WO2006057396A1 - プロテアソームの再構成方法 - Google Patents

プロテアソームの再構成方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006057396A1
WO2006057396A1 PCT/JP2005/021842 JP2005021842W WO2006057396A1 WO 2006057396 A1 WO2006057396 A1 WO 2006057396A1 JP 2005021842 W JP2005021842 W JP 2005021842W WO 2006057396 A1 WO2006057396 A1 WO 2006057396A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
proteasome
hsp70
hsp90
proteanome
hsp40
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/021842
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heiichiro Udono
Taketoshi Yamano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN
Original Assignee
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN filed Critical RIKEN
Priority to JP2006547926A priority Critical patent/JPWO2006057396A1/ja
Publication of WO2006057396A1 publication Critical patent/WO2006057396A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for reconstituting a 26S proteasome and a 26S proteasome reconstituted by the method. More specifically, the present invention relates to a method for reconstituting a 26S proteasome using a molecular chaperone such as hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90, or PA28, and the 26S proteasome reconstituted by the method. .
  • a molecular chaperone such as hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90, or PA28
  • Ubiquitin-dependent degradation pathway is known as a mechanism for degrading unnecessary proteins in cells.
  • Ubiquitin is a small protein with a strength of 76 amino acids, and its yeast strength is widely preserved in the living world, including humans.
  • Ubiquitin is a C-terminal glycine residue that binds to the cysteine residue of E1 (ubiquitin-active enzyme) in an ATP-dependent manner, and then the E1 force is also transferred to E2 (ubiquitin-binding enzyme), which is recognized by E3 (ubiquitin ligase). Isopeptide bonds to the lysine side chain of the target protein.
  • a polyubiquitin chain is formed.
  • the polyubiquitin chain added to the target protein by the ubiquitin system as described above is recognized by the 26S proteasome, and the ubiquitin-cleaved protein is degraded by the 26S proteasome.
  • the 26S proteasome is the most important degrading enzyme of intracellular proteins.
  • This 26S proteasome also has an enzyme catalytic site 20S proteasome that also has ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ring force and 19Scap molecular force that binds to both sides.
  • the conventional 26S proteasome purification method was a method in which a 20S proteanome and a 19Scap molecule were separately purified and finally both molecules were mixed.
  • a method of purification at once using gel filtration and ion exchange chromatography Alexei F. Kissel ev, et al., The size of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20S protea somes. Biol. Chem. 274, 3363-3371, 1999). These methods are well-recognized biochemically, but they can be purified only from a considerable number of cells ( ⁇ 10 ⁇ ) and tissues (rat liver, scorpion spleen, etc.). Is difficult.
  • An object of the present invention is to solve the above-described problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a method for reconstituting the 26S proteasome from a relatively small amount of cells or tissues. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for reconstituting 26S proteasome from an arbitrary sample (for example, a sputum sample which can be obtained only in a small amount) by a simple operation.
  • the present inventors have used any small amount of cell / tissue lysate ( ⁇ 10 6 cells) as a starting material, and a molecular chaperone (hsp70, hsp40 or hsp90). It was surprisingly found that the 26S proteasome can be reconstituted in a short time by incubating these cells' yarn and tissue lysates in the presence of). The present invention has been completed based on this finding.
  • the 26S proteasome is reconstituted in vitro, including incubating a cell or tissue lysate in the presence of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28.
  • a method is provided.
  • an in vitro reconstituted 26S proteanome obtained by incubating a cell or tissue lysate in the presence of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28. Is provided.
  • the cell or tissue lysate is a supernatant obtained by centrifuging a homogenized liquid containing a buffer solution in the cell or tissue.
  • the incubation is performed in the presence or absence of ATP.
  • hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 is a recombinant protein.
  • hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 is a recombinant protein labeled with a tag for purification.
  • the method of the present invention further comprises a step of purifying the 26S proteasome using the tag after incubation.
  • the present invention provides a method of reconstituting a 26S proteasome in vitro, comprising incubating a lysate of a cell or tissue in the presence of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28, as well as reconstituted in vitro obtained by the above method.
  • hsp70 hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28
  • the cells or tissues used in the present invention include tissues and organs of any organism including humans (including any organ such as kidney, liver, stomach, small intestine, large intestine, heart, brain, lung, thymus, etc.) Any microorganism, or any cell (including cultured cells) can be used as a starting material. More specifically, in the method of the present invention, the 26S proteasome can be reconstituted from the cytoplasmic fraction of the material.
  • the cytoplasmic fraction can be prepared by a normal cytoplasmic fractionation method. For example, by homogenizing and centrifuging the cells described above, the cell membrane, nucleus, mitochondrion, lysosome and micronome fractions can be removed and the supernatant can be used as the cytoplasmic fraction.
  • the cell or tissue lysate obtained as described above is incubated in the presence of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28.
  • This incubation may be performed in the presence of ATP or in the absence of ATP, but in order to obtain a more active 26S proteasome, it is preferably performed in the presence of ATP. .
  • hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 used in the present invention is known, and is described in, for example, the following documents.
  • Hsp70 Soulier 3 ⁇ 4, et al., Developmental regulation of murine integrin ⁇ 1 subunit- and Hsc73— encoding genes in the mammary gland: sequence of a new mouse Hsc73 cDN A. Gene 172 (2), 285-289 (1996), registration number NCBI Accession U27129
  • Hsp40 Homo sapiens DnaJ: Strausberg RL et al., Generation and initial analysis of mo re than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences.Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 99 (26), 16899-16903 (2002) Registration number NCBI Accession BC002352
  • Hsp90 Yamazaki M et al. Nucleotide sequence of a-length cDNA for 90 kDa he at-shock protein from human peripheral blood lymphocytes.Nucleic Acids Res. 17 (1 7), 7108 (1989), accession number NCBI Accession X15183
  • the hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 used in the present invention may be any of a naturally-derived protein, a recombinant protein, or a chemically synthesized protein, but from the viewpoint of convenience of preparation. Recombinant proteins are preferred. Further, from the viewpoint of facilitating isolation and purification of the 26S proteanome reconstituted by the method of the present invention, hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 used in the present invention is labeled with a tag for purification. It is preferable.
  • Examples of the tag for purification include a histidine tag [for example, 6 X His tag] or a Flag tag.
  • a protein labeled with a histidine tag can be purified with a Ni column, and a protein labeled with a Flag tag can be purified with an anti-Flag antibody.
  • hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 used in the reconstitution of the 26S proteome will be contained in the reconstituted 26S proteasome, so hsp70, hsp70 / hsp40 , hsp 90 or PA28 may be labeled with a purification tag to facilitate purification of the reconstituted 26S proteasome.
  • One of the advantages of the present invention is the ease of purification of the reconstituted 26S proteanome.
  • the amount of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 used is not particularly limited as long as the 26S proteanome can be reconstituted.
  • the amount of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90 or PA28 used is not particularly limited as long as the 26S proteanome can be reconstituted.
  • 10 7 cell pellets are used as the starting material, It is sufficient to use about 5 ⁇ g.
  • Incubation for reconstitution of 26S proteanome is carried out at a suitable temperature (eg, 4 ° C to room temperature, preferably 4 ° C) for several minutes to 10 hours, preferably about 1 hour to 5 hours. Good. During the incubation, the mixture is preferably shaken.
  • a suitable temperature eg, 4 ° C to room temperature, preferably 4 ° C
  • the mixture is preferably shaken.
  • the enzyme activity of the 26S proteanome reconstituted by the method of the present invention is determined by an appropriate fluorescent substrate (for example, Sue-LLVY-AMC (N-succil-Leu-Leu-Vaktyr-7-amino-4). -Methyl-coumarin) etc.). Since this Suc-LLVY-AMC emits fluorescence when cleaved by the proteasome, the enzyme activity of the oral theanome can be evaluated by measuring the intensity of the fluorescence.
  • an appropriate fluorescent substrate for example, Sue-LLVY-AMC (N-succil-Leu-Leu-Vaktyr-7-amino-4). -Methyl-coumarin) etc.
  • the 26S proteasome reconstituted by the method of the present invention is composed of the 20S proteasome as a protease and other regulatory factors, and can recognize and degrade ubiquitinated proteins.
  • the 26S proteasome reconstituted by the method of the present invention can be used to elucidate the function of the enzyme and to elucidate the degradation mechanism of ubiquitin-like proteins. It can also be used for diagnosis and treatment of various diseases. Certain oncogenes have been reported to be degraded by ubiquitin-dependent degradation pathways Yes. Therefore, the 26S proteasome reconstituted by the method of the present invention is useful for elucidation of the mechanism of canceration, treatment and diagnosis of cancer, and the like.
  • the 26S proteasome reconstituted by the method of the present invention is useful for elucidating the mechanism of Alzheimer's disease and treating and diagnosing Alzheimer's disease.
  • proteasome inhibitor may be a therapeutic agent for such diseases.
  • the 26S proteasome reconstituted by the method of the present invention can also be used in a screening system for proteasome inhibitors.
  • Example I Reconstitution of 26S proteanom with hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90, PA28 Purification from mouse normal liver tissue 101 was carried out using hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90, PA28, and ATP
  • the 26S proteasome was reconstituted in vitro with buffer conditions in the presence or absence. A total of eight types of proteasomes were reconstituted from the combinations.
  • 26S buffer A 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM ATP, ImM DTT, 0.25) corresponding to 4 to 10 times the volume of cell pellet or liver tissue, etc. M sucrose, 1% NP40, 0.5 mM PMSF) and homogenize well with a homogenizer.
  • the proteasome is eluted with 100 ⁇ l of 26S buffer D (25 mM Tris—HCl (pH 7.5), 2 mM ATP, ImM DTT. 0.25 M sucrose, 0.2 M Imidazole).
  • the reconstituted 26S proteasome sample is a proteasome reconstituted from about 1 ⁇ g of yarn and weave weight.
  • Fig. 1 shows the results of enzyme activity of eight kinds of crude 26S obtained.
  • the 26S proteanome which is active to some extent is recovered by hsp70 / hsp40, hsp90, and PA28 even in the absence of ATP.
  • the activity of reconstitution with hsp70 alone was low. That is, the presence of hsp40 reduces ATP requirements.
  • the most active 26S proteanome is reconstituted in the presence of 0.2 mM ATP.
  • Example 2 Cleavage of precursor peptide of MHC class I antigen peptide by 26S proteasome MHC class I antigen peptide precursor peptide (added with C-terminal flanking) by 26S proteasome reconstituted in Example 1 ), And an experiment was conducted to see if the MHC class I antigen peptide was actually excised.
  • the model peptide used was OVA (SI
  • the proteanome obtained as shown in FIG. 1 was cleaved for 0,1,3,12 hours (final volume 100 1), and the low molecular weight one was recovered with Centricon 10.
  • the composition of the reaction solution is as in Example 1. The measurement was performed in the same manner as in the case of measuring the hydrolytic activity of Suc-LLVY-amc in the presence of ATP.
  • cytotoxic T cells The cytotoxic activity of target cells by different cytotoxic T cells (CTL) was observed in the chromium 51 release test. If the injury activity is high, this means that many MHC class voyage peptides have been cut out. The result is shown in Fig.2.
  • OVA is an MHC class I ligand in both hsp90-based and PA28-based proteasomes
  • Example 3 Fractionation of 26S proteanome reconstituted in vitro
  • the 26S proteasome reconstituted in vitro was further fractionated according to molecular weight using a gel filtration column (Amersham Superose 6).
  • the reconstituted proteasome was concentrated to 1001 and injected into the AKTAFPLC system.
  • the solution was flowed at a flow rate of 0.5 ml / min and fractionated at 1 ml / fraction.
  • 26S buffer C was used as the mobile phase.
  • the Suc-LLV Y-amc degradation activity of each fraction was measured according to the method shown in Example 1.
  • Each fraction NO. Is plotted on the horizontal axis and the enzyme activity is plotted on the vertical axis.
  • Example 4 Inhibitory effect of gelsanamycin on Suc-LLVY-AMC degradation activity of 26S proteanome
  • PA28a promotes the appearance of a football-type proteanome and the formation of a hybrid-type proteanome.
  • hsp90 promotes the formation of single-cap 26S proteasome, but it disappears in the presence of geldanamycin 5 ⁇ or EDTA O.lmM.
  • Example 6 Promoting assembly of single-cap type 26S proteanome by hsp90
  • Example 7 Reconstruction of proteanome with PA28a and hsp90
  • ⁇ 28 ⁇ was added to mouse EL4 cells or ⁇ 28 ⁇ — 'j8 — / _ cell lysate in the absence or presence of ATP and hsp90 in the presence of TP, and pulled down after 30 minutes incubation. .
  • Identification of bound molecules was performed by SDS-PAGE followed by Western blot, and Western blot was performed with antibodies against 20S proteasome and 19Scap Rptl after Native-PAGE to identify the type of proteanome formed. .
  • PA28a settles the football-type proteasome, and in the presence of ATP, the force that has precipitated the hybrid proteasome. It is noteworthy that endogenous hsp90 enters this. ( Figure 8).
  • hsp90 precipitates the hybrid proteasome in the presence of ATP, but of course, endogenous PA28 is also precipitated together (Fig. 8).
  • single-cap 26S proteanome is precipitated from lysates of ⁇ 28 ⁇ -j8- cells by hsp90 (Fig. 8). Therefore, PA28 has nothing to do with the binding of hsp90 to the single cap type 26S proteanome! /.
  • PA28a reconstitutes the football proteasome in the absence of ATP and the hybrid proteasome in the presence of ATP.
  • hsp90 reconstitutes the hybrid proteasome in the presence of ATP.
  • PA 28a-10 ⁇ -cell lysate reconstitutes single-cap 26S proteasome.
  • Fig. 8 shows how the proteasome complex precipitated in suc-LLVY-amc (chymotrypsin-like activity) and Boc-LRR-amc (trypsin-like activity) is affected in the presence of geldanamycin.
  • a proteasome complex as shown in Fig. 9 was purified from EL4 or ⁇ 28 ⁇ - ⁇ j8 cell extract using recombinant PA28 ⁇ , hsp90.
  • Each proteasome complex was treated with gelmanamycin (GA) 25 mM for 30 minutes to prepare a non-progenitor product.
  • the enzyme activity was measured for chymotrypsin-like activity and trypsin-like activity using Suc-LL VY-amc and Boc-LRR-amc, respectively.
  • FIG. 10 shows a summary of the proteanome reconstitution process using PA28a and hsp90. Covering any cell lysate with 28 ⁇ or hsp90 allows reconfiguration of football, single cap 26S, and hybrid proteanomes.
  • the present invention makes it possible to reconstitute the 26S proteasome in vitro using a molecular chaperone (hsp70, hsp40 or hsp90) as a recombinant protein from a partial lysate of an extremely small amount of cells' tissue.
  • a molecular chaperone hsp70, hsp40 or hsp90
  • This makes it possible to extract proteasomes from cells / tissues more easily than conventional methods.
  • This also makes it possible to arbitrarily extract different types of proteasomes that are characteristically expressed in individual cells' tissues.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the enzyme activity of a 26S protease that was reconstituted in the presence of hsp70, hsp70 / hsp40, hsp90, or PA28.
  • FIG. 2 shows the results of examining the cleavage of the precursor peptide of MHC class I antigen peptide by 26S proteasome.
  • PA28 a -assembled proteasome Black bar PA28 ⁇ ⁇ C5-assembled proteasome (dominant negative of PA28 a) Gray bar; hsp90- assemled proteasome Oblique bar; Pulse with synthetic peptide (with or without) Target cells
  • FIG. 3 shows the results of fractionating the 26S proteasome reconstituted in vitro according to molecular weight using a gel filtration column (Amersham Superose 6).
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting for examining protein molecules in each fraction obtained by fractionating 26S proteasome using a gel filtration column.
  • FIG. 5 shows the results of examining the inhibitory effect of 26D proteanome on the Suc-LLVY-AMC degradation activity by geldanamicin.
  • FIG. 6 shows the results of investigating the promotion of proteanome assembly by Hsp90 and PA28 ⁇ .
  • FIG. 7 shows the results of examining the assembly promotion of a single-cap type 26S proteanome by hsp90.
  • FIG. 8 shows the results of examining the proteanome reconstitution with PA28 ⁇ and hsp90.
  • Figure 9 shows the effect of hydrolytic activity of proteasome complexes on suc-LLVY-amc (chymotrypsin-like activity) and Boc- LRR-amc (trypsin-like activity) in the presence of geldanamycin. The result of examining whether to receive is shown.
  • FIG. 10 shows the process of reconstructing the proteanome by PA28 ⁇ and hsp90.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、比較的少量の細胞や組織から26Sプロテアソームを再構成する方法を提供することである。本発明によれば、hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又はPA28の存在下において細胞又は組織のライセートをインキュベートすることを含む、26Sプロテアソームをインビトロで再構成する方法が提供される。                                                                         

Description

明 細 書
プロテアソームの再構成方法
技術分野
[0001] 本発明は、 26Sプロテアソームを再構成するための新規な方法、並びに当該方法に より再構成された 26Sプロテアソームに関するものである。より詳細には、本発明は、 h sp70、 hsp70/hsp40、 hsp90、又は PA28などの分子シャペロンを用いた 26Sプロテアソ ームの再構成方法、並びに当該方法により再構成された 26Sプロテアソームに関する ものである。
背景技術
[0002] 細胞内において不要なタンパク質が分解されるメカニズムとして、ュビキチン依存 性の分解経路が知られている。ュビキチンは 76アミノ酸力もなる小タンパク質であり、 酵母力もヒトまで生物界にぉ 、て広く保存されて 、る。ュビキチンは C末端のグリシン 残基で ATP依存性に E1 (ュビキチン活性ィ匕酵素)のシスティン残基と結合した後、 E1 力も E2(ュビキチン結合酵素)に転移され、 E3(ュビキチンリガーゼ)によって認識され る標的タンパク質のリジン側鎖にイソペプチド結合する。標的タンパク質のリジン残基 に結合したュビキチンのリジン残基にュビキチンの C末端力イソペプチド結合を繰り 返すことにより、ポリュビキチン鎖が形成される。上記したようなュビキチンシステムに より標的タンパク質に付加されたポリュビキチン鎖は 26Sプロテアソームによって認識 され、ュビキチンィ匕されたタンパク質は 26Sプロテアソームにより分解される。
[0003] 上記の通り、 26Sプロテアソームは、細胞内蛋白の最も主要な分解酵素である。この 26Sプロテアソームは α β β αリング力もなる酵素触媒部位 20Sプロテアソームとその 両側に結合する 19Scap分子力もなる。 20Sプロテアノームの各リングは 7個のサブュ- ットからなり、従って 20Sプロテアソームは 7 X 4=28個の分子力も構成される。一方、 1 9Scap分子は 6個の ATPaseサブュ-ットと約 12個の non- ATPaseサブュ-ットの合計 1 8個の分子から構成されている。従って、 26Sプロテアソームは 28 + 18 + 18 = 64個もの 分子が集まった巨大複合分子であり、その分子量は約 2.5MDaにも及ぶ。 26Sプロテ ァノームの生化学的に精製することは、その構造が巨大複合分子であることから簡単 ではない。
[0004] 従来の 26Sプロテアソーム精製法は、 20Sプロテアノームと 19Scap分子を別々に精製 して最後に両分子を混合して作成する方法であった。あるいは、ゲル濾過とイオン交 換クロマトグラフィーを用いて一度に精製を行う方法も知られている (Alexei F. Kissel ev,他、 The size of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20S protea somes. J.Biol.Chem. 274, 3363-3371, 1999)。これらの方法は、生化学的には十分 認知されたものであるが、相当規模の細胞数 (〜10ω)や組織 (ラット肝臓、ゥサギ脾 臓など)からでないと途中のロスが多いため精製が困難である。また、任意の、例えば ヒトなどの少量の末梢血 (〜106)、臓器'組織の一部 (0.1cm3)など力も簡便に精製す ることが困難であるなどの問題点がある。従って、従来の 26Sプロテアソーム精製法を 使用する場合は、ごく限られた研究室等で得られた限られた種類のプロテアノームし か入手することができない。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即 ち、本発明は、比較的少量の細胞や組織から 26Sプロテアソームを再構成する方法 を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、任意の試料 (例えば、少量 しか入手できな ヽ試料など)から 26Sプロテアソームを簡便な操作で再構成する方法 を提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、任意の少量の細胞 · 組織ライセート（〜106細胞）を出発材料として使用し、分子シャペロン (hsp70,hsp40 或は hsp90)の存在下においてこれらの細胞'糸且織ライセートをインキュベートすること によって、短時間のうちに 26Sプロテアソームを再構成できることを意外にも見出した。 本発明は、この知見に基づいて完成したものである。
[0007] 即ち、本発明によれば、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28の存在下にお!/、て細 胞又は組織のライセートをインキュベートすることを含む、 26Sプロテアソームをインビ トロで再構成する方法が提供される。 [0008] 本発明の別の側面によれば、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28の存在下にお いて細胞又は組織のライセートをインキュベートすることによって得られる、インビトロ で再構成された 26Sプロテアノームが提供される。
[0009] 好ましくは、細胞又は組織のライセートは、細胞又は組織に緩衝液をカ卩えてホモジ ナイズした液体を遠心することにより得られる上清である。
好ましくは、 ATPの存在下又は非存在下においてインキュベートを行う。
[0010] 好ましくは、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28は組み換え蛋白質である。
好ましくは、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28は、精製のためのタグで標識され た組み換え蛋白質である。
好ましくは、本発明の方法は、インキュベーション後に、前記タグを利用して 26Sプロ テアソームを精製する工程をさらに含む。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明について具体的に説明する。
本発明は、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28の存在下において細胞又は組織 のライセートをインキュベートすることを含む、 26Sプロテアソームをインビトロで再構成 する方法、並びに上記方法により得られるインビトロで再構成された 26Sプロテアソー ムに関する。
[0012] 本発明で用いる細胞又は組織としては、ヒトを含む任意の生物の組織又は器官（腎 臓、肝臓、胃、小腸、大腸、心臓、脳、肺、胸腺などの任意の臓器を含む)、任意の微 生物、又は任意の細胞 (培養細胞を含む)を出発材料として使用することができる。よ り具体的には、本発明の方法では、上記材料の細胞質画分から 26Sプロテアソームを 再構成することができる。細胞質分画の調製は、通常の細胞質分画法によることがで きる。例えば、上記記載の細胞をホモジネートし、遠心分離することにより、細胞膜、 核、ミトコンドリア、リソゾームおよびミクロノームの分画を除き、その上清を細胞質分 画として使用することができる。
[0013] 細胞又は組織のライセートの調製方法の一例としては、以下の実施例に記載され ている通り、下記（1)〜（5)の操作を挙げることができるが、これに準ずる任意の方法 でもよい。 (1)細胞ペレット又は肝臓組織などのウエットボリュームを 1とした時に、その 4〜10倍 量に相当する 26Sバッファー A (25mM Tris- HCl(pH7.5), 2mM ATP, ImM DTT, 0.25 M sucrose, 1%NP40, 0.5mM PMSF)をカ卩え、ホモジェナイザーにてよくホモジェナイズ する。
(2)氷上にて 30分間静置する。
(3) 7,000rpm 10分間遠心
(4)上清を回収、さらに 15,000rpm 30分間遠心する。
(5)上清を回収
[0014] 本発明の方法では、上記のようにして得た細胞又は組織のライセートを、 hsp70, hs p70/hsp40, hsp90又は PA28の存在下においてインキュベートする。このインキュベー シヨンは、 ATPの存在下で行ってもよいし、 ATPの非存在下で行ってもよいが、より活 性の高い 26Sプロテアソームを得るためには、 ATPの存在下で行う方が好ましい。
[0015] 本発明で用いる hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28は何れも公知であり、例えば 、以下の文献等に記載されている。
Hsp70: Soulier ¾,他、 Developmental regulation of murine integrin β 1 subunit- and Hsc73— encoding genes in the mammary gland: sequence of a new mouse Hsc73 cDN A. Gene 172(2), 285-289 (1996),登録番号 NCBI Accession U27129
Hsp40(Homo sapiens DnaJ): Strausberg RL他、 Generation and initial analysis of mo re than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 99(26), 16899-16903 (2002),登録番号 NCBI Accession BC002352
[0016] Hsp90: Yamazaki M et al. Nucleotide sequence of a滅- length cDNA for 90 kDa he at- shock protein from human peripheral blood lymphocytes. Nucleic Acids Res. 17(1 7), 7108 (1989),登録番号 NCBI Accession X15183
PA28; Jiang H他、 Sequence and expression of mouse proteasome activator PA28 an d the related autoantigen Ki. Immunogenetics 46(2), 93-98(1997),登録番号 NCBI A ccession NM謝 1189
[0017] 本発明で用いる hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28は、天然由来の蛋白質、組 換え蛋白質、又は化学合成した蛋白質の何れでもよいが、調製の便宜の観点からは 組換え蛋白質が好ましい。また、本発明の方法で再構成した 26Sプロテアノームの単 離'精製を容易にするという観点から、本発明で使用する hsp70, hsp70/hsp40, hsp90 又は PA28は、精製のためのタグで標識されていることが好ましい。精製のためのタグ としては、ヒスチジンタグ〔例えば、 6 X Hisタグ〕、又は Flagタグなどが挙げられる。ヒス チジンタグで標識された蛋白質は Niカラムにより精製することができ、 Flagタグで標識 された蛋白質は抗 Flag抗体で精製することができる。本発明の方法では、 26Sプロテ ァノームの再構成の際に用いる hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28は何れも再構 成された 26Sプロテアソーム中に含有されることになるため、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp 90又は PA28に精製のためのタグを標識しておくことによって、再構成された 26Sプロ テアソームを精製することが容易になる。再構成された 26Sプロテアノームの精製が容 易であることは、本発明の利点の一つである。
[0018] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28の使用量は、 26Sプロテアノームが再構成で きる限り特に限定されないが、例えば、出発材料として 107個の細胞ペレットを使用す るような場合は、 5 μ g程度使用すれば十分である。
[0019] 26Sプロテアノームの再構成のためのインキュベーションは、適当な温度（例えば、 4 °Cから室温、好ましくは 4°C)にて数分から 10時間、好ましくは 1時間から 5時間程度 行えばよい。インキュベーションの際、混合物を震盪混和することが好ましい。
[0020] 本発明の方法で再構成される 26Sプロテアノームの酵素活性は、適当な蛍光基質（ 例えば、 Sue- LLVY- AMC (N-スクシ-ル- Leu- Leu- VaKTyr- 7-ァミノ- 4-メチル -クマ リン）など）を用いて行うことができる。この Suc-LLVY-AMCは、プロテアソームにより 切断されると蛍光を発するようになるので、その蛍光の強度を測定することにより、プ 口テアノームの酵素活性を評価することができる。
[0021] 本発明の方法で再構成される 26Sプロテアソームは、プロテアーゼとしての 20Sプロ テアソームとその他の制御因子とから構成されるものであり、ュビキチン化した蛋白質 を認識して分解することができる。本発明の方法で再構成される 26Sプロテアソームは 、当該酵素の機能の解明やュビキチンィ匕した蛋白質の分解機構の解明のために用 いることができる。また、各種の疾患の診断や治療のためにも使用することができる。 ある種の癌遺伝子は、ュビキチン依存性の分解経路で分解されることが報告されて いる。従って、本発明の方法で再構成される 26Sプロテアソームは、癌化のメカ-ズ ムの解明や癌の治療および診断などにも有用である。また、アルツハイマー病患者 の脳内にはュビキチンィ匕した蛋白質が異常蓄積していることから、アルッノ、イマ一病 の原因の一つとして、細胞内における蛋白質分解系の異常が示唆されている。従つ て、本発明の方法で再構成される 26Sプロテアソームは、アルツハイマー病のメカ- ズムの解明やアルツハイマー病の治療および診断にも有用である。
[0022] さらにまた、上記した通りプロテアソームは各種疾患に関与していることから、プロテ ァソーム阻害剤はそのような疾患の治療薬となり得る可能性がある。本発明の方法で 再構成される 26Sプロテアソームは、プロテアソーム阻害剤のスクリーニング系にお ヽ て使用することもできる。
[0023] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例
[0024] 実施例 I :hsp70,hsp70/hsp40, hsp90, PA28による 26Sプロテアァノームの再構成法 マウス正常肝臓組織 10 1から精製を開始し、 hsp70, hsp70/hsp40, hsp90, PA28に より、 ATP存在下又は非存在下でのバッファー条件で 26Sプロテアソームを in vitroで 再構成した。組み合わせから以下の合計 8種類のプロテアソームを再構成した。
Hsp70-26S ATP (-)
Hsp70-26S ATP (+)
Hsp70/hsp40-26S ATP (-)
Hsp70/hsp40-26S ATP (+)
Hsp90-26S ATP (-)
Hsp90-26S ATP (+)
PA28-26S ATP (-)
PA28-26S ATP (+)
[0025] (方法）
(1)細胞ペレット又は肝臓組織などのウエットボリュームを 1とした時に、その 4〜10倍 量に相当する 26Sバッファー A(25mM Tris- HCl(pH7.5), 2mM ATP, ImM DTT, 0.25 M sucrose, 1%NP40, 0.5mM PMSF)をカ卩え、ホモジェナイザーにてよくホモジェナイズ する。
(2)氷上にて 30分間静置する。
(3) 7,000rpm 10分間遠心
(4)上清を回収、さらに 15,000rpm 30分間遠心する。
(5)上清を回収
(6)リコンビナント hsp70 g), hsp40 (5 g)をカ卩え、 4°Cにて 3時間震盪混和する。リ コンビナント蛋白はその N末に 6 X His.タグがついたものを使用した。リコンビナント蛋 白の加えるべき量は、細胞数 107個のペレットであれば各 5 g(hsp70, hsp40, hsp90, PA28)で十分である。
(7) (6)に Ni2+ -agarose (Qiagen社）〜20 μ 1(ゲルボリューム)をカ卩え、さらに 1時間 4 °Cにて震盪混和する。
(8) 2,500rpm 1分間遠心。
(9)上清を捨てる。
(10) 26Sバッファー B (25mM Tris— HCl(pH7.5), 2mM ATP, ImM DTT.0.25M sucro se, 1%NP40, 0.5mM PMSF, 25mM Imidazole)を十分量カ卩え suspensionした後に転倒 混和 10回ほど行い、再度 2,500rpm 1分間遠心。この際、ボルテックスはしない。
(11) 上清を捨てる。（9)を 4回繰り返す。
(12) 26Sバッファー C (25mM Tris— HCl(pH7.5), 2mM ATP, ImM DTT, 0.25M sucr ose)を用いて上記（8)と（9)の操作を 2回繰り返す。
(13) 26Sバッファー D (25mM Tris— HCl(pH7.5), 2mM ATP, ImM DTT.0.25M sucro se, 0.2M Imidazole) 100 μ 1でプロテアソームを溶出する。
(14) 2,500rpm 1分間遠心後、上清を回収する。この時点で、 crudeの 26Sプロテアソ ームが回収されたことになる。
(15) (14)で得られた分画の酵素活性はプロテアノームの蛍光基質 (Suc-LLVY-A MC)を用いて行う。アツセィは 96wellプレートを用いて以下のように行った。
(ATP非存在下でのアツセィの場合）
0.5M Tris-HCl (pH8.0) 20 μ 1 Suv— LLVY— amc 1 μ 1
Reconstituted sample 20 μ 1
DDW 59 1
100 ^ 1
[0027] (ATP存在下でのアツセィの場合）
0.5M Tris-HCl (pH8.0) 20 μ 1
Sue— LLVY— amc 1 μ 1
Reconstituted sample 20 μ 1
DDW 55 μ 1
ATP (50 mM) 4 l
100 ^ 1
[0028] reconstituted 26S proteasome sampleは約 1 μ gの糸且織重量から再構成したプロテ ァソームである。
[0029] 図 1に 8種類の得られた crude 26Sの酵素活性についての結果を示す。図 1の結果 力も明らかなように、 ATPが存在しなくとも hsp70/hsp40, hsp90, PA28によりある程度 活性のある 26Sプロテアノームが回収される。一方、 hsp70単独で再構成を行った場 合の活性は低かった。即ち、 hsp40の存在は ATP要求性を減少させる。また、いずれ の場合も ATP 0.2mM存在下では最高度に活性のある 26Sプロテアノームが再構成さ れる。
[0030] 実施例 2： 26Sプロテアソームによる MHCクラス I抗原ペプチドの前駆ペプチドの切断 実施例 1で再構成された 26Sプロテアソームにより、 MHCクラス I抗原ペプチドの前 駆ペプチド (C末フランキングを付加したもの）を切断し、実際に MHCクラス I抗原ぺプ チドが切り出されるかにつ!/、て実験を行った。用いたモデルペプチドは OVA (SI
257-269
INFEKL TEWTS),マラリア抗原 CSP (SYVPSAEQILEFVKQ),メラノーマ抗原 TR
280-294
P2 (SVYDFFVWL HYYSV)の 3種類である。 OVA ， TRP2 ，は Kbに提示
180-193 257-264 180-188
されるペプチドであり、 CSP は Kdに提示される。これらの合成ペプチド各 10 μ gを
280-288
図 1のようにして得られたプロテアノームで 0,1,3,12時間切断し（最終ボリューム 100 1 )、低分子量のものをセントリコン 10で回収した。反応液の組成は、実施例 1における Suc-LLVY-amcの ATP存在下での加水分解活性の測定の場合と同様に行った。
[0031] OVA , TRP2 を含んでいると思われるものはマウス EL4(H- 2b)に、また CSP
257-264 180-188 2 を含んで!/、ると思われるものは p815(H-2d)にパルスし、それぞれのペプチドに特
76-284
異的な細胞傷害性 T細胞 (cytotoxic T lymphocyte;CTL)による標的細胞の傷害活性 をクロム 51遊離試験にて観察した。傷害活性が高く出れば、即ち MHCクラス航原ぺ プチドが多く切り出されたということになる。その結果を図 2に示す。
[0032] OVA は hsp90- based, PA28- basedのプロテアソーム両方で MHCクラス Iリガンド
257-269
が切断されるのに対し、 CSP は hsp90-basedプロテアソームのみで、さらに TRP2
280-294 18 は PA28_basedのプロテアソームのみでリガンドが切り出されてくるという事実が判
0-193
明した。即ち、プロテアノームの種類により産生される抗原ペプチドの種類が異なるも のと解釈される。
[0033] 実施例 3： in vitro再構成してきた 26Sプロテアノームの分画
in vitroで再構成した 26Sプロテアソームをゲル濾過カラム（アマシャム Superose 6)を 用いて分子量に応じてさらに分画した。再構成したプロテアソームを 100 1に濃縮し 、それを AKTAFPLCシステムへインジェクションした。流速 0.5ml/分で流し、 1 ml/フラ クシヨンで分画した。移動相は、 26Sバッファー Cを用いた。各フラクションの Suc-LLV Y-amcの分解活性を実施例 1に示した方法に従って測定した。各フラクション NO.を 横軸に、その酵素活性を縦軸にプロットした。既知の精製法で得られた 26Sをコント口 ールにして hsp90, hsp70/hsp40で再構成したプロテアノームの大きさを検証してみた 。図 3にその結果を示す。実施例 1で再構成されたプロテアノームの大きさは明らか に 26Sプロテアノームとほぼ同じ大きさであることがわかる。ちなみに精製 20Sプロテア ソームは、その酵素活性がフラクション 12に認められる。
[0034] 続いてフラクション 7〜12にどのような蛋白分子が含まれているかを調べるためにゥ エスタンブロットを用いて検討した。図 4に示すように、酵素活性フラクション (Noll〜 12)に一致して 20Sが観察される。 19Sはもちろん活性部位にも認められる力 それ以 外のフラクションにも比較的幅広く見られる。大切な事は、既存の方法でマイルドにと つてきた 26Sプロテアノームの活性フラクションにやはり hsp90, hsp70, hsp40が認めら れることである。また、 hsp70/hsp40で再構成したプロテアソームは既知の 26Sプロテア ノームの分子構成パターンによく似て!/、ることがわかった。内在性の Hsp90が含まれ ているのは以外である。 Hsp90で再構成したプロテアノームの場合、活性フラクション 部位にはもちろん hsp90が含まれる力 内在性 hsp70/hsp40の含有量は低!、。
[0035] 実施例 4： 26Sプロテアノームの Suc-LLVY-AMC分解活性におけるゲルダナマイシン による抑制効果
3種類の 26Sプロテアソーム（即ち、既知の方法でとった 26Sプロテアノーム、 hsp90で 再構成した 26Sプロテアノーム、及び hsp70/hsp40で再構成された 26Sプロテアソーム )の Suc-LLVY-AMC分解活性におけるゲルダナマイシン（hsp90特異的阻害剤 0〜50 μ Μ)による抑制効果を検討した。その結果を図 5に示す。
[0036] その結果、 hsp90で再構成したプロテアノームの酵素活性はゲルダナマイシンで濃 度依存的に抑制されることが明らかになった。一方、既知の 26S或は hsp70/hsp40で 再構成されたプロテアノームの場合はゲルダナマイシンで部分的に抑制される。ネガ ティブコントロールとして用いた精製 20Sプロテアノームの SDSによる人工的な活性は ゲルダナマイシンで全く抑制されな力つた。以上の結果より、従来 26Sと考えられてき たものは hsp90依存性， hsp70/hsp40依存性のプロテアノームに亜分類される可能性 が考えられる。あるいは、 hsp90依存性のものは hsp70/hsp40依存性のプロテアソー ムが完成する前の前段階 (あるいはその逆)のものである可能性も排除できない。
[0037] 実施例 5： Hsp90及び PA28 aによるプロテアノームのアッセンブリ促進
PA28 α ~' β十細胞のライセートにリコンビナント ΡΑ28 a又は hsp90をカ卩え、 30分間 室温にてインキュベーションし、これを 3— 20%の Native-PAGEにかけ、泳動後ゲルを suc-LLVY-amcを含む溶液に浸す。 37°C、 10分間インキュベーションし、 360nmの UV 照射により、 460應のフィルターにより加水分解活性を視覚化した（図 6)。
[0038] PA28 aの添加により、フットボール型プロテアノームの出現と、ハブリツド型プロテア ノームの形成が促進される。一方、 hsp90によりシングルキャップ型 26Sプロテアソーム の形成が促進されるが、ゲルダナマイシン 5 μ Μ又は EDTA O.lmMの存在下では消 失する。
[0039] 即ち、 Hsp90によるプロテアノームのアッセンブリ促進は、 ATP除去により、あるいは Mg2+のキレートイ匕による消失する一方、 PA28 αによるそれは影響を受けないことが分 かった。
[0040] 実施例 6 : hsp90によるシングルキャップ型 26Sプロテアノームのアッセンブリ促進
ヒスチジンタグの付いたリコンビナント hsp90を ΡΑ28 α— j8— 細胞のライセートに添 加し、 30分間室温にてインキュベーションし、これを 3— 15%の Native-PAGEにかける 。その後、ニトロセルロース膜に転写後、抗ヒスチジンタグ抗体、抗 20S Q; 2抗体、 19S Rpt6抗体でウェスタンブロットを行った。その結果、 hsp90はシングルキャップ型 26Sプ 口テアノームの位置に泳動し、この泳動パターンは、 EDTA存在下では変化がないが 、ゲルダナマイシン存在下では完全に消失した（図 7)。また、 hsp90により 20S、 19S R pt6の量が有意に増加している。これは一番左の図の加水分解活性の増加と完全に 一定する。即ち、 hsp90は Hsp90はシングルキャップ型 26Sプロテアノームに結合して、 シングルキャップ型 26Sプロテアノームのアッセンブリを促進することが分かった。
[0041] 実施例 7： PA28 a及び hsp90によるプロテアノームの再構成
ΡΑ28 αを ATP非存在下若しくは存在下で、また、 hsp90を ΑΤΡ存在下でマウス EL4 細胞あるいは ΡΑ28 α— ' j8— /_細胞のライセートに添カ卩し、 30分インキュベーション後に pull downを行った。 SDS-PAGEに続くウェスタンブロット法にて、結合している分子の 同定を行い、また、 Native-PAGE後に 20Sプロテアソーム及び 19Scap Rptlに対する 抗体でウェスタンブロットを行い、形成されたプロテアノームの種類を特定した。その 結果、 ATP非存在下では、 PA28 aはフットボール型プロテアソームを沈降し、 ATP存 在下ではハイブリッドプロテアソームを沈降してきた力 注目すべきはこの中に内在 性 hsp90がー緒に入ってくることである（図 8)。一方、 hsp90は ATP存在下において、 ハイブリッドプロテアソームを沈降するがこのときもちろん内在性 PA28も一緒に沈降さ れる（図 8)。また、 ΡΑ28 α— j8— 細胞のライセートからは hsp90によりシングルキャップ 型 26Sプロテアノームが沈降される（図 8)。従って、 hsp90のシングルキャップ型 26Sプ 口テアノームへの結合には PA28は全く関係な!/、。
[0042] 以上の結果から以下のことが分かった。 PA28 aは ATP非存在下ではフットボール 型プロテアソームを、又 ATP存在下ではハイブリッド型プロテアソームを再構成する。 一方、 hsp90は ATP存在下でハイブリッド型プロテアソームを再構成する。もちろん PA 28 a十 βチ細胞のライセートからはシングルキャップ型 26Sプロテアソームを再構成す る。
[0043] 実施例 8 :
図 8で沈降されてきたプロテアソーム複合体の suc-LLVY-amc (キモトリプシン様活 性）， Boc-LRR-amc (トリプシン様活性）に対する加水分解活性がゲルダナマイシン 存在下でどのような影響を受けるのかを検討した。 ATP (-)又は (+)の条件下で、 EL4 或は ΡΑ28 α— Λ j8チ細胞抽出液から、リコンビナント PA28 α , hsp90を用いて図 9に示 すようなプロテアソーム複合体を精製した。各プロテアソーム複合体を、ゲルダナマイ シン (GA)25mMで 30分処理したものとしな ヽものを作製した。その酵素活性を Suc-LL VY-amc、 Boc-LRR-amcを用いてそれぞれキモトリブシン様活性、トリプシン様活性 を測定した。
[0044] その結果、 ATP存在下で沈降してきたプロテアソーム（即ち hsp90を含む）のキモトリ プシン様活性のみが有意に低下することが明らかになった（図 9)。即ち、 hsp90はハ イブリツドプロテアノーム、シングルキャップ型 26Sプロテアノームのキモトリブシン様活 性に重要な役割を担うことが明らかになった。即ち、 Hsp90を含むプロテアソームはハ イブリツドプロテアソームか、シングルキャップ型 26Sプロテアソームである力 これらの キモトリブシン様活性のみ力 ¾sp90の特異的阻害剤ゲルダナマイシンで抑制されるこ とが分力つた。
[0045] 以上 PA28 a、 hsp90によるプロテアノームの再構成過程をまとめたものを図 10に示 す。任意の細胞ライセートに ΡΑ28 α又は hsp90をカ卩えることによりフットボール型、シ ングルキャップ 26S、及びハイブリッドプロテアノームの再構成が可能になる。
産業上の利用可能性
[0046] 本発明は、任意の、極めて少量の細胞'組織の一部ライセートからリコンビナント蛋 白としての分子シャペロン（hsp70,hsp40或は hsp90)を用いて 26Sプロテアソームを in v itro再構成できることを可能にする。これにより、従来法よりもより簡便に細胞 ·組織か らプロテアソームを取り出すことが可能になる。このことは個々の細胞'組織に特徴的 に発現する異なる種類のプロテアソームを任意に取り出すことを可能にするものでも ある。
図面の簡単な説明 [図 1]図 1は、 hsp70,hsp70/hsp40, hsp90,又は PA28の存在下で再構成した 26Sプロ テアァノームの酵素活性を測定した結果を示す。
[図 2]図 2は、 26Sプロテアソームによる MHCクラス I抗原ペプチドの前駆ペプチドの切 断を調べた結果を示す。 白のバー； PA28 a -assembledプロテアソーム 黒のバー； PA28 α Δ C5- assembledプロテアソーム (PA28 aのドミナントネガティブ） 灰色のバ 一； hsp90- assemledプロテアソーム 斜線のバー；合成ペプチド（あり又はなし）でパ ルスした標的細胞
[図 3]図 3は、 in vitroで再構成した 26Sプロテアソームをゲル濾過カラム（アマシャム Su perose 6)を用いて分子量に応じて分画した結果を示す。
[図 4]図 4は、 26Sプロテアソームをゲル濾過カラムで分画した各フラクション中の蛋白 分子を調べるためのウェスタンブロットの結果を示す。
[図 5]図 5は、 26Sプロテアノームの Suc-LLVY-AMC分解活性におけるゲルダナマイ シンによる抑制効果を調べた結果を示す。
[図 6]図 6は、 Hsp90及び PA28 αによるプロテアノームのアッセンブリ促進を調べた結 果を示す。
[図 7]図 7は、 hsp90によるシングルキャップ型 26Sプロテアノームのアッセンブリ促進を 調べた結果を示す。
[図 8]図 8は、 PA28 α及び hsp90によるプロテアノームの再構成を調べた結果を示す。
[図 9]図 9は、プロテアソーム複合体の suc-LLVY-amc (キモトリプシン様活性）、 Boc- LRR-amc (トリプシン様活性）に対する加水分解活性がゲルダナマイシン存在下でど のような影響を受けるのかを検討した結果を示す。
[図 10]図 10は、 PA28 α及び hsp90によるプロテアノームの再構成過程を示す。

Claims

請求の範囲
[I] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28の存在下において細胞又は組織のライセート をインキュベートすることを含む、 26Sプロテアソームをインビトロで再構成する方法。
[2] 細胞又は組織のライセートが、細胞又は組織に緩衝液をカ卩えてホモジナイズした液 体を遠心することにより得られる上清である、請求項 1に記載の方法。
[3] ATPの存在下又は非存在下においてインキュベートを行う、請求項 1又は 2に記載の 方法。
[4] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28が組み換え蛋白質である、請求項 1から 3の何 れかに記載の方法。
[5] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28力 精製のためのタグで標識された組み換え 蛋白質である、請求項 1から 4の何れかに記載の方法。
[6] インキュベーション後に、前記タグを利用して 26Sプロテアソームを精製する工程をさ らに含む、請求項 5に記載の方法。
[7] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28の存在下において細胞又は組織のライセート をインキュベートすることによって得られる、インビトロで再構成された 26Sプロテアソー ム。
[8] 細胞又は組織のライセートが、細胞又は組織に緩衝液をカ卩えてホモジナイズした液 体を遠心することにより得られる上清である、請求項 7に記載の 26Sプロテアノーム。
[9] ATPの存在下又は非存在下においてインキュベートを行う、請求項 7又は 8に記載の 26Sプロテアノーム。
[10] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28が組み換え蛋白質である、請求項 7から 9の何 れかに記載の 26Sプロテアノーム。
[II] hsp70, hsp70/hsp40, hsp90又は PA28力 精製のためのタグで標識された組み換え 蛋白質である、請求項 7から 10の何れかに記載の 26Sプロテアノーム。
[12] インキュベーション後に、前記タグを利用して 26Sプロテアソームを精製する、請求項 11に記載の 26Sプロテアノーム。
PCT/JP2005/021842 2004-11-29 2005-11-29 プロテアソームの再構成方法 Ceased WO2006057396A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006547926A JPWO2006057396A1 (ja) 2004-11-29 2005-11-29 プロテアソームの再構成方法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004343923 2004-11-29
JP2004-343923 2004-11-29
JP2005-263898 2005-09-12
JP2005263898 2005-09-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006057396A1 true WO2006057396A1 (ja) 2006-06-01

Family

ID=36498129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/021842 Ceased WO2006057396A1 (ja) 2004-11-29 2005-11-29 プロテアソームの再構成方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2006057396A1 (ja)
WO (1) WO2006057396A1 (ja)

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CASCIO P. ET AL.: "Properties of the hybrid form of the 26S proteasome containing both 19S and PA28 complexes", EMBO J., vol. 21, no. 11, June 2002 (2002-06-01), pages 2636 - 2645, XP002996564 *
KISSELEV A.F. ET AL.: "The sizes of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20S proteasomes. Implications for understanding the degradative mechanism and antigen presentation", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 6, February 1999 (1999-02-01), pages 3363 - 3371, XP002996565 *
KOPP F. ET AL.: "Reconstitution of Hybrid Proteasomes from Purified PA700-20S Complexes and PA28 alpha beta Activator: Ultrastructure and Peptidase Activities", J. MOL. BIOL., vol. 313, no. 3, October 2001 (2001-10-01), pages 465 - 471, XP004472443 *
SOULIER S. ET AL.: "Developmental regulation of murine integrin beta 1 subunit- and Hsc73-encoding genes in mammary gland: sequence of a new mouse Hsc73 cDNA", GENE, vol. 172, no. 2, June 1996 (1996-06-01), pages 285 - 289, XP004042752 *
STRAUSBERG R.L. ET AL.: "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 26, December 2002 (2002-12-01), pages 16899 - 16903, XP002294427 *
TANAHASHI N. ET AL.: "Hybrid Proteasomes", J. BIOL. CHEM., vol. 275, no. 19, May 2000 (2000-05-01), pages 14336 - 14345, XP002996562 *
VERMA R. ET AL.: "Proteasomal proteomics: identification of nucleotide-sensitive proteasome-interacting proteins by mass spectrometric analysis of affinity-purified proteasomes", MOL. BIOL. CELL., vol. 11, no. 10, October 2000 (2000-10-01), pages 3425 - 3439, XP001014761 *
WU B.J. ET AL.: "Transcription of the human hsp70 gene is induced by serum stimulation", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, no. 18, September 1985 (1985-09-01), pages 6070 - 6074, XP002996563 *
YAMAZAKI M. ET AL.: "Nucleotide sequence of a full-length cDNA for 90 kDa heat-shock protein from human peripheral blood lymphocytes", NUCLEIC ACID RES., vol. 17, no. 17, September 1989 (1989-09-01), pages 7108, XP002996566 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006057396A1 (ja) 2008-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Monti et al. Molecular cloning and characterization of NEU4, the fourth member of the human sialidase gene family
Lai et al. C-terminal deletion of human tissue transglutaminase enhances magnesium-dependent GTP/ATPase activity
JP2002527051A (ja) デルタ６脂肪酸デサチュラーゼ
CN111448315B (zh) 一种Cas蛋白体系分离DNA的方法
CN1059466C (zh) 鉴定患有细胞异常性的个体的方法
JP2003156488A (ja) 痛みに関連する分子の同定及び使用
EP1432792A2 (en) Histone deacetylase 9
Kapłon et al. Starmaker exhibits properties of an intrinsically disordered protein
Sawada et al. Interaction of the δ and b subunits contributes to F1 and F0 interaction in the Escherichia coli F1F0-ATPase
Donoso et al. Physiology, Pathophysiology and Clinical Relevance of D‐Amino Acids Dynamics: From Neurochemistry to Pharmacotherapy
JP4142953B2 (ja) ペプチジルアルギニンデイミナーゼ６
JPWO2006057396A1 (ja) プロテアソームの再構成方法
US12331074B2 (en) Site-specific serine ADP-ribosylated proteins and peptides and method for producing the same
WO2002031163A1 (en) Novel adamts family polypeptide and gene encoding the same
JP4232423B2 (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
US20040151715A1 (en) Catalytic domain of ADAM33 and methods of use thereof
JP2003189883A (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
US7285408B2 (en) Crystalline form of an n231 mutant catalytic domain of ADAM33 and methods of use thereof
US20050233411A9 (en) Compositions and methods for cleaving IAP
JPH11243972A (ja) アミノペプチダーゼファミリーのメンバー、ｍｅｔｐｒｏ ０２
JP3090478B2 (ja) Ｄｎａをｃｏ―ｄｎａに変換するための材料および方法
JP4635218B2 (ja) 神経細胞において物質の核内移行に関与する新規タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子、並びにその利用
JPH09173087A (ja) Ａｔｐおよび核酸に結合し、ヘリカーゼおよびａｔｐアーゼの性質を有すると推定される蛋白質
JP2003189884A (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
AU758898B2 (en) Human deadenylating nuclease, its production and its use

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006547926

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05811713

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1