WO2006054000A2 - Netrine 4 mutee, ses fragments et leur utilisation comme medicaments - Google Patents

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Definitions

  • the subject of the present invention is mutant 4 netrin, its fragments and their use as a medicament.
  • the present invention also relates to new therapeutic uses of non-mutated netrin 4 and its fragments.
  • the subject of the present invention is also new uses of variablenin ligands, such as netrin, namely netrin 1, netrin 3, netrin Gl or netrin 4, and RGMs ("repulsive guidance molecule"), in combination with a chemotherapy agent, especially in the context of the preparation of a medicament for the treatment of cancers.
  • netrin namely netrin 1, netrin 3, netrin Gl or netrin 4
  • RGMs repulsive guidance molecule
  • the subject of the present invention is also new uses of netrin, in particular netrin 1, netrin G1, netrin 3 and netrin 4, in particular in the context of the treatment of non-tumoral pathologies related to scarcity of pericytes. .
  • Netrin 4 belongs to the family of netrin, which are axon guide molecules. To date, 4 members of this family are known (Netrin 1, G, 3, 4). Netrin 4 is a protein consisting of a C-terminal basic domain interacting with heparin, 3 EGF-like domains and a laminin-like domain (Yurchenko et al., 2004).
  • Netrin 1 stimulates attraction when it is bound to the dcc receptor (or neogenin) and repulsion when it is bound to the dcc receptors and one of the UNC5H family receptors (Livesey, 1999, Mehlen et al., 2003; Cooper et al., 1999).
  • Netrin 1 can bind to the A2 receptor and modify the level of cellular cAMP, the attraction or repulsion being also controlled by the cAMP / cGMP level (Corset et al., 2000).
  • Netrin G represents a family of genes differing from other netrins by the presence of a hydrophobic C-terminal domain that binds to glycosylphosphoinositolphosphate (Nakashiba et al., 2000). Their function is still unknown. On the other hand, netrin G has been reported to bind neither to dcc nor to UNC5H1, H2, H3 (Nakashiba et al, 2002). Netrin 3 stimulates the attraction of neurons when bound to a dcc or neogenin receptor and induces their repulsion when linked to a receptor of the UNC5H receptor family (Livesey et al., 1999).
  • RGM molecules are molecules involved in the guidance of axons of neurons. There are 3 named genes
  • RGM-A is a ligand of neogenin (Matsunaga et al., 2004) and that a variant of the RGM-C gene is the iron transport gene called HFE (Papanicolaou et al., 2004).
  • netrin 1 and netrin 4 inhibit endothelial cell activity via the UNC5H2 receptor (Lu et al., 2004) and inhibit vascularization of the retina. It is another object of the present invention to provide novel antiangiogenic agents.
  • the object of the present invention is to provide a combination treatment making it possible to increase the efficacy of treatments involving angiogenesis and in particular conventional anti-tumor treatments, or anti-angiogenic treatments used in pathologies other than tumors.
  • sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524 or a fragment of the said sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, provided that this fragment has an anti-angiogenic activity and / or a pericyte activation activity, said fragment comprising in particular about 40 to about 450 amino acids, and preferably from about 40 to about 260 amino acids, and preferably from about 40 to about 230 amino acids, and being in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q ranging from 187 to 248, or with the sequence SEQ ID NO: 526 or with the sequence SEQ ID NO: 528,
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 261 and 515 of SEQ ID NO: 522, provided that this homologous sequence has anti-angiogenic activity and / or pericyte activation activity.
  • the aforementioned protein SEQ ID NO: 522 is a new protein corresponding to the mutated netrin 4 protein and the above-mentioned protein SEQ ID NO: 524 corresponds to the protein SEQ ID NO: 522 without signal peptide.
  • sequence SEQ ID NO: 522 comprises 628 amino acids and the sequence SEQ ID NO: 524 comprises 609 amino acids and corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 522 from residue 20 to residue 628.
  • the mutated netrin 4 represented by the sequence SEQ ID NO: 522, corresponds to the netrin 4 protein represented by SEQ ID NO: 498 having the following 9 point mutations:
  • the aforementioned fragments corresponding to the protein sequences SEQ ID NO: 374 to SEQ ID NO: 496, are new fragments corresponding to fragments of the aforementioned mutated netrin 4.
  • sequences SEQ ID NO: 2q correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 374 to 496, that is to say to the following protein sequences: SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 400 SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444,
  • sequence SEQ ID NO: 374 corresponds to a laminin-type fragment (extracellular matrix protein binding to certain integrins) of the mutated human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 373.
  • This fragment comprises 260 amino acids and corresponds to the fragment of the mutated netrin 4 protein from residue 1 to residue 260 of the sequence SEQ ID NO: 522.
  • sequence SEQ ID NO: 376 corresponds to an EGF (EGF factor repetition domain) fragment of the mutated netrin 4 human protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 375.
  • This fragment comprises 255 amino acids and corresponds to the fragment of the mutated netrin 4 protein from residue 261 to residue 515 of sequence SEQ ID NO: 522.
  • sequence SEQ ID NO: 378 is a fragment corresponding to the deleted mutated human netrin 4 protein of the sequence SEQ ID NO: 364, said fragment being coded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 377. This fragment comprises 515 amino acids and corresponds to the fragment of the mutated netrin 4 protein from residue 1 to residue 515 of the sequence SEQ ID NO: 522.
  • sequence SEQ ID NO: 386 is a laminin-like fragment of the mutated human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 385. This fragment comprises 229 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein. mutant from residue 32 to residue 260 of sequence SEQ ID NO: 522.
  • sequence SEQ ID NO: 384 is an EGF-like fragment of the mutated human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 383. This fragment comprises 56 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein. mutated from residue 332 to residue 387 of sequence SEQ ID NO: 522.
  • sequence SEQ ID NO: 526 corresponds to the delimited fragment of positions 1 to 288 of SEQ ID NO: 522.
  • sequence SEQ ID NO: 528 corresponds to the delimited fragment of positions 1 to 288 of SEQ ID NO: 522, fused to a peptide sequence of 24 amino acids.
  • the present invention relates to a protein characterized in that it comprises or consists of: * the sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, or
  • fragments of the said sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524 comprising in particular about 40 to about 450 amino acids, and preferably about 40 at about 260 amino acids, and preferably from about 40 to about 230 amino acids, and being represented in particular by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526 or with the sequence SEQ ID NO: 528,
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 261 and 515 of SEQ ID NO: 522, provided that this homologous sequence has anti-angiogenic activity.
  • Angiogenesis inhibitory activity is also referred to as antiangiogenic activity. This activity can be demonstrated, for example, in vitro by demonstrating the inhibition of both the multiplication, migration and differentiation of endothelial cells by the abovementioned protein.
  • Measurement of the inhibition of endothelial cell multiplication can be achieved by culturing endothelial cells in the presence of the protein or fragment whose activity is to be evaluated.
  • Measurement of inhibition of endothelial cell migration can be accomplished by "waving" on a mat of endothelial cells and then incubating the cells in the presence of the test fragment. The number of cells that migrated to the wound is then measured.
  • Measurement of the inhibition of differentiation (tubulogenesis) of endothelial cells can be performed by measuring the length of tabules formed by endothelial cells cultured on gel in the presence of the fragment to be tested.
  • the fragments of the invention can be injected systemically (intravenously, intraperitoneally, subcutaneously) to animals in which an experimental angiogenic disease has been created.
  • the fragments of the invention can also be injected directly into a tumor.
  • fragments or anti-idiotypic antibodies of the invention (described below) can be issued by a gene therapy method by local or systemic route by any method allowing the expression of the fragments or anti-idiotypic antibodies according to 'invention.
  • the anti-idiotypic fragments or antibodies according to the invention may be inserted into a plasmid which is transfected into the cancer cells. All these measurement methods are described in particular in the article by Jain et al. (1997).
  • anti-tumor activity is meant an activity that makes it possible to inhibit tumor growth and / or to induce the regression or even the disappearance of tumors. This activity can be demonstrated, for example, in vivo by measuring the mass of tumors, which have been induced in the mouse by injection of tumor cells, in the presence and absence of the peptide sequences of the invention and / or nucleic acids expressing the peptide sequences of the invention.
  • sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524 or a fragment of the said sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, provided that this fragment exhibits a pericyte activation activity, said fragment comprising in particular about 40 to about 450 amino acids, and preferably from about 40 to about 260 amino acids, and preferably from about 40 to about 230 amino acids, and especially represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526, or by the sequence SEQ ID NO: 528,
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 261 and 515 of SEQ ID NO: 522, provided that this homologous sequence has pericyte activation activity.
  • the activating activity of the pericytes is verified in particular by the proliferation and migration tests as defined below and in the experimental part.
  • the present invention results in particular from the demonstration by the inventors of the function of activation of pericytes by the binding of provisiontrines to the receptors UNC5H4 pericytes and smooth muscle cells.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein as defined above, namely a nucleotide sequence coding for mutated netrin 4.
  • a preferred nucleotide sequence according to the invention is a nucleotide sequence characterized in that it comprises or consists of:
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 521 coding for SEQ ID NO: 522
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 523 coding for SEQ ID NO: 524
  • nucleotide sequence derived, by degeneracy of the genetic code, from one of the abovementioned nucleotide sequences, and coding for a protein represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or for the sequence SEQ ID NO: 526 or for the sequence SEQ ID NO: 528,
  • nucleotide sequence derived in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, of one of the abovementioned nucleotide sequences coding for a protein derived from SEQ ID NO: 2q, q ranging from 187 to 248, or for the sequence SEQ ID NO: 526 or for the sequence SEQ ID NO: 528, as defined above,
  • any homologous nucleotide sequence of one of the abovementioned nucleotide sequences preferably having an identity of at least approximately 50%, with one of the sequences SEQ ID NO: 2q-1 encoding a homologous protein of SEQ ID NO 2q, or with the sequence SEQ ID NO: 525 coding for the sequence SEQ ID NO: 526 or with the sequence SEQ ID NO: 527 coding for the sequence SEQ ID NO: 528, as defined above,
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the sequence complementary to one of the abovementioned sequences.
  • hybridize under stringent conditions corresponds in particular to a hybridization buffer such as 0.5 ⁇ SSC, at a hybridization temperature of 60 ° C., as well as to a washing medium such as 0.1 ⁇ SSC. added with 1% SDS and at a wash temperature of 50 ° C.
  • a hybridization buffer such as 0.5 ⁇ SSC
  • a washing medium such as 0.1 ⁇ SSC. added with 1% SDS and at a wash temperature of 50 ° C.
  • SEQ ID NO: 2q-1 sequences encode the aforementioned mutated 4-netrin fragments, represented by SEQ ID NO: 2q, and correspond to the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 373 coding for SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 coding for SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377 coding for SEQ
  • SEQ ID NO: 378 SEQ ID NO: 379 coding for SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381 coding for SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383 coding for SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 coding for SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387 coding for SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389 coding for SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391 coding for SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393 coding for SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379 coding for SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381 coding for SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383 coding for SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 coding for SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387 coding for SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389
  • SEQ ID NO: 458 SEQ ID NO: 459 coding for SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461 coding for SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463 coding for SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 coding for SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 coding for SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 coding for SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 coding for SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473 coding for SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 459 coding for SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461 coding for SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463 coding for SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 coding for SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 coding for SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 coding for SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 475 coding for SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 coding for SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479 coding for SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481 coding for SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483 coding for SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485 coding for SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487 coding for SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 coding for SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 encoding SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493 encoding SEQ ID NO: 494 where SEQ ID NO: 495 encoding SEQ ID NO: 496.
  • the sequence SEQ ID NO: 525 codes for the sequence SEQ ID NO: 526.
  • the sequence SEQ ID NO: 527 codes for the sequence SEQ ID NO: 528.
  • the present invention also relates to a recombinant vector, in particular plasmid, cosmid, phage or Virus DNA, containing a nucleotide sequence as defined above, namely a nucleotide sequence coding for the mutated netrin 4 or one of its fragments as defined above, said recombinant vector being characterized in particular by the fact that it contains the elements necessary for the expression in a host cell of the polypeptides encoded by the aforementioned nucleic acids, inserted into said vector.
  • the present invention also relates to a host cell, chosen in particular from bacteria, viruses, yeasts, fungi, plants or mammals, said host cell being transformed, in particular using a recombinant vector as defined above.
  • the present invention also relates to an antibody characterized in that it is specifically directed against a protein as defined above, in particular directed against the mutated netrin 4 or one of its fragments as defined above.
  • the present invention also relates to an anti-idiotypic antibody of a protein as defined above, in particular directed against the mutated netrin 4 or one of its fragments as defined above.
  • the present invention also relates to an Fab fragment of anti-idiotypic antibodies as defined above, in particular directed against the mutated Netrin 4 or one of its fragments as defined above.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, comprising as active substance,
  • the present invention also relates to the use as defined above of the mutated netrin 4 protein, represented by the sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ.
  • ID NO: 524 for the preparation of a medicament capable of being administered at a rate of about 0.1 to about 2000 ⁇ g / kg, in particular intravenously, subcutaneously, systemically, by intravenous injection. -Vitréenne, by local way by means of infiltrations or by means of an eyewash, possibly associated with an electropermination.
  • the mutated netrin 4 protein may also be delivered by an injection of plasmid encoding the mutated netrin 4 protein of interest.
  • any of the netins of the invention or a fragment thereof may be delivered by any intravascular device method (stents) after attachment of the protein or fragment to said device.
  • the present invention relates to the use:
  • An anti-idiotypic antibody as defined above for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of pathologies requiring inhibition of proliferation and / or endothelial migration, particularly in the context of the following pathologies: cancers and leukemias, macular degeneration related to age, choroidal neovascularization complicating myopia, neovascularization of the cornea, particularly transplant rejection, glaucoma, diabetic retinopathies or preterm, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcomas, Castelman and Kaposi's sarcoma, or as part of the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • the expression "inhibition of endothelial proliferation” refers to any substance capable of curbing the proliferation of endothelial cells according to the proliferation test described below.
  • the present invention relates to the combination product comprising:
  • mutated netrin 4 represented by SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, or
  • sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524 in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526 or the sequence SEQ ID NO: 528, in combination with an anti-angiogenic agent chosen in particular from:
  • AVASTIN (bevacizumab) developed by Genentech and Roche
  • MACUGEN pegaptanib developed by Eyetech and Pfizer
  • LUCENTIS (ranibizumab) developed by Genentech and Novartis, for simultaneous, separate or spread over time for the treatment of the following pathologies: cancers and leukemias, age-related macular degeneration, choroidal neovascularization complicating myopia, corneal neovascularization, particularly graft rejection, glaucoma, diabetic retinopathies, preterm, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcomas, Castelman's disease and Kaposi's sarcoma, or in the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • the doses of mutated netrin 4 are from about 10 to about 10,000 ng / injection, preferably from about 100 to about 5,000 ng / injection, every 6 weeks.
  • the doses of anti-angiogenic agent are about 0.3 and 1 mg every 6 weeks.
  • the subject of the invention is the use of: an antibody as defined above, or
  • Fab fragment of anti-idiotypic antibodies as defined above, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of pathologies requiring the stimulation of proliferation and / or endothelial migration, in particular in the the following pathologies: ischemic pathologies such as arteritis of the lower limbs, myocardial infarction, stroke, scleroderma or Raynaud's disease.
  • Measurement of activation of endothelial cell proliferation can be accomplished by placing the endothelial cells in an appropriate culture medium and then measuring the total number of cells.
  • Measurement of activation of endothelial cell migration can be accomplished by "weaving" a cell mat and then incubating the cells in the presence of the protein, or nucleotide sequence or anti-human antibody. idiotypic to test. The number of cells that migrated to the wound is then measured.
  • the present invention relates to the use:
  • nucleotide sequence as defined above, or
  • an anti-idiotypic antibody as defined above or an Fab fragment of anti-idiotypic antibodies as defined above, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of non-tumoral pathologies related to or caused by a rarefaction of pericytes or smooth muscle cells.
  • the present invention relates to the use of: - a protein as defined above
  • nucleotide sequence as defined above, or
  • an anti-idiotypic antibody as defined above, or for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of tumor pathologies related to or caused by a rarefaction of pericytes or smooth muscle cells.
  • non-tumoral pathologies related to or caused by a rarefaction of pericytes or smooth muscle cells, and requiring activation of proliferation or migration of pericytes or muscle cells. smooth are chosen from:
  • the use according to the present invention is characterized in that the non-tumoral pathologies related to or caused by a rarefaction of pericytes or smooth muscle cells, and requiring activation of the proliferation or migration of pericytes or smooth muscle cells, are selected from: - diabetic retinopathies,
  • vascular dementia such as Alzheimer's disease
  • the present invention also relates to the use as defined above, characterized in that the activation activity of the proliferation or migration of pericytes or smooth muscle cells is measured according to the proliferation or migration test, and in that this activating activity corresponds to at least 120% of the cells obtained in the absence of the protein, or the nucleotide sequence or the anti-idiotypic antibody as defined above.
  • This property can be used to expand smooth muscle cells or pericytes from any progenitor cell or stem cell collection to perform cell therapies.
  • Measurement of the activation of pericyte or smooth muscle cell migration can be accomplished by "weaving" on a carpet of cells and then incubating the cells in the presence of the protein, or nucleotide sequence, or anti-idiotypic antibody to be tested. The number of cells that migrated to the wound is then measured.
  • the measurement of the activation of the proliferation of pericytes or smooth muscle cells can be carried out by placing the pericytes or smooth muscle cells in a suitable culture medium, in particular in DMEM medium containing no serum, and then measuring the total number of cells.
  • a suitable culture medium in particular in DMEM medium containing no serum, and then measuring the total number of cells.
  • the present invention relates to the use:
  • sequence SEQ ID NO: 524 or a fragment of the said sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526 or with the sequence SEQ ID NO: 528, in combination with a chemotherapy agent, for the preparation of a medicament for the treatment of cancers.
  • the present invention relates to the combination product:
  • mutated netrin 4 represented by SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, or a fragment of the said sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526 or by the sequence SEQ ID NO: 528, in combination with a chemotherapy agent, for simultaneous, separate or spread over time for the treatment of tumor pathologies.
  • the present invention relates to the combination product comprising:
  • sequence SEQ ID NO: 524 or a fragment of the said sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526 or with the sequence SEQ ID NO: 528, in association with an anti-angiogenic agent, especially chosen from: AVASTIN (bevacizumab) developed by Genentech and Roche, MACUGEN
  • the present invention relates to the use:
  • sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524 in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2q, q varying from 187 to 248, or by the sequence SEQ ID NO: 526 or by the sequence SEQ
  • an anti-angiogenic agent especially chosen from: A VASTIN (bevacizumab) developed by Genentech and Roche, MACUGEN (pegaptanib) developed by Eyetech and Pfizer and LUCENTIS (ranibizumab) developed by Genentech and Novartis, or any another anti-VEGF agent for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of tumoral or non-tumoral pathologies as defined above.
  • the present invention also relates to the combined use of an antiangiogenic agent and a chemotherapy agent.
  • the present invention relates to the use of a ligand of neogenin, or optionally a nucleotide sequence coding for a ligand of neogenin, or of a vector containing a nucleotide sequence coding for said ligand, or a host cell transformed by said vector, or an anti-idiotypic antibody directed against said ligand, in combination with a chemotherapy agent, for the preparation of a medicament for the treatment of cancers.
  • an anti-angiogenic agent selected from said neogenin ligand or said nucleotide sequence or said vector or said host cell or said anti-idiotypic antibody, with a chemotherapeutic agent makes it possible to obtain a synergistic effect of induce less resistance to conventional anti-tumor treatments.
  • doxorubicin methotrexate
  • vinblastine vincristine
  • cladribine fluorouracil
  • cytarabine anthracyclines
  • cisplatin cyclophosphamide
  • fludarabine gemcitabine
  • gemcitabine aromatase inhibitors, irinotecan, navelbine, oxaliplatin, taxofen, taxol and taxotere.
  • the use according to the invention is characterized in that the ligand or the nucleotide sequence or the anti-idiotypic antibody is chosen from: - one of the following proteins: netrin 1 represented by SEQ ID NO: 502 or SEQ ID NO: 504, Netrin Gl represented by SEQ ID NO: 506 or SEQ ID NO: 508, Netrin 3 represented by SEQ ID NO: 510, Netrin 4 represented by SEQ ID NO: 498 or SEQ ID NO: 500, one of the RGM molecules represented by SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 or SEQ ID NO: 520, or the mutated netrin 4 represented by SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524,
  • nucleotide sequence coding for one of the abovementioned proteins in particular represented by one of the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507,
  • SEQ ID NO: 2n sequences correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 496.
  • the abovementioned SEQ ID NO: 2n sequences correspond to the following protein sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114,
  • SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488,
  • SEQ ID NO: 490 SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494 or SEQ ID NO: 496.
  • SEQ ID NO: 2n-1 sequences correspond to the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 495.
  • SEQ ID NO: 2n-1 sequences encode the aforementioned protein sequences SEQ ID NO: 2n, and correspond to the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 1 coding for SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 coding for SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 coding for SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 coding for SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 coding for SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 coding for SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 encoding SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 encoding SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 encoding SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 encoding SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 encoding SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 encoding SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 encoding SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 encoding SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 coding for SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 coding for SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 coding for SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 coding for SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 encoding SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 encoding SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 encoding SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 coding for SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 encoding SEQ ID
  • SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 coding for SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 coding for SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 coding for SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 coding for SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 encoding SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 encoding SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 encoding SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 coding for SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 encoding SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 coding for SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 coding for SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 coding for SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 coding for SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 encoding SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 encoding SEQ ID
  • SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 105 encoding SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 encoding SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 encoding SEQ ID NO: 1 10, SEQ ID NO: 1 11 encoding SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 encoding SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115 encoding SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 encoding - SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 encoding SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 encoding SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 encoding SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 encoding SEQ ID NO: 126 , SEQ ID NO: 127 coding for SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 coding for SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 coding for SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 171 coding for SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 coding for SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 coding for SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 coding for SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179 encoding SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 encoding SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 coding for SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 encoding SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 coding for SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 encoding SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID
  • SEQ ID NO: 187 encoding SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 encoding SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 encoding SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 encoding SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195 coding for SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 coding for SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 coding for SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 coding for SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 encoding SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 encoding SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 encoding SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 encoding SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 coding for SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 coding for SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO
  • SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 221 coding for SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 coding for SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225 coding for SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 coding for SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 coding for SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231 coding for SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233 coding for SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235 coding for SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221 coding for SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 coding for SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225 coding for SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 coding for SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 coding for SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231 coding for S
  • SEQ ID NO: 237 coding for SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO; 239 coding for SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 coding for SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 encoding SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 encoding for ' SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 coding for SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249 coding for SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 coding for SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 coding for SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255 coding for SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257 coding for SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259 coding for SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261 coding for SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263 coding for SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 coding
  • SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 285 coding for SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 coding for SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 coding for SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 coding for SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293 coding for SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 coding for SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297 coding for SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299 coding for SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 285 coding for SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 coding for SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 coding for SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 coding for SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293 coding for SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 coding for SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297
  • SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO: 335 coding for SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 coding for SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339 coding for SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341 coding for SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343 coding for SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345 coding for SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347 coding for SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349 coding for SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335 coding for SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 coding for SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339 coding for SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341 coding for SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343 coding for SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345
  • SEQ ID NO: 431 encoding SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433 encoding SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435 encoding SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 encoding SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439 coding for SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441 coding for SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 coding for SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445 coding for SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447 encoding SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449 encoding SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451 encoding SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453 encoding SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455 coding for SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 coding for SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459
  • SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 465 coding for SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 coding for SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 coding for SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 coding for SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473 coding for SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475 coding for SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 coding for SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479 coding for SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481 coding for SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483 coding for SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485 coding for SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487 encoding SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 encoding SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 encoding SEQ ID NO: 492,
  • sequence SEQ ID NO: 498 corresponds to the netrin 4 human protein encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 497
  • sequence SEQ ID NO: 500 corresponds to the aforementioned netrin 4 human protein without the signal peptide, encoded by the sequence nucleotide SEQ ID NO: 499.
  • the sequence SEQ ID NO: 498 comprises 628 amino acids and the sequence SEQ ID NO: 500 comprises 609 amino acids and corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 498 from residue 20 to residue 628 .
  • sequence SEQ ID NO: 502 corresponds to the netrin 1 human protein encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 501
  • sequence SEQ ID NO: 504 corresponds to the aforementioned netrin 1 human protein without the signal peptide, coded by the sequence nucleotide SEQ ID NO: 503.
  • the sequence SEQ ID NO: 502 comprises 604 amino acids and the sequence SEQ ID NO: 504 comprises 580 amino acids and corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 502 ranging from residue 25 to residue 604. .
  • sequence SEQ ID NO: 506 corresponds to the human netrin protein Gl encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 505, and the sequence SEQ ID NO: 508 corresponds to the aforementioned human netrin G1 protein without the signal peptide, coded by the sequence nucleotide SEQ ID NO: 507.
  • the sequence SEQ ID NO: 506 comprises 438 amino acids and the sequence SEQ ID NO: 508 comprises 410 amino acids and corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 506 from residue 29 to residue 438 .
  • sequence SEQ ID NO: 510 corresponds to the netrin-3 human protein encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 509.
  • the sequence SEQ ID NO: 510 comprises 580 amino acids.
  • the sequence SEQ ID NO: 512 corresponds to the RGM-A molecule encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 511.
  • the sequence SEQ ID NO: 512 comprises 450 amino acids.
  • the sequence SEQ ID NO: 514 corresponds to the RGM-B molecule encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 513, and the sequence SEQ ID NO: 518 corresponds to the above-mentioned RGM-B molecule without the signal peptide, encoded by the sequence nucleotide SEQ ID NO: 517.
  • the sequence SEQ ID NO: 514 comprises 437 amino acids and the sequence SEQ ID NO; 518 comprises 392 amino acids and corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 514 from residue 46 to residue 437.
  • sequence SEQ ID NO: 516 corresponds to the RGM-C molecule encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 515
  • sequence SEQ ID NO: 520 corresponds to the above-mentioned RGM-C molecule without the signal peptide, coded by the sequence nucleotide SEQ ID NO: 519.
  • the sequence SEQ ID NO: 516 comprises 426 amino acids and the sequence SEQ ID NO: 520 comprises 391 amino acids and corresponds to a fragment of the sequence SEQ ID NO: 516 from residue 36 to residue 426 .
  • sequence SEQ ID NO: 360 corresponds to a laminin-type fragment (extracellular matrix protein binding to certain integrins) of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 359 This fragment comprises 260 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein ranging from residue 1 to residue 260 of the sequence SEQ ID NO: 498.
  • sequence SEQ ID NO: 362 corresponds to an EGF-like fragment (EGF factor repetition domain) of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 361.
  • This fragment comprises 255 amino acids and corresponds to to the fragment of netrin 4 protein from residue 261 to residue
  • sequence SEQ ID NO: 364 corresponds to the heparin-binding fragment of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 363. This fragment comprises 113 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein from residue 516 to residue 628 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 366 is a fragment corresponding to the netrin 4 human protein deleted of the sequence SEQ ID NO: 364, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 365. This fragment comprises 515 amino acids and corresponds to fragment of netrin 4 protein from residue 1 to residue
  • sequence SEQ ID NO: 8 is a laminin type fragment of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 7. This fragment comprises 229 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein from residue 32 to residue 260 of the sequence SEQ ID NO: 498.
  • sequence SEQ ID NO: 2 is an EGF-like fragment of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. This fragment comprises 60 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein from residue 261 to residue 320 of the sequence SEQ ID NO: 498.
  • sequence SEQ ID NO: 4 is an EGF-like fragment of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 3. This fragment comprises 56 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein from residue 332 to residue 387 of the sequence SEQ ID NO: 498.
  • sequence SEQ ID NO: 6 is an EGF-like fragment of the human netrin 4 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5. This fragment comprises 52 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 4 protein from residue 394 to residue 445 of the sequence SEQ ID NO: 498.
  • the fragments of the netrin 4 protein corresponding to the protein sequences SEQ ID NO: 10 to SEQ ID NO: 126 and to the protein sequences SEQ ID NO: 368 and SEQ ID NO: 370, as well as the corresponding nucleotide sequences SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 125 and the nucleotide sequences SEQ ID NO: 367 and SEQ ID NO: 369 are grouped in the following table:
  • sequence SEQ ID NO: 128 corresponds to a laminin-type fragment (extracellular matrix protein binding to certain integrins) of the human netrin 1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 127.
  • This fragment comprises 283 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 1 protein from residue 1 to residue 283 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 130 corresponds to an EGF (EGF factor repetition domain) type fragment of the human netrin 1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 129.
  • This fragment comprises 204 amino acids and corresponds to to the fragment of netrin 1 protein from residue 284 to residue
  • sequence SEQ ID NO: 132 corresponds to a heparin-binding fragment of the human netrin 1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 131 This fragment comprises 117 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 1 protein from residue 488 to residue 604 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 372 is a fragment corresponding to the human netrin 1 protein deleted of the sequence SEQ ID NO: 132, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 371. This fragment comprises 487 amino acids and corresponds to fragment of netrin 1 protein from residue 1 to residue
  • sequence SEQ ID NO: 140 is a laminin-like fragment of the human netrin 1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 139 This fragment comprises 235 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 1 protein from residue 49 to residue 283 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 134 is an EGF-like fragment of the human netrin 1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 133 This fragment comprises 48 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 1 protein from residue 284 to residue 331 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 136 is an EGF-like fragment of the human protein netrin 1, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 135. This fragment comprises 56 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 1 protein from residue 341 to residue 396 of the sequence SEQ ID NO: 502.
  • sequence SEQ ID NO: 138 is an EGF-like fragment of the human netrin 1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 137. This fragment comprises 48 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 1 protein from residue 403 to residue 450 of the sequence SEQ ID NO: 502.
  • the fragments of the netrin 1 protein corresponding to the protein sequences SEQ ID NO: 142 to SEQ ID NO: 262, as well as the corresponding nucleotide sequences SEQ ID NO: 141 to SEQ ID NO: 261 are grouped in the following table:
  • sequence SEQ ID NO: 264 corresponds to a laminin-type fragment (extracellular matrix protein that binds to certain integrins) of the human netrin G1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 263.
  • This fragment comprises 295 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin protein Gl ranging from residue 1 to residue 295 of the sequence SEQ ID NO: 506.
  • the sequence SEQ ID NO: 266 corresponds to an EGF (EGF factor repetition domain) fragment of the human netrin G1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 265.
  • This fragment comprises 143 amino acids and corresponds to to the fragment of the netrin protein Gl from residue 296 to residue 438 of the sequence SEQ ID NO: 506.
  • sequence SEQ ID NO: 268 is a laminin type fragment of the human netrin G1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 267. This fragment comprises 225 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin G1 protein. from residue 71 to residue 295 of the sequence SEQ ID NO: 506.
  • sequence SEQ ID NO: 270 is an EGF-type fragment of the human netrin G1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 269. This fragment comprises 47 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin G1 protein. from residue 296 to residue 342 of the sequence SEQ ID NO: 506.
  • sequence SEQ ID NO: 272 is an EGF-like fragment of the human netrin G1 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 271. This fragment comprises 37 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin G1 protein. from residue 373 to residue 409 of the sequence SEQ ID NO: 506.
  • sequence SEQ ID NO: 298 corresponds to a laminin-type fragment (extracellular matrix protein that binds to certain integrins) of the human netrin 3 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 297.
  • This fragment comprises 253 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 3 protein from residue 1 to residue 253 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 300 is a laminin-like fragment of the human netrin 3 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • sequence SEQ ID NO: 302 corresponds to an EGF (EGF factor repetition domain) type fragment of the human netrin 3 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 301.
  • This fragment comprises 180 amino acids and corresponds to to the fragment of the netrin 3 protein from residue 254 to residue
  • sequence SEQ ID NO: 304 is an EGF-like fragment of the human netrin 3 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 303 This fragment comprises 46 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 3 protein from residue 254 to residue 299 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 306 is an EGF-like fragment of the human netrin 3 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 305 This fragment comprises 50 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 3 protein from residue 373 to residue 422 of the sequence
  • sequence SEQ ID NO: 308 corresponds to the heparin-binding fragment of the human netrin 3 protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 307. This fragment comprises 148 amino acids and corresponds to the fragment of the netrin 3 protein from residue 433 to residue 580 of the sequence
  • the fragments of the netrin 3 protein corresponding to the protein sequences SEQ ID NO: 310 to SEQ ID NO: 352, as well as the nucleotide sequences corresponding SEQ ID NO: 309 to SEQ ID NO: 351 are grouped in the following table:
  • sequence SEQ ID NO: 354 corresponds to a fragment of the RGM-A protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 353. This fragment comprises 111 amino acids and corresponds to the fragment of the RGM-A protein ranging from residue 180 to residue 290 of the sequence SEQ ID NO: 512.
  • sequence SEQ ID NO: 356 corresponds to a fragment of the RGM-B protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 355. This fragment comprises 111 amino acids and corresponds to the fragment of the RGM-B protein ranging from residue 180 to residue 290 of the sequence SEQ ID NO: 514.
  • sequence SEQ ID NO: 358 corresponds to a fragment of the RGM-C protein, said fragment being encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 357.
  • This fragment comprises 111 amino acids and corresponds to the fragment of the RGM-C protein ranging from residue 180 to residue 290 of the sequence SEQ ID NO: 516.
  • the present invention also relates to a combination product comprising at least one neogene ligand, or optionally a nucleotide sequence coding for a neogene ligand, chosen in particular from:
  • netrin 1 represented by SEQ ID NO: 502 or SEQ ID NO: 504
  • the netrin Gl represented by SEQ ID NO: 506 or SEQ ID NO: 506
  • Netrin 3 represented by SEQ ID NO: 510 Netrin 4 represented by SEQ ID NO: 498 or SEQ ID NO: 500
  • one of the RGM molecules represented by SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 or SEQ ID NO: 520, or the mutated Netrin 4 represented by SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, or a fragment of one of these proteins in particular represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2n, n varying from 1 to 248,
  • nucleotide sequence coding for one of the abovementioned proteins in particular represented by one of the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO
  • doxorubicin especially chosen from: doxorubicin, methotrexate, vinblastine, vincristine, cladribine, fluorouracil, cytarabine, anthracyclines, cisplatin, cyclophosphamide, fludarabine, gemcitabine, aromatase inhibitors, irinotecan, navelbine, oxaliplatin, taxofen, taxol or taxotere, for simultaneous use, separated or spread in time for the treatment of cancer.
  • chemotherapy agent especially chosen from: doxorubicin, methotrexate, vinblastine, vincristine, cladribine, fluorouracil, cytarabine, anthracyclines, cisplatin, cyclophosphamide, fludarabine, gemcitabine, aromatase inhibitors, irinotecan, navelbine, oxaliplatin, taxofen, taxol or taxotere
  • the doses of the anti-angiogenic agent are from about 10 to about 20,000 ⁇ g / kg of body weight.
  • the periodicity of the injections is determined in particular by analogy to the dosage of the anti-angiogenic treatment currently existing on the market under the name of Avastin.
  • the present invention relates to new fragments of Netrin 4.
  • the present invention 'relates to novel fragments of the protein netrin 4, characterized in that they comprise or consist of one of the following sequences:
  • sequence SEQ ID NO: 2p a sequence SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 to 63, or any sequence derived from one of the abovementioned sequences, in particular by substitution, deletion or addition of one or more amino acids, provided that this derived sequence has anti-angiogenic activity, or
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 261 and 515 of SEQ ID NO: 498, provided that this homologous sequence has anti-angiogenic activity.
  • SEQ ID NO: 2p sequences correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 126, namely the following protein sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120,
  • SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 124 or SEQ ID NO: 126, as previously defined.
  • the fragments SEQ ID NO: 2p are new fragments of netrin 4, exhibiting an activity of inhibition of angiogenesis.
  • the abovementioned SEQ ID NO: 2p-1 sequences encode the aforementioned protein sequences SEQ ID NO: 2p, and correspond to the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 1 coding for SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 coding for SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 coding for SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 coding for SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 coding for SEQ ID NO: 10, SEQ
  • SEQ ID NO: 11 encoding SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 encoding SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 encoding SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 encoding SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 19 coding for SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 coding for SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 coding for SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 coding for SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO: 27 encoding SEQ ID NO: 28,
  • SEQ ID NO: 29 coding for SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 coding for SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 coding for SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 coding for SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 encoding SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 encoding SEQ ID NO: 40, SEQ ID. NO: 41 coding for SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 coding for SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 coding for SEQ ID NO: 46,
  • SEQ ID NO: 47 coding for SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 coding for SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 coding for SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 coding for SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 encoding SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 encoding SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 encoding SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 encoding SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 encoding SEQ ID NO: 64,
  • SEQ ID NO: 65 coding for SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 coding for SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 coding for SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 coding for SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 encoding SEQ ID NO: 74, - SEQ ID NO: 75 encoding SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 encoding SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 encoding SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 encoding SEQ ID NO: 82,
  • SEQ ID NO: 83 encoding SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 encoding SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 encoding SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 encoding SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 encoding SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 encoding SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 encoding SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 encoding SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 coding for SEQ ID NO: 100,
  • SEQ ID NO: 101 coding for SEQ ID NO: 102
  • SEQ ID NO: 103 coding for SEQ
  • SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 105 coding for SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 coding for SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 encoding SEQ ID NO: 110, SEQ
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein as defined above .
  • nucleotide sequence according to the invention is characterized in that it comprises or consists of:
  • nucleotide sequence derived, by degeneracy of the genetic code, from one of the abovementioned nucleotide sequences, and coding for a protein represented by SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 to 63,
  • nucleotide sequence derived in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, of one of the abovementioned nucleotide sequences coding for a protein derived from one of the sequences SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 at 63, as defined above,
  • any homologous nucleotide sequence of one of the abovementioned nucleotide sequences preferably having an identity of at least approximately 50%, with one of the sequences SEQ ID NO: 2p-1 coding for a homologous protein of SEQ ID NO : 2p, as defined above, p ranging from 1 to 63,
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the sequence complementary to one of the abovementioned sequences.
  • hybridize under stringent conditions corresponds in particular to a hybridization buffer such as 0.5X SSC, at a hybridization temperature of 60 ° C., as well as to a washing medium such as O, IX SSC supplemented with 1% of SDS and at a wash temperature of 50 ° C.
  • the present invention also relates to a recombinant vector, in particular plasmid, cosmid, phage or virus DNA, containing a nucleotide sequence as defined above, in particular SEQ ID NO: 2p-1, p varying from 1 to 63.
  • An advantageous vector according to the invention contains the elements necessary for the expression in a host cell of polypeptides encoded by nucleic acids. aforementioned, in particular SEQ ID NO: 2p-1, p varying from 1 to 63, inserted into said vector.
  • the present invention relates to a host cell, chosen in particular from bacteria, viruses, yeasts, fungi, plants or mammalian cells, said host cell being transformed, in particular using a recombinant vector as defined above.
  • the present invention also relates to an antibody characterized in that it is specifically directed against a protein as mentioned above, namely a fragment of netrin 4, in particular represented by SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 at 63.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, comprising as active substance,
  • a protein as defined above corresponding to the fragments of netrin 4, and preferably one of the sequences SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 to 63, or
  • nucleotide sequence as defined above, in particular one of the sequences SEQ ID NO: 2p-1, p varying from 1 to 63, or
  • an antibody as defined above in particular directed against one of the sequences SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 to 63.
  • the present invention also relates to the use:
  • a protein as defined above corresponding to the fragments of netrin 4, and preferably one of the sequences SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 to 63, or
  • nucleotide sequence as defined above, in particular one of the sequences SEQ ID NO: 2p-1, p varying from 1 to 63, or
  • an antibody as defined above in particular directed against one of the sequences SEQ ID NO: 2p, p varying from 1 to 63.
  • a medicinal product intended for the treatment of pathologies requiring the inhibition of endothelial proliferation, particularly in the context of the following pathologies: cancers and leukemias, age-related macular degeneration, diabetic retinopathies, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcomas, Castelman's disease and Kaposi's sarcoma, or as part of the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • the present invention relates to the use of RGM and new RGM fragments
  • the present invention relates to the use of: a protein characterized in that it comprises or consists of:
  • fragment of this protein comprising in particular about 40 to about 150 amino acids, and being represented in particular by one of the sequences SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO : 356 or SEQ ID NO: 358,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 511 encoding SEQ ID NO: 512
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 513 coding for SEQ ID NO: 514
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 515 coding for SEQ ID NO: 516
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 517 coding for SEQ ID NO: 518
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 519 coding for SEQ ID NO: 520
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 353 coding for SEQ ID NO: 354, or the nucleotide sequence SEQ ID NO: 355 coding for
  • SEQ ID NO: 356 or the nucleotide sequence SEQ ID NO: 357 coding for SEQ ID NO: 358,
  • a medicament intended for the prevention or treatment of non-tumoral pathologies requiring inhibition of endothelial proliferation, particularly in the context of the following conditions: age-related macular degeneration, diabetic retinopathies, rheumatoid arthritis, angiomas, or in the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • the present invention also relates to RGM fragments, characterized in that they comprise or consist of one of the following sequences:
  • sequence homologous to one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region comprised between amino acids at position 180 and 290 of SEQ ID NO: 512, as' the proviso that this sequence homologue has anti-angiogenic activity.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for one of the RGM fragments as defined above.
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355 or SEQ ID NO: 357 or any nucleotide sequence derived, by degeneracy of the genetic code, from one of the aforementioned nucleotide sequences, and encoding a protein represented by SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 or SEQ ID NO: 358,
  • nucleotide sequence derived in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, from one of the abovementioned nucleotide sequences coding for a protein derived from SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 or SEQ ID NO : 358, as defined above,
  • any homologous nucleotide sequence of one of the aforementioned nucleotide sequences preferably having an identity of at least about 50%, with the sequence SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355 or SEQ ID NO: 357, coding for a homologous protein of SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 or SEQ ID NO: 358, as defined above,
  • nucleotide sequence complementary to the abovementioned sequences or any nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the sequence complementary to one of the abovementioned sequences.
  • hybridize under stringent conditions corresponds in particular to a hybridization buffer such as 0.5X SSC, at a hybridization temperature of 60 ° C., as well as to a washing medium such as O 5 IX SSC added with 1% SDS and at a wash temperature of 50 ° C.
  • a hybridization buffer such as 0.5X SSC
  • a washing medium such as O 5 IX SSC added with 1% SDS and at a wash temperature of 50 ° C.
  • the present invention also relates to a recombinant vector, in particular plasmid, cosmid, phage or viral DNA, containing a nucleotide sequence as defined above, said recombinant vector preferably containing the elements necessary for the expression in a host cell of the polypeptides encoded by the aforementioned nucleic acids inserted into said vector.
  • the present invention also relates to a host cell, chosen in particular from bacteria, viruses, yeasts, fungi, plants or mammalian cells, said host cell being transformed, in particular using a recombinant vector such as defined above.
  • the present invention relates to an antibody characterized in that it is specifically directed against one of the aforementioned RGM fragments.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, comprising as active substance, - one of the aforementioned RGM fragments, or
  • nucleotide sequence as defined above, coding for one of the aforementioned RGM fragments, or
  • the present invention also relates to the use
  • nucleotide sequence as defined above coding for one of the aforementioned RGM fragments, or an antibody as defined above, directed against one of the fragments of
  • RGM mentioned above, for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies requiring inhibition of endothelial proliferation, particularly in the context of the following pathologies: cancers and leukemias, age-related macular degeneration, diabetic retinopathies , rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcomas, Castelman's disease and Kaposi's sarcoma, or in the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • the present invention also relates to the use of fragments of Netrin 1, Netrin 3 and its fragments, Netrin Gl and its fragments, as well as the corresponding new fragments.
  • the present invention relates to the use:
  • netrin Gl represented by the sequence SEQ ID NO: 506 or by the sequence SEQ ID NO: 508, or netrin 3 represented by the sequence SEQ ID NO: 506
  • nucleotide sequence corresponding in particular to the nucleotide sequence SEQ ID NO: 505 coding for SEQ ID NO: 506, or to the nucleotide sequence SEQ ID NO: 507 coding for SEQ ID NO: 508, or the nucleotide sequence SEQ ID NO: 509 coding for SEQ ID NO: 510, or a sequence SEQ ID NO: 2m-1 encoding SEQ ID NO: 2m, m varying from 64 at 176, or at the sequence SEQ ID NO: 371 coding for SEQ ID NO: 372,
  • Fab fragment of anti-idiotypic antibodies for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of pathologies requiring the inhibition of endothelial proliferation, particularly in the context of following pathologies: cancers and leukemias, degeneration age-related macular disorders, diabetic retinopathies, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcomas, Castelman's disease and Kaposi's sarcoma, or in the treatment of obesity or retinal neovascularization .
  • sequences SEQ ID NO: 2m mentioned above correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 128 to SEQ ID NO: 352, that is to say to the following protein sequences: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ
  • SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206,
  • SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296,
  • SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352.
  • SEQ ID NO: 2m-1 sequences encode the aforementioned protein sequences SEQ ID NO: 2m, and correspond to the sequences nucleotides: SEQ ID NO: 127 coding for SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 137 encoding SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 encoding SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 encoding SEQ ID NO: 142, SEQ
  • SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 151 coding for SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153 coding for SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 coding for SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 coding for SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 encoding SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 coding for SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153 coding for SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 coding for SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 coding for SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 encoding SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 coding for SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153 coding for SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 coding for SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 coding for SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 181 coding for SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 encoding SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 coding for SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 encoding SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 coding for SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 encoding SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 coding for SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 encoding SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 encoding SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181
  • SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 201 coding for SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 coding for SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 coding for SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 coding for SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 encoding SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 coding for SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 coding for SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 coding for SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 coding for SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 encoding SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 coding for SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 coding for SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 coding for SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 coding for SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 237 coding for SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 encoding SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 coding for SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 coding for SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 encoding SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 coding for SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249 coding for SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 coding for SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 coding for SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255 coding for SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 259 encoding SEQ ID NO: 260, 'SEQ ID NO: 261 encoding SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263 encoding SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 encoding SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 encoding SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269 encoding SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271 encoding SEQ ID NO: 272 , SEQ ID NO: 273 coding for SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 275 coding for SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277 coding for SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279 coding for SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281 coding for SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 coding for SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 coding for SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 coding for SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 coding for SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO:
  • the present invention relates to a protein, characterized in that it comprises or consists of one of the following sequences:
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 284 and 487 of SEQ ID NO: 502, provided that this homologous sequence has an anti-angiogenic activity, provided that said protein is different from the sequence SEQ ID NO: 502 or SEQ ID NO: 504.
  • SEQ ID NO: 2i sequences are fragments of netrin 1 and correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 128 to SEQ ID NO: 262, that is to say the following protein sequences: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220,
  • the present invention also relates to the fragments of Netrin Gl, characterized in that they comprise or consist of one of the following sequences: a sequence SEQ ID NO: 2j, j varying from 132 to 148, or
  • sequences SEQ ID NO: 2j correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 264 to SEQ ID NO: 296, that is to say: SEQ ID NO: 264, SEQ
  • the present invention also relates to the fragments of netrin 3, characterized in that they comprise or consist of one of the following sequences:
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 254 and 433 of SEQ ID NO: 510, provided that this homologous sequence has anti-angiogenic activity.
  • sequences SEQ ID NO: 2k mentioned above correspond to the protein sequences SEQ ID NO: 298 to 352, that is to say to the following protein sequences: SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350 or SEQ ID NO: 352.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein as defined above, namely a nucleotide sequence coding for fragments of netrin 1.
  • nucleotide sequence derived, by degeneracy of the genetic code from one of the abovementioned nucleotide sequences and coding for a protein represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2i, i ranging from 64 to 131,
  • nucleotide sequence derived in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, of one of the abovementioned nucleotide sequences coding for a protein derived from one of the sequences SEQ ID NO: 2i, i varying from 64 at 131, as defined above,
  • any homologous nucleotide sequence of one of the abovementioned nucleotide sequences preferably having an identity of at least approximately 50%, with one of the sequences SEQ ID NO: 2i-1 coding for a homologous protein of SEQ ID NO 2i, i ranging from 64 to 131, as defined above, or any nucleotide sequence complementary to the abovementioned sequences,
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the sequence complementary to one of the abovementioned sequences, provided that said nucleotide sequence is different from the sequence SEQ ID NO: 501 or SEQ ID NO: 503.
  • SEQ ID NO: 2i-1 sequences encode the aforementioned netrin 1 fragments, represented by SEQ ID NO: 2i, and correspond to the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 127 coding for SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO : 129 coding for SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 coding for SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 coding for SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 encoding SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 encoding SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 encoding SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 encoding SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 encoding SEQ ID NO: 144 , SEQ ID NO: 145 coding for SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 coding for SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 coding
  • SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 163 coding for SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 coding for SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 coding for SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 coding for SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 coding for SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 coding for SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 coding for SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 coding for SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 163 coding for SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 coding for SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 coding for SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 coding for SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 coding for SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 coding for SEQ ID
  • SEQ ID NO: 179 coding for SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 coding for SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 coding for SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 coding for SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187 encoding SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 encoding SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 encoding SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 encoding SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195 encoding SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 encoding SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 encoding SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 encoding SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 encoding SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 encoding SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 213 coding for SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215 coding for SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217 coding for SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 coding for SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221 coding for SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 coding for SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225 coding for SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 coding for SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 coding for SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215 coding for SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217 coding for SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 coding for SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221 coding for SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 coding
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active substance, a protein corresponding to the netrin fragments 1, as defined above, or
  • an antibody characterized in that it is specifically directed against a protein as defined above, or
  • the present invention relates to the use of: a protein corresponding to the netrin fragments 1, as defined above, or
  • an anti-idiotypic antibody of a protein as defined above for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of pathologies requiring inhibition of proliferation and / or endothelial migration, particularly in the context of the following pathologies: cancers and leukemias, age-related macular degeneration, choroidal neovascularization complicating myopia, corneal neovascularization, in particular graft rejection, glaucoma, diabetic retinopathies or premature diabetic retinopathies, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angio sarcomas, Castelman's disease and Kaposi's sarcoma, or in the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • the present invention also relates to the use: - of an antibody, 'characterized in that it is specifically directed against a protein as defined above, or
  • Fab fragment of anti-idiotypic antibodies of a protein as defined above for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of pathologies requiring the stimulation of proliferation and / or endothelial migration, particularly in the context of the following pathologies: ischemic pathologies such as arteritis of the lower limbs, infarction myocardium, stroke, scleroderma or Raynaud's disease.
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein as defined above, namely a nucleotide sequence coding for fragments of Netrin Gl.
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 2j-1, j varying from 132 to 148
  • nucleotide sequence derived by degeneracy of the genetic code, from one of the abovementioned nucleotide sequences, and encoding a protein represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2j, ranging from 132 to 148, or any nucleotide sequence derived, in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, of one of the abovementioned nucleotide sequences coding for a protein derived from one of the sequences SEQ ID NO: 2j, ranging from 132 to 148, as defined above,
  • nucleotide sequence of one of the abovementioned nucleotide sequences, preferably having an identity of at least about
  • nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the sequence complementary to one of the abovementioned sequences.
  • SEQ ID NO: 2j-1 encode the aforementioned Gl netetrin fragments, represented by SEQ ID NO: 2j, and correspond to the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 263 coding for SEQ ID NO: 264,
  • SEQ ID NO: 265 coding for SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 coding for SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269 coding for SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271 coding for SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273 coding for SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275 encoding SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277 encoding SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279 encoding SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281 encoding SEQ ID NO: 282 , SEQ ID NO: 283 coding for SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 coding for SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 coding for SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 coding for SEQ ID NO : 290, SEQ ID NO: 291 encoding SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293 encoding
  • the present invention also relates to a nucleotide sequence coding for a protein as defined above, namely a nucleotide sequence coding for fragments of netrin 3.
  • nucleotide sequence derived, by degeneracy of the genetic code, from one of the abovementioned nucleotide sequences, and coding for a protein represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2k, k varying from 149 to 176,
  • nucleotide sequence derived in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, of one of the abovementioned nucleotide sequences coding for a protein derived from one of the sequences SEQ ID NO: 2k, k varying from at 176, as defined above,
  • nucleotide sequence homologous to one of the abovementioned nucleotide sequences preferably having an identity of at least approximately 50%, with one of the sequences SEQ ID NO: 2k-1 coding for a protein homologous to one of sequences SEQ ID NO: 2k, k varying from 149 to 176, as defined above,
  • SEQ ID NO: 2k-1 sequences encode the above-mentioned 3 netrin fragments, represented by SEQ ID NO: 2k, and correspond to the following nucleotide sequences: SEQ ID NO: 297 coding for SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO : 299 coding for SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301 coding for SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303 coding for SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305 coding for SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307 coding for SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309 coding for SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311 coding for SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313 coding for SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315 coding for SEQ ID NO:
  • the present invention also relates to a recombinant vector, in particular plasmid, cosmid, phage or virus DNA, containing a nucleotide sequence as defined above, namely a nucleotide sequence coding for one of Netrin 1, netrin 3 fragments. or netrin G, said recombinant vector being characterized in that it contains the elements necessary for the expression in a host cell of the polypeptides encoded by the aforementioned nucleic acids, inserted in said vector.
  • the present invention also relates to a host cell, chosen in particular from bacteria, viruses, yeasts, fungi, plants or mammalian cells, said host cell being transformed, in particular using a recombinant vector such as defined above.
  • the present invention also relates to an antibody characterized in that it is specifically directed against a protein as defined above, in particular directed against a fragment of netrin 1, netrin 3, or netrin G or the like. as defined above.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, comprising as active substance, one of the fragments of Netrin 1, Netrin 3, or Netrin G mentioned above, or
  • nucleotide sequence as defined above, coding for one of the aforementioned fragments of Netrin 1, Netrin 3, or Netrin G, or an antibody as defined above, directed against the one of the fragments of Netrin 1, Netrin 3, Netrin G mentioned above, or
  • the present invention also relates to the use:
  • any homologous sequence of one of the abovementioned sequences preferably having an identity of at least about 50% with the region between the amino acids at position 284 and 487 of SEQ ID NO: 502, provided that this homologous sequence has an anti-angiogenic activity, provided that said protein is different from the sequence SEQ ID NO: 502 or SEQ ID NO: 504
  • an anti-idiotypic antibody Fab fragment as defined above, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of pathologies requiring the inhibition of endothelial proliferation, particularly in the context of following pathologies: cancers and leukemias, choroidal neovascularization complicating myopia, corneal neovascularization, in particular transplant rejection, glaucoma, diabetic retinopathies or prematurity, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcomas, the Castelman's disease and Kaposi's sarcoma, or as part of the treatment of obesity or retinal neovascularization.
  • cancers and leukemias choroidal neovascularization complicating myopia
  • corneal neovascularization in particular transplant rejection, glaucoma, diabetic retinopathies or prematurity, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, angiomas, angiosarcom
  • the present invention relates to new uses of netrin.
  • the present invention relates to the use of: a protein characterized in that it comprises or consists of:
  • netrin Gl represented by the sequence SEQ ID NO: 506 or by the sequence SEQ ID NO: 508, netrin 3 represented by the sequence SEQ ID NO: 510 or netrin 4 represented by the sequence SEQ ID NO: 498 or by the sequence SEQ ID NO: 500
  • * a fragment of one of these proteins or Netrin 1 represented by the sequence SEQ ID NO: 502 or SEQ ID NO: 504 provided that this fragment exhibits an activating activity pericytes, said fragment comprising in particular about 40 to about 400 amino acids, and being especially represented by one of the sequences SEQ ID NO: 2m, m varying from 1 to 176, or by the sequence SEQ ID NO: 372,
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 505 coding for SEQ ID NO: 506
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 507 coding for SEQ ID NO: 508
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 509 coding for SEQ ID NO: 510
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 497 coding for SEQ ID NO: 498
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 499 coding for SEQ ID NO:
  • the present invention also relates to the use as defined above of netrin 4 protein, represented by the sequence SEQ ID NO: 498 or SEQ ID NO: 500, for the preparation of a medicinal product that can be administered with reasonable from about 0.1 to about 20 mg / kg, especially intravenously, subcutaneously, systemically, intravitreally, locally by infiltration or via a eye drops, possibly associated with electropermination.
  • the present invention also relates to the use as defined above, characterized in that the activity of inhibiting the formation of atheroma plaques is measured according to the proliferation or migration test mentioned above, and in that this Inhibition activity corresponds to a percentage inhibition of between 20% and 100% of the atheroma plaques obtained in the absence of the protein, or the nucleotide sequence or the anti-idiotypic antibody as defined above. above.
  • the present invention relates to the use as defined above of anti-idiotypic antibodies of a netrin, in particular mutine or non-mutated netrin 4 protein, represented by the sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, and with the sequence SEQ ID NO: 498 or SEQ ID NO: 500, recognizing the UNC5H4 receptor on the surface of pericytes or smooth muscle cells, for the preparation of a medicament for the prevention or control of treatment of the following pathologies:
  • the present invention also relates to the use of the UNC5H4 receptor on the surface of pericytes or smooth muscle cells, or pericytes or smooth muscle cells carrying these receptors, for the implementation of a method for screening compounds that promote proliferation. or the migration of pericytes or smooth muscle cells.
  • the present invention relates to a method for screening compounds that promote the proliferation or migration of pericytes or smooth muscle cells, characterized in that it comprises the following steps:
  • the tests used in the context of this screening method are the tests as described above for proliferation or migration.
  • the present invention relates to a method for screening compounds which modulate the binding between the UNC5H4 receptor and mutated or non-mutated netrin 4, represented by the sequence SEQ ID NO: 522 or SEQ ID NO: 524, or by the sequence SEQ ID NO: 498 or SEQ ID NO: 500, characterized in that it comprises the following steps:
  • the proteins containing the extracellular domains of UNC5H4 receptor fused to a Fc sequence of human IgG are immobilized 'on microtitration plates ( incubation at a concentration of between 1 and 1000 ng / ml).
  • the compounds are added serially diluted in PBS buffer containing 0.05% Tween 20 and 10-500 ⁇ g Netrin 1, 3, 4 or G labeled by any suitable method (radioactive iodine, biotin, fluorochrome).
  • the amount of netrin bound to the receptor is revealed either by adding an appropriate concentration of anti-netrin antibody coupled to peroxidase, either by measuring radioactivity, or by adding peroxidase-coupled avidin, or by fluorescence measurement. The peroxidase was then revealed by a colorimetric reaction. In all cases, the amount of the test compound is measured by its ability to inhibit the fixed amount of netrin.
  • Figure 1 corresponds to the HUAEC cell migration test.
  • the cells are counted in 8 fields and the mean and the standard deviation are represented on the ordinate axis.
  • the x-axis corresponds to the concentration of the netrin protein
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Figure 2 corresponds to the test of migration of the smooth muscle cells of the aorta.
  • the cells are counted in 8 fields and the mean and standard deviation are represented on the y-axis.
  • the abscissa axis corresponds to the concentration of the netrin 1 and netrin 4 proteins in ng / ml.
  • the white columns correspond to a concentration of 0 ng / ml; columns with vertical hatching correspond to a concentration of 6 ng / ml; columns with horizontal hatching correspond to a concentration of 18 ng / ml; columns with oblique hatching correspond to a concentration of 55 ng / ml; the gray columns correspond to a concentration of 160 ng / ml and the black columns correspond to a concentration of 500 ng / ml.
  • Figure 3 corresponds to the proliferation test of HUAEC cells.
  • the abscissa axis corresponds to the concentration of the netrin 4 protein (500 ng / ml) in the presence of 2 ng / ml of VEGF or FGF2 as indicated in the figure and the y-axis at the percentage of proliferation.
  • the black columns correspond to the witness; the white columns correspond to the proliferation percentage in the presence of 500 ng / ml netrin 4 and the gray columns correspond to the proliferation percentage in the presence of 500 ng / ml of netrin 4 and 5 ⁇ g / ml of IgG directed against the receptor neogenin.
  • Figure 4 corresponds to the analysis of the effect of Netrin 4 (NET-4), Netrin 1 (NET-I) and Netrin Gl (NET-Gl) on the proliferation of MSM.
  • the curve represented by diamonds corresponds to netrin 4.
  • the curve represented by squares corresponds to Netrin Gl.
  • the curve represented by triangles corresponds to Netrin 1.
  • Figure 5 shows the effect of an anti-neogenin antibody on the proliferation of MSM.
  • the y-axis represents the optical density at 595 nm.
  • the white columns correspond to the proliferation without anti-neogenin antibodies and the black columns correspond to the proliferation in the presence of 5 ⁇ g / ml of anti-neogenin antibodies.
  • Figure 6 corresponds to the apoptosis test of HUAEC cells.
  • the x-axis corresponds to the concentration of the netrin 4 protein (500 ng / ml) in the presence of 50 ng / ml of VEGF or FGF2 as indicated in the figure and the y-axis to the percentage of apoptotic cells.
  • the white columns correspond to the control without net 4; the gray columns correspond to the percentage of apoptosis in the presence of 500 ng / ml netrin 4.
  • Figure 7A is the test for proliferation of smooth muscle cells of aorta.
  • the abscissa axis corresponds to the concentration in ng / ml of the netrin 4 protein or the mutated netrin 4 protein and the ordinate axis to the percentage of proliferation.
  • the left curve represented by squares corresponds to the mutated netrin 4.
  • the right curve represented by lozenges corresponds to Netrin 4.
  • Figure 7B corresponds to the test of migration of the smooth muscle cells of the aorta.
  • the cells are counted in 8 fields and the mean and the standard deviation are plotted on the y-axis.
  • the abscissa axis corresponds to the concentration of the netrin 4 and netrin 4 proteins mutated in ng / ml.
  • the curve represented by squares corresponds to the mutated netrin 4.
  • the curve represented by diamonds corresponds to Netrin 4.
  • Figure 8 corresponds to a HUAEC cell proliferation assay to determine the effect of PC3 cell supernatants transfected with mutated (clone 1 and clone 5) or non-mutated netrin 4 (clone 8, 10 and 15).
  • the y-axis represents the percentage of proliferation.
  • Column 1 corresponds to the control (DMEM alone);
  • column 2 corresponds to untransfected PC3 cells;
  • column 3 corresponds to clone 1;
  • column 4 corresponds to clone 5;
  • column 5 corresponds to clone 8;
  • column 6 corresponds to clone 10;
  • column 7 corresponds to clone 15.
  • Figure 9 corresponds to an analysis of tumor progression.
  • the ordinate axis corresponds to the volume of the tumors (in mm 3 ).
  • the curve with the diamonds corresponds to the untransfected PC3 cells.
  • the curve comprising the squares corresponds to the PC3 cells transfected with the clone 1.
  • the curve comprising the triangles corresponds to the PC3 cells transfected with the clone 5.
  • Figure 10 corresponds to an analysis of the tumor progression in the presence of AVASTIN.
  • the ordinate axis corresponds to the ratio of tumor volume measured after treatment to the tumor volume measured before treatment.
  • Column 1 corresponds to untransfected PC3 cells;
  • column 2 corresponds to clone 8 of PC3;
  • column 3 corresponds to clone 10 of PC3;
  • column 4 corresponds to clone 15 of PC3.
  • FIGS. 11A and 11B are an analysis of the effect of netrin 4 on choroidal vascularization in mice.
  • the mice were injected with 1 ⁇ l of PBS.
  • the mice received an injection of ⁇ l of PBS containing 1 ⁇ g of netrin 4.
  • the endothelial cells are immunostained and appear in white in FIGS. 11A and 11B.
  • Figures 12A, 12B, 12C correspond to the perfusion of a fluorescent dextran which visualizes the choroidal neovessels around a gray laser impact in the center.
  • Figure 13 corresponds to the test of migration of aortic smooth muscle cells in the presence of deletion mutants of mutated netrin 4.
  • the cells are counted in 8 fields and the mean and the standard deviation are represented on the ordinate axis.
  • the abscissa axis corresponds to the concentration of Netrin 4 in ng / ml.
  • the curve with the crosses corresponds to Netrin 4 non-mutated.
  • the curve with the diamonds corresponds to the conditioned medium of the cells transfected with a complete sequence of mutated netrin 4.
  • the curve with the squares corresponds to the conditioned medium of the cells transfected with the sequence SEQ ID NO: 528.
  • the Netrin 1 (SEQ ID NO: 502), Netrin 4 (SEQ ID NO: 498), Netrin Gl (SEQ ID NO: 506), Netrin 3 (SEQ ID NO: 510) and Mutated Netrin 4 (SEQ ID NO.
  • netrin 1, netrin 4 and netrin G1 molecules are commercially available from R & D.
  • the 165 amino acid isoform of VEGF is produced by infection of SF9 insect cells with a recombinant baculovirus containing the corresponding cDNA (Plouet et al., 1997).
  • HUAEC Human umbilical arterial endothelial cells
  • Aortic smooth muscle cells were maintained in DMEM supplemented with 15% heat inactivated fetal calf serum (FCS), 100 ⁇ g / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin at 37 ° C in 10 minutes. % of CO 2 . Stem cultures received 2 ng / ml FGF every even day.
  • FCS heat inactivated fetal calf serum
  • RNAs of human umbilical cord artery (HUAEC) cells were extracted using TriPure (Roche). Then the RNAs were transcribed using Roche's RT-PCR Kit (AMV) as directed by the manufacturer.
  • AMV Roche's RT-PCR Kit
  • the conditions adopted for the amplification were: 35 cycles with denaturation at 94 ° C. for 1 minute; hybridization at 55 ° C for 1 minute; and extension at 72 ° C. for 1 minute.
  • the netrin 4 sequence was extracted from this vector and inserted into the vector pcDNA3.1 (-) / His myc C digested with the same restriction enzymes. This latter vector containing the complete sequence of the mutated netrin 4 was used to transfect cells. Identical manipulation led to obtaining an expression vector of wild-type 4 netrin using the sequence of wild-type 4 netrin.
  • the mutated netrin 4 was produced by transfection of CHO pgsA 745 cells by the vector containing the sequence of wild-type 4 netrin according to a protocol already described.
  • the protein was purified by affinity chromatograpy for heparin sepharose and eluted by a discontinuous gradient of NaCl (0.3, 1.0 and 2.0 M NaCl .NET 4m eluted with 2M NaCl, and one degree of purity> 90%.
  • mutant netrin 4 (NET 4m) was compared with that of wild-type 4 netrin (NET 4) according to the smooth muscle cell proliferation assay.
  • FIG. 7A shows that NET 4m triggers mitogenic activity at a concentration 1000 times lower than that of NET 4. Similarly in a migration test, NET-4m is 1000-fold more active than NET-4 (See Figure 7B ).
  • the pcDNA3.1 (-) / His myc C vector containing the complete sequence of the mutated netrin 4 (628 AA) was digested with the restriction enzyme BamHI, treated with the klenow fragment of polymerase 1, and then digested with the restriction enzyme PshAl.
  • the linearized fragment corresponding to the pcDNA3.1 (-) / His myc C vector containing the mutated netrin 4 sequence deleted from the cter domain (478-628) is then isolated after migration on agarose gel and purified on a Qiagen column. After ligation, one thus obtains a pcDNA3.1 (-) / His myc C expression vector containing the mutated netrin 4 sequence deleted from the cter domain (1-477).
  • the pcDNA3.1 (-) / His myc C vector containing the complete sequence of the mutated netrin 4 (628 aa) was digested with restriction enzyme Xcm1. This enzyme, which cuts the internal sequence of Netrin 4 at two sites (aa288 / aa488), allows the deletion of the protein from its central domain (domain V with EGF motifs). After purification of the fragment and ligation, an expression vector pcDNA3.1 (-) / His myc C containing the mutated netrin 4 sequence deleted from the central domain (288/488) is thus obtained.
  • this vector encodes a 312-amino acid truncated mutine 4-derived protein with the laminin domain sequence (1-288) and a protein sequence of 24 amino acids.
  • Vascular endothelial cells of human umbilical arteries are inoculated into 4 cm high density wells (50,000 cells / well).
  • the proliferation is stopped by overnight incubation in the presence of Ml 99 (Life Sciences) containing 2% FCS.
  • An injury is then performed in the monolayer using a foam scraper, to delimit a free surface of any cell.
  • the monolayers are then washed 3 times with M199 to remove non-adherent cells. A photograph is then taken to delimit the surface before any cell migration.
  • the wells are then incubated in M 199 and
  • VSM Smooth muscle cells
  • the monolayers are then washed 3 times in DMEM to remove non-adherent cells. A photograph is then taken to delimit the surface before any cell migration.
  • the wells are then incubated in DMEM medium without FCS in the presence of variable concentrations of Netrin 4 (NET-4) or Netrin 1 (NET-I).
  • 96-well culture plates were inoculated with 2,000 HUAEC cells per well in EBM supplemented with 10% FCS.
  • the cells were stimulated or not with 2 ng / ml of VEGF 165 and different concentrations of netrin 1 or netrin 4. In some wells, 5 mg / ml of anti-neogenin antibody were added. After 5 days, the wells were rinsed gently with DMEM and the cells were fixed in 1% glutaldehyde for 20 minutes at room temperature. The fixed cells were quantified by crystal violet incorporation (Kueng et al., 1989): the cells were incubated in 0.1% crystal violet (Sigma) for 20 minutes.
  • netrin 1 or netrin 4 proteins used alone have no significant effect on basal proliferation (due to serum alone).
  • netrin 4 protein inhibits VEGF-induced proliferation in a dose-dependent fashion. 50% of the maximum effect is obtained with a concentration of 200 ng / ml.
  • anti-neogenin antibodies completely reverses the inhibitory activity of the proliferation induced by netrin 1 or netrin 4.
  • Smooth muscle cell proliferation assays 96-well culture plates were inoculated with 2,000 VSM cells per well in DMEM supplemented with 10% FCS. After 6 h, the cells are transferred into DMEM medium containing 2% FCS and then stimulated or not with different concentrations of Netrin 1, Netrin Gl or Netrin 4. After 5 days, the wells were rinsed with DMEM and the cells were fixed in 1% glutaldehyde, stained with crystal violet and solubilized with acetic acid. Optical density readings were performed at 595 nm. Similar results were obtained in three separate experiments. The values given are average optical densities of 6 well ⁇ SD.
  • Figure 4 shows that the proteins, Netrin Gl and Netrin 4 used alone have a significant effect on proliferation in a dose-dependent fashion. 50% of the maximum effect is obtained with a concentration of 20 ng / ml. On the other hand netrin 1 has a non-significant effect on proliferation.
  • 96-well culture plates were inoculated with 2,000 VSM cells per well in DMEM supplemented with 10% FCS. After 6 h the cells are transferred into DMEM medium containing 2% FCS and then stimulated or not with different concentrations of netrin 1, netrin Gl or netrin 4. In some wells 5 ⁇ g / ml of anti-neogenin antibodies were added. After 5 days, the wells were gently rinsed with DMEM and the cells were fixed in 1% glutaldehyde. for 20 minutes at room temperature.
  • the fixed cells were quantified by crystal violet incorporation (Kueng et al, 1989): the cells were incubated in 0.1% crystal violet (Sigma) for 20 minutes at room temperature, the unincorporated dye was removed in thoroughly washing the wells with large amounts of water and the incorporated crystallized violet dye was then solubilized with 100 ⁇ l of 10% acetic acid per well. Optical density readings were performed at 595 nm. Similar results were obtained in three separate experiments (see Figure 4). The values given are average optical densities of 6 well ⁇ SD.
  • FIG. 5 shows that the addition of anti-neogenin antibodies does not reverse the stimulating activity of proliferation induced by netrin 4.
  • 96-well ELISA plates (Nunc) were coated with VEGF 165 protein according to the protocol described in the article by Hutchings et al. (2003), diluted in 0.05 M carbonate buffer at pH 9.6 overnight at 4 ° C. Non-specific binding sites were blocked for 1 hour at 37 ° C with 5 mg / ml BSA (bovine serum albumin) in carbonate buffer and washed twice with DMEM prior to the experiments. The cells were trypsinized, washed and resuspended in 5 ml of DMEM with 10% FCS in an untreated plastic tube and incubated for 1 hour at 37 ° C with 10% CO 2 .
  • BSA bovine serum albumin
  • the cells were then concentrated by centrifugation and resuspended in DMEM + 0.2% BSA without serum and the cell suspension was treated for 20 minutes (37 ° C, 10% CO 2 ) with netrin 4 protein. used to modulate membership.
  • 40,000 cells per well were distributed in the wells in a volume of 100 ⁇ l of DMEM + 0.2% BSA. The cells were allowed to adhere at 37 ° C under 10% CO 2 for the desired time. Wells were gently washed three times with DMEM to remove non-adherent cells and adherent cells were fixed with 1% glutaraldehyde for 20 minutes at room temperature.
  • the fixed cells were quantified by crystal violet incorporation (Kueng et al, 1989): the cells were incubated with 0.1% crystallized violet (Sigma) diluted in 0.2 M borate buffer pH 9.5 for 20 minutes at room temperature, the unincorporated dye was removed by thoroughly washing the wells with large amounts of water and the incorporated crystal violet dye was then solubilized with 100 ⁇ l of 10% acetic acid per well.
  • crystal violet incorporation Karl et al, 1989
  • 50,000 HUAEC cells are deposited on culture wells previously gelatinized in EBM medium containing 10% FCS and 2 ng / ml VEGF. 2 days later the cells are incubated overnight in EBM medium containing 2% FCS and 200 ng / ml netrin 4 in the presence or absence of FGF2 or VEGF. The cells are rinsed 24 hours later and incubated with propidium iodide, fixed and examined under a fluorescence microscope. Cells with fragmented nuclei are counted in fluorescence and total cells are counted under direct light.
  • the operation is performed in at least 8 fields representing a minimum of 300 cells.
  • the percentage of cells with a fragmented nucleus is then calculated.
  • Netrin 4 alone does not have a significant effect on apoptosis.
  • Netrin 4 protein totally inhibits the anti-apoptotic effect exerted by VEGF or FGF-2 (see Figure 6).
  • a neutralizing antibody of Netrin 1, 3, Gl or 4 or of one of its abovementioned fragments is prepared by injecting an animal, in particular a mouse, said netrin or said fragment mixed with Freund ' s complete adjuvant (1 volume per volume of Netrin or Netrin fragment). An amount of netrin or netrin fragment between
  • the serum is separated and the immunoglobulins are purified by any usual fractionation method, in particular ammonium sulfate precipitation, affinity chromatography for protein A or G. The neutralizing activity of the proteins is measured. immunoglobulins by any described test (for example, in the case of netrin 4 or a fragment thereof, binding of labeled netrin 4 to the extracellular domain of any of its receptors, proliferation, migration, cellular adhesion).
  • a batch of immunoglobulins will be said to be neutralizing when it will have the ability to inhibit the interaction of Netrin 1, 3, 4 or Gl with either the extracellular domain of dcc, neogenin, UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3 or UNC5H4.
  • anti-idiotypic antibodies of Netrin 1, 3, Gl or 4, or one of their fragments are prepared by injecting the mice subcutaneously. 1-100 ⁇ g of the preparation of immunoglobulins neutralizing the activity of said netrin or said fragment previously described in combination with 100 ⁇ l of adjuvant, including Freund's complete adjuvant (Sigma). The injection is repeated 15, 30 and 45 days later. Fifty-five days after the first injection, 10 ⁇ g of the same antibody were injected into the mice intraperitoneally. Fifty-eight days after the first injection, the mice are sacrificed and their spleens are removed and dilacerated in ISCOVE medium to release the splenocytes.
  • the splenocytes are fused with mouse myeloma cells, including AG8X 63 cells (Kearney et al, 1979), and incubated at 100,000 cells / well.
  • the melting is carried out by adding 50 ⁇ l of polyethylene glycol (PEG) 20 times at 30 seconds intervals.
  • PEG polyethylene glycol
  • ISCOVE medium preheated to 37 ° C. are then added dropwise to the cell suspension, and after an incubation period of 4 minutes at 37 ° C., 4 ml are added.
  • the suspension is centrifuged then the cell pellet is then taken up in 100 ml of ISCOVE medium supplemented with 20% fetal calf serum and HAT IX (5OX: 5 mM hypoxanthine, 20 ⁇ M aminopterin and 0.8 mM thymidine) and distributed to 100 ⁇ l per well on macrophages.
  • ISCOVE medium supplemented with 20% fetal calf serum and HAT IX (5OX: 5 mM hypoxanthine, 20 ⁇ M aminopterin and 0.8 mM thymidine
  • the Fab fragments of anti-netrin immunoglobulin 1, 3, Gl or 4 prepared by any conventional technique, in particular a papain digestion, are immobilized on microtiter plates (0.1-20 ⁇ g / ml in carbonate buffer 50). mM pH 9.6). After saturation of the nonspecific sites by a solution of serum albumin diluted to 5 mg / ml in the same buffer, the supernatants of hybridoma cultures are added half diluted in PBS buffer (phosphate buffer solution) containing 0.05% of Tween 20. After rinsing, the anti-idiotypic antibodies are revealed by adding an appropriate concentration of mouse anti-Fc antibody coupled to peroxidase. The amount of bound anti-idiotypic antibody is then measured by peroxidase revelation and is proportional to the intensity of the colorimetric reaction.
  • Hybridomas selected by their ability to secrete antibodies against anti-netrin 1, 3, Gl or 4 antibodies are then cloned, i.e. the cells are seeded under limiting dilution conditions (5 cells / ml). ) under a volume 5 ml per well.
  • the medium is changed after 10 days. After 15 days, some wells contain foci of cells that have multiplied from the cell seeded initially, so all these cells are identical and are from the same clone. When the area occupied by the cells represents at least half of the total area of the well, the medium is taken and analyzed.
  • a second ELISA is then used: goat immunoglobulins directed against the Fc domains of human IgGs are incubated on microtiter plates (0.1-20 ⁇ g / ml in 50 mM carbonate buffer pH 9.6). After saturation of the nonspecific sites by a solution of serum albumin diluted to 5 mg / ml in the same buffer, the proteins containing the extracellular domains of the netrin receptors fused to a Fc sequence of human IgG are immobilized on the microtiter plates ( incubation at a concentration of between 1 and 100 ⁇ g / ml). The supernatants of hybridoma cultures are added half diluted in PBS buffer containing 0.05% Tween 20.
  • the anti-idiotypic antibodies are revealed by adding an appropriate concentration of anti-mouse Fc antibodies. coupled with peroxidase. The amount of bound anti-idiotypic antibody is then measured by peroxidase revelation and is proportional to the intensity of the colorimetric reaction.
  • the monoclonal anti-idiotypic antibodies are screened by a battery of tests, in particular by an ELISA test on extracellular domains of the known netrin receptors (dcc, neogenin, UNC5-A, UNC5-B, UNC5-C, UNC5-D), inhibition of HUAEC cell proliferation or migration or in vivo measurement assays for anti-angiogenic activity.
  • the anti-idiotypic antibodies are therefore mimes of netrin domains. The goal is to make an "internal image" of a Netrin domain and thus to be able to obtain an antibody binding 1 netrin receiver without binding all the receptors.
  • the agonist function of this given antibody is determined by measuring its activity on cells, that is to say that the functions of the antibodies are inhibited. HUAEC without inhibiting or stimulating netrin functions on MSM and / or stimulating VSM without affecting HUAEC.
  • diabetic retinopathies at an early stage where pericyte depletion precedes neovascularization
  • psoriasis in particular psoriatic arthritis
  • rat tails were screened and dissected to recover the white bundles, which are predominantly of type I collagen. Collagen is extracted from these fibers in 50 ml of cold 0.5 M acetic acid and shaken overnight. . The liquid is then centrifuged at 5000g for 40 minutes and the supernatant is recovered.
  • the gel is poured into culture wells (2 mm thick) and incubated at 37 ° C to solidify. Cells are added after 15 minutes (100,000 cells / cm 2 ) on the surface of the gel. After 2 hours, the different soluble factors are added and the cells are observed and photographed after 24 hours.
  • 96-well culture plates were inoculated with 2,000 VSM cells per well in DMEM supplemented with 10% FCS. After 6 h the cells are transferred into DMEM medium containing 2% FCS and then stimulated or not with different concentrations of netrin 4 (NET-4) or netrin 4 mutated (NET-4m). After 5 days, the wells were rinsed with DMEM and the cells were fixed in 1% glutaldehyde, stained with crystal violet and solubilized with acetic acid. Optical density readings were performed at 595 nm. Similar results were obtained in three separate experiments. The values given are average optical densities of 6 well ⁇ SD.
  • the mutated netrin 4 was produced by transfection of CHO pgsA 745 cells with the vector containing the wild-type 4 netrin sequence according to a protocol already described (Plouet, 1997). The protein was purified by affinity chromatography for heparin sepharose and eluted with a discontinuous gradient of NaCl (0.3, 1.0 and 2.0 M NaCl.
  • 4M is eluted with 2M NaCl and has a degree of purity> 90%.
  • NET 4 m The biological activity of NET 4 m was compared with that of wild type NET 4 according to the smooth muscle cell proliferation assay.
  • Figure 7A shows that half of the maximal stimulation is obtained with a concentration of 120 ng / ml of non-mutated netrin 4 (NET-4) and 0.1 ng / ml of mutated netrin 4 (NET-4m). This means that the mitogenic activity of mutated netrin 4 is 1000 times more active than netrin
  • the confluent monolayer of VSM is incubated overnight in the presence of DMEM.
  • An injury is then performed in the monolayer using a foam scraper, then the wells are washed 3 times with DMEM and then incubated in the presence of varying concentrations of Netrin 4 (NET-4) or Netrin 4 mutated (NET- 4m).
  • NET-4 Netrin 4
  • NET- 4m Netrin 4 mutated
  • the prostate cancer cells are cultured in DMEM medium supplemented with antibiotics and 10% fetal calf serum.
  • the transfection protocol was established as follows:
  • plasmid 5 ⁇ g of plasmid are mixed with 5 ⁇ l of lipofectin and 100 ⁇ l of DMEM (without antibiotics) for half an hour at room temperature and gently stirred. The mixture is then diluted to 5 ml in DMEM and dropped into the box containing the PC3 cells. After incubation for 6 hours in an oven at 37 ° C., the medium is aspirated and replaced with 10 ml of fresh medium.
  • the Netrin content 4 of each medium has measured as described previously in the paragraph concerning the proliferation test. 4 ⁇ l of conditioned medium were added to 100 ⁇ l of culture medium. The results are expressed as a percentage of proliferation with respect to the control (well containing 4 ⁇ l of DMEM medium).
  • conditioned medium of NET-4 m clones 1, 5 and NET-4 clone 8 stimulate proliferation of HUAEC cells by only 200%, which corresponds to about 50% of the proliferation induced by the conditioned medium.
  • netrin 4 (NET-4) or mutated netrin 4 (NET-4 m) inhibit the proliferation of HUAECs without modifying the proliferation of PC3 cancer cells.
  • mice (clones 1 and 5) were injected into nude mice in the flank (1 million cells per injection).
  • mutated netrin 4 exerts antitumor activity by its anti-angiogenic activity.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • An anti-VEGF antibody is marketed under the name AVASTIN. Knowing that netrin 4 (NET-4) acts by a mechanism of action different from VEGF, we measured the synergistic effect of netrin 4 (NET 4) with an anti-VEGF antibody marketed under the name of AV ASTIN. .
  • mice were grafted with either untransfected PC3 or NET-4 cloned 8 transfected PC3 with a marginal reduction in tumor volume or clone 10 or Which give rise to tumors of equivalent volume to untransfected PC3 cells (not shown).
  • the tumors had a volume greater than 600 mm 3
  • the mice received a peritoneal injection of AV ASTIN (50 ⁇ g every 3 days), a dose corresponding to the therapeutic recommendations in human pathology (5 mg / kg / week). and the tumor volume was measured as previously described.
  • AV ASTIN has no effect on untransfected PC3 tumors or PC3 clones 10 or 15 that do not secrete sufficient NET-4 activity to inhibit tumor progression. After 4 days the increase in tumor volume with respect to volume at the beginning of the treatment is 200, 150 and 200% respectively.
  • mice are anesthetized by means of an intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (Centravet) (200 ⁇ l per mouse of a solution diluted to 0.6 mg / 100 ⁇ l). After falling asleep, the mice undergo pupillary dilation with 1% tropicamide. A 12mm diameter round glass blade acts as a contact lens to magnify the fundus. Then a laser impact (50 ⁇ m, 400mW, 0.05s) is performed on each retina at about 2 papillary diameters of the optic nerve in the nasal cavity.
  • pentobarbital sodium Centravet
  • a 12mm diameter round glass blade acts as a contact lens to magnify the fundus.
  • a laser impact 50 ⁇ m, 400mW, 0.05s
  • mice undergo local anesthesia by ocular instillation of tetracaine and antisepsis by instillation of betadine 5%.
  • microinjector microcapillary intravitreal injections of 1 .mu.l of PBS solution or netrin 4 at different concentrations are carried out. 3 mice are injected with PBS, 3 mice are injected with netrin 4 (0.1 mg / ml), 2 mice are injected with netrin 4
  • mice are injected with netrin 4 (1 mg / ml), 2 control mice do not undergo any injection.
  • mice After 10 days, the mice are sacrificed, enucleated by mounting the two eyes in OCT and the retinas are cut with a microtome and revealed by the anti-CD3 antibodies marking the endothelial cells which appear in white.
  • FIGS. 11A and 11B it appears that the injection of netrin 4 at 0.1 and 0.3 ⁇ g has no effect.
  • the dose of 1 ⁇ g / eye there is a clear reduction of the choroidal vasculature and the glial inflammatory reaction.
  • Fig. 11 B there is a decrease in retinal neovascularization but especially a reduction in the thickness of the neovascularized zone and the number of vessels.
  • the rats are anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (Centravet) (1 ml per rat of a solution diluted to 0.6 mg / 100 ⁇ l). After falling asleep, the rats undergo pupillary dilation with 1% tropicamide. A 12mm diameter round glass blade acts as a contact lens to magnify the fundus. Then three laser strikes (50 ⁇ m, 400mW, 0.05s) are performed on each retina at about 2 papillary diameters of the nasal optic nerve.
  • Quantification was performed by measuring the pixels per ⁇ 2 and reduced the perfusion by 50%.
  • FIGS. 12A to 12D show that netrin 1 and netrin 4 exert a marginal reduction in neovascularization compared to the control whereas a 2000-fold lower dose of mutated netrin 4 exerts a significantly significant reduction: p less than 0.02.
  • PgsA-745 CHO cells were transfected with the expression vectors
  • PCDNA-3 containing the complete mutated netrin 4 (MC4) sequence or the sequence SEQ ID NO: 528 (MC5). After 16 h the cells are incubated with DMEM medium and the conditioned media collected after 48 h. Cell migration activity
  • VSM is measured as previously described (see Figure 13).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Netrin-Gl a novel glycosyl phosphatidylinositol-linked mammalian netrin that is functionally divergent from classical netrins. JNeurosci. (17): 6540-50;

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une nétrine choisie parmi la nétrine 4, la nétrine 4 mutée, la nétrine 1, la nétrine Gl ou la nétrine 3, ou l'un de leurs fragments, ou d'une séquence nucléotidique codant pour l'une de ces nétrines ou l'un de ces fragments, ou d'un anticorps anti-idiotypique de l'une de ces nétrines ou de l'un de ces fragments, ou d'un fragment Fab desdits anticorps anti-idiotypiques, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies tumorales ou non tumorales.

Description

NETRINE 4 MUTEE, SES FRAGMENTS ET LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENTS
La présente invention a pour objet la nétrine 4 mutée, ses fragments et leur utilisation comme médicament.
La présente invention a également pour objet de nouvelles utilisations thérapeutiques de la nétrine 4 non mutée et de ses fragments.
La présente invention a également pour objet de nouvelles utilisations de ligands de la néogénine, tels que les nétrines, à savoir la nétrine 1, la nétrine 3, la nétrine Gl ou la nétrine 4, et les RGM ("répulsive guidance molécule"), en association avec un agent de chimiothérapie, notamment dans le cadre de la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
La présente invention a également pour objet de nouvelles utilisations des nétrines, notamment de la nétrine 1, de la nétrine Gl, de la nétrine 3 et de la nétrine 4, notamment dans le cadre du traitement de pathologies non tumorales liées à une raréfaction des péricytes.
La nétrine 4 appartient à la famille des nétrines, qui sont des molécules de guidage des axones. A ce jour, 4 membres de cette famille sont connus (nétrines 1, G, 3, 4). La nétrine 4 est une protéine constituée d'un domaine basique C-terminal interagissant avec l'héparine, de 3 domaines de type EGF et d'un domaine de type laminine (Yurchenko et al., 2004).
La nétrine 1 stimule l'attraction quand elle est liée au récepteur dcc (ou à la néogénine) et la répulsion quand elle est liée aux récepteurs dcc et un des récepteurs de la famille UNC5H (Livesey, 1999 ; Mehlen et al., 2003 ; Cooper et al., 1999). De plus, la nétrine 1 peut se lier au récepteur A2 et modifier le taux d'AMPc cellulaire, l'attraction ou la répulsion étant aussi contrôlées par le taux AMPc/GMPc (Corset et al., 2000).
La nétrine G représente une famille de gènes différant des autres nétrines par la présence d'un domaine C-terminal hydrophobe se liant au glycosyl phosphoinositolphosphate (Nakashiba et al., 2000). Leur fonction est encore inconnue. En revanche, il a été rapporté que la nétrine G ne se lie ni à dcc ni à UNC5H1, H2, H3 (Nakashiba et al, 2002). La nétrine 3 stimule l'attraction des neurones quand elle est liée à un récepteur dcc ou néogénine et induit leur répulsion quand elle est liée à un récepteur de la famille des récepteurs UNC5H (Livesey et al., 1999).
Les molécules RGM ("répulsive guidance molécule") sont des molécules impliquées dans le guidage des axones des neurones. Il en existe 3 gènes dénommés
RGM-A, RGM-B, RGM-C. On sait depuis peu que le RGM-A est un ligand de la néogénine (Matsunaga et al, 2004) et qu'un variant du gène RGM-C est le gène de transport du fer dénommé HFE (Papanicolaou et al., 2004).
Le document US 2003/0207347A1, publié le 6 novembre 2003, décrit la nétrine 4 native et ses utilisations. Plus particulièrement, cette demande décrit un polypeptide dérivé de la nétrine 4 présentant des propriétés de modulation de l'angiogenèse, ainsi que l'utilisation de la nétrine 4 dans un procédé de modulation du développement vasculaire, notamment de l'angiogenèse, et plus particulièrement d'inhibition de l'angiogenèse, notamment dans le cadre de tumeurs. A ce jour, rien n'est connu sur les récepteurs de la nétrine 4 ni sur ses éventuelles fonctions neuronales.
Il a été récemment publié que la nétrine 1 et la nétrine 4 inhibent l'activité des cellules endothéliales par l'intermédiaire du récepteur UNC5H2 (Lu et al., 2004) et inhibent la vascularisation de la rétine. La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux agents anti- angiogéniques.
La présente invention a pour but de fournir un traitement de combinaison permettant d'augmenter l'efficacité des traitements impliquant l'angiogenèse et notamment de traitements anti-tumoraux conventionnels, ou de traitements anti- angiogéniques utilisés dans des pathologies autres que les tumeurs.
A ce jour, il n'existe pas d'agent thérapeutique susceptible d'entrer en synergie avec les médicaments classiquement utilisés dans le cadre du traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge, ou d'autres maladies oculaires impliquant une ' néovascularisation.
La présente invention concerne une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
* la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou * un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique et / ou une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 260 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528,
* toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique et / ou une activité d'activation des péricytes, ou
* toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique et / ou une activité d'activation des péricytes. La protéine SEQ ID NO : 522 susmentionnée est une nouvelle protéine correspondant à la protéine nétrine 4 mutée et la protéine SEQ ID NO : 524 susmentionnée correspond à la protéine SEQ ID NO : 522 sans peptide signal.
La séquence SEQ ID NO : 522 comprend 628 acides aminés et la séquence SEQ ID NO : 524 comprend 609 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 522 allant du résidu 20 au résidu 628.
La nétrine 4 mutée, représentée par la séquence SEQ ID NO : 522, correspond à la protéine nétrine 4 représentée par SEQ ID NO : 498 présentant les 9 mutations ponctuelles suivantes :
- remplacement de la cystéine en position 13 par une arginine,
- remplacement de la lysine en position 68 par une thréonine,
- remplacement de la serine en position 183 par une proline, — remplacement de l'histidine en position 205 par une tyrosine,
- remplacement de la cystéine en position 234 par une tyrosine,
- remplacement de Palanine en position 331 par une asparagine,
- remplacement de la cystéine en position 332 par une arginine, - remplacement de Pasparagine en position 353 par une serine,
- remplacement de Pasparagine en position 515 par une lysine.
Les fragments susmentionnés, correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO : 374 à SEQ ID NO : 496, sont de nouveaux fragments correspondant à des fragments de la nétrine 4 mutée susmentionnée.
Les séquences SEQ ID NO : 2q susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO : 374 à 496, c'est-à-dire aux séquence protéiques suivantes : SEQ ID NO : 374, SEQ ID NO : 376, SEQ ID NO : 378, SEQ ID NO : 380, SEQ ID NO : 382, SEQ ID NO : 384, SEQ ID NO : 386, SEQ ID NO : 388, SEQ ID NO : 390, SEQ ID NO : 392, SEQ ID NO : 394, SEQ ID NO : 396, SEQ ID NO : 398, SEQ ID
NO : 400, SEQ ID NO : 402, SEQ ID NO : 404, SEQ ID NO : 406, SEQ ID NO : 408, SEQ ID NO : 410, SEQ ID NO : 412, SEQ ID NO : 414, SEQ ID NO : 416, SEQ ID NO : 418, SEQ ID NO : 420, SEQ ID NO : 422, SEQ ID NO : 424, SEQ ID NO : 426, SEQ ID NO : 428, SEQ ID NO : 430, SEQ ID NO : 432, SEQ ID NO : 434, SEQ ID NO : 436, SEQ ID NO : 438, SEQ ID NO : 440, SEQ ID NO : 442, SEQ ID NO : 444,
SEQ ID NO : 446, SEQ ID NO : 448, SEQ ID NO : 450, SEQ ID NO : 452, SEQ ID NO : 454, SEQ ID NO : 456, SEQ ID NO : 458, SEQ ID NO : 460, SEQ ID NO : 462, SEQ ID NO : 464, SEQ ID NO : 466, SEQ ID NO : 468, SEQ ID NO : 470, SEQ ID NO : 472, SEQ ID NO : 474, SEQ ID NO : 476, SEQ ID NO : 478, SEQ ID NO : 480, SEQ ID NO : 482, SEQ ID NO : 484, SEQ ID NO : 486, SEQ ID NO : 488, SEQ ID
NO : 490, SEQ ID NO : 492, SEQ ID NO : 494 ou SEQ ID NO : 496.
La séquence SEQ ID NO : 374 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 373. Ce fragment comprend 260 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 1 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO : 522.
La séquence SEQ ID NO : 376 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 375. Ce fragment comprend 255 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 261 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO : 522.
La séquence SEQ ID NO : 378 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 4 mutée délétée de la séquence SEQ ID NO : 364, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 377. Ce fragment comprend 515 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 1 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO : 522.
La séquence SEQ ID NO : 386 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 385. Ce fragment comprend 229 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 32 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO : 522.
La séquence SEQ ID NO : 384 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 383. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 332 au résidu 387 de la séquence SEQ ID NO : 522.
Les fragments de la protéine nétrine 4 mutée correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO : 380 à SEQ ID NO : 496, ' ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO : 379 à SEQ ID NO : 495 sont regroupés dans le tableau qui suit :
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
La séquence SEQ ID NO : 526 correspond au fragment délimité des positions 1 à 288 de la SEQ ID NO : 522. La séquence SEQ ID NO : 528 correspond au fragment délimité des positions 1 à 288 de la SEQ ID NO : 522, fusionné à une séquence peptidique de 24 acides aminés.
La présente invention concerne une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou
* un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 260 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528,
* toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
* toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique.
L'activité d'inhibition de l'angiogenèse est également désignée activité anti- angiogénique. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la différenciation, de cellules endothéliales par la protéine susmentionnée. La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la protéine ou du fragment dont on souhaite évaluer l'activité. La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une "blessure" sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence du fragment à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La mesure de l'inhibition de la différenciation (tubulogenèse) des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tabules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence du fragment à tester.
Parmi les modèles classiques de mesure d'angiogenèse, on peut citer les modèles par délivrance locale comme : - l'injection sous-cutanée de Matrigel (Becton Dickinson) imprégné du composé de l'invention (Inold et al., 2002), ou
— le dépôt sur la membrane chorio-allantoïdienne de poulet d'un implant contenant un composé de l'invention (Celerier et al., 2002).
Alternativement, les fragments de l'invention peuvent être injectés par voie systémique (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée) à des animaux chez qui on a créé une maladie angiogénique expérimentale. Les fragments de l'invention peuvent aussi être injectés directement dans une tumeur. Alternativement les fragments ou les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention (décrits ci-après) peuvent être délivrés par une méthode de thérapie génique par voie locale ou systémique par toute méthode permettant l'expression des fragments ou des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention. Alternativement les fragments ou les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention peuvent être insérés dans un plasmide qui est transfecté dans les cellules cancéreuses. Tous ces procédés de mesure sont notamment décrits dans l'article de Jain ét al. (1997). On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression, voire la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention.
La présente invention concerne une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
* la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou * un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, sous réserve que ce fragment présente une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 260 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526, ou par la séquence SEQ ID NO : 528,
* toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'activation des péricytes , ou
* toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'activation des péricytes.
L'activité d'activation des péricytes est vérifiée notamment par les tests de prolifération et de migration tels que définis ci-après et dans la partie expérimentale.
La présente invention découle notamment de la mise en évidence par les Inventeurs de la fonction d'activation des péricytes par la liaison des nétrines aux récepteurs UNC5H4 des péricytes et des cellules musculaires lisses.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour de la nétrine 4 mutée. Une séquence nucléotidique préférée selon l'invention est une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 521 codant pour SEQ ID NO : 522, ou la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 523 codant pour SEQ ID NO : 524,
- un fragment de l'une de ces séquences nucléotidiques, et notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 525 ou par la séquence SEQ ID NO : 527,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou pour la séquence SEQ ID NO : 526 ou pour la séquence SEQ ID NO : 528,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou pour la séquence SEQ ID NO : 526 ou pour la séquence SEQ ID NO : 528, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2q-l codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2q, ou avec la séquence SEQ ID NO : 525 codant pour la séquence SEQ ID NO : 526 ou avec la séquence SEQ ID NO : 527 codant pour la séquence SEQ ID NO : 528, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées,
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 60°C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que O,1X SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 50°C.
Les séquences SEQ ID NO : 2q-l susmentionnées codent pour les fragments de nétrine 4 mutée susmentionnés, représentés par SEQ ID NO : 2q, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 373 codant pour SEQ ID NO : 374, SEQ ID NO : 375 codant pour SEQ ID NO : 376, SEQ ID NO : 377 codant pour SEQ
ID NO : 378, SEQ ID NO : 379 codant pour SEQ ID NO : 380, SEQ ID NO : 381 codant pour SEQ ID NO : 382, SEQ ID NO : 383 codant pour SEQ ID NO : 384, SEQ ID NO : 385 codant pour SEQ ID NO : 386, SEQ ID NO : 387 codant pour SEQ ID NO : 388, SEQ ID NO : 389 codant pour SEQ ID NO : 390, SEQ ID NO : 391 codant pour SEQ ID NO : 392, SEQ ID NO : 393 codant pour SEQ ID NO : 394, SEQ ID
NO : 395 codant pour SEQ ID NO : 396, SEQ ID NO : 397 codant pour SEQ ID NO : 398, SEQ ID NO : 399 codant pour SEQ ID NO : 400, SEQ ID NO : 401 codant pour SEQ ID NO : 402, SEQ ID NO : 403 codant pour SEQ ID NO : 404, SEQ ID NO : 405 codant pour SEQ ID NO : 406, SEQ ID NO : 407 codant pour SEQ ID ' NO : 408, SEQ ID NO : 409 codant pour SEQ ID NO : 410, SEQ ID NO : 411 codant pour SEQ ID NO : 412, SEQ ID NO : 413 codant pour SEQ ID NO : 414, SEQ ID NO : 415 codant pour SEQ ID NO : 416, SEQ ID NO : 417 codant pour SEQ ID NO : 418, SEQ ID NO : 419 codant pour SEQ ID NO : 420, SEQ ID NO : 421 codant pour SEQ ID NO : 422, SEQ ID NO : 423 codant pour SEQ ID NO : 424, SEQ ID NO : 425 codant pour SEQ ID NO : 426, SEQ ID NO : 427 codant pour SEQ ID NO : 428, SEQ ID NO : 429 codant pour SEQ ID NO : 430, SEQ ID NO : 431 codant pour SEQ ID NO : 432, SEQ ID NO : 433 codant pour SEQ ID NO : 434, SEQ ID NO : 435 codant pour SEQ ID NO : 436, SEQ ID NO : 437 codant pour SEQ ID NO : 438, SEQ ID NO : 439 codant pour SEQ ID NO : 440, SEQ ID NO : 441 codant pour SEQ ID NO : 442, SEQ ID NO : 443 codant pour SEQ ID NO : 444, SEQ ID NO : 445 codant pour SEQ ID NO : 446, SEQ ID NO : 447 codant pour SEQ ID NO : 448, SEQ ID NO : 449 codant pour SEQ ID NO : 450, SEQ ID NO : 451 codant pour SEQ ID NO : 452, SEQ ID NO : 453 codant pour SEQ ID NO : 454, SEQ ID NO : 455 codant pour SEQ ID NO : 456, SEQ ID NO : 457 codant pour SEQ ID
NO : 458, SEQ ID NO : 459 codant pour SEQ ID NO : 460, SEQ ID NO : 461 codant pour SEQ ID NO : 462, SEQ ID NO : 463 codant pour SEQ ID NO : 464, SEQ ID NO : 465 codant pour SEQ ID NO : 466, SEQ ID NO : 467 codant pour SEQ ID NO : 468, SEQ ID NO : 469 codant pour SEQ ID NO : 470, SEQ ID NO : 471 codant pour SEQ ID NO : 472, SEQ ID NO : 473 codant pour SEQ ID NO : 474, SEQ ID
NO : 475 codant pour SEQ ID NO : 476, SEQ ID NO : 477 codant pour SEQ ID NO : 478, SEQ ID NO : 479 codant pour SEQ ID NO : 480, SEQ ID NO : 481 codant pour SEQ ID NO : 482, SEQ ID NO : 483 codant pour SEQ ID NO : 484, SEQ ID NO : 485 codant pour SEQ ID NO : 486, SEQ ID NO : 487 codant pour SEQ ID NO : 488, SEQ ID NO : 489 codant pour SEQ ID NO : 490, SEQ ID NO : 491 codant pour SEQ ID NO : 492, SEQ ID NO : 493 codant pour SEQ ID NO : 494 où SEQ ID NO : 495 codant pour SEQ ID NO : 496.
La séquence SEQ ID NO : 525 code pour la séquence SEQ ID NO : 526. La séquence SEQ ID NO : 527 code pour la séquence SEQ ID NO : 528. La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour la nétrine 4 mutée ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus, ledit vecteur recombinant étant notamment caractérisé en ce qu'il contient les éléments nécessaire à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus, notamment dirigé contre la nétrine 4 mutée ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie ci-dessus, notamment dirigé contre la nétrine 4 mutée ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également un fragment Fab d'anticorps anti- idiotypiques tels que définis ci-dessus, notamment dirigé contre la nétrine 4 mutée ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active,
— une protéine telle que définie ci-dessus, ou - une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus , ou
— un anticorps tel que défini ci-dessus , ou
— un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, ou
— un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus de la protéine nétrine 4 mutée, représentée par la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ
ID NO : 524, pour la préparation d'un médicament susceptible d'être administré à raison d'environ 0,1 à environ 2000 μg/kg, notamment par voie intraveineuse, par voie sous-cutanée, par voie systémique, par injection intra-vitréenne, par voie locale au moyen d'infiltrations ou par l'intermédiaire d'un collyre, éventuellement associé à une électroperméation.
La protéine nétrine 4 mutée peut également être délivrée par une injection de plasmide codant pour la protéine d'intérêt nétrine 4 mutée.
Alternativement, l'une quelconque des nétrines de l'invention ou l'un de ses fragments peut être délivré par tout procédé de dispositif intravasculaire (stents) après fixation de la protéine ou du fragment sur ledit dispositif.
La présente invention concerne l'utilisation :
— d'une protéine telle que définie ci-dessus ou,
— d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus ou,
— d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la néovascularisation choroïdienne compliquant la myopie, la néovascularisation de la cornée en particulier le rejet de greffe, les glaucomes, les rétinopathies diabétiques ou du prématuré, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne. L'expression "inhibition de la prolifération endothéliale" désigne toute substance capable de freiner la prolifération de cellules endothéliales selon le test de prolifération décrit ci-après.
La présente invention concerne le produit de combinaison comprenant:
- de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou
- d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou la séquence SEQ ID NO : 528, en association avec un agent anti-angiogénique notamment choisi parmi :
AVASTIN (bevacizumab) développé par Genentech et Roche, MACUGEN (pegaptanib) développé par Eyetech et Pfizer et LUCENTIS (ranibizumab) développé par Genentech et Novartis, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la néovascularisation choroïdienne compliquant la myopie, la néovascularisation de la cornée en particulier le rejet de greffe, les glaucomes, les rétinopathies diabétiques ou du prématuré, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
Dans le cadre de la présente invention, les doses de la nétrine 4 mutée sont comprises d'environ 10 à environ 10 000 ng/injection, préférentiellement d'environ 100 à environ 5 000 ng/injection, toutes les 6 semaines. Dans le cadre de la présente invention, les doses d'agent anti-angiogénique (AVASTIN, MACUGEN ou LUCENTIS par exemple) sont comprises d'environ 0,3 et lmg toutes les 6 semaines. L'invention a pour objet l'utilisation : - d'un anticorps tel que défini ci-dessus, ou
- un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant la stimulation de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : pathologies ischémiques telles que l'artérite des membres inférieurs, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, la sclérodermie ou la maladie de Raynaud.
La mesure de l'activation de la prolifération des cellules endothéliales peut être réalisée en plaçant les cellules endothéliales dans un milieu de culture approprié et en mesurant ensuite le nombre total de cellules. La mesure de l'activation de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une "blessure" sur un tapis de cellules et en incubant ensuite les cellules en présence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La présente invention concerne l'utilisation :
- d'une protéine telle que définie ci-dessus
- d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ou
- d'un anticorps tel que défini ci-dessus, ou
- d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, ou — d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
La présente invention concerne l'utilisation : - d'une protéine telle que définie ci-dessus
- d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ou
- d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, ou pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
L'utilisation selon la présente invention est caractérisée en ce que les pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et nécessitant une activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, sont choisies parmi :
- la dégénérescence maculaire liée à l'âge,
- la néovascularisation choroidienne compliquant la myopie, - les rétinopathies diabétiques ou du prématuré,
- le glaucome néovasculaire (de la cornée, de la rétine...)
- les néovascularisations cornéennes en particulier le rejet de greffe
- la polyarthrite rhumatoïde,
- le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, - les angiomes,
- l'athérosclérose,
- l'obésité,
- les malformations intestinales,
- la maladie de Crohn, — les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires dont Cadasil est un exemple,
- la maladie d'Alzheimer,
- les pathologies dégénératiyes osseuses et les fractures, et
- les anévrysmes et les dissections vasculaires. Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation selon la présente invention est caractérisée en ce que les pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et nécessitant une activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, sont choisies parmi : - les rétinopathies diabétiques,
- les malformations intestinales,
- la maladie de Crohn,
- l'athérosclérose,
- l'obésité, - les démences vasculaires, telles que la maladie d'Alzheimer,
- les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et
- les anévrysmes et les dissections vasculaires.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'activité d'activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses est mesurée selon le test de prolifération ou de migration, et en ce que cette activité d'activation correspond à au moins 120% des cellules obtenues en l'absence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique tels que définis ci-dessus. Cette propriété peut être utilisée pour expandre des cellules musculaires lisses ou des péricytes à partir de tout prélèvement de cellules progénitrices ou de cellules souches afin de pratiquer des thérapies cellulaires.
La mesure de l'activation de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses peut être réalisée en effectuant une "blessure" sur un tapis de cellules et en incubant ensuite les cellules en présence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure.
La mesure de l'activation de la prolifération des péricytes ou des cellules musculaires lisses peut être réalisée en plaçant les péricytes ou cellules musculaires lisses dans un milieu de culture approprié, notamment dans du milieu DMEM ne contenant pas de sérum, et en mesurant ensuite le nombre total de cellules. La présente invention concerne l'utilisation:
- de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID
NO : 524, ou - d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528, en association avec un agent de chimiothérapie, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
La présente invention concerne le produit dé combinaison :
- de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou - d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528, en association avec un agent de chimiothérapie, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement des pathologies tumorales. La présente invention concerne le produit de combinaison comprenant:
- de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID
NO : 524, ou - d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528, en association avec un agent anti-angiogénique notamment choisi parmi : AVASTIN (bevacizumab) développé par Genentech et Roche, MACUGEN
(pegaptanib) développé par Eyetech et Pfizer et LUCENTIS (ranibizumab) développé par Genentech et Novartis, ou tout autre agent anti-VEGF pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement ou à la prévention des pathologies tumorales ou non tumorales telles que définies ci-dessus. La présente invention concerne l'utilisation :
- de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID
NO : 524, ou
- d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ
ID NO : 528, en association avec un agent anti-angiogénique notamment choisi parmi : A VASTIN (bevacizumab) développé par Genentech et Roche, MACUGEN (pegaptanib) développé par Eyetech et Pfizer et LUCENTIS (ranibizumab) développé par Genentech et Novartis, ou tout autre agent anti-VEGF pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies tumorales ou non tumorales telles que définies ci-dessus.
La présente invention concerne également l'utilisation combinée d'un agent anti- angiogénique et d'un agent de chimiothérapie. En particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'un ligand de la néogénine, ou le cas échéant d'une séquence nucléotidique codant pour un ligand de la néogénine, ou d'un vecteur contenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ligand, ou d'une cellule hôte transformée par ledit vecteur, ou d'un anticorps anti- idiotypique dirigé contre ledit ligand, en association avec un agent de chimiothérapie, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
La combinaison d'un agent anti-angiogénique, choisi parmi ledit ligand de la néogénine ou ladite séquence nucléotidique ou ledit vecteur ou ladite cellule hôte ou ledit anticorps anti-idiotypique, avec un agent de chimiothérapie permet d'obtenir un effet synergique et d'induire une moindre résistance aux traitements anti-tumoraux conventionnels.
Parmi les agents de chimiothérapie préférés selon l'invention, on peut notamment citer la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, les inhibiteurs de l'aromatase, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofène, le taxol et le taxotère.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le ligand ou la séquence nucléotidique ou l'anticorps anti- idiotypique est choisi parmi : — l'une des protéines suivantes : la nétrine 1 représentée par SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504, la nétrine Gl représentée par SEQ ID NO : 506 ou SEQ ID NO : 508, la nétrine 3 représentée par SEQ ID NO : 510, la nétrine 4 représentée par SEQ ID NO : 498 ou SEQ ID NO : 500, l'une des molécules RGM représentées par SEQ ID NO : 512, SEQ ID NO : 514, SEQ ID NO : 516, SEQ ID NO : 518 ou SEQ ID NO : 520, ou la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524,
- ou un fragment de l'une des ces protéines, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2n, n variant de 1 à 248,
— ou une séquence nucléotidique codant pour l'une des protéines susmentionnées, notamment représentée par l'une des séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 501, SEQ ID NO : 503, SEQ ID NO : 505, SEQ ID NO : 507,
SEQ ID NO : 509, SEQ ID NO : 497, SEQ ID NO : 499, SEQ ID NO : 51 1, SEQ ID NO : 513, SEQ ID NO : 515, SEQ ID NO : 517, SEQ ID NO : 519, SEQ ID NO : 521, SEQ ID NO : 523, ou l'une des séquences SEQ ID NO : 2n-l, n variant de 1 à 248, - ou un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci- dessus.
Les séquences SEQ ID NO : 2n susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 496. Les séquences SEQ ID NO- : 2n susmentionnées correspondent aux séquences protéiques suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 44, SEQ ID
NO : 46, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO : 72, SEQ ID NO : 74, SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 82, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO : 88, SEQ ID NO : 90, SEQ ID NO : 92,
SEQ ID NO : 94, SEQ ID NO : 96, SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO : 100, SEQ ID NO : 102, SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO : 106, SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO : 110, SEQ ID NO : 112, SEQ ID NO : 114, SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO : 122, SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO : 126, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO : 132, SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO : 136, SEQ ID
NO : 138, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 142, SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 146, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 150, SEQ ID NO : 152, SEQ ID NO : 154, SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO : 160, SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO : 168, SEQ ID NO : 170, SEQ ID NO : 172, SEQ ID NO : 174, SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO : 178, SEQ ID NO : 180, SEQ ID NO : 182,
SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 186, SEQ ID NO : 188, SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO : 194, SEQ ID NO : 196, SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO : 200, SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 204, SEQ ID NO : 206, SEQ ID NO : 208, SEQ ID NO : 210, SEQ ID NO : 212, SEQ ID NO : 214, SEQ ID NO : 216, SEQ ID NO : 218, • SEQ ID NO : 220, SEQ ID NO : 222, SEQ ID NO : 224, SEQ ID NO : 226, SEQ ID
NO : 228, SEQ ID NO : 230, SEQ ID NO : 232, SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 236, SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO : 240, SEQ ID NO : 242, SEQ ID NO : 244, SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO : 250, SEQ ID NO : 252, SEQ ID NO : 254, SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO : 258, SEQ ID NO : 260, SEQ ID NO : 262, SEQ ID NO : 264, SEQ ID NO : 266, SEQ ID NO : 268, SEQ ID NO : 270, SEQ ID NO : 272, SEQ ID NO : 274, SEQ ID NO : 276, SEQ ID NO : 278, SEQ ID NO : 280, SEQ ID NO : 282, SEQ ID NO : 284, SEQ ID NO : 286, SEQ ID NO : 288, SEQ ID NO : 290, SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 294, SEQ ID NO : 296, SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 300, SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO : 304, SEQ ID NO : 306, SEQ ID NO : 308, SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 312, SEQ ID NO : 314, SEQ ID NO : 316, SEQ ID NO : 318, SEQ ID NO : 320, SEQ ID NO : 322, SEQ ID NO : 324, SEQ ID NO : 326, SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 330, SEQ ID NO : 332, SEQ ID NO : 334, SEQ ID NO : 336, SEQ ID NO : 338, SEQ ID NO : 340, SEQ ID NO : 342, SEQ ID NO : 344, SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO : 348, SEQ ID NO : 350, SEQ ID NO : 352, SEQ ID
NO : 354, SEQ ID NO : 356, SEQ ID NO : 358, SEQ ID NO : 360, SEQ ID NO : 362, SEQ ID NO : 364, SEQ ID NO : 366, SEQ ID NO : 368, SEQ ID NO : 370, SEQ ID NO : 372, SEQ ID NO : 374, SEQ ID NO : 376, SEQ ID NO : 378, SEQ ID NO : 380, SEQ ID NO : 382, SEQ ID NO : 384, SEQ ID NO : 386, SEQ ID NO : 388, SEQ ID NO : 390, SEQ ID NO : 392, SEQ ID NO : 394, SEQ ID NO : 396, SEQ ID NO : 398,
SEQ ID NO : 400, SEQ ID NO : 402, SEQ ID NO : 404, SEQ ID NO : 406, SEQ ID NO : 408, SEQ ID NO : 410, SEQ ID NO : 412, SEQ ID NO : 414, SEQ ID NO : 416, SEQ ID NO : 418, SEQ ID NO : 420, SEQ ID NO : 422, SEQ ID NO : 424, SEQ ID NO : 426, SEQ ID NO : 428, SEQ ID NO : 430, SEQ ID NO : 432, SEQ ID NO : 434, SEQ ID NO : 436, SEQ ID NO : 438, SEQ ID NO : 440, SEQ ID NO : 442, SEQ ID
NO : 444, SEQ ID NO : 446, SEQ ID NO : 448, SEQ ID NO : 450, SEQ ID NO : 452, SEQ ID NO : 454, SEQ ID NO : 456, SEQ ID NO : 458, SEQ ID NO : 460, SEQ ID NO : 462, SEQ ID NO : 464, SEQ ID NO : 466, SEQ ID NO : 468, SEQ ID NO : 470, SEQ ID NO : 472, SEQ ID NO : 474, SEQ ID NO : 476, SEQ ID NO : 478, SEQ ID NO : 480, SEQ ID NO : 482, SEQ ID NO : 484, SEQ ID NO : 486, SEQ ID NO : 488,
SEQ ID NO : 490, SEQ ID NO : 492, SEQ ID NO : 494 ou SEQ ID NO : 496.
Les séquences SEQ ID NO : 2n-l susmentionnées correspondent aux séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 495.
Les séquences SEQ ID NO : 2n-l susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO : 2n, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11 codant pour SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13 codant pour SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15 codant pour SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17 codant pour SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19 codant pour SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 codant pour SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23 codant pour SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25 codant pour SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27 codant pour SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29 codant pour SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 31 codant pour SEQ ID
NO : 32, SEQ ID NO : 33 codant pour SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35 codant pour SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 codant pour SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39 codant pour SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 41 codant pour SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43 codant pour SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45 codant pour SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 47 codant pour SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49 codant pour SEQ ID
NO : 50, SEQ ID NO : 51 codant pour SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53 codant pour SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 55 codant pour SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 57 codant pour SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 59 codant pour SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO : 61 codant pour SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 63 codant pour SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 65 codant pour SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO : 67 codant pour SEQ ID
NO : 68, SEQ ID NO : 69 codant pour SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO : 71 codant pour SEQ ID NO : 72, SEQ ID NO : 73 codant pour SEQ ID NO : 74, SEQ ID NO : 75 codant pour SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO : 77 codant pour SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 79 codant pour SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 81 codant pour SEQ ID NO : 82, SEQ ID NO : 83 codant pour SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 85 codant pour SEQ ID
NO : 86, SEQ ID NO : 87 codant pour SEQ ID NO : 88, SEQ ID NO : 89 codant pour SEQ ID NO : 90, SEQ ID NO : 91 codant pour SEQ ID NO : 92, SEQ ID NO : 93 codant pour SEQ ID NO : 94, SEQ ID NO : 95 codant pour SEQ ID NO : 96, SEQ ID NO : 97 codant pour SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO : 99 codant pour SEQ ID NO : 100, SEQ ID NO : 101 codant pour SEQ ID NO : 102, SEQ ID NO : 103 codant pour SEQ
ID NO : 104, SEQ ID NO : 105 codant pour SEQ ID NO : 106, SEQ ID NO : 107 codant pour SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO : 109 codant pour SEQ ID NO : 1 10, SEQ ID NO : 1 11 codant pour SEQ ID NO : 112, SEQ ID NO : 113 codant pour SEQ ID NO : 114, SEQ ID NO : 115 codant pour SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 117 codant pour - SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 119 codant pour SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO : 121 codant pour SEQ ID NO : 122, SEQ ID NO : 123 codant pour SEQ ID NO : 124, SEQ ID NO : 125 codant pour SEQ ID NO : 126, SEQ ID NO : 127 codant pour SEQ ID NÔ : 128, SEQ ID NO : 129 codant pour SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO : 131 codant pour SEQ ID NO : 132, SEQ ID NO : 133 codant pour SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO : 135 codant pour SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO : 137 codant pour SEQ ID NO : 138, SEQ ID NO : 139 codant pour SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 141 codant pour SEQ ID NO : 142, SEQ ID NO : 143 codant pour SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 145 codant pour SEQ ID NO : 146, SEQ ID NO : 147 codant pour SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 149 codant pour SEQ ID NO : 150, SEQ ID NO : 151 codant pour SEQ ID NO : 152, SEQ
ID NO : 153 codant pour SEQ ID NO : 154, SEQ ID NO : 155 codant pour SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO : 157 codant pour SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO : 159 codant pour SEQ ID NO : 160, SEQ ID NO : 161 codant pour SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 163 codant pour SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO : 165 codant pour SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO : 167 codant pour SEQ ID NO : 168, SEQ ID NO : 169 codant pour SEQ ID
NO : 170, SEQ ID NO : 171 codant pour SEQ ID NO : 172, SEQ ID NO : 173 codant pour SEQ ID NO : 174, SEQ ID NO : 175 codant pour SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO : 177 codant pour SEQ ID NO : 178, SEQ ID NO : 179 codant pour SEQ ID NO : 180, SEQ ID NO : 181 codant pour SEQ ID NO : 182, SEQ ID NO : 183 codant pour SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 185 codant pour SEQ ID NO : 186, SEQ ID
NO : 187 codant pour SEQ ID NO : 188, SEQ ID NO : 189 codant pour SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO : 191 codant pour SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO : 193 codant pour SEQ ID NO : 194, SEQ ID NO : 195 codant pour SEQ ID NO : 196, SEQ ID NO : 197 codant pour SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO : 199 codant pour SEQ ID NO : 200, SEQ ID NO : 201 codant pour SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 203 codant pour SEQ ID NO : 204, SEQ ID NO : 205 codant pour SEQ ID NO : 206, SEQ ID NO : 207 codant pour SEQ ID NO : 208, SEQ ID NO : 209 codant pour SEQ ID NO : 210, SEQ ID NO : 211 codant pour SEQ ID NO : 212, SEQ ID NO : 213 codant pour SEQ ID NO : 214, SEQ ID NO : 215 codant pour SEQ ID NO : 216, SEQ ID NO : 217 codant pour SEQ ID NO : 218, SEQ ID NO : 219 codant pour SEQ ID
NO : 220, SEQ ID NO : 221 codant pour SEQ ID NO : 222, SEQ ID NO : 223 codant pour SEQ ID NO : 224, SEQ ID NO : 225 codant pour SEQ ID NO : 226, SEQ ID NO : 227 codant pour SEQ ID NO : 228, SEQ ID NO : 229 codant pour SEQ ID NO : 230, SEQ ID NO : 231 codant pour SEQ ID NO : 232, SEQ ID NO : 233 codant pour SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 235 codant pour SEQ ID NO : 236, SEQ ID
NO : 237 codant pour SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO ; 239 codant pour SEQ ID NO : 240, SEQ ID NO : 241 codant pour SEQ ID NO : 242, SEQ ID NO : 243 codant pour SEQ ID NO : 244, SEQ ID NO : 245 codant pour' SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO : 247 codant pour SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO : 249 codant pour SEQ ID NO : 250, SEQ ID NO : 251 codant pour SEQ ID NO : 252, SEQ ID NO : 253 codant pour SEQ ID NO : 254, SEQ ID NO : 255 codant pour SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO : 257 codant pour SEQ ID NO : 258, SEQ ID NO : 259 codant pour SEQ ID NO : 260, SEQ ID NO : 261 codant pour SEQ ID NO : 262, SEQ ID NO : 263 codant pour SEQ ID NO : 264, SEQ ID NO : 265 codant pour SEQ ID NO : 266, SEQ ID NO : 267 codant pour SEQ ID NO : 268, SEQ ID NO : 269 codant pour SEQ ID NO : 270, SEQ ID NO : 271 codant pour SEQ ID NO : 272, SEQ ID NO : 273 codant pour SEQ ID NO : 274, SEQ ID NO : 275 codant pour SEQ ID NO : 276, SEQ ID NO : 277 codant pour SEQ ID NO : 278, SEQ ID NO : 279 codant pour SEQ ID NO : 280, SEQ ID NO : 281 codant pour SEQ ID NO : 282, SEQ ID NO : 283 codant pour SEQ ID
NO : 284, SEQ ID NO : 285 codant pour SEQ ID NO : 286, SEQ ID NO : 287 codant pour SEQ ID NO : 288, SEQ ID NO : 289 codant pour SEQ ID NO : 290, SEQ ID NO : 291 codant pour SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 293 codant pour SEQ ID NO : 294, SEQ ID NO : 295 codant pour SEQ ID NO : 296, SEQ ID NO : 297 codant pour SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 299 codant pour SEQ ID NO : 300, SEQ ID
NO : 301 codant pour SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO : 303 codant pour SEQ ID NO : 304, SEQ ID NO : 305 codant pour SEQ ID NO : 306, SEQ ID NO : 307 codant pour SEQ ID NO : 308, SEQ ID NO : 309 codant pour SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 311 codant pour SEQ ID NO : 312, SEQ ID NO : 313 codant pour SEQ ID NO : 314, SEQ ID NO : 315 codant pour SEQ ID NO : 316, SEQ ID NO : 317 codant pour SEQ ID NO : 318, SEQ ID NO : 319 codant pour SEQ ID NO : 320, SEQ ID NO : 321 codant pour SEQ ID NO : 322, SEQ ID NO : 323 codant pour SEQ ID NO : 324, SEQ ID NO : 325 codant pour SEQ ID NO : 326, SEQ ID NO : 327 codant pour SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 329 codant pour SEQ ID NO : 330, SEQ ID NO : 331 codant pour SEQ ID NO : 332, SEQ ID NO : 333 codant pour SEQ ID
NO : 334, SEQ ID NO : 335 codant pour SEQ ID NO : 336, SEQ ID NO : 337 codant pour SEQ ID NO : 338, SEQ ID NO : 339 codant pour SEQ ID NO : 340, SEQ ID NO : 341 codant pour SEQ ID NO : 342, SEQ ID NO : 343 codant pour SEQ ID NO : 344, SEQ ID NO : 345 codant pour SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO : 347 codant pour SEQ ID NO : 348, SEQ ID NO : 349 codant pour SEQ ID NO : 350, SEQ ID
NO : 351 codant pour SEQ ID NO : 352, SEQ ID NO : 353 codant pour SEQ ID NO : 354, SEQ ID NO : 355 codant pour SEQ ID NO : 356, SEQ ID NO : 357 codant pour SEQ ID NO : 358, SEQ ID NO : 359 codant pour SEQ ID NO : 360, SEQ ID NO : 361 codant pour SEQ ID NO : 362, SEQ ID NO : 363 codant pour SEQ ID NO : 364, SEQ ID NO : 365 codant pour SEQ ID NO : 366, SEQ ID NO : 367 codant pour SEQ ID NO : 368, SEQ ID NO : 369 codant pour SEQ ID NO : 370, SEQ ID NO : 371 codant pour SEQ ID NO : 372, SEQ ID NO : 373 codant pour SEQ ID NO : 374, SEQ ID NO : 375 codant pour SEQ ID NO : 376, SEQ ID NO : 377 codant pour SEQ ID NO : 378, SEQ ID NO : 379 codant pour SEQ ID NO : 380, SEQ ID
NO : 381 codant pour SEQ ID NO : 382, SEQ ID NO : 383 codant pour SEQ ID NO : 384, SEQ ID NO : 385 codant pour SEQ ID NO : 386, SEQ ID NO : 387 codant pour SEQ ID NO : 388, SEQ ID NO : 389 codant pour SEQ ID NO : 390, SEQ ID NO : 391 codant pour SEQ ID NO : 392, SEQ ID NO : 393 codant pour SEQ ID NO : 394, SEQ ID NO : 395 codant pour SEQ ID NO : 396, SEQ ID NO : 397 codant pour SEQ ID NO : 398, SEQ ID NO : 399 codant pour SEQ ID NO : 400, SEQ ID NO : 401 codant pour SEQ ID NO : 402, SEQ ID NO : 403 codant pour SEQ ID NO : 404, SEQ ID NO : 405 codant pour SEQ ID NO : 406, SEQ ID NO : 407 codant pour SEQ ID NO : 408, SEQ ID NO : 409 codant pour SEQ ID NO : 410, SEQ ID NO : 411 codant pour SEQ ID NO : 412, SEQ ID NO : 413 codant pour SEQ ID
NO : 414, SEQ ID NO : 415 codant pour SEQ ID NO : 416, SEQ ID NO : 417 codant pour SEQ ID NO : 418, SEQ ID NO : 419 codant pour SEQ ID NO : 420, SEQ ID NO : 421 codant pour SEQ ID NO : 422, SEQ ID NO : 423 codant pour SEQ ID NO : 424, SEQ ID NO : 425 codant pour SEQ ID NO : 426, SEQ ID NO : 427 codant pour SEQ ID NO : 428, SEQ ID NO : 429 codant pour SEQ ID NO : 430, SEQ ID
NO : 431 codant pour SEQ ID NO : 432, SEQ ID NO : 433 codant pour SEQ ID NO : 434, SEQ ID NO : 435 codant pour SEQ ID NO : 436, SEQ ID NO : 437 codant pour SEQ ID NO : 438, SEQ ID NO : 439 codant pour SEQ ID NO : 440, SEQ ID NO : 441 codant pour SEQ ID NO : 442, SEQ ID NO : 443 codant pour SEQ ID NO : 444, SEQ ID NO : 445 codant pour SEQ ID NO : 446, SEQ ID NO : 447 codant pour SEQ ID NO : 448, SEQ ID NO : 449 codant pour SEQ ID NO : 450, SEQ ID NO : 451 codant pour SEQ ID NO : 452, SEQ ID NO : 453 codant pour SEQ ID NO : 454, SEQ ID NO : 455 codant pour SEQ ID NO : 456, SEQ ID NO : 457 codant pour SEQ ID NO : 458, SEQ ID NO : 459 codant pour SEQ ID NO : 460, SEQ ID NO : 461 codant pour SEQ ID NO : 462, SEQ ID NO : 463 codant pour SEQ ID
NO : 464, SEQ ID NO : 465 codant pour SEQ ID NO : 466, SEQ ID NO : 467 codant pour SEQ ID NO : 468, SEQ ID NO : 469 codant pour SEQ ID NO : 470, SEQ ID NO : 471 codant pour SEQ ID NO : 472, SEQ ID NO : 473 codant pour SEQ ID NO : 474, SEQ ID NO : 475 codant pour SEQ ID NO : 476, SEQ ID NO : 477 codant pour SEQ ID NO : 478, SEQ ID NO : 479 codant pour SEQ ID NO : 480, SEQ ID NO : 481 codant pour SEQ ID NO : 482, SEQ ID NO : 483 codant pour SEQ ID NO : 484, SEQ ID NO : 485 codant pour SEQ ID NO : 486, SEQ ID NO : 487 codant pour SEQ ID NO : 488, SEQ ID NO : 489 codant pour SEQ ID NO : 490, SEQ ID NO : 491 codant pour SEQ ID NO : 492, SEQ ID NO : 493 codant pour SEQ ID NO :
494 ou SEQ ID NO : 495 codant pour SEQ ID NO : 496.
La séquence SEQ ID NO : 498 correspond à la protéine humaine nétrine 4 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 497, et la séquence SEQ ID NO : 500 correspond à la protéine humaine nétrine 4 susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 499. La séquence SEQ ID NO : 498 comprend 628 acides aminés et la séquence SEQ ID NO : 500 comprend 609 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 498 allant du résidu 20 au résidu 628.
La séquence SEQ ID NO : 502 correspond à la protéine humaine nétrine 1 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 501, et la séquence SEQ ID NO : 504 correspond à la protéine humaine nétrine 1 susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 503. La séquence SEQ ID NO : 502 comprend 604 acides aminés et la séquence SEQ ID NO : 504 comprend 580 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 502 allant du résidu 25 au résidu 604.
La séquence SEQ ID NO : 506 correspond à la protéine humaine nétrine Gl codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 505, et la séquence SEQ ID NO : 508 correspond à la protéine humaine nétrine Gl susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 507. La séquence SEQ ID NO : 506 comprend 438 acides aminés et la séquence SEQ ID NO : 508 comprend 410 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 506 allant du résidu 29 au résidu 438.
La séquence SEQ ID NO : 510 correspond à la protéine humaine nétrine- 3 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 509. La séquence SEQ ID NO : 510 comprend 580 acides aminés.
La séquence SEQ ID NO : 512 correspond à la molécule RGM-A codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 511. La séquence SEQ ID NO : 512 comprend 450 acides aminés. La séquence SEQ ID NO : 514 correspond à la molécule RGM-B codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 513, et la séquence SEQ ID NO : 518 correspond à la molécule RGM-B susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 517. La séquence SEQ ID NO : 514 comprend 437 acides aminés et la séquence SEQ ID NO ; 518 comprend 392 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 514 allant du résidu 46 au résidu 437.
La séquence SEQ ID NO : 516 correspond à la molécule RGM-C codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 515, et la séquence SEQ ID NO : 520 correspond à la molécule RGM-C susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 519. La séquence SEQ ID NO : 516 comprend 426 acides aminés et la séquence SEQ ID NO : 520 comprend 391 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO : 516 allant du résidu 36 au résidu 426.
La séquence SEQ ID NO : 360 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 359: Ce fragment comprend 260 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO : 498.
La séquence SEQ ID NO : 362 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 361. Ce fragment comprend 255 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu
515 de la séquence SEQ ID NO : 498.
La séquence SEQ ID NO : 364 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 363. Ce fragment comprend 113 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 516 au résidu 628 de la séquence
SEQ ID NO : 498.
La séquence SEQ ID NO : 366 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 4 délétée de la séquence SEQ ID NO : 364, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 365. Ce fragment comprend 515 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu
515 de la séquence SEQ ID NO : 498. La séquence SEQ ID NO : 8 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 7. Ce fragment comprend 229 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 32 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO : 498.
La séquence SEQ ID NO : 2 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1. Ce fragment comprend 60 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu 320 de la séquence SEQ ID NO : 498.
La séquence SEQ ID NO : 4 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 3. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 332 au résidu 387 de la séquence SEQ ID NO : 498.
La séquence SEQ ID NO : 6 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 5. Ce fragment comprend 52 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 394 au résidu 445 de la séquence SEQ ID NO : 498.
Les fragments de la protéine nétrine 4 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO : 10 à SEQ ID NO : 126 et aux séquences protéiques SEQ ID NO : 368 et SEQ ID NO : 370, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO : 9 à SEQ ID NO : 125 et les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 367 et SEQ ID NO : 369 sont regroupés dans le tableau qui suit :
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
La séquence SEQ ID NO : 128 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 127. Ce fragment comprend 283 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 1 au résidu 283 de la séquence
SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 130 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 129. Ce fragment comprend 204 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 284 au résidu
487 de la séquence SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 132 correspond aμ fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 1 , ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 131. Ce fragment comprend 117 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 488 au résidu 604 de la séquence
SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 372 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 1 délétée de la séquence SEQ ID NO : 132, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 371. Ce fragment comprend 487 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 1 au résidu
487 de la séquence SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 140 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 139. Ce fragment comprend 235 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 49 au résidu 283 de la séquence
SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 134 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 133. Ce fragment comprend 48 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 284 au résidu 331 de la séquence
SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 136 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 135. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 341 au résidu 396 de la séquence SEQ ID NO : 502.
La séquence SEQ ID NO : 138 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 137. Ce fragment comprend 48 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 403 au résidu 450 de la séquence SEQ ID NO : 502.
Les fragments de la protéine nétrine 1 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO : 142 à SEQ ID NO : 262, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO : 141 à SEQ ID NO : 261 sont regroupés dans le tableau qui suit :
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
La séquence SEQ ID NO : 264 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine Gl, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 263. Ce fragment comprend 295 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine Gl allant du résidu 1 au résidu 295 de la séquence SEQ ID NO : 506. La séquence SEQ ID NO : 266 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine Gl, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 265. Ce fragment comprend 143 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine Gl allant du résidu 296 au résidu 438 de la séquence SEQ ID NO : 506.
La séquence SEQ ID NO : 268 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine Gl, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 267. Ce fragment comprend 225 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine Gl allant du résidu 71 au résidu 295 de la séquence SEQ ID NO : 506.
La séquence SEQ ID NO : 270 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine Gl, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 269. Ce fragment comprend 47 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine Gl allant du résidu 296 au résidu 342 de la séquence SEQ ID NO : 506.
La séquence SEQ ID NO : 272 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine Gl, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 271. Ce fragment comprend 37 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine Gl allant du résidu 373 au résidu 409 de la séquence SEQ ID NO : 506.
Les fragments de la protéine nétrine Gl correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO : 274 à SEQ ID NO : 296, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO : 273 à SEQ ID NO : 295, sont regroupés dans le tableau qui suit :
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
La séquence SEQ ID NO : 298 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 297. Ce fragment comprend 253 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 1 au résidu 253 de la séquence
SEQ ID NO : 510.
La séquence SEQ ID NO : 300 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 299. Ce fragment comprend 220 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 34 au résidu 253 de la séquence
SEQ ID NO : 510.
La séquence SEQ ID NO : 302 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 301. Ce fragment comprend 180 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 254 au résidu
433 de la séquence SEQ ID NO : 510.
La séquence SEQ ID NO : 304 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 303. Ce fragment comprend 46 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 254 au résidu 299 de la séquence
SEQ ID NO : 510.
La séquence SEQ ID NO : 306 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 305. Ce fragment comprend 50 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 373 au résidu 422 de la séquence
SEQ ID NO : 510.
La séquence SEQ ID NO : 308 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 307. Ce fragment comprend 148 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 433 au résidu 580 de la séquence
SEQ ID NO : 510.
Les fragments de la protéine nétrine 3 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO : 310 à SEQ ID NO : 352, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO : 309 à SEQ ID NO : 351 sont regroupés dans le tableau qui suit :
Figure imgf000035_0001
La séquence SEQ ID NO : 354 correspond à un fragment de la protéine RGM-A, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 353. Ce fragment comprend 111 acides aminés et correspond au fragment de la protéine RGM-A allant du résidu 180 au résidu 290 de la séquence SEQ ID NO : 512.
La séquence SEQ ID NO : 356 correspond à un fragment de la protéine RGM-B, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 355. Ce fragment comprend 111 acides aminés et correspond au fragment de la protéine RGM-B allant du résidu 180 au résidu 290 de la séquence SEQ ID NO : 514.
La séquence SEQ ID NO : 358 correspond à un fragment de la protéine RGM-C, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 357. Ce fragment comprend 111 acides aminés et correspond au fragment de la protéine RGM-C allant du résidu 180 au résidu 290 de la séquence SEQ ID NO : 516. La présente invention concerne également un produit de combinaison comprenant au moins un ligand de la néogénine, ou le cas échéant d'une séquence nucléotidique codant pour un ligand de la néogénine, notamment choisi parmi :
- l'une des protéines suivantes : la nétrine 1 représentée par SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504, la nétrine Gl représentée par SEQ ID NO : 506 ou SEQ ID
NO : 508, la nétrine 3 représentée par SEQ ID NO : 510, la nétrine 4 représentée par SEQ ID NO : 498 ou SEQ ID NO : 500, l'une des molécules RGM représentées par SEQ ID NO : 512, SEQ ID NO : 514, SEQ ID NO : 516, SEQ ID NO : 518 ou SEQ ID NO : 520, ou la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, - ou un fragment de l'une des ces protéines, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2n, n variant de 1 à 248,
- ou une séquence nucléotidique codant pour l'une des protéines susmentionnées, notamment représentée par l'une des séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 501, SEQ ID NO : 503, SEQ ID NO : 505, SEQ ID NO : 507, SEQ ID NO : 509, SEQ ID NO : 497, SEQ ID NO : 499, SEQ ID NO : 511, SEQ ID
NO : 513, SEQ ID NO : 515, SEQ ID NO : 517, SEQ ID NO : 519, SEQ ID NO : 521 , SEQ ID NO : 523, ou l'une des séquences SEQ ID NO : 2n-l, n variant de 1 à 248,
- ou un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci- dessus, et au moins un agent de chimiothérapie, notamment choisi parmi : la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, les inhibiteurs de l'aromatase, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofène, le taxol ou le taxotère, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement du cancer.
Dans le cadre de la présente invention, les doses de l'agent anti-angiogénique sont comprises d'environ 10 à environ 20 000 μg/kg de poids corporel. La périodicité des injections est notamment déterminée par analogie à la posologie du traitement anti- angiogénique existant actuellement sur le marché sous le nom d'Avastin.
La présente invention concerne de nouveaux fragments de nétrine 4. En particulier, la présente invention' concerne de nouveaux fragments de la protéine nétrine 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes :
* une séquence SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63, ou * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
* toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 498, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique.
Les séquences SEQ ID NO : 2p susmentionnées .correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 126, à savoir les séquences protéiques suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID
NO : 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 18, SEQ
ID NO : 20, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 28,
SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 46, SEQ
ID NO : 48, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 56,
SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 64, SEQ ID
NO : 66, SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO : 72, SEQ ID NO : 74, SEQ
ID NO : 76, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 82, SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO : 88, SEQ ID NO : 90, SEQ ID NO : 92, SEQ ID
NO : 94, SEQ ID NO : 96, SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO : 100, SEQ ID NO : 102, SEQ
ID NO : 104, SEQ ID NO : 106, SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO : 110, SEQ ID
NO : 112, SEQ ID NO : 114, SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 120,
SEQ ID NO : 122, SEQ ID NO : 124 ou SEQ ID NO : 126, telles que définies précédemment.
Les fragments SEQ ID NO : 2p sont de nouveaux fragments de la nétrine 4, présentant une activité d'inhibition de l'angiogenèse. Les séquences SEQ ID NO : 2p-l susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO : 2p, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, SEQ
ID NO : 11 codant pour SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13 codant pour SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15 codant pour SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17 codant pour SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19 codant pour SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 codant pour SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23 codant pour SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25 codant pour SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27 codant pour SEQ ID NO : 28,
SEQ ID NO : 29 codant pour SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 31 codant pour SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33 codant pour SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 35 codant pour SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 37 codant pour SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 39 codant pour SEQ ID NO : 40, SEQ ID. NO : 41 codant pour SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 43 codant pour SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 45 codant pour SEQ ID NO : 46,
SEQ ID NO : 47 codant pour SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49 codant pour SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51 codant pour SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53 codant pour SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 55 codant pour SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 57 codant pour SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 59 codant pour SEQ ID NO : 60, SEQ ID NO : 61 codant pour SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO : 63 codant pour SEQ ID NO : 64,
SEQ ID NO : 65 codant pour SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO : 67 codant pour SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO : 69 codant pour SEQ ID NO : 70, SEQ ID NO : 71 codant pour SEQ ID NO : 72, SEQ ID NO : 73 codant pour SEQ ID NO : 74,- SEQ ID NO : 75 codant pour SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO : 77 codant pour SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 79 codant pour SEQ ID NO : 80, SEQ ID NO : 81 codant pour SEQ ID NO : 82,
SEQ ID NO : 83 codant pour SEQ ID NO : 84, SEQ ID NO : 85 codant pour SEQ ID NO : 86, SEQ ID NO : 87 codant pour SEQ ID NO : 88, SEQ ID NO : 89 codant pour SEQ ID NO : 90, SEQ ID NO : 91 codant pour SEQ ID NO : 92, SEQ ID NO : 93 codant pour SEQ ID NO : 94, SEQ ID NO : 95 codant pour SEQ ID NO : 96, SEQ ID NO : 97 codant pour SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO : 99 codant pour SEQ ID NO : 100,
SEQ ID NO : 101 codant pour SEQ ID NO : 102, SEQ ID NO : 103 codant pour SEQ
ID NO : 104, SEQ ID NO : 105 codant pour SEQ ID NO : 106, SEQ ID NO : 107 codant pour SEQ ID NO : 108, SEQ ID NO : 109 codant pour SEQ ID NO : 110, SEQ
ID NO : 111 codant pour SEQ ID NO : 112, SEQ ID NO : 113 codant pour SEQ ID NO : 114, SEQ ID NO : 115 codant pour SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO : 117 codant pour SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 119 codant pour SEQ ID NO : 120, SEQ ID NO : 121 codant pour SEQ ID NO : 122, SEQ ID NO : 123 codant pour SEQ ID NO : 124 ou SEQ ID NO : 125 codant pour SEQ ID NO : 126. La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, la séquence nucléotidique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 2p-l codant pour SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2p-l codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2p, telle que définie ci-dessus, p variant de 1 à 63,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées,
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 600C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que O, IX SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 5O0C. La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment SEQ ID NO : 2p-l, p variant de 1 à 63.
Un vecteur avantageux- selon l'invention contient les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, notamment SEQ ID NO : 2p-l, p variant de 1 à 63, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant telle que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que mentionnée ci-dessus, à savoir un fragment de la nétrine 4, notamment représenté par SEQ ID NO : 2p, p variant de l à 63.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active,
- une protéine telle que définie ci-dessus, correspondant aux fragments de la nétrine 4, et de préférence l'une des séquences SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63, ou
- une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment l'une des séquences SEQ ID NO : 2p-l, p variant de 1 à 63, ou
- un anticorps tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre l'une des séquences SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63. La présente invention concerne également l'utilisation :
- d'une protéine telle que définie ci-dessus, correspondant aux fragments de la nétrine 4, et de préférence l'une des séquences SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63, ou
- d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment l'une des séquences SEQ ID NO : 2p-l, p variant de 1 à 63, ou
- d'un anticorps tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre l'une des séquences SEQ ID NO : 2p, p variant de 1 à 63. pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne. La présente invention concerne l'utilisation de RGM et de nouveaux fragments de RGM
En particulier, la présente invention concerne l'utilisation : - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
* la séquence SEQ ID NO : 512, SEQ ID NO : 514, SEQ ID NO : 516, SEQ ID NO :' 518 ou SEQ ID NO : 520,
* un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 150 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 354, SEQ ID NO : 356 ou SEQ ID NO : 358,
* toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 512, SEQ ID NO : 514, SEQ ID NO : 516, SEQ ID NO : 518 ou SEQ ID NO : 520, ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
* toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 512, SEQ ID NO : 514, SEQ ID NO : 516, SEQ ID NO : 518 ou SEQ ID NO : 520, ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une identité d'au moins - environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position
180 et 290 de la séquence SEQ ID NO : 512, SEQ ID NO : 514, SEQ ID NO : 516, SEQ ID NO : 518 ou SEQ ID NO : 520, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique, - ou d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant :
* soit pour la protéine telle que définie ci-dessus,
* soit pour un fragment de la protéine telle que définie ci-dessus,
* soit pour une séquence dérivée de la protéine telle que définie ci-dessus,
* soit pour une séquence homologue de la protéine telle que définie ci- dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à. la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 511 codant pour SEQ ID NO : 512, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 513 codant pour SEQ ID NO : 514, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 515 codant pour SEQ ID NO : 516, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 517 codant pour SEQ ID NO : 518, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 519 codant pour SEQ ID NO : 520, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 353 codant pour SEQ ID NO : 354, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 355 codant pour
SEQ ID NO : 356, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 357 codant pour SEQ ID NO : 358,
- ou d'un anticorps anti-idiotypique de la protéine telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, les angiomes, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
La présente invention concerne également des fragments de RGM, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes :
* une séquence SEQ ID NO : 354, SEQ ID NO : 356 ou SEQ ID NO : 358, ou
* toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
* toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 180 et 290 de SEQ ID NO : 512, sous ' réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour l'un des fragments de RGM tels que définis ci-dessus.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 353, SEQ ID NO : 355 ou SEQ ID NO : 357, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO : 354, SEQ ID NO : 356 ou SEQ ID NO : 358,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 354, SEQ ID NO : 356 ou SEQ ID NO : 358, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec la séquence SEQ ID NO : 353, SEQ ID NO : 355 ou SEQ ID NO : 357, codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 354, SEQ ID NO : 356 ou SEQ ID NO : 358, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, - ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 60°C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que O5IX SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 50°C.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ledit vecteur recombinant contenant de préférence les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre l'un des fragments de RGM susmentionnés.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active, - l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou
- une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou
- un anticorps tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'un des fragments de RGM susmentionnés.
La présente invention concerne également l'utilisation
- de l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou
- d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou - d'un anticorps tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'un des fragments de
RGM susmentionnés, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
La présente invention concerne également l'utilisation de fragments de nétrine 1, de nétrine 3 et de ses fragments, de nétrine Gl et de ses fragments, ainsi que les nouveaux fragments correspondants
En particulier, la présente invention concerne l'utilisation :
- d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
* la nétrine Gl représentée par la séquence SEQ ID NO : 506 ou par la séquence SEQ ID NO : 508, ou la nétrine 3 représentée par la séquence SEQ
ID NO : 510,
* un fragment de l'une de ces protéines ou de la nétrine 1 représentée par la séquence SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 400 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2m, m variant de 64 à 176, ou par la séquence SEQ ID NO : 372, * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 508, SEQ ID NO : 510, ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par sμbstitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti- angiogénique, ou
* toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 508, SEQ ID NO : 510, ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 296 et 438 de la séquence SEQ ID NO : 506, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique,
- ou d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant :
* soit pour l'une des protéines telles que définies ci-dessus, * soit pour un fragment de l'une des protéines telles que définies ci-dessus,
* soit pour une séquence dérivée de l'une des protéines telles que définies ci-dessus,
* soit pour une séquence homologue de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 505 codant pour SEQ ID NO : 506, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 507 codant pour SEQ ID NO : 508, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 509 codant pour SEQ ID NO : 510, ou à une séquence SEQ ID NO : 2m- 1 codant pour SEQ ID NO : 2m, m variant de 64 à 176, ou à la séquence SEQ ID NO : 371 codant pour SEQ ID NO : 372,
— ou d'un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci-dessus,
— ou d'un anticorps de l'une des protéines telles que définies ci-dessus,
- ou d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tels que définis ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne. Les séquences SEQ ID NO : 2m susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO .: 128 à SEQ ID NO : 352, c'est-à-dire aux séquences protéiques suivantes : SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO : 132, SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO : 138, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 142, SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 146, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 150, SEQ ID NO : 152, SEQ ID NO : 154, SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO : 160, SEQ ID
NO : 162, SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO : 168, SEQ ID NO : 170, SEQ ID NO : 172, SEQ ID NO : 174, SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO : 178, SEQ ID NO : 180, SEQ ID NO : 182, SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 186, SEQ ID NO : 188, SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO : 194, SEQ ID NO : 196, SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO : 200, SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 204, SEQ ID NO : 206,
SEQ ID NO : 208, SEQ ID NO : 210, SEQ ID NO : 212, SEQ ID NO : 214, SEQ ID NO : 216, SEQ ID NO : 218, SEQ ID NO : 220, SEQ ID NO : 222, SEQ ID NO : 224, SEQ ID NO : 226, SEQ ID NO : 228, SEQ ID NO : 230, SEQ ID NO : 232, SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 236, SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO : 240, SEQ ID NO : 242, SEQ ID NO : 244, SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO : 250, SEQ ID
NO : 252, SEQ ID NO : 254, SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO : 258, SEQ ID NO : 260, SEQ ID NO : 262, SEQ ID NO : 264, SEQ ID NO : 266, SEQ ID NO : 268, SEQ ID NO : 270, SEQ ID NO : 272, SEQ ID NO : 274, SEQ ID NO : 276, SEQ ID NO : 278, SEQ ID NO : 280, SEQ ID NO : 282, SEQ ID NO : 284, SEQ ID NO : 286, SEQ ID NO : 288, SEQ ID NO : 290, SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 294, SEQ ID NO : 296,
SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 300, SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO : 304, SEQ ID NO : 306, SEQ ID NO : 308, SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 312, SEQ ID NO : 314, SEQ ID NO : 316, SEQ ID NO : 318, SEQ ID NO : 320, SEQ ID NO : 322, SEQ ID NO : 324, SEQ ID NO : 326, SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 330, SEQ ID NO : 332, SEQ ID NO : 334, SEQ ID NO : 336, SEQ ID NO : 338, SEQ ID NO : 340, SEQ ID
NO : 342, SEQ ID NO : 344, SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO : 348, SEQ ID NO : 350, SEQ ID NO : 352.
Les séquences SEQ ID NO : 2m- 1 susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO : 2m, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 127 codant pour SEQ ID NO : 128, SEQ ID
NO : 129 codant pour SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO : 131 codant pour SEQ ID NO :
132, SEQ ID NO : 133 codant pour SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO : 135 codant pour
SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO : 137 codant pour SEQ ID NO : 138, SEQ ID NO : 139 codant pour SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 141 codant pour SEQ ID NO : 142, SEQ
ID NO : 143 codant pour SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 145 codant pour SEQ ID NO
: 146, SEQ ID NO : 147 codant pour SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 149 codant pour
SEQ ID NO : 150, SEQ ID NO : 151 codant pour SEQ ID NO : 152, SEQ ID NO : 153 codant pour SEQ ID NO : 154, SEQ ID NO : 155 codant pour SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO : 157 codant pour SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO : 159 codant pour SEQ ID
NO : 160, SEQ ID NO : 161 codant pour SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 163 codant pour SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO : 165 codant pour SEQ ID NO : 166, SEQ ID
NO : 167 codant pour SEQ ID NO : 168, SEQ ID NO : 169 codant pour SEQ ID
NO : 170, SEQ ID NO : 171 codant pour SEQ ID NO : 172, SEQ ID NO : 173 codant pour SEQ ID NO : 174, SEQ ID NO : 175 codant pour SEQ ID NO : 176, SEQ ID
NO : 177 codant pour SEQ ID NO : 178, SEQ ID NO : 179 codant pour SEQ ID
NO : 180, SEQ ID NO : 181 codant pour SEQ ID NO : 182, SEQ ID NO : 183 codant pour SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 185 codant pour SEQ ID NO : 186, SEQ ID
NO : 187 codant pour SEQ ID NO : 188, SEQ ID NO : 189 codant pour SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO : 191 codant pour SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO : 193 codant pour SEQ ID NO : 194, SEQ ID NO : 195 codant pour SEQ ID NO : 196, SEQ ID
NO : 197 codant pour SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO : 199 codant pour SEQ ID
NO : 200, SEQ ID NO : 201 codant pour SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 203 codant pour SEQ ID NO : 204, SEQ ID NO : 205 codant pour SEQ ID NO : 206, SEQ ID NO : 207 codant pour SEQ ID NO : 208, SEQ ID NO : 209 codant pour SEQ ID
NO : 210, SEQ ID NO : 211 codant pour SEQ ID NO : 212, SEQ ID NO : 213 codant pour SEQ ID NO : 214, SEQ ID NO : 215 codant pour SEQ ID NO : 216, SEQ ID
NO : 217 codant pour SEQ ID NO : 218, SEQ ID NO : 219 codant pour SEQ ID
NO : 220, SEQ ID NO : 221 codant pour SEQ ID NO : 222, SEQ ID NO : 223 codant pour SEQ ID NO : 224, SEQ ID NO : 225 codant pour SEQ ID NO : 226, SEQ ID
NO : 227 codant pour SEQ ID NO : 228, SEQ ID NO : 229 codant pour SEQ ID
NO : 230, SEQ ID NO : 231 codant pour SEQ ID NO : 232, SEQ ID NO : 233 codant pour SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 235 codant pour SEQ ID NO : 236, SEQ ID
NO : 237 codant pour SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO : 239 codant pour SEQ ID NO : 240, SEQ ID NO : 241 codant pour SEQ ID NO : 242, SEQ ID NO : 243 codant pour SEQ ID NO : 244, SEQ ID NO : 245 codant pour SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO : 247 codant pour SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO : 249 codant pour SEQ ID NO : 250, SEQ ID NO : 251 codant pour SEQ ID NO : 252, SEQ ID NO : 253 codant pour SEQ ID NO : 254, SEQ ID NO : 255 codant pour SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO :
257 codant pour SEQ ID NO : 258, SEQ ID NO : 259 codant pour SEQ ID NO : 260,' SEQ ID NO : 261 codant pour SEQ ID NO : 262, SEQ ID NO : 263 codant pour SEQ ID NO : 264, SEQ ID NO : 265 codant pour SEQ ID NO : 266, SEQ ID NO : 267 codant pour SEQ ID NO : 268, SEQ ID NO : 269 codant pour SEQ ID NO : 270, SEQ ID NO : 271 codant pour SEQ ID NO : 272, SEQ ID NO : 273 codant pour SEQ ID
NO : 274, SEQ ID NO : 275 codant pour SEQ ID NO : 276, SEQ ID NO : 277 codant pour SEQ ID NO : 278, SEQ ID NO : 279 codant pour SEQ ID NO : 280, SEQ ID NO : 281 codant pour SEQ ID NO : 282, SEQ ID NO : 283 codant pour SEQ ID NO : 284, SEQ ID NO : 285 codant pour SEQ ID NO : 286, SEQ ID NO : 287 codant pour SEQ ID NO : 288, SEQ ID NO : 289 codant pour SEQ ID NO : 290, SEQ ID
NO : 291 codant pour SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 293 codant pour SEQ ID NO : 294, SEQ ID NO : 295 codant pour SEQ ID NO : 296, SEQ ID NO : 297 codant pour SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 299 codant pour SEQ ID NO : 300, SEQ ID NO : 301 codant pour SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO : 303 codant pour SEQ ID NO : 304, SEQ ID NO : 305 codant pour SEQ ID NO : 306, SEQ ID NO : 307 codant pour SEQ ID NO : 308, SEQ ID NO : 309 codant pour SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 311 codant pour SEQ ID NO : 312, SEQ ID NO : 313 codant pour SEQ ID NO : 314, SEQ ID NO : 315 codant pour SEQ ID NO : 316, SEQ ID NO : 317 codant pour SEQ ID NO : 318, SEQ ID NO : 319 codant pour SEQ ID NO : 320, SEQ ID NO : 321 codant pour SEQ ID NO : 322, SEQ ID NO : 323 codant pour SEQ ID
NO : 324, SEQ ID NO : 325 codant pour SEQ ID NO : 326, SEQ ID NO : 327 codant pour SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 329 codant pour SEQ ID NO : 330, SEQ ID NO : 331 codant pour SEQ ID NO : 332, SEQ ID NO : 333 codant pour SEQ ID NO : 334, SEQ ID NO : 335 codant pour SEQ ID NO : 336, SEQ ID NO : 337 codant pour SEQ ID NO : 338, SEQ ID NO : 339 codant pour SEQ ID NO : 340, SEQ. ID
NO : 341 codant pour SEQ ID NO : 342, SEQ ID NO : 343 codant pour SEQ ID NO : 344, SEQ ID NO : 345 codant pour SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO : 347 codant pour SEQ ID NO : 348, SEQ ID NO : 349 codant pour SEQ ID NO : 350, SEQ ID NO : 351 codant pour SEQ ID NO : 352. La présente invention concerne une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
- ' une séquence SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131 , ou
- toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
- toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 284 et 487 de SEQ ID NO : 502, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique, sous réserve que ladite protéine soit différente de la séquence SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504.
Les séquences SEQ ID NO : 2i susmentionnées sont des fragments de la nétrine 1 et correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO : 128 à SEQ ID NO : 262, c'est- à-dire les séquences protéiques suivantes : SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 130, SEQ
ID NO : 132, SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO : 138, SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 142, SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 146, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 150, SEQ ID NO : 152, SEQ ID NO : 154, SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO : 160, SEQ ID NO : 162, SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO : 168, SEQ ID NO : 170, SEQ ID NO : 172, SEQ ID NO : 174, SEQ ID
NO : 176, SEQ ID NO : 178, SEQ ID NO : 180, SEQ ID NO : 182, SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 186, SEQ ID NO : 188, SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO : 194, SEQ ID NO : 196, SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO : 200, SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 204, SEQ ID NO : 206, SEQ ID NO : 208, SEQ ID NO : 210, SEQ ID NO : 212, SEQ ID NO : 214, SEQ ID NO : 216, SEQ ID NO : 218, SEQ ID NO : 220,
SEQ ID NO : 222, SEQ ID NO : 224, SEQ ID NO : 226, SEQ ID NO : 228, SEQ ID NO : 230, SEQ ID NO : 232, SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 236, SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO : 240, SEQ ID NO : 242, SEQ ID NO : 244, SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO : 250, SEQ ID NO : 252, SEQ ID NO : 254, SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO : 258, SEQ ID NO : 260 ou SEQ ID NO : 262.
La présente invention concerne également les fragments de la nétrine Gl, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes : - une séquence SEQ ID NO : 2j, j variant de 132 à 148, ou
- toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou - toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 296 et 438 de SEQ ID NO : 506, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique.
Les séquences SEQ ID NO : 2j susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO : 264 à SEQ ID NO : 296, c'est-à-dire : SEQ ID NO : 264, SEQ
ID NO : 266, SEQ ID NO : 268, SEQ ID NO : 270, SEQ ID NO : 272, SEQ ID NO : 274, SEQ ID NO : 276, SEQ ID NO : 278, SEQ ID NO : 280, SEQ ID NO : 282, SEQ ID NO : 284, SEQ ID NO : 286, SEQ ID NO : 288, SEQ ID NO : 290, SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 294 ou SEQ ID NO : 296. La présente invention concerne également les fragments de la nétrine 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes :
- une séquence SEQ ID NO : 2k, k variant de 149 à 176, ou
- toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
- toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 254 et 433 de SEQ ID NO : 510, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique.
Les séquences SEQ ID NO : 2k susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO : 298 à 352, c'est-à-dire aux séquence protéiques suivantes : SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 300, SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO : 304, SEQ ID NO : 306, SEQ ID NO : 308, SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 312, SEQ ID NO : 314, SEQ ID NO : 316, SEQ ID NO : 318, SEQ ID NO : 320, SEQ ID NO : 322, SEQ ID
NO : 324, SEQ ID NO : 326, SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 330, SEQ ID NO : 332, SEQ ID NO : 334, SEQ ID NO : 336, SEQ ID NO : 338, SEQ ID NO : 340, SEQ ID NO : 342, SEQ ID NO : 344, SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO : 348, SEQ ID NO : 350 ou SEQ ID NO : 352.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour les fragments de la nétrine 1.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2i-l, i variant de 64 à 131,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2i-l codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, telle que définie ci-dessus, — ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées,
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées sous réserve que ladite séquence nucléotidique soit différente de la séquence SEQ ID NO : 501 ou SEQ ID NO : 503.
Les séquences SEQ ID NO : 2i-l susmentionnées codent pour les fragments de nétrine 1 susmentionnés, représentés par SEQ ID NO : 2i, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 127 codant pour SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 129 codant pour SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO : 131 codant pour SEQ ID NO : 132, SEQ ID NO : 133 codant pour SEQ ID NO : 134, SEQ ID NO : 135 codant pour SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO : 137 codant pour SEQ ID NO : 138, SEQ ID NO : 139 codant pour SEQ ID NO : 140, SEQ ID NO : 141 codant pour SEQ ID NO : 142, SEQ ID NO : 143 codant pour SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 145 codant pour SEQ ID NO : 146, SEQ ID NO : 147 codant pour SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 149 codant pour SEQ ID NO : 150, SEQ ID NO : 151 codant pour SEQ ID NO : 152, SEQ ID NO : 153 codant pour SEQ ID NO : 154, SEQ ID NO : 155 codant pour SEQ ID NO : 156, SEQ ID NO : 157 codant pour SEQ ID NO : 158, SEQ ID NO : 159 codant pour SEQ ID NO ; 160, SEQ ID NO : 161 codant pour SEQ ID
NO : 162, SEQ ID NO : 163 codant pour SEQ ID NO : 164, SEQ ID NO : 165 codant pour SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO : 167 codant pour SEQ ID NO : 168, SEQ ID NO : 169 codant pour SEQ ID NO : 170, SEQ ID NO : 171 codant pour SEQ ID NO : 172, SEQ ID NO : 173 codant pour SEQ ID NO : 174, SEQ ID NO : 175 codant pour SEQ ID NO : 176, SEQ ID NO : 177 codant pour SEQ ID NO : 178, SEQ ID
NO : 179 codant pour SEQ ID NO : 180, SEQ ID NO : 181 codant pour SEQ ID NO : 182, SEQ ID NO : 183 codant pour SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 185 codant pour SEQ ID NO : 186, SEQ ID NO : 187 codant pour SEQ ID NO : 188, SEQ ID NO : 189 codant pour SEQ ID NO : 190, SEQ ID NO : 191 codant pour SEQ ID NO : 192, SEQ ID NO : 193 codant pour SEQ ID NO : 194, SEQ ID NO : 195 codant pour SEQ ID NO : 196, SEQ ID NO : 197 codant pour SEQ ID NO : 198, SEQ ID NO : 199 codant pour SEQ ID NO : 200, SEQ ID NO : 201 codant pour SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 203 codant pour SEQ ID NO : 204, SEQ ID NO : 205 codant pour SEQ ID NO : 206, SEQ ID NO : 207 codant pour SEQ ID NO : 208, SEQ ID NO : 209 codant pour SEQ ID NO : 210, SEQ ID NO : 21 1 codant pour SEQ ID
NO : 212, SEQ ID NO : 213 codant pour SEQ ID NO : 214, SEQ ID NO : 215 codant pour SEQ ID NO : 216, SEQ ID NO : 217 codant pour SEQ ID NO : 218, SEQ ID NO : 219 codant pour SEQ ID NO : 220, SEQ ID NO : 221 codant pour SEQ ID NO : 222, SEQ ID NO : 223 codant pour SEQ ID NO : 224, SEQ ID NO : 225 codant pour SEQ ID NO : 226, SEQ ID NO : 227 codant pour SEQ ID NO : 228, SEQ ID
NO : 229 codant pour SEQ ID NO : 230, SEQ ID NO : 231 codant pour SEQ ID NO : 232, SEQ ID NO : 233 codant pour SEQ ID NO : 234, SEQ ID NO : 235 codant pour SEQ ID NO : 236, SEQ ID NO : 237 codant pour SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO : 239 codant pour SEQ ID NO : 240, SEQ ID NO : 241 codant pour SEQ ID NO : 242, SEQ ID NO : 243 codant pour SEQ ID NO : 244, SEQ ID NO : 245 codant pour SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO : 247 codant pour SEQ ID NO : 248, SEQ ID NO : 249 codant pour SEQ ID NO : 250, SEQ ID NO : 251 codant pour SEQ ID NO : 252, SEQ ID NO : 253 codant pour SEQ ID NO : 254, SEQ ID NO : 255 codant pour SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO : 257 codant pour SEQ ID NO : 258, SEQ ID NO : 259 codant pour SEQ ID NO : 260 ou SEQ ID NO : 261 codant pour SEQ ID NO : 262.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active, - une protéine correspondant aux fragments de nétrine 1, tels que définis ci- dessus, ou
- une séquence nucléotidique codant pour lesdits fragments de nétrine 1, tels que définis ci-dessus, ou
- un anticorps, caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus , ou
- un anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie ci-dessus, ou
- un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques d'une protéine telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne l'utilisation : - d'une protéine correspondant aux fragments de nétrine 1, tels que définis ci- dessus, ou
- d'une séquence nucléotidique codant pour lesdits fragments de nétrine 1, tels que définis ci-dessus, ou
- d'un anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la néovascularisation choroïdienne compliquant la myopie, la néovascularisation de la cornée en particulier le rejet de greffe, les glaucomes, les rétinopathies diabétiques ou du prématuré, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angio sarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
La présente invention concerne également l'utilisation : - d'un anticorps, ' caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus, ou
- d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques d'une protéine telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant la stimulation de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : pathologies ischémiques telles que Fartérite des membres inférieurs, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, la sclérodermie ou la maladie de Raynaud.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour les fragments de la nétrine Gl .
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2j-l, j variant de 132 à 148,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO : 2j, j variant de 132 à 148, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO : 2j, j variant de 132 à 148, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ
50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2j-l codant pour une protéine homologue de l'une des séquences SEQ ID NO : 2j-, j variant de 132 à 148, telle que définie ci- dessus,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées,
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
Les séquences SEQ ID NO : 2j-l susmentionnées codent pour les fragments de nétrine Gl susmentionnés, représentés par SEQ ID NO : 2j, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 263 codant pour SEQ ID NO : 264,
SEQ ID NO : 265 codant pour SEQ ID NO : 266, SEQ ID NO : 267 codant pour SEQ ID NO : 268, SEQ ID NO : 269 codant pour SEQ ID NO : 270, SEQ ID NO : 271 codant pour SEQ ID NO : 272, SEQ ID NO : 273 codant pour SEQ ID NO : 274, SEQ ID NO : 275 codant pour SEQ ID NO : 276, SEQ ID NO : 277 codant pour SEQ ID NO : 278, SEQ ID NO : 279 codant pour SEQ ID NO : 280, SEQ ID NO : 281 codant pour SEQ ID NO : 282, SEQ ID NO : 283 codant pour SEQ ID NO : 284, SEQ ID NO : 285 codant pour SEQ ID NO : 286, SEQ ID NO : 287 codant pour SEQ ID NO : 288, SEQ ID NO : 289 codant pour SEQ ID NO : 290, SEQ ID NO : 291 codant pour SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 293 codant pour SEQ ID NO : 294 ou SEQ ID NO : 295 codant pour SEQ ID NO : 296.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour les fragments de la nétrine 3.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2k- 15 k variant de 149 à 176,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO : 2k, k variant de 149 à 176,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO : 2k, k variant de 149 à 176, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2k- 1 codant pour une protéine homologue de l'une des séquences SEQ ID NO : 2k, k variant de 149 à 176, telle que définie ci- dessus,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées,
- ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées. Les séquences SEQ ID NO : 2k- 1 susmentionnées codent pour les fragments de nétrine 3 susmentionnés, représentés par SEQ ID NO : 2k, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes : SEQ ID NO : 297 codant pour SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 299 codant pour SEQ ID NO : 300, SEQ ID NO : 301 codant pour SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO : 303 codant pour SEQ ID NO : 304, SEQ ID NO : 305 codant pour SEQ ID NO : 306, SEQ ID NO : 307 codant pour SEQ ID NO : 308, SEQ ID NO : 309 codant pour SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 311 codant pour SEQ ID NO : 312, SEQ ID NO : 313 codant pour SEQ ID NO : 314, SEQ ID NO : 315 codant pour SEQ ID NO : 316, SEQ ID NO : 317 codant pour SEQ ID NO : 318, SEQ ID
NO : 319 codant pour SEQ ID NO : 320, SEQ ID NO : 321 codant pour SEQ ID NO : 322, SEQ ID NO : 323 codant pour SEQ ID NO : 324, SEQ ID NO : 325 codant pour SEQ ID NO : 326, SEQ ID NO : 327 codant pour SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 329 codant pour SEQ ID NO : 330, SEQ ID NO : 331 codant pour SEQ ID NO : 332, SEQ ID NO : 333 codant pour SEQ ID NO : 334, SEQ ID NO : 335 codant pour SEQ ID NO : 336, SEQ ID NO : 337 codant pour SEQ ID NO : 338, SEQ ID NO : 339 codant pour SEQ ID NO : 340, SEQ ID NO : 341 codant pour SEQ ID NO : 342, SEQ ID NO : 343 codant pour SEQ ID NO : 344, SEQ ID NO : 345 codant pour SEQ ID NO : 346, SEQ ID NO : 347 codant pour SEQ ID NO : 348, SEQ ID NO : 349 codant pour SEQ ID NO : 350 ou SEQ ID NO : 351 codant pour SEQ ID
NO : 352.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour l'un des fragments de nétrine 1, de nétrine 3, ou de nétrine G, ledit vecteur recombinant étant notamment caractérisé en ce qu'il contient les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus, notamment dirigé contre un fragment de la nétrine 1, de la nétrine 3, ou de la nétrine G ou tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active, - l'un des fragments de la nétrine 1, de la nétrine 3, ou de la nétrine G susmentionnés, ou
- une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour l'un des fragments de la nétrine 1, de la nétrine 3, ou de la nétrine G susmentionnés, ou - un anticorps tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'un des fragments de la nétrine 1, de la nétrine 3, de la nétrine G susmentionnés, ou
- un anticorps anti-idiotypique de la nétrine 1, de la nétrine 3, ou de la nétrine G susmentionnés, ou
- un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypique tels que définis ci-dessus. La présente invention concerne également l'utilisation :
- d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
- une séquence SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, ou
- toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
- toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 284 et 487 de SEQ ID NO : 502, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique, sous réserve que ladite protéine soit différente de la séquence SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504
- ou d'une séquence nucléotidique codant pur l'une des protéines susmentionnées, - ou d'un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus,
- ou d'un anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie ci-dessus,
- ou d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypique tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la néovascularisation choroïdienne compliquant la myopie, la néovascularisation de la cornée en particulier le rejet de greffe, les glaucomes, les rétinopathies diabétiques ou du prématuré, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
La présente invention concerne les nouvelles utilisations des nétrines.
En particulier, la présente invention concerne l'utilisation : - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
* la nétrine Gl représentée par la séquence SEQ ID NO : 506 ou par la séquence SEQ ID NO : 508, la nétrine 3 représentée par la séquence SEQ ID NO : 510 ou la nétrine 4 représentée par la séquence SEQ ID NO : 498 ou par la séquence SEQ ID NO : 500, * un fragment de l'une de ces protéines ou de la nétrine 1 représentée par la séquence SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504, sous réserve que ce fragment présente une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 400 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2m, m variant de 1 à 176, ou par la séquence SEQ ID NO : 372,
* toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 508, SEQ ID NO : 510, SEQ ID NO : 498, SEQ ID NO : 500 ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'activation des péricytes, ou
* toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 506, SEQ ID NO : 508, SEQ ID NO : 510, SEQ ID NO : 498, SEQ ID NO : 500 ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 296 et 438 de la séquence SEQ ID NO : 506, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'activation des péricytes, - ou d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant :
* soit pour l'une des protéines telles que définies ci-dessus, * soit pour un fragment de l'une des protéines telles que définies ci-dessus,
* soit pour une séquence dérivée de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, * soit pour une séquence homologue de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 505 codant pour SEQ ID NO : 506, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 507 codant pour SEQ ID NO : 508, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 509 codant pour SEQ ID NO : 510, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 497 codant pour SEQ ID NO : 498, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 499 codant pour SEQ ID
NO : 500, ou à une séquence SEQ ID NO : 2m- 1 codant pour SEQ ID NO : 2m, m variant de 1 à 176, ou à la séquence SEQ ID NO : 371 codant pour
SEQ ID NO : 372,
- ou d'un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci-dessus,
- ou d'un anticorps de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, - ou d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tels que définis ci- dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses. La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus de la protéine nétrine 4, représentée par la séquence SEQ ID NO : 498 ou SEQ ID NO : 500, pour la préparation d'un médicament susceptible d'être administré à raison d'environ 0,1 à environ 20 mg/kg, notamment par voie intraveineuse, par voie sous- cutanée, par voie systémique, par injection intra-vitréenne, par voie locale au moyen d'infiltrations ou par l'intermédiaire d'un collyre, éventuellement associé à une électroperméation.
La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'activité d'inhibition de la formation des plaques d'athérome est mesurée selon le test de prolifération ou de migration susmentionnés, et en ce que cette activité d'inhibition correspond à un pourcentage d'inhibition compris de 20% à 100% des plaques d'athérome obtenues en l'absence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique tels que définis ci-dessus.
L'activité anti-athéromateuse est mesurée par le test tel que décrit dans Arnal et al. (2003). Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus d'anticorps anti-idiotypiques d'une nétrine, notamment de la protéine nétrine 4 mutée ou non, représentée par la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, et par la séquence SEQ ID NO : 498 ou SEQ ID NO : 500, reconnaissant le récepteur UNC5H4 à la surface des péricytes ou cellules musculaires lisses, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies suivantes :
- la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la néovascularisation choroidienne compliquant la myopie - les rétinopathies diabétiques ou du prématuré,
- le glaucome néovasculaire (de la cornée, de la rétine...)
- les néovascularisations cornéennes en particulier le rejet de greffe
- la polyarthrite rhumatoïde,
- le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, - les angiomes,
- l'athérosclérose,
- l'obésité,
- les malformations intestinales,
- la maladie de Crohn, — les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires dont Cadasil est un exemple,
- la maladie d' Alzheimer,
- les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et
- les anévrysmes et les dissections vasculaires. La présente invention concerne également l'utilisation du récepteur UNC5H4 à la surface des péricytes ou cellules musculaires lisses, ou de péricytes ou cellules musculaires lisses porteuses de ces récepteurs, pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage de composés activateurs de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses. La présente invention concerne un procédé de criblage de composés activateurs de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la mesure de l'inhibition de la liaison de la nétrine 4 à son récepteur UNC5H4, ou de l'inhibition de l'activité mitogénique, chimiotactique, anti-apoptotique ou de différenciation des nétrines ou de tout autre facteur de type nétrine sur les cellules musculaires lisses ou péricytes, et
- la mesure de la perte de l'inhibition de l'activité mitogénique ou chimiotactique ou anti-apoptotique ou de différenciation des nétrines ou de tout autre facteur de type nétrine sur les cellules musculaires lisses ou péricytes, par adjonction d'un anticorps neutralisant le récepteur UNC5H4.
Les tests utilisés dans le cadre de ce procédé de criblage sont les tests tels que décrits ci-dessus de prolifération ou de migration.
La présente invention concerne un procédé de criblage de composés modulateurs de la liaison entre le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4 mutée ou non, représentée par la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou par la séquence SEQ ID NO : 498 ou SEQ ID NO : 500, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
— la mise en présence dudit composé modulateur avec le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4, et - la mesure du taux de liaison spécifique entre le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4, une différence dudit taux en présence dudit composé par rapport au taux normal en l'absence dudit composé étant une indication de la propriété dudit composé à moduler la liaison entre le récepteur UNC5H4 et la nétrine 4. Le test de criblage est effectué de la manière suivante : Des immunoglobulines de chèvre dirigées contre les domaines Fc des IgG humaines sont incubées sur des plaques de microtitration (0,1-20 μg/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les protéines contenant les domaines extracellulaires du récepteur UNC5H4 fusionné à une séquence Fc d'IgG humaine sont immobilisées ' sur les plaques de microtitration (incubation à une concentration comprise entre 1 et 1000 ng/ml). Les composés sont ajoutés dilués en série dans du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20 et 10-500 pg de nétrine 1, 3, 4 ou G soit marquée par tout procédé convenable (iode radioactif, biotine, fluorochrome). Après rinçages, la quantité de nétrine liée au récepteur est révélée soit par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-nétrine couplé à la peroxydase, soit par mesure de radioactivité, soit par adjonction d'avidine couplée à la peroxydase, soit par mesure de fluorescence. La peroxydase est ensuite révélée par ' une réaction colorimétrique. Dans tous les cas, la quantité du composé à tester est mesurée par sa capacité à inhiber la quantité de nétrine fixée.
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PARTIE EXPERIMENTALE
La Figure 1 correspond au test de migration des cellules HUAEC. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne et l' écart-type sont représentés sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine
4 en ng/ml en présence (V 50) ou absence de 50 ng/ml de VEGF (facteur de croissance endothéliale vasculaire).
La Figure 2 correspond au test de migration des cellules musculaires lisses d'aorte. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne et l'écart-type sont représentés sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration des protéines nétrine 1 et nétrine 4 en ng/ml. Les colonnes blanches correspondent à une concentration de 0 ng/ml ; les colonnes avec les hachures verticales correspondent à une concentration de 6 ng/ml ; les colonnes avec les hachures horizontales correspondent à une concentration de 18 ng/ml ; les colonnes avec les hachures obliques correspondent à une concentration de 55 ng/ml ; les colonnes grises correspondent à une concentration de 160 ng/ml et les colonne noires correspondent à une concentration de 500 ng/ml.
La Figure 3 correspond au test de prolifération des cellules HUAEC. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine 4 (500 ng/ml) en présence de 2 ng/ml de VEGF ou FGF2 comme indiqué sur la figure et l'axe des ordonnées au pourcentage de prolifération. Les colonnes noires correspondent au témoin ; les colonnes blanches correspondent au pourcentage de prolifération en présence de 500 ng/ml de nétrine 4 et les colonnes grises correspondent au pourcentage de prolifération en présence de 500 ng/ml de nétrine 4 et de 5 μg/ml d'IgG dirigées contre le récepteur néogénine.
La Figure 4 correspond à l'analyse de l'effet de la nétrine 4 (NET-4), de la nétrine 1 (NET-I) et de la nétrine Gl (NET-Gl) sur la prolifération des VSM. La courbe représentée par des losanges correspond à la nétrine 4. La courbe représentée par des carrés correspond à la nétrine Gl. La courbe représentée par des triangles correspond à la nétrine 1. La Figure 5 représente l'effet d'un anticorps anti-néogénine sur la prolifération des VSM. L'axe des ordonnées représente la densité optique à 595 nm. Les colonnes blanches correspondent à la prolifération sans anticorps anti-néogénine et les colonnes noires correspondent à la prolifération en présence de 5 μg/ml d'anticorps anti- néogénine.
La Figure 6 correspond au test d'apoptose des cellules HUAEC. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine 4 (500 ng/ml) en présence de 50 ng/ml de VEGF ou FGF2 comme indiqué sur la figure et l'axe des ordonnées au pourcentage de cellules apoptotiques. Les colonnes blanches correspondent au témoin sans nétrine 4 ; les colonnes grises correspondent au pourcentage d'apoptose en présence de 500 ng/ml de nétrine 4.
La Figure 7 A correspond au test de prolifération des cellules musculaires lisses d'aorte. L'axe des abscisses correspond à la concentration en ng/ml de la protéine nétrine 4 ou de la protéine nétrine 4 mutée et l'axe des ordonnées au pourcentage de prolifération. La courbe de gauche représentée par des carrés correspond à la nétrine 4 mutée. La courbe de droite représentée par des losanges correspond à la nétrine 4.
La Figure 7 B correspond au test de migration des cellules musculaires lisses d'aorte. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne et Pécart-type sont représentés sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration des protéines nétrine 4 et nétrine 4 mutée en ng/ml. La courbe représentée par des carrés correspond à la nétrine 4 mutée. La courbe représentée par des losanges correspond à la nétrine 4.
La Figure 8 correspond à un test de prolifération de cellules HUAEC afin de déterminer l'effet des surnageants des cellules PC3 transfectées avec la nétrine 4 mutée (clone 1 et clone 5) ou non mutée (clone 8, 10 et 15). L'axe des ordonnées représente le pourcentage de prolifération. La colonne 1 correspond au témoin (DMEM seul) ; la colonne 2 correspond aux cellules PC3 non transfectées ; la colonne 3 correspond au clone 1 ; la colonne 4 correspond au clone 5 ; la colonne 5 correspond au clone 8 ; la colonne 6 correspond au clone 10 ; la colonne 7 correspond au clone 15. La Figure 9 correspond à une analyse de la progression tumorale. L'axe des abscisses correspond au temps exprimé en j ours, j = 0 étant le jour où la greffe tumorale est pratiquée. L'axe des ordonnées correspond au volume des tumeurs (en mm3). La courbe comportant les losanges correspond aux cellules PC3 non transfectées. La courbe comportant les carrés correspond aux cellules PC3 transfectées avec le clone 1.
La courbe comportant les triangles correspond aux cellules PC3 transfectées avec le clone 5.
La Figure 10 correspond à une analyse de la progression tumorale en présence d'AVASTIN. L'axe des ordonnées correspond au rapport du volume tumoral mesuré après le traitement sur le volume tumoral mesuré avant le traitement. La colonne 1 correspond aux cellules PC3 non transfectées ; la colonne 2 correspond au clone 8 de PC3 ; la colonne 3 correspond au clone 10 de PC3 ; la colonne 4 correspond au clone 15 de PC3.
Les Figures 11 A et 11 B correspondent à une analyse de l'effet de la nétrine 4 sur la vascularisation choroïdienne chez la souris. Dans la figure 11 A, les souris ont reçu une injection de 1 μl de PBS. Dans la figure 11 B, les souris ont reçu une injection del μl de PBS contenant lμg de nétrine 4. Les cellules endothéliales sont révélées par immunomarquage et apparaissent en blanc sur les figures 11 A et 11 B.
Les Figures 12 A, 12 B, 12 C correspondent à la perfusion d'un dextran fluorescent qui visualise les néovaisseaux choroïdiens autour d'un impact laser en gris au centre. Les rats ont reçu deux ou trois impacts laser à J (jours)=0, puis à J=7, J=IO une injection sous rétinienne du véhicule seul (PBS) (12 A) ou contenant de la nétrine 1
(12 B) ou 2 μg de nétrine 4 ( 12 C) ou 100 pg de nétrine 4 mutée (12 D). A J=14, les rats sont sacrifiés et perfusés par la lectine fluorescente qui permet de visualiser les néovaisseaux choroïdiens apparaissant en blancs sur les figures et entourant un impact laser en gris.
La Figure 13 correspond au test de migration des cellules musculaires lisses d'aorte en présence de mutants de délétion de la nétrine 4 mutée. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne et l' écart-type sont représentés sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la nétrine 4 en ng/ml. La courbe avec les croix correspond à la nétrine 4 non mutée. La courbe avec les losanges correspond au milieu conditionné des cellules transfectées avec une séquence complète de nétrine 4 mutée. La courbe avec les carrés correspond au milieu conditionné des cellules transfectées avec la séquence SEQ ID NO : 528.
PARTIE EXPÉRIMENTALE
Matériels :
Les molécules nétrine 1 (SEQ ID NO : 502), nétrine 4 (SEQ ID NO : 498), nétrine Gl (SEQ ID NO : 506), nétrine 3 (SEQ ID NO : 510) et nétrine 4 mutée (SEQ ID
NO : 522) sont des protéines recombinantes. Les molécules nétrine 1, nétrine 4 et nétrine Gl sont disponibles dans le commerce auprès de R&D.
L'isoforme de 165 acides aminés du VEGF est produite par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant l'ADNc correspondant (Plouët ét al., 1997).
Des cellules endothéliales artérielles ombilicales humaines (HUAEC) ont été isolées à partir d'artères ombilicales perfusées avec de la collagènase (Sigma) pour digérer la membrane basale. Les cellules HUAEC ont été maintenues dans du milieu EBM (Clonetics) additionné de 15% de sérum de veau fœtal (SVF) inactivé par la chaleur, 100 μg/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine à 37°C dans 10% de
CO2. Les cultures souches ont reçu 2 ng/ml de VEGF chaque jour pair.
Des cellules musculaires lisses d'aorte ont été maintenues dans du milieu DMEM additionné de 15% de sérum de veau fœtal (SVF) inactivé par la chaleur, 100 μg/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine à 37°C dans 10% de CO2. Les cultures souches ont reçu 2 ng/ml de FGF chaque jour pair.
IDENTIFICATION D'UNE NÉTRINE 4 MUTÉE
Clonage de Ia nétrine 4 mutée Les ARN totaux des cellules de l'artère de cordon ombilical humain (HUAEC) ont été extraits à l'aide du TriPure (Roche). Ensuite les ARN ont été transcrits en utilisant le kit pour RT-PCR (AMV) de Roche selon les indications du fabricant.
Les amorces (5')-TT CTA GAC ATG GGG AGC TGC GCG CGG-(3') (sens) et (5')-C ATT AAC GTC GAA CTG ACA GGT ATC-(3') (sens contraire) ont servi à l'amplification de la séquence 1-1039 de la nétrine 4, tandis que les amorces (5')-AG CAC TGT GCC CCG TTA TAC AAT GA-(3') (sens) et (5')-CGG GAT CCA CTT GCA CTC TCT TTT TAA AAT ATC C-(3') (sens contraire) ont été utilisées pour amplifier la séquence 914-1884 de la nétrine 4. Les conditions adoptées pour l'amplification ont été : 35 cycles avec dénaturation à 940C pendant 1 minute ; hybridation à 55°C pendant 1 minute ; et extension à 720C pendant 1 minute.
Les produits obtenus ont été mélangés et utilisés pour effectuer une nouvelle PCR avec les amorces (5')-TT CTA GAC ATG GGG AGC TGC GCG CGG-(3') (sens) et (5')-CGG GAT CCA CTT GCA CTC TCT TTT TAA AAT ATC C-(3') (sens contraire) dans les mêmes conditions décrites précédemment, avec un nombre de cycles de 25 au lieu de 35. Ce produit PCR contenant toute la séquence de la nétrine 4 a été clone dans le vecteur intermédiaire pCR2.1 (Invitrogen). Après digestion par Xba I et Bam HI, la séquence de la nétrine 4 a été extraite de ce vecteur et insérée dans le vecteur pcDNA3.1 (-)/His myc C digéré par les mêmes enzymes de restriction. Ce dernier vecteur contenant la séquence complète de la nétrine 4 mutée a été utilisé pour transfecter des cellules. Une manipulation identique a conduit à l'obtention d'un vecteur d'expression de la nétrine 4 sauvage en utilisant la séquence de la nétrine 4 sauvage.
La nétrine 4 mutée a été produite par transfection de cellules CHO pgsA 745 par le vecteur contenant la séquence de la nétrine 4 sauvage selon un protocole déjà décrit
(Plouët, 1997). La protéine a été purifiée par chromatograpbie d'affinité pour l'héparine sépharose et éluée par un gradient discontinu de NaCl (0, 3; 1,0 et 2,0 M NaCl. NET 4m est éluée par NaCl 2M, et a un degré de pureté > 90%.
L'activité biologique de la nétrine 4 mutée (NET 4m) a été comparée à celle de la nétrine 4 sauvage (NET 4) selon le test de prolifération des cellules musculaires lisses.
La Figure 7A montre que la NET 4 m déclenche une activité mitogénique à une concentration 1000 fois inférieure à celle de NET 4. De même dans un test de migration, NET-4 m est 1000 fois plus active que NET-4 (Voir Figure 7B).
Construction de mutants de délétion pour Ia nétrine 4 mutée
Le vecteur pcDNA3.1 (-)/His myc C contenant la séquence complète de la nétrine 4 mutée (628 AA) a été digéré par l'enzyme de restriction BamHl, traité avec le fragment klenow de la polymérase 1, puis digéré avec l'enzyme de restriction PshAl. Le fragment linéarisé correspondant au vecteur pcDNA3.1 (-)/His myc C contenant la séquence nétrine 4 mutée délétée du domaine cter (478-628) est ensuite isolé après migration sur gel d'agarose et purifié sur colonne Qiagen. Après ligation, on obtient donc un vecteur d'expression pcDNA3.1 (-)/His myc C contenant la séquence de la nétrine 4 mutée délétée du domaine cter (1-477). le vecteur pcDNA3.1 (-)/His myc C contenant la séquence complète de la nétrine 4 mutée (628 aa) a été digéré par l'enzyme de restriction Xcml. Cette enzyme qui coupe la séquence interne de la nétrine 4 en deux sites (aa288/aa488) permet de déléter la protéine de son domaine central (domaine V à motifs EGF). Après purification du fragment et ligation, on obtient donc un vecteur d'expression pcDNA3.1 (-)/His myc C contenant la séquence de la nétrine 4 mutée délétée du domaine central (288/488). Cependant, puisque la ligation des deux sites Xcml conduit à l'apparition d'un codon stop (aa 313), ce vecteur code pour une protéine nétrine 4 mutée tronquée de 312 acides aminés comportant la séquence du domaine laminine (1-288) et une séquence proteique de 24 acides aminés.
Tests de migration des cellules endothéliales vasculaires d'artères ombilicales humaines fHUAEC)
Des cellules endothéliales vasculaires d'artères ombilicales humaines (HUAEC) sont inoculées dans des puits de 4 cm à haute densité (50 000 cellules/puits). Quand la monocouche est confluente, la prolifération est arrêtée par l'incubation, pendant une nuit, en présence de Ml 99 (Life Sciences) contenant 2% de SVF. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche à l'aide d'un grattoir mousse, permettant de délimiter une surface libre de toute cellule. Les monocouches sont ensuite lavées 3 fois par du Ml 99 pour enlever les cellules non adhérentes. Une photographie est alors prise pour délimiter la surface avant toute migration cellulaire. Les puits sont ensuite incubés en M 199 et
2% de SVF seul ou en présence de 50 ng/ml de VEGF en présence de concentrations variables de nétrine 4 (NET-4) ou nétrine 1 (NET-I) ou nétrine Gl (NET-Gl). Après 24 heures, les puits sont lavés 3 fois et colorés au May-Grunwald-Giemsa et photographiés et les cellules comptées dans 8 champs par condition. Les photographies prises avant et après l'expérience sont alors superposées pour permettre le comptage des cellules ayant migré. Les résultats sont exprimés en nombre de cellules par champs.
Les résultats de ces tests pour la nétrine 4 sont indiqués dans la Figure 1. D'après la Figure 1, on constate que l'addition de NET-4 en l'absence de VEGF n'a pas d'effet sur la migration basale des cellules HUAEC. En revanche, NET-4 inhibe l'activité du VEGF et 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 200 ng/ml de NET-4.
Tests de migration des cellules musculaires lisses (VSM)
Des cellules musculaires lisses (VSM) sont inoculées dans des puits de 4 cm2 à haute densité (50 000 cellules/puits). Quand la monocouche est confluente, la prolifération est arrêtée par l'incubation, pendant une nuit, en présence de Ml 99 (Life Sciences) contenant 2% de SVF. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche à l'aide d'un grattoir mousse, permettant de délimiter une surface libre de toute cellule.
Les monocouches sont ensuite lavées 3 fois dans du DMEM pour enlever les cellules non adhérentes. Une photographie est alors prise pour délimiter la surface avant toute migration cellulaire. Les puits sont ensuite incubés en milieu DMEM sans SVF en présence de concentrations variables de nétrine 4 (NET-4) ou nétrine 1 (NET-I). Après
24 h les puits sont lavés 3 fois et colorés au May-Grunwald-Giemsa et photographiés.
Les photographies prises avant et après l'expérience sont alors superposées pour permettre le comptage des cellules ayant migré.
Les résultats de ces tests sont indiqués dans la Figure 2. D'après la Figure 2, on constate que la nétrine 1 et la nétrine 4 ont un effet positif sur la migration des VSM. En effet, la nétrine 1 et la nétrine 4 stimulent la migration des cellules musculaires lisses et 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 20 ng/ml de NET-4.
Tests de prolifération des cellules endothéliales vasculaires d'artères ombilicales humaines (HU AEC)
Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 2 000 cellules HUAEC par puits dans du EBM additionné de 10% de SVF. Les cellules ont été stimulées ou non avec 2 ng/ml de VEGF165 et différentes concentrations de nétrine 1 ou nétrine 4. Dans certains puits, 5 mg/ml d'anticorps anti-néogénine ont été ajoutés. Au bout de 5 jours, les puits ont été rincés doucement avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al., 1989) : les cellules ont été incubées dans 0,1% de cristal violet (Sigma) pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant violet cristallisé incorporé a ensuite été solubilisé par 100 μl de 10% d'acide acétique par puits. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées (voir Figure 1). Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits ± SD.
Les protéines nétrine 1 ou nétrine 4 utilisées seules n'ont pas d'effet significatif sur la prolifération basale (due au sérum seul). En revanche, comme indiqué sur la Figure 3, la protéine nétrine 4 inhibe la prolifération induite par le VEGF sur un mode dépendant de la dose. 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 200 ng/ml. L'addition d'anticorps anti-néogénine inverse complètement l'activité inhibitrice de la prolifération induite par la nétrine 1 ou la nétrine 4.
Tests de prolifération des cellules musculaires lisses (VSM) Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 2 000 cellules VSM par puits dans du milieu DMEM additionné de 10% de SVF. Après 6 h les cellules sont transférées dans du milieu DMEM contenant 2% SVF puis stimulées ou non avec différentes concentrations de nétrine 1, nétrine Gl ou nétrine 4. Au bout de 5 jours, les puits les puits ont été rincés avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde, colorées au cristal violet et solubilisées par de l'acide acétique. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées. Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits ± SD.
La Figure 4 montre que les protéines, nétrine Gl et nétrine 4 utilisées seules ont un effet significatif sur la prolifération sur un mode dépendant de la dose. 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 20 ng/ml. En revanche nétrine 1 exerce un effet non significatif sur la prolifération.
Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 2 000 cellules VSM par puits dans du milieu DMEM additionné de 10% de SVF. Après 6 h les cellules sont transférées dans du milieu DMEM contenant 2% SVF puis stimulées ou non avec différentes concentrations de nétrine 1, nétrine Gl ou nétrine 4. Dans certains puits 5 μg/ml d'anticorps anti-néogénine ont été ajoutés. Au bout de 5 jours, les puits ont été rincés doucement avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al, 1989) : les cellules ont été incubées dans 0,1% de cristal violet (Sigma) pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant violet cristallisé incorporé a ensuite été solubilisé par 100 μl de 10% d'acide acétique par puits. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées (voir Figure 4). Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits ± SD.
La Figure 5 montre que l'addition d'anticorps anti-néogénine ne reverse pas l'activité stimulante de la prolifération induite par la nétrine 4.
Tests d'adhésion cellulaire
Des plaques ELISA à 96 puits (Nunc) ont été recouvertes de protéine VEGF165 selon le protocole décrit dans l'article de Hutchings et al. (2003), diluée dans du tampon carbonate 0,05 M à pH 9,6 pendant la nuit à 4°C. Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués pendant 1 heure à 37°C avec 5 mg/ml de BSA (sérum albumine bovine) dans du tampon carbonate et lavés deux fois avec du DMEM avant les expériences. Les cellules ont été trypsinisées, lavées et remises en suspension dans 5 ml de DMEM avec 10% de SVF dans un tube de plastique non traité et incubées pendant 1 heure à 37°C avec 10% de CO2. Les cellules ont ensuite été concentrées par centrifugation et remises en suspension dans un mélange DMEM + 0,2% BSA sans sérum et la suspension cellulaire a été traitée pendant 20 minutes (37°C, 10% de CO2) avec la protéine nétrine 4 utilisée pour moduler l'adhésion. 40 000 cellules par puits ont été distribuées dans les puits dans un volume de 100 μl de DMEM + 0,2% de BSA. Les cellules ont été laissées adhérer à 37°C sous 10% de CO2 pendant le temps voulu. Les puits ont été lavés doucement trois fois avec du DMEM pour retirer les cellules non adhérentes et les cellules adhérentes ont été fixées avec 1% de glutaraldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al, 1989) : les cellules ont été incubées avec 0,1% de violet cristallisé (Sigma) dilué dans 0,2 M de tampon borate à pH 9,5 pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant cristal violet incorporé a ensuite été solubilisé par 100 μl de 10% d'acide acétique par puits. Test d'apoptose
50 000 cellules HUAEC sont déposées sur des puits de culture préalablement gélatinisées dans du milieu EBM contenant 10% de SVF et 2 ng/ml de VEGF. 2 jours après les cellules sont incubées une nuit dans du milieu EBM contenant 2% de SVF et 200 ng/ml de nétrine 4 en présence ou absence FGF2 ou VEGF. Les cellules sont rincées 24 h après et incubées avec du iodure de propidium, fixées et examinées au microscope à fluorescence. Les cellules présentant des noyaux fragmentés sont comptées en fluorescence et les cellules totales sont comptées sous éclairage direct.
L'opération est effectué dans au moins 8 champs représentant un minimum de 300 cellules. Le pourcentage de cellules présentant un noyau fragmenté est alors calculé.
La nétrine 4 utilisée seule n'a pas d'effet significatif sur l'apoptose. En revanche, la protéine nétrine 4 inhibe totalement l'effet anti-apoptotique exercé par le VEGF ou le FGF-2 (voir Figure 6).
Production d'anticorps anti-idiotypiques
Dans un premier temps on prépare un anticorps neutralisant de nétrine 1, 3, Gl ou 4 ou de l'un de ses fragments susmentionnés (SEQ ID NO : 2 à 352) en injectant à un animal, notamment une souris, ladite nétrine ou ledit fragment mélangée avec de l'adjuvant complet de Freund (1 volume par volume de nétrine ou de fragment de nétrine). On choisira une quantité de nétrine ou de fragment de nétrine comprise entre
10 et 500 μg/kg de poids corporel pour immuniser l'animal. La même opération est effectuée à 15 et 30 jours d'intervalle, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Au jour 40 une saignée est pratiquée, le sérum est séparé et les immunoglobulines sont purifiées par toute méthode de fractionnement habituelle, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie d'affinité pour la protéine A ou G. On mesure l'activité neutralisante des immunoglobulines par n'importe quel test décrit (par exemple, dans le cas de la nétrine 4 ou de l'un de ses fragments, liaison de la nétrine 4 marquée au domaine extracellulaire de l'un quelconque de ses récepteurs, prolifération, migration, adhésion cellulaire). Ainsi, un lot d' immunoglobulines sera dit neutralisant quand il aura la capacité d'inhiber l'interaction de la nétrine 1, 3, 4 ou Gl avec soit le domaine extracellulaire de dcc, de néogénine, de UNC5H1, de UNC5H2, de UNC5H3 ou de UNC5H4.
Dans un deuxième temps, on prépare des anticorps anti-idiotypiques de la nétrine 1, 3, Gl ou 4, ou de l'un de leurs fragments en injectant à des souris par voie sous- cutanée 1-100 μg de la préparation des immunoglobulines neutralisant l'activité de ladite nétrine ou dudit fragment précédemment décrites en association avec 100 μl d'adjuvant, notamment de l'adjuvant complet de Freund (Sigma). L'injection est répétée 15, 30 et 45 jours après. Cinquante-cinq jours après la première injection, on injecte à des souris 10 μg du même anticorps par voie intrapéritonéale. Cinquante-huit jours après la première injection, les souris sont sacrifiées et leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu ISCOVE pour libérer les splénocytes. Les splénocytes sont fusionnés avec des cellules de myélome de souris, notamment des cellules AG8X 63 (Kearney et al, 1979), et incubés à raison de 100 000 cellules/puits. La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 μl de polyéthylène glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle.
Quatre ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37°C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une période d'incubation de 4 minutes à 37°C, 4 ml sont ajoutés. La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau foetal et du HAT IX (5OX : Hypoxanthine 5 mM, Aminoptérine 20 μM et Thymidine 0,8 mM) et distribuées à raison de 100 μl par puits sur les macrophages. Après 5 jours, 100 μl de milieu HAT sont ajoutés, et entre 8 et 14 jours le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer par ELISA les anticorps dirigés contre les anticorps ayant servi d'agent immunogène, c'est à dire les anticorps anti-nétrine 1, 3, Gl ou 4. On mesure alors l'activité des anticorps anti-idiotypiques par un test ELISA :
Les fragments Fab des immunoglobulines anti-nétrine 1, 3, Gl ou 4, préparés par toute technique conventionnelle, notamment une digestion à la papaïne, sont immobilisés sur des plaques de microtitration (0,1-20 μg/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS (solution tampon phosphate) contenant 0,05% de Tween 20. Après rinçages, les anticorps anti- idiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique.
Les hybridomes sélectionnés par leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre des anticorps anti-nétrine 1, 3, Gl ou 4 sont alors clones, c'est-à-dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de O5I ml par puits. Le milieu est changé après 10 jours. Après 15 jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé.
On met en oeuvre alors un second ELISA : des immunoglobulines de chèvre dirigées contre les domaines Fc des IgG humaines sont incubées sur des plaques de microtitration (0,1-20 μg/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les protéines contenant les domaines extracellulaires des récepteurs des nétrines fusionnés à une séquence Fc d'IgG humaine sont immobilisés sur les plaques de microtitration (incubation à une concentration comprise entre 1 et 100 μg/ml). Les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20. Après rinçages, les anticorps anti- idiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique.
Une fois les clones identifiés, leur nature monoclonale est affirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites comme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal. Un troisième clonage est alors effectué exactement dans les mêmes conditions pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux. Les anticorps anti-idiotypiques monoclonaux sont criblés par une batterie de tests, notamment par un test ELISA sur domaines extracellulaires des récepteurs connus des nétrines (dcc, néogénine, UNC5-A, UNC5-B, UNC5-C, UNC5-D), d'inhibition de la prolifération ou de la migration des cellules HUAEC ou des tests de mesure in vivo d'une activité anti-angiogénique. Les anticorps anti-idiotypiques sont donc des mimes de domaines de nétrines. Le but est de fabriquer une "image interne" d'un domaine de nétrine et donc de pouvoir obtenir un anticorps liant 1 récepteur de nétrine sans lier tous les récepteurs. Une fois la spécificité attestée, on détermine la fonction agoniste de cet anticorps donné en mesurant son activité sur des cellules c'est à dire que l'on inhibe les fonctions des HUAEC sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les VSM et/ou on stimule les VSM sans affecter les HUAEC.
L'intérêt général de ces anticorps est de pouvoir mimer une fonction des nétrines sur une cible cellulaire sans affecter d'autres cibles. Ainsi, il serait intéressant de stimuler les fonctions des péricytes sans induire l'apoptose des cellules endothéliales ou inhiber leur migration, leur prolifération, leur différenciation dans certaines pathologies :
- la dégénérescence maculaire liée à l'âge,
- les rétinopathies diabétiques, à un stade précoce où la raréfaction des péricytes précède la néovascularisation,
- le glaucome néovasculaire (de la cornée, de la rétine...),
- la polyarthrite rhumatoïde,
- le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique,
- les angiomes, - l'athérosclérose,
- l'obésité,
- les cancers.
Inversement, il serait intéressant d'inhiber la prolifération des cellules endothéliales sans affecter les péricytes pour les pathologies ci-dessus.
Angiogenèse in vitro
Quatre queues de rat ont été dépiautées et disséquées pour récupérer les faisceaux blancs qui sont constitués en majeure partie de collagène de type I. Le collagène est extrait de ces fibres dans 50 ml d'acide acétique 0,5 M froid et agités sur une nuit. Le liquide est ensuite centrifugé à 5000g pendant 40 minutes et le surnageant est récupéré.
L'extraction est refaite une fois avec 20 ml d'acide acétique, les surnageants sont mélangés et puis dialyses contre 1 1 d'acide acétique 0,2 M. La concentration en collagène est ajustée à 3 mg/ml par pesée. La préparation des gels pour l'angiogenèse in vitro s'effectue sur de la glace pour conserver la solution de collagène sous forme liquide. Un ml de collagène (5 mg/ml) est mélangé à 0,5 ml de DMEM 10X (contenant une concentration 10X en antibiotiques et en glutamine), 0,9 ml de H2O stérile et 0,1 ml de bicarbonate de sodium IM. Une fois le pH ajusté à 7,4, il est ajouté un volume égal de matrigel (Becton Dickinson). Le gel est coulé dans des puits de culture (2 mm d'épaisseur) et incubé à 37°C pour se solidifier. Les cellules sont rajoutées après 15 minutes (100 000 cellules/cm2) sur la surface du gel. Après 2 heures, les différents facteurs solubles sont ajoutés et les cellules sont observées et photographiées après 24 heures.
Comparaison de l'activité de NET-4 et NET-4m sur la prolifération (Figure 7
A) et Ia migration (Figure 7 B) des VSM
Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 2 000 cellules VSM par puits dans du milieu DMEM additionné de 10% de SVF. Après 6 h les cellules sont transférées dans du milieu DMEM contenant 2% SVF puis stimulées ou non avec différentes concentrations de nétrine 4 (NET-4) ou nétrine 4 mutée (NET-4m). Au bout de 5 jours, les puits ont été rincés avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde, colorées au cristal violet et solubilisées par de l'acide acétique. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées. Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits ± SD.
Test de prolifération des VSM (figure 7 A)
La nétrine 4 mutée a été produite par transfection de cellules CHO pgsA 745 par le vecteur contenant la séquence de la nétrine 4 sauvage selon un protocole déjà décrit (Plouët, 1997). La protéine a été purifiée par chromatographie d'affinité pour l'héparine sépharose et éluée par un gradient discontinu de NaCl (0, 3; 1,0 et 2,0 M NaCl. NET
4M est éluée par NaCl 2M, et a un degré de pureté > 90%.
L'activité biologique de NET 4 m a été comparée à celle de la NET 4 sauvage selon le test de prolifération des cellules musculaires lisses. La Figure 7 A montre que la moitié de la stimulation maximale est obtenue avec une concentration de 120 ng/ml de nétrine 4 non mutée (NET-4) et 0.1 ng/ml de nétrine 4 mutée (NET-4m). Ceci signifie que l'activité mitogénique de la nétrine 4 mutée est 1000 fois plus active que la nétrine
4 non mutée.
Test de migration des VSM (figure 7 B)
La monocouche confluente de VSM est incubée, pendant une nuit, en présence de DMEM. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche à l'aide d'un grattoir mousse, puis les puits sont lavés 3 fois par du DMEM puis incubés en présence de concentrations variables de nétrine 4 (NET-4) ou nétrine 4 mutée (NET-4m). Après 24 heures, les puits sont lavés 3 fois et colorés au May-Grunwald-Giemsa et photographiés et les cellules comptées dans 8 champs par condition. Les résultats sont exprimés en nombre de cellules par champs.
Il apparaît que la moitié de la stimulation maximale est obtenue avec une concentration de 12 ng/ml de nétrine 4 non mutée (NET-4) et 0,004 ng/ml de nétrine 4 mutée (NET-4m). Ceci signifie que l'activité chimiotactique de la nétrine 4 mutée est 3000 fois plus active que la nétrine 4 non mutée.
Transfection de cellules cancéreuses PC3 Les cellules de cancer de la prostate sont cultivées en milieu DMEM additionnée d'antibiotiques et de 10% de sérum de veau fœtal. Le protocole de transfection a été établi comme suit :
- Jl : inoculation de cellules à basse densité (10000 cellules/cm2) dans une boîte de 10 cm de diamètre - J2 : transfection par pcDNA3-NET4 ou pcDNA-3-NET-4m
5 μg de plasmide sont mélangés avec 5 μl de lipofectine et 100 μl de DMEM (sans antibiotiques) pendant une demi-heure à température ambiante et agités doucement. Le mélange est ensuite dilué à 5 ml dans du DMEM et déposé goutte à goutte dans la boite contenant les cellules PC3. Après 6 heures d'incubation dans une étuve à 37°C, le milieu est aspiré et remplacé par 10 ml de milieu frais.
- J3 : rinçage de la boite et incubation pendant 24 heures avec du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal et les antibiotiques
- J4 : trypsinisation des cellules, incubation dans 4 boîtes de 10 cm de diamètre dans du milieu DMEM complet additionné de 500 μg/ml de généticine (Sigma) - Jl 7 : prélèvement de clones de cellules (100-400 cellules/clone) à l'aide d'une micropipette et transfert dans des puits de 2 cm2
- J24 : trypsinisation et incubation des clones cellulaires dans des boîtes de 12 puits (120000 cellules/puits)
- J27 : rinçage des puits et inoculation dans du milieu DMEM sans sérum - J30 : collecte des milieux conditionnés et analyse de la quantification de nétrine 4 dans chaque milieu
Après avoir vérifié que les clones transfectés par la nétrine 4 (NET-4) ou la nétrine 4 mutée (NET-4.m) ont un temps de doublement équivalent (26-30 heures), le contenu de nétrine 4 de chaque milieu a été mesuré comme décrit précédemment dans le paragraphe concernant le test de prolifération. 4 μl de milieu conditionné ont été ajoutés à 100 μl de milieu de culture. Les résultats sont exprimés en pourcentage de prolifération par rapport au contrôle (puits contenant 4 μl de milieu DMEM).
Il apparaît sur la Figure 8 que le milieu de cellules non transfectées ainsi que les clones 10 et 15 de NET 4 induisent une prolifération équivalente des cellules HUAEC, de l'ordre de 300% par rapport au contrôle.
En revanche le milieu conditionné des clones 1 , 5 de NET-4 m ainsi que le clone 8 de NET-4 stimulent la prolifération des cellules HUAEC de seulement 200%, ce qui correspond à environ 50% de la prolifération induite par le milieu conditionné des cellules PC3.
Donc la nétrine 4 (NET-4) ou la nétrine 4 mutée (NET-4 m) inhibent la prolifération des HUAEC sans modifier la prolifération des cellules cancéreuses PC3.
Analyse de Ia tumorigénicité des clones de PC3 transfectées Les cellules PC3 non transfectées et les cellules PC3 transfectées par NET-4 m
(clones 1 et 5) ont été injectées à des souris nude dans le flanc (1 million de cellules par injection).
La longueur (L) et la largeur (1) de chaque tumeur a été mesurée au pied à coulisse et le volume exprimé par la formule 0,52x Lx I2' II apparaît sur la Figure 9 que les clones 1 et 5 donnent naissance à des tumeurs beaucoup plus petites que les rumeurs obtenues avec des cellules PC3. La réduction est supérieure à 80 %.
Donc la nétrine 4 mutée (NET-4 m) exerce une activité antitumorale par son activité anti-angiogénique.
Effet synergique de NET 4 sur l'inhibition du VEGF.
Il est actuellement bien admis que le VEGF est un acteur majeur de l'angiogenèse pathologique et que son inhibition est une voie thérapeutique majeure. Un anticorps anti-VEGF est commercialisé sous le nom d' AVASTIN. Sachant que la nétrine 4 (NET- 4) agit par un mécanisme d'action différent du VEGF, nous avons mesuré l'effet synergique de la nétrine 4 (NET 4) avec un anticorps anti-VEGF commercialisé sous le nom d'AV ASTIN.
Des souris ont reçu une greffe de PC3 non transfectées ou de PC3 transfectées par NET-4 clone 8 présentant une réduction marginale du volume tumoral ou clone 10 ou 15 qui donnent naissance à des tumeurs de volume équivalent à celui des cellules PC3 non transfectées (non montré). Une fois que les tumeurs ont présenté un volume supérieur à 600 mm.3, les souris ont reçu une injection péritonéale d'AV ASTIN (50μg tous les 3 jours), dose correspondant aux recommandations thérapeutiques en pathologie humaine (5mg/Kg/semaine) et le volume tumoral a été mesuré comme décrit précédemment.
11 apparaît sur la Figure 10 que l' AV ASTIN n'a aucun effet sur les tumeurs PC3 non transfectées ou PC3 clone 10 ou 15 qui ne sécrètent pas d'activité NET-4 suffisante pour inhiber la progression tumorale. Après 4 jours l'accroissement du volume tumoral par rapport au volume au début du traitement est de 200, 150 et 200 % respectivement.
En revanche le volume des tumeurs clone 8, qui sécrète une activité NET-4 importante, reste stable : donc la nétrine 4 permet de restaurer une sensibilité aux traitements anti- VEGF dans des tumeurs de taille importante
Angiogenèse choroïdienne chez la souris
12 Souris C57BL/6J âgées de 9 semaines ont reçu une photocoagulation laser de la rétine selon le protocole suivant.
Les souris sont anesthésiées grâce à une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodium (Centravet) (200μl par souris d'une solution diluée à 0,6 mg/lOOμl). Après endormissement, les souris subissent une dilatation pupillaire au tropicamide 1%. Une lame de verre ronde de 12mm de diamètre fait office de lentille de contact pour magnifier le fond d'œil. Puis un impact de laser (50μm, 400 mW, 0,05s) est réalisé sur chaque rétine à environ 2 diamètres papillaires du nerf optique en nasal.
Après 7 jours, les souris subissent une anesthésie locale par instillation oculaire de tétracaïne et une antisepsie par instillation de bétadine 5%. A l'aide du microinjecteur- microcapillaire des injections intravitréenne de l μl de solution de PBS ou de nétrine 4 à différentes concentrations sont réalisées. 3 souris sont injectées avec du PBS, 3 souris sont injectées avec de la nétrine 4 (0,1 mg/ml), 2 souris sont injectées avec de la nétrine 4
(0,3 mg/ml), 2 souris sont injectées avec de la nétrine 4 (1 mg/ml), 2 souris contrôles ne subissent aucune injection.
Après 10 jours, les souris sont sacrifiées, énuclées par montage des deux yeux en OCT puis les rétines sont coupées au microtome et révélées par les anticorps anti-CD3 marquant les cellules endothéliales qui apparaissent en blanc. Sur les Figures 11 A et 11 B, il apparaît que l'injection de nétrine 4 à 0,1 et 0,3 μg n'a pas d'effet. En revanche à la dose de lμg/œil il y a une nette réduction de la vascularisation choroïdienne et de la réaction inflammatoire gliale.
En particulier sur la Figure 11 A, il apparaît à l'intérieur de la rétine une augmentation ponctiforme de la vascularisation et une efflorescence de toute la vascularisation choroïdienne en blanc.
Sur la Figure 11 B on remarque une diminution de la néovascularisation rétinienne mais surtout une réduction de l'épaisseur de la zone néovascularisée et du nombre de vaisseaux.
Angiogenèse choroïdienne chez le rat
Les rats sont anesthésiés grâce à une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodium (Centravet) (1 ml par rat d'une solution diluée à 0,6 mg/lOOμl). Après endormissement, les rats subissent une dilatation pupillaire au tropicamide 1%. Une lame de verre ronde de 12mm de diamètre fait office de lentille de contact pour magnifier le fond d'œil. Puis trois impacts de laser (50μm, 400 mW, 0,05s) sont réalisés sur chaque rétine à environ 2 diamètres papillaires du nerf optique en nasal.
Après 7 et 10 jours les rats ont reçu (4 par groupe, soit 6-8 yeux analysés par condition, donc 12-18 impacts par condition) une injection sous rétinienne (sous un volume de 5 μl) contenant :
- PBS
- NET-4 (2μg) - NET-I (2 μg) - NET-4 m et purifiée (100 pg) Après 14 jours les rats ont été anesthésiés, perfusés par une solution de dextran fluorescent (en blanc) qui permet de visualiser la perfusion des vaisseaux. Les rétines ont ensuite été montées "à plat et photographiés.
Dans les yeux traités par le véhicule seul on voit une zone centrale marquée en gris au niveau de l'impact correspondant à une prolifération endothéliale et une couronne de vaisseaux marqués en blanc. Ces vaisseaux étant visualisés par le dextran fluorescent, on peut affirmer qu'ils sont fonctionnels. Il apparaît que les injections de NET-4 et de NET-I ont un effet marginal à 2 μg/ rat. En revanche, l'injection de 100 pg de NET-4 m inhibe presque totalement la perfusion et donc la néovascularisation choroïdienne.
La quantification a été effectuée en mesurant les pixels par μ2 et réduit la perfusion de 50%.
Les résultats sur les Figures 12 A à 12 D, montrent que la nétrine 1 et la nétrine 4 exercent une réduction marginale de la néovascularisation par rapport au contrôle alors qu'une dose 2000 fois plus faible de nétrine 4 mutée exerce une réduction significativement importante : p inférieur à 0,02.
Effet de NET-4 m (MC4) et du fragment de séquence SEO ID NO : 528 sur Ia migration des VSM (MCS).
Des cellules pgsA-745 CHO ont été transfectées avec les vecteurs d'expression
PCDNA-3 contenant la séquence complète de nétrine 4 mutée (MC4) ou la séquence SEQ ID NO : 528 (MC5). Après 16 h les cellules sont incubées avec du milieu DMEM et les milieux conditionnés collectés après 48 h. L'activité de migration sur les cellules
VSM est mesurée comme décrit précédemment (voir Figure 13).
Sur la Figure 13, il apparaît que MC4 et MC5 ont la même activité spécifique (équivalent à 2μg/ml de nétrine 4 de référence). Donc la délétion de 340 acides aminés située en position C terminale n'affecte pas la fonction de la nétrine 4 mutée.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
* la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou
* un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique et / ou une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 260 acides aminés et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528, * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique et / ou une activité d'activation des péricytes, ou
* toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique et / ou une activité d'activation des péricytes.
2. Protéine, selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
* la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou
* un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 260 acides aminés et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528, * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou * toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique.
3. Protéine, selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes :
* la séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ou
* un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, sous réserve que ce fragment présente une activité d'activation des péricytes, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 260 acides aminés et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence SEQ ID NO : 528,
* toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'activation des péricytes , ou * toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO : 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'activation des péricytes.
4. Séquence nucléotidique codant pour une protéine selon la revendication 1, 2 ou 3.
5. Séquence nucléotidique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 521 codant pour SEQ ID NO : 522, ou la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 523 codant pour SEQ ID NO : 524, - un fragment de l'une de ces séquences nucléotidiques, et notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q-l, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 525 ou par la séquence SEQ ID NO : 527,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou la séquence SEQ ID NO : 528,
- ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou pour la séquence SEQ ID NO : 526 ou pour la séquence SEQ
ID NO : 528, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2q-l codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2q, ou avec la séquence SEQ ID NO : 525 codant pou la séquence
SEQ ID NO :526 ou avec la séquence SEQ ID NO : 527 codant pou la séquence SEQ ID NO :528, telle que définie ci-dessus,
- ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, — ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
6. Vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 4 ou 5, ledit vecteur recombinant étant notamment caractérisé en ce qu'il contient les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, insérés dans ledit vecteur.
7. Cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les viras, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini dans la revendication 6.
8. Anticorps, caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie dans la revendication 1, 2 ou 3.
9. Anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie dans la revendication 1, 2 ou 3.
10. Fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tels que définis dans la revendication 9.
11. Composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active :
- une protéine telle que définie dans la revendication 1, 2 ou 3, ou
- une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 4 ou 5, ou
- un anticorps tel que défini dans la revendication 8, ou - un anticorps anti-idiotypique tel que défini dans la revendication 9, ou
- un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tel que défini dans la revendication 10.
12. Utilisation : - d'une protéine telle que définie dans la revendication 1 , 2 ou 3, ou
- d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 4 ou 5, ou
- d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini dans la revendication 9, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la néovascularisation choroïdienne compliquant la myopie, la néovascularisation de la cornée en particulier le rejet de greffe, les glaucomes, les rétinopathies diabétiques ou du prématuré, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
13. Utilisation :
- d'un anticorps tel que défini dans la revendication 8, ou
- un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tel que défini dans la revendication 10, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant la stimulation de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : pathologies ischémiques telles que Partérite des membres inférieurs, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, la sclérodermie ou la maladie de Raynaud.
14. Utilisation :
- d'une protéine telle que définie dans la revendication 1, 2 ou 3, ou
- d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 4 ou 5, ou
- d'un anticorps tel que défini dans la revendication 8, ou - d'un anticorps anti-idiotypique tel que défini dans la revendication 9, ou
- d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques tel que défini dans la revendication 10, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que les pathologies non tumorales liées à, ou causées par, une raréfaction des péricytes ou des cellules musculaires lisses, et nécessitant une activation de la prolifération ou de la migration des péricytes ou des cellules musculaires lisses, sont choisies parmi :
- la dégénérescence maculaire liée à l'âge,la néovascularisation choroidienne compliquant la myopie,
- les rétinopathies diabétiques ou du prématuré,
- le glaucome néovasculaire, - les néovascularisation cornéenne en particulier le rejet de greffe
- la polyarthrite rhumatoïde,
- le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique,
- les angiomes,
' 5 — l'athérosclérose,
- l'obésité,
- les malformations intestinales,
- la maladie de Crohn,
- les démences vasculaires, sous-corticales vasculaires la maladie 10 d'Alzheimer,
- les pathologies dégénératives osseuses et les fractures, et
- les anévrysmes et les dissections vasculaires.
16. Utilisation :
15 - de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID
NO : 524, ou
- d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248 , ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou par la séquence 20 SEQ ID NO : 528, en association avec un agent de chimiothérapie, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
17. Protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des 25 séquences suivantes :
- une séquence SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, ou
- toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou
30 - toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 284 et 487 de SEQ ID NO : 502, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique, sous réserve que ladite protéine soit différente de la séquence SEQ ID NO : 502 ou SEQ ID NO : 504.
18. Séquence nucléotidique codant pour une protéine selon la revendication 17.
19. Séquence nucléotidique selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 2i-l, i variant de 64 à 131, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, ou
- toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, telle que définie ci-dessus, ou
- toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO : 2i-l codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2i, i variant de 64 à 131, telle que définie ci-dessus, ou — toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou
- toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées, sous réserve que ladite séquence nucléotidique soit différente de la séquence SEQ ID NO : 501 ou SEQ ID NO : 503.
20. Composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active :
- une protéine telle que définie dans la revendication 17, ou
- une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 18 ou 19, ou
- un anticorps, caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie dans la revendication 17, ou
- un anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie dans la revendication 17, ou - un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques d'une protéine telle que définie dans la revendication 17.
21. Utilisation : - d'une protéine telle que définie dans la revendication 17, ou
- d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 18 ou
19, ou
- d'un anticorps anti-idiotypique d'une protéine telle que définie dans la revendication 17, ou pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers et les leucémies, la néovascularisation choroïdienne compliquant la myopie, la néovascularisation de la cornée en particulier le rejet de greffe, les glaucomes, les rétinopathies diabétiques ou du prématuré, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
22. Utilisation : - d'un anticorps, caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie dans la revendication 17, ou
- d'un fragment Fab d'anticorps anti-idiotypiques d'une protéine telle que définie dans la revendication 17, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant la stimulation de la prolifération et/ou de la migration endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : pathologies ischémiques telles que l'artérite des membres inférieurs, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, la sclérodermie ou la maladie de Raynaud.
23. Utilisation :
- de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID
NO : 524, ou
- d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, ' notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou la séquence SEQ ID NO : 528, en association avec un agent anti-angiogénique choisi parmi : AVASTIN
(bevacizumab), MACUGEN (pegaptanib), et LUCENTIS (ranibizumab), ou tout autre agent anti-VEGF pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies tumorales ou non tumorales telles que définies dans la revendication 12.
24. Produit de combinaison comprenant: - de la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID
NO : 524, ou
- d'un fragment de la dite séquence SEQ ID NO : 522 ou SEQ ID NO : 524, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO : 2q, q variant de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO : 526 ou la séquence SEQ ID NO : 528, en association avec un agent anti-angiogénique AVASTIN (bevacizumab),
MACUGEN (pegaptanib) et LUCENTIS (ranibizumab), ou tout autre agent anti-VEGF pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement ou à la prévention des pathologies tumorales ou non tumorales telles que définies dans la revendication 12.
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