WO2006030100A1 - Utilisations d'oligosaccharides prebiotiques benefiques pour la flore vaginale - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
Definitions
- the present invention relates to uses, especially in cosmetic or pharmaceutical compositions for vaginal use, of prebiotic oligosaccharides selected for their ability to promote the growth of beneficial endogenous vaginal bacterial strains.
- microbial flora or endogenous microflora
- endogenous microflora are characteristic of the species and the region of the body where they develop.
- certain microorganisms are known for their beneficial action on the skin or the vaginal mucosa, for example by maintaining a slightly acidic environment and / or by participating in the protection of the body against infections.
- pathogenic microorganisms usually have little or no presence on the skin or on the vaginal mucosa.
- Probiotics consist of exogenous living bacteria that are provided in particular by the diet and whose effects are favorable to the host organism.
- probiotic strains beneficial for the intestinal flora and used in humans are mainly bifidobacteria and lactobacilli. These bacteria play a favorable role on health by complementing the natural flora of the colon.
- the prebiotic ingredients are essentially oligosaccharides capable of selectively stimulating the growth and metabolic activity of endogenous bacterial strains for a beneficial effect on the host organism.
- the European patent EP 0 591 443 describes the use of oligosaccharides chosen from glucooligosaccharides, fructooligosaccharides, ⁇ - and ⁇ -galacto-oligosaccharides and mixtures thereof, which are metabolizable by beneficial strains of the cutaneous microflora or vaginal, but little or not metabolizable by pathogenic or opportunistic strains, to prepare compositions for promoting the development and growth of a beneficial skin or vaginal microflora.
- the Applicant has, in the context of the present invention, more particularly interested in prebiotic oligosaccharides likely to promote beneficial vaginal microflora.
- the Applicant has been able to select specific oligosaccharides with prebiotic properties particularly advantageous vis-à-vis the beneficial saprophytic flora of the vagina, consisting essentially of lactobacilli.
- the specific oligosaccharides selected by the Applicant are the fructooligosaccharide (FOS) of formula GF 2 and the glucooligosaccharides (GOS) comprising glucosidic linkages ⁇ (1 ⁇ 6) which may contain a glucoside bond of ⁇ (1 ⁇ 4) type at the end. reducing agent and having a degree of polymerization greater than or equal to 4.
- FOS fructooligosaccharide
- GOS glucooligosaccharides
- FOS GF 2 consists of a molecule of glucose and two molecules of fructose. It is a FOS of degree of polymerization 3 (DP3), commonly called 1-ketosis. This oligosaccharide is especially present in the mixture sold under the name Actilight ® (sold by Beghin-Meiji Industries, Paris, France).
- the FOS Actilight ® mixture is prepared from sucrose using a transfer enzyme, ⁇ -fructosyltransferase, in particular produced by Aspergillus niger or Aureobasidium pullulans (Hidaka et al., (1991), J. Carbohydrate Chemistry 10 ( 4), 509-522).
- GOS ⁇ (1 ⁇ 6) are short-chain glucans consisting of linear linkages of ⁇ -linked glycosides (1 ⁇ 6).
- these GOS are generally obtained by enzymatic glucose transglucosylation (P. Monsan and F. Paul (1995), FEMS Microbiology Reviews 16, 187-192), that is to say by enzymatic transfer of glucose from Sucrose on maltose using a glucosyltransferase from the bacterial species Leuconostoc mesenteroides, such as L. mesenteroides NRRL B-512F. This technique is well known to those skilled in the art.
- the Applicant has more precisely studied the beneficial saprophytic flora of the vagina and has thus been able to identify the following 3 lactobacilli:
- lactobacilli were isolated by the Applicant from healthy vaginal samples and were selected for their interesting probiotic properties, in particular: (i) high production of hydrogen peroxide, (ii) high production of lactic acid, (iii) adhesion to the vaginal mucosa, (iv) presence of arginine deaminase (see experimental section below). They have been identified from a taxonomic point of view by determination of the 16S RNA sequence by the Institut Pasteur (Lille, France).
- vaginal lactobacilli strains Given their ubiquitous presence in healthy endogenous vaginal flora and their probiotic properties of interest, these are beneficial vaginal lactobacilli strains that should be favored. development and growth.
- the present invention relates to cosmetic or pharmaceutical compositions comprising at least one oligosaccharide chosen from:
- GOS of linear structure comprising glycoside bonds of ⁇ (1 ⁇ 6) type, optionally containing a glucosidic linkage of ⁇ (1 ⁇ 4) type at the reducing end, with a degree of polymerization (DP) greater than or equal to at 4; and
- the DP of ⁇ GOS (1 ⁇ 6) will preferably be between 4 and 10, and more preferably 4, 5, 6 or 7.
- the pharmaceutical composition comprises and / or is constituted by at least the linear GOS ⁇ (1 ⁇ 6), where appropriate containing an ⁇ (1 ⁇ 4) bond at the reducing end of DP equal to at least 4.
- the compositions of the invention make it possible to maintain a favorable environment for the development of the beneficial endogenous vaginal flora.
- compositions according to the invention are intended for the treatment of the vaginal mucosa, and more particularly for the treatment or prevention of bacterial vaginosis.
- compositions according to the invention are hygiene products.
- the amount of oligosaccharide (s) present in the composition of the invention may range from about 0.1% by weight to 20% and more preferably about 1 to 10% by weight, more preferably, from about 1 to 5% by weight. Below 0.1% by weight, the effect of the oligosaccharide (s) generally becomes negligible. On the other hand, there are generally no particular advantages in incorporating more than about 20% by weight of oligosaccharide (s), although this is quite possible. Very often, economic considerations lead to limiting the amount of oligosaccharide (s) to about 20% by weight, preferably about 10% by weight, and more preferably to about 5% by weight.
- the oligosaccharide component is in fact a mixture of oligosaccharides chosen from the abovementioned oligosaccharides, insofar as the manufacturing processes of these structures produce such mixtures.
- compositions of the invention may contain the ingredients usually incorporated in such compositions. It goes without saying of course that it is necessary to avoid incorporating into the compositions ingredients whose properties would interfere with the desired goal, which is to promote the development of beneficial vaginal microflora and the maintenance of acidic conditions.
- ionic surfactants such as sodium lauryl sulphate, whose bactericidal properties are well known.
- a surfactant such as sodium lauryl sulphate, whose bactericidal properties are well known.
- a nonionic surfactant such as an alkyl glucoside, will be used instead. or a dialkyl ester.
- compositions of the invention incorporating in the compositions of the invention a small proportion (for example less than about 1% by weight) of preservative having a bacteriostatic action and, optionally, anti ⁇ fungal can be tolerated, or even be advantageous, for allow the preservation of said compositions for long periods.
- compositions of the invention contain an acid buffer adjusting the pH of the composition in the range from 4 to 7, preferably from 4.5 to 6, such as a lactic acid / sodium lactate buffer, so that promote rapid reimplantation of the microflora.
- an acid buffer adjusting the pH of the composition in the range from 4 to 7, preferably from 4.5 to 6, such as a lactic acid / sodium lactate buffer, so that promote rapid reimplantation of the microflora.
- the oligosaccharides may be incorporated into any type of composition suitable for topical application to the vagina, such as liquid soap, vaginal gel, etc., intravaginal cannula or ovum, or any suitable medical device.
- it is a canula or ovule for intra-vaginal use.
- Such a composition is more particularly intended for the prevention and to the treatment of bacterial vaginosis, by a stimulating effect / reconstitution of the resident lactic flora by a direct effect of an oligosaccharide of well-defined structure.
- compositions can be prepared easily by the techniques commonly used in the field considered here.
- the present invention relates to the use of at least one oligosaccharide chosen from the oligosaccharides selected by the Applicant for the preparation of a composition, preferably intended for the treatment of the vaginal mucosa, aimed at promoting the development and the growth of a beneficial vaginal microflora.
- said oligosaccharide is GOS ⁇ (1 ⁇ 6), where appropriate containing an ⁇ (1 ⁇ 4) bond at the reducing end, of DP equal to at least 4.
- Such microflora comprises in particular lactobacilli and, preferably, at least one lactobacillus chosen from the following lactobacilli: Lactobacillus sp. oral clone (or L. vaginalis) registered on 29/07/04 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number 1-3255; L crispatus registered on 20/12/01 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under number I-2769; L jensenii registered on 29/07/04 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number I-3256; and L gasseri registered on 25/08/05 at the CNCM under number I-3495.
- lactobacilli Lactobacillus sp. oral clone (or L. vaginalis) registered on 29/07/04 at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number 1-3255; L crispatus registered on 20/12/01 at the
- said composition is intended to prevent or treat bacterial vaginosis.
- composition thus prepared is also particularly useful for a cosmetic application, which is essentially local.
- Other aspects and advantages of the present invention will become apparent from the detailed experimental description hereinafter, including examples provided for illustrative purposes only.
- Fructooligosaccharides 1-1 Fructooligosaccharides (FOS)
- FOS are short chain fructo-oligosaccharides consisting of fructose molecules and may contain a glucose molecule at one end (depending on the origin of the FOS). FOS occur naturally in a number of plants such as onions, tomatoes, artichokes, bananas, starches, asparagus, leeks, wheat, rye and garlic. .
- FOS can be produced industrially by two different processes: - Raftilose ® FOS (Orafti, Belgium) originating from the hydrolysis of chicory inulin; there are also other producers of this type of FOS,
- FOS Raftilose ® is obtained from chicory root inulin partially hydrolyzed by a specific endoinulinase.
- Inulin is a linear polymer of fructose bound in / 2-1 with at one end a glucose bound in ⁇ - ⁇ 2.
- FOS Actilight ® is produced from sucrose and an enzyme, ⁇ ⁇ fructosyl transferase according to the following enzymatic mechanism:
- fructosyltransferase n (Fru-Glc) ⁇ (Fm) n-1 - Fru - GIc + (n-I) GIc ⁇ 2- ⁇ 1 ⁇ 2-1 ⁇ 2- ⁇ 1 sucrose FOS Actilight ®
- Fructosyl transferase is produced by Aspergillus niger or Aureobasidium pullulans (Hidaka et al (1991)).
- FOS Actilight ® is then purified by chromatography.
- the FOS Actilight ® consists of 3 molecules:
- DP3 - G-F2 (DP3) containing a glucose molecule and two fructose molecules
- DP4 - G-F3 (DP4) containing a molecule of glucose and 3 molecules of fructose
- GOS are short-chain gluco-oligosaccharides consisting of a sequence of glucose units linked at a -6 and which may also contain ⁇ 1-2, ⁇ 1-3 and ⁇ 1-4 bonds (Monsan and Paul, 1995).
- GOS alpha 1-6 is a linear gluco-oligosaccharide consisting of a chain of glucose units linked together by alpha 1-6 bonds. It is obtained by an enzymatic transglucosylation reaction from a donor, sucrose, on an acceptor which may be glucose, methyl alpha-glucoside, isomaltose, isomaltotriose and maltose. This reaction is catalyzed by Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 (F) glucosyltransferase according to the following reaction:
- the acceptor used is maltose (disaccharide glucosyl ⁇ 1-4glucose).
- GOS ⁇ 1-6 oligosaccharides therefore all contain the glycosidic linkage ⁇ 1-4 of the maltose acceptor at their reducing end.
- GOS ⁇ 1-2 / 1-6 consists of a sequence of ⁇ 1-6 linked glucose residues containing ⁇ 1-2 linkages (branch point or non-reducing end). It is obtained by the same process as that used for the production of GOS ⁇ 1-6, but the enzyme used is produced by another strain, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299.
- Vaginal strains were selected from a population of 1000 menstruated women and aged 18 to 40 years according to 3 criteria:
- strains are representative of the flora of Doderlein (endogenous protective lactic flora natural vaginal mucosa). They have been selected for their ability to produce hydrogen peroxide, rapidly acidify the culture medium and adhere strongly to the cells of the vaginal mucosa.
- the selected strains are those that cause the most frequent pathologies of the urogenital system, namely:
- Candida albicans (strain ATCC 2091), responsible for some vaginitis
- Gardnerella vaginalis strain from clinical isolation, responsible for bacterial vaginosis.
- FOS Actilight ® 950P (supplied by BEGHIN-MEIJI (France)).
- Table 1 Structure and composition of the oligosaccharides tested.
- microflora growth is monitored over time by different parameters: - turbidity of the fermentation medium (measurement of turbidity at 640 nm),
- Lactobacilli produce lactic acid which is one of the defenses of the vaginal ecosystem against the colonization of pathogens. The latter is determined according to an enzymatic method.
- Table 2 shows for each strain the culture medium used and the incubation conditions. Table 2. Culture media and incubation conditions for each strain.
- the fermentation medium is supplemented with the oligosaccharide to be tested at a concentration of 10 g / l.
- the inoculation of the culture is carried out with a volume of the preculture equal to 2% of the volume of the culture. The incubation lasts 48 hours at 37 ° C.
- a control fermentation with each specific culture medium used containing 10 g / L glucose instead of 10 g / L oligosaccharide is also performed.
- Blood is added after sterilizing the broth by heat.
- the turbidity of the microbial culture is evaluated by spectrophotometry at 640 nm, diluted 1/10 th (He ⁇ ios ⁇ - Thermospectronic, UK).
- the kinetics of increase in turbidity then makes it possible to calculate the physiological growth parameters for each strain as a function of the oligosaccharide.
- the generation time is determined by the LISEXEL software (Jean-Louis Uribelarrea, DGBA-INSA, Toulouse, France).
- a pre-culture count is performed, as well as every 24 hours on the crop in order to estimate the population throughout the fermentation.
- This cell count of Malassez also makes it possible to check the purity of the crop.
- the lactic acid present in the fermentation supernatants (after centrifugation of the culture medium for 5 min at 12 000 g to eliminate the bacteria) is assayed using an enzymatic kit (Enzytec TM D / L-lactic acid, Diffchamb , France).
- the fermentation media used being complex, many peaks appear on the chromatographic profile and interfere with the interpretation of oligosaccharides.
- the samples are demineralized beforehand using ion exchange resins. 2 types of SPE cartridges were used:
- HPLC analysis conditions developed for studying the consumption of sugars by microflora are defined in Table 4. Table 4. HPLC analysis conditions according to the sugars studied
- the detection is done by refractometry.
- the panose, or GOS ⁇ -1, 6 / ⁇ -1,4 of DP equal to 3 has the following formula:
- the FOS Raftilose ® is almost not consumed and therefore does not allow sufficient growth of the strains.
- oligosaccharides containing at least one ⁇ 1-2 bond, are not consumed by lactobacilli. This type of binding is not hydrolysable by bacterial enzymes.
- GOS ⁇ 1-6 is particularly well consumed by the 3 strains I-2769, I-3256 and I-3495. It provides a good level of growth and lactic acid production.
- FOS Actilight ® and GOS ⁇ 1-6 are not consumed by the 3 pathogens of the urogenital system.
- These 2 oligosaccharides thus have a remarkable prebiotic potential with respect to the beneficial vaginal flora (so-called Doderlein flora), because they constitute a growth substrate for this flora that is both very effective and very specific.
- composition comprising at least or consisting of the linear GOS # -1.6 / ⁇ -1, 4 of DP equal to 4 and, where appropriate, comprising and / or being constituted by furthermore GOS ⁇ -1, 6 / ⁇ -1, 4 of DP> 4, promotes the growth of a beneficial vaginal microflora.
- FOS Actilight ® / GOS ⁇ 1-6 / lactic acid mixture is well consumed by the 3 probiotic strains tested, whereas it is not used by the pathogenic strains. Given these results, it is clear that the GOS ⁇ 1 -6 (> DP4) and FOS Actilight ® (DP 3) are prebiotic oligosaccharides specific vis-a-vis the beneficial vaginal flora. All intestinal prebiotic oligosaccharides, and in particular those described in EP 591 443, are therefore not usable in the context of the present invention.
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Abstract
La présente invention se rapporte aux utilisations, notamment dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques à usage vaginal, d'oligosaccharides prébiotiques sélectionnés pour leur capacité à favoriser la croissance de souches bactériennes vaginales endogènes bénéfiques.
Description
Utilisations d'oiigosaccharides prébiotiques bénéfiques pour la flore vaginale
La présente invention se rapporte aux utilisations, notamment dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques à usage vaginal, d'oiigosaccharides prébiotiques sélectionnés pour leur capacité à favoriser la croissance de souches bactériennes vaginales endogènes bénéfiques.
L homme et les animaux sont l'hôte de populations de microorganismes qui se développent naturellement tant à la surface que dans les cavités de leur corps. Ces flores microbiennes, ou microflores endogènes, sont caractéristiques de l'espèce et de la région du corps où elles se développent. En contact étroit avec leur hôte, certains microorganismes sont connus pour leur action bénéfique sur la peau ou la muqueuse vaginale, par exemple en maintenant un environnement légèrement acide et/ou en participant à la protection de l'organisme vis-à-vis d infections par des microorganismes pathogènes habituellement peu ou pas présents sur la peau ou sur la muqueuse vaginale.
On recherche, depuis bon nombre d'années, des composés, aliments ou ingrédients dits « santé » en ce qu'ils sont capables de favoriser le développement de la flore locale saine, par opposition à la flore pathogène. Les concepts suivants ont ainsi été développés :
a) Les probiotiques sont constitués par des bactéries vivantes exogènes qui sont apportées notamment par l'alimentation et dont les effets sont favorables à l'organisme hôte. Par exemple, les souches probiotiques bénéfiques pour la flore intestinale et utilisées chez l'homme (laits fermentes et compléments alimentaires) sont principalement des bifidobactéries et des lactobacilles. Ces bactéries jouent un rôle favorable sur la santé en complémentant la flore naturelle du colon.
b) Les ingrédients prébiotiques sont essentiellement des oligosaccharides capables de stimuler de manière sélective la croissance et l'activité métabolique de souches bactériennes endogènes pour un effet bénéfique sur l'organisme hôte. A titre d'exemple, on citera notamment les galacto- et les fructo- oligosaccharides, l'inuline ou encore des amidons résistants.
Afin de préserver l'homme et la femme vis-à-vis d'infections microbiennes, notamment bactériennes, diverses et parfois sévères, et outre les moyens pharmaceutiques et thérapeutiques actuels, tels que les antibiothérapies, moyens plus ou moins contraignants et parfois pourvus d'effets secondaires gênants, les industriels cherchent à mettre au point des soins, qui permettent de créer un milieu favorable au développement de la flore endogène bénéfique et d'orienter le métabolisme de I ensemble de la microflore endogène, de sorte que cette dernière participe au maintien du bon équilibre physico-chimique de la peau et des muqueuses, tout en ne favorisant pas concomitamment le développement de microorganismes pathogènes.
Par exemple, le brevet européen EP 0 591 443 décrit l'utilisation d'oligosaccharides choisis parmi les glucooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les α- et β-galacto-oligosaccharides et leurs mélanges, qui sont métabolisables par des souches bénéfiques de la microflore cutanée ou vaginale, mais peu ou pas métabolisables par des souches pathogènes ou opportunistes, pour préparer des compositions destinées à favoriser le développement et la croissance d'une microflore cutanée ou vaginale bénéfique.
_n38Ce brevet décrit en particulier les applications cosmétiques de telles compositions.
La Demanderesse s'est, dans le cadre de la présente invention, plus particulièrement intéressée aux oligosaccharides prébiotiques
susceptibles de favoriser la microflore vaginale bénéfique.
Grâce aux résultats issus de ses travaux de recherche, la Demanderesse a pu sélectionner des oligosaccharides spécifiques dotés de propriétés prébiotiques particulièrement avantageuses vis-à-vis de la flore saprophyte bénéfique du vagin, essentiellement constituée de lactobacilles.
Les oligosaccharides spécifiques sélectionnés par la Demanderesse sont le fructooligosaccharide (FOS) de formule GF2 et les glucooligosaccharides (GOS) comprenant des liaisons glucosidiques α(1→ 6) pouvant contenir une liaison glucosidique de type α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, et de degré de polymérisation supérieur ou égal à 4.
Le FOS GF2 est constitué d'une molécule de glucose et de deux molécules de fructose. Il s'agit d'un FOS de degré de polymérisation 3 (DP3), communément appelé 1-cétose. Cet oligosaccharide est notamment présent dans le mélange commercialisé sous la désignation Actilight® (vendu par Beghin-Meiji Industries, Paris, France). Le mélange FOS Actilight® est préparé à partir de saccharose à l'aide d'une enzyme de transfert, la β-fructosyltransférase, notamment produite par Aspergillus niger ou Aureobasidium pullulans (Hidaka et al. (1991), J. Carbohydrate Chemistry 10 (4), 509-522).
Les GOS α(1→ 6) sont des glucanes à courte chaîne constitués d'enchaînements linéaires de glucoses liés en α(1→ 6). Au niveau industriel, ces GOS sont généralement obtenus par transglucosylation enzymatique du glucose (P. Monsan et F. Paul (1995), FEMS Microbiology Reviews 16, 187-192), c'est-à-dire par transfert enzymatique du glucose à partir du saccharose sur le maltose à l'aide d'une glucosyltransférase provenant de l'espèce bactérienne Leuconostoc mesenteroides, telle que L. mesenteroides NRRL B-512F. Cette technique est bien connue de l'homme du métier.
Conformément à la description expérimentale qui suit, la Demanderesse a pu démontrer que ces oligosaccharides particuliers représentent des substrats carbonés spécifiques de la flore saprophyte bénéfique du vagin, et sont à ce titre capables de favoriser l'effet barrière vis-à-vis de microorganismes pathogènes responsables d'infections urogénitales souvent récidivantes.
A cet égard, la Demanderesse a plus précisément étudié la flore saprophyte bénéfique du vagin et a ainsi pu identifier les 3 lactobacilles suivants :
- Lactobacillus sp. oral clone (ou L vaginalis) enregistrée le
29/07/2004 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Institut Pasteur, France) sous le numéro 1-3255;
- L crispatus enregistrée le 20/12/2001 à la CNCM sous le numéro I- 2769; et
- L. jensenii enregistrée le 29/07/2004 à la CNCM sous le numéro I- 3256.
Ces 3 souches de lactobacilles ont été isolées par la Demanderesse à partir de prélèvements vaginaux sains et ont été sélectionnées pour leurs propriétés probiotiques intéressantes, notamment : (i) forte production de peroxyde d'hydrogène, (ii) forte production d'acide lactique, (iii) adhésion à la muqueuse vaginale, (iv) présence d'arginine désaminase (voir partie expérimentale ci-dessous). Elles ont été identifiées d'un point de vue taxonomique par détermination de la séquence de l'ARN 16S par l'Institut Pasteur (Lille, France).
De plus, une souche de l'espèce Lactobacillus gasseri enregistrée le 25/08/05 à la CNCM sous le numéro I-3495, présente fréquemment dans la flore de Doderleïn (Tarnberg et al. (2002), Acta Pathologica
Microbiologica et Immunologica Scandinavica 110 (11), 802-810) a également été étudiée vis-à-vis de son aptitude à utiliser les oligosaccharides sélectionnés comme source de carbone.
Compte tenu, d'une part de leur présence ubiquitaire au niveau de la flore vaginale endogène saine, et d'autre part de leurs propriétés probiotiques d'intérêt, il s'agit là de souches de lactobacilles vaginales bénéfiques, dont il convient de favoriser le développement et la croissance.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques comprenant au moins un oligosaccharide choisi parmi :
- le FOS de formule GF2 (1-cétose), où G est un résidu de glucose et F un résidu de fructose ;
- les GOS de structure linéaire comprenant des liaisons glucosidiques de type α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison glucosidique de type α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, de degré de polymérisation (DP) supérieur ou égal à 4 ; et
- leurs mélanges.
Le DP des GOS α(1→ 6) sera compris de préférence entre 4 et 10, et de manière encore préférée, 4, 5, 6 ou 7.
De manière encore préférée, la composition pharmaceutique comprend et/ou est constituée par au moins le GOS linéaire α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison α(1→ 4) à l'extrémité réductrice de DP égal à au moins 4.
Ainsi, grâce à la présence d'un ou plusieurs des oligosaccharides susmentionnés, les compositions de l'invention permettent de maintenir un milieu favorable au développement de la flore vaginale endogène bénéfique.
De préférence, les compositions selon l'invention sont destinées au traitement de la muqueuse vaginale, et plus particulièrement au traitement ou à la prévention d'une vaginose bactérienne.
Selon une autre préférence, les compositions selon l'invention sont des produits d'hygiène.
La quantité d'oligosaccharide(s) présente dans la composition de l'invention peut aller d'environ 0,1 % en poids à 20 % et plus, de préférence d'environ 1 à 10 % en poids, de manière encore préférée, d'environ 1 à 5 % en poids. En dessous de 0,1 % en poids, l'effet du ou des oligosaccharides devient le plus souvent négligeable. Par ailleurs, il n'y a généralement pas d'avantages particuliers à incorporer plus d'environ 20 % en poids d'oligosaccharide(s), bien que cela soit tout à fait possible. Bien souvent, des considérations d'ordre économique amènent à limiter la quantité d'oligosaccharide(s) à environ 20 % en poids, de préférence à environ 10 % en poids, et plus préférentiellement à environ 5 % en poids.
Très avantageusement, le constituant oligosaccharide est en fait un mélange d'oligosaccharides choisis parmi les oligosaccharides susmentionnés, dans la mesure où les procédés de fabrication de ces structures produisent de tels mélanges.
Outre le constituant oligosaccharide, les compositions de l'invention peuvent contenir les ingrédients habituellement incorporés dans ce genre de compositions. Il va de soi évidemment qu'il convient d'éviter d'incorporer aux compositions des ingrédients dont les propriétés
interféreraient avec le but recherché, qui est de favoriser le développement de la microflore vaginale bénéfique et le maintien de conditions acides.
A cet égard, il convient d'éviter d'incorporer des ingrédients bactéricides en des proportions qui annihileraient la microflore endogène ou des ingrédients conférant à la composition un caractère basique prononcé.
Par exemple, il serait préférable d'éviter d'utiliser de fortes proportions d'agents tensio-actifs ioniques, tels que le laurylsulfate de sodium, dont les propriétés bactéricides sont bien connues. Si l'on souhaite incorporer une forte proportion d'un agent tensio-actif dans la composition (par exemple dans le cas d'un savon liquide), on utilisera plutôt un agent tensio-actif non-ionique, tel qu'un alkyl glucoside ou un ester de dialkyle.
Cependant, incorporer aux compositions de l'invention une faible proportion (par exemple moins d'environ 1 % en poids) d'agent conservateur ayant une action bactériostatique et, éventuellement, anti¬ fongique peut être toléré, voire même se révéler avantageux, pour permettre la conservation desdites compositions pendant de longues périodes.
Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent un tampon acide ajustant le pH de la composition dans la gamme de 4 à 7, de préférence de 4,5 à 6, tel qu'un tampon acide lactique/lactate de sodium, de façon à favoriser la réimplantation rapide de la microflore.
Les oligosaccharides peuvent être incorporés à n'importe quel type de composition appropriée pour une application locale au niveau du vagin, telle que savon liquide, gel vaginal, etc., canule ou ovule à usage intra- vaginal, ou tout dispositif médical adapté.
De préférence, il s'agit d'un canule ou ovule à usage intra-vaginal.
Une telle composition est plus particulièrement destinée à Ia prévention et
au traitement des vaginoses bactériennes, par un effet de stimulation/reconstitution de la flore lactique résidente par effet direct d'un oligosaccharide de structure bien déterminée.
Ces compositions peuvent être préparées facilement par les techniques couramment en usage dans le domaine ici considéré.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un oligosaccharide choisi parmi les oligosaccharides sélectionnés par la Demanderesse pour la préparation d'une composition, de préférence destinée au traitement de la muqueuse vaginale, visant à favoriser le développement et la croissance d'une microflore vaginale bénéfique.
De préférence, ledit oligosaccharide est le GOS α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, de DP égal à au moins 4.
Une telle microflore comprend en particulier des lactobacilles et, de préférence, au moins un lactobacille choisi parmi les lactobacilles suivants : Lactobacillus sp. oral clone (ou L. vaginalis) enregistrée le 29/07/04 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-3255; L crispatus enregistrée le 20/12/01 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-2769; L jensenii enregistrée le 29/07/04 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I- 3256 ; et L gasseri enregistrée le 25/08/05 à la CNCM sous le numéro I- 3495.
De préférence, ladite composition est destinée à prévenir ou à traiter une vaginose bactérienne.
La composition ainsi préparée est également particulièrement utile pour une application cosmétique, essentiellement locale.
D'autres aspects et avantages de la présente invention ressortiront de manière claire de la description expérimentale détaillée ci-après, comprenant des exemples fournis à titre purement illustratif.
PARTIE EXPERIMENTALE
I- Les oligosaccharides
1-1 Les fructo-oligosaccharides (FOS)
Les FOS sont des fructo-oligosaccharides à courte chaîne constitués de molécules de fructose et pouvant contenir une molécule de glucose à l'une des extrémités (en fonction de l'origine du FOS). Les FOS existent à l'état naturel dans un certain nombre de plantes comme l'oignon, la tomate, l'artichaut, la banane, le topinamb.our, l'asperge, le poireau, le blé, le seigle et l'ail.
Les FOS peuvent être produits industriellement par 2 procédés différents : - le FOS Raftilose® (Orafti, Belgique) provenant de l'hydrolyse de l'inuline de chicorée; il existe également d'autres producteurs de ce type de FOS,
- le FOS Actilight® (Béghin Meiji, France) obtenu par synthèse enzymatique.
o Le FOS Raftilose ®1
Le FOS Raftilose® est obtenu à partir de l'inuline de racine de chicorée hydrolysée partiellement par une endoinulinase spécifique. L'inuline est un polymère linéaire de fructose lié en /?2-1 avec à l'une des extrémités un glucose lié en αλ- β2.
endoinulinase
(Fra)n- Fru- Glc ^ (Fru)m - Fru - Fm + (Fru)p - Fru - GIc β2-l β2-αl β2-l β2-l β2-l β2-αl inuline FOS Raftilose®
GIc = résidu glucoside / Fru = résidu fructoside β2-αl = liaison de type β-(2ol)-α / β2-l = liaison de type β-(2→l) n » m > p
Mode de production du FOS Raftilose ®
A partir d'inuline dont le degré de polymérisation (DP) varie de 2 à 60 environ, un mélange d'oligofructoses (DP2 à DP7) ainsi que quelques résidus de glucose, fructose et saccharose sont obtenus.
-1
Structure du FOS Raftilose ®
o Le FOS Actilight®
Le FOS Actilight® est produit à partir de saccharose et d'une enzyme, la β~ fructosyl transférase selon le mécanisme enzymatique suivant :
fructosyltransférase n (Fru-Glc) ^ (Fm)n-1 - Fru - GIc + (n- I) GIc β2-αl β2-l β2-αl saccharose FOS Actilight®
GIc = résidu glucoside ou glucose / Fm = résidu fructoside β2-αl = liaison de type β-(2<-»l)-α / β2-l = liaison de type β-(2→l)
Synthèse enzymatique du FOS Actilight®
La fructosyl-transférase est produite par Aspergillus niger ou Aureobasidium pullulans (Hidaka ét al. (1991)).
A partir de n molécules de saccharose, un mélange de saccharose, glucose et de fructooligosaccharides est obtenu. Le FOS Actilight® est ensuite purifié par chromatographie. Le FOS Actilight® est constitué de 3 molécules :
- G-F2 (DP3) contenant une molécule de glucose et deux molécules de fructose, - G-F3 (DP4) contenant une molécule de glucose et 3 molécules de fructose,
- G-F4 (DP5) contenant une molécule de glucose et 4 molécules de fructose (Bornet, Industries Alimentaires et Agricoles Juillet-Août (2001 ), pages 74-80).
Structure du FOS Actilight .©
G-F3 G-F4
Nystose Fructosyl
1-2 Les gluco-oligosaccharides (GOS)
Les GOS sont des gluco-oligosaccharides à courte chaîne constitués d'un enchaînement d'unités glucose liées en a^-6 et pouvant contenir également des liaisons α1-2, α1-3 et σ1-4 (Monsan et Paul, 1995).
o Le GOS a1-6
Le GOS alpha 1-6 est un gluco-oligosaccharide linéaire constitué d'un enchaînement d'unités glucose liées entre elles par des liaisons alpha 1-6. Il est obtenu par une réaction de transglucosylation enzymatique à partir d'un donneur, le saccharose, sur un accepteur qui peut être le glucose, l'alpha-glucoside de méthyle, l'isomaltose, l'isomaltotriose et le maltose.
Cette réaction est catalysée par la glucosyltransférase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512(F) selon la réaction suivante :
glucane-sacchaïase mélange
GIc - GIc + n (Glc-Fru) W (GIc)n-GIc-GIc + nFru αl-4 αl-β2 αl-6 αl-4 maltose saccharose GOS αl-6/αl-4
(accepteur) (donneur)
GIc = résidu glucoside / Fm = résidu fructoside ou fructose αl-x = liaison de type α-(l→x) / cd-β2 = liaison de type α-(l-θ-2)-β
Synthèse enzymatïque du GOS or 1-6
Structure du GOS σ1-6
Dans les exemples ci-après, l'accepteur utilisé est le maltose (disaccharide glucosylα1-4glucose). Les oligosaccharides GOS α1-6 contiennent donc tous la liaison glucosidique α1-4 de l'accepteur maltose à leur extrémité réductrice.
o Le GOS a1-2/a1-6
Le GOS α1-2/1-6 est constitué d'un enchaînement de résidus de glucose liés en α1-6 et contenant des liaisons en α1-2 (point de ramification ou
extrémité non réductrice). Il est obtenu selon le même procédé que celui utilisé pour la production du GOS α1-6, mais l'enzyme utilisée est produite par une autre souche, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299.
Structure du GOS cr1-2/1-6
II - Exemple 1
11-1 Isolement et caractérisatîon des souches de lactobacilles d'origine vaginale
Des souches vaginales ont été sélectionnées à partir d'une population de 1000 femmes menstruées et âgées de 18 à 40 ans en fonction de 3 critères :
• Critères biologiques :
- absence d'infections du type vaginite ou vaginose
- flore vaginale normale à forte population en lactobacilles
• Critères technologiques des souches isolées : - croissance correcte sur milieu de type MRS (Man, Rogosa et
Sharpe)
- résistance à la conservation à -8O0C.
• Critères de sélection des souches isolées :
- adhésion aux cellules épithéliales vaginales
- forte production de peroxyde d'hydrogène (H2O2) et d'acide lactique - inhibition de la croissance de souches pathogènes vaginales
- présence d'une activité arginine désaminase
3 souches de lactobacilles vaginaux ont ainsi pu être sélectionnées et identifiées par séquençage de I'ADNR 16S (Centre de typage moléculaire, Institut Pasteur de Lille, France) :
• 1-3255 : 99% d'homologie de séquence avec Lactobacillus sp.
Oral clone
96% d'homologie de séquence avec Lactobacillus vaginalis représentative de Lactobacillus vaginalis
(hétérofermentaire stricte, produit les formes D et L de l'acide lactique)
• 1-2769 : 99% d'homologie de séquence avec Lactobacillus crispatus représentative de Lactobacillus crispatus
(homofermentaire stricte, produit les formes D et L de l'acide lactique)
• 1-3256 : 99% d'homologie de séquence avec Lactobacillus jensenii représentative de Lactobacillus jensenii
(homofermentaire stricte, produit seulement la forme D de l'acide lactique)
Ces souches sont représentatives de la flore de Doderleïn (flore lactique endogène protectrice naturelle de la muqueuse vaginale). Elles ont été retenues pour leur capacité à produire du peroxyde d'hydrogène, à
acidifier rapidement le milieu de culture et à adhérer fortement aux cellules de la muqueuse vaginale.
De plus, une souche de l'espèce Lactobacillus gasseri, enregistrée le 25/08/05 à la CNCM sous le numéro 1-3495, présente fréquemment dans la flore de Doderleïn (Tarnberg et al., 2002), a également été étudiée vis à vis de son aptitude à utiliser les oligosaccharides sélectionnés comme source de carbone.
11-2 Souches pathogènes
Les souches choisies sont celles qui provoquent les pathologies les plus fréquentes du système urogénital à savoir :
• Candida albicans (souche ATCC 2091 ), responsable de certaines vaginites
• Escherichia coli uropathogène (souche CIP 54.8T), responsable d'infections urinaires
• Gardnerella vaginalis (souche issue d'un isolement clinique), responsable de vaginoses bactériennes.
11-3 Oligosaccharides testés
4 oligosaccharides ont été testés :
- FOS Actilight® 950P (fourni par la société BEGHIN-MEIJI (France)).
- FOS Raftilose® P95 (fourni par la société ORAFTI (Belgique)).
- GOS α1-2/α1-6 (fourni par la société SOLABIA (France)).
- GOS α1 -6 (produit fabriqué par GENIBIO (France)).
Leur composition est précisée dans le Tableau 1.
Tableau 1. Structure et composition des oligosaccharides testés.
5 * Glcp = résidu glucopyranoside FrUf= résidu fructofuranoside f n = 1 à 3 et m = 1 à 6 (m peut être > à 6, jusqu'à environ 15-20 en 10 fonction des conditions de réaction)
11-4 Mise en œuvre des cultures de lactobacilles et de pathogènes vaginaux
Pour évaluer la capacité de chaque souche à utiliser les oligosaccharides étudiés comme source de carbone, le glucose présent à l'origine dans les milieux de culture spécifiques de chaque souche, est remplacé par l'oligosaccharide testé.
L'évolution de la croissance de la microflore est suivie au cours du temps par différents paramètres : - turbidité du milieu de fermentation (mesure de la turbidité à 640 nm),
- pH du milieu de fermentation,
- nombre de cellules microbiennes (numération sur cellule de Malassez), - consommation des oligosaccharides par un dosage HPLC.
Les lactobacilles produisent de l'acide lactique qui est un des moyens de défense de l'écosystème vaginal contre la colonisation des pathogènes. Ce dernier est dosé selon une méthode enzymatique.
II-4.1 JOUR 1 : Pré-culture des souches
Afin de diminuer la durée de la phase de latence lors de la fermentation, une pré-culture de 24h est réalisée. Dans 15 mL de bouillon de culture spécifique de la souche étudiée, environ 107 bactéries sont introduites (équivalent à 1 cryotube contenant 1 mL de culture à 35 % de transmittance à 640 nm et conservé à -2O0C).
Le Tableau 2 présente pour chaque souche le milieu de culture utilisé et les conditions d'incubation.
Tableau 2. Milieux de culture et conditions d'incubation pour chaque souche.
II- 4. 2 JOURS 2-3-4 : culture des souches
En fonction de l'objectif de l'expérience et des souches étudiées, les milieux et les volumes de fermentation ainsi que les conditions d'incubation ne sont pas les mêmes (Tableau 3). Des fermentations en petits volumes sont réalisées afin d'identifier rapidement des souches ou des sucres intéressants. Des fermentations en grand volume permettent de faire un suivi plus précis au cours du temps.
Tableau 3. Conditions de culture en fonction de la souche étudiée
Dans tous les cas, le milieu de fermentation est additionné de l'oligosaccharide à tester à une concentration de 10 g/L. L'inoculation de Ia culture est réalisée avec un volume de la pré-culture égal à 2 % du volume de la culture. L'incubation dure 48h à 370C.
Une fermentation témoin avec chaque milieu de culture spécifique utilisé contenant 10 g/L de glucose au lieu de 10 g/L d'oligosaccharide est également réalisée.
Composition des milieux de fermentation
o Bouillon MRS reconstitué sans glucide (g/1)
Tryptone 10
Extrait de viande 10
Extrait de levure 5
Tween 80 1 ,08
K2HPO4 2
Acétate de sodium 5
Ammonium citrate 2
MgSO4, 7H2O 0,2
MnSO4, H2O 0,05
PH 6,4
o illon Trypcase Soja reconstitué sans
Peptone pancréatique de 17 caséine
Peptone papaïnique de soja 3
NaCI 5
K2HPO4 2,5
PH 7,3
o Bouillon Sabouraud reconstitué sans glucide (g/L)
Peptone pancréatique de 5 caséine
Extrait de viande 5 pH 5,7
Bouillon Schaëdler reconstitué sans glucide (g/L)
Tryptone 5
Extrait de levure 5
Peptone de caséine 5,67 peptone de soja 1
NaCI 1 ,67
K2HPO4 0,83
Tris trizma base 3
Hémine 0,01
L~cystine 0,4
Vitamine K3 0,0005
Sang de mouton stérile 5%
PH 7,3
Le sang est ajouté après avoir stérilisé le bouillon par la chaleur.
11-5 ANALYSES EFFECTUÉES
11-5.1 Suivi de la croissance
11-5.1.1 Mesure de la turbidité
La turbidité de la culture microbienne est évaluée par spectrophotométrie à 640 nm, après dilution au 1/10éme (HeΛios β - Thermospectronic, Royaume Uni). La cinétique d'augmentation de la turbidité permet ensuite de calculer les paramètres physiologiques de croissance pour chaque souche en fonction de l'oligosaccharide. Le temps de génération est déterminé grâce au logiciel LISEXEL (Jean-Louis Uribelarrea, DGBA- INSA, Toulouse, France).
11-5. 1.2 Numération cellulaire
La numération cellulaire est réalisée par un dénombrement sur cellule de Malassez.
Une numération de la pré-culture est effectuée, ainsi que toutes les 24h sur la culture afin d'estimer la population tout au long de la fermentation. Cette numération sur cellule de Malassez permet également de vérifier la pureté de la culture.
11-5.2 Suivi de l'acidité
11-5.2.1 Mesure du pH
Le suivi du pH dans le milieu au cours de la fermentation est réalisé à l'aide d'un pH - mètre (Denver Instrument, Allemagne).
11-5. 2. 2 Dosage de l'acide lactique
L'acide lactique présent dans les surnageants de fermentation (après centrifugation du milieu de culture pendant 5 min à 12 000g pour éliminer les bactéries) est dosé à l'aide d'un kit enzymatique (Enzytec™ D/L-lactic acid, Diffchamb, France).
Il- 5.3 Dosage des sucres par HPLC
//- 5. 3. 1 Traitement des échantillons issus de la fermentation
Les milieux de fermentation utilisés étant complexes, de nombreux pics apparaissent sur le profil chromatographique et gênent l'interprétation des oligosaccharides. Avant l'analyse, les échantillons sont préalablement déminéralisés à l'aide de résines échangeuses d'ions. 2 types de cartouches SPE ont été utilisés :
- Cartouche SAX Extract-clean (Alltech, France) : résine échangeuse d'anions sous forme acétate, éliminant les composés chargés négativement,
- Cartouche SCX Extract-clean (Alltech, France) : résine échangeuse de cations sous forme H+, éliminant les composés chargés positivement.
//- 5.3.2 Conditions d'analyse HPLC
Les conditions d'analyse HPLC mise au point pour l'étude de la consommation de sucres par la microflore sont définies dans le Tableau 4.
Tableau 4. Conditions d'analyses HPLC selon les sucres étudiés
Dans tous les cas, la détection se fait par réfractométrie.
Malgré le traitement des échantillons sur cartouches SPE, certains milieux de fermentation créent des interférences qui ne permettent pas de suivre la consommation de certains DP. Seuls les DP ≥3 du FOS Actilight et les DP >4 du FOS Raftilose, des GOS σ1-6 et des GOS α1-2 / α1-6 ont pu être analysés.
11-6 Résultats et interprétation
Tableau 5. Paramètres de croissance des 3 souches de lactobacilles sélectionnées en présence des différents glucides.
LACTOBACILLES
GLUCIDE PARAMETRES DE CROISSANCE SELECTIONNES
Δmax T ' Δmax pH * [lactate] § glucose 0,598 00:48 2,2 10,9
1-3255
FOS Actilight® 0,318 00:58 1,6 4,1
Lb. vaginalis
FOS Raftîlose ® 0,055 01:31 0,6 1,2
GOSα-1,6 0,173 01:10 1-4 3,9
GOSα-1,2/α-1,6 0,208 01:30 1,3 3,4 glucose 0,466 01:01 1,9 10,7
FOS Actilight ® 0,274 01:00 1,4 3,3
1-2769
FOS Raftîlose ® 0,083 01:24 0,6 0,0
Lb. crispatus
GOS α-1,6 0,344 01:10 1,6 7,3
GOSα-1,2/α-1,6 0,262 01:13 1,2 3,0 glucose 0,392 01:00 1,9 9,1
FOS Actilight® 0,236 01:01 1,3 3,3
1-3256
FOS Raftilose ® 0,083 01:15 0,3 0,4
Lb. jensenii GOS α-1,6 0,262 01:01 1,8 7,6
GOSα-1,2/α-1,6 0,345 01:06 1,3 3,3
* Δmax T = variation maximale de turbidité à 640 nm comparée à la valeur initiale f G = temps de génération (h :min)
* Δmax pH = variation maximale de pH comparée à la valeur initiale § [lactate] = concentration de lactate en fin de fermentation (g/L)
Les valeurs de consommation du glucose et des oligosaccharides indiqués dans les Tableaux 6 à 10 sont exprimées en % de la quantité initiale présente dans le milieu de culture.
Tableau 6. Consommation de chaque glucide après 48 h de fermentation par les 3 souches de lactobacilles sélectionnées (%).
LACTOBACILLES
DEGRE DE
GLUCIDE I-3255 1-2769 1-3256 POLYMERISATION Lb. Lb. Lb. vaginalis cήspatus jensenii glucose - 100 100 100
DP3 76 76 81
FOS Actilight ® DP4 <10 24 <10
DP5 <10 ≤10 ≤10
DP4 ≤10 <10 ≤10
FOS Raftilose ® DP5 <10 ≤10 ≤10
DP4 37 100 100 OS α-1,6 DP5 <10 94 96
DP6 ≤10 96 94
DP4 39 80 100
DP5 (α-1,2) <10 ≤10 ≤10 OS α-1,2/α-1,6 DP5 <10 71 100
DP6 (α-1,2) ≤10 ≤10 ≤10
DP6 ≤10 36 86
Tableau 7. Consommation des 2 oligosaccharides sélectionnés par la souche Lactobacillus gasseri 1-3495 après 48 h de fermentation (%).
Tableau 8. Consommation des 2 oligosaccharides sélectioi vi v vinnés après 48 h O O O de fermentation par les 3 souches de microorganismes pathogènes (%).
MICROORGANISMES
DEGRE DE PATHOGENES
GLUCIDE POLYMERISATION C. albicans E. coli G. vaginalis
ATCC 2091 CIP 548T CIP 7074T glucose - 93 52 ≤10
DP3 ≤10 21 <10
FOS Actilight ® DP4 ≤10 19 ≤10 DP5 <10 14 ≤10
DP4 <10 ≤10
GOS α-1,6 DP5 <10 <10 DP6 ≤10 ≤10
Tableau 9. Consommation de différents glucides en fonction du degré de polymérisation par les 2 souches de lactobacilles sélectionnées (%).
LACTOBACILLES
DEGRE DE
GLUCIDE POLYMERISATION I-2769 I-3256
Lb. crispatus Lb. jensenii glucose - 99 95 panose DP3 81 77
GOS α-1,6/α-1,4 DP4 à DP6 90 82
Le panose, ou GOS α-1 ,6/α-1,4 de DP égal à 3, possède la formule suivante :
GIc - GIc - GIc α1-6 α1-4
Tableau 10. Consommation de différents glucides en fonction du degré de polymérisation par 2 souches de microorganismes pathogènes (%).
MICROORGANISME
DEGRE DE PATHOGENE
GLUCIDE POLYMERISATION C. albicans E. coli
ATCC 2091 CIP 548T glucose - 98 41 panose DP3 46 < 10
GOS α-1,6/α-1,4 DP4 à DP6 < 10 < 10
Les consommations inférieures ou égales à 10% sont négligeables.
Parmi les 4 oligosaccharides testés, le FOS Raftilose® n'est quasiment pas consommé et ne permet donc pas une croissance suffisante des souches.
Concernant le GOS α1-2/α1-6, les oligosaccharides, contenant au moins une liaison α1-2, ne sont pas consommés par les lactobacilles. Ce type de liaison n'est pas hydrolysable par les enzymes bactériennes.
Pour le FOS Actilight®, seul le DP3 est consommé. Il assure une
croissance « efficace » des lactobacilles à lui seul. En effet, il permet l'obtention d'un faible temps de génération, avec une turbidité maximale et une bonne acidification du milieu de fermentation.
Le GOS α1-6 est particulièrement bien consommé par les 3 souches I- 2769, I-3256 et I-3495. Il permet d'obtenir un bon niveau de croissance et de production d'acide lactique.
Par contre, le FOS Actilight® et le GOS α1-6 ne sont pas consommés par les 3 pathogènes du système urogénital. Ces 2 oligosaccharides présentent donc un potentiel prébiotique remarquable vis à vis de la flore vaginale bénéfique (flore lactique dite de Doderleïn), car ils constituent un substrat de croissance de cette flore à la fois très efficace et très spécifique.
Les résultats présentés dans les tableaux 9 et 10 montrent l'utilisation sélective des GOS α-1, 6/ α-1 ,4 de DP>4 par les lactobacilles. Bien que la souche pathogène E.coli consomme très faiblement le GOS α-1, 6/ σ-1,4 de DP3 (panose), le fait que C. albicans consomme 46% du DP3 est suffisant pour permettre à cette souche pathogène de se développer. Par contre, les souches E. coli et C. albicans ne consomment pas les GOS α-1 ,6/ α-1 ,4 de DP4 à DP7, contrairement aux lactobacilles. Ainsi, l'utilisation d'une composition comprenant au moins ou étant constitué par le GOS linéaire #-1,6/ σ-1 ,4 de DP égal à 4 et, le cas échéant, comprenant et/ou étant constitué par en outre les GOS α-1 , 6/ α- 1 ,4 de DP>4, favorise la croissance d'une microflore vaginale bénéfique.
III- Exemple 2
Un mélange constitué de FOS Actilight®, de GOS α1-6 et d'acide lactique a été formulé de la façon suivante :
• FOS Actilight® : 50% (p/p) • GOS α1-6 : 40% (p/p)
• acide lactique : 10% (p/p).
Des cultures des lactobacilles vaginaux 1-3255, 1-2769 et 1-3256, ainsi que des pathogènes E. coli, C. albicans et G. vaginalis, ont ensuite été réalisées dans le milieu de culture standard reconstitué et additionné de 10 g/L du mélange ainsi préparé. Les résultats sont présentés dans le Tableau 11.
Tableau 11. Résultats des fermentations des 3 souches de lactobacilles vaginaux en présence du mélange FOS Actilight®/GOS α1-6/acide lactique à 10 g/L.
* Δmax T = variation maximale de turbidité à 640 nm comparée à la valeur initiale f G = temps de génération (h :min) * Δmax pH = variation maximale de pH comparée à la valeur initiale
Les croissances des lactobacilles observées avec le mélange FOS Actilight®/GOS α1-6 / acide lactique atteignent les mêmes niveaux qu'avec chaque oligosaccharide utlisé seul.
Le mélange FOS Actilight®/GOSα1-6 / acide lactique est bien consommé par les 3 souches probiotiques testées, alors qu'il ne l'est pas par les souches pathogènes.
Au vu de ces résultats, il apparaît clairement que le GOS α1 -6 (> DP4) et le FOS Actilight® (DP 3) constituent des oligosaccharides prébiotiques spécifiques vis-à-vis de la flore vaginale bénéfique. Tous les oligosaccharides prébiotiques à visée intestinale et en particulier ceux décrits dans EP 591 443 ne sont donc pas utilisables dans le cadre de la présente invention.
Il va de soi que les modes de réalisation décrits ne sont que des exemples et l'on pourrait les modifier, notamment par substitution déquivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention.
Claims
1. Composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant au moins le glucooligosaccharide (GOS) linéaire comprenant des liaisons glucosidiques de type α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison glucosidique de type α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, de degré de polymérisation égal à au moins 4.
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend en outre les oligosaccharides GOS linéaires α(1→ 6) de DP égal à 5 et 6.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre le fructooligosaccharide de formule GF2, où G est un résidu de glucose et F un résidu de fructose.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la quantité d'oligosaccharides va d'environ 0,1 % à 20 % en poids.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la quantité d'oligosaccharides va d'environ 1 à 10 % en poids, de préférence d'environ 1 à 5 % en poids.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce quelle comprend en outre un agent tensio-actif non- ionique.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un agent tampon ajustant le pH dans la gamme de 4 à 7, de préférence de 4,5 à 6.
8. Composition selon l une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un savon liquide, d'un gel vaginal, d'une ovule, ou d'une canule à usage intra-vaginal.
9. Utilisation d'au moins un oligosaccharide GOS linéaire comprenant des liaisons glucosidiques de type α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison glucosidique de type α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, de degré de polymérisation égal à au moins 4 pour la préparation d'une composition visant à favoriser le développement et la croissance d'une microflore vaginale bénéfique.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir ou à traiter une vaginose bactérienne.
11. Utilisation selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que ladite microflore comprend au moins un lactobacille choisi parmi les lactobacilles suivants :
- Lactobacillus sp. oral clone (ou L. vaginalis) enregistrée le 29/07/04 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-3255;
- L crispatus enregistrée le 20/12/01 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-2769;
- L jensenii enregistrée le 29/07/04 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-3256 ; et
- L gasseri enregistrée le 25/08/05 à la Collection Nationale de
Cultures et de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-3495.
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