノ酸がフエ-ルァラニン、チロシン、メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチ ォニンであることが知られている（パーカー（Parker KC)等、 J Immunol 152: 163-175, 1994、およびラメンシー（Rammensee HG)等、 Immunogenetics 41: 178-228, 1995)。 また、このようなモチーフ上とり得るアミノ酸を類似の性質を持つアミノ酸で置換して得 られるペプチドも HLA-A24抗原結合性ペプチドとして許容される可能性がある。 本発明の腫瘍抗原ペプチドが、配列番号 1若しくは 2で示されるアミノ酸配列にお いて他のアミノ酸による置換を含む場合、そのような置換の例として、これら配列の第 2位および/または C末端のアミノ酸残基の、モチーフ上で規定される他のアミノ酸残 基による置換が含まれる。具体的には、配列番号 1若しくは 2に示されるアミノ酸配列 中第 2位のチロシンの、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンによる置換、 および/または C末端のロイシンの、フエ-ルァラニン、イソロイシン、トリプトファンまた はメチォニンによる置換が挙げられる。それらのペプチドは、 HLA-A24分子と結合し て CTLにより認識されるという活性を有するものである。
[0015] 本発明の腫瘍抗原ペプチドの長さは、 HLA-A24分子と複合体を形成し抗原提示 細胞の表面に提示されて特異的な CTLを誘導するのに必要な長さ、通常、 8〜11残 基、好ましくは 9〜10残基である。本発明の腫瘍抗原ペプチドは、標的細胞内で断 片化されて本発明の腫瘍抗原ペプチドを与えることができるより長いペプチドを用い て抗原提示細胞の表面に提示させることもでき、そのようなペプチドの使用は本発明 の範囲内である。
[0016] また、 HLA-A24分子と複合体を形成し、抗原提示細胞の表面に提示されて特異的 な CTLに認識されることを条件として、腫瘍抗原ペプチドの N末端や遊離のアミノ基 には、ホルミル基、ァセチル基、 t—ブトキシカルボ-ル (t Boc)基等が結合してい てもよく、腫瘍抗原ペプチドの C末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、ェチ ル基、 t ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。さらに、本発明の腫瘍抗 原ペプチドは、生体内への導入を容易にするように、修飾されていてもよい。
[0017] 本発明の腫瘍抗原ペプチドは通常のペプチド合成により調製することができる。そ のような方法として、例えば、文献（ぺプタイド'シンセシス（Peptide Synthesis) , Inc., New York, 1966;ザ'プロテインズ（The Proteins) ,Vol2, Academic Press Inc., New Yo rk, 1976 ;ペプチド合成，丸善 (株）， 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）， 198 5 ;医薬品の開発続第十四卷 'ペプチド合成，広川書店, 1991)などに記載されている 方法が挙げられる。 [0018] 合成した候補ペプチドが HLA-A24分子に結合して CTLにより認識されるか否かは 、以下のような一般的な方法に準じて調べることができる。
例えば、 J.Immunol., 154, p2257, 1995に記載の方法に従い、 HLA-A24陽性のヒト 力も末梢血リンパ球を単離し、インビトロで候補ペプチドを添加して刺激した場合に、 該候補ペプチドをパルスした HLA-A24陽性細胞を特異的に認識する CTLが誘導さ れるか否かを調べる。ここで、 CTL誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に 反応して CTLが産生する種々のサイト力イン (例えば IFN- γ )の量を酵素免疫測定法 (ELISA)等により測定することによって調べることができる。または、 51Crで標識した抗 原ペプチド提示細胞に対する CTLの傷害性を測定する方法 (51Crリリースアツセィ、 I nt. J. Cancer, 58:p317,1994)によっても調べることができる。前記アツセィで用いる H LA-A24陽性細胞としては、子宮頸癌細胞株 SKG-IIIa (JCRB 0232 ;RCB1892)、 C1R — A24細胞（Dr. M. Takiguchi (Kumamoto University, Japan)より供与)、食道癌細胞 株 KE-4 (FERM BP-5955)などの細胞が挙げられる。
[0019] さらに、 HLA- A24cDNA発現プラスミドを COS- 7細胞（ATCC No.CRL1651)や VA- 1 3細胞（RCB0251)に導入し、得られた細胞に対して前記候補ペプチドをパルスし、 H LA-A24拘束性の CTL株 (HLA-A24分子に提示されたペプチドに特異的に反応する CTL株）を反応させ、該細胞が産生する種々のサイト力イン (例えば IFN- γ )の量を測 定することによつても、調べることができる（J. Exp.Med., 187:277,1998) ο以上のような 種々のアツセィ法は当業者に既知であり、例えば、 W097/46676等にも詳細に記載さ れている。
[0020] なお、腫瘍抗原ペプチドの HLA-A24分子に対する結合親和性は、該ペプチドとラ ジォアイソトープで標識された標準ペプチド (配列番号 1若しくは 2)との HLA抗原へ の結合の競合阻害アツセィにより、無細胞系で容易に測定することができる（R.T.Kub 0ら、 J.Immunol, 152:3913, 1994)。
[0021] 本発明の腫瘍抗原ペプチドは HPV16の E6蛋白由来の抗原ペプチドであり、広範な ヒト対象が保有している（例えば、 日本人の約 60%が保有) HLA-A24分子に結合し て提示され、 CTLにより認識されることから、インビボおよびインビトロで、腫瘍、特に 子宮頸癌の治療、予防、診断などに有用である。 [0022] 本発明は、本発明の腫瘍抗原ペプチドの少なくとも 1種を有効成分として含有する 腫瘍の治療または予防用組成物を提供する。
腫瘍の治療または予防を目的とする使用に際しては、本発明の腫瘍抗原ペプチド の少なくとも 1種または 2種以上を組み合わせ、要すれば他の腫瘍抗原ペプチド等と 組み合わせて患者に投与する。本発明の腫瘍の治療または予防用組成物を HLA-A 24陽性であり、かつ本発明の腫瘍抗原ペプチドが由来する腫瘍抗原蛋白（HPV16の E6蛋白）に関して陽性の子宮頸癌患者に投与すると、抗原提示細胞の HLA-A24分 子に腫瘍抗原ペプチドが高密度に提示され、提示された HLA-A24抗原複合体特異 的 CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊する。その結果、患者の腫瘍を治療し、または腫 瘍の増殖または転移を予防することができる。
[0023] 本発明の腫瘍抗原ペプチドを含有する腫瘍の治療または予防用組成物は、細胞 性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にし て投与したりすることができる。アジュバントとしては、文献（Clin.Microbiol.Rev., 7:27 7-289,1994)に記載のものなどが応用可能である。また、リボソーム製剤、直径数 m のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤など外因性の抗原 ペプチドを HLA抗原へ効率良く抗原提示させ得る製剤なども用いられる。投与方法 としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射など、適宜選択することができる。本発明 の腫瘍抗原ペプチドの投与量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等に応じて適 宜調整することができる力 通常、 0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg 、より好ましくは 0.1mg〜10mgであり、これを数日ないし数週に 1回投与するのが好ま しい。
[0024] また、本発明の腫瘍抗原ペプチドは、インビトロで抗原提示細胞を誘導するために 用いることができ、そのような細胞は腫瘍の治療等に有用である。
すなわち、本発明は、 HLA-A24陽性腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有 する細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドをパルスすることを含む、抗原提示細胞を調 製する方法を提供する。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原 ペプチドを提示可能な HLA-A24抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に 限定されな ヽが、特に抗原提示能が高 ヽとされる榭状細胞が好まし ヽ。 また、本発明は、前記方法によって調製された、 HLA-A24分子と本発明の腫瘍抗 原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を提供する。
[0025] 本発明の抗原提示細胞は、腫瘍の治療用組成物の有効成分となりうる。
本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有する腫瘍の治療用組成物は、抗原 提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、培 地等を含むことが好ましい。投与方法として、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙 げられる。上記の腫瘍治療用組成物を患者の体内に戻すと、 HLA-A24陽性かつ本 発明の腫瘍抗原ペプチドの由来である腫瘍抗原蛋白陽性の患者の体内で効率良く 特異的な CTLが誘導され、腫瘍を治療し、さらには転移を予防することができる。
[0026] さらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドのインビト口での利用法として、以下の養子免 疫療法における利用が挙げられる。
すなわち、メラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に 培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている (J. Natl.Ca ncer.Inst.,86:1159、 1994) 0またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をインビトロで 腫瘍抗原ペプチド TRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的な CTLを増殖させ、 該 CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている Exp.Med., 185:453,1997)。これは、抗原提示細胞の HLA抗原と腫瘍抗原ペプチドと の複合体を特異的に認識する CTLをインビトロで増殖させた結果に基づくものである 。本発明の腫瘍抗原ペプチドを用いて、インビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して 腫瘍特異的 CTLを増やした後、この CTLを患者に戻すことにより腫瘍を治療すること が可能である。
[0027] よって、本発明は、 HLA-A24陽性腫瘍患者由来の単離された末梢血リンパ球を本 発明の腫瘍抗原ペプチドで刺激することを含む、細胞傷害性 T細胞を調製する方法 を提供する。また、本発明は、前記方法により調製された、 HLA-A24抗原と本発明の 腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性 T細胞を提供する。
[0028] 本発明の細胞傷害性 T細胞は、腫瘍の治療用組成物の有効成分となりうる。
前記治療用組成物は、 CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生 理食塩水 (PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮 下投与、皮内投与が挙げられる。上記の治療用組成物を患者の体内に戻すことによ り、 HLA-A24陽性かつ本発明の腫瘍抗原ペプチドの由来である腫瘍抗原蛋白陽性 の患者の体内で CTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊する ことにより、腫瘍を治療し、さらには転移を予防することができる。
[0029] また、本発明の腫瘍抗原ペプチドを腫瘍の診断に用いるには、例えば、常法に従 つて該腫瘍抗原ペプチドに対する抗体を調製し、要すれば適宜標識し、それを用い て腫瘍が疑われる患者カゝら得た試料 (例えば血液，腫瘍組織など）中の抗原の存在 を検出することにより腫瘍の有無を診断することができる。さら〖こ、本発明の腫瘍抗原 ペプチドそのものを診断薬に用い、前記血液または腫瘍組織などの試料中の抗体の 存在を検出することにより腫瘍の有無を診断することも可能である。
[0030] 本発明はまた、上記の腫瘍抗原ペプチド、該腫瘍抗原ペプチドを提示して!/ヽる抗 原提示細胞、該腫瘍抗原ペプチドと HLA-A24抗原との複合体を特異的に認識する 細胞傷害性 T細胞を用いて腫瘍を治療または予防、または診断する方法を提供する 。さらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドは、当該技術分野における研究用試薬としても 有用である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例
[0031] 実施例 1 HPV-16 E6蛋白由来の HLA-A24拘束性腫瘍抗原ペプチドの調製
I. 腫瘍抗原ペプチドの同定
1-1.材料と実験方法
末梢血単核球（PBMC)の調製
ヒト免疫不全ウィルス (HIV)が陰性である子宮頸癌患者および健常人力 20 mlを 採血し、 Ficoll-Conrey比重法により末梢血リンパ球と血漿を分離し、 PBMCを調製し た。
[0032] 細胞株
HPV16陽性で HLA-A24陽性子宮頸癌細胞株として SKG-IIIa(RCB1892: RIKEN Bi oResource Center)を、 HPV16陽性で HLA-A24陰性子宮頸癌細胞株として OMC-1 ( RCB0753: RIKEN BioResource Center)を用いた。また、 HPV16陰性で HLA- A24陽 性癌細胞株として食道癌細胞株 KE-4 (Department of Surgery, Kurume University S chool of Medicine, Fukuoka, Japanにおいて榭立（FERM BP- 5955) )を用いた。
[0033] ペプチド
既に報告されている HLA-A24結合モチーフに基づき (パーカー等、前掲、およびラ メンシ一等、前掲)、 HPV16由来で E6蛋白由来抗原ペプチドを 4種類準備した。即ち 、 HPV16- E6のアミノ酸配列の 42- 50位 (VYDFAFQDL、配列番号 3)、 75- 83位（EYR HYCYSL、配列番号 1)、 91- 99位（QYNKPLCDL、配列番号 4)、および 91- 100位（Q YNKPLCDLL,配列番号 2)のアミノ酸配列を有するペプチドである。なお、 HPV16-E 6のアミノ酸配列は、 NCBI (National Center for Biotechnology Information, U. S. A.) のデータバンク: AJ388058に開示されて!、る。
[0034] ペプチド CTTJff,駆 の 討
文献記載の方法に従い、準備した HPV16の E6蛋白由来抗原ペプチドを用いて子 宫頸癌患者の PBMCを繰り返し刺激した (ヒダ（Hida N)等、 Cancer Immunol Immunot her 51: 219-228, 2002)。具体的には，初日にペプチド (10 μ g/ml)を加えて IL- 2 (100 U/ml、 Shionogi Co., Osaka, Japan)の存在下、 45% RPMI- 1640、 45%AIM- V培地 (Gi bco BRL)、 10% FCSからなる培養液中で、温度 37°Cで培養を開始した後、 3、 6、 9日 目に 2倍濃度のペプチド (20 μ g/ml)と IL-2 (100 U/ml)を含む培養液で半分の培養 液を交換した。 14日後に、培養リンパ球を回収し、刺激に用いたぺプチをパルスした C1R- A24細胞（C1Rリンパ腫の HLA- A24分子発現亜細胞株（Oiso M, et al.， Int. J. Cancer 81: 387-394, 1999) )と混合培養し、 18時間後の培養上清中の IFN- γを ELIS A法で測定した。コントロールペプチドとして 2つの HIVペプチド、 HLA-A24分子に結 合性を有する Epstein- Barrウィルス（EBV)由来のペプチド（TYGPVFMCL、配列番 号 5)およびインフルエンザウイルス（Flu)由来のペプチド（RFYIQMCYEL、配列番号 6)、を用いた。
[0035] フローサイトメトリー
癌細胞株の HLA-A24分子の細胞表面での発現を検討するために、一次抗体とし て抗 HLA- A24抗体（Cat#0041HA, One Lambde Inc., Canoga Park, CA, USA)、 2次 抗体としてフルォレセインイソチオシァネート（FITC)結合性抗マウス IgGで染色し、フ ローサイトメトリー法で検討した。
[0036] PCR
癌細胞よりトータル RNAを抽出後、 Superscript (登録商標） Preamplication system (I nvitrogen)を用いて cDNAを合成した。次いで、以下のプライマーを用いて DNAを増 幅した。
センス： 5 '-GTGTGTACTGCAAGCAACAG-3 ' (配列番号 7)
アンチセンス： 5 ' -GC AATGTAGGTGTATCTCC A-3 ' (配列番号 8)
また、コントロールとしてグリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)を以 下のプライマーで増幅した。
センス： 5 '-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 ' (配列番号 9)
アンチセンス： 5し GGTCCACCACTGACACGTTG- 3' (配列番号 10)
PCRは、 TaqDNAポリメラーゼを用いて、 30サイクル (54°C)で常法通り行った（Matsu eda S. et ai., Cancer Immunol Immunother., 53: 479-489, 2004)。
[0037] M ww
ペプチド刺激により誘導した CTLの、 HPV16が感染して 、る HLA-A24陽性子宮頸 癌細胞株に対する細胞傷害活性を、 51Cr遊離試験により検討した。また、 51Cr遊離試 験時に、抗 HLA-クラス I(W6/32,マウス IgG2a)、抗 HLA-クラス II (H- DR- 1、マウス IgG 2a)、抗 CD4 (Nu- Th/I、マウス IgG2a)および抗 CD8 (Nu- Ts/c、マウス IgG2a)抗体を 各 10 g/ml加え、細胞傷害活性を担う細胞を検討した。さらに、子宮頸癌細胞に対 する細胞傷害活性がペプチド特異的 CTLに依存することを確認するために、刺激に 用いたペプチド、または、コントロール HIVペプチドをパルスした51 Crで標識していな い C1R- A24細胞を添カ卩して行う、非放射性阻害検定（cold inhibition assay)も行った
[0038] ペプチド特異的 IgGの測定
ペプチド特異的 IgG抗体は、既に報告した方法に従い測定した（コマツ (Komatsu N )等、 Scand J Clin Lab Invest 64: 1-11, 2004)。具体的には、個々のペプチドを彩色 カルボキシビーズ (Luminex 100(登録商標））に結合し、当該ペプチド結合ビーズと血 漿を反応させ、さらにピオチン標識抗ヒ HgG( y )抗体ならびにストレプトアビジンと反 応させた。反応後、蛍光フローメトリー法 (xMAP技術）により測定した。 IgG抗体の特 異性は、対応するペプチドをコートしたプレートで血漿を培養して血漿中の IgG抗体 を吸収し、吸収後の IgG抗体のレベルを測定することによって確認した。
[0039] 統計処理
結果の統計学的有意差は、 two-tailedスチューデント t-testで検討し、 P〈0.05を有 总とした o
[0040] 1-2.結果
1) HPV16- E6蛋白由来ペプチドによる CTLの誘導
HLA-A24分子への結合モチーフに基づいて調製した、 HPV16の E6蛋白由来の 4 種の候補ペプチドと、対照として、 EBVおよび Flu由来の HLA-A24結合性ペプチドを 用いた (表 1)。
13人の HLA-A24陽性子宮頸癌患者（Pt#l〜Pt#13)および 6人の健常人（HD#1〜H D#6)から得た PBMCを各ペプチドで刺激し、刺激ペプチド特異的 CTLの誘導を、 IFN - γの産生を指標として、検討した。 HLA-A24陽性子宮頸癌患者の PBMCのぺプチ ドによる刺激は、ヒダ等 (前掲）により記載された方法に従って行った。 14日後、培地 中に遊離された、刺激したペプチドに特異的な IFN- γの量を ELISAで調べた。それ ぞれのペプチドに関して、 4ゥエルで検討した。結果を表 1に示す。表 1のスコア一は 、個々のペプチドの HLA-A24分子への結合の強さを示している。
[0041] [表 1]
HP
Figure imgf000015_0001
V16-E6 91-99ペプチドを用いた場合には、 13人中 3人、 HPV16-E6 91-100ペプチド を用いた場合には、 13人中 5人の患者力も得た PBMC試料でペプチド特異的 CTLの 誘導が認められた。 HPV16-E6 42-50ペプチドの場合には、ペプチド特異的 CTLが 誘導されたのは 13人中 1人であった。
[0042] 2) HPV16- E6蛋白由来ペプチドで刺激した CTLの子宮頸癌に対する細胞傷害活性 2— 1)子宮頸癌細胞株での HPV16と HLA-A24分子の発現
子宮頸癌細胞 SKG- 1 (IFO 50308: JCRB Cell Bank)、 SKG- Illb (IFO 50311: JCRB Cell Bank)、および OMC- 1 (以上、扁平上皮癌）、同じく SKG- Iliaおよび OMC- 4 (Dep artment of ubstencs ana Gynecology, usaka Medicalし ollege, Japan【こて榭 A/j (以 上、腺癌）、卵巣癌細胞 OMC- 3 (Department of Obsterics and Gynecology, Osaka Medical College, Japanにて榭立）、並びに食道癌細胞株 KE- 4における HPV16- E6 蛋白の発現を PCR法およびウェスタンブロット法で検討した結果を、図 1Aおよび Bに 示す。また、子宮頸癌細胞 SKG-IIIaおよび OMC-1における HLA-A24分子の発現を フローサイトメトリー法で解析した結果を図 1Cに示す。
図 1 Aおよび Bに示すように、子宮頸癌細胞株 SKA-IIIa、 SKG-mbおよび OMC-1に HPV16の感染が確認された。一方、陰性のコントロールである食道癌細胞株 KE-4に は HPV16の感染を認めなかった。また、 SKG-IIIaは、 HLA-A24陽性である力 OMC- 1は陰性であることが確認された（図 1B)。
[0043] 2- 2) HPV16-E6ペプチドで刺激誘導した CTLの子宮頸癌細胞に対する細胞傷害 活性
HPV16-E6 75-83ペプチド、または、 HPV16-E6 91-100ペプチドの刺激で誘導した 子宮頸癌患者由来 CTLの子宮頸癌細胞に対する細胞傷害活性を検討した。 5名の HLA-A24陽性子宮頸癌患者（ΡΤ#2、 ΡΤ#6、 ΡΤ#7、 ΡΤ#11、 ΡΤ#12)の PBMCを個々 のペプチドで刺激し、 3種類の標的細胞（HLA-A24陽性 HPV16陽性 SKG-IIIa、 HLA- A24陰性 HPV16陽性 OMC- 1、および HLA- A24陽性 HPV16陰性の PHA刺激 T細胞） に対する細胞傷害活性を51 Cr放出試験で検討した。結果を図 2に示す。
図 2に示すように、 4人の HLA-A24陽性子宮頸癌患者 (Pt#2、 Pt#6、 Pt#7、 Pt#12)の PBMCから HPV16- E6 75- 83ペプチドで誘導した CTLは、 HPV16陽性であり HLA- A2 4陰性の OMC-1と PHA (フイトへマグルチニン）で刺激して誘導した HLA-A24陽性 T 細胞に対するよりも、 HPV16と HLA-A24の両者について陽性である SKG-IIIaに対し て、より高い細胞傷害活性を示した。同様の結果が、 3人の HLA-A24陽性子宮頸癌 患者 (Pt#6、 Pt#7、 Pt#ll)の PBMCから HPV16- E6 91- 100ペプチドで誘導した CTLに ついても認められた。
[0044] 3) HPV16- E6蛋白由来ペプチドで刺激した CTLの子宮頸癌に対する細胞傷害活性 の、クラス I拘束性ペプチド特異的 CD8陽性 T細胞への依存
2種類の HPV16-E6蛋白由来ペプチドで刺激 '誘導した CTLの子宮頸癌に対する 細胞傷害活性が、どのような細胞に依存しているかを抗体による阻害試験と競合的 標的細胞を用いた非放射性阻害検定 (cold inhibition assay)で検討した。結果を図 3 および図 4に示す。
2名の HLA-A24陽性子宮頸癌患者（PT#6、 ΡΤ#7)の PBMCを個々のペプチドで刺 激し、 3種類の標的細胞に対する細胞傷害活性を検討する51 Cr放出試験にぉ ヽて、 抗 HLA-クラス I(W6/32、マウス IgG2a)、抗 HLA-クラス II (H- DR- 1,マウス IgG2a)、抗 C D4 (Nu- Th/I、マウス IgG2a)および、抗 CD8 (Nu- Ts/c、マウス IgG2a)抗体を各 10 g/ ml加えて子宮頸癌細胞に対する影響を調べた（図 3)。
また、子宮頸癌細胞に対する細胞傷害活性がペプチド特異的 CTLに依存すること を確認するために、刺激に用いたペプチド、または、コントロール HIVペプチドをパル スした、 51Crで標識して 、な 、C1R-A24細胞を添加して非放射性阻害検定を行った（ 図 4)。
[0045] 図 3に示すように、 2名の子宮頸癌患者（Pt#6と Pt#7)から HPV16-E6 75-83ぺプチ ド、または、 HPV16-E6 91-100ペプチドで誘導した CTLの SKG-IIIaに対する細胞傷 害活性は、抗クラス I抗体と抗 CD8抗体の添カ卩により阻害された力 抗クラス II抗体、 抗 CD4抗体、抗 CD14抗体の添カ卩では阻害されなかった。また、これらの SKG-IIIaに 対する細胞傷害活性は、刺激に用いた HPV16-E6ペプチドをパルスした51 Crで標識 していない (cold) C1R-A24細胞の添カ卩により有意に抑制された力 コントロールの HI Vペプチドをパルスした51 Crで標識して!/、な!/、(cold) C1R-A24細胞を添カ卩した場合に は抑制されな力つた（図 4)。以上の結果は、 2種類の HPV16- E6蛋白由来ペプチドで 刺激'誘導した CTLの子宮頸癌に対する細胞傷害活性はクラス I拘束性ペプチド特 異的 CD8陽性 T細胞に依存して 、ることを示して 、る。
[0046] 4)ペプチド特異的 IgG抗体
4種の HPV16- E6蛋白由来ペプチド（HPV16- E6 42-50、 HPV16- E6 75-83、 HPV16
-E6 91-99および HPV16-E6 91-100)に特異的な IgG抗体力 子宮頸癌患者および 健常人の血漿中に同定される力否かを蛍光フローメトリー法で測定した。結果を表 2 に示す。表中、各数値は蛍光強度を示している。
[0047] [表 2]
Figure imgf000019_0001
表 2に記載の通り、子宮頸癌患者においては、 HPV16-E6 42-50ペプチドと HPV16 -E6 91-99ペプチドに対しては 12人中 3人で、 HPV16-E6 91-100ペプチドに対しては 12人中 4人でペプチド反応性 IgG抗体が同定できた。また、女性健常人においては、 HPV16-E6 91-99ペプチドに対しては 14人中 4人で、 HPV16-E6 91-100ペプチドに 対しては 14人中 7人でペプチド反応性 IgG抗体が同定できた。 HPV16-E6 75_83ぺプ チドに対しては、子宮頸癌患者と女性健常人の両者にぉ 、てペプチド反応性 IgG抗 体は同定できな力つた。血漿中のペプチド反応性 IgG抗体のレベルは、対応する HP V16-E6蛋白由来ペプチドをコートしたゥエルで血漿を培養することにより顕著に減少 した（図 5)。これにより、 IgG抗体のペプチド特異性が確認された。
[0048] 1-3.結論
以上の 1-1および 1-2に記載の通り、日本人の約 6割および白人の約 2割が発現する HLA-A24分子と結合して抗原提示細胞により提示され、子宮頸癌反応性 CTLを誘 導できる HPV16の E6蛋白由来抗原ペプチドとして HPV16-E6 75-83ペプチドと HPV1 6-E6 91-100ペプチドが同定された。これらのペプチドは本願発明の目的に有用で ある。しかし、本発明者らのグループが行った癌ワクチン療法の臨床研究において、 ワクチン投与されたペプチドに対して IgG抗体が誘導された症例では生存期間が延 長する傾向が認められている（ミネ（Mine T)等、 Clin Cancer Res 10: 929-937, 2004
) o
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドは 、ずれも HLA-A24拘束性 CTLを誘導して子 宫頸癌の治療や予防に有用であるが、中でも HPV16-E6 91-100ペプチドは、効率的 な CTL誘導能を有すると共に IgG抗体に認識され易い抗原ペプチドである可能性が 高ぐ癌ワクチン療法における有効成分として極めて有用性が高いと予測される。 産業上の利用可能性
[0049] 本発明によれば、アジア人種、特に日本人のほぼ 60%が陽性であり、また白人の 約 20%が陽性である HLA-A24陽性の子宮頸癌を、診断、予防または治療する方法 、並びに転移を予防するための手段の開発を大いに促進することができる。

Claims

請求の範囲 [I] 次の ヽずれかの腫瘍抗原ペプチド：
(1)配列番号 1若しくは 2に示されるアミノ酸配列力 なるペプチド、または
(2)配列番号 1若しくは 2に示されるアミノ酸配列にぉ ヽて 1若しくは複数のアミノ酸が 欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ HLA-A24分子と結 合して細胞傷害性 T細胞により認識され得るペプチド。
[2] 前記（2)におけるペプチドのアミノ酸配列が、配列番号 1若しくは 2に示されるァミノ 酸配列の第 2位および/または C末端のアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基による置換 を含むものである、請求項 1記載の腫瘍抗原ペプチド。
[3] 前記（2)におけるペプチドのアミノ酸配列が、配列番号 1若しくは 2に示されるァミノ 酸配列の第 2位のチロシンの、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンによ る置換を含むものである、請求項 1記載の腫瘍抗原ペプチド。
[4] 前記（2)におけるペプチドのアミノ酸配列が、配列番号 1若しくは 2に示されるァミノ 酸配列の C末端のロイシンの、フエ-ルァラニン、イソロイシン、トリプトファンまたはメ チォニンによる置換を含むものである、請求項 1記載の腫瘍抗原ペプチド。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドから選択される少なくとも 1種 を有効成分として含有する、腫瘍の治療または予防用組成物。
[6] 子宮頸癌を治療または予防するための、請求項 5記載の組成物。
[7] 請求項 1〜4のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドから選択される少なくとも 1種 を患者に投与することを含む、腫瘍の治療または予防方法。
[8] 子宮頸癌を治療または予防するための、請求項 7記載の方法。
[9] 腫瘍の治療または予防用組成物を製造するための、請求項 1〜4のいずれかに記 載の腫瘍抗原ペプチドの使用。
[10] 子宮頸癌の治療または予防用組成物を製造するための、請求項 9記載の使用。
[II] HLA-A24陽性腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞に、請求項 1 〜4の 、ずれか〖こ記載の腫瘍抗原ペプチドをパルスすることを含む、抗原提示細胞 を調製する方法。
[12] 請求項 11記載の方法により調製された、抗原提示細胞。 HLA-A24陽性腫瘍患者由来の単離された末梢血リンパ球を請求項 1〜4のいずれ かに記載の腫瘍抗原ペプチドで刺激することを含む、細胞傷害性 T細胞を調製する 方法。
請求項 13記載の方法により調製された、細胞傷害性 T細胞。
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