WO2006048321A1 - Multimodal veränderte zellen als darreichungsform für aktive substanzen und als diagnostische partikel - Google Patents

Multimodal veränderte zellen als darreichungsform für aktive substanzen und als diagnostische partikel Download PDF

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Definitions

  • Multimodal modified cells as a dosage form for active substances and as diagnostic particles
  • erythrocytes Red Blood Cells as Carriers for Drugs, JR DeLoach, and U. Sprandel (publisher), Bibliotheca Haematologica no. 51, S. Karger, Basel, 1985; Red Blood Cells as Carriers for Drugs, C. Ropars, M. Chassaigne and C. Nicolau (Editor), Advances in the Biosciences, Volume 67, Pergamon Press, Oxford, New York, 1987; Drug, enzymes and peptide delivery using erythrocytes as carriers, C.
  • the cells are blood cells, in particular an erythrocyte.
  • the diagnostic substance may in particular be magnetite. It has been shown that active substances in the form of nanoparticles can be introduced particularly well into cells without damaging them, in particular the cell membrane.
  • Blood from humans or animals is treated with an anticoagulant. Thereafter, the erythrocytes are separated from the remaining blood constituents by centrifugation. The plasma and other blood components are removed. The erythrocytes are washed in physiological saline. The erythrocytes are resuspended in a hypotonic and cooled solution containing the magnetite particles. This suspension is moderately agitated on a roller shaker for about 1 hour. After incubation of the erythrocytes in the magnetite solution, the suspension is centrifuged in order to separate the erythrocytes from the suspension solution. This is removed and the erythrocytes are washed in physiological solution at room temperature.
  • the amount of magnetite present in the erythrocytes can be quantified by MRI or by chemical determination of iron.
  • the magnetite-loaded erythrocytes can be returned to the bloodstream of the donor if the work was carried out under sterile conditions.
  • Blood cells e.g. Erythrocytes are gewa ⁇ rule, as described in the exemplary embodiment (1). Subsequently, the erythrocytes are resuspended in a saline solution which contains polymers labeled with fluorescent dyes. These polymers adsorb to the erythrocyte surface. Subsequently, a small amount of this suspension is introduced into the measuring channel of a suitable flow cytometer so that each individual cell is detected due to the fluorescence excited by the laser radiation. Non-erythrocyte constituents of the suspension are known as such on account of the lack of the fluorescence signal.
  • the embodiment (2) can be combined with exemplary embodiment (1).
  • Erythrocytes prepared as in embodiment (1) are placed in a, e.g. resuspending the hypotonic and cooled solution containing Suspendanz endoxan. This suspension is moderately agitated on a roller shaker for about 1 hour. After incubation of the erythrocytes in this solution, the suspension is centrifuged in order to separate the erythrocytes from the suspension solution. This is removed and the erythrocytes are washed in physiological solution at room temperature. Subsequently, the erythrocytes loaded with endoxan are placed in a blood cell culture. The monocytes and granulocytes present in this culture recognize the treated erythrocytes and phagocytose them. The amount of phagocytosed cells can be made by means of a test that allows to distinguish the living monocytes and granulocytes from the dead ones.
  • the exemplary embodiment (3) can be combined with the exemplary embodiments (1) and (2).
  • magnetite and active substances e.g. Endoxan be included in a Pre ⁇ parations course in the erythrocytes.
  • the preparation of embodiments (1) and (3) are identical except for the substance to be entrapped. Of course, this only applies to mutually compatible substances.
  • the coating of native erythrocytes with suitable polymers can be done using pure adsorption or by utilizing the electrostatic interaction of the polymers with the surface of the erythrocytes. Which process dominates depends on the type of polymers used.
  • Erythrocytes treated as in the embodiment (1) or (3) are brought into a saline solution contained in a polymer. Since the erythrocytes are sensitive to pH changes and salt concentration changes, which can lead to the destruction der ⁇ same, conditions must be complied with, which do not deviate too much from the physiological conditions. At room temperature, the erythrocytes are incubated in the suspension with moderate movement for about 30 min. They are then centrifuged and the suspension solution separated from the erythrocytes.
  • Embodiment (4) can be ⁇ with the Ausf ⁇ hrungsbeiit (2), (3) and (4) were ⁇ combined.
  • human or animal cells can be changed by the method according to the invention
  • altered cells can additionally be modified in the surface for the purpose of specific interaction with the biological environment of the target organism or for the purpose of labeling with fluorescent or optical or magnetic or enzymatic or diagnostic markers.
  • the altered cells are, in particular, blood cells, e.g. Erythrocytes, platelets, neutrophils, eosinophils and basophils, monocytes and lymphocytes, hematopoietic stem and progenitor cells.
  • blood cells e.g. Erythrocytes, platelets, neutrophils, eosinophils and basophils, monocytes and lymphocytes, hematopoietic stem and progenitor cells.
  • altered cells may be cells of other organs of the human and animal organism or genetically transformed cells.
  • the modified cells can serve as a dosage form for the active substances and contain the active substances, for example in the form of • molecules
  • the modified cells contain as dosage form the substances in a form that were ⁇ activated by interaction with the body's own substrates.
  • the modified cells may contain radioactive substances, or magnetizable or superparamagentisable nanoparticulate substances, as a dosage form.
  • the altered cells as a dosage form containing active substances may contain these e.g. released by • passive processes such as Diffusion, permeation, osmosis
  • Triggered events such as a change in the permeability, a lysis, heating, a mechanical destruction that cause a resonance process
  • the altered cells as diagnostic particles may contain substances which are detectable by means of
  • MRI Nuclear magnetic resonance or magnetic resonance imaging
  • CT X-ray computed tomography
  • PET positron emission tomography
  • the altered cells may contain as diagnostic particles diagnosable substances such.
  • IR absorbers Magnetic and paramagnetic substances such as e.g. lodestone
  • altered cells in their surface can be modified by
  • the modified cells can be used as a dosage form for the active substances and as diagnostic cell particles
  • modified cells should be prepared as a dosage form for the active substances and as diagnostic cell particles in accordance with the applicable rules and conditions of good laboratory and manufacturing practice (GLP, GMP) in the fields of pharmacy, medicine, biotechnology and technology.
  • GLP laboratory and manufacturing practice

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Abstract

In der vorliegenden Anmeldung wird gezeigt, dass sowohl aktive Substanzen als auch diagno­stisch wirksame Substanzen simultan in biologische Zellen eingebracht werden können. Diese multimodal veränderten Zellen lassen sich mit modernen Bild gebenden Verfahren in vivo und in vitro wieder finden. Zusätzlich zu dem diagnostischen und Wirkstoffträgerprinzip kön­nen sie als zielgenaue Darreichungsform der aktiven Substanzen dienen.

Description

Multimodal veränderte Zellen als Darreichungsform für aktive Substanzen und als diagnostische Partikel
Hintergrund der Erfindung
In den letzten Jahren hat die räumliche und zeitliche Auflösung Bild gebender diagnostischer Verfahren sehr große Fortschritte gemacht. An der Spitze dieser Verfahren stehen tomografi- sehe Verfahren wie Computertomografie (CT) und Magnetresonanztomografie (MRT) sowie Positronemissionstomografie (PET). Es gelingt mit diesen Verfahren, Krankheitsherde im Organismus mit hoher Genauigkeit nachzuweisen und zu lokalisieren. Die pharmakologi¬ schen Wirkstoffe werden jedoch im Allgemeinen immer noch systemisch und nicht zielgenau dargereicht. Einer der Gründe dafür besteht daran, dass die diagnostischen Prinzipien und die Prinzipen der Darreichung der Wirkstoffe auf völlig unabhängigen Verfahren und verschie¬ denartigen Substanzen basieren. [Bildgebende Systeme für die medizinische Diagnostik, Heinz Morneburg, Wiley-VCH Verlag 1995; CT, EBT, MRT und Angiographie, Roland C. Bittner, u. a. Urban & Fischer 2003; Drug Delivery Systems (Pharmacology and Toxicology: Basic and Clinical Aspects), Vasant V. Ranade, Mannfred A. Hollinger CRC Press 2003]
Es gibt eine Fülle von Untersuchungen, aktive Substanzen in biologische Zellen, z.B. Ery¬ throzyten, einzuschließen [Red Blood Cells as Carriers for Drugs, J. R. DeLoach und U. Sprandel (Herausgeber), Bibliotheca Haematologica No. 51 , S. Karger, Basel, 1985; Red Blood Cells as Carriers for Drugs, C. Ropars, M. Chassaigne und C. Nicolau (Herausgeber), Advances in the Biosciences, Volume 67, Pergamon Press, Oxford, New York, 1987; Drug, enzyme and peptide delivery using erythrocytes as carriers, C. Gutierrez Millän et al., Journal of Controlled Release, 95/1, 2004, 27-49; DE 2656317; US 4289756; WO 92/08804]. Die Wirkstoffaufnahme kann dabei so gestaltet werden, dass ein hoher Anteil der Zellen überlebt. Damit ist die Zurückführbarkeit der Zellen in das biologische System gewährleistet. Zu den bisher eingekapselten aktiven Substanzen zählen auch solche, die man heute zu diagnosti¬ schen Zwecken verwenden könnte. Zusammenfassung der Erfindung
In der vorliegenden Anwendung konnte gezeigt werden, dass sowohl Wirkstoffe als auch dia- gnostisch wirksame Substanzen simultan in die Zellen eingebracht werden können. Überra¬ schenderweise konnten diese multimodal veränderten Zellen mit modernen Bild gebenden Verfahren wieder gefunden werden. Damit kann die der Erfindung zu Grunde liegende Idee realisiert werden, das diagnostische und das Darreichungsprinzip miteinander zu verknüpfen und dieses nachzuweisen. Zusätzlich zu dem diagnostischen und Wirkstoffträgerprinzip las- sen sich die Zellen für eine zielgenaue Darreichung der aktiven Substanzen modifizieren.
Erfindungsgemäß enthalten veränderte menschliche oder tierische Zellen
• mindestens eine aktive Substanz, die in Form von Nanopartikeln vorliegt, und
• mindestens eine diagnostische Substanz.
Insbesondere handelt es sich bei den Zellen um Blutzellen, insbesondere um einen Erythrozy¬ ten. Bei der diagnostischen Substanz kann es sich insbesondere um Magnetit handeln. Es hat sich gezeigt, dass aktive Substanzen in Form von Nanopartikeln besonders gut in Zellen ein¬ gebracht werden können, ohne diese, insbesondere die Zellmembran, zu beschädigen.
Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Veränderung von menschlichen oder tie¬ rischen Zellen mit den Schritten vorgeschlagen:
• Beladen der Zellen mit mindestens einer aktiven Substanz, die in Form von Nanopartikeln vorliegt, und • Beladen der Zellen mit mindestens einer diagnostischen Substanz.
Günstig ist, wenn das Beladen mit mindestens einer aktiven Substanz und mindestens einer diagnostischen Substanz gleichzeitig erfolgt. Ausführungsbeispiele
( 1) Beladung der Erythrozyten mit Magnetit - MRT
Blut vom Mensch oder Tier wird mit einem Antikoagulanz versetzt. Danach werden die Ery¬ throzyten von den übrigen Blutbestandteilen durch Zentrifugation getrennt. Das Plasma und die übrigen Blutbestandteile werden entfernt. Die Erythrozyten werden in physiologischer Salzlösung gewaschen. Die Erythrozyten werden in eine die Magnetitpartikel enthaltene hy- potone und gekühlte Lösung resuspendiert. Diese Suspension wird ca. 1 Stunde moderat auf einem Rollschüttler bewegt. Nach der Inkubation der Erythrozyten in der Magnetitlösung wird die Suspension zentrifugiert, um die Erythrozyten von der Suspensionslösung zu tren¬ nen. Diese wird entfernt und die Erythrozyten werden in physiologischer Lösung bei Raum¬ temperatur gewaschen. Die Menge des Magnetits, welches sich in den Erythrozyten befindet, kann mittels MRT oder über eine chemische Eisenbestimmung quantifiziert werden. Die mit Magnetit beladenen Erythrozyten können in die Blutbahn des Spenders zurückgegeben wer¬ den, wenn unter sterilen Bedingungen gearbeitet wurde.
(2) Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen (Antikörper) - Nachweis mittels Durchflusszyto- meter
Blutzellen wie z.B. Erythrozyten werden, wie im Ausfuhrungsbeispiel (1) beschrieben, gewa¬ schen. Anschließend werden die Erythrozyten in eine Salzlösung resuspendiert, die mit Fluo¬ reszenzfarbstoffen markierte Polymere enthält . Diese Polymere adsorbieren an die Erythro- zytenoberfläche. Anschließend wird eine geringe Menge dieser Suspension in den Messkanal eines geeigneten Durchflusszytometers eingebracht, so dass jede einzelne Zelle aufgrund der durch die Laserstrahlung angeregten Fluoreszenz detektiert werden. Nichterythrozytäre Be¬ standteile der Suspension werden auf Grund des fehlenden Fluoroszenzsignals als solche er¬ kannt.
Das Ausführungsbeispiel (2) kann mit Ausfuhrungsbeispiel ( 1) kombiniert werden. (3) Beladung der Erythrozyten mit Endoxan - Nachweis mittels Phagozytose
Erythrozyten, aufbereitet wie im Ausfύhrungsbeispiel ( 1 ), werden in eine, z.B. die aktive Susbtanz Endoxan enthaltende hypotone und gekühlte Lösung resuspendiert. Diese Suspensi- on wird ca. 1 Stunde moderat auf einem Rollschüttler bewegt. Nach Inkubation der Erythro¬ zyten in dieser Lösung wird die Suspension zentrifugiert, um die Erythrozyten von der Sus¬ pensionslösung zu trennen. Diese wird entfernt und die Erythrozyten werden in physiologi¬ scher Lösung bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend werden die mit Endoxan bela- denen Erythrozyten in eine Blutzellkultur gegeben. Die in dieser Kultur befindlichen Mono- zyten und Granulozyten erkennen die behandelten Erythrozyten und phagozytieren diese. Die Menge der phagozytierten Zellen kann mit Hilfe eines Tests erfolgen, der es gestattet, die lebenden Monozyten und Granulozyten von den abgestorbenen zu unterscheiden. Das Ausführungsbeispiel (3) kann mit den Ausführungsbeispielen (1) und (2) kombiniert wer¬ den.
Insbesondere können simultan Magnetit und aktive Substanzen, z.B. Endoxan, in einem Prä¬ parationsverlauf in die Erythrozyten eingeschlossen werden. Die Präparation der Ausfüh¬ rungsbeispiele (1) und (3) sind bis auf die einzuschließende Substanz identisch. Das gilt selbstverständlich nur für miteinander verträgliche Substanzen.
(4) Beschichtung von Erythrozyten mit Polymeren
Die Beschichtung nativer Erythrozyten mit geeigneten Polymeren kann unter Nutzung reiner Adsorption oder unter Nutzung der elektrostatischen Wechselwirkung der Polymere mit der Oberfläche der Erythrozyten erfolgen. Welcher Prozess dominiert, hängt von der Art der ver¬ wendeten Polymere ab. Erythrozyten, behandelt wie im Ausführungsbeispiel (1) oder (3), werden in eine Polymere enthaltene Salzlösung gebracht. Da die Erythrozyten empfindlich auf pH - Änderungen und Salzkonzentrationsänderungen reagieren, was zur Zerstörung der¬ selben führen kann, sind Bedingungen einzuhalten, die von den physiologischen Bedingungen nicht zu stark abweichen. Bei Raumtemperatur werden die Erythrozyten in der Suspension unter moderater Bewegung ca. 30 min inkubiert. Anschließend werden sie zentrifugiert und die Suspensionslösung von den Erythrozyten getrennt. Vorsichtiges mehrmaliges Waschen der Erythrozyten in geeigneten Salzlösungen entfernt nicht gebundene Polymere. Diesem Schritt können weitere Beschichtungsschritte nach der gleichen Vorgehensweise folgen. Den Erfolg der Beschichtung kann dadurch festgestellt werden, dass z.B. das veränderte Zetapo- tential der Erythrozyten bestimmt wird.
Ausführungsbeispiel (4) kann mit den Ausfύhrungsbeispielen (2), (3) und (4) kombiniert wer¬ den.
Grundsätzlich können durch das erfindungsgemäße Verfahren menschliche oder tierische Zelle verändert werden durch
• Beladung mit mindestens einer aktiven Substanz und
• Beladung mit mindestens einer diagnostischen Substanz.
Ein nach der Veränderung gerichtete Zurückführung der veränderten Zellen in den menschli- chen oder tierischen Körper als zelluläre Darreichungsform für die aktive Substanz und als diagnostisches Zellpartikel ist möglich.
Weiterhin können die veränderten Zellen zusätzlich in der Oberfläche modifiziert werden zum Zwecke der spezifischen Wechselwirkung mit dem biologischen Milieu des Zielorga- nismus oder zum Zwecke der Markierung mit fluoreszenten oder optischen oder magneti¬ schen oder enzymatischen oder diagnostischen Markern.
Bei den veränderten Zellen handelt es sich insbesondere um Blutzellen, wie z.B. Erythrozy¬ ten, Thrombozyten, neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen.
Außerdem kann es sich bei den veränderten Zellen um Zellen anderer Organe des menschli¬ chen und tierischen Organismus oder um genetisch transformierte Zellen handeln.
Die veränderten Zellen können als Darreichungsform für die aktiven Substanzen dienen und enthalten die aktiven Substanzen z.B. in Form von • Molekülen
• Nanopartikeln
• Koloidale Nanopartikeln
• Mizellen • Molekülkomplexen und -aggregaten
• Emulsionen
• Liposomen und Vesikeln
• Layer-by-Layer-Partikeln
• Zellbestandteilen
Außerdem ist es möglich, dass die veränderten Zellen als Darreichungsform die Substanzen in einer Form enthalten, die durch Wechselwirkung mit körpereigenen Substraten aktiviert wer¬ den.
Ebenso ist es möglich, dass die veränderten Zellen als Darreichungsform radioaktive Substan¬ zen, magnetisierbare oder superparamagentisierbare nanopartikuläre Substanzen enthalten.
Die veränderten Zellen als Darreichungsform, welche aktive Substanzen enthalten, können diese z.B. freisetzten durch • passive Vorgänge wie z.B. Diffusion, Permeation, Osmose
• getriggerte Vorgänge, wie z.B. eine Veränderung der Permeabilität, eine Lysis, Erwärmung, eine mechanische Zerstörung, die einen Resonanzvorgang bewir¬ ken
• Einwirkung von Ultraschall, Laserlicht, magnetischen Feldern, magnetischen Feldpulsen, elektrischen Feldern, elektrischen Feldpulsen
• Wechselwirkung mit anderen Zellen wie z.B. Phagozytose oder Endozytose, Aktivierungsmechanismen
Die veränderten Zellen als diagnostische Partikel können Substanzen enthalten, die nach- weisbar sind mittels
• Kernspinresonanz bzw. Kernspintomografie (MRT) • Röntgenstrahlen bzw. Röntgencomputertomografie (CT)
• Positronemissionstomografie (PET)
• Fluoreszenzmesstechniken
• Lasertechniken • Ultraschalltechniken
• Infrarottechniken
• Weiterer bildgebender Verfahren
Dabei können die veränderten Zellen als diagnostische Partikel diagnostizierbare Substanzen enthalten wie z.B.
• dreiwertige Kationen
• mehrwertige Ionen
• Luminiszenz bzw.Fluoreszenz- und Phosphoreszenzfarbstoffe
• IR-Absorber • Magnetische und paramagnetische Substanzen wie z.B. Magnetit
• Polariserbare Substanzen
• Röntgenkontrastmittel
• Ultraschallkontrastmittel
Zusätzlich können die veränderten Zellen in ihrer Oberfläche modifiziert werden durch
• PEGylierung
• Kovalente Anbindung von Peptiden, Oligonukleotiden, Oligosaccharide und hybride Formen derselben
• Adsoφtion von Mono- und Multischichten, wie Polyelektrolytmultischichten • Antikörper und Antigene
• Inkorporation von Zellmembranbestandteilen und Zellvesikeln
• Veränderung der Lipidmatrix
• Änderung ihrer mechanischen Eigenschaften
• Adsoφtion von ionischen und molekularen Substanzen • Immobilisierung von Enzymen • Einbau von Rezeptoren
• Subtanzen, die eine Veränderung der Permeabilitäts- und Stoffaustauscheigen¬ schaften bewirken
Die veränderten Zellen können als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als dia¬ gnostische Zellpartikel verwendet werden
• in isolierten Organen und Organsystemen
• in Zellkulturenin Bioreaktoren oder
• für in vitro Untersuchungen.
Weiterhin sollten die veränderten Zellen als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostische Zellpartikel gemäß der jeweils geltenden Regeln und Auflagen der guten Labor- und Herstellungspraxis (GLP, GMP) in den Gebieten der Pharmazie, Medizin, Bio¬ technologie und Technik hergestellt werden.

Claims

Ansprüche
1. Menschliche oder tierische Zeilen enthaltend
• mindestens eine aktive Substanz, die in Form von Nanopartikeln vorliegt, und • mindestens eine diagnostische Substanz.
2. Menschliche oder tierische Zellen nach Anspruch 1 , wobei es sich bei der diagnostischen Substanz um magnetisierbare oder superparamagentisierbare nanopartikuläre Substanzen han¬ delt.
3. Menschliche oder tierische Zellen nach Anspruch I oder 2, wobei es sich bei der diagnosti¬ schen Substanz um Magnetit handelt.
4. Menschliche oder tierische Zellen nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei den menschlichen oder tierischen Zellen um Blutzellen, wie z.B. Erythrozyten, Thrombozy¬ ten, neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen, handelt.
5. Menschliche oder tierische Zellen nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zellen oberflächenmodifiziert sind.
6. Menschliche oder tierische Zellen nach Anspruch 5, wobei die Oberfläche der Zellen mit Polymeren beschichtet ist.
7. Menschliche oder tierische Zellen nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Oberfläche der Zel¬ len mit Polyelektrolytschichten beschichtet ist.
8. Verfahren zur Veränderung von menschlichem oder tierischem Zellen mit den Schritten:
• Beladen der Zellen mit mindestens einer aktiven Substanz, die in Form von Nanopartikeln vorliegt, und
• Beladen der Zellen mit mindestens einer diagnostischen Substanz.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zellen das Beladen mit der mindestens einen akti¬ ven Substanz und der mindestens einen diagnostischen Substanz gleichzeitig erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Oberfläche der Zellen mit Polymeren be¬ schichtet wird.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Oberfläche der Zelle mit PoIy- elektrolytschichten beschichtet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 1 1 , wobei es sich bei der diagnostischen Sub¬ stanz um magnetisierbare oder superparamagentisierbare nanopartikuläre Substanzen handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei es sich bei der diagnostischen Sub- stanz um Magnetit handelt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei es sich bei den menschlichen oder tierischen Zellen um Blutzellen, wie z.B. Erythrozyten, Thrombozyten, neutrophile, eosi¬ nophile und basophile Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen, handelt.
15. Verwendung der veränderte Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bzw. der nach einem der Ansprüche 8 bis 14 hergestellten Zellen als Darreichungsform für die aktive Substanz und als diagnostische Zellpartikel • in isolierten Organen und Organsystemen
• in Zellkulturen
• in Bioreaktoren oder
• für in vitro Untersuchungen.
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