WO2006037528A1 - Fleureszenzmikroskop mit mindestens einem absorptionsfilter zur reflexunterdrückung unerwünschten beleuchtungslichts - Google Patents

Fleureszenzmikroskop mit mindestens einem absorptionsfilter zur reflexunterdrückung unerwünschten beleuchtungslichts Download PDF

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Reiner Mitzkus
Anke Vogelgsang
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Carl Zeiss Jena GmbH
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    • G02B21/0032Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers

Definitions

  • the invention relates to a microscope with at least one beam splitter.
  • beam splitters are generally part of reflector modules for fluorescence microscopy. These reflector modules consist of two filters and the wavelength-selective splitter mirror / beam splitter.
  • the fluorescence of the specimen exciting light is provided by the excitation filter according to the selected application method narrowband and in the required wavelength available.
  • the splitter mirror directs this light as efficiently as possible through the lens to the specimen.
  • the light emitted by appropriate excitation of fluorescence in the specimen is shifted somewhat in the direction of its wavelength with respect to its wavelength (Stokes shift) and now passes through the splitter mirror. This passage through the splitter mirror must also be efficient in order to avoid losses.
  • a blocking filter (emission filter) attached after the splitter mirror has the task of transmitting only the light emitted by the specimen, but blocking possible proportions of the excitation light as completely as possible.
  • non-reflected light at the opposite side of the excitation filter housing parts is at least partially reflected or scattered and thrown back into the beam path, in particular thrown with high efficiency in the direction of the emission filter, since the splitter mirror on its rear reflection layer reflects the excitation light well.
  • Housing parts light is thrown back from the conical surface and thus reflected back into the detection beam path.
  • Material passes on a light trap and is thus removed from the rays away.
  • Excitation filter defined wavelength adapted and preferably mounted on the reflector module.
  • the splitter side of the absorbent material In order to avoid unwanted reflections on the absorbent material, it is advantageous to provide the splitter side of the absorbent material with a
  • a scattered light sleeve is arranged in the detection beam path, which illuminates the light passing obliquely through the emission filter
  • Fig. 1 shows the known basic structure of a reflector module
  • Fig. 3 shows a first embodiment of the invention
  • Fig. 4 shows a second embodiment
  • Fig. 5 is a schematic representation of a microscope with a beam splitter
  • the reflector module 1 of Fig. 1 consists of an excitation filter 2, an emission filter 3 and a splitter mirror 4.
  • the light of a light source e.g.
  • Halogen lamp meets the excitation filter 2, which only the desired part of Spectrum passes and is directed by the splitter mirror 4 in the direction of the object, not shown here (excitation beam Sl). After interaction of this light with the fluorescent parts of the object, the returning, somewhat shifted in its wavelength fluorescent light hits again on the splitter mirror 4, is transmitted by this and then strikes the Emissionsf ⁇ lter 3, which has the task of transmitting only the desired fluorescent light and on to direct the detector, also not shown here (emission beam S2). The excitation light which has been reflected by the object must be blocked by the emission filter.
  • FIG. 2 shows how excitation light can enter the detection beam path S2 in the prior art. Since the splitter mirror 4 can not reflect the excitation light 100% in the direction of the object, a part of the excitation light reaches parts 5 of the microscope lying behind the table mirror (beam path S3) and is scattered or reflected by them in an undirected manner in general. A part of this scattered or reflected light can now fall obliquely on the emission filter 3 and is transmitted by this (beam path S4), since the emission filter unfolds its blocking effect for the excitation light only at normal incidence. This leads to a reduction in contrast in the detection beam path, which is undesirable.
  • an absorption filter 6 is mounted on the side of the reflector module 1 opposite the excitation filter 2, which absorbs the excitation light to a large extent.
  • the absorption filter is adapted to the excitation filter in order to absorb exactly the excitation wavelength.
  • the absorption filter 6 extends over the entire side of the reflector module 1, so that also obliquely reflected light from the microscope parts 5 back to the absorption filter 6 again and is attenuated by this again (beam path S4).
  • a light trap may also be provided, as e.g. in DE 199 26 037 was proposed.
  • stray light sleeve which preferably consists of a black anodized corrugated sleeve or a corrugated black plastic sleeve.
  • Fig. 4 is shown as an alternative that the absorption filter 6 can also be attached to the microscope part 5 or a possibly provided light trap according to DE 199 26 037.
  • the absorption filter on its side facing the splitter mirror 4 on an anti-reflective coating on to effectively prevent the occurrence of reflections on its input side.
  • Fig. 5 the total beam path is shown schematically in a microscope. From a light source 7, the light is directed onto the excitation filter 2 via a heat protection filter 8, the aperture diaphragm 9 and the field diaphragm 10.
  • the splitter mirror 4 reflects the excitation light via the objective 11 onto the object 12.
  • the fluorescence light generated by the excitation light in the object 12 again passes the objective 11 and is now transmitted by the splitter mirror 4 and through the emission filter onto the tube lens 13 and from there via a prism system the eyepieces 14 shown.
  • the light can also be imaged by means of a camera attached to the phototube 15.
  • excitation filter 2, emission filter 3 and splitter mirror 4 are shown as separate components, but are usually combined to form reflector modules.
  • the invention is not bound to the illustrative embodiments shown, expert developments do not lead to a departure from the scope defined by the claims.
  • the invention can also be used in laser scanning microscopes in the suppression of stray light at the main or secondary color splitters.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verhinderung von Falschlicht im Detektionsstrahlengang von Fluoreszenzmikroskopen. Dazu dient ein am oder in der Nähe des Reflektormoduls angebrachtes Absorptionsfilter 6, welches das vom Teilerspiegel 4 durchgelassene Anregungslicht 53 wirkungsvoll dämpft.

Description

FLEURESZENZMIKROSKOP MIT MINDESTENS EINEM ABSORPTIONSFILTER ZUR REFLEXUNTERDRÜCKUNG UNERWÜNSCHTEN BELEUCHTUNGSLICHTS
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler. Solche Strahlteiler sind im Allgemeinen Bestandteil von Reflektormodulen für die Fluoreszenzmikroskopie. Diese Reflektormodule bestehen aus zwei Filtern und dem wellenlängen-selektiv wirkenden Teilerspiegel/Strahlteiler.
Das die Fluoreszenz des Präparates anregende Licht wird durch das Anregungsfilter dem gewählten Applikationsverfahren entsprechende schmalbandig und in der benötigten Wellenlänge zur Verfügung gestellt. Der Teilerspiegel lenkt dieses Licht möglichst effizient durch das Objektiv auf das Präparat. Das durch entsprechende Anregung von Fluoreszenz im Präparat emittierte Licht ist bzgl. seiner Wellenlänge etwas in Richtung längerer Wellenlänge verschoben (Stokes-Shift) und passiert jetzt den Teilerspiegel. Dieser Durchgang durch den Teilerspiegel muss ebenfalls effizient erfolgen um Verluste zu vermeiden. Ein nach dem Teilerspiegel angebrachtes Sperrfilter (Emissionsfilter) hat die Aufgabe nur das vom Präparat emittierte Licht durchzulassen, mögliche Anteile des Anregungslichtes aber möglichst vollständig zu blockieren.
Bei bekannten Reflektormodulen wird das durch den Teilerspiegel hindurchgehende, nicht reflektierte Licht an den dem Anregungsfilter gegenüber liegenden Seite befindlichen Gehäuseteilen zumindestens teilweise reflektiert bzw. gestreut und so in den Strahlengang zurückgeworfen, insbesondere mit hoher Effizienz in Richtung des Emissionsfilters geworfen, da der Teilerspiegel auch auf seiner nun rückseitig liegenden Reflexionsschicht das Anregungslicht gut reflektiert. Ein besonderes Problem entsteht durch das gestreute Licht, welches unter einem von 90° verschiedenen Winkel auf das Emissionsfilter trifft, weil die für die Filter verwendeten dichroitischen Schichten ihre vorausberechnete Filterwirkung nur für senkrechten Lichteinfall realisieren können, bei schrägem Einfall werden auch andere Wellenlängen als die gewünschten durchgelassen.
Damit wird in dem sich dem Emissionsfilter anschließenden Detektionsstrahlengang, der zur Beobachtung mittels Okularen oder empfindlicher Kameras führt, eine vom Anregungslicht direkt hervorgerufene Untergrundhelligkeit erzeugt, welche den Kontrast vermindert und insbesondere die Untersuchung schwacher Fluoreszenzen unmöglich machen kann. In der DE 199 26 037 Al der Anmelderin wurde zur Lösung dieses Problems vorgeschlagen, die Rückseite des Reflektormoduls zu entfernen oder durchsichtig zu gestalten und das den Teilerspiegel durchdringende Licht auf eine zumindestens teilweise Kegelform aufweisende reflektierende Oberfläche zu lenken und auf diese Art aus dem Strahlengang zu entfernen. Es kann aber auch bei dieser Lösung immer noch passieren, dass durch Reflexion an
Gehäuseteilen Licht von der kegelförmige Fläche zurück geworfen wird und damit wieder in den Detektionsstrahlengang reflektiert wird.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe die durch den Stand der Technik bekannte
Unterdrückung von unerwünschtem Anregungslicht im Detektionsstrahlengang weiter zu verbessern.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler, wobei zur
Reflexunterdrückung unerwünschtes Beleuchtungslicht auf ein dieses absorbierendes Material gerichtet wird.
Besonders vorteilhaft ist, wenn Licht welches trotzdem noch durch das absorbierende
Material hindurchtritt auf eine Lichtfalle geleitet und so aus dem Strahlen weg entfernt wird.
Ein weitere Vorteil ergibt sich, wenn das absorbierende Material der durch das
Anregungsfilter definierten Wellenlänge angepasst und vorzugsweise am Reflektormodul angebracht ist.
Eine alternative vorteilhafte Lösung besteht darin , das absorbierende Material am
Mikroskopgehäuse anzubringen, wobei es vorteilhafterweise schräg zum einfallenden Licht positioniert wird.
Damit es nicht zu unerwünschten Reflexionen am absorbierenden Material kommt ist es vorteilhaft, die dem Teilerspiegel zugewandte Seite des absorbierenden Materials mit einer
Anti-Reflex-Schicht zu versehen.
Zusätzlich ist es vorteilhaft, wenn im Detektionsstrahlengang zusätzlich eine Streulichthülse angeordnet ist, welche das den Emissionsfilter schräg durchsetzende Licht aus dem
Strahlengang entfernt.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 den bekannten Grundaufbau eines Reflektormoduls
Fig. 2 das Entstehen von Falschlicht im Emissionsstrahlengang bei einem bekannten
Reflektormodul
Fig. 3 ein erstes Ausführungsbeispiel der Erfindung
Fig. 4 ein zweites Ausführungsbeispiel
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Mikroskops mit einem Strahlteiler
Der Reflektormodul 1 aus Fig. 1 besteht aus einem Anregungsfilter 2, einem Emissionsfilter 3 und einem Teilerspiegel 4. Das Licht einer hier nicht dargestellten Lichtquelle (z.B. einer
Halogenlampe) trifft auf das Annregungsfilter 2, welcher nur den gewünschten Teil des Spektrums hindurchlässt und wird vom Teilerspiegel 4 in Richtung des hier nicht dargestellten Objekts gelenkt (Anregungsstrahlengang Sl). Nach Wechselwirkung dieses Lichts mit den fluoreszierenden Teilen des Objekts trifft das zurückkommende, etwas in seiner Wellenlänge verschobene Fluoreszenzlicht wieder auf den Teilerspiegel 4, wird von diesem durchgelassen und trifft dann auf den Emissionsfϊlter 3, welcher die Aufgabe hat, nur das gewünschte Fluoreszenzlicht durchzulassen und auf den ebenfalls hier nicht dargestellten Detektor zu lenken (Emissionsstrahlengang S2). Das Anregungslicht, welches von dem Objekt reflektiert wurde, muss vom Emissionsfilter geblockt werden.
Fig. 2 zeigt, wie beim Stand der Technik doch Anregungslicht in den Detektionsstrahlengang S2 gelangen kann. Da der Teilerspiegel 4 das Anregungslicht nicht zu 100% in Richtung des Objekts reflektieren kann, gelangt ein Teil des Anregungslichtes auf hinter dem Teüerspiegel liegende Teile 5 des Mikroskops (Strahlengang S3) und wird von diesen im Allgemeinen ungerichtet gestreut bzw. reflektiert. Ein Teil dieses gestreuten oder reflektierten Lichts kann nun schräg auf den Emissionsfilter 3 fallen und wird von diesem durchgelassen (Strahlengang S4), da der Emissionsfilter seine Sperrwirkung für das Anregungslicht nur bei senkrechtem Einfall entfaltet. Damit kommt es zu einer Kontrastverringerung im Detektionsstrahlengang, welche unerwünscht ist.
In Fig. 3 ist erfindungsgemäß an der dem Anregungsfilter 2 gegenüberliegenden Seite des Reflektormoduls 1 ein Absorptionsfilter 6 angebracht, welches das Anregungslicht weitgehend absorbiert. Dazu ist es günstig, wenn das Absorptionsfilter an das Anregungsfilter angepasst ist, um genau die Anregungswellenlänge zu absorbieren. Das Absorptionsfilter 6 erstreckt sich dabei über die gesamte Seite des Reflektormoduls 1, so dass auch von den Mikroskopteilen 5 schräg zurückgeworfenes Licht zuerst wieder auf das Absorptionsfilter 6 trifft und von diesem noch einmal gedämpft wird (Strahlengang S4). Anstelle der Mikroskopteile 5 kann auch eine Lichtfalle vorgesehen sein, wie sie z.B. in DE 199 26 037 vorgeschlagen wurde. Zur weiteren Verbesserung der Eliminierung von Falschlicht im Detektionsstrahlengang S2 kann jetzt noch eine Streulichthülse angeordnet werden, welche bevorzugt aus einer schwarz eloxierten geriffelten Hülse oder einer geriffelten schwarzen Kunststoffhülse besteht. Durch diese wird das schräg in den Detektionsstrahlengang einfallende Licht wirkungsvoll eliminiert.
In Fig. 4 ist als Alternative dargestellt, dass das Absorptionsfilter 6 auch am Mikroskopteil 5 oder einer eventuell vorgesehenen Lichtfalle nach DE 199 26 037 angebracht sein kann. In jedem Fall weist das Absorptionsfilter an seiner dem Teilerspiegel 4 zugewandtes Seite eine Anti-Reflex-B eschichtung auf um das Entstehen von Reflexionen an seiner Eingangsseite wirkungsvoll zu verhindern.
In Fig. 5 ist schematisch der Gesamtstrahlengang in einem Mikroskop dargestellt. Von einer Lichtquelle 7 wird das Licht über ein Wärmeschutzfilter 8, die Aperturblende 9 und die Leuchtfeldblende 10 auf den Anregungsfilter 2 gerichtet. Der Teilerspiegel 4 reflektiert das Anregungslicht über das Objektiv 11 auf das Objekt 12. Das vom Anregungslicht im Objekt 12 erzeugte Fluoreszenzlicht passiert wiederum das Objektiv 11 und wird jetzt vom Teilerspiegel 4 durchgelassen und durch das Emissionsfilter auf die Tubuslinse 13 und von dieser über ein Prismensystem in die Okulare 14 abgebildet. Alternativ kann das Licht auch mittels einer am Fototubus 15 angebrachte Kamera abgebildet werden. Dabei sind hier Anregungsfilter 2, Emissionsfilter 3 und Teilerspiegel 4 als getrennte Bauelemente dargestellt, werden aber üblicherweise zu Reflektormodulen zusammengefasst. Die Erfindung ist nicht an die dargestellten Ausfiihrungsbeispiele gebunden, fachmännische Weiterentwicklungen führen nicht zu einem Verlassen des durch die Patentansprüche definierten Schutzumfangs. Insbesondere lässt sich die Erfindung auch in Laser Scanning Mikroskopen bei der Unterdrückung von Falschlicht an den Haupt- bzw. Nebenfarbteilern anwenden.

Claims

Patentansprüche
1. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler, wobei zur Reflexunterdrückung unerwünschten Beleuchtungslicht auf ein dieses absorbierendes Material gerichtet wird.
2. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler nach Anspruch 1 , wobei Licht welches durch das absorbierende Material hindurchtritt auf eine Lichtfalle geleitet und so aus dem Strahlenweg entfernt wird.
3. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler nach Anspruch 1 oder 2, wobei das absorbierende Material der durch das Anregungsfilter definierten Wellenlänge angepasst ist.
4. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das absorbierende Material vorzugsweise am Reflektormodul angebracht ist.
5. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das absorbierende Material am Mikroskopgehäuse angebracht ist.
6. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das absorbierende Material schräg zum einfallenden Licht positioniert ist..
7. Mikroskop mit mindestens einem Strahlteiler nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die dem Teilerspiegel zugewandte Seite des absorbierenden Materials mit einer Anti-Reflex-Schicht versehen ist.
8. Mikroskop mit mindestens einem Strahl teuer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei im Strahlengang zusätzlich eine Streulichthülse angeordnet ist.
PCT/EP2005/010472 2004-10-04 2005-09-28 Fleureszenzmikroskop mit mindestens einem absorptionsfilter zur reflexunterdrückung unerwünschten beleuchtungslichts Ceased WO2006037528A1 (de)

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Non-Patent Citations (1)

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"Incident light microscope - object illumination achieved by light coming in through microscope objective", DERWENT, 1976, XP002295029 *

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