WO2006022572A1 - Procede de diagnostic de tumeurs malignes - Google Patents

Procede de diagnostic de tumeurs malignes Download PDF

Info

Publication number
WO2006022572A1
WO2006022572A1 PCT/RU2004/000484 RU2004000484W WO2006022572A1 WO 2006022572 A1 WO2006022572 A1 WO 2006022572A1 RU 2004000484 W RU2004000484 W RU 2004000484W WO 2006022572 A1 WO2006022572 A1 WO 2006022572A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
serum
antibodies
early embryonic
idiotypic
antigens
Prior art date
Application number
PCT/RU2004/000484
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2006022572A8 (fr
Inventor
Alexandr Vladimirovich Baljura
Original Assignee
Ivakhnenko, Igor Nikolaevich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ivakhnenko, Igor Nikolaevich filed Critical Ivakhnenko, Igor Nikolaevich
Priority to EA200501082A priority Critical patent/EA009007B1/ru
Publication of WO2006022572A1 publication Critical patent/WO2006022572A1/ru
Publication of WO2006022572A8 publication Critical patent/WO2006022572A8/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells

Definitions

  • the invention relates to medicine, and specifically to oncology, and relates to a method of in vitro diagnosis of malignant tumors using the serum of pregnant animals.
  • the prior art knows a large number of methods for diagnosing tumors based on the study of tumor markers for predicting the disease and monitoring treatment, which to one degree or another allows obtaining information about the condition of the diagnosed patient.
  • Tumor markers are produced by tumor cells or the body in response to the development of the tumor.
  • the level of tumor markers is not increased, as a result of this, tumor markers cannot be used to diagnose malignant tumors, regardless of location and histogenesis.
  • a known method for diagnosing malignant tumors by serological blood testing including adding to the patient’s whole blood sample an anti-idiotypic anti-embryonic serum, measuring the patient erythrocyte sedimentation rate and in the control, determining the difference between the first and second, multiplying by the maximum of both ESR values, dividing by 50, and when the value of the obtained indicator is more than 1.5, tumor growth is diagnosed [1].
  • a known method for the diagnosis of a malignant tumor by studying the erythrocyte sedimentation rate under the influence of two agents - anti-idiotypic anti-embryonic serum and control serum, using rat serum as the first agent, and as the second - rat serum, which are previously injected with lymphocytes of intact syrenic animals, find the minimum and maximum ESR gradient, the obtained values determine the coefficient of malignancy of cell growth according to the formula:
  • a method for the diagnosis of malignant tumors using a specific antiserum to a universal tumor antigen including the selection of tissues, preparation of cell suspension, immunization of animals, obtaining antiserum from it, introducing it into the reaction with the blood of the subject, according to the results of which the tumor is diagnosed, and a two-stage immunization is carried out , and as the tissues in the first stage in genetically homogeneous animals, an embryo at the fetus stage is isolated, a cell suspension is prepared, after immunization wherein, in the animal produce fence spleen cells isolated from these cells and the second step is carried immunizing an animal of the same genetic line with a suspension of the lymphocytes, after which the animal receives an antiserum, the cells of the intact organs of the same animals are added to it, the mixture is decanted, the supernatant fraction is separated, it is filtered through a millipore filter with a pore diameter of 20 ⁇ m, the filtrate is added to
  • ⁇ is the diagnostic coefficient, which in the presence of a tumor is 1.5;
  • a - ESR value in the experimental sample (antiserum to the tumor antigen was added to the citrated blood of the subject);
  • B 1 and B 2 ESR value in control samples (the antiserum of the same animal species that was used to obtain the antiserum was added to the citrated blood of the subject);
  • X is the highest ESR value in the analysis (either in sample A, or the average of B 1 and B 2 , ie (B '+ B 2 ) / 2) [3].
  • A is the ESR value in the experimental sample (antiserum to the tumor antigen was added to the citrated blood of the subject);
  • X is the highest ESR value in the analysis (or in sample A or the average of B 1 and B 2 , i.e. (B 1 + B 2 ) / 2);
  • ⁇ is the diagnostic coefficient, and with the obtained values of the diagnostic coefficient ⁇ , significantly differing from the control values (> 1.5), a tumor is diagnosed [4].
  • the claimed invention is based on the parapartheno-genetic hypothesis of oncogenesis, first proposed by A.V. Balyura in 1983 [5,6,7,23]. According to this hypothesis, during malignancy in the initial differentiating somatic cell, parthenogenetic activation of the genome (parapartogenesis) occurs, which leads to the sequential inclusion of two genetically determined programs: a program for the normal development of a somatic cell blocked at one or another stage of differentiation, and for some cells, an additional program normal ontogenesis, starting from the earliest stages.
  • stem tumor cells reproduce the features of the cells of the original tissue
  • others differentiate tumor cells originating from stem tumor cells
  • reproducing the features of the cells of the original tissue acquire, as the tumor progresses, more and more similarities with differentiating cells of other organs and tissues, and the rate of such acquisition will be greatest in low-grade tumors, medium - in moderately differentiated x tumors and low - in highly differentiated tumors.
  • tumor - testicular teratocarcinoma which affects animals and humans.
  • This tumor consists of a mixture of cells, one part of which is similar to cells of the embryonic testicle, and the other to 14 types of cells of various organs and tissues. It was shown that cells similar to cells of the embryonic testicle are multipotent: when one such cell is transplanted, a tumor is formed, which in turn consists of cells similar to cells of the embryonic testicle and the aforementioned 14 types of differentiating cells, such as kidney, nerve, muscle and others, and transplant one differentiating cells did not lead to tumor formation [10,17,26,27,28,29,30];
  • Oncogenes c-srk, c-myc, c-erb, cpash, c-resk, c-sis, N-myc, L-myc
  • Oncogenes appear to be a normal component of embryogenesis [13,14,19];
  • - mRNAs are found in the cytoplasm of malignant tumor cells that are similar to those in embryonic cells at the very early stages of development [31];
  • tumor cells synthesize products of an early period of development. For humans, these products are characteristic for the period from gametogenesis to 10 weeks of fetal development. With the completion of organogenesis, the synthesis of at least part of the substances common to embryonic and tumor cells ceases [18,20,24].
  • malignant tumor cells even at the stage of several cells, produce early embryonic antigens (stage-specific antigens).
  • fetal blood antigens including those at the very early stages of development (early embryonic antigens, stage-specific antigens) that are absent in the mother’s tissues, can pass through the placenta and cause the mother to form the corresponding antibodies.
  • Such antibodies are found in all cases of a normal pregnancy, having, according to some authors, a regulatory and normalizing effect on the course of fetal development [8, 9].
  • “immunological conflicts) arise between the mother and the fetus)), which often happens in horses and especially in mules [9]. Cases were noted when, when crossing a mare with a certain producer, non-viable foals were born, or miscarriages occurred. It turned out that this is due to the incompatibility of the tissues of the mother and fetus [9].
  • N. Jerpe developed the concept of an idiotypic network, according to which, as a result of an immune response to an antigen, antibodies are formed whose idiotypic determinants can be autoimmunogens.
  • each antibody can cause the formation of anti-idiotypic antibodies (At2), which in turn cause the formation of anti-anti-idiotypic antibodies (At3), and those later on - the synthesis of anti-anti-anti-idiotypic antibodies (At4), etc. .
  • Anti-idiotypic antibodies (At2) and anti-anti-anti-idiotypic antibodies (At4) carry an “internal antigen image”, i.e. have antigenic determinants and can bind to Atl and At3 [15]. It was shown that antigens and idiotypes are expressed on antigen-binding receptors of T- and B-lymphocytes, adsorbed on the surface of red blood cells and are contained in blood serum [12,15].
  • stage-specific antigens early embryonic antigens
  • Atl early embryonic antigens
  • At2 anti-idiotypic antibodies
  • At3 anti-anti-idiotypic antibodies
  • At4 anti-anti-anti-idiotypic antibodies
  • the blood serum of animals in the early stages of pregnancy contains the same early embryonic antigens (stadiospecific antigens), Atl, At2, At3, At4, etc., which can interact with the corresponding antigens and antibodies in the blood of a patient with a malignant tumor.
  • the presence of early embryonic antigens stadiospecific antigens
  • antibodies to early embryonic antigens Atl
  • anti-idiotypic antibodies to early embryonic antibodies At2
  • anti-anti-idiotypic antibodies to early embryonic antibodies At3
  • anti-anti-anti-idiotypic antibodies to early embryonic antibodies At4
  • the essence of the claimed diagnostic method lies in the fact that serum obtained from animals in early pregnancy is added to tissues or blood, with subsequent consideration of the results in the ESR reaction, as well as in other known immunological reactions, and in the presence of significantly different values when normal serum is added blood of the corresponding animal, the presence of a malignant tumor is diagnosed.
  • the technical result of the claimed invention is the creation of a method for the diagnosis of malignant tumors, which, compared with the prototype, allowed to significantly reduce the complexity of the method, while significantly simplifying the process due to the proposed use of serum of pregnant animals, as well as to remove the problems inherent in the prototype and related to the volume the resulting serum.
  • a significant difference of the claimed method is that for the first time it is proposed to use the blood serum of pregnant animals as a diagnostic serum, in particular the blood serum of mare foals taken on the 45-100th day of the draw, and normal horse serum as a control serum.
  • the aforementioned technical result is achieved in the implementation process of the claimed invention due to the fact that in the method for diagnosing malignant tumors, by means of a serological blood test, including adding to one patient’s whole blood sample an anti-idiotypic anti-embryonic serum, and to another patient’s whole blood sample, normal animal serum the same type, measuring the erythrocyte sedimentation rate in both samples, determining the difference in the erythrocyte sedimentation rate in both of the mentioned samples, in the calculation, according to the data obtained and the known calculation formula, of a diagnostic coefficient, the magnitude of which is used to diagnose tumor growth, for detecting early embryonic antigens, antibodies to early embryonic antigens, anti-idiotypic antibodies to early embryonic antigens, anti-idiotypic antibodies to early embryonic antibodies in a patient’s blood serum antigens expressed on T and B lymphocytes adsorbed on red blood cells as anti-idiotypic anti-embryonic serum using cosiness is a serum of pregnant animals containing early embryonic antigens, antibodies
  • the method is implemented as follows. 200 ⁇ l of heparinized blood (20 units of heparin per 1 ml of blood) are added to two tubes. 50 ⁇ l of serum of mares are added to one of the tubes, and 50 ⁇ l of normal horse serum to the other. The tubes are shaken for 1 to 2 minutes, after which the blood from the first tube is pipetted into two glass capillaries to the 50 mark and placed in the Panchenkov apparatus. Similarly, blood is introduced from the second tube, and both capillaries are also placed in the Panchenkov apparatus. As capillaries, standard capillaries with an inner diameter of about 0.8 mm are used.
  • the capillaries are incubated for one hour at a temperature of 37 ° C. After one hour, the ESR in the capillaries is measured in mm, and the arithmetic mean value of the ESR in the experiment and in the control is calculated.
  • the diagnostic coefficient is calculated as follows: the difference in ESR between experience and control is divided by 50 and multiplied by the highest ESR obtained. The upper limit of the norm corresponds to 1.5. In cancer patients, the diagnostic coefficient can reach 4.0 - 5.0 and higher.
  • the proposed diagnostic method was tested on a group of patients, including cancer patients, patients with non-cancerous diseases and practically healthy people. The results are shown in the table.
  • the diagnostic coefficient in patients with malignant tumors is much more than 1.5, and in healthy people and patients with non-cancerous diseases it is much less than 1.5.
  • the proposed diagnostic method was examined 86 cancer patients and 16 healthy people and patients with non-cancerous diseases, the sensitivity of the method was 88%.
  • Kiselev F.L. Pavlish O.F.
  • Tatosyan F.G The molecular basis of carcinogenesis in humans. M., Medicine, 1990, p. 317. N.Kopnin B.P. Biochemistry, 2000, JVE 1, p. 5-33.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Способ диагностики злокачественных опухолей
Область техники
Изобретение относится к медицине, а конкретно к онкологии, и касается способа ин-витро диагностики злокачественных опухолей, с использованием сыворотки беременных животных.
Предшествующий уровень техники
К настоящему времени из уровня техники известно большое количество методов диагностики опухолей, основанных на исследовании опухолевых маркеров для прогнозирования заболевания и мониторинга лечения, которые в той или иной мере позволяют получать информацию о состоянии диагностируемого пациента.
Опухолевые маркеры, а их известно уже более 200, продуцируются опухолевыми клетками или организмом в ответ на развитие опухоли. Однако на ранних стадиях опухолевого процесса уровень опухолевых маркеров, как правило, не повышен, вследствие этого исследования онкомаркеров нельзя использовать для диагностики злокачественных опухолей независимо от локализации и гистогенеза.
Известен способ диагностики злокачественной опухолей путём серологического исследования крови, включающий добавление к пробе цельной крови пациента антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки, измерение скорости оседания эритроцитов пациента и в контроле, определение разницы между первым и вторым, умножение на максимальную из обеих величин СОЭ, деление на 50, и при величине полученного показателя более 1,5, диагностируют опухолевый рост [1].
Данный способ позволяет диагностировать злокачественные опухоли вне зависимости от особенностей их гистогенеза и локализации. Однако для получения антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки необходима двукратная иммунизация мелких сингенных животных, что является достаточно сложным и трудоёмким процессом. Кроме того, использование мелких животных не обеспечивает получение необходимого достаточного количества сыворотки. Известен способ диагностики злокачественной опухоли путём исследования скорости оседания эритроцитов под воздействием двух агентов - антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки и контрольной сыворотки, при этом в качестве первого агента используют крысиную сыворотку, а в качестве второго - сыворотку крыс, которым предварительно вводят лимфоциты интактных синrенных животных, находят минимальный и максимальный градиент СОЭ, по полученным значениям определяют коэффициент злокачественности роста клеток по формуле:
( С макс - С мин ) х 2Cмaкc Кзр =
100
где: К зр - коэффициент злокачественного роста;
С макс - максимальный уровень градиента СОЭ; С мин - минимальный уровень градиента СОЭ;
и при значении К зр = 1,55 - 7,0 определяют злокачественную опухоль [2]. Данный способ диагностики позволил значительно расширить исследуемый спектр заболеваний опухолевой природы, а также дифференцировать именной злокачественный рост опухолевых клеток от заболеваний неопухолевой природы и нормы. Однако для получения антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки необходимы также сингенные крысы, которых необходимо иммунизировать лимфоцитами синrенных животных. Это существенное ограничение, делает невозможным использование для получения таких сывороток, крупных животных, например, таких, как лошади, чтобы обеспечить получение упомянутой сыворотки в достаточных количествах.
Известен также способ диагностики злокачественных опухолей с использованием специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену, включающий выделение тканей, приготовление клеточной взвеси, иммунизацию животных, получение из неё антисыворотки, введение её в реакцию с кровью обследуемого, по результатам которой диагностируют опухоль, при этом проводят двухэтапную иммунизацию, а в качестве тканей на первом этапе у генетически однородных животных выделяют эмбрион на стадии fеtus, готовят клеточную взвесь, после иммунизации которой, у животного производят забор клеток селезёнки, выделяют из них лимфоциты и проводят второй этап иммунизации животного той же генетической линии взвесью этих лимфоцитов, после чего у животного получают антисыворотку, добавляют в неё клетки интактных органов тех же животных, смесь декантируют, отделяют надосадочную фракцию, фильтруют её через миллипоровый фильтр с диаметром пор 20 мкм, фильтрат добавляют к крови обследуемого, а результат учитывают по иммунофлуоресценции или в реакции СОЭ и при величинах, достоверно отличающихся от контрольных значений, диагностируют опухоль. При проведении реакции СОЭ, диагностический коэффициент определяют по формуле:
Figure imgf000004_0001
α =
50
где: α - диагностический коэффициент, который при наличии опухоли составляет 1,5;
А - величина СОЭ в опытной пробе (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка к антигену опухоли);
В1 и В2 - величина СОЭ в контрольных пробах (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка того же вида животного, который использовался для получения антисыворотки);
X - наибольшее значение СОЭ в анализе (или в пробе А, или среднее В1 и В2, т.е. (B' + B2) / 2) [3].
Данный способ позволил повысить чувствительность и специфичность проводимой диагностики, однако для его реализации требуется антисыворотка, процесс получения которой, также достаточно сложен и весьма трудоёмок.
Наиболее близким к заявленному изобретению, по технической сущности и достигаемому при использовании результату, является способ диагностики злокачественных опухолей с использованием специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену, включающий добавление упомянутой антисыворотки к тканям, крови или другим физиологическим жидкостям обследуемого, с последующим учётом результатов по иммунофлоуресценции, в реакциях СОЭ, рассчитанных по формуле:
Figure imgf000005_0001
α =
50 где: А - величина СОЭ в опытной пробе (к цитратной крови обследуемого добавлена антисыворотка к антигену опухоли);
В1 и В2 - величина СОЭ в контрольных пробах (к цитратной крови обследуемого добавлена сыворотка того же вида животного, который использовался для получения антисыворотки);
X - наибольшее значение СОЭ в анализе (или в пробе А или среднее В1 и В2, т.е. (В1 + B2)/2); α - диагностический коэффициент, и при полученных величинах диагностического коэффициента α, достоверно отличающихся от контрольных значений ( > 1,5 ), диагностируют опухоль [4].
Одним из существенных недостатков известного технического решения является сложность и трудоёмкость процесса получения антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки. Кроме того, использование мелких, лабораторных животных, не обеспечивает возможности получения большого количества антисыворотки от одного животного, а следовательно и широкого, промышленного использования изобретения. Действительно, его трудно использовать на таких удобных для работы животных, как, например, лошадь. В соответствии с прототипом, подопытным лошадям необходимо ввести эмбриональные ткани, выделить селезёнку и ввести другим лошадям суспензии клеток селезёнки - это достаточно дорогостоящая и непрактичная технология.
Раскрытие изобретения
Известно, что ранняя диагностика злокачественных опухолей существенно влияет на результаты лечения онкологических больных. При многих локализациях излечение больных начальными стадиями опухолевого процесса достигается более чем в 90% случаев. Однако в настоящее время у подавляющего большинства первичных онкологических больных диагностируется распространённый опухолевый процесс. В этой связи создание теста для «ин-витpo» диагностики злокачественных опухолей, независимо от локализации и гистогенеза, является актуальной потребностью, а её успешное разрешение позволит значительно улучшить результаты лечения онкологических больных.
В основу заявленного изобретения положена парапартеноrенетическая гипотеза онкогенеза, впервые предложенная А.В.Балюрой в 1983 году [5,6,7,23]. Согласно этой гипотезе, при малигнизации в исходной дифференцирующейся соматической клетке происходит партеногенетическая активация генома (парапартеногенез), что приводит к последовательному включению двух генетически детерминированных программ: программы нормального развития соматической клетки, блокированной на том или ином этапе дифференцировки, а у части клеток - дополнительно программы нормального онтогенеза, начиная с самых ранних этапов. Было установлено, что в злокачественной опухоли существуют два вида клеток: одни клетки (стволовые опухолевые клетки) воспроизводят черты клеток исходной ткани, другие (дифференцирующиеся опухолевые клетки, происходящие из стволовых опухолевых клеток), воспроизводя черты клеток исходной ткани, по мере опухолевой прогрессии, приобретают всё большее сходство с дифференцирующимися клетками других органов и тканей, причём темп такого приобретения будет наибольшим у низко дифференцированных опухолей, средним - у умеренно дифференцированных опухолей и низким - у высоко дифференцированных опухолей.
Автор считает, что роль любых канцерогенных воздействий сводится к запусканию механизма парапартеногенеза, который является общим для всех злокачественных опухолей, но в клетках доброкачественных опухолей не реактивируется программа онтогенеза. В качестве доказательства парапартеногенетической гипотезы онкогенеза автор приводит следующие доводы:
- существует особая злокачественная опухоль - тератокарцинома яичка, поражающая животных и человека. Эта опухоль состоит из смеси клеток, одна часть которых подобна клеткам эмбрионального яичка, а другая - 14 видам клеток различных органов и тканей. Было показано, что клетки, сходные с клетками эмбрионального яичка, мультипотентны: при пересадке одной такой клетки образуется опухоль, состоящая в свою очередь из клеток, подобных клеткам эмбрионального яичка и упомянутым 14 видам дифференцирующихся клеток, подобных почечным, нервным, мышечным и другим, а пересадка одной дифференцирующейся клетки к образованию опухоли не приводила [10,17,26,27,28,29,30];
- экспрессия онкогенов (с-srk, с-mус, с-еrb, сrаsh, с-rеsk, с-sis, N-mус, L-mус) наблюдается как при опухолевом росте, так и на определённых (самых ранних) стадиях эмбриогенеза. По-видимому, онкогены являются нормальным компонентом эмбриогенеза [13,14,19];
- в цитоплазме клеток злокачественных опухолей обнаруживаются мРНК, сходные с таковыми у эмбриональных клеток на самых ранних стадиях развития [31];
- опухолевые клетки синтезируют продукты именно раннего периода развития. Для человека эти продукты характерны для периода от гаметогенеза до 10 недель внутриутробного развития. С завершением органогенеза синтез, по крайней мере, части веществ, общих для эмбриональных и опухолевых клеток, прекращается [18,20,24].
Таким образом, на основании парапартеногенетической гипотезы онкогенеза можно заключить, что ключевым отличием клеток злокачественных опухолей от нормальных является то, что клетки злокачественных опухолей, даже на стадии нескольких клеток, продуцируют ранние эмбриональные антигены (стадиоспецифические антигены).
Приведенные выше доводы, были положены в основу создания нового метода «ин-витpo» диагностики рака независимо от локализации и гистогенеза.
Ещё в 1864г. Ф.Мюллер и в 1866г. Э. Геккель сформулировали основной биогенетический закон, согласно которому в ходе индивидуального развития происходит краткое и сжатое повторение исторического развития предков данного организма [8,9]. Как следует из упомянутого закона, в ходе развития зародыша появляются «лягyшeчьи» белки (антигены), затем «змeиныe», и, наконец, «чeлoвeчecкиe» антигены [9].
Было выявлено определённое сходство между клетками злокачественных опухолей и клетками эмбрионов на ранних стадиях развития. Так, более семидесяти лет назад Нirsсhfеld и Наlbеr установили, что сыворотки кроликов, иммунизированные водными вытяжками из тканей эмбрионов крысы положительно реагировали в реакции связывания комплемента с липоидными экстрактами из тканей крысиной плаценты, из саркомы Йенсена и ещё сильнее - с липоидными экстрактами человеческого рака, но с экстрактами из тканей нормальных органов человека эти сыворотки не реагировали [9,1 1]. В дальнейшем эти данные были многократно подтверждены [9].
Известно, также, что антигены крови плода, в том числе на самых ранних стадиях развития (ранние эмбриональные антигены, стадиоспецифические антигены), отсутствующие в тканях матери, могут проходить через плаценту и вызывать образование у матери соответствующих антител. Такие антитела обнаруживаются во всех случаях нормально протекающей беременности, оказывая, по мнению некоторых авторов, регулирующее и нормализующее действие на ход развития плода [8,9]. Но в отдельных случаях при естественном ходе беременности между матерью и плодом возникают «иммyнoлoгичecкиe конфликты)), что нередко происходит у лошадей и особенно у мулов [9]. Отмечены случаи, когда при скрещивании кобылы с определённым производителем рождались нежизнеспособные жеребята, либо бывали выкидыши. Оказалось, что это объясняется несовместимостью тканей матери и плода [9].
Особенно часто «иммyнoлoгичecкиe конфликты)) проявляются в случае, когда плод кобылы, покрытый ослом, наследует антигены от осла. Эти антигены иммунизируют кобылу, в результате чего образуются соответствующие антитела, которые и губят плод [9]. В южных районах Франции отход потомства мулов достигает 15% [9].
Было установлено, что появление антител запускает целый каскад иммунологических реакций. В 1974 г. N.Jеrпе [25] разработал концепцию идиотипической сети, в соответствии с которой, в результате иммунного ответа на антиген образуются антитела, идиотипические детерминанты которых могут быть аутоиммуногенами. Иначе говоря, каждое антитело (Атl) может вызывать образование антиидиотипических антител (Aт2), которые в свою очередь вызывают образование анти-антиидиотипических антител (АтЗ), а те в дальнейшем - синтез анти-анти-антидиотипических антител (Aт4) и т.д.
Антиидиотипичесикие антитела (Aт2) и анти-анти-антиидиотипические антитела (Aт4) несут «внyтpeнний образ aнтигeнa», т.е. имеют антигенные детерминанты и могут связываться с Атl и АтЗ [15]. Было показано, что антигены и идиотипы экспрессируются на антигенсвязывающих рецепторах T- и В-лифоцитах, адсорбируются на поверхности эритроцитов и содержатся в сыворотке крови [12,15]. Автор полагает, что у больного злокачественной опухолью синтезируются ранние эмбриональные антигены (стадиоспецифические антигены), которые вызывают образование антител к ранним эмбриональным антигенам (Атl), вызывающие образование антиидиотипичесикх антител (Aт2), которые в свою очередь приводят к образованию анти-антиидиотипических антител (АтЗ), а те - к образованию анти-анти-антиидиотипических антител (Aт4) и т.д. Эти ранние эмбриональные антигены, а также Aтl,Aт2,AтЗ,Aт4 и т.д. экспрессируются на T- и В-лимфоцитах, адсорбируются на эритроцитах и содержатся в сыворотке крови больного злокачественной опухолью.
В сыворотке крови животных на ранних стадиях беременности содержатся такие же ранние эмбриональные антигены (стадиоспецифические антигены), Атl, Aт2, АтЗ, Aт4 и т.д., способные взаимодействовать с соответствующими антигенами и антителами в крови больного злокачественной опухолью.
Таким образом, в соответствии с заявленным изобретением, в процессе «ин- витpo» диагностики злокачественных опухолей у больного злокачественной опухолью выявляется наличие ранних эмбриональных антигенов (стадиоспецифических антигенов), антител к ранним эмбриональным антигенам (Атl), антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антителам (Aт2), анти-антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антителам (АтЗ), анти-анти-антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антителам (Aт4), и т.д., экспрессированных на T- и В-лимфоцитах, адсорбированных на эритроцитах и содержащихся в сыворотке крови.
Существо заявленного способа диагностики заключается в том, что к тканям или крови прибавляют сыворотку, полученную от животных на ранних сроках беременности, с последующим учётом результатов в реакции СОЭ, а также в других известных иммунологических реакциях, и при наличии достоверно отличающихся значений при добавлении нормальной сыворотки крови соответствующего животного, диагностируется наличие злокачественной опухоли. Техническим результатом заявленного изобретения является создание способа диагностики злокачественных опухолей, который по сравнению с прототипом, позволил значительно снизить трудоёмкость способа, с одновременным, значительным упрощением технологического процесса, за счёт предложенного использования сыворотки беременных животных, а также снять проблемы, присущие прототипу и связанные с объёмом получаемой сыворотки.
Существенным отличием заявленного способа является то, что в качестве диагностической сыворотки, отличной от контрольной, впервые предложено использовать сыворотку крови беременных животных, в частности сыворотку крови жеребых кобыл, взятую на 45-100 день жеребости, а в качестве контрольной сыворотки - нормальную лошадиную сыворотку.
Упомянутый технический результат, достигается в процессе реализации заявленного изобретения за счёт того, что в способе диагностики злокачественных опухолей, посредством серологического исследования крови, включающим добавление к одной пробе цельной крови пациента антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки, а к другой пробе цельной крови пациента - нормальной сыворотки животного того же вида, измерение скорости оседания эритроцитов в обеих пробах, определение разницы в скорости оседания эритроцитов в обеих упомянутых пробах, вычисление, по полученным данным и известной расчётной формуле, диагностического коэффициента, по величине которого диагностируют опухолевый рост, для выявления в сыворотке крови у обследуемого пациента ранних эмбриональных антигенов, антител к ранним эмбриональным антигенам, антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антигенам, антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антигенам, экспрессированных на T- и В-лимфоцитах, адсорбированных на эритроцитах, в качестве антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки, используют сыворотку беременных животных, содержащую ранние эмбриональные антигены, антитела к ранним эмбриональным антигенам, антиидиотипические антитела к ранним эмбриональным антигенам, анти-антиидиотипические антитела, анти-анти- антиидиотипические антитела и нормальную сыворотку таких же животных; а также тем, что в качестве сыворотки беременных животных, используют сыворотку жеребых кобыл и нормальную лошадиную сыворотку; а также тем, что в качестве сыворотки жеребых кобыл используют сыворотку, полученную на 45 - 100 день жеребости; а также тем, что сыворотку жеребых кобыл добавляют к тканям, крови или другим жидкостям обследуемого пациента и по полученным значениям в реакции
СОЭ, или в других известных иммунологических реакциях, при величинах, достоверно отличающихся от значений, полученных при добавлении нормальной лошадиной сыворотки, диагностируют опухоль.
Лучший вариант осуществления изобретения Способ реализуется следующим образом. В две пробирки вносят по 200 мкл гепаринизированной крови (20 ед. гепарина на 1 мл крови). В одну из пробирок добавляют 50 мкл сыворотки жеребых кобыл, а в другую - 50 мкл нормальной лошадиной сыворотки. Пробирки встряхивают в течение 1 - 2 минут, после чего кровь из первой пробирки с помощью микропипетки вносят в два стеклянных капилляра до отметки 50 и помещают их в аппарат Панченкова. Аналогичным образом вносят кровь из второй пробирки, и оба капилляра также помещают в аппарат Панченкова. В качестве капилляров используют стандартные капилляры с внутренним диаметром около 0,8 мм. Капилляры инкубируют в течение одного часа при температуре 37° С. Через один час измеряют СОЭ в капиллярах в мм, подсчитывают среднее арифметическое значение СОЭ в опыте и в контроле. Вычисляют диагностический коэффициент следующим образом: разницу в СОЭ между опытом и контролем делят на 50 и умножают на наибольший полученный показатель СОЭ. Верхняя граница нормы соответствует 1,5. У онкологических больных диагностический коэффициент может достигать 4,0 - 5,0 и выше.
Предложенный способ диагностики был апробирован на группе пациентов, включающей онкологических больных, больных неопухолевыми заболеваниями и практически здоровых людей. Полученные результаты приведены в таблице.
N°, N° ИИннииццииааллыы Диагноз Диагностический п/п обследуемого коэффициент
1 2 3 4
1. С - а Рак яичников T1N0M0M 4,2 2. В - о Рак молочной железы T4N2M1 2,8
3. А - в Лимфосаркома 4,0
4. И - ч Рак молочной железы T2N0M0 1,6
5. К - а Рак молочной железы 4,5
6. С - а Рак молочной железы TЗT1 Ml 5,3
7. Л - г Рак молочной железы T2N IMO 2,5
8. А - а Меланома прямой кишки T2N0M0. Состояние после брюшно-промежной эстирпации прямой 1 1 ,5 кишки. Метастазы в лёгкие, мозг. Состояние после химиотерапии
9. С - в Рак почки T2N0M0 2,4
10. Б - х Рак тела матки T2N0M0 2,4
11. С - а Здорова О 1122.. EЕ -- йй Аденома простаты 0,6
13. Е - я Фиброзно-кистотная мастопатия 1 , 1
14. Б - в Сахарный диабет 0,2
15. П - а Миома матки 0,3
16. Ц - я Эндометриоз 0,8
Как следует из приведенных данных, диагностический коэффициент у больных злокачественными опухолями, как правило, значительно больше 1,5, а у здоровых людей и больных неопухолевыми заболеваниями он значительно меньше 1,5. Предложенным способом диагностики было обследовано 86 онкологических больных и 16 здоровых людей и больных неопухолевыми заболеваниями, чувствительность способа составила 88%.
Промышленная применимость
Таким образом, в соответствии с заявленным изобретением, предложен способ диагностики злокачественных опухолей, в котором удалось преодолеть недостатки, присущие упомянутым выше техническим решениям, представляющим известный уровень техники, упростить технологию самого процесса диагностики, существенно снизить его трудоёмкость, а также исключить ограничения, касающиеся объёма используемой сыворотки, с одновременным повышением чувствительности способа.
Источники информации, принятые во внимание при оформлении заявки:
1. Патент СССР JVg 1836640, МПК 5 G 01 N 33/80, 1992г.
2. Патент РФ X° 21 1 1495, МКИ 6 G 01 N 33/80, 1995г.
3. Патент РФ JVs 2137136, МПК 6 G 01 N 33/53, 33/96, 1998г. 4.Пaтeнт PФ Wo 2149023, MПK7 A 61 К 39/395, G 01 N 33/531, 1998г. 5.Бaлюpa А.В. Парапартеногенетическая гипотеза канцерогенеза. M., 1983, с.10
(рукопись депонирована во ВНИИМИ МЗ СССР JVa 7134-83). б.Балюра А.В. Гипотеза возникновения злокачественных опухолей. Вестник медицины, 1995, N°3, с.10.
7.Бaлюpa А.В. Парапартеногенетическая гипотеза онкогенеза. Тезисы второго съезда онкологов стран СНГ «Kyiv Опkоlоgу 2000», Киев, 23-26 мая 2000, Mi 173. 8. Вязов О. E. Иммунология эмбриогенеза. M., Медгиз, 1962, с.328. 9. Вязов О. E. Новое в развитии зародыша. M., 1964, с.29. Ю.Дыбан П.А. Экспер.Онкол. 1981 , 3, M>6, c.44-50. l l .Дэй Ю. Иммунология рака. M., Мир, 1966, с.15-24, 37-46. 12. Новицкий В. В., Степанова E. А., Гольдберг В. В., Колосова M.B., Рязанцева
H. В., Корчин В. И. Эритроциты и злокачественные новообразования. Томск, 2000, c.286.
1 З.Киселёв Ф.Л., Павлиш O.Ф., Татосян Ф.Г. Молекулярные основы канцерогенеза у человека. M., Медицина, 1990, c.317. Н.Копнин Б.П. Биохимия, 2000, JVэ 1, c.5-33.
15.Пoл У. Иммунология. M., Мир, 1988, c.476, 455, 360. lб.Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. M., Мир, 2000, c.581. П.Шапот В. С. Биохимические аспекты опухолевого роста. M., Медицина, 1975, c.304. lδ.Эренпрейс Я. Г. Экспериментальная онкология. 1982, N° 6, с.13-18.
19.Эpeнпpeйc Я.Г. Вопросы онкологии. 1983, N°7, с.109-1 14. 2O.Эpeнпpeйc Я.Г. Современные концепции опухолевого роста. Рига, Зинатне, 1987, c.120. 21.Эфpyccи Б. Гибридизация соматических клеток. M., Мир, 1976, с.195.
22.Яpилин А.А. Основы иммунологии. M., Медицина, 1999, c.607.
23.Balyura А. А пеw hуроthеsis оf опсоgепеsis. Вестник медицины, 1995, N°4, с.l.
24.Fishman W. S., Siпgеr R.М. In: Сапсег. А Сотрrеhепsivе Тrеаtisе. N. Y., Lопdоп, 1975, 3, p.57-80.
25.Jeme N.K. Апп. Iттuпоl. (Раris), 1974, 125C, p.373-380.
26.Kleinsmith L. J., Рiеrсе G.В. Сапсег Res.1964, 24, Ш 9, р. 1544-1552. 27.Pierce G.В. In: Сап. Сапсег Сопf. 1961 , N.Y., Lопdоп, Асаd. Ргеss, 1967, 3, p.223-246.
28.Pierce G.B., DiхопF.J., Vеrпеу E. Сапсег. 1959, M> 3, p.573-584.
29.Pierce G.В. Сurrепt tорiсs iп dеvеlортепtаl biоlоgу. N. Y., Асаd.Рrеss, 1967, 3, р. 223-246. 30. Рiеrсе G.В. In: Dеvеlортепtаl аsресts оf саrсiпоgепеsis апd iттuпitу. N. Y.,
Асаd. Ргеss, 1974, р. 3-22.
Зl.Rigbi P. W., Вriсkеll P.R., Lаtоhтап D.S. еt аl. In: Тrапsfоrтеd Рhепоtуре. 1984, GoId Sрriпgеr Наrbоr, р. 97-104.

Claims

Формула изобретения
1. Способ диагностики злокачественных опухолей, посредством серологического исследования крови, включающий добавление к одной пробе цельной крови пациента антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки, а к другой пробе цельной крови пациента - нормальной сыворотки животного того же вида, измерение скорости оседания эритроцитов в обеих пробах, определение разницы в скорости оседания эритроцитов в обеих упомянутых пробах, вычисление, по полученным данным и известной расчётной формуле, диагностического коэффициента, по величине которого диагностируют опухолевый рост, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что для выявления в сыворотке крови у обследуемого пациента ранних эмбриональных антигенов, антител к ранним эмбриональным антигенам, антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антигенам, антиидиотипических антител к ранним эмбриональным антигенам, экспрессированных на T- и В-лимфоцитах, адсорбированных на эритроцитах, в качестве антиидиотипической антиэмбриональной сыворотки, используют сыворотку беременных животных, содержащую ранние эмбриональные антигены, антитела к ранним эмбриональным антигенам, антиидиотипические антитела к ранним эмбриональным антигенам, анти-антиидиотипические антитела, анти-анти- антиидиотипические антитела и нормальную сыворотку таких же животных.
2. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве сыворотки беременных животных, используют сыворотку жеребых кобыл и нормальную лошадиную сыворотку.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве сыворотки жеребых кобыл используют сыворотку, полученную на 45 - 100 день жеребости.
4. Способ по п.l, отличающийся тем, что сыворотку жеребых кобыл добавляют к тканям, крови или другим жидкостям обследуемого пациента и по полученным значениям в реакции СОЭ, или в других известных иммунологических реакциях, при величинах, достоверно отличающихся от значений, полученных при добавлении нормальной лошадиной сыворотки, диагностируют опухоль.
PCT/RU2004/000484 2004-08-23 2004-12-06 Procede de diagnostic de tumeurs malignes WO2006022572A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200501082A EA009007B1 (ru) 2004-08-23 2004-12-06 Способ диагностики злокачественных опухолей

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004125522 2004-08-23
RU2004125522/15A RU2277242C2 (ru) 2004-08-23 2004-08-23 Способ диагностики опухолей

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006022572A1 true WO2006022572A1 (fr) 2006-03-02
WO2006022572A8 WO2006022572A8 (fr) 2006-06-15

Family

ID=35910066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2004/000484 WO2006022572A1 (fr) 2004-08-23 2004-12-06 Procede de diagnostic de tumeurs malignes

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20060040330A1 (ru)
EA (1) EA009007B1 (ru)
RU (1) RU2277242C2 (ru)
WO (1) WO2006022572A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2452501C2 (ru) * 2010-08-31 2012-06-10 Александр Владимирович Балюра Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения, эритроцитарный диагностикум для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения и способ диагностики наличия злокачественных новообразований с использованием указанного эритроцитарного диагностикума
RU2487362C1 (ru) * 2012-05-24 2013-07-10 Балюра Екатерина Александровна Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111495C1 (ru) * 1995-12-15 1998-05-20 Валентин Сергеевич Ерхов Способ диагностики злокачественной опухоли
RU2137136C1 (ru) * 1998-02-27 1999-09-10 Ерхов Валентин Сергеевич Способ диагностики злокачественных опухолей с использованием специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену
RU2149023C1 (ru) * 1998-04-20 2000-05-20 Ерхов Валентин Сергеевич Способ получения специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену и способ диагностики злокачественных опухолей с использованием этой антисыворотки
US6187549B1 (en) * 1988-03-21 2001-02-13 Cytra Corporation Protein as a diagnostic of cancer
US20010005582A1 (en) * 1998-06-17 2001-06-28 Christine Benistant Method and kit for early diagnosis of cancer
US20040048320A1 (en) * 1999-08-06 2004-03-11 Hanash Samir M. Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6187549B1 (en) * 1988-03-21 2001-02-13 Cytra Corporation Protein as a diagnostic of cancer
RU2111495C1 (ru) * 1995-12-15 1998-05-20 Валентин Сергеевич Ерхов Способ диагностики злокачественной опухоли
RU2137136C1 (ru) * 1998-02-27 1999-09-10 Ерхов Валентин Сергеевич Способ диагностики злокачественных опухолей с использованием специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену
RU2149023C1 (ru) * 1998-04-20 2000-05-20 Ерхов Валентин Сергеевич Способ получения специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену и способ диагностики злокачественных опухолей с использованием этой антисыворотки
US20010005582A1 (en) * 1998-06-17 2001-06-28 Christine Benistant Method and kit for early diagnosis of cancer
US20040048320A1 (en) * 1999-08-06 2004-03-11 Hanash Samir M. Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer

Also Published As

Publication number Publication date
RU2004125522A (ru) 2006-02-10
US20060040330A1 (en) 2006-02-23
RU2277242C2 (ru) 2006-05-27
EA009007B1 (ru) 2007-10-26
WO2006022572A8 (fr) 2006-06-15
EA200501082A1 (ru) 2006-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baldwin et al. Embryonic antigen expression in chemically induced rat hepatomas and sarcomas
CN100472213C (zh) 癌症的检测和治疗
CN102460176B (zh) 差异多肽检测方法及其应用
KIERS et al. Paraneoplastic anti-neuronal nuclear IgG autoantibodies (type I) localize antigen in small cell lung carcinoma
JP2007527000A (ja) ワクチン選択のための初期ｂ細胞検出
US20070099253A1 (en) Method for producing a specific antiserum against the universal tumorous antigen and method for diagnosing malignant tumours using said antiserum
KR101969847B1 (ko) 동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법
RU2277242C2 (ru) Способ диагностики опухолей
Lechowski et al. Alpha-fetoprotein in canine multicentric lymphoma
RU98106976A (ru) Способ получения специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену и способ диагностики злокачественных опухолей с использованием этой антисыворотки
JP7432578B2 (ja) がんマーカーおよびその用途
RU2137136C1 (ru) Способ диагностики злокачественных опухолей с использованием специфической антисыворотки к универсальному опухолевому антигену
EP3832309B1 (en) Composition for diagnosis of bone metastasis of cancer and kit comprising same
JPH0121909B2 (ru)
Vider et al. Carcinoembryonic antigen (CEA) monitoring in the management of radiotherapeutic patients
WO1984000421A1 (en) Method for assaying tumor-associated antigen-specific immune complex
JP4476801B2 (ja) 新生物の検出方法
US20130225437A1 (en) Biomarkers of cancer
CN107219359B (zh) 一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒
JP2003166994A (ja) アレルゲン特異的ＩｇＥの分析方法
US20110097703A1 (en) Method for carrying out a qualitative preliminary instant diagnosis of oncologic diseases
Wu The cerebrospinal fluid immune cell landscape in animal models of multiple sclerosis
RU2205410C2 (ru) Способ получения антиидиотипической сыворотки для диагностики злокачественных опухолей
WO2009066131A1 (en) Methods for preparation of vaccines, laboratory kits, and treatment components
CN116539894A (zh) Capg在制备病理性心肌肥厚检测试剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200501082

Country of ref document: EA

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
CFP Corrected version of a pamphlet front page

Free format text: UNDER (71) REPLACE "APPLICANT (FOR US ONLY): IVAKHNENKO, IGOR NIKOLAEVICH" BY"APPLICANT (FOR ALL DESIGNATED STATES EXCEPT US): IVAKHNENKO, IGOR NIKOLAEVICH" IN RUSSIAN LANGUAGE CORRECT

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase