WO2006032718A1 - Secuencias, vectores y células gtf y sus aplicaciones en el sector alimentario - Google Patents
Secuencias, vectores y células gtf y sus aplicaciones en el sector alimentario Download PDFInfo
- Publication number
- WO2006032718A1 WO2006032718A1 PCT/ES2005/070127 ES2005070127W WO2006032718A1 WO 2006032718 A1 WO2006032718 A1 WO 2006032718A1 ES 2005070127 W ES2005070127 W ES 2005070127W WO 2006032718 A1 WO2006032718 A1 WO 2006032718A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- gtf
- sequence
- dna sequence
- protein
- expression vector
- Prior art date
Links
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 241000209761 Avena Species 0.000 claims abstract 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 claims description 3
- 241000500340 Pediococcus damnosus Species 0.000 abstract description 19
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 abstract description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3s,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000869 Homopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 241000192134 Oenococcus oeni Species 0.000 description 4
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 4
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 3
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 235000003086 food stabiliser Nutrition 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940035901 lactobacillus sp Drugs 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 235000020166 milkshake Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 2
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 2
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 2
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 2
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 description 1
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 101100184605 Escherichia coli mobA gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 201000010538 Lactose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000202223 Oenococcus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 101100391699 Pseudomonas viridiflava gacA gene Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 101100001155 Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6) cpoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000019987 cider Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 101150067044 copG gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 235000011850 desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 101150039753 epsG gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021321 essential mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150082058 malR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 101150035026 mobA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000020262 oat milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150107738 repB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
Definitions
- Biotechnology for the food sector More specifically, fermentation of food and beverages, and specifically obtaining microorganisms producing exopolysaccharides ( ⁇ -glucans) and food additives.
- EPS Exopolysaccharides secreted by various bacteria have an important role as adhesion factors, in the interactions of bacteria with plants as signaling molecules or as protective agents against stress situations or phage infections (van Kranenburg and cois. ( 1999) Curr. Opin. Biotech. 10: 498-504).
- EPS are produced by both Gram-negative and Gram-positive bacteria. Some of these polymers have unique properties that make them suitable for use as stabilizing agents, thickeners, gelling agents and emulsifiers. They are used as additives in the manufacture of numerous foods such as dairy products (yogurts, milkshakes and ice cream), juices and cereal-based preparations.
- EPS produced by Gram-negative bacteria
- xanthan produced by Xanthomonas campestris and used in rubber cosmetics as a thickener, stabilizer and suspending agent
- acetane produced by Acetobacter xylinum is used for the production of cream and vinegar substitutes (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16: 41-46).
- capsular polysaccharides produced by Sphingomonas which possess rheological properties are used as food stabilizing agents (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16: 41-46).
- Gram-positive bacteria and specifically lactic acid bacteria produce several EPS of industrial interest.
- LAB lactic acid bacteria
- a clear example is the dextrans produced by Leuconostoc mesenteroides, used in the synthesis of matrices used in chromatography techniques, for coating metal surfaces or for stabilizing syrups.
- some LAB strains belonging to the Streptococcus, Lactobacillus and Lactococcus genera produce EPSs that are being used in situ to improve the texture of fermented products such as yogurt and cheese (de Vos (1999) Curr. Opin. Biotech. 10: 483-484).
- Oatmeal is a cereal that has a high nutritional value due to its content in proteins, vitamin E, unsaturated fatty acids and essential minerals. In addition, it contains 4-6% of ⁇ -glucans, which reduce serum cholesterol levels in humans. This effect has been verified in clinical studies on ingestion of oat-based foods (see details on htpp // www.adavena.com) and in fact the FDA (Food and Drug Administration, USA) has authorized the labeling of "beneficial product for Health "in oat-based food preparations containing 0.75 g of soluble fiber ( ⁇ glucan).
- Cereal Base (CEBA) (Lund, Sweden) is specialized in the production of cereal-based foods as an alternative to dairy products. It has developed a technology called Adavena that has allowed the obtaining of an oat milk with which it produces products such as yogurt substitutes, dairy desserts, ice cream, etc. fermented with LAB (Mártensson et al., 2002).
- the nutritional and dietary properties of these preparations improve if the ⁇ -glucans content of these preparations is increased, incorporating the producing bacteria or by direct addition of those polymers.
- the genes or metabolic pathways involved in this production of ⁇ -glucans in microorganisms of potential use in the food sector are not known.
- An object of the present invention constitutes a DNA sequence, hereinafter gti DNA sequence of the present invention, from GRAS lactic acid bacteria
- EPS exopolysaccharides
- the invention also relates to a GTF expression vector comprising the GTF DNA sequence of the invention, hereinafter GTF expression vector of the invention, and which allows the transformation of microorganisms or cells and the subsequent obtaining of microorganisms capable of expressing The GTF protein (SEQ ID N06) and allowing the guest to acquire the ability, or improve the existing one, to produce EPS.
- GTF expression vector comprising the GTF DNA sequence of the invention, hereinafter GTF expression vector of the invention, and which allows the transformation of microorganisms or cells and the subsequent obtaining of microorganisms capable of expressing The GTF protein (SEQ ID N06) and allowing the guest to acquire the ability, or improve the existing one, to produce EPS.
- Another object of the present invention is the use of the GTF DNA sequence or the GTF expression vector in a cell transformation process for obtaining GTF cells.
- Another object of the present invention constitutes a protein with glycosyltransferase activity that is constituted by one of the amino acid sequences selected from: a) the amino acid sequence identified as SEQ ID N06 or a fragment thereof; and b) an amino acid sequence analogous to the sequence defined in a).
- Another object of the invention constitutes a cell, hereinafter GTF cell of the present invention, comprising a GTF DNA sequence or a pGTF expression vector of the invention, capable of recombinantly expressing the GTF protein (SEQ ID N06) and that, therefore, acquires the capacity, or improvement of the existing one, of producing EPS.
- GTF cell of the present invention comprising a GTF DNA sequence or a pGTF expression vector of the invention, capable of recombinantly expressing the GTF protein (SEQ ID N06) and that, therefore, acquires the capacity, or improvement of the existing one, of producing EPS.
- Another object of the present invention is the use of GTF cells to produce EPSs by a method comprising: a) the growth of the GTF cell in a suitable medium and under conditions that allow the expression of the GTF expression vector or the GTF DNA sequence, b) the production of EPSs by the GTF cell of a), and c) the purification of the EPS of b)
- another object of the present invention constitutes the use of GTF cells in food fermentation processes, among others, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, belonging to the following group : dairy products, alcoholic beverages and oatmeal.
- the invention faces the problem of providing new genetic and biological tools that allow the expression of new enzymes useful for the production of EPSs and the generation of microorganisms of industrial value.
- the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have identified a gti gene coding for an enzyme with glycosyltransferase activity (GTF), from Pedioccocus damnosus 2.6 genomic material. The recombinant expression of this gene in
- Streptococcus pneumoniae and in Lactococcus lactis demonstrated the glycosyltransferase activity of the enzyme encoded by said gene, as well as the possibility of successfully transforming Gram-positive bacteria, including lactic acid bacteria, with said gene that acquire the capacity of its expression.
- the strains of lactic bacteria can be useful for obtaining EPSs for later use as an additive in the food sector, and, in addition, their subsequent genetic manipulation to confer them GRAS quality can allow their use for the transformation of food with new properties.
- the overproduction of GTF with glycosyltransferase activity could allow obtaining such polymers on a large scale for incorporation as additives to food and dietary preparations that have beneficial properties for human health.
- an object of the present invention constitutes a DNA sequence, hereinafter GTF DNA sequence of the present invention, from GRAS lactic acid bacteria and coding for a protein with glycosyltransferase activity that allows the production of exopolysaccharides and that is constituted by one of the nucleotide sequences selected from: a) the nucleotide sequence identified as SEQ ID NO9 or a fragment thereof; and b) a nucleotide sequence analogous to the sequence defined in a).
- the term "analogous" is intended to include any DNA sequence that can be isolated or constructed based on the nucleotide sequence shown in the SEQ.
- ID NO9 for example, by the introduction of conservative or non-conservative nucleotide substitutions, including the insertion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides at any end or inside the sequence.
- an analogous DNA sequence is substantially homologous to the nucleotide sequence identified as SEQ ID NO9.
- the expression "substantially homologous” means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity, at the nucleotide level, of at least 60%, preferably of at least 85% , or more preferably of at least 95%.
- the GTF DNA molecule of the invention comes from P. damnosus 2.6 and can be found in similar forms in other microorganisms, among others, by way of illustration and without limiting the scope of the invention: Lactobacillus sp. and Oenococcus oeni, where they can be from Naturally or in another case, they could also be as a result of a process of gene transformation in which the transformed organism reproduces said DNA molecules.
- the DNA sequence of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the DNA of any microorganism it contains, by using probes or oligonucleotides, prepared thanks to the information of the nucleotide sequence of said DNA molecule. , provided in this invention by an expert in the field.
- the DNA molecule of the invention includes fragments thereof that exhibit said glycosyltransferase activity.
- the GTF DNA sequence of the invention is a DNA molecule of P. damnosus 2.6, and in particular SEQ ID N09.
- the GTF DNA sequence of the invention can be used, in general, in the generation of an expression vector that allows the expression of these proteins with glycosyltransferase activity in a wide range of host cells.
- the invention also refers to a GTF expression vector comprising the GTF DNA sequence of the invention, hereinafter GTF expression vector of the invention, and which allows the transformation of microorganisms or cells and the subsequent obtaining of microorganisms capable of expressing the GFP protein (SEQ ID N06) and allowing the host to acquire the ability, or improve the existing one, to produce EPS.
- the expression vector of the present invention comprises at least one GTF DNA sequence of the invention and at least one promoter that directs the transcription of the gene of interest, to which it is operatively linked, and other necessary sequences. or appropriate for the transcription of the gene of interest and its appropriate regulation in time and place, for example, start and end signals, cut-off sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators, transcriptional repressors, insertion sequences, etc. .
- Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case between plasmids and cosmids with an origin of bacterial replication so that it can be amplified in multicopy from extra chromosomal elements in bacteria or integrative vectors so that it can be amplified in monocopy from the chromosome in bacteria, as well as a usable marker to select transformed cells different from the gene of interest.
- the choice of the vector will depend on the host cell in which it will be introduced later.
- the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid which, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cell and replicated together with the host cell chromosome.
- the vector of the invention can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. CoId Sprig Harbor laboratory Press N.Y.).
- a particular object of the present invention constitutes the plasmid pGTF containing the GTF DNA sequence of the present invention (see Example 2).
- Another object of the present invention is the use of the GTF DNA sequence or the GTF expression vector in a cell transformation process for obtaining GTF cells.
- Another object of the present invention constitutes a protein with glycosyltransferase activity that is constituted by one of the amino acid sequences selected from: a) the amino acid sequence identified as SEQ ID N06 or a fragment thereof; and b) an amino acid sequence analogous to the sequence defined in a).
- Another object of the invention constitutes a cell, hereinafter GTF cell of the present invention, comprising a GTF DNA sequence or a pGTF expression vector of the invention, capable of recombinantly expressing the GTF protein (SEQ ID N06) and that, therefore, acquires the capacity, or improvement of the existing one, of producing EPS.
- the host cells that can be transformed with said expression vector can be, both Gram-positive and Gram-negative bacterial cells, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention LABs belonging to the genera Lactococcus Lactobacillus and Streptococcus as S Thermophilus, different subspecies of L lactis and Lactobacillus delbrueckii, subsp. bulgaric, which are currently used in the manufacture of dairy products.
- a particular embodiment of the present invention constitutes the GTF L lactis MG1363 [pGTF] cell and the S. pneumoniae R61 [pGTF] cell.
- the GTF cells of the invention can be used for the overproduction of EPSs for later use in the different possible applications.
- another object of the present invention constitutes the use of GTF cells to produce EPSs by a method comprising: a) the growth of the GTF cell in a suitable medium and under conditions that allow the expression of the GTF expression vector or of the GTF DNA sequence, b) the production of EPSs by the GTF cell of a), and c) the purification of the EPS of b)
- the purification of EPS produced by GTF cells can be carried out by conventional techniques known to a person skilled in the art.
- the EPSs thus obtained can be used as stabilizing agents, thickeners, gelling agents and emulsifiers in multiple food handling, processing and transformation processes, for example, as an additive in the manufacture of numerous foods such as dairy derivatives (yogurts, milkshakes and ice cream), juices and cereal-based preparations), as substitutes for cream and vinegar (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16: 41-46), as food stabilizing agents (Sutherland (1998) Trends Biotechnol 16: 41-46), in rubber form cosmetics as a thickener, stabilizer and suspending agent (Becker et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 145-152), and as a material in the synthesis of matrices used in chromatography techniques, stop coating metal surfaces or to stabilize syrups.
- Another object of the present invention constitutes the use of GTF cells in food fermentation processes, among others, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, belonging to the following group: dairy products, alcoholic beverages and oatmeal
- Figure 1 Physical map of plasmid pGTF.
- the genetic symbols used are: gtf, encodes glycosyltransferase; gfp, encodes the green fluorescent protein; erm, codes for the protein responsible for resistance to erythromycin; malR, encodes for the MaIR transcriptional repressor; PM, gtf and gfp promoter; copG and repB, encode the proteins involved in plasmid replication.
- Figure 2. Prediction of the secondary structure of the GTF protein of P. damnosus 2.6 using the SOSUI program.
- the colors of the amino acids correspond to: black, hydrophobic; blue, with polar chain; blue and bold, positively charged; Red, negatively charged.
- Figure 3 Detection in S. pneumoniae and L. lactis of the expression of gtf and gfp respectively by microscopic agglutination detection and by fluorescence microscopy.
- oligonucleotides were designed based on the conserved amino acid sequence of the glycosyl transferase of P. damnosus IOEB8801 (Walling et al. (2001) Lait 81: 289-300), since the nucleotide sequence of the coding gene has not been published , nor deposited in the DNA sequence data banks.
- the 1.8 kb amplified fragment was cloned into the pCR 2.1 -TOPO vector (Invitrogen) and the recombinant plasmid obtained was established in Escherichia coli DH5 ⁇ .
- the determination of the nucleotide sequence of the DNA fragment revealed the existence of a reading frame open lacking its amino terminal region.
- the DNA sequence obtained was used to synthesize oligonucleotides 5'-ACGCCCTGCGTGTTATCATA -3 '(SEQ ID N03) and 5' - TGTGTAATGGCACTCACGAC -3 '(SEQ ID N04) and by PCR reaction reverse the 5 amplified' of the gene gft, which was cloned using the same vector, method and host bacteria that were used to clone the 3 ' end of the gene.
- the sequence of 3352 nucleotides of the cloned regions is shown in SEQ ID N05 (nucleotides 1-621 region 3 ' of the mobA gene, nucleotides 819-1085 hypothetical gene 0RF1 and nucleotides 1282-2982 of the gtf-CDS region).
- the gft gene (SEQ ID NO 9) encodes the GTF protein of 567 amino acids detailed in SEQ ID N06.
- the comparison of the DNA sequence of the P. damnosus gtf gene with those deposited in the databases showed the absence of significant homologies.
- GTF glycosyltransferase
- Example 2 Construction of the vector pGTF that allows the overexpression of the GTF protein of Pediococcus damnosus 2.6.
- the homology of the GTF with the glycosyltransferase Tts of S. pneumoniae (UuI and cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061) and constituting the capsule of serotype 37 (UuI and cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061) indicated that possibly the GTF is the only protein responsible for the biosynthesis of the exopolysaccharide of P. damnosus.
- the recombinant plasmid pGTF overproducer of GTF and containing the DNA sequence of the gene gene of the invention (SEQ ID NO9) ( Figure 1) was constructed as part of this invention.
- pLSIRGFP expression vector Nieto et al. (2000) Plasmid 43: 205-213
- a DNA fragment that includes the coding region of the gtf gene was cloned between the inducible PM promoter and the gfp reporter gene.
- the amplified region comprising the gene gti using Pfu DNA polymerase Ia (Stratagene) and using as substrate the total DNA of the plasmids carried by P. damnosus 2.6 and the oligonucleotides 5 '- TCTAGAAATTAAAGGAATGTGTAA-3' (SEQ ID NO7) and 5 ' -
- TCTAGATTAATCATTCCAATCAACTG-3 ' (SEQ ID NO8), which include the recognition sequence of restriction enzyme Xba ⁇ .
- the 1,734 kb amplified fragment was cloned, in the correct orientation with respect to the PM promoter in the unique Xba? Site of pLSIRGFP and, subsequently, the recombinant plasmid was established in the uncapsulated R61 strain of S. pneumoniae (R6 strain whose genome has Hoskins et al. (2001) J. Bacteriol. 183: 5709-5717 and which was named R61 by Dr.
- Plasmid pGTF which is capable of replicating in Gram-positive and Gram-positive and negative bacteria contains a transcriptional fusion Pu-gtf-gfp, which allows overexpression by growth of carrier cells in maltose containing medium and a detection of Ia expression from the PM promoter by measuring the fluorescence of the GFP protein (Nieto et al. (2000) Plasmid 43: 205-213).
- Example 3 In vitro detection of the integrated GTF function in S. pneumoniae membranes.
- S. pneumoniae Tts glycosyltransferase is an integral membrane protein (LIuI and cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061).
- the analysis of the prediction of the topological location of the GTF of P. damnosus 2.6 using the SOSUI program is an integral membrane protein (LIuI and cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061).
- the cells present in 1 liter of medium were sedimented by centrifugation at 12,000 xg for 20 minutes (min) at 4 0 C and resuspended in buffer A (70 mM Tris. HCI pH 7.0, 9 mM MgCI 2 , 1 mM CaCI 2 ) with 0.2 M phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and sedimented by centrifugation at 10,000 xg for 10 min at 4 0 C.
- buffer A 70 mM Tris. HCI pH 7.0, 9 mM MgCI 2 , 1 mM CaCI 2
- PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
- Bacteria resuspended in buffer A were subjected to mechanical breakage passing them twice through a French press (Aminco).
- the homogenate was centrifuged at 12000 xg for 15 min at 4 0 C and the supernatant was again centrifuged at 12000 xg for 30 min at 4 0 C.
- the sedimented membranes were resuspended in 2 ml of buffer A containing 0.2 mM PMSF and stored at -8O 0 C.
- the protein concentration of the membrane preparations was determined using the BCA Protein Assay system (Pierce).
- glycosyltransferase activity was carried out using 30 ⁇ M (0.1 ⁇ Ci) UDP- [ 14 C] glucose (specific activity 333 mCi / mmol) in a buffer A supplemented with 50 mM NaCI in a total volume of 100 ⁇ l and membranes in a concentration range between 0.05 and 0.5 mg ml 1 of proteins.
- the reactions were performed by incubation at 3O 0 C for 15 min.
- the reaction was terminated by addition of SDS to a final concentration of 0.5% and incubation at 37 0 C for 15 min.
- bovine serum albumin was added at a final concentration of 0.4% and 1 ml of 10% trichloroacetic acid (TCA).
- the levels of activity detected could be due to the products of the chromosomal cpoA and epsG genes of S. pneumoniae, whose function is unknown, but which are homologously proposed as glycosyltransferases in the KEGG databank (http://www.genome.jp/kegg/).
- a unit of glycosyl transferase activity corresponds to the amount of enzyme that catalyzes the incorporation into a macromolar product of 1 pmol of glucose per mg of protein and per minute.
- the results of detecting glycosyltransferase activity indicated that plasmid pGTF encodes the GTF protein in active form.
- the antibodies developed against the capsule of serotype 37 of S. pneumoniae are very specific and do not react with uncapsulated strains or other serotypes of S. pneumoniae or with other bacteria, said antibodies were used to assess in vivo Ia functional expression of the Pediococcus GTF both in S. pneumoniae R61 [pGTF] as in Lactococcus lactis line MG1363 (to which the pGTF plasmid had been transferred by transformation).
- the functional expression of the GTF was determined by means of the agglutination technique using antibodies developed against the capsule of S.
- the preparations were analyzed by phase contrast and fluorescence microscopy using a Zeiss Axioplan microscope (Universal microcope) with standard FITC excitation fluorescence filters set D480 / 30 and TBP emission 460/530/610.
- the results obtained are shown in Figure 3.
- the fluorescence of the GFP protein allowed fluorescence microscopy to detect the existence of gene expression from the PM promoter of pLS1 RGFP and pGTF in S. pneumoniae cells ( Figures 3B and 3D ) and L lactis ( Figures 3F and 3H) induced with maltose.
- the images obtained by fluorescence microscopy and phase contrast revealed that only the S.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Esta invención presenta secuencias, vectores y microorganismos GTF que están constituidas o comprenden el gen gtf de P.damnosus 2.6 que codifica una glicosiltransferasa localizada en la membrana y que permite la producción de exopolisacáridos del tipo β-glucano por sobreexpresión de dicho gen recombinante. El hecho de que sea un único gen el implicado en la síntesis de este enzima facilita la optimización de las condiciones de expresión que permitirán la producción de β-glucanos a escala industrial. Estos polímeros, que pueden ser utilizados como aditivos en numerosos alimentos, poseen además propiedades beneficiosas para la salud humana. Por otro lado, estos microorganismos GTF transformados pueden ser utilizado en procesos de fermentación de alimentos como productos lácteos, bebidas alcohólicas y avena.
Description
TÍTULO
SECUENCIAS, VECTORES Y CÉLULAS GTF Y SUS APLICACIONES EN EL SECTOR ALIMENTARIO
SECTOR DE LA TÉCNICA
Biotecnología para el sector alimentario. Más concretamente, fermentación de alimentos y bebidas, y en concreto obtención de microorganismos productores de exopolisacáridos (β- glucanos) y de aditivos alimentarios.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los exopolisacáridos (EPS) secretados por diversas bacterias tienen un papel importante como factores de adherencia, en las interacciones de las bacterias con las plantas como moléculas señalizadoras o como agentes protectores frente a situaciones de estrés o infecciones por fagos (van Kranenburg y cois. (1999) Curr. Opin. Biotech. 10: 498-504). Los EPS son producidos tanto por bacterias Gram -negativas como Gram-positivas. Algunos de estos polímeros poseen propiedades únicas que les hacen idóneos para ser utilizados como agentes estabilizadores, espesantes, gelificadores y emulsionantes. Se utilizan como aditivos en Ia fabricación de numerosos alimentos como derivados lácteos (yogures, batidos y helados), zumos y preparados a base de cereales. Entre los EPS más representativos producidos por las bacterias Gram-negativas podemos citar el xantano, producido por Xanthomonas campestris y empleado en cosmética en forma de goma como espesante, estabilizador y agente de suspensión (Becker y cois. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 145-152). También el acetano, producido por Acetobacter xylinum es utilizado para Ia producción de sucedáneos de Ia nata y del vinagre (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16:41-46). Además, polisacáridos capsulares producidos por Sphingomonas, que poseen propiedades reológicas son utilizados como agentes estabilizadores de los alimentos (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16: 41-46).
Las bacterias Gram-positivas y específicamente las bacterias ácido-lácticas (LAB) producen varios EPS de interés industrial. Un claro ejemplo son los dextranos producidos por Leuconostoc mesenteroides, empleados en Ia síntesis de matrices utilizadas en técnicas de cromatografía, pare el recubrimiento de superficies metálicas o para estabilizar jarabes. Además, algunas estirpes de LAB pertenecientes a los géneros Streptococcus, Lactobacillus y Lactococcus producen EPSs que están siendo utilizadas in situ para mejorar Ia textura de productos fermentados como el yogourt y el queso (de Vos (1999) Curr. Opin. Biotech. 10: 483-484). Sin embargo, en Ia actualidad Ia producción a gran escala de los EPSs de LAB es restringida debido a los bajos nivel producidos
(40-800 mg M de cultivo) en comparación con Xanthomonas campestris que puede producir de 10 a 25 g M o convertir del 60 al 70% del azúcar sustrato en xantano por cultivo continuo.
Por otra parte, se han realizado estudios que indican que los EPS producidos por las LAB poseen efectos beneficiosos para Ia salud humana como estimuladores del sistema inmunitario y por ello se ha propuesto Ia utilización de las estirpes productoras para obtener alimentos funcionales (JoIIy y cois. (2002) Antonie van Leeuwenhoek 82: 367-374). Además, algunos de los EPSs son β-glucanos y existen evidencias de que estos homopolisacáridos contribuyen a disminuir los niveles de colesterol sérico (Behall y cois. (1997) J. Am. College Nutr. 16:64-51. De ahi el interés de incorporar los β-glucanos a alimentos y preparados dietéticos y Ia necesidad de disponer de métodos eficientes para su producción a gran escala.
La caracterización estructural de los EPSs producidos por las estirpes aisladas de sidra P. damnosus 2.6 (Dueñas y cols.(1998) Carbohidr. Res. 303: 453-458), Lactobacillus sp. G77 (Dueñas y cois. (1997) Carbohidr. Res. 307: 125-133) y Oenococcus oeni 14 (resultados no publicados) revelaron que todas ellas sintetizan el mismo homopolisacárido del tipo β-D-glucano. Además, se ha demostrado, que tanto P. damnosus 2.6 como Lactobacillus sp. G77 pueden crecer y producir EPS durante Ia elaboración de alimentos fermentados basados en Ia avena, mejorando sus cualidades organolépticas (Olof Mártensson y cois. (2002) Nutrition Research 22: 1461 -1473).
En Ia actualidad, una elevada proporción de Ia población mundial adulta presenta intolerancia a Ia lactosa y se está creando una conciencia social sobre las reacciones alérgicas producidas por Ia leche y por Ia soja. La avena es un cereal que posee un alto valor nutritivo debido a su contenido en proteínas, vitamina E, ácidos grasos insaturados y minerales esenciales. Además, contiene un 4-6% de β-glucanos, que reducen los niveles de colesterol sérico en los seres humanos. Este efecto ha sido constatado en estudios clínicos sobre ingestión de alimentos basados en avena (ver detalles en htpp//www.adavena.com) y de hecho Ia FDA (Food and Drug Administration, USA) ha autorizado el etiquetado de "producto beneficioso para Ia salud" en preparados alimenticios basados en avena que contienen 0.75 g de fibra soluble (β glucano). La empresa Cereal Base (CEBA) (Lund, Suecia) está especializada en Ia producción de alimentos basados en cereales como alternativa a los productos lácteos. Ha desarrollado una tecnología denominada Adavena que ha permitido Ia obtención de una leche de avena con Ia que elabora productos como sucedáneos de yogures, postres lácteos, helados, etc. fermentados con LAB (Mártensson et al., 2002). Las propiedades nutritivas y dietéticas de estos preparados mejoran si se aumenta el contenido en β-glucanos de estos preparados, incorporando las bacterias productoras o bien por adición directa de esos polímeros.
Sin embargo, no se conocen los genes o vías metabólicas implicadas en esta producción de β-glucanos en microorganismos de potencial utilización en el sector alimentario.
DESCRIPCIÓN Descripción breve
Un objeto de Ia presente invención Io constituye una secuencia de DNA, en adelante secuencia de DNA gtí de Ia presente invención, proveniente de bacterias ácido lácticas GRAS
(Generally Recognized as Safe) y codificante de una proteina con actividad glicosiltransferasa que permite Ia producción de exopolisacaridos (EPS) y que está constituida por una de las secuencias de nucleótidos seleccionada entre: a) Ia secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID N09 o un fragmento de Ia misma; y b) una secuencia de nucleótidos análoga a Ia secuencia definida en a).
La invención también se refiere a un vector de expresión GTF que comprende Ia secuencia de DNA GTF de Ia invención, en adelante vector de expresión GTF de Ia invención, y que permite Ia transformación de microorganismos o células y Ia posterior obtención de microorganismos capaces de expresar Ia proteina GTF (SEQ ID N06) y que permita al huésped adquirir Ia capacidad, o mejorar Ia ya existente, de producir EPS.
Otro objeto de Ia presente invención es el uso de Ia secuencia de DNA GTF o del vector de expresión GTF en un proceso de transformación celular para Ia obtención de células GTF.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye una proteina con actividad glicosiltransferasa que está constituida por una de las secuencias de aminoácidos seleccionada entre: a) Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID N06 o un fragmento de Ia misma; y b) una secuencia de aminoácidos análoga a Ia secuencia definida en a).
Otro objeto de Ia invención Io constituye una célula, en adelante célula GTF de Ia presente invención, que comprende una secuencia de DNA GTF o un vector de expresión pGTF de Ia invención, capaz de expresar de forma recombinante Ia proteina GTF (SEQ ID N06) y que, por Io tanto, adquiere Ia capacidad, o mejora Ia ya existente, de producir EPS.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de las células GTF para producir EPSs mediante un procedimiento que comprende:
a) el crecimiento de Ia célula GTF en un medio adecuado y en condiciones que permitan Ia expresión del vector de expresión GTF o de Ia secuencia de DNA GTF, b) Ia producción de EPSs por Ia célula GTF de a), y c) Ia purificación de los EPS de b) Finalmente, otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de las células GTF en procesos de fermentación de alimentos, entre otros, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, pertenecientes al siguiente grupo: productos lácteos, bebidas alcohólicas y avena.
Descripción detallada
La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevas herramientas genéticas y biológicas que permitan Ia expresión de nuevas enzimas útiles para Ia producción de EPSs y Ia generación de microorganismos de valor industrial.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han identificado un gen gti codificante de una enzima con actividad glicosiltransferasa (GTF), a partir de material genómico de Pedioccocus damnosus 2.6. La expresión recombinante de este gen en
Streptococcus pneumoniae y en Lactococcus lactis demostró Ia actividad glicosiltrasferasa de Ia enzima codificada por dicho gen, asi como Ia posibilidad de transformar con éxito bacterias Gram- positivas, incluyendo bacterias ácido lácticas, con dicho gen que adquieren Ia capacidad de su expresión. Las cepas de bacterias lácticas pueden ser útiles para Ia obtención de EPSs para su uso posterior como aditivo en el sector alimentario, y, además, su posterior manipulación genética para conferirlas calidad GRAS puede permitir el uso de las mismas para Ia transformación de alimentos con nuevas propiedades. La sobreproducción de Ia GTF con actividad glicosiltransferasa podría permitir obtener dichos polímeros a gran escala para su incorporación como aditivos a alimentos y preparados dietéticos que poseen propiedades beneficiosas para Ia salud humana.
La comparación de Ia secuencia de dicho gen gtí con las depositadas en las bases de datos mostró Ia ausencia de homologías significativas. Sin embargo, al comparar Ia secuencia de Ia proteína GTF producto del gen gtf se observó que es homologa a las glicosiltranferasas de Ia familia COG1215. Además, Ia proteína GTF presenta una homología relativamente elevada (34%) con Ia proteína Tts de Streptococus pneumoniae, una glicosiltransferasa que es el único enzima requerido para Ia biosíntesis y secreción de un β-D-glucano similar al de P. damnosus (LIuI y cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061). Esta característica se contrapone con los complejos operones (compuestos por unos 10 genes) que codifican las proteínas requeridas para Ia síntesis
y secreción de los heteropolisacáridos y homopolisacáridos bacterianos utilizados actualmente a nivel industrial (JoIIy y Stingele (2001) Int. Dairy J. 11 : 733-745) y representa una clara e importante ventaja técnica. En consecuencia, una proteina con características similares a Ia Tts, pero proveniente de un microorganismo no patógeno y con calidad alimentaria tendría un potencial para Ia producción de β-D-glucanos por manipulación genética y de interés industrial.
El mismo equipo investigador ha observado, mediante Ia caracterización por PCR del gen gtf en distintas estirpes bacteriana productoras de β-D-glucano, de homo- o hetero-polisacáridos, que Ia proteina GTF está implicada específicamente en Ia biosintesis de homopolisacaráridos constituidos por β-D-glucano y no otro tipo de homo- o hetero-polisacáridos (ver solicitud de patente española "PROCEDIMENTO DE DETECCIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRODUCTORAS DE β-GLUCANOS" (2004)).
Asi, un objeto de Ia presente invención Io constituye una secuencia de DNA, en adelante secuencia de DNA GTF de Ia presente invención, proveniente de bacterias ácido lácticas GRAS y codificante de una proteina con actividad glicosiltransferasa que permite Ia producción de exopolisacaridos y que está constituida por una de las secuencias de nucleótidos seleccionada entre: a) Ia secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO9 o un fragmento de Ia misma; y b) una secuencia de nucleótidos análoga a Ia secuencia definida en a). En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de DNA que pueda ser aislada o construida en base a Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia SEQ. ID NO9, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo Ia inserción de uno o más nucleótidos, Ia adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia.
En general, una secuencia de DNA análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de nucleótidos identificada como Ia SEQ ID NO9. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La molécula de DNA GTF de Ia invención procede de P. damnosus 2.6 y puede encontrarse en formas parecidas en otros microorganismos, entre otros, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención: Lactobacillus sp. y Oenococcus oeni, donde pueden estar de
forma natural o en otro caso, también podrían estar como resultado de un proceso de transformación génica en el que el organismo transformado reproduzca dichas moléculas de DNA. La secuencia de DNA de Ia invención puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del DNA de cualquier microorganismo que Ia contenga, mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a Ia información de Ia secuencia de nucleótidos de dicha molécula de DNA, proporcionada en esta invención por un experto en Ia materia. Resultados obtenidos por el mismo equipo investigador indican que Ia producción de β-glucano por las estirpes Pediococcus damnosus 2.6, Lactobacillus sp G-77 y Oenococcus oeni 077 requiere Ia expresión del gen gtf, cuyas formas alélicas son prácticamente idénticas en todas las estirpes, aunque su localización genómica y los elementos reguladores de su expresión son diferentes en cada estirpe (ver solicitud de patente "PROCEDIMENTO DE DETECCIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRODUCTORAS DE β-GLUCANOS" (2004))
Por otro lado, a partir de Ia secuencia de DNA GFT de Ia presente invención un experto en Ia materia puede obtener otras deleciones o fragmentos proteicos derivados de esta proteina GTF o de sus formas homologas que mantengan su actividad glicosiltransferasa. Por tanto, Ia molécula de DNA de Ia invención incluye los fragmentos de Ia misma que presentan dicha actividad glicosiltransferasa.
En una realización particular, Ia secuencia de DNA GTF de Ia invención es una molécula de DNA de P. damnosus 2.6, y en concreto Ia SEQ ID N09. La secuencia de DNA GTF de Ia invención puede ser utilizada, en general, en Ia generación de un vector de expresión que permite Ia expresión de estas proteínas con actividad glicosiltransferasa en una amplia gama de células huésped.
Por tanto, Ia invención también se refiere a un vector de expresión GTF que comprende Ia secuencia de DNA GTF de Ia invención, en adelante vector de expresión GTF de Ia invención, y que permite Ia transformación de microorganismos o células y Ia posterior obtención de microorganismos capaces de expresar Ia proteína GFP (SEQ ID N06) y que permita al huésped adquirir Ia capacidad, o mejorar Ia ya existente, de producir EPS.
En general, el vector de expresión de Ia presente invención comprende, al menos, una secuencia de DNA GTF de Ia invención y, al menos, un promotor que dirige Ia transcripción del gen de interés, al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales, represores transcripcionales, secuencias de inserción, etc. Ejemplos
de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos y cósmidos con un origen de replicación bacteriano para que pueda ser amplificado en multicopia a partir de los elementos extra cromosómicos en bacterias o vectores integrativos para que pueda ser amplificado en monocopia a partir del cromosoma en bacterias, asi como un marcador utilizable para seleccionar las células transformadas diferente al gen de interés. La elección del vector dependerá de Ia célula hospedadora en Ia que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de DNA puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma de Ia célula huésped.
El vector de Ia invención puede ser obtenido por métodos convencionales conocidos por los técnicos en Ia materia (Sambrook y cois. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. CoId Sprig Harbour laboratory Press N.Y.). Un objeto particular de Ia presente invención Io constituye el plásmido pGTF que contiene Ia secuencia de DNA GTF de Ia presente invención (ver Ejemplo 2). Otro objeto de Ia presente invención es el uso de Ia secuencia de DNA GTF o del vector de expresión GTF en un proceso de transformación celular para Ia obtención de células GTF.
Otro objeto de Ia presente invención Io constituye una proteina con actividad glicosiltransferasa que está constituida por una de las secuencias de aminoácidos seleccionada entre: a) Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID N06 o un fragmento de Ia misma; y b) una secuencia de aminoácidos análoga a Ia secuencia definida en a). Otro objeto de Ia invención Io constituye una célula, en adelante célula GTF de Ia presente invención, que comprende una secuencia de DNA GTF o un vector de expresión pGTF de Ia invención, capaz de expresar de forma recombinante Ia proteina GTF (SEQ ID N06) y que, por Io tanto, adquiere Ia capacidad, o mejora Ia ya existente, de producir EPS.
Las células hospedadoras que se pueden transformar con dicho vector de expresión pueden ser, tanto células bacterianas Gram -positivas como Gram-negativas, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención LABs pertenecientes a los géneros Lactococcus Lactobacillus y Streptococcus como S. thermophilus, distintas subespecies de L lactis y Lactobacillus delbrueckii, subsp. bulgarícus, que son actualmente utilizados en Ia elaboración de productos lácteos.
Una realización particular de Ia presente invención Io constituye Ia célula GTF L lactis MG1363[pGTF] y Ia célula S. pneumoniae R61 [pGTF].
Las células GTF de Ia invención pueden ser utilizadas para Ia sobreproducción de EPSs para su posterior uso en las distintas posibles aplicaciones. Asi, otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de las células GTF para producir EPSs mediante un procedimiento que comprende: a) el crecimiento de Ia célula GTF en un medio adecuado y en condiciones que permitan Ia expresión del vector de expresión GTF o de Ia secuencia de DNA GTF, b) Ia producción de EPSs por Ia célula GTF de a), y c) Ia purificación de los EPS de b)
La purificación de los EPS producidos por las células GTF puede ser realizada por técnicas convencionales conocidas por un experto en Ia materia.
Como se ha indicado anteriormente los EPSs asi obtenidos pueden ser utilizados como agentes estabilizadores, espesantes, gelificadores y emulsionantes en múltiples procesos de manipulación, procesamiento y transformación de alimentos, por ejemplo, como aditivo en Ia fabricación de numerosos alimentos como derivados lácteos (yogures, batidos y helados), zumos y preparados a base de cereales), como sucedáneos de Ia nata y del vinagre (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16: 41-46), como agentes estabilizadores de los alimentos (Sutherland (1998) Trends Biotechnol. 16: 41-46), en cosmética en forma de goma como espesante, estabilizador y agente de suspensión (Becker y cois. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 145-152), y como material en Ia síntesis de matrices utilizadas en técnicas de cromatografía, pare el recubrimiento de superficies metálicas o para estabilizar jarabes.
Por otro lado, estos resultados permiten abrir nuevas posibilidades para transformar un sistema bacteriano GRAS, es decir, microorganismos - entre otros, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, estirpes de LAB pertenecientes a los géneros del siguiente grupo: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Oenococcus - que pueden ser utilizados en Ia industria alimentaria en procesos de fermentación de alimentos, entre otros, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, pertenecientes al siguiente grupo: productos lácteos, bebidas alcohólicas y avena, que permite Ia mejora de Ia textura de los productos fermentados, ej. yogourt y el queso (de Vos (1999) Curr. Opin. Biotech. 10: 483-484) o Ia mejora de sus cualidades organolépticas (Olof Mártensson y cois. (2002) Nutrition Research 22: 1461-1473).
Así, otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de las células GTF en procesos de fermentación de alimentos, entre otros, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, pertenecientes al siguiente grupo: productos lácteos, bebidas alcohólicas y avena.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Mapa físico del plásmido pGTF. Los símbolos genéticos utilizados son: gtf, codifica Ia glicosiltransferasa; gfp, codifica Ia proteína fluorescente verde; erm, codifica para Ia proteína responsable de Ia resistencia a eritromicina; malR, codifica para el represor transcripcional MaIR; PM, promotor de gtf y gfp; copG y repB, codifican las proteínas implicadas en Ia replicación del plásmido.
Figura 2.- Predicción de Ia estructura secundaria de Ia proteína GTF de P. damnosus 2.6 utilizando el programa SOSUI. Los colores de los aminoácidos corresponden a: negro, hidrofóbicos; azul, con cadena polar; azul y negrita, cargados positivamente; rojo, cargados negativamente.
Figura 3.- Detección en S. pneumoniae y en L. lactis de Ia expresión de gtf y gfp respectivamente por detección microscópica de aglutinación y por microscopía de fluorescencia. Contiene fotografías de cultivos celulares de las cepas de S. pneumoniae: R61[pLS1 RGFP] (A y B) y R61[pGTF] (C y D) y de L lactis : MG1363[pLS1 RGFP] y MG1363[pGTF] detectados por microscopía de contraste de fase (A, C, E y G) y por microscopía de fluorescencia (B, D, F y H).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1.-Clonaje y caracterización del gen gtfάe P. damnosus 2.6. El clonaje de Ia región 5' del gen se realizó por amplificación de PCR utilizando el DNA total de los plásmidos portados por P. damnosus 2.6 y los oligonucleótidos degenerados 5'- TAYGAYAAYACNCARGARGT-3' (Oligo I, SEQ ID N01) y δ'-ACRAARTARTCRTARTCRTG-S' (Oligo II, SEQ ID N02) (Y = T o C; W; R = A o G; N = A, C, G o T). Estos oligonucleótidos fueron diseñados en base a Ia secuencia de aminoácidos conservada de Ia glicosil transferasa de P. damnosus IOEB8801 (Walling et al. (2001) Lait 81: 289-300), ya que Ia secuencia de nucleótidos del gen codificante no ha sido publicada, ni depositada en los bancos de datos de secuencias de DNA. El fragmento amplificado de 1,8 kb fue clonado en el vector pCR 2.1 -TOPO (Invitrogen) y el plásmido recombinante obtenido fue establecido en Escherichia coli DH5α. La determinación de Ia secuencia de nucleótidos del fragmento de DNA reveló Ia existencia de un marco de lectura
abierta carente de su región amino terminal. La secuencia de DNA obtenida fue utilizada para sintetizar los oligonucleótidos 5'-ACGCCCTGCGTGTTATCATA-3' (SEQ ID N03) y 5'- TGTGTAATGGCACTCACGAC-3' (SEQ ID N04) y mediante reacción de PCR reversa se amplificó el extremo 5' del gen gft, que fue clonado utilizando el mismo vector, método y bacteria huésped que se emplearon para clonar el extremo 3' del gen. La secuencia de 3352 nucleótidos de las regiones clonadas se muestra en Ia SEQ ID N05 (nucleótidos 1-621 región 3' del gen mobA, nucleótidos 819-1085 gen hipotético 0RF1 y nucleótidos 1282-2982 del gen gtf -región CDS). El gen gft (SEQ ID NO 9) codifica Ia proteina GTF de 567 aminoácidos detallados en Ia SEQ ID N06. La comparación de Ia secuencia de DNA del gen gtf de P. damnosus con las depositadas en las bases de datos mostró Ia ausencia de homologías significativas. Sin embargo, al comparar Ia secuencia de Ia proteina (con Ia base de datos Swissprot) codificada por el gen gtf (GTF) se observó que es homologa a glicosiltranferasas de Ia familia COG1215. Además, Ia proteina GTF presenta una homología relativamente elevada (34%) con Ia proteína Tts de Streptococus pneumoniae, una glicosiltransferasa que es el único enzima requerido para Ia biosíntesis y secreción de un β-D-glucano similar al de P. damnosus (LIuI y cois (1999) J. Biol. Chem. 24:21053- 21061). Esta característica se contrapone con los complejos operones (compuestos por unos 10 genes) que codifican las proteínas requeridas para Ia síntesis y secreción de los heteropolisacáridos y homopolisacáridos bacterianos utilizados actualmente a nivel industrial (JoIIy y Stingele (2001) Int. Dairy J. 11: 733-745). En consecuencia, una proteína con características similares a Ia Tts, pero proveniente de un microorganismo no patógeno y con calidad alimentaria tendría un potencial para Ia producción de β-D-glucanos por manipulación genética y de interés industrial.
Resultados obtenidos por el mismo equipo investigador indican que Ia producción de β- glucano por las estirpes Pediococcus damnosus 2.6, Lactobacillus sp G-77 y Oenococcus oeni 077 requiere Ia expresión del gen gtf, cuyas formas alélicas son prácticamente idénticas en todas las estirpes, aunque su localización genómica y los elementos reguladores de su expresión son diferentes en cada estirpe (ver solicitud de patente española "PROCEDIMENTO DE DETECCIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRODUCTORAS DE β-GLUCANOS (2004))
Ejemplo 2.- Construcción del vector pGTF que permite Ia sobreexpresión de Ia proteína GTF de Pediococcus damnosus 2.6.
Como se ha comentado anteriormente, Ia homología de Ia GTF con Ia glicosiltransferasa Tts de S. pneumoniae (UuI y cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061) y que constituye Ia cápsula del serotipo 37 (UuI y cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061) indicaba que posiblemente Ia GTF es Ia única proteina responsable de Ia biosintesis del exopolisacárido de P. damnosus. Por este motivo, se procedió a construir como parte de esta invención el plásmido recombinante pGTF sobreproductor de GTF y que contiene Ia secuencia de DNA del gen gñ de Ia invención (SEQ ID NO9) (Figura 1). En el vector de expresión pLSIRGFP (Nieto y cois. (2000) Plasmid 43: 205-213) se clonó entre el promotor inducible PM y el gen reportero gfp un fragmento de DNA que incluye Ia región codificante del gen gtf. Para ello se amplificó Ia región que incluye el gen gti utilizando Ia DNA polimerasa Pfu (Stratagene) y utilizando como sustrato el DNA total de los plásmidos portados por P. damnosus 2.6 y los oligonucleótidos 5'- TCTAGAAATTAAAGGAATGTGTAA-3' (SEQ ID NO7) y 5'-
TCTAGATTAATCATTCCAATCAACTG-3' (SEQ ID NO8), que incluyen Ia secuencia de reconocimiento del enzima de restricción Xba\. El fragmento amplificado de 1,734 kb fue clonado, en Ia orientación correcta respecto al promotor PM en el sitio único Xba\ de pLSIRGFP y, posteriormente, el plásmido recombinante fue establecido en Ia estirpe no capsulada R61 de S. pneumoniae (estirpe R6 cuyo genoma ha sido secuenciado Hoskins y cois. (2001) J. Bacteriol. 183: 5709-5717 y que fue denominada R61 por el Dr. Sanford Lacks en: Lacks (1968) Genetics 60: 685-706) por transformación y selección de los transformantes por resistencia a 5 μg mi 1 de eritromicina (marcador de resistencia del plásmido vector) según se describe en Lacks (1968) Genetics 60: 685-706) obteniéndose Ia estirpe S. pneumoniae R61[pGTF]. El plásmido pGTF, que es capaz de replicar en bacterias Gram-positivas y Gram- gram positivas y negativas contiene una fusión transcripcional Pu-gtf-gfp, que permite una sobreexpresión por crecimiento de las células portadoras en medio conteniendo maltosa y una detección de Ia expresión desde el promotor PM por medida de Ia fluorescencia de Ia proteina GFP (Nieto y cois. (2000) Plasmid 43: 205-213).
Ejemplo 3. -Detección in vitro de Ia función de GTF integrada en membranas de S. pneumoniae.
La glicosiltransferasa Tts de S. pneumoniae es una proteina integral de membrana (LIuI y cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061). El análisis de Ia predicción de Ia localización topológica de Ia GTF de P. damnosus 2.6 utilizando el programa SOSUI
(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.ip/sosuiframeO.html ) reveló que el dominio catalítico de Ia
proteína (aminoácidos 83 a 377 está localizado en el citoplama bacteriano) y que existen seis regiones transmembranales: dos localizadas en el extremo amino terminal de Ia proteina precediendo al dominio catalítico de ésta y cuatro localizadas en su región carboxilo (Figura 2). Por los motivos antedichos se procedió a purificar membranas de las estirpes de S. pneumoniae R61 portadoras del plásmido pGTF o del plásmido vector pLSIRGFP y determinar Ia actividad glicosiltransferasa utilizando como sustrato UDP-glucosa. Para ello, células de las estirpes de S. peumoniae R61 [pLSIRGFP] (Nieto y cois. (2000) Plasmid 43: 205-213) y R61[pGTF] fueron crecidas en 1 I de medio Tood-Hewitt (Difco) suplementado con extracto de levadura al 0,5%, sacarosa al 0,1% y maltosa al 0,8% hasta una AΘSO de 0,4. Los cultivos de las dos estirpes mostraron un tiempo de duplicación similar (Tabla 1), indicando que Ia expresión de Ia fusión PM- gtf-gfp no tenía un efecto deletéreo para S. pneumoniae. La valoración de Ia expresión a partir del promotor PM se realizó mediante Ia determinación de Ia fluorescencia debida a Ia proteína GFP de 0,1 mi de los cultivos por espectrometría de fluorescencia (Nieto y cois. (2000) Plasmid 43: 205- 213). Los resultados obtenidos (Tabla 1) mostraron, que en las dos estirpes analizadas existía expresión de Ia proteína GFP siendo ligeramente inferior en Ia R61[pGTF] que en Ia estirpe portadora del vector, efecto observado en construcciones previas al intercalar un gen entre el promotor PM y el gen gfp (resultados no mostrados).
Para realizar Ia obtención de membrana requeridas para determinar Ia actividad glicosiltransferasa, las células presentes en 1 I litro de medio fueron sedimentadas por centrifugación a 12000 x g durante 20 minutos (min) a 40C y resuspendidas en el tampón A (70 mM Tris.HCI pH 7,0, 9 mM MgCI2 , 1 mM CaCI2) con 0.2 M fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y sedimentadas por centrifugación a 10000 x g durante 10 min a 40C. Las bacterias resuspendidas en el tampón A fueron sometidas a rotura mecánica pasándolas dos veces por una prensa de French (Aminco). El homogeneizado fue centrifugado a 12000 x g durante 15 min a 40C y el sobrenadante fue otra vez centrifugado a 12000 x g durante 30 min a 40C. Las membranas sedimentadas fueron resuspendidas en 2 mi de tampón A conteniendo 0.2 mM de PMSF y almacenadas a -8O0C. La concentración de proteínas de las preparaciones de membranas se determinó utilizando el sistema BCA Protein Assay (Pierce). La determinación de Ia actividad glicosiltransferasa fue realizada utilizando 30 μM (0.1 μCi) UDP-[14C]glucosa (actividad específica 333 mCi/mmol) en un tampón A suplementado con 50 mM NaCI en un volumen total de 100 μl y membranas en un rango de concentraciones comprendido entre 0,05 y 0,5 mg mi 1 de proteínas. Las reacciones se realizaron por incubación a 3O0C durante 15 min. Las reacción fue terminada por adición de SDS a una concentración final del 0,5% e incubación a 370C durante 15 min.
Seguidamente se adicionó seroalbumina bovina a una concentración final del 0,4% y 1 mi de ácido tricloroacético (TCA) al 10%. Después de una incubación durante 30 min a O0C, las mezclas se filtraron a través de filtros Wathman GF/A y fueron lavadas con 15 mi de TCA al 10%. Los filtros se secaron a 650C durante 20 min y Ia radioactividad presente en ellos se midió en un contador de centelleo (LKB Wallack). Los resultados obtenidos (Tabla 1) revelaron Ia existencia de actividad glicosiltransferasa en las membranas de las dos estirpes analizadas. Los niveles fueron aproximadamente 2,5 veces superiores en Ia estirpe R61[pGTF] en comparación con Ia estirpe control. Este incremento era presumiblemente debido a Ia actividad glicosiltransferasa de Ia GTF de P. damnosus. En el caso de Ia estirpe control R61[pLS1 RGFP] los niveles de actividad detectados podrían ser debidos a los productos de los genes cpoA y epsG cromosomales de S. pneumoniae, cuya función es desconocida, pero que por homología están propuestos como glicosiltransferasas en el banco de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) .
Tabla 1. Efecto de Ia inducción de Ia fusión Pm-gtf-gfp en el crecimiento, niveles de GFP y de actividad glicosiltransferasa en S. pneumoniae
1El tiempo de duplicación de las bacterias se calculó utilizando las medidad de Aβso durante el crecimiento.
2La fluorescencia de 0,1 mi de los cultivos previamente sedimentados y resuspendidos en 0,1 mi de tampón PBS pH
7,2 se midió en placas de microtítulo en un espectrofotómetro LS_50B (Perkin Elmer) mediante una excitación a una longitud de onda de 488 nm con una apertura de 5 y Ia detección de Ia fluorescencia se realizó a una longitud de onda de 511 nm con una apertura de 5.
3Los valores representan Ia media y Ia desviación estándar de 10 determinaciones empleando distintas concentraciones de membranas en el rango de 0.05 a 0.5 mg mi 1 de proteína. Una unidad de actividad glicosil transferasa corresponde a Ia cantidad de enzima que cataliza Ia incorporación en un producto macromolar de 1 pmol de glucosa por mg de proteína y por minuto.
Ejemplo 4.-Detección de Ia función de GTF In vivo en S. pneumoniae y L lactis.
Los resultados de detección de actividad glicosiltransferasa indicaban que el plásmido pGTF codifica Ia proteina GTF en forma activa. Ya que los anticuerpos desarrollados frente a Ia cápsula del serotipo 37 de S. pneumoniae son muy específicos y no reaccionan con estirpes no capsuladas o de otros serotipos de S. pneumoniae o con otras bacterias, se procedió a utilizar dichos anticuerpos para valorar in vivo Ia expresión funcional de Ia GTF de Pedíococcus tanto en
S. pneumoniae R61 [pGTF] como en Ia estirpe MG1363 de Lactococcus lactis (a Ia cual se había transferido el plásmido pGTF por transformación). La expresión funcional de Ia GTF fue determinada mediante Ia técnica de aglutinación utilizando anticuerpos desarrollados frente a Ia cápsula de S. pneumoniae serotipo 37 y por microscopía (LIuI y cois (1999) J. Biol. Chem. 24: 21053-21061). Células de las cepas de S. peumoniae R61[pLS1 RGFP] y R61[pGTF] fueron crecidas en medio Tood-Hewitt (Difco) suplementado con extracto de levadura al 0,5%, sacarosa al 0,1% y maltosa al 0,8% a una A65o de 0,4. Células de las cepas de L. lactis MG1363 [pLS1 RGFP] y MG1363[pGTF] fueron crecidas en medio Tood-Hewitt (Difco) suplementado con extracto de levadura al 0,5% y maltosa al 5% a una A66o de 0,5. Un mi de cada uno de los cultivos fue sedimentado por centrifugación y las células fueron resuspendidas en 100 μl de tampón PBS pH 8,0 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 140 mM NaCI, 3 mM KCI). Diez μl de cada uno de los cultivos fueron mezclados con 10 μl del anticuerpo desarrollado frente al serotipo 37 neumocócico (Statens Seruminstitut, Dinamarca) y mantenidos a 40C durante 2 horas. Las preparaciones fueron analizadas por microscopía de contraste de fase y fluorescencia utilizando un microscopio Zeiss Axioplan (Universal microcope) con filtros de fluorescencia de excitación Standard FITC set D480/30 y emisión TBP 460/530/610. Los resultados obtenidos aparecen recogidos en Ia Figura 3. La fluorescencia de Ia proteína GFP permitió detectar por microscopía de fluorescencia Ia existencia de expresión génica a partir del promotor PM de pLS1 RGFP y de pGTF en las células de S. pneumoniae (Figuras 3B y 3D) y L lactis (Figuras 3F y 3H) inducidas con maltosa. Las imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia y contraste de fase revelaron qué sólo las células de S. pneumoniae (Figuras 3C y 3D) y de L lactis (Figuras 3G y 3H) portadoras del plásmido pGTF e inducidas con maltosa eran capaces de aglutinar. Estos resultados muestran que pGTF confiere a S. pneumoniae y a L lactis Ia capacidad de sintetizar el exopolisacárido.
Claims
1.- Secuencia de DNA GTF caracterizada porque proviene de bacterias ácido lácticas GRAS, codifica una proteina con actividad glicosiltransferasa que permite Ia producción de exopolisacaridos (EPS) y porque está constituida por una de las secuencias de nucleótidos seleccionada entre: a) Ia secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID N09 o un fragmento de Ia misma; y b) una secuencia de nucleótidos análoga a Ia secuencia definida en a).
2.- Secuencia de DNA GTF según Ia reivindicación 1 caracterizada porque es Ia SEQ ID N09.
3.- Vector de expresión GTF caracterizado porque comprende Ia secuencia de DNA GTF según las reivindicaciones 1 y 2.
4.- Vector de expresión GTF según Ia reivindicación 3 caracterizado porque es el plásmido pGTF
5.- Uso de Ia secuencia de DNA GTF según las reivindicaciones 1 y 2 o del vector de expresión GTF según las reivindicaciones 3 y 4 en un proceso de transformación celular.
6.- Proteina con actividad glicosiltransferasa caracterizada porque está constituida por una de las secuencias de aminoácidos seleccionada entre: a) Ia secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID N06 o un fragmento de Ia misma; y b) una secuencia de aminoácidos análoga a Ia secuencia definida en a).
7.- Célula GTF caracterizada porque comprende una secuencia de DNA GTF según las reivindicaciones 1 y 2 o un vector de expresión pGTF según una de las reivindicaciones 3 y 4, capaz de expresar de forma recombinante Ia proteina GTF según Ia reivindicación 6 y, por Io tanto, adquiere Ia capacidad, o mejora Ia ya existente, de producir EPSs.
8.- Uso de las células GTF según Ia reivindicación 7 en un procedimiento para producir EPSs .
9.- Us o de las células GTF según Ia reivindicación 8 caracterizado porque el procedimiento comprende: a) el crecimiento de Ia célula GTF en un medio adecuado y en condiciones que permitan Ia expresión del vector de expresión GTF o de Ia secuencia de DNA GTF, b) Ia producción de EPSs por Ia célula GTF, y c) Ia purificación de los EPSs de b).
10.- Uso de las células GTF según Ia reivindicación 7 en procesos de fermentación de alimentos.
11.- Uso de las células GTF según Ia reivindicación 10 caracterizado porque los procesos de fermentación de alimentos pertenecen al siguiente grupo: productos lácteos, bebidas alcohólicas y avena.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05784933A EP1847598A1 (en) | 2004-09-11 | 2005-09-08 | Gtf cells, vectors and sequences and applications thereof in the food sector |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200402175A ES2251301B1 (es) | 2004-09-11 | 2004-09-11 | Secuencias, vectores y celulas gtf y sus aplicaciones en el sector alimentario. |
| ESP200402175 | 2004-09-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2006032718A1 true WO2006032718A1 (es) | 2006-03-30 |
Family
ID=36089879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/ES2005/070127 WO2006032718A1 (es) | 2004-09-11 | 2005-09-08 | Secuencias, vectores y células gtf y sus aplicaciones en el sector alimentario |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1847598A1 (es) |
| ES (1) | ES2251301B1 (es) |
| WO (1) | WO2006032718A1 (es) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112280795A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-01-29 | 昆明理工大学 | 糖基转移酶基因的用途 |
-
2004
- 2004-09-11 ES ES200402175A patent/ES2251301B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-09-08 WO PCT/ES2005/070127 patent/WO2006032718A1/es active Application Filing
- 2005-09-08 EP EP05784933A patent/EP1847598A1/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MARTENSSON O ET AL: "a fermented, ropy, non-dairy aot product based on the exopolysaccharide-producing strain pediococcus damnosus.", ADVANCES IN FOOD SCIENCES, vol. 24, no. 1, 2002, pages 4 - 11, XP008097080 * |
| MARTENSSON O ET AL: "Development of an oat-based sour milk-like product", ADVANCES IN FOOD SCIENCES, vol. 25, no. 3, 2003, pages 100 - 106, XP008097079 * |
| WALLING E GINDREAU E LONVAUD-FUNEL A: "La biosynthese d'exopolysaccharide par des souches de pediococcus damnosus isolées du vin: mise au point d'outils moleculaires de detection.", LAIT, vol. 81, no. 1-2, April 2001 (2001-04-01), pages 289 - 300, XP008097085 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112280795A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-01-29 | 昆明理工大学 | 糖基转移酶基因的用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1847598A1 (en) | 2007-10-24 |
| ES2251301A1 (es) | 2006-04-16 |
| ES2251301B1 (es) | 2007-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boels et al. | Functional analysis of the Lactococcus lactis galU and galE genes and their impact on sugar nucleotide and exopolysaccharide biosynthesis | |
| Horn et al. | Spontaneous mutation reveals influence of exopolysaccharide on Lactobacillus johnsonii surface characteristics | |
| CN111133112A (zh) | 唾液酸转移酶及其在生产唾液酸化低聚糖中的用途 | |
| Ouskova et al. | Hyaluronan release from Streptococcus pyogenes: export by an ABC transporter | |
| JP3862776B2 (ja) | 乳酸菌産生エキソポリサッカライド | |
| BRPI0706981A2 (pt) | seqüências de nucleotìdeos, vetor, células hospedeiras transformadas por vetor, proteìna codificada, dextrana sacarase truncada, proteìna de fusão, método de preparação de dextrana sacarase, método de produção de dextranas e/ou isomalto-oligossacarìdeos, dextrana, isomalto-oligossacarìdeos, composição, composição farmacêutica ou alimetìcia, composiçaõ de texturização, uso de dextrana sacarase, uso de dextrana e uso de dextrana ou imo | |
| EP2914274A1 (en) | Genetically-modified probiotic for treatment of phenylketonuria | |
| Griffin et al. | The cpsABCDE genes involved in polysaccharide production in Streptococcus salivarius ssp. thermophilus strain NCBF 2393 | |
| Nácher-Vázquez et al. | Dextransucrase expression is concomitant with that of replication and maintenance functions of the pMN1 plasmid in Lactobacillus sakei MN1 | |
| KR101718681B1 (ko) | 가용성 단백질 발현량 및 활성이 증대된 헬리코박터 파일로리 유래 α-1,3 푸코실 전달효소의 유전자와 단백질 및 α-1,3 푸코실올리고당 생산에의 응용 | |
| Böhmer et al. | Recombinant production of hyperthermostable CelB from Pyrococcus furiosus in Lactobacillus sp. | |
| KR101091138B1 (ko) | 류코노스톡 락티스로부터 유래된 글루칸수크라제 및 그 제조방법 | |
| EP0750043B1 (fr) | Bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides | |
| ES2251301B1 (es) | Secuencias, vectores y celulas gtf y sus aplicaciones en el sector alimentario. | |
| JP5248324B2 (ja) | 製品及び方法 | |
| WO2008053588A1 (fr) | Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci | |
| Skory et al. | Secreted expression of Leuconostoc mesenteroides glucansucrase in Lactococcus lactis for the production of insoluble glucans | |
| US7256029B2 (en) | Biopolymer thickener | |
| TWI221854B (en) | Lac shuttle vectors, kit for expression of a heterologous gene and DNA vaccine carrier containing the same | |
| Kang et al. | Production of Exopolysaccharides by Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 Expressing the eps Gene Clusters from Two Strains of Lactobacillus rhamnosus | |
| CN114761563A (zh) | 诱导型质粒自毁辅助重组 | |
| JP2007530034A (ja) | 新規のマンノース特異的アドヘシンとその使用 | |
| Soumya et al. | Nisin controlled homologous Over-expression of an exopolysaccharide biosynthetic glycosyltransferase gene for enhanced EPS production in Lactobacillus plantarum BR2 | |
| Zhao et al. | Effect of sugar transporter on galactose utilization in Streptococcus thermophilus | |
| TW202229318A (zh) | 具有發酵乳之牽絲性之提升作用之蛋白質、以及使用其之發酵乳及其製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AK | Designated states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW |
|
| AL | Designated countries for regional patents |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG |
|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2005784933 Country of ref document: EP |
|
| WWP | Wipo information: published in national office |
Ref document number: 2005784933 Country of ref document: EP |