WO2006041159A1 - プロモーター領域を付加したプライマー - Google Patents

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WO2006041159A1
WO2006041159A1 PCT/JP2005/018960 JP2005018960W WO2006041159A1 WO 2006041159 A1 WO2006041159 A1 WO 2006041159A1 JP 2005018960 W JP2005018960 W JP 2005018960W WO 2006041159 A1 WO2006041159 A1 WO 2006041159A1
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ivt
arna
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Koichi Hiratsuka
Yoshimitsu Abiko
Michiko Kishikawa
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Nihon University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a primer to which a promoter region is added. More specifically, the present invention relates to a random primer added with a promoter region and a primer containing a base sequence complementary to a specific gene added with a promoter region. The present invention also relates to a method of using these primers for RNA amplification, biological gene expression analysis and Z or identification analysis.
  • RNA that can obtain tissue / cell force is used as a sample.
  • RNA that can obtain tissue / cell force.
  • the total RNA of pathogenic microorganisms obtained from patient-derived samples is extremely small, it is not quantitatively sufficient for analysis using microarrays or Northern blotting that require total RNA in the order of ⁇ g. It was.
  • RNA after culturing and growing the collected microorganism, but depending on the culture conditions at that time and the growth time of the cell during RNA extraction, the pathogenic gene From the analysis results obtained, it is not possible to grasp the pathogenicity of pathogenic microorganisms in vivo. Therefore, in order to analyze the pathogenicity of pathogenic microorganisms, it is desired to establish a method for efficiently linearly amplifying a trace amount of pathogenic microorganism RNA that can be collected clinically.
  • RNA amplification in eukaryotes is generally performed by the IVT method (In Vitro Transcription method). Since eukaryotes have a polyA structure at the end of the mRNA that is the target of gene expression analysis, a primer with a T7 promoter sequence attached to a repeating structure of thymine (T) bases is attached to this structure, and the IVT method is used. By doing so, a large amount of mRNA can be amplified from a very small amount of sample.
  • IVT method In Vitro Transcription method
  • RNA cannot be amplified in the same manner as in the eukaryotes.
  • Prokaryotic gene amplification uses a prokaryotic RNA as a saddle type and detects RNA information by amplification using random primers or primers containing a base sequence complementary to the gene to be amplified. It is common.
  • a method has also been developed in which poly-A polymerase is added to a prokaryotic RNA fragment and a polyA structure is added to bind the repeating structure of thymine (T) base as a primer to perform RT-PCR. (For example, refer to Patent Document 1).
  • Patent Document 1 JP 2004-180561 A
  • An object of the present invention is to provide a primer capable of stably amplifying RNA and a method for amplifying RNA using the primer. Then, it is an object to provide a method for using these primers for RNA amplification, gene expression analysis and Z or identification analysis of organisms. Means for solving the problem
  • T 7 Random primers with a promoter region such as T3 or SP6, and primers containing a base sequence complementary to a specific gene with these promoter motor regions added, and using these primers As a result, the present invention was completed.
  • the random primer added with the promoter region of the present invention amplifies RNA by binding the random primer region to the RNA in the form of a RNA and binding RNA polymerase to the promoter motor region after double-stranded DNA synthesis. Is possible.
  • a primer region containing a complementary base sequence binds to a specific prokaryotic gene, resulting in double-stranded DNA synthesis.
  • Prokaryotic RNA can be amplified by binding RNA polymerase to the promoter region.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • a primer characterized by adding a promoter region to a random primer
  • a primer characterized by having a promoter region attached to a primer comprising a base sequence complementary to a specific gene.
  • Method for amplifying RNA The method according to (5) or (6), which is an IVT method.
  • the antisense aRNA (amplified RNA) obtained by the 1-cycle IVT method is further subjected to the IVT method using any of the primers described in (1) to (4) above, so that the sense aRNA is obtained.
  • the primer attached with the promoter region of the present invention can amplify DNA or RNA using a very small amount of total RNA as a sample. Furthermore, it is a highly versatile primer that can amplify the mRNA of the target gene. DNA or RNA amplified by the primer of the present invention can be analyzed by microarray, Northern blot, or the like. Therefore, by amplifying RNA using the primer of the present invention, the pathogenicity of the pathogenic microorganism at the time of sampling can be analyzed.
  • the "primer added with a promoter region" of the present invention means that RNA polymerase can bind to a random primer or a primer containing a base sequence complementary to a specific gene in order to amplify a truncated RNA.
  • a primer with a promoter sequence added is a primer capable of amplifying the RNA to be amplified or a specific gene thereof, a misaligned one may be used, for example, by a synthesis company such as Proligo Japan. Use the synthesized primer.
  • the primer of the present invention can be synthesized according to the phosphoramidide method. This person In this method, synthesis proceeds from the 3 'end to the 5' end, so a random primer region or a primer region containing a base sequence complementary to a specific gene is created, and then a promoter region is created.
  • the primer of the present invention is synthesized. These synthesized primers can be purified by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like.
  • primers attached with the promoter region of the present invention the following are examples of random primers having a random primer region consisting of 9 bases and a T7 promoter region added to the terminal side. 3,
  • the "promoter region” of the present invention refers to a region comprising a promoter base sequence to which RNA polymerase can bind in the amplification of RNA.
  • the promoter include ⁇ 7 promoter, ⁇ 3 promoter, SP6 promoter and the like. Any of these promoter motors should be a promoter to which RNA polymerase can bind. The most stable amplification can be obtained.
  • the "random primer” of the present invention refers to a primer comprising a base sequence randomly arranged in four basic strengths: adenine ( ⁇ ), thymine ( ⁇ ), glycine (G), and cytosine (C). Any primer can be used as long as it can bind to the RNA to be amplified.
  • the random primer of the present invention can be prepared by a synthesizer or the like, and “a method of sequentially performing a coupling end force using a mixed amidite of A, T, G, and C” or “simultaneously A, T, It can be prepared by either the method of flowing G and C to the reaction phase or the method of flowing sequentially.
  • primer comprising a base sequence complementary to a specific gene means that a specific gene is expressed! /, Complementary to the base sequence of mRNA or a specific gene. Any primer can be used as long as it is a primer to be obtained.
  • the “specific gene” refers to a specific gene to be amplified for use in gene expression analysis and / or identification analysis of an organism. Specifically, it can be used for gene expression analysis and Z or identification analysis of target organisms, such as specific pathogenic genes of pathogenic microorganisms, 16S rRNA for identifying pathogenic microorganisms, etc. In these analyses, if the base sequence of the gene is very strong, a misaligned one can be used. It does not include primers with a thymine (T) base repeat structure and a T7 promoter sequence that can comprehensively amplify eukaryotic mRNA.
  • T thymine
  • a primer containing a base sequence complementary to a specific gene of the present invention can be prepared with a synthesizer or the like, and a necessary base sequence can be selected from the base sequence of the gene to be amplified.
  • a synthesizer or the like By “A, T, G, C sequentially flowing to the reaction phase”, a single base sequence can be prepared.
  • the setting of the “base sequence complementary to a specific gene” in the primer of the present invention selects a region that is specific to the gene to be amplified and has no homology with other genes. Can be set. Whether the selected region is specific to the gene can be comprehensively determined using gene sequence search software, BLAST search, or the like.
  • the primer of design leave the horse chestnut child using the primer design site such as prim e r3.
  • the “amplification” of the present invention refers to amplifying a truncated RNA by SMART method or IVT method, etc. using RNA as a truncated form and using a primer to which the promoter region of the present invention is added.
  • Book The amplification of the invention is as follows: 1. After obtaining cDNA by RT reaction using RNA as a template, 2. Obtaining double-stranded cDNA by an existing method, 3.
  • SMART primer and the present invention Amplify the region sandwiched between the primers with the promoter region by PCR (SMA RT method), or amplify RNA by binding RNA polymerase to the promoter region added to the primer of the present invention (IVT method) This can be done by steps 1 to 3.
  • RNA that is easily degraded by the primer of the present invention is immediately converted to stable DNA, and therefore, there is a low possibility of RNA degradation. Therefore, even when a very small amount of RNA that is difficult to collect is used as a sample, it can be stably amplified.
  • the primer with the promoter region of the present invention attached in the step 1 above is used, and the RNA is single-stranded from the RNA by RT enzyme.
  • the RT enzyme used added a nucleotide residue (C) to the 3 'end of the cDNA, and the complementary oligo (G) sequence was added to the 3' end at the step 2 above.
  • C nucleotide residue
  • G complementary oligo
  • the double-stranded cDNA can be used as a trapezoidal shape to exponentially amplify the region sandwiched between the primer with the promoter region added and the SMART primer.
  • Antisense aRNA amplified RNA
  • the SMART method can be performed using an existing kit, such as BD Atlas SMART Fluorescent Probe Amplification Kit (BD Bioscience), ART mRNA Amnli. Fication Kit (Clontech) or BD Atlas SMART cDNA Probe Ampli fication Kit (BD Biosciences Clontech) can be used.
  • the BD Atlas SMART cDNA Probe Amplification Kit (BD Biosciences Clontec) provides results comparable to probes made from pure mRNA, even for very small amounts of RNA material (see references 2, 3 etc.) ).
  • RNA when RNA is amplified by the IVT method using the primer of the present invention, a single-strand is obtained by RT enzyme using a primer in which the RNA of the present invention is attached in the step 1.
  • the cDNA is synthesized, and the RNA that has been converted into a ribonuclease by RNaseH in the above step 2 is decomposed.
  • double-stranded cDNA is synthesized by DNA polymerase I and T4 DNA polymerase, and the double-stranded DNA synthesized in the above step 3.
  • dNTP Mix and T7 polymerase enzyme are added to cDNA and translated in vitro to synthesize and amplify antisense aRNA.
  • the IVT method can be performed using an existing kit, such as MessageAmp aRNA Kit (Ambion), RNA Transcript Labeling Kit (Affymetrix), MEGAspript T7 Kit (Ambion) or MEG Aspript SP6 Kit (Ambion) Etc. can be used.
  • a double-stranded cDNA is synthesized by using a primer with RNA as a saddle and a promoter region of the present invention, and amplified aRNA by the IVT method. Then, in the second cycle, reverse transcription reaction was performed using the antisense aRNA amplified in the first cycle and the promoter region of the present invention was added. After degrading the RNA, a commercially available random primer was added.
  • primers used in the first and second cycles can be primers that have the same promoter region. Chains may be synthesized.
  • the purified double-stranded cDNA is purified by a purification column in the Amino Allyl Message Amp aRNA Kit (Ambion), in addition to the conventionally known phenol's Kuroguchi form method. Or a purification column such as QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen).
  • RNAs Since the amplification of these RNAs is generally not affected by the concentration of each template (template) in the mixed sample or the sequence of the template in transcription, refer to References 5, 6 etc. ) All RNAs can be amplified almost linearly without depending on the individual mRNA base sequences in the mixed sample.
  • RNA + mRNA can be amplified. Therefore, amplification of this RNA depends on the purpose. For example, when rRNA is not required for gene expression analysis of organisms, the RNA strength of the sample is also removed after removal of rRNA using a research kit (MICROB Express Bacterial mRNA Purification Kit: Am bion). Only the mRNA can be amplified by the primer of the invention. In addition, 16S rRNA can be amplified in the identification analysis of organisms, and by combining these, gene expression analysis and identification analysis of organisms can be performed simultaneously.
  • MICROB Express Bacterial mRNA Purification Kit Am bion
  • a primer containing a base sequence complementary to the specific gene is designed and a promoter region is added to the specific gene. It is also possible to analyze the expression of.
  • the "gene expression analysis and Z or identification analysis of an organism" of the present invention refers to a random primer to which a promoter region of the present invention is added or a base sequence complementary to a specific gene to which a promoter region is added. This refers to analyzing the expression of microbial pathogenic genes or identifying the organism from 16S rRNA by using microarrays or Northern plots, etc., using RNA amplified with the included primers.
  • aRNA amplified by the IVT method, aDNA amplified by the SMART method (amplified DNA), or transcribed cDNA should be used in the present invention for gene expression analysis and Z or identification analysis of organisms. Can do.
  • RNA is more preferable for binding to a DNA probe comprising a PCR product or a synthetic oligonucleotide on a microarray because RNA is stronger than DNA.
  • aRNA amplified by two consecutive IVT methods and a sense aRNA of the same copy number as a detection sample, double-stranded DNA probes such as PCR products can be spotted. ! /, The microarray can further improve the detection sensitivity.
  • a double-stranded DNA-labeled probe of a specific gene is usually used by the PCR method, so both sense aRNA and antisense aRNA are simultaneously amplified and transferred to a membrane.
  • the present invention are shown below, but the present invention is not limited by these.
  • N6-T7primer or N9-T7primer a random primer with a promoter region attached was designed and prepared by a synthesizer (Proligo Japan).
  • N6-T7primer is shown in SEQ ID NO: 1 and N9-T7primer is shown in SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Porphyromonas gineivalis strain W83 (ATCC No. BAA-308) purchased from ATCC (American Type Culture Collection; 0.5% yeast extract, L-cysteine-HC1, hemin and menadi in BHI (Brain Heart Infion) medium Cultivated in a medium supplemented with on until the mid-log phase in an anaerobic device, collected the cells, and immediately collected the Trizol solution (invitrogen), and the cell disrupter (FastPre p , BIO101) The water layer obtained by centrifugation was purified with phenol chloroform, ethanol precipitated, and then dissolved with MilliQ (DNase-, RNase-free water; In vitrogen) was used as an RNA sample.
  • ATCC No. BAA-308 ATCC No. BAA-308
  • N6—T7primer (2. M) or N9-T7primer (2.5 M) was adjusted to 2.0: L calorie and MilliQ to a total volume of 10.0: L, and kept at 70 ° C for 5 minutes for denature. And kept at 4 ° C on ice.
  • the enzymes and reagents described in Table 1 were added to each Denature mixture obtained in 1) above using the Superscript Choice System for cDNA Synthesis (Invitrogen). After that, RT reaction was performed at 37 ° C for 1 hour. After RT reaction, the enzyme was inactivated at 70 ° C for 10 minutes, and kept at 4 ° C for 3 minutes.
  • Purify double-stranded cDNA solution (Purified cDNA solution; obtain 7 pieces) by dissolving in MilliQ (Invitrogen).
  • Antisense aRNA was obtained by the IVT method using 8.0 L of the purified double-stranded cDNA solution obtained in 4) above. This IVT method was performed by adding the enzymes and reagents listed in Table 3 to the purified double-stranded cDNA solution (MEGAspript T7 Kit: Ambion) and then incubating at 37 ° C overnight.
  • the amount of antisense aRNA amplified by the IVT method (IVT (+)) and the amount of RNA without IVT (IVT (—)) are stored in an absorptiometer (Ultrospec 3100 pro: Amersham Biosciences) Measured and calculated and shown in Table 4.
  • IVT amplification there is no significant difference in IVT amplification ratio between N6—T7 primer and N9—T7 primer. Amplification of total RNA was observed. Although no particular results were shown, those using the same amount of total RNA before amplification showed almost the same amplification efficiency after IVT.
  • the mRNA of htp35 gene encoding Porphvromonas gingivalis outer membrane protein was amplified. 2.0 g of total RNA extracted from Porphyromonas gingivalis W83 strain in mid-log phase was used as a sample. Using the Htp35 gene specific T7primer (2.5 M) described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing in which a T7 promoter region is added to a specific sequence of the to gene, the method described in Examples 2, 1) to 5) above. Amplification was performed by the IVT method.
  • the sample (IVT (+)) amplified by the IVT method was confirmed to have a lower V and cycle rise than the unamplified sample (IVT (1)).
  • IVT (-) was 2.
  • OX 10 6 copies and IVT (+) was 9.1 X 10 7 copies.
  • the amplification factor was calculated to be about 45, and it was confirmed that the prokaryotic RNA was amplified even when the T7 promoter region was added to the specific sequence of the htO35 gene.
  • RNA amplification using a random primer with a promoter region of Example 1 enables RNA amplification of microgram order useful for microarray and Northern blot analysis, etc. from bacterial RNA of ng order. investigated.
  • RNA solution was denatured at 70 ° C for 10 minutes and then kept on ice for 2 minutes o
  • the double-stranded cDNA synthesis mix (ds cDNA synthesis mix) obtained in 2.3) above was purified using a column of QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). The purified double-stranded cDNA was dissolved twice with 50 ⁇ L of MilliQ.
  • the MEGAspript T7 Kit (Ambion) was directly added to the double-stranded cDNA pellet obtained in 2.4) above, and the IVT was then added in the same manner as in Example 1 using the same procedure as in Example 1. Went the law.
  • a method of synthesizing only the sense strand from aRNA (2) a method of synthesizing the senseZantisense strand simultaneously, or (3) a method of synthesizing only the antisense strand.
  • Each strand was amplified and aRNA was synthesized.
  • Method (1) As a method of synthesizing only the sense strand from RNA, N6—T7primer described in SEQ ID NO: 1 was added to antisense aRNA obtained by 1-cycle IVT method and RT reaction was performed. Only sense aRNA was obtained by strand cDNA synthesis and IVT method. The outline of the method is shown in Fig. 1.
  • Method (2) In the method of simultaneously synthesizing the senseZantisense strand from RNA, N6—T7primer described in SEQ ID NO: 1 was added to antisense aRNA obtained by 1 cycle I VT method, and RT reaction was performed. The RNA in the form of a cocoon was decomposed and removed and purified. Subsequently, double-stranded cDNA was synthesized by adding a commercially available random primer with 6 N bonds, and senseZantisense aRNA was obtained by performing the IVT method. An overview of the method is shown in Figure 2.
  • Enzymes and reagents were added to the Denature mixture obtained in 1.1) above using the Superscript Choice System for cDNA Synthesis (Invitrogen) to the composition shown in Table 9. Thereafter, it was incubated at 25 ° C for 10 minutes. To this, 1.1 was added Superscript II (Invitrogen) in the kit, and RT reaction was performed at 42 ° C for 1 hour. After RT reaction, it was incubated at 70 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme and kept at 4 ° C for 3 minutes.
  • Double-stranded cDNA synthesis (ds cDNA Synthesis)
  • the enzymes and reagents listed in Table 11 were added using the Amino Allyl transferase Amp ARNA Kit (Ambion) and MEGAscript T7 Kit (Ambion). After the addition, the IVT method was performed in the same manner as in Example 1. (1) Only the sense strand was synthesized by the method of synthesizing only the sense strand, (2) the senseZantisense strand was synthesized by the method of synthesizing the senseZantisense strand simultaneously, or (3) only the antisense strand was synthesized by the method of synthesizing only the antisense strand.
  • IVT 435 sense / antisense 34, 936 ⁇ 7S52 80. 3 ⁇ 1 8. 1
  • lOng of total RNA is finally reduced to about 16 ⁇ g by the method of amplifying only the sense of method (1) or the method of amplifying only the antisense of method (3).
  • various transcriptome analyzes such as Northern plot analysis are possible with a small amount of prokaryotic RNA. It was considered.
  • a global transcriptome analysis was performed using the Affymetrix GeneChip gene expression microarray, and the correlation of each amplified RNA sample was examined.
  • GeneChip sense strand gene probes are spotted on the array, so the sample to be bound to the array must finally synthesize aRNA consisting only of the antisense strand, and streptavidin is added to the bound RNA sample. Since one fluorescent dye is fluorescent by indirect staining, it is necessary to label the sample with piotin that binds to streptavidin. Therefore, for preparation of samples, a thiotin-labeled antisense aRNA was synthesized.
  • the IVT method with biotin labeling was performed during the second cycle of IVT, and was performed by adding Bio-11 CTP and Bio-16-UTP (Enzo) to the MEGAscript T7 Kit (Ambion) (Table 1). 13). Piotin labeling was performed by incubating at 37 ° C for 16 hours. Finally, 1.0 L of 2 UZ w L of DNase H was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes to completely degrade the truncated cDNA.
  • Each aRNA labeled with biotin in the above 1) was purified using a purification column in the Amino Allyl Message Amp aRNA Kit.
  • the aRNA was dissolved by passing 50 L of MilliQ through the column twice.
  • the purified IVT product was fragmented to bind to a short 25 mer gene probe on the GeneChip.
  • aRNA 2-4 ⁇ g
  • 10 L of 5x Fragmentation Buffer Affymetrix
  • the total volume was adjusted to 50.
  • O / z L with MilliQ By incubating this at 94 ° C for 35 minutes, the aRNA fragment was fragmented to a size of about 35 to 200 bp.
  • E. coli total RNA as a sample, only a biotin-labeled antisense aRNA probe was synthesized by 1-cycle IVT method or 2-cycle IVT method, and this was synthesized into a GeneChi ⁇ array (E. coli Genome 2.0 Array; Affymetrix), and examined the correlation between the 1-cycle amplification and the GeneChip results for 2-cycle amplified samples.
  • probes are usually synthesized by labeling biotin at the 3rd and 3rd ends of each fragment after synthesizing cDNA from total RNA using random primers.
  • the IVT method with biotin labeling was performed by adding Bio-11-CTP and Bio-16-UTP (Enzo) to MEGAscript T7 Kit (Ambion) (Table 13) for 16 hours at 37 ° C. Then, 1.0 L of 2UZ L of DNase H was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes to decompose the vertical cDNA. By purifying this, 21 ⁇ L of purified piotin-labeled antisense aRNA solution was obtained.
  • the purified IVT product was fragmented from an aRNA sample in order to bind to a short 25-mer gene probe on the GeneChip.
  • Each aRNA (2-4 g) was prepared by adding 10. L of 5x Fragmentation Buffer (Affymetrix) to a total volume of 50. MilliQ and incubating at 94 ° C for 5 minutes. The obtained aRNA fragment was fragmented to a size of about 35 to 200 bp.
  • Add each reagent to make a hybridization cocktail, and then hybridize the hybridization cocktail with 80.0 ⁇ L and the chip at 45 ° C for 16 hours. It was. After washing the chip, staining with streptavidin-fluorescent (Phycoerythrin; Molecular Probes) label was performed. Furthermore, after the chip was washed again, the fluorescence intensity was measured with a scanner (Affymetrix).
  • Fig. 7 shows a scatter plot of the variability between the two samples in each group using the 1-cycle IVT method and the 2-cycle IVT method. 2 cycle IVT compared to 1 cycle IVT method The method slightly increased the variation. This was presumed to be caused by two cycles of amplification from a small sample.
  • the 2-cycle IVT method amplification shows some variation compared to the 1-cycle IVT method amplification
  • the 2-cycle IVT method amplification shows a slight variation in the number of genes whose Flag information is displayed as “Present”.
  • a decrease was observed, it was found that there was a high correlation between the analysis results obtained between the 1-cycle IVT method and the 2-cycle method.
  • IVT amplification was performed using P. gineivalis. S. mutans and E. coli total RNA together with this primer, no significant difference in amplification efficiency was observed. It was suggested that a constant amplification efficiency can be expected regardless of the case.
  • RNA sample (10.0 g) prepared in Example 6 10.0 L random hexamer (75.0 ng / ⁇ L; Invitrogen) and 2.0 L Diluted poly-A control (Affymetrix) was prepared and prepared with MilliQ to a total volume of 30.0 L. This was kept at 70 ° C for 10 minutes, further kept at 25 ° C for 10 minutes, and then placed on ice. To this, add the enzymes and reagents listed in Table 17 and hold at 25 ° C for 10 minutes, at 37 ° C for 60 minutes, at 42 ° C for 60 minutes, and further at 70 ° C for 10 minutes, and then at 4 ° C. Then, 20 ⁇ L of IN NaOH was added and kept at 65 ° C. for 30 minutes. After adding IN HC1 to this, MinElute PCR Purification Purification was performed using Kit (Qiagen).
  • the product was eluted with 12 L of EB buffer included in the kit. 1 L of this was used for single-stranded cDNA concentration measurement.
  • ss cDNA labeled sample
  • the single-stranded cDNA 10 L (2-7 g) prepared in 1.1) was used as a sample. This was kept at 94 ° C for 10 minutes to denature and then kept on ice. To this, the enzymes and reagents listed in Table 18 were added and incubated at 37 ° C for 10 minutes, and then kept at 98 ° C for 10 minutes to obtain fragments.
  • each reagent was added to prepare a hybridization cocktail, and the hybridization between the hybridization 80.0 L and the chip was performed at 45 ° C for 16 hours. I did it. After washing the chip, staining with streptavidin-fluorescent (Phycoerythrin; Molecular Probes) label was performed. Further, after the chip was washed again, the fluorescence intensity was measured with a scanner (Affymetrix).
  • the gene expression pattern obtained by sample preparation according to the GeneChip manual is used to determine the gene expression in the 1-cycle IVT method or the gene expression in the 2-cycle IVT method obtained above. And the correlation between them was examined. As shown in Fig. 9, the correlation coefficient between the gene expression results in the manual method and the 1-cycle IVT method was significantly correlated with 0.75 (Parametric, two-tail, p ⁇ 0.01). The correlation coefficient between the gene expression results in the manual method and the 2-cycle IVT method is also statistically significant as 0.69 (Parametric, two-tail, p ⁇ 0.01) as shown in Fig. 10. Admitted.
  • the number of gene expression confirmed by GeneChip analysis is 2,951 genes by manual method, 3,581 genes by 1-cycle IVT method, or There were 2,191 genes by the 2-cycle IVT method ( Figure 11). Of the 2,951 genes in the marine method, 78.6% overlapped with the 1-cycle IVT method, and 60.0% overlapped with the 2-cycle IVT method. In addition, there are 2,104 genes that overlap between the 1-cycle IVT method and the 2-cycle IVT method, and this number accounts for 58.8% of the 1-cycle IVT method and 96.0% of the 2-cycle IVT method. This result shows that most of the results obtained by the 2-cycle IVT method are included in the results obtained by the 1-cycle IVT method.
  • the primer with the promoter region of the present invention can amplify RNA.
  • the primer of the present invention By using the primer of the present invention to amplify microbial RNA obtained from microbial infection patients, and analyzing the obtained mRNA information by microarray, Northern blot, etc., the pathogenicity of pathogenic microorganisms is investigated and clinical diagnosis is performed. It can be used to select a prognosis treatment.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for synthesizing only a sense strand from RNA (Example 4).
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for simultaneously synthesizing senseZantisense strands from RNA (Example 4).
  • FIG. 3 shows an outline of a method for synthesizing only an antisense strand from RNA (Example 4).
  • FIG. 4 is a diagram showing the fragment size of total RNA purified from Streptococcus mutans (Example 4).
  • FIG. 5 shows the fragment size of aRNA synthesized by the 1-cycle IVT method (Example 4).
  • FIG. 6 is a diagram showing the fragment size of aRNA synthesized by the 2-cycle IVT method (Example 4).
  • FIG. 7 is a graph showing the variation between two samples in each group subjected to the 1-cycle IVT method and the 2-cycle IVT method (Example 6).
  • FIG. 8 is a graph showing a correlation function of gene expression results in the 1-cycle IVT method and the 2-cycle IVT method (Example 6).
  • FIG. 9 is a diagram showing the correlation coefficient between gene expression results by GeneChip method and 1-cycle IVT method (Example 7).
  • FIG. 10 is a graph showing a correlation coefficient between gene expression results by GeneChip method and 2-cycle IVT method (Example 7).
  • FIG. Ll A graph showing the number of genes determined to be expressed by the GeneChip method, the 1-cycle IVT method, and the 2-cycle IVT method (Example 7).

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Abstract

　プロモーター領域を付加したプライマーの提供。プロモーター領域を付加したプライマーをＲＮＡの増幅、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析に用いる方法の提供。 　ＲＮＡに相補性の高い部分に結合するランダムプライマー又は特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーに、プロモーター領域を付加したプライマーを作製し、これを用いることでＲＮＡの増幅、生物の遺伝子発現解析及び／又は同定解析を行う。 

Description

明 細 書
プロモーター領域を付加したプライマー 技術分野
[0001] 本発明は、プロモーター領域を付加したプライマーに関する。更に詳しくは、プロモ 一ター領域を付加したランダムプライマー及びプロモーター領域を付加した特定の 遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーに関する。そして、これらのプライマー を RNAの増幅、生物遺伝子の発現解析及び Z又は同定解析に用いる方法に関す る。
背景技術
[0002] 微生物感染で発症する疾病の診断において、患者より分離された微生物の生化学 的検査や 16S rRNAの塩基配列に着目した PCR法により、病原微生物を同定する 検査方法が行なわれてきた。し力しながら近年、同一微生物であっても株の違いによ つて病原性が異なる事が明らかになっており、更に、その微生物の病原性は患者個 々のおかれている環境によって刻々と変化することもわ力つてきた。従って、これらの 検査方法では、患者力 分離された微生物のありのままの病原性の強さを的確に捕 らえることは不可能であり、試料採取時における様々な病原性遺伝子の発現を的確 に捕捉可能な検査方法の確立が必要になってきている。
[0003] その新たな検査方法の一つとして、マイクロアレイやノーザンブロット法を用いた解 祈が盛んに行われており、このような解析では試料として組織 ·細胞力 得られる RN Aが用いられる。しかし、患者由来の試料カゝら得られる病原微生物の全 RNAは極微 量であるため、 μ gオーダーの全 RNAを必要とするマイクロアレイやノーザンブロット 法等による解析には量的に不十分であった。
この問題の解決にあたり、採取された微生物を培養'増殖させた後、 RNAを抽出す る方法が考えられるが、その時の培養条件や RNA抽出の際の菌体増殖時期によつ て病原性遺伝子の RNA発現が大きく変動する可能性が高ぐそこ力 得られる解析 結果からは、生体内における病原微生物のありのままの病原性を掌握することができ ない。 従って、病原微生物のありのままの病原性を解析するためには、臨床的に採取可 能な極微量の病原微生物 RNAを効率良くリニア増幅する方法の確立が望まれてい る。
[0004] 真核生物における RNAの増幅は IVT法（In Vitro Transcription法）によって 行われるのが一般的である。真核生物は、遺伝子発現解析の対象とする mRNAの 末端に polyA構造が存在するため、この構造にチミン (T)塩基の繰り返し構造に T7 プロモーター配列をつけたプライマーを結合させて、 IVT法を行うことにより、極少量 の試料から大量の mRNAを増幅することができる。
一方、病原微生物のような原核生物においては、 polyA構造が存在しないことから 、前記真核生物と同様な RNAの増幅はできない。原核生物の遺伝子の増幅は、原 核生物の RNAを铸型として、ランダムプライマーや増幅の対象とする遺伝子に相補 的な塩基配列を含むプライマーを用いて増幅することで RNA情報を検出する方法 が一般的である。また、近年では、原核生物の RNA断片に polyAポリメラーゼを用 い、 polyA構造を付加することで、これにチミン (T)塩基の繰り返し構造をプライマー として結合させ、 RT— PCRを行う方法も開発されている（例えば、特許文献 1参照)。 しかし、この特許文献 1の方法では、分解し易い RNAの状態で polyA付加、精製等 の様々な処理を行うため RNAが分解する可能性が高ぐ効率的ではない。特に、極 微量の RNAを試料とし、その全 RNAのわずが数％にすぎな!/ヽ mRNAを増幅させる ために全 RNAに polyA付カ卩をするのは、コストパフォーマンスが悪く不向きである。 このように、 RNAを安定かつ安価で増幅できる方法の提供が望まれて 、た。
特許文献 1 :特開 2004— 180561号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、 RNAを安定して増幅することができるプライマー及びこれを用いて RN Aの増幅を行う方法の提供を課題とする。そして、これらのプライマーを RNAの増幅 、生物の遺伝子発現解析及び Z又は同定解析に用いる方法の提供を課題とする。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 5 '末端側に T 7、 T3又は SP6等のプロモーター領域を付カ卩したランダムプライマー及びこれらのプ 口モーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを 作製し、これらのプライマーを用いることにより生物の RNAを増幅できることを見出し 、本発明を完成するに至った。本発明のプロモーター領域を付加したランダムプライ マーは、铸型となる RNAにランダムプライマー領域が結合し、二本鎖 DNA合成後プ 口モーター領域に RNAポリメラーゼが結合することによって、 RNAを増幅することが できる。
また、プロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むブラ イマ一では、原核生物の特定の遺伝子に、相補的な塩基配列を含むプライマー領 域が結合し、二本鎖 DNA合成後プロモーター領域に RNAポリメラーゼが結合する ことによって、原核生物の RNAを増幅することができる。
すなわち、本発明は、次の（1)〜（7)に関する。
(1) ランダムプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマ
(2) 特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーにプロモーター領域が付 カロされたことを特徴とするプライマー。
(3) プロモーター領域が、 Τ7プロモーター、 Τ3プロモーター、 SP6プロモーターか ら選ばれる 、ずれか 1つである前記（1)又は（2)に記載のプライマー。
(4) 原核生物の RNAの増幅に用いる前記（1)〜（3)の 、ずれかに記載のプライマ
(5) 前記（1)〜 (4)のいずれかに記載のプライマーを用いて、 RNAを増幅する方 法。
(6) ng単位の RNAを増幅できる前記（5)に記載の方法。
(7) RNAを増幅する方法力 IVT法である前記（5)又は（6)に記載の方法。
(8) IVT法を 2サイクル行うことを特徴とする前記（7)に記載の方法。
(9) 1サイクル IVT法によって得られた antisense aRNA (amplified RNA)に前 記（1)〜（4)の 、ずれかに記載のプライマーを用いてさらに IVT法を行うことにより、 s ense aRNAを増幅する前記（8)に記載の方法。 (10) 1サイクル IVT法によって得られた antisense aRNAに前記（1)〜（4)のい ずれかに記載のプライマーを用いて RT反応を行った後、さらに前記（1)〜 (4)のい ずれかに記載のプライマーを用いて IVT法を行うことにより、 sense aRNA及び anti sense aRNAを増幅する前記（8)に記載の方法。
(11) 1サイクル IVT法によって得られた antisense aRNAにランダムプライマーを 用いて RT反応を行った後、さらに前記（1)〜 (4)のいずれかに記載のプライマーを 用いて IVT法を行うことにより、 antisense aRNAを増幅する前記（8)に記載の方法
(12) 前記（1)〜（4)のいずれかに記載のプライマーを用いて SMART法により DN Aを増幅する方法。
(13) 前記（1)〜 (4)のいずれかに記載のプライマーを用いて増幅した aRNA及び Z又は aDNAを用いて、生物の遺伝子発現解析及び Z又は同定解析を行う方法。 発明の効果
[0008] 本発明のプロモーター領域を付カ卩したプライマーは、極微量の全 RNAを試料とし て DNA又は RNAを増幅することができる。さらに、標的となる遺伝子の mRNAを増 幅させることができる汎用性のある高いプライマーである。本発明のプライマーにより 増幅された DNA又は RNAは、マイクロアレイやノーザンブロット等により解析するこ とができる。従って、本発明のプライマーを用いた RNAの増幅により、試料採取時の 病原微生物のありのままの病原性を解析することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明の「プロモーター領域を付加したプライマー」とは、铸型 RNAを増幅するた めに、ランダムプライマー又は特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー に、 RNAポリメラーゼが結合し得るプロモーターの塩基配列を付加したプライマーの ことをいう。本発明のプロモーター領域を付加したプライマーは、増幅の対象とする R NA又はその特定の遺伝子を増幅できるプライマーであれば、 、ずれのものを用い てもよぐ例えばプロリゴジャパン社等の合成業者によって合成したプライマーを用い ることちでさる。
本発明のプライマーの合成は、ホスホアミダイド法に従って行うことができる。この方 法では 3'末端カゝら 5'末端側に合成が進むため、ランダムプライマー領域又は特定 の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー領域が作製された後、引き続きプロ モーター領域が作製されて、本発明のプライマーが合成される。これらの合成された プライマーは高速液体クロマトグラフィー (HPLC)等で精製することができる。
[0010] 下記に本発明のプロモーター領域を付カ卩したプライマーのうち、 9つの塩基からな るランダムプライマー領域を有する 5，末端側に T7プロモーター領域を付加したラン ダムプライマーを例示した。 3，
Figure imgf000006_0001
T7プロモータ一領域 ランダムブライマ一領域
[0011] 本発明の「プロモーター領域」とは、 RNAの増幅にあたり、 RNAポリメラーゼが結 合し得るプロモーターの塩基配列からなる領域のことを 、う。プロモーターとしては、 Τ7プロモーター、 Τ3プロモーター、 SP6プロモーターなどが挙げられる。これらのプ 口モーターは、いずれも RNAポリメラーゼが結合し得るプロモーターであればよぐ 最も安定した増幅が得られる Τ7プロモーターを用いることが特に望ま 、。
[0012] 本発明の「ランダムプライマー」とは、アデニン (Α)、チミン (Τ)、グリシン (G)、シトシ ン（C)の 4つの塩基力ランダムに並んだ塩基配列からなるプライマーのことをいい、 増幅の対象とする RNAに結合し得るプライマーであれば、いずれのものも用いること ができる。本発明のランダムプライマーは合成機等で作製することができ、「A、 T、 G 、 Cのミックスされたアミダイドを用いてカップリングを合成末端力 順次行う方法」や、 「同時に A、 T、 G、 Cを反応相に流す方法」あるいは「順次流す方法」のいずれの方 法によっても作製することができる。特に増幅の対象とする生物の全ゲノム配列が決 定されている場合においては、その全塩基配列を遺伝子解析ソフトで検索することに より、必要なランダムプライマーのみを選択することができるため、「A、 T、 G、 Cを反 応相に順次流す方法」によって、 1本 1本決められた塩基配列を作製し、最後に各プ ライマーを混合調整することで、対象とする RNAへの結合の精度がより高いプライマ 一を合成することができる。 [0013] 本発明の「特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマー」とは、特定の遺 伝子が発現して!/、る mRNAまたは特定の遺伝子の塩基配列に相補的に結合し得る プライマーであれば、いずれのものも用いることができる。また、「特定の遺伝子」とは 、生物の遺伝子発現解析及び/又は同定解析などに用いるために増幅の対象とす る特定の遺伝子のことをいう。具体的には、病原微生物の特定の病原遺伝子や、病 原微生物を同定するための 16S rRNAなどが挙げられる力 対象とする生物の遺 伝子発現解析及び Z又は同定解析などに用いることができ、これらの解析にあたり、 その塩基配列がわ力つて 、る遺伝子であれば、 、ずれのものも用いることができる。 なお、真核生物の mRNAを網羅的に増幅できるチミン (T)塩基の繰り返し構造に T7 プロモーター配列をつけたプライマーは含まない。
本発明の特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーは合成機等で作製 することができ、増幅の対象とする遺伝子の塩基配列より、必要な塩基配列を選択す ることができるため、「A、 T、 G、 Cを反応相に順次流す方法」によって、 1本 1本決め られた塩基配列を作製することができる。
[0014] 本発明のプライマーにおける「特定の遺伝子に相補的な塩基配列」の設定は、増 幅の対象とする遺伝子に特異的な領域で、他の遺伝子と相同性を持たない領域を 選出することで設定することができる。選出した領域がその遺伝子に特異的かどうか は、遺伝子配列検索ソフトや、 BLASTサーチ等を利用して、網羅的に判定すること ができる。また、プライマーの設計は primer3等のプライマー設計サイトを利用するこ とちでさる。
本発明のプライマーは铸型となる RNAに結合し得るプライマーであれば、長さは特 に問わないが、プライマーが安定して利用できる長さであることが好ましい。本発明の プライマーは、変更不可能なおよそ 30塩基の塩基配列力 なるプロモーター領域と 最低 6塩基以上力 なるランダムプライマー領域又は特定の遺伝子に相補的な塩基 配列を含むプライマー領域力 なることが好まし 、。特定の遺伝子に相補的な塩基 配列を含むプライマー領域の塩基配列は 20塩基前後が扱 、やすく好ま 、。
[0015] 本発明の「増幅」とは、 RNAを铸型として、本発明のプロモーター領域を付加した プライマーを用い、 SMART法又は IVT法などで铸型 RNAを増幅することをいう。本 発明の増幅は、 1. RNAを铸型として RT反応により cDNAを得た後に、 2.既存の方 法により 2本鎖 cDNAを得て、 3.それを铸型に、 SMARTプライマーと本発明のプロ モーター領域を付加したプライマーに挟まれた領域を PCRによって増幅する（SMA RT法)又は本発明のプライマーに付加されたプロモーター領域に、 RNAポリメラー ゼを結合させて RNAを増幅する（IVT法）という 1.〜3.のステップによって行うこと ができる。
本発明のプロモーター領域を付加したプライマーによる増幅では、直ちに本発明の プライマーによって分解され易い RNAを安定な DNAに変換することから RNAの分 解'消失の可能性が低い。従って、 RNA試料の採取が難しぐ極微量の RNAを試料 とする場合でも安定して増幅することができる。
[0016] 本発明のプライマーを用いて SMART法により铸型 RNAを増幅する場合、前記 1 .のステップで本発明のプロモーター領域を付カ卩したプライマーを用い、 RT酵素に よって RNAから 1本鎖 cDNAを合成すると同時に、使用した RT酵素によって、 cD NAの 3'末端にヌクレオチド残基 (C)が付加され、そこに前記 2.のステップで相補 的なオリゴ (G)配列を 3，末端に持つ SMARTプライマーをァニールさせて、 2本鎖 c DNAを合成し、 PCR法によって铸型 RNAを複製 '増幅させる方法であり（参考文献 1等参照）、本発明においては、このようにして得られた 2本鎖 cDNAを铸型として、 プロモーター領域を付加したプライマーと SMARTプライマーで挟まれた領域を指 数対数的に増幅することができる。ここで増幅された 2本鎖 cDNAに結合して 、るプ ライマーのプロモーター領域に RNAポリメラーゼが結合することで、転写により antis ense aRNA (amplified RNA)を得ることもできる。
参考文献 l : Chenchik, A. , Zhu, Y. Y. , Diatchenko, L. , Li, R. , Hill, J. &Siebert, P. D. (1998) Generation and use of high— quality cDNA from small amounts of total RNA by SMART PCR. In Gene CI oning and Analysis by RT— PCR (BioTechniques Books, MA) , pp . 305- 319.
[0017] SMART法は既存のキットを用いて行うことができ、 BD Atlas SMART Fluore scent Probe Amplification Kit (BD Bioscience社)、 ART mRNA Amnli fication Kit (Clontech社）又は BD Atlas SMART cDNA Probe Ampli fication Kit (BD Biosciences Clontech社）などを用いることができる。 BD At las SMART cDNA Probe Amplification Kit (BD Biosciences Clontec h社）では微量の RNA材料にお!、ても純粋な mRNAから作製したプローブに匹敵 する結果が得られている (参考文献 2, 3等参照)。
参考文献 2 : Gonzalez, P. , Zigler, J. S. Jr, Epstein, D. L. &Borras T. (1 999) Identification and isolation of differentially expressed genes f rom very small tissue samples. Biotechniques. 26 : 884— 892.
参考文献 3 :Livesey, F. J. , Furukawa, T. , Steffen, M. A. , Church, G. M. &Cepko, C. L. (2000) Microarray analysis of the transcriptional network controlled by the photoreceptor homeobox gene Crx. し urr Biol. 10 : 301— 310.
また、本発明のプライマーを用いて IVT法により RNAを増幅した場合、前記 1.の ステップにおいて RNAを铸型として本発明のプロモーター領域を付カ卩したプライマ 一を用い、 RT酵素によって 1本鎖 cDNAを合成し、前記 2.のステップで RNaseH によって铸型とした RNAを分解すると同時に、 DNA ポリメラーゼ I及び T4 DNA ポリメラーゼによって 2本鎖 cDNAを合成し、前記 3.のステップで合成した 2本鎖 c DNAに dNTP Mixと T7ポリメラーゼ酵素をカ卩えて in vitro 翻訳を行い、 antisen se aRNAを合成 '増幅する方法である。真核生物由来の微量試料においては、 IV T法によって各 mRNAに対する antisense aRNAが数百倍コピーされて合成され ることが確認されている（参考文献 4等参照)。なお、 IVT法は既存のキットを用いて 行うことができ、 MessageAmp aRNA Kit (Ambion社）、 RNA Transcript La beling Kit (Affymetrix社）、 MEGAspript T7 Kit (Ambion 社）又は MEG Aspript SP6 Kit (Ambion社）などを用いることができる。
参考文献 4 : Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas JD, Eberwine JH. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1 990 Mar; 87 (5) : 1663- 7. [0019] 更に本発明のプライマーを用いると、 IVT法を 2サイクル続けて行うことにより antise nse aRNAの増幅と、それと同コピー数の sense aRNAの増幅を同時に行うことが できる。これは 1サイクル目で RNAを铸型として本発明のプロモーター領域を付カロし たプライマーを用い、 2本鎖 cDNAを合成し、 IVT法によって antisense aRNAを増 幅する。更に続けて 2サイクル目で、 1サイクル目で増幅した antisense aRNAを铸 型として本発明のプロモーター領域を付加したプライマーを用い、逆転写反応を行 い、 RNAを分解後、市販のランダムプライマーを添加しながら 2本鎖 cDNAを合成し 、この二本鎖 cDNAを铸型として IVT法を行うことで sense aRNAおよび antisens e aRNAを同時にかつ同コピー数増幅することができる。基本的に、この方法では 使用するプライマーは 1サイクル目と 2サイクル目で同じプロモーター領域を有するプ ライマーを用いてもよぐ異なったプロモーター領域を有するプライマーを組み合わ せることで目的に応じた方向の鎖を合成してもよい。
[0020] なお、 RNAの増幅過程における、合成された二本鎖 cDNAの精製には従来知ら れているフエノール'クロ口ホルム法の他、 Amino Allyl MessageAmp aRNA Kit (Ambion社）中の精製用カラムや QIAquick PCR Purification Kit (Qiage n社)等の精製カラムを用いて行うことができる。
これらの RNAの増幅は RNA ポリメラーゼ活性が一般的には混合試料中の各铸 型 (テンプレート)の濃度や転写における铸型の塩基配列に影響されな 、ことから (参 考文献 5, 6等参照）、混合試料中の個々の mRNA塩基配列に依存せずに概ねリニ ァに全ての RNAを増幅することができる。
参考文献 5 : Baugh LR, Hill AA, Brown EL, Hunter CP. Quantitative analysis of mRNA amplification by in vitro transcription. , Nucleic
Acids Res. 2001 Marl ; 29 (5)： E29.
参考文献 6 : Pabon C, Modrusan Z, Ruvolo MV, Coleman IM, Daniel S, Yue H, Arnold LJ Jr. Optimized T7 amplification system for mi croarray analysis . , Biotechniques. 2001 Oct; 31 (4) : 874— 9.
[0021] 更に、本発明のプライマーを用いた RNAの増幅では、対象とする生物の全 RNA
(rRNA+mRNA)を増幅することができる。従って、この RNAの増幅は目的に応じ て行うことができ、例えば、生物の遺伝子発現解析にあたり、 rRNAが不要な場合に は、研究キット（MICROB Express Bacterial mRNA Purification Kit: Am bion社)等によって試料の RNA力も rRNAを除いた後に、本発明のプライマーによ つて mRNAのみを増幅することができる。また、生物の同定解析にあたり、 16S rR NAを増幅することもでき、これらを組み合わせることで、生物の遺伝子発現解析及 び同定解析を同時に行うこともできる。更に、生物の遺伝子発現解析にあたり、特定 の遺伝子の塩基配列がわかって 、る場合には、特定の遺伝子に相補的な塩基配列 を含むプライマーを設計し、プロモーター領域を付加することで特定の遺伝子の発 現を解析することもできる。
[0022] 本発明の「生物の遺伝子発現解析及び Z又は同定解析」とは、本発明のプロモー ター領域を付加したランダムプライマー又はプロモーター領域を付加した特定の遺 伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーを用いて増幅した RNAを使用し、マイク ロアレイやノーザンプロット等を行い、微生物の病原遺伝子の発現を解析したり、 16 S rRNAよりその生物を同定したりすることをいう。生物の遺伝子発現解析及び Z又 は同定解析には、本発明において、 IVT法により増幅された aRNA又は SMART法 により増幅された aDNA (amplified DNA)又は転写された cDNAは、いずれも使 用することができる。特にマイクロアレイ上の PCR産物や合成オリゴヌクレオチドから なる DNAプローブへの結合には DNAに比較し RNAの方が強いことから、 RNAを 用いることがより好ましい。また、 IVT法を 2サイクル続けて行うことにより増幅された a ntisense aRNAと、それと同コピー数の sense aRNAを検出用の試料として用い ることで、 PCR産物等 2本鎖 DNAプローブがスポットされて!/、るマイクロアレイでは更 に検出感度を向上することができる。また、ノーザンプロット解析においても、通常 PC R法により特定遺伝子の 2本鎖 DNA標識プローブを作成'使用する場合が多いこと から、 sense aRNAおよび antisense aRNAの両方を同時に増幅し、メンブレンに 転写することで、解析のターゲットとなる遺伝子の検出感度を向上することができる。 以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。 実施例 1
[0023] <プロモーター領域を付加したランダムプライマーの作製 > T7プロモーターの配列（33塩基）に 6つの塩基力 なるランダム配列（以下、 Ν6と 示す）、又は 9つの塩基力 なるランダム配列（以下、 Ν9と示す）に付加することで、 3 9mer又は 42merのプロモーター領域を付カ卩したランダムプライマー（以下、 N6—T 7primer又は N9— T7primerと示す。）を設計し、合成業者 (プロリゴジャパン社）に て作製した。 N6— T7primerを配列表配列番号 1に、 N9— T7primerを配列番号 2 にそれぞれ示した。
[0024] <プロモーター領域を付カ卩したランダムプライマーを用いる RNAの増幅 >
1.試料の調製
ATCC (American Type Culture Collection;より購入した Porphyromonas gineivalis W83株（ATCC No. BAA— 308)を用い、 BHI (Brain Heart Inf usion)培地に 0. 5% yeast extract, L― cysteine― HC1, hemin及び menadi onを添カロした培地にて嫌気装置内で mid— log phaseになるまで培養した。培養後 の菌体を集菌し、直ちに Trizol溶液（invitrogen社）をカ卩えて菌体破砕器 (FastPre p, BIO101社）にて破砕を行った。遠心で得られた水層をフエノールクロ口ホルム で精製し、エタノール沈殿させたのち MilliQ (DNase— , RNase— free water; In vitrogen社）で溶解したものを RNA試料とした。
[0025] 2. RNAの増幅
1)変性（Denature)
前記 1.で調製した試料をそれぞれ 2. O ^ g, 0. 2 g、 0. 02 g用い、実施例 1に おいて作製した配列表配列番号 1及び 2に記載の N6— T7primer (2. M)又は N9-T7primer (2. 5 M)を 2. 0 ： Lカロえ、 MilliQ で全量力 10. 0 ： Lになるよう に調製し、 70°Cに 5分間保ち変性 (Denature)した後、氷上で 4°Cに保った。
[002り」 2) RT反 、 (Reverse Transcription Reaction)
前記 1)で得られたそれぞれの変'性ミックス（Denature mixture)に、 Superscript Choice System for cDNA Synthesis (Invitrogen社）を用いて表 1の糸且成 になるように記載の酵素、試薬をそれぞれ加えた後、 37°Cに 1時間保ち RT反応を行 つた。 RT反応後、 70°Cに 10分間保ち酵素の失活を行い、 4°Cに 3分間保った。
[0027] [表 1] Densture mixturs 10.0
5 1 st ST. buffer (Invitrogen社) 4.0
0.1 M DTT (Invitrogen社） 2.0
10 mM dNTP Mixture (Invitrogen社) 2.0
Superscript II (Invitrogen社) 2.0
Total 20.0 ju L
[0028] 3)二本鎖 cDNA合成（ds cDNA Synthesis)
前記 2)で得られたそれぞれの RT反応ミックス（RT reaction mixture)に、 Supe r¾cript Choice System for cDNA synthesis (Invitrogen社)を用 ヽ 、表 2に記載の酵素、試薬をそれぞれ加えた後、 16°Cに 2時間保ち二本鎖 cDNA合成ミ ックス（ds cDNA synthesis mixture)を得た。得られた二本鎖 cDNA合成ミック ス 150. に T4 DNA ポリメラーゼ（T4 DNA polymerase : Invitrogen社 ) 2. O /z Lを加え、 16。Cに 5分間保った後、 0. 5M EDTA (Sigma社） 10. O /z Lを 加えて反応を終了した。
[0029] [表 2]
RT reaction mixture 20.0
5x 2nd St. buffrer (Invitrogen社) 30.0
10 mM dNTP (Invitrogen社) 3.0
10U/ μ L DNA ligase (Invitrogen社) 1.0
L DNA polymerase I (Invitrogen社) 4.0
2U/ a L RNase H (Invitrogen社) 1.0
MiliQ (Invitrogen社) 91.0
Total 150.0 /i L
[0030] 4) cDNAの精製（cDNA purification)
A.フエノールークロロホルム処理
前記 3)で得られた二本鎖 cDNA合成ミックス（ds cDNA synthesis mixture) 52. 0 μ Lに同量のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール混合液（phenol: chloroform： isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1 (pH7. 9) )をカ卩え、 20秒間ボルテツ タスした溶液を全量 Phase lock Gel Heavy (Eppenndorf社）チューブに入れ、 遠心分離（15, 000xg、 2分間）を行い、得られた上清を新しいチューブに移した。
B.クロ口ホルム処理
前記 A.にて得られた上清に、同量のクロ口ホルムをカ卩え、 20秒間ボルテックスした 溶液を全量 Phase lock Gel Heavy (Eppenndorf社）チューブに入れ、遠心分 離（15, 000xg、 2分間）を行った後の上清を新しいチューブに移した。
C.エタノール沈殿
前記 B.にて得られた上清に、 0. 5 Lのグリコーゲンと上清 1Z10量の 7. 5M N H Ac (pH 5. 2)を加えて混合後、—20°Cに冷却された 100%エタノールを 2. 5倍
4
量添加'混合し、—80°Cで 30分間インキュベートした。これを遠心分離（15, OOOxg
、 5分間）して上清を除き、残ったペレットを 5〜10分間自然乾燥させた後、 8.
の MilliQ (Invitrogen社）に溶力して、精製二本鎖 cDNA溶液 (Purified cDNA solution; 得 7こ。
[0031] 5) IVT法 （In VitroTranscription)
前記 4)で得られた精製二本鎖 cDN A溶液 8. 0 Lを铸型として IVT法により antis ense aRNAを得た。本 IVT法は精製二本鎖 cDNA溶液に表3に記載の酵素、試 薬（MEGAspript T7 Kit: Ambion社）をそれぞれ加えた後、 37°Cで一昼夜イン キュペートして行った。
[0032] [表 3]
Purified cDNA Mixture 8.0
75mM T7 ATP (Ambion社） 2.0
75m T7 TTP (Ambion社） 2.0
75m T7 GTP (Ambion社） 2.0
75mM T7 CTP (Ambion社） 2.0
10x T7 Reaction buffer (Ambion社） 2.0
10x T7 Enzyme Mix (Ambion社) 2.0
Total 20.0 μ L
[0033] 前記 5)で得られた antisense aRNAを Chroma Spin— 30 Columns (Clonte ch社)を用いて精製した後、更に前記 4)に記載のエタノール精製を行い得られたぺ レットを 10. O /z Lの MilliQに溶かして精製 antisense aRNAを得た。
[0034] 腿
IVT法の実施によって増幅された antisense aRNA量 (IVT ( + ) )及び IVTを行 わなかった場合の RNA量（IVT (—））を吸光度計（Ultrospec 3100 pro :アマシ ャムバイオサイエンス社）にて測定'算出し表 4に示した。 IVT増幅により N6—T7 pr imerと N9—T7 primerによる IVT増幅倍率に優位な差はなぐ約 20倍力ら 50倍の 全 RNAの増幅が認められた。なお、特に結果は示さないが、増幅前の同濃度の全 R NA量を用いたものは、 IVT後にどれもほぼ同様の増幅効率を示した。
[0035] [表 4]
IVT法による aRNA量（jU g)
Figure imgf000015_0001
()内は増幅倍率を示す。
実施例 2
[0036] <プロモーター領域を付加した特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマ 一を用いる原核生物の RNAの増幅〉
Porphvromonas gingivalis 外膜タンパク質をコードする htp35遣伝子の mRN Aの増幅を行った。 mid— log phaseにおける Porphyromonas gingivalis W83 株より抽出した total RNA2. 0 gを試料として用いた。 T7プロモーター領域を to 遺伝子の特定の配列に付加した配列表配列番号 3に記載の Htp35 gene spe cific T7primer (2. 5 M)を用い、前記実施例 2、 1)〜5)に記載の方法で IVT 法により増幅を行った。
[0037] 増幅により得られた aRNAを铸型として、配列表配列番号 4 (htp35— up)及び 5 (h tp35— down)に記載の増幅確認用リアルタイム PCRプライマーを用いてリアルタイ ム PCRを行い、得られた 遺伝子の mRNAのコピー数を測定した。対照として I VT法を行わなかった mRNAにつ!/、ても測定を行った。各グループはそれぞれ 4サ ンプルずつ実験に供した。 Porphvromonas gingivalisの ¾色体 DNAを用いて作 製した検量線を用い、各サンプル内に含有する to ^に対する mRNAコピー数を計 算し、その平均値より増幅倍率を計算した。
検量線は Porphyromonas gingivalisの染色体の大きさを某に、核酸溶液 1 ml あたりに含まれる染色体 DNAの分子量 (molecules/ml)を算出し (換算式： 1 μ g of lOOObp DNA = 1. 52pmol = 9. 1 X lOUmolecules)、これを 10倍ずつ 段階的に希釈した試料を作製して、リアルタイム実験の装置と試薬で、リアルタイム P CRを行 ヽ、既知の濃度の核酸サンプルが何サイクルで検出可能になるかを調べて 作製した。測定結果を表 5に示した。
[表 5]
Figure imgf000016_0001
[0039] 腿
mRNAコピー数が多!、程、リアルタイム PCRでは少な!/、cycle数で立ち上がつてく る。 IVT法により増幅した試料 (IVT ( + ) )は増幅しなカゝつた試料 (IVT (一））より少な V、サイクルでの立ち上がりが確認された。 遺伝子に対する mRNAコピー数を 計算したところ、 IVT (―)が 2. O X 106コピーに対して IVT ( + )が 9. 1 X 107コピー であった。これにより増幅倍率は約 45と計算され、 T7プロモーター領城を htO35遣 伝子の特定の配列に付加したプライマーにぉ 、ても原核生物の RNAが増幅される ことが確認された。
実施例 3
[0040] 実施例 1のプロモーター領域を付カ卩したランダムプライマーを用いる RNAの増幅に より、 ngオーダーの細菌 RNAより、マイクロアレイや Northern— blot解析等に有用 な μ gオーダーの RNA増幅ができることを検討した。
[0041] 1.試料の調製
ニューヨーク州立大学バッファロウ校の H. Kuramitsu教授から分与された^!^ OCOCCUS mutans GS 5株 用 ヽ、 brain heart infusion (ΒΗΙ) ί¾·地 (Difco社) にて簡易嫌気装置内で mid— log phaseになるまで培養した。培養後の菌体を集菌 し、直ちに Trizol溶液 （invitrogen社）をカ卩えて菌体破砕器（FastPrep, BIO101 社）にて破砕を行った。遠心で得られた水層をフエノールクロ口ホルムで精製し、エタ ノール沈殿させたのち MilliQをカ卩えたものを RNA試料とした。 [0042] 2. RNAの増幅
1)変性 (Denature)
前記 1.で調製した 3.
Figure imgf000017_0001
を 1. OμL· 用い、配列表配列番号 1に記載の N6— T7primer(2. 5/zM)を 2. O/zLカロえ、 Mill iQ(Invitrogen社)で総量が 10. 0 Lになるように調製し、 RNA溶液とした。調製し た RNA溶液を 70°Cに 10分間保ち変性 （Denature)した後、氷上で 2分間以上保 つた o
[0043] 2)RT反応 (Reverse Transcription Reaction)
前記 2. 1)で得られた変'性ミックス（Denature mixture)に、 Superscript Choi ce System for cDNA Synthesis (Invitrogen社）を用いて表 6に記載の組成 になるように酵素、試薬をそれぞれ加えた後、 25°Cで 10分間インキュベートした。こ れにキット中の Superscript II (Invitrogen社） 2. 0 1を加え、 42°Cで 1時間保ち RT反応を行った。 RT反応後、 70°Cに 10分間保ち酵素の失活を行い、 4°Cに 3分間 った。
[0044] [表 6]
Denature mixture 10. 0
5x 1st ST. buffer (Invitrogen社） 4. 0
0. 1 M DTT (Invitrogen社） 2. 0
10 mM d TP Mixture (Invitrogen社） 2. 0
Total 18. Ofil
[0045] 3)二本鎖 cDNA合成（ds cDNA Synthesis)
前記 2. 2)で得られたそれぞれの RT反応ミックス（RT reaction mixture)に、 S uperScnpt Choice system lor cDNA synthesis (Invitrogen社) 用いて 、表 7に記載の組成になるように酵素、試薬をそれぞれ加えた後、 16°Cに 2時間保つ た。これにさらに T4 DNA ポリメラーゼ（T4 DNA polymerase: Invitrogen社 )2. O/zLを加え、 16。Cに 5分間保った後、 0. 5M EDTA(Sigma社） 10. O/zLを 加えて反応を終了した。
[0046] [表 7] RT reaction mixture 20. 0
5x 2nd St. buffrer (Invitrogen社） 20. 0
10 mM dNTP (Invitrogen社） 2. 0
^0Uy UL DNA !igase (Invitrogen社） 1. 0
10U/ \X L DNA polymerase I (Invitrogen社) 4. 0
2\}/ il . RNase H (Invitrogen社） 1. 0
MMIiQ (Invitrogen社） 52. 0
Total 100. 0 L
[0047] 4)二本鎖 cDNAの精製 （cDNA purification)
A.カラム処理
前記 2. 3)で得られた二本鎖 cDNA合成ミックス（ds cDNA synthesis mixtur e)は、 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen社）のカラムを用いて精製した 。精製した二本鎖 cDNAは 50 μ Lの MilliQで 2回溶解した。
B.エタノール精製
前記 A.にて得られた cDNA溶液 100. に、 0. 5 Lのグリコーゲンと 10. 0μ Lの 7. 5Μ NH Acをカ卩えた後、さらに一 20°Cに冷却された 100%エタノールを 25
4
0. 0 Lを加え、 80°Cで 30分間インキュベートした。これを遠心分離（15, 000xg
、 5分間）して上清を除き、残ったペレットを 5〜10分間自然乾燥させて、精製された 二本鎖 cDNAペレットを得た。
[0048] 5)1サイクル IVT法 （In VitroTranscription)
前記 2.4)で得られた二本鎖 cDNAペレットに MEGAspript T7 Kit(Ambion 社)を用いて、表 8に記載の組成の酵素、試薬を直接加えた後、実施例 1と同様の手 法で IVT法を行った。
[0049] [表 8]
75mM T7 ATP (Ambion社） 4. 0
75mM T7 UTP (Ambion社） 4. 0
75mM T7 GTP (Ambion社） 4. 0
75mM T7 CTP (Ambion社） 4. 0
10x T7 Reaction buffer (Ambion社) 4. 0
10x T7 Enzyme Mix (Ambion社) 4. 0
MilliQ (Invitrogen社) 16. 0
Total 40. OuL [0050] 前記 2. 5)で得られた aRNAを Amino Allyl MessageAmp aRNA Kit中の 精製用カラムを用いて精製し、 50. 0 Lの MilliQで 2回溶解し、続けて前記 2. 4) に記載のエタノール精製を行って精製 antisense aRNAを得た。ここで得られた an tisense aRNAを 1サイクル IVT法によって得られた aRNAとした。
実施例 4
[0051] 実施例 3で示した 1サイクル IVT法に加え、 IVT増幅を 2サイクル行った場合の増幅 効率を調べた。また、 2サイクル IVT法において、本発明のプロモーター領域を付カロ したランダムプライマーと市販のランダムプライマーを組み合わせて用いることにより、 マイクロアレイの標識用色素である Cy3ZCy5 Dyeをカップリングさせるための ami no― allyl 標識の sense鋇、 antisense鎖及ひ sense/ antisense鎖 aRNA 合成 し、それぞれの増幅倍率を検討した。さらに 1サイクル IVT法と 2サイクル IVT法のそ れぞれで得られる aRNAのサイズレンジを調べた。
[0052] 具体的には、（1) aRNAから sense鎖のみを合成する方法、（2) senseZantisens e鎖を同時に合成する方法又は（3) antisense鎖のみを合成する方法の 3つ方法を 用いて、それぞれの鎖を増幅し、 aRNAを合成させた。
方法（1)： RNAから sense鎖のみを合成する方法として、 1サイクル IVT法で得られ た antisense aRNAに、配列表配列番号 1に記載の N6— T7primerを加えて RT 反応をした後、二本鎖 cDNA合成をし、 IVT法を実施することで sense aRNAのみ を得た。方法の概要を図 1に示した。
方法（2)： RNAから senseZantisense鎖を同時に合成する方法では、 1サイクル I VT法で得られた antisense aRNAに、配列表配列番号 1に記載の N6— T7prime rを加えて RT反応をした後、铸型となった RNAを分解'除去し、精製を行った。続い て市販の Nが 6個結合したランダムプライマーを加えて二本鎖 cDNA合成をし、 IVT 法を実施することで senseZantisense aRNAを得た。方法の概要を図 2に示した。 方法（3)： RNAから antisense鎖のみを合成する方法では、 1サイクル IVT法で得 られた antisense aRNAに、市販の Nが 6個結合したランダムプライマーをカ卩えて R T反応をした後、铸型となった RNAを分解 '除去し、精製を行った。続いて配列表配 列番号 1に記載の N6— T7primerをカ卩えて二本鎖 cDNA合成をし、 IVT法を実施 することで antisense aRNAのみを得た。方法の概要を図 3に示した。
[0053] 1. RNAの増幅
1)変性 (Denature)
前記実施例 3の 1サイクル IVT法で得られた antisense aRNA溶液 8. 0 μ L· (435 ng)に、増幅の目的とする aRNAの種類である、（1) sense aRNAのみ、（2) sens e/antisense aRNA又は（3) antisense aRNAのみに応じて配列表配列番号 1 に記載の N6—T7primer (25 μ Μ)又はランダムへキサマー（25 μ Μ)を 3. 0 μ L加 え、全量が 11. 0 1^の溶液を調製した（11= 3)。 （1)及び（2)では N6—T7primer、 (3)ではランダムへキサマー（Invitrogen社)を用いた。調製した溶液を 70°Cに 10 分間保ち変性 (Denature)した後、氷上で 4°Cに 2分間以上保った。
[0054」 2) RT反 、 (Reverse Transcription Reaction)
前記 1. 1)で得られた変'性ミックス（Denature mixture)に、 Superscript Choi ce System for cDNA Synthesis (Invitrogen社）を用いて表 9に記載の組成 になるように酵素、試薬をそれぞれ加えた後、 25°Cで 10分間インキュベートした。こ れにキット中の Superscript II (Invitrogen社）を 1. 1を加え、 42°Cで 1時間 RT 反応を行った。 RT反応後 70°Cで 10分間インキュベートし、酵素の失活を行い、 4°C に 3分間保った。続いて 2UZ μ Lの RNase Hを 1. 0 μ L加え 37°Cで 20分間、 95 °Cで 5分間、最後に 4°Cで 3分間おくことにより、 1本鎖 cDNA (ss cDNA)を得た。 得られた 1本鎖 cDNAは QIAquick PCR Purification Kitを用いて精製した。 精製した 1本鎖 cDNAは 50 μ Lの MilliQで溶解した。
[0055] [表 9]
Denature mixture 1 1 .◦
5x 1 st ST. buffer (Invitrogen社） 4. 0
0. 1 M DTT (Invitrogen社） 2. 0 1 0 m dNTP Mixture (Invitrogen社） 1 . 0
RNase—Inhibitor— (Invitrogen社) 1 . 0 _
Total 1 9. μ ϊ
[0056] 2.二本鎖 cDNA合成（ds cDNA Synthesis)
3)変'性 (Denature) 前記 1. 2)で得られた 1本鎖 cDNA溶液 47. O /z Lを用い、（1) sense鎖のみを合 成する方法では MilliQを 3. O ^ L, (2) senseZantisense鎖を同時に合成する方 法ではランダムへキサマーを 3. を、又は（3) antisense鎖のみを合成する方法 では、配列表配列番号 1に記載の N6—T7primerを 3. 0 1を加えた。これを 70°C に 10分間保ち変性 (Denature)した後、氷上で 3分間以上保った。
[0057] 4)二本鎖 cDNA合成
前記 1)で得られた変性 1本鎖 cDNA溶液を 25°Cに 10分間保つことでプライマーを 結合させ後、表 10に記載の酵素、試薬を加え総量を 100. とし、 16°Cで 2時間 インキュベートした。さらに T4 DNA ポリメラーゼ（T4 DNA polymerase : Invi trogen社）を 2. を加え、 16°Cで 5分間保った。得られた二本鎖 cDNAは QIAq uick PCR Purification Kit内のカラムを用いて精製し、 50 Lの MilliQで 2回 溶解したのち、前記 2. 4)に記載のエタノール精製を行い 14. 0 Lの MilliQで溶解 した。
[0058] [表 10]
5x 2nd ST. buffer (Inv rogen社） 20. 0
1 0 mM dNTP Mixture (Invitrogen¾) 2. 0 1 OU / / L DNA !igase (Invitrogen社） 1 . 0 1 OU / U L DNA polymerase I (Invitrogen社) 4. 0
MilliQ (Invitrogen¾) 23. 0
Total 50. 0 し
[0059] 5) IVT法（In VitroTranscription)
それぞれの方法で得られた二本鎖 cDNA溶液 14. 0 μ Lを、 Amino Allyl essa geAmp aRNA Kit (Ambion社）及び MEGAscript T7 Kit (Ambion社）を用 いて、表 11に記載の酵素、試薬を加えた後、実施例 1と同様の手法で IVT法を行つ た。（1) sense鎖のみを合成する方法では sense鎖のみが、（2) senseZantisense 鎖を同時に合成する方法では senseZantisense鎖が、又は（3) antisense鎖のみ を合成する方法では antisense鎖のみを合成した。
[0060] [表 11] 50mM aaUTP Solution (Ambion社） 3. 0
25mM ATP, CTP, GTP Mix (Ambion社） 1 2. 0
50mM UTP Solution (Ambion社） 3. 0
75mM T7 CTP (Ambion社） 4. 0
1 Ox T7 Reaction buffer (Ambion社) 4. 0
1 Ox T7 Enzyme Mix—(Ambion社） 4. 0―
Total 30. O jU L
[0061] 前記 2. 5)で得られた各種 aRNAを Amino Allyl MessageAmp aRNA Kit 中の精製カラムを用いて精製し、 50. O /z Lの MilliQ で 2回溶解したのち、前記 2. 4)に記載のエタノール精製を行った。最終的にペレットを 21. 0 μ Lの MilliQ に溶 力して aRNA溶液を得た。調製した aRNA溶液のうち 1 μ Lを RNA量測定のための 試料とし、吸光度計（Ultrospec 3100 pro：アマシャムバイオサイエンス社）にて 測定 ·算出される RNA総量の結果を表 12に示した。
[0062] [表 12]
Amount of the * Amount of pr * Amplification original RNA Method oducted aRNAs efficiency
(ng)
1サイクル 3 1 33 ± 1 1 2 44. 4± 3フ. 2
IVT 30 1 , 583 ±392 52. 8 ± 1 3. 1
2サイクル 435 sense aRNA 1 6, 71 6 ±2329 38. 4± 5. 4
IVT 435 sense/antisense 34, 936 ±7S52 80. 3 ± 1 8. 1
aRNA
435 antisense aRNA 4, 297 ±972 9. 9 ± 1 . 5
* average ± SO
[0063]
表 12で示すように、 3ng又は 30ngの total RNAから、 1サイクル IVT法で得られ た aRNA量 (n= 3)の平均増幅効率は 44. 4倍と 52. 8倍であった。また、 1サイクル I VT法で得られた aRNAを 435 ngの aRNAから 2サイクル IVT法の sense鎖のみを 合成する方法、 senseZantisense鎖を同時に合成する方法又は antisense鎖を合 成する方法で得られた aRNA量 (n = 3)の平均増幅効率は、 38. 4倍、 80. 3倍又は 9. 9倍であった。従って、原核生物の ngオーダーの微量 RNA試料を基に IVT法を 2サイクル行うことにより、マイクロアレイ等への使用に必要な /X gオーダーに増幅でき ることが確認された。
[0064] これらの結果より、 T7プロモーター配列付きのランダムプライマーの使用により、極 微量の微生物 RNA増幅が可能になることが判明した。 1サイクル目及び 2サイクル目 の増幅効率に大きな差はなく各々 40力ら 50倍であった。方法（2)の sense及び anti senseを同時に作らせる方法では予想されるように ds cDNAの両端のプロモーター が同時に働いたために 80. 3倍の増幅効率であった。
これらの増幅により最終的には約 lOngの total RNAが方法（1)の senseのみを 増幅する方法又は方法（3)の antisenseのみを増幅する方法で約 16 μ gに、方法（2 )の sense及び antisenseを同時に増幅する方法で約 35 μ gに増幅されることから、 いずれの方法においても、マイクロアレイのみでなくノーザンプロット解析等、様々な トランスクリプトーム解析が微量の原核生物 RNAで可能であると考えられた。
[0065] 実施例 3の 1サイクル IVT法及び実施例 4の 2サイクル IVT法で得られた IVT生成 物のフラグメントサイズ分布を調べるために、 Bioanalyzer (Agilent Tech.社）で 測定したところ、図 5に示すように、 1サイクル IVT法では 950bp付近のサイズを中心 におよそ lOObp力 3, OOObpの範囲に増幅産物が分布していた。また、 2サイクル I VT法によって合成された aRNAのサイズ分布は、図 6に示したようにおよそ lOObp 力 2, OOObpであり、サイズのピークは 450bp付近に存在していた。比較として、増 幅材料である Streptococcus mutansから精製した total RNAのサイズ分布を図 4に示した。
実施例 5
[0066] < IVT生成物の GeneChip遺伝子発現マイクロアレイの検討 >
Affymetrix社の GeneChip遺伝子発現マイクロアレイを用いてグローバルなトラン スクリプトーム解析を行い、各増幅 RNA試料の相関を調べた。 GeneChipは sense 鎖の遺伝子プローブがアレイ上にスポットされているため、アレイと結合させるための 試料は最終的に antisense鎖のみからなる aRNAの合成をおこなう必要があり、かつ 結合した RNA試料にストレプトアビジン一蛍光色素を間接的に染色することで蛍光 させることから、ストレプトアビジンに結合するピオチンにて試料を標識する必要があ る。従って、試料作成にはピオチン標識の antisense aRNAを合成した。
1. 1)ピオチン標識
GeneChipによる解析のために Escherichia coli (以下、 E. coliとする）から抽出 した全 RNAを基に、前記実施例 3の方法 2.に準じて 1サイクル IVT法で得られた an tisense aRNAに、市販の Nが 6個結合したランダムプライマー （ランダムへキサマ 一; Invitrogen社)をカ卩えて RT反応をした後、铸型となった RNAを分解'除去し、精 製を行った。続 、て配列表配列番号 1に記載の N6— T7primerを加えて二本鎖 cD NA合成をし、 IVT法をすることで antisense鎖のみの aRNAを合成した（n= 2)。ビ ォチン標識を伴う IVT法は 2サイクル目の IVT中に行 、、 MEGAscript T7 Kit ( Ambion社）に Bio— 11 CTPおよび Bio— 16—UTP (Enzo社）を添カ卩して行った (表 13)。 37°Cで 16時間インキュベートすることで、ピオチン標識を行った。最後に 2 UZ w Lの DNase Hを 1. 0 L加え 37°Cで 30分間インキュベートすることで、完全 に铸型 cDNAの分解を行った。
[0067] [表 13]
75mM T7 ATP (Ambion社） 2. 0
75mM T7 UTP (Ambion社） 1 . 5
75m T7 GTP (Ambion社） 2 0
75mM T7 CTP (Ambion社） 1 . 5
Bio— 1 1— CTP (Enzo社） 3. 75
Bio— 1 6— UTP (Enzo社） 3. 75
1 0x T7 Reaction buffer (Ambion社) 2. 0
1 0x T7 Enzyme Mix (Ambion社) 2. 0
MilliQ (Invitrogen社） 1 . 5
Total 20.
[0068] 1. 2) aRNAの精製（aRNA purification)
A.カラム処理
前記 1)でビォチンラベルされた各 aRNAを、 Amino Allyl MessageAmp aR NA Kit中の精製用カラムを用いて精製した。 aRNAはカラムに 50 Lの MilliQを 2回通して溶解した。
B.エタノール沈澱
前記 A.にて得られた cDNA溶液 100. に、 0. 5 Lのグリコーゲンと 50. Ο μ L (上清の 0. 5倍）の 7. 5Μ NH Ac (pH5. 2)をカ卩えて混ぜた後、更に 20°Cに
4
冷却された 100%エタノールを 250. 0 L (上清の 2. 5倍）を加えて混ぜ、 80°Cで 30分間インキュベートした。これを遠心分離 （15, 000xg、 5分間）して上清を除き、 残ったペレットを 5〜10分間自然乾燥させて、ペレットを得た。このペレットを 21. Ο μ Lの MilliQに溶かして精製 antisense aRNA溶液を得た。
調製した aRNA溶液 1 μ Lは吸光度計 (Ultrospec 3100 pro：アマシャムバイオ サイエンス社)を用いた濃度測定のための試料とした。
[0069] 3) IVT生成物の断片化処理（Fragmentation)
精製された IVT生成物は GeneChip上の 25merからなる短い遺伝子プローブに結 合させるために断片化処理を行った。それぞれの aRNA (2— 4 μ g)に 5xFragment ation Buffer (Affymetrix社）を 10. Lをカロえ、 MilliQで全量 50. O /z Lとした 。これを 94°Cに 35分間インキュベートすることで aRNA断片は 35〜200bp前後の大 きさに断片化した。
実施例 6
[0070] < 1サイクル IVT法及び 2サイクル IVT法で増幅される aRNAの相関性の検討 >
E. coliの total RNAを試料として、 1サイクル IVT法又は 2サイクル IVT法により、 ビォチン標識 antisense aRNAプローブのみを合成し、これを E. coli用 GeneChi ρアレイ（E. coli Genome 2. 0 Array ;Affymetrix社）にて解析し、 1サイクル増 幅と 2サイクル増幅試料での GeneChip結果にあたえる相関を検討した。 原核生物 における GeneChipアレイ用の Target labelingにおいては、通常、全 RNAからラ ンダムプライマーによる cDNA合成後、断片化を行ない、各断片の 3，末端にビォチ ンを標識することでプローブを合成する。しかし、この方法では全 RNA試料中に含 有される 2— 3%の mRNAと同コピー数の cDNAが逆転写反応で合成されることから 、本プロトコールに準じて研究を進めていくためには試料として 10. もの全 RN Aを必要とする。そこでこの問題を解決するにあたり、本 T7配列付加プライマーを使 用し、铸型 RNAを増幅する事で、 ngオーダーの極微量の RNAを用いて GeneChip 解析が遂行可能かを検証した。
GeneChipの解析に際して試料を最終的にピオチン標識する必要がある。そこで 原核生物に対するピオチン標識試料作製方法として 1) 1サイクル IVT法と、 2) 2サイ クル IVT法を行い、铸型 RNAを増幅した後、断片化処理を行ない、プローブを作成 した。そして、これらのプローブを用いて、 用 GeneChipアレイにおける各遺 伝子の発現レベルを調べ、 1サイクル IVT法と 2サイクル IVT法で増幅される antisen se aRNAの相関性を検証した。
[0071] 1.試料の調製
本研究室保管の E. coli JM109株を用い、 LB培地にて好気状態で mid— log p haseになるまで培養した。培養後の菌体 ^^菌し、直ちに Trizol溶液 (invitrogen 社)をカ卩えて菌体破砕器 (FastPrep, BIO 101社）にて破砕を行った。遠心で得られ た水層をフエノールクロ口ホルムで精製し、エタノール沈殿させたのち MilliQをカロえ たものを RNA試料とした。
[0072] 2. RNAの増幅
1) 1サイクル IVT法
前記 1.で調製した 500ngZ μ Lの試料 (n= 2)を 1. 0 L用い、配列表配列番号 1に記載の N6— T7primer (2. 5 M)を 2. 0 Lカロえ、 MilliQ (Invitrogen社）で 全量が 10. 0 Lになるように調製し、 RNA-プライマー混合液とした。この RNA-プ ライマー混合液を用い、前記実施例 3に記載の RT反応と同様に、 RT反応を行った。 さらに前記実施例 3に記載の二本鎖 cDNA合成と同様に、二本鎖 cDNA合成を行 い、この cDNAを精製した。ピオチン標識を伴う IVT法は MEGAscript T7 Kit (A mbion社）に Bio— 11— CTPおよび Bio— 16— UTP (Enzo社）を添カ卩して（表 13) 37°Cで 16時間インキュベートしたのち、 2UZ Lの DNase Hを 1. O /z Lカロえ 37°C で 30分間インキュベートし、铸型 cDNAの分解を行った。これを精製することで精製 されたピオチン標識 antisense aRNA溶液を 21 μ L得た。うち 1 Lを使用し、比色 値を測定することで合成された aRNA総量を算出した。
2) 2サイクル IVT法
前記 1で調製した 50ngZ μ Lの試料 (n= 2)を用い、前記実施例 3の方法（3)に準 じて 1サイクル IVT法で得られた非ピオチン標識 antisense aRNAに、市販の Nが 6 個結合したランダムプライマー（ランダムへキサマー； Invitrogen社）をカ卩えて RT反 応をした後、铸型となった RNAを分解 '除去し、精製を行った。続いて配列表配列番 号 1に記載の N6—T7primerをカ卩えて ds cDNA合成をし、 IVT法をすることで anti sense鎖のみの aRNAを合成した（n= 2)。 2サイクル目の IVT中にピオチン標識を 行った。ビォチン標識を伴う IVT法は MEGAscript T7 Kit ( Ambion社）に Bio— 11— CTPおよび Bio— 16— UTP (Enzo社）を添カ卩して（表 13) 37°Cで 16時間イン キュペートしたのち、 2UZ Lの DNase Hを 1. 0 L加え 37°Cで 30分間インキュ ペートし、铸型 cDNAの分解を行った。これを精製することで精製されたピオチン標 識 antisense aRNA溶液を 21 μ L得た。
3) IVT生成物の増幅効率の検討
1サイクル IVT法及び 2サイクル IVT法で得られたそれぞれの aRNA溶液を用い、 実施例 4に記載の方法と同様に、精製されたピオチン標識 antisense aRNA溶液 のうち、 1 Lを使用し吸光度計（Ultrospec 3100 pro：アマシャムバイオサイェン ス社）にて比色値を測定することで合成された aRNA総量を算出した。結果を表 14 に示した。
[0073] [表 14]
Amount of the * Amount of the * Average efficiency of original RNA ng) aRNA (ng) the amplifications
1サイクル IVT 500 1 4, 000 ± 4, 854 28. 0± 9. 7
2サイクル IVT 50 3 , 941 ± 1 , 61 6 78. 8 ± 32. 3
* average 士 SD
[0074] 表 14で示すように、 500ngの total RNAから、 1サイクル IVT法で得られた aRN A量（n= 2)の平均増幅効率は 28倍であった。また、 50ngの total RNAから、 2サ イタル IVT法で得られた aRNA量 (n= 2)の平均増幅効率は約 80倍であった。従 つて、原核生物の ngオーダーの微量 RNA試料を基に IVT法を 2サイクル行うことに より、マイクロアレイ等への使用に必要な; z gオーダーに増幅できることが確認された
[0075] 3) IVT生成物の断片化処理 (Fragmentation)
精製された IVT生成物は GeneChip上の 25merからなる短い遺伝子プローブに結 合させるために aRNA試料の断片化処理を行った。それぞれの aRNA (2— 4 g)に 5x Fragmentation Buffer(Affymetrix社）を 10. Lをカ卩え、 MilliQで全量 5 0. とし、これを 94°Cに 5分間インキュベートすることで行われた。得られた aRN A断片は 35〜200bp前後の大きさに断片化された。 次に表 15に従い、各試薬を加えてハイブリダィゼーシヨンカクテルを作成し、その ハイブリダィゼーシヨンカクテル 80. 0 μ Lとチップとのハイブリダィゼーシヨンを 45°C で 16時間行なった。チップを洗浄後、ストレプトアビジン一蛍光（Phycoerythrin; Molecular Probes社)標識による染色を行った。さらにチップの再洗浄を行ったの ち、スキャナー (Affymetrix社）にて蛍光強度を測定した。
[0076] [表 15]
2x Hybridization Buffer 40. 0
3nM B2 Control Oligo (Affymetrix社） 1 . 3
1 0mg/mL Herring Sperm DNA ( Promega¾) 0. 8
50mg/tnL BSA (Invitrogen社） 0. 8
1 00% D SO (Sigma社） 6. 2
Fragmentated and Labeled aRNA 25. 0
Mil!iQ 5. 9
Total 80. 0 し
[0077] 4)遺伝子の Flag情報の解析
前記 2.で調製した 1サイクル IVT法及び 2サイクル IVT法で得られたそれぞれの a RNA断片を使用して GeneChipを行なった結果を、 Affymetrix遺伝子解析ソフト にて解析し、各遺伝子の発現の有無を調べた。表 16〖こ示すよう〖こ、 Af 00fymetrix解
卜
析ソフトにおいて、遺伝子発現が認められると判定されるものは Flag情報が" Presen t"、また偽陽性と判定されるものは" Marginal"と表示される。 1サイクル IVT 法に て増幅した RNAを基に行なった場合、発現が認められる遺伝子の割合はチップ上 の総遺伝子数の約 40%であった。一方、 2サイクル IVT 法を基に行なった場合、 発現が認められる遺伝子の割合はチップ上の総遺伝子数の約 27%であった。
[0078] [表 16] hip Number Ratio (%) Average (%)
1サイクル a 3747 36. 7
IVT b 4360 42. 7
2サイクル a 2705 26. 5 27. 0
IVT b 281 1 27. 5
[0079] 図 7に 1サイクル IVT法及び 2サイクル IVT法を行なった各グループ 2試料間の ばらつきを Scatter plotで示した。 1サイクル IVT法に比較して、 2サイクル IVT 法では若干ばらつきが増大した。これは、少量の試料から 2サイクルの増幅を行なつ ていることが原因と推察された。
また、 1サイクル IVT法と 2サイクル IVT法での遺伝子発現結果の相関関数を調べ た。図 8に示したように双方の増幅法で 0. 87 (Parametric, two -tail, p< 0. 01) と高い相関が認められた。
これらの結果より、 T7プロモーター配列付きのランダムプライマーを IVT法に応用 することにより、極微量の微生物 RNA増幅をマイクロアレイ解析に必要な量まで増幅 する事が可能であることが示された。
総括すると、 2サイクル IVT法の増幅では 1サイクル IVT法の増幅と比較し、多少の ばらつきが認められ、また 2サイクル IVT法の増幅では Flag情報が" Present"と表示 される遺伝子数に若干の減少が認められるものの 1サイクル IVT法及び 2サイクル法 の両方法間で得られる解析結果には高い相関が認められることが判明した。また、 P . gineivalis. S. mutans及び E. coliの total RNAを材料として本プライマーを併 用した IVT増幅を行なったところ、どの増幅効率にも大きな差異は認められな 、こと 力 原核生物の種を問わず一定の増幅効率が期待できることが示唆された。
実施例 7
[0080] <IVT法と Gene chipマニュアルに基づく方法の相関性の検討 >
実施例 6の IVT法を用いて解析した方法と RNA試料増幅を施さな ヽ原核生物用 G eneChipマニュアルに準じて解析した方法との相関を検討した。
[0081] 1. Gene chipマニュアルによる遺伝子発現
1) RT反応および一本鎖 cDNA合成
実施例 6で調製した の total RNA試料（10. 0 g)〖こ 10. 0 Lのランダム へキサマー（75. 0 ng/ μ L； Invitrogen社）と 2. 0 Lの Diluted poly -A co ntrols (Affymetrix社）をカ卩え、 MilliQで総量 30. 0 Lとなるように調製した。これ を 70°Cに 10分間保ち、さらに 25°Cに 10分間保った後、氷上に置いた。これに表 17 に記載の酵素、試薬を加え、 25°Cに 10分間、 37°Cで 60分間、 42°Cで 60分間、さら に 70°Cで 10分間保った後に、 4°Cにおき、 20 μ Lの IN NaOHを加え、 65°Cで 30 分間保った。これに IN HC1を 加えた後、 MinElute PCR Purification Kit (Qiagen社)を用いて精製した。
生成物をキットに含まれている EB buffer 12 Lで溶出した。うち 1 Lを一本鎖 cDNA濃度測定のために用いた。解析の際にはチップ間でのシグナル標準化を施 すため、チップに反応させる標識試料（ss cDNA)の量は少なくとも 1. 5 g含まれ ていればよぐ特に揃える必要はない。本実験では ss cDNAを 4. 5 g生成された ことを確認し、次の断片化処理の過程に進んだ。
[0082] [表 17]
5x first ST. buffer (Invitrogentt) 1 2. 0
1 OOmM DTT (Invitrogen社） 6. 0
1 0mM dNTPs (Invitrogen¾t ) 3. 0
SUPERase— In (20U/mL) (Ambion社） 1 . 5
Superscript II ( 200U m L) (Invitrogenネ i) 7. 5
Total 30. O U L
[0083] 2)一本鎖 cDNAの断片化処理（Fragmentation)
前記 1. 1)で調製した一本鎖 cDNA 10 L (2— 7 g)を試料として用いた。これ を 94°Cに 10分間保ち変性させた後、氷上で保った。これに、表 18に記載の酵素、 試薬を加え、 37°Cで 10分間インキュベートした後、 98°Cで 10分間保ち、フラグメント を得た。
[0084] [表 18]
1 Ox One— Phor-AII Buffer
DNase I (O. 6UZ ( i g) of cDNA)
MiliiQ
Total
[0085] 前記 1. 2)にて得られたフラグメントの末端に、表 19に記載の酵素、試薬をそれぞ れ加え、 37°Cで 60分間インキュベートすることでラベルした。ラベル後は 2. の 0. 5M EDTAを加え反応を停止したのち 20°Cで貯蔵した。
[0086] [表 19] 5x Reaction buffer 1 0. 0
GeneChip DNA labeling Reagent 2. 0
Termi nal Deoxynucleotidyl Transferase 1 . 0
Fragmentation DNA Product 20. 0
MilliQ 1 6. 0
Total 50. 0 L
[0087] 表 20に従い、各試薬を加えてハイブリダィゼーシヨンカクテルを作成し、そのハイブ リダィゼーシヨンカクテノレ 80. 0 Lとチップとのハイブリダィゼーシヨンを 45°Cで 16 時間行なった。チップを洗浄後、ストレプトアビジン一蛍光（Phycoerythrin； Mole cular Probes社)標識による染色を行った。さらにチップの再洗浄を行ったのち、ス キヤナー (Affymetrix社）にて蛍光強度を測定した。
[0088] [表 20]
2x Hybridization Buffer 40. 0
3 n B2 Control Oligo (Affymetrix社） 1 . 3
1 Omg/m L Herring Sperm DNA ( Promega社) 0. 8
50mg/m L B SA (Invitrogen¾) 0. 8
1 00% D SO (Sigma社） 6. 2
Fragmentated and Labeled aRNA 25. 0
MilliQ 5. 9
Total 80. O L
[0089] 3)遺伝子の Flag情報の解析
前記によって得られた aRNA断片を使用して GeneChipを行なった結果を、 Affy metrix遺伝子解析ソフトにて解析し、各遺伝子の発現の有無を調べた。表 21に示 すように、 Affymetrix解析ソフトにおいて遺伝子発現が認められると判定される割合 はチップ上の総遺伝子数の約 35. 2%であった。
[0090] [表 21]
Chip Number Ratio (%) Average (%)
Gene Chip a 4, 041 39. 6 35. 2
b 3, 1 49 30 8 さらに、 GeneChipマニュアルに準じたサンプル調整で得られた遺伝子発現のパタ ーンを、前記で得られた 1サイクル IVT法での遺伝子発現又は 2サイクル IVT法での 遺伝子発現と比較し、それぞれの相関関係を調べた。 マニュアル法と 1サイクル IVT法での遺伝子発現結果の相関係数は図 9に示すよう に、 0. 75 (Parametric, two -tail, p< 0. 01)と有意な相関が認められた。また、 マニュアル法と 2サイクル IVT法での遺伝子発現結果の相関係数も図 10に示すよう に 0. 69 (Parametric, two -tail, p< 0. 01)と統計学的に有意な相関が認められ た。
以上の結果から、 IVT法により RNA増幅された試料はマニュアル法での RNA増幅 を伴わない方法で得られたオリジナルの試料に含まれる mRNAの混合比を保持して いたことが示された。
[0092] 今回行なった GeneChipl枚に反応させた試料カ 丁法で 1. 1 gの aRNAである のに対して、マニュアル法では倍量の 2. 2 gの cDNAを使用した。しかしながら、 発現が認められると判定された遺伝子発現シグナルの平均値が 1サイクル IVT法（ 1 35. 7, n= 2)および 2サイクル IVT法（110. 5, n= 2)に比較してマ-ユアル法（52 . 5, n= 2)では約半分に減少した。本結果はマニュアル法に比較して IVT法ではビ ォチン標識力 倍以上高い事を示すことから、 IVT法により微量の試料カゝら抽出した RNAをさらに高感度に標識するのに有効である事が示された。特にシグナル全体を 高めることで、コピー数の少な!/、すなわちシグナル強度が低 、遺伝子のばらつきを 減少させることでより多くの解析対象となる遺伝子数を増加させることが可能となるこ とが示唆された。
[0093] GeneChip解析により遺伝子発現が認められるもの（Flag情報が" Present"または "Marginal"と示されるもの）の数はマニュアル法で 2, 951遺伝子、 1サイクル IVT法 で 3, 581遺伝子、また 2サイクル IVT法で 2, 191遺伝子であった（図 11)。マ-ユア ル法での 2, 951遺伝子のうち 1サイクル IVT法とは 78. 6%が重複し、 2サイクル IVT 法とは 60. 0%が重複していた。また 1サイクル IVT法と 2サイクル IVT法で重複する 遺伝子は 2, 104存在し、この数は 1サイクル IVT法の 58. 8%、 2サイクル IVT法の 9 6. 0%を占める。本結果は 2サイクル IVT法により得られる結果の大部分は 1サイク ル IVT法で得られる結果に包括されることを示して ヽる。また各方法で得られる遺伝 子群のうち他の方法との間に重複を示さない遺伝子群の大部分は遺伝子発現のシ グナル強度の低い側に集中して現れている事が判明した。反対に、どの方法におい ても重複する 1, 661遺伝子はシグナル強度の高 、側に集中して 、ることが判明した 産業上の利用可能性
[0094] 本発明のプロモーター領域を付カ卩したプライマーは RNAを増幅することができる。
本発明のプライマーによって、微生物感染症患者力 得られた微生物 RNAを増幅し 、得られた mRNA情報をマイクロアレイやノーザンブロット等によって解析することで 、病原微生物のありのままの病原性を調べ、臨床的診断、予後'治療法の選択に用 いることがでさる。
図面の簡単な説明
[0095] [図 1]RNAから sense鎖のみを合成する方法の概要を示した図である（実施例 4)。
[図 2]RNAから senseZantisense鎖を同時に合成する方法の概要を示した図であ る（実施例 4)。
[図 3]RNAから antisense鎖のみを合成する方法の概要を示した図である（実施例 4
) o
[図 4]Streptococcus mutansから精製した total RNAのフラグメントサイズを示し た図である（実施例 4)。
[図 5]1サイクル IVT法によって合成された aRNAのフラグメントサイズを示した図であ る（実施例 4)。
[図 6]2サイクル IVT法によって合成された aRNAのフラグメントサイズを示した図であ る（実施例 4)。
[図 7] 1サイクル IVT 法及び 2 サイクル IVT法を行なった各グループ 2試料間の ばらつきを示した図である（実施例 6)。
[図 8] 1サイクル IVT法及び 2サイクル IVT法での遺伝子発現結果の相関関数を示 した図である（実施例 6)。
[図 9]GeneChip法と 1サイクル IVT法での遺伝子発現結果の相関係数を示した図で ある（実施例 7)。
[図 10]GeneChip法と 2サイクル IVT法での遺伝子発現結果の相関係数を示した図 である（実施例 7)。 [図 ll]GeneChip法と 1サイクル IVT 法及び 2 サイクル IVT法で発現が有ると 判定された遺伝子数を示した図である (実施例 7)。

Claims

請求の範囲
[I] ランダムプライマーにプロモーター領域が付加されたことを特徴とするプライマー。
[2] 特定の遺伝子に相補的な塩基配列を含むプライマーにプロモーター領域が付加さ れたことを特徴とするプライマー。
[3] プロモーター領域が、 T7プロモーター、 T3プロモーター、 SP6プロモーターから選 ばれるいずれか 1つである請求項 1又は 2に記載のプライマー。
[4] 原核生物の RNAの増幅に用いる請求項 1〜3のいずれかに記載のプライマー。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載のプライマーを用いて、 RNAを増幅する方法。
[6] ng単位の RNAを増幅できる請求項 5に記載の方法。
[7] RNAを増幅する方法力 IVT法である請求項 5又は 6に記載の方法。
[8] IVT法を 2サイクル行うことを特徴とする請求項 7に記載の方法。
[9] 1サイクル IVT法によって得られた antisense aRNA (amplified RNA)に請求 項 1〜4のいずれかに記載のプライマーを用いてさらに IVT法を行うことにより、 sens e aRNAを増幅する請求項 8に記載の方法。
[10] 1サイクル IVT法によって得られた antisense aRNAに請求項 1〜4のいずれかに 記載のプライマーを用いて RT反応を行った後、さらに請求項 1〜4のいずれかに記 載のプライマーを用いて IVT法を行うことにより、 sense aRNA及び antisense aR
NAを同時に増幅する請求項 8に記載の方法。
[II] 1サイクル IVT法によって得られた antisense aRNAにランダムプライマーを用い て RT反応を行った後、さらに請求項 1〜4のいずれかに記載のプライマーを用いて I VT法を行うことにより、 antisense aRNAを増幅する請求項 8に記載の方法。
[12] 請求項 1〜4のいずれかに記載のプライマーを用いて SMART法により DNAを増 幅する方法。
[13] 請求項 1〜4のいずれかに記載のプライマーを用いて増幅した aRNA及び Z又は a DNA (amplified DNA)を用いて、生物の遺伝子発現解析及び Z又は同定解析 を行う方法。
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