WO2006051241A2 - Procede de couplage de molecules non immunogenes, compose intermediaire, produit final obtenu et utilisations - Google Patents

Procede de couplage de molecules non immunogenes, compose intermediaire, produit final obtenu et utilisations Download PDF

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    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines

Definitions

  • the present invention relates to a method of coupling non-immunogenic small molecules to make them immunogenic.
  • the invention also covers an intermediate compound involved in this process, the process for obtaining this intermediate product, the final product obtained and its uses.
  • the molecules of interest are immunogenic, or antigenic, that is to say likely to be identified by recognition structures of the immune system such as antibody molecules or receptors. T cells, and trigger an immune response.
  • certain categories of small molecules do not have functional groups suitable for coupling to a carrier protein, such as for example a carboxyl group. This is particularly the case of molecular weight molecules of less than 1000 Daltons (Da), which have at least one aromatic ring or a heterocycle.
  • a carrier protein such as for example a carboxyl group.
  • the present invention aims at producing, by oxidation of the small molecule, an intermediate product which has the functional groups suitable for coupling to a carrier protein.
  • In vivo oxidation techniques described in a large number of publications are known. These known methods concern the oxidation of neurotransmitters which then become reactive towards certain molecules. This is the case of catecholamines and in particular of dopamine which is highly oxidizable and which in the presence of cysteine (for example by binding with an N-acetyl-cysteine), generates cysteinyl dopamine.
  • the present invention aims to obtain an immunogenic conjugate from small molecules having no functional groups associated with the coupling. More particularly, the present invention provides a reproducible and easily measurable coupling method comprising a redox mechanism step. The intermediate compound obtained is then coupled to a carrier protein.
  • small molecules small molecules of molecular weight less than 1000Da, having at least one aromatic ring or heterocycle, and at least one site for nucleophilic attack.
  • carrier proteins denote macromolecules with a molecular weight greater than 10,000 Da. 1 / COUPLING METHOD
  • the coupling process comprises two steps.
  • the first step of the coupling process consists in using an aliphatic compound (B) having at least one thiol group and at least one carboxyl group, to form an intermediate compound (CI), from A.
  • Acetyl-Cysteine (NAC) or glutathione This preliminary step takes place in a basic environment.
  • the bond between the small molecule A and the compound B is by oxidation-reduction mechanism by nucleophilic attack at highly oxidizable reactive sites of A.
  • the thiol group of the compound B binds to the most reactive site of the small molecule A.
  • the intermediate compound CI obtained can then be coupled to a carrier protein D by amidation reaction.
  • This reaction consists in replacing the hydroxyl of the carboxyl group by an amine belonging to the carrier protein D.
  • the reaction that occurs is as follows:
  • This reaction takes place in two stages.
  • chlorine chloroformate reacts with the hydrogen of the carboxyl group of intermediate compound CL to form hydrochloric acid.
  • the chloroformate and the intermediate CL can thus combine to form a reaction product (PR).
  • the reaction product PR is then capable of reacting with the carrier protein D to terminate the amidification reaction.
  • the reaction that occurs is the following
  • the carbodiimide activates the carboxyl group of the intermediate compound CL to form a first reaction product (PR1).
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) is then added to PR1 to obtain a second reaction product (PR2).
  • the second reaction product PR2 is then capable of reacting with the carrier protein D to terminate the amidification reaction.
  • the first is to react an ion derived from the acyl halide (bromine, chlorine, iron, iodine, etc.) with the hydrogen of the carboxyl group of the intermediate compound CL.
  • an ion derived from the acyl halide bromine, chlorine, iron, iodine, etc.
  • the acyl halide can associate with CL to give a reaction product (PR 1 ).
  • reaction product PR 1 that interacts with the carrier protein D to form the final conjugate.
  • amidif ication of the intermediate compound CL thus makes it possible to obtain a conjugate which has retained the structure and the biological activity of the starting molecule.
  • this method allows the production of polyclonal or monoclonal idiotype antibodies directed against non-immunogenic molecules by themselves, or ⁇ nti-idiotypes, internal images of non-immunogenic molecules by themselves.
  • the anti-idiotype antibodies produced can also be used as molecule markers to detect certain pathologies in the serum of patients. They can in particular allow the search for antibodies circulating in the serum of people or animals carrying tumors.
  • This process may also find interesting applications in the field of the environment. In fact, the development of antibodies against certain toxic molecules according to this process will make it possible to assay these molecules in various media, biological or otherwise.
  • the present invention is illustrated hereinafter by a single nonlimiting example.
  • the NAC solution is then added to the benzo (a) pyrene solution.
  • the medium After addition of ImI of phosphate buffer, the medium is adjusted to pH7 by adding hydrochloric acid and then freeze-dried.
  • the freeze-dried NAC-benzo (a) pyrene compound is solubilized in a volume greater than 3 ml of anhydrous DMSO. 50 to 70 ⁇ l of anhydrous triethylamine (TEA) are then added thereto.
  • TEA triethylamine
  • the activation After addition of 400 ⁇ l of ECF diluted to the 16th in dimethylformamide, the activation is carried out with stirring for 10 min. 4 0 C.
  • the compound is then added dropwise to 5 mg of carrier protein previously diluted in a volume greater than 3 ml of UHP water and 40 .mu.l TEA.
  • the first dialysis is carried out for one hour against pure DMSO so as to remove unbound B (a) P in excess.
  • the bath is then replaced by a DMSO / Methanol / CaCI 2 phosphate buffer mixture for a period of 24 hours.
  • the last dialysis is performed against a phosphate buffer CaCl 2 to remove salts and organic solvents. This bath is renewed twice.
  • the conjugate is obtained in suspension in an aqueous medium and can be stored at 4 ° C. in the dark for a short time. Conjugates obtained are stable over time for about two months.
  • Benzo (a) pyrene a relatively common polycyclic aromatic hydrocarbon in the environment, is a small, hydrophobic, carcinogenic molecule. Its molecular weight is 252.3Da. The production of antibodies directed against this molecule allows many applications in the field of oncology. In particular, it has been demonstrated on an animal model that the conjugate synthesized according to the invention from benzo (a) pyrene has a preventive effect on chemoinduced tumors.

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Abstract

L'objet de l'invention est un procédé de couplage d'une première molécule de poids moléculaire inférieur à 1000 Da avec une seconde molécule de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, caractérisé en ce qu'on réalise une amidification d'un composé intermédiaire obtenu à partir de la première molécule, possédant au moins un hétérocycle et au moins un groupement carboxyle, ladite amidification portant sur la seconde molécule. L'invention couvre également le composé intermédiaire intervenant dans ce procédé, le procédé d'obtention de ce composé intermédiaire, le produit final obtenu et ses utilisations.

Description

PROCEDE DE COUPLAGE DE MOLECULES NON IMMU NOGEN ES, COMPOSE INTERMEDIAIRE, PRODUIT FINAL OBTENU ET UTILISATIONS
La présente invention concerne un procédé de couplage de petites molécules non immunogènes afin de les rendre immunogènes.
L'invention couvre également un composé intermédiaire intervenant dans ce procédé, le procédé d'obtention de ce produit intermédiaire, le produit final obtenu et ses utilisations.
Le développement et la production d'anticorps dirigés contre des molécules du vivant présente de nombreuses applications notamment dans le domaine des sciences biologiques et médicales.
On sait cependant que ce procédé n'est réalisable que si les molécules d'intérêt sont immunogènes, ou antigéniques, c'est à dire susceptibles d'être identifiées par des structures de reconnaissance du système immunitaire telles que des molécules anticorps ou des récepteurs des lymphocytes T, et de déclencher une réponse immunitaire.
Or toutes les molécules ne sont pas immunogènes par elles-mêmes. C'est le cas notamment de nombreuses molécules de petite taille qui ne possèdent pas d'encombrement stérique suffisant pour induire une réponse immunitaire. Parmi ces molécules, on peut citer à titre d'exemples, les acides gras, les acides aminés, les neuromédiateurs, ou encore les vitamines.
Aussi pour induire la production d'anticorps dirigés contre ces molécules, il est possible de les associer à des macromolécules grâce à des techniques de couplages chimiques, et de synthétiser ce qu'on appelle des conjugués. Les petites molécules deviennent alors antigéniques tout en conservant leur structure et leur activité biologique propres.
On connaît différentes techniques de couplages permettant de rendre immunogéniques des petites molécules. La méthode la plus simple consiste à adsorber directement la petite molécule sur la protéine porteuse par simple contact.
Il existe un autre procédé, basé sur une réaction chimique de type Friedel et
Crafts entre la petite molécule et la protéine porteuse par l'intermédiaire d'un dérivé halogène iodé de type iodure de sodium, diodopropane ou diodopyridone. On connaît également une technique réalisée à partir d'un dérivé de la petite molécule, ce dérivé étant ensuite couplé sur la protéine porteuse par un agent chimique tel que le glutaraldéhyde.
Il existe aussi une autre méthode, plus stable que les précédentes, qui recourt à l'utilisation d'un composé chloré intermédiaire comme par exemple l'éthylchloroformate.
Bien que ces méthodes de couplage soient couramment utilisées pour de nombreuses applications, elles ne sont pas applicables à toutes les molécules.
En effet certaines catégories de petites molécules ne possèdent pas de groupements fonctionnels appropriés au couplage à une protéine porteuse, comme par exemple un groupement carboxyle. C'est le cas notamment des molécules de poids moléculaire inférieur à 1000 Daltons (Da), qui possèdent au moins un cycle aromatique ou un hétérocycle.
L'obtention d'anticorps dirigés contre de telles molécules représente un enjeu important notamment dans le domaine de l'immunologie appliquée aux sciences médicales.
Le but est donc de trouver une nouvelle méthode de couplage qui permette de greffer une petite molécule sur une protéine porteuse malgré l'absence de groupements fonctionnels appropriés. Pour pallier ce problème la présente invention vise à réaliser, par oxydation de la petite molécule, un produit intermédiaire qui possède les groupements fonctionnels appropriés au couplage sur une protéine porteuse. On connaît des techniques d'oxydation in vivo décrites dans un grand nombre de publications. Ces procédés connus concernent l'oxydation de neurotransmetteurs qui deviennent alors réactifs envers certaines molécules. C'est le cas des catécholamines et en particulier de la dopamine qui est très oxydable et qui en présence de cystéine (par exemple par liaison avec une N-acétyl-cystéine), génère la dopamine cystéinylée. Si l'on connaît bien les mécanismes d'oxydation des neurotransmetteurs pour modifier leurs propriétés, on ne connaît pas l'intérêt de ces neurotransmetteurs modifiés pour obtenir des anticorps dirigés contre eux après couplage. La présente invention vise donc l'obtention d'un conjugué immunogénique à partir de petites molécules ne possédant pas de groupements fonctionnels associés au couplage. Plus particulièrement, la présente invention propose une méthode de couplage reproductible et facilement mesurable comprenant une étape faisant appel à un mécanisme d'oxydoréduction. Le composé intermédiaire obtenu est ensuite couplé à une protéine porteuse. L'invention est maintenant décrite en détail. Dans la présente description, on désigne par « petites molécules » (A), des petites molécules de poids moléculaire inférieur à 1000Da, possédant au moins un cycle aromatique ou un hétérocycle, et au moins un site permettant une attaque nucléophile. A titre d'exemples, on peut citer comme molécules entrant dans cette catégorie l'acide folique, la thiamine, la riboflavine, la nicotinamide, les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou encore le roténone.
De même, on désigne par « protéines porteuses » (D), des macromolécules de poids moléculaire supérieur à 10 000Da. 1/ PROCEDE D>E COUPLAGE
Le procédé de couplage comprend deux étapes.
lère étape : Attaque nucléophile sur A et liaison au site le plus réactif La première étape du procédé de couplage consiste à recourir à un composé aliphatique (B) possédant au moins un groupement thiol et au moins un groupement carboxyle, pour former un composé intermédiaire (CI), à partir de A.
Parmi les composés B on peut citer à titre d'exemples la thiol cystéine, la N-
Acétyl-Cystéine (NAC) ou le glutathion. Cette étape préliminaire a lieu en milieu basique.
La liaison entre la petite molécule A et le composé B se fait par mécanisme d'oxydoréduction par attaque nucléophile au niveau de sites réactifs très oxydables de A.
Le groupement thiol du composé B se lie au site le plus réactif de la petite molécule A.
La réaction qui se produit est la suivante :
Figure imgf000005_0001
R COOH
2ème étape : Couplage du composé intermédiaire à la protéine porteuse par amidification
Le composé intermédiaire CI obtenu peut ensuite être couplé à une protéine porteuse D par réaction d'amidif ication. Cette réaction consiste à remplacer l'hydroxyle du groupement carboxyle par une aminé appartenant à la protéine porteuse D. La réaction qui se produit est la suivante :
+ HR'N - Protéine
Figure imgf000006_0002
COOH
Figure imgf000006_0001
Protéine
R1
La formation d'une liaison amide entre le groupement carboxyle du composé intermédiaire CL et l'aminé de la protéine porteuse D ne se fait pas directement et nécessite le passage par une ou plusieurs réaction(s) intermédiaire(s). Parmi les nombreux moyens permettant l'amidification de CL1 on peut citer à titre d'exemple plusieurs variantes :
1) Amidif ication de CL par intervention d'un chlorof ormiate
Cette réaction se déroule en deux temps. Dans un premier temps, le chlore du chloroformiate réagit avec l'hydrogène du groupement carboxyle du composé intermédiaire CL pour former de l'acide chlorhydrique. Le chloroformiate et le composé intermédiaire CL peuvent ainsi s'associer pour former un produit de réaction (PR).
Le produit de réaction PR est ensuite capable de réagir avec la protéine porteuse D pour terminer la réaction d'amidif ication. La réaction qui se produit est la suivante
Figure imgf000007_0001
HR'N - Protéine
Figure imgf000007_0002
R C N Protéine
R1
2) Amidif ication de CL par intervention d'une carbodiimide Cette réaction se déroule en trois temps.
Dans un premier temps, la carbodiimide active le groupement carboxyle du composé intermédiaire CL pour former un premier produit de réaction (PRl). On ajoute ensuite à PRl un N-hydroxysuccinimide (NHS) pour obtenir un second produit de réaction (PR2).
Le second produit de réaction PR2 est ensuite capable de réagir avec la protéine porteuse D pour terminer la réaction d'amidif ication.
Figure imgf000008_0001
3) Amidif icαtion de CI par intervention d'un halogénure d'acyle Cette réaction comprend deux étapes.
La première consiste à faire réagir un ion issu de l'halogénure d'acyle (le brome, le chlore, le fer, l'iode, etc.) avec l'hydrogène du groupement carboxyle du composé intermédiaire CL. Ainsi l'halogénure d'acyle peut s'associer à CL pour donner un produit de réaction (PR1).
C'est ce produit de réaction PR1 qui interagit avec la protéine porteuse D pour former le conjugué final.
Figure imgf000009_0001
HR'N - Protéine
Figure imgf000009_0002
R.
L'amidif ication du composé intermédiaire CL permet donc d'obtenir un conjugué qui a conservé la structure et l'activité biologique de la molécule de départ.
2/ APPLICATIONS Les applications d'un tel procédé peuvent être très diverses.
D'une manière générale ce procédé permet la production d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux idiotypes dirigés contre des molécules non immunogéniques par elles-mêmes, ou αnti-idiotypes, images internes de molécules non immunogéniques par elles-mêmes.
Il pourra donc être avantageusement utilisé dans le domaine de l'immunologie en recherche fondamentale et appliquée aux sciences médicales. II peut par exemple permettre l'élaboration de nouveaux vaccins. On peut citer son utilisation en particulier pour la réalisation de vaccins expérimentaux pour les animaux à titre préventif contre les tumeurs.
Les anticorps anti-idiotypes produits peuvent également être utilisés en tant que marqueurs de molécules pour détecter certaines pathologies dans le sérum de patients. Ils peuvent notamment permettre la recherche d'anticorps circulant dans le sérum de personnes ou d'animaux porteurs de tumeurs.
Ce procédé pourra également trouver des applications intéressantes dans le domaine de l'environnement. En effet, le développement d'anticorps contre certaines molécules toxiques selon ce procédé permettra de doser ces molécules dans divers milieux, biologiques ou non.
La présente invention est illustrée ci-après par un exemple unique non limitatif.
3/ EXEMPLE : SYNTHÈSE D'UN CONJUGUE BENZO(AV/RENE
On solubilise 5mg de benzo(a)pyrène dans un volume de DMSO supérieur à 0,9ml. Parallèlement, 0,8mg de N-acétyl-Cystéine (NAC) sont repris dans ImI de soude
4N.
La solution de NAC est ensuite ajoutée à la solution de benzo(a)pyrène.
Après ajout de ImI de tampon phosphate, le milieu est ajusté à pH7 par ajout d'acide chlorhydrique puis lyophilisé. Le composé NAC-benzo(a)pyrène lyophilisé est solubilisé dans un volume supérieur à 3ml de DMSO anhydre. On lui adjoint ensuite 50 à 70 μl de triéthylamine anhydre (TEA). Après ajout de 400μl d'ECF diluée au 16ème dans du diméthylf ormamide, l'activation est effectuée sous agitation pendant 10 min à 40C. Le composé est alors ajouté goutte à goutte, à 5mg de protéine porteuse préalablement diluée dans un volume supérieur à 3ml d'eau UHP et 40 μl de TEA.
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
NH
COCH, L'ensemble est ensuite dialyse contre différents bains.
La première dialyse est réalisée pendant une heure contre du DMSO pur de manière à éliminer le B(a)P en excès non fixé.
Le bain est ensuite remplacé par un mélange DMSO/Méthanol/Tampon phosphate CaCI 2 pour une durée de 24 heures.
Finalement, la dernière dialyse est réalisée contre un Tampon phosphate CaCI 2 pour éliminer les sels et les solvants organiques. Ce bain est renouvelé deux fois. En fin de dialyse, le conjugué est obtenu en suspension dans un milieu aqueux et peut être conservé à 40C à l'abri de la lumière pendant une courte période. Les conjugués obtenus sont stables au cours du temps pendant environ deux mois.
Le benzo(a)pyrène, hydrocarbure aromatique polycyclique relativement répandu dans l'environnement, est une petite molécule hydrophobe, carcinogénique. Son poids moléculaire est de 252,3Da. La production d'anticorps dirigés contre cette molécule permet de nombreuses applications dans le domaine de la cancérologie. Il a notamment été mis en évidence sur un modèle animal que le conjugué synthétisé selon l'invention à partir de benzo(a)pyrène a un effet préventif sur des tumeurs chimio-induites.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de couplage d'une première molécule de poids moléculaire inférieur à 1000 Da avec une seconde molécule de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, caractérisé en ce qu'on réalise une réaction sur la première molécule de manière à obtenir un composé intermédiaire (CI) possédant au moins un hétérocycle et au moins un groupement carboxyle, et en ce qu'on réalise une réaction d'amidification entre ce composé intermédiaire (CI) et la seconde molécule, de façon à coupler lesdites première et seconde molécules.
2. Procédé de couplage selon la revendication 1, caractérisé en ce que la seconde molécule est une protéine.
3. Procédé de couplage selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'amidif ication du composé intermédiaire (CI) se fait par intervention d'un chlorof ormiate.
4. Procédé de couplage selon la revendication 3, caractérisé en ce que la réaction d'amidification comprend les étapes suivantes :
- réaction entre le chlore du chloroformiate et l'hydrogène du groupement carboxyle du composé intermédiaire (CI),
- obtention d'un produit de réaction (PR), et
- couplage dudit produit de réaction (PR) à la seconde molécule.
5. Procédé de couplage selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'amidification du composé intermédiaire se fait par intervention d'une carbodiimide.
6. Procédé de couplage selon la revendication 5, caractérisé en ce que la réaction d'amidification comprend les étapes suivantes : - αctivαtion du groupement cαrboxyle du composé intermédiaire (CI) par une carbodiimide,
- obtention d'un premier produit de réaction (PRl),
- association d'un N-hydroxysuccinimide audit premier produit de réaction (PRl),
- obtention d'un second produit de réaction (PR2), et
- couplage dudit second produit de réaction (PR2) à la seconde molécule.
7. Procédé de couplage selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'amidif ication du composé intermédiaire se fait par intervention d'un halogénure d'acyle.
8. Procédé de couplage selon la revendication 7, caractérisé en ce que la réaction d'amidif ication comprend les étapes suivantes :
- réaction entre un ion de l'halogénure d'acyle et l'hydroxyle du groupement carboxyle du composé intermédiaire (CI),
- obtention d'un produit de réaction (PR1), et
- couplage dudit produit de réaction (PR1) à la seconde molécule.
9. Procédé d'obtention du composé intermédiaire (CI) pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on réalise une attaque nucléophile de la première molécule par un composé aliphatique possédant au moins un groupement thiol et au moins un groupement carboxyle.
10. Composé intermédiaire obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il possède au moins un hétérocycle et au moins un groupement carboxyle avec un hydroxyle.
11. Produit final obtenu par amidif ication du composé intermédiaire de la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule de poids moléculaire inférieur à 1000 Da couplé à une molécule de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da.
12. Utilisation du produit final de la revendication 11 pour la production d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux idiotypes dirigés contre des molécules de poids moléculaire inférieur à 1000 Da.
13. Utilisation du produit final de la revendication 11 pour la production d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux anti-idiotypes, images internes de molécules de poids moléculaire inférieur à 1000 Da.
14. Utilisation du produit final de la revendication 11 pour le dosage d'anticorps circulant dans le sérum de patients ou animaux porteurs de tumeurs.
15. Utilisation du produit final de la revendication 11 comme vaccin expérimental pour les animaux à titre préventif contre les tumeurs.
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