WO2006011587A1 - 癌細胞の悪性度判定法 - Google Patents

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WO2006011587A1
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nucleus
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Yutaka Miura
Makoto Kawaguchi
Hirotaka Iwase
Minoru Hamazaki
Jung Cha-Gyun
Hitoo Nishino
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Nagoya Industrial Science Research Institute
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    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Definitions

  • the present invention relates to a means for determining malignancy of cancer cells. Specifically, the present invention relates to a method for determining malignancy of cancer cells, and reagents and kits used therefor.
  • Cancer which refers to all malignant tumors, exhibits various pathologies depending on the tissue in which it forms, the genetic predisposition of the patient, environmental factors, and the like.
  • cancer treatment in general, the most effective therapy is preferentially selected from chemotherapy, radiation therapy, or surgery. It is extremely important to accurately determine the malignancy of cancer cells when deciding on a cancer treatment policy.
  • the grade of cancer is generally determined by the ability of cancer cells to grow and the effects of chemotherapy or radiotherapy. Low-grade cancers have low proliferative ability and are easy to remove surgically, or chemotherapy or radiation therapy is effective and the prognosis is good.
  • Non-special literature 1 Miura et al. And loning and characterization of an ATBF1 isoform thatex presses in a neuronal differentiation-dependent manner. J. Biol. Chem. (1995) 270: 2 6840-26848
  • Non-Patent Document 2 Kataoka et al. Alpha-fetoprotein producing gastric cancer lacks transcrip ription factor ATBF1. Oncogene (2001) 20: 869—873
  • Non-Special Reference 3 Ishu et al. ATBF1- A protein, but not ATBF1- B, ispreferentialyexpres ssed in developing rat brain. J. Compartive Neurology (2003) 465: 57-71
  • Non-Special Terms 4 Kataoka et al., INGl represses transcription by direct DNA binding and through eifectson p53.Cancer Res. (2003) 15: 5785-92.
  • Non-Patent Document 5 Noguchi et al. An example of long-term survival of AFP-producing gastric cancer with brain metastasis. Journal of the Japan Society for External Health (2003) 36 (12): 1659-1664
  • Non-Special Reference 7 Iida et al. Alteration of the AT motif binding factor- 1 expressionin alp ha— fetoprotein producing gastric cancer: is it an event fordifferentiation and proliferation of the tumors? Oncology Report (2004) 11: 3-7
  • Non-Special Terms 8 Kaspar et al. Myb- interacting protein, ATBF1, repressestranscription al activity of Myb oncoprotein. J. Biol. Chem. (1999) 274: 14422-1442
  • Non-Special Terms 9 Sun X et al. Frequentsomatic mutations of the transcription factor ATBF ⁇ in human prostate cancer. Nat Genet. (2005) Mar 6; [Epub ahead of print] Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide means for easily determining the malignancy of cancer cells.
  • ATBF1 AT motif binding factor 1
  • ATBF1-A 404 kDa, amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2).
  • -A coding base sequence GenBank accession
  • ATBF1-B (306 kDa, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4, and the base sequence encoding ATBF1-B (see GenBank accession number: L32833) is shown in SEQ ID NO: 5) (See Non-Patent Document 1).
  • ATBFl-A has a structure in which the N-terminal side of the protein is 920 amino acids longer than ATBFl-B.
  • ATBF1 moved from the cytoplasm to the nucleus and changed to the expression of the nucleus. Cell cycle arrest and growth suppression were observed. These results show that ATBF1 is a protein that actually translocates to the cytoplasmic nucleus as expected from the presence of two nuclear retention signals and that this translocation is associated with cell cycle arrest. Means.
  • PI3K family proteins confirmed at the time of the study, an ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated, telangiectasia cerebellum) was examined to determine which protein is involved in phosphate bundling during the nuclear translocation of ATBF1.
  • a caffeine a drug that is thought to specifically inhibit the action of the ataxia causative gene, was activated, resulting in inhibition of nuclear translocation when the PI3K inhibitor Wortmannin, LY294002 was used.
  • LY294002 was used.
  • caffeine inhibited the translocation of ATBF1 to the nucleus in almost all cultured cells, which means that PI3K involved in the phosphorylation of the ATBF1 nuclear retention signal site is ATM.
  • the introduction of ATBF1 into the nucleus means that it is promoted by the detection of DNA damage due to ATM activity (phosphorylation), that is, radiation.
  • ATBF1 travels from the cytoplasm to the nucleus and then to the cytoplasm. It became clear that switching to the time of the cell cycle and the proliferation state by doing.
  • ATBF1 expression vector was used to culture mouse neuroblastoma-derived cultures. Cell line Neur 0 2A cells were subjected to forced expression experiments (basic experiment 3). As a result, it became clear that cells with forced expression of ATBF1 did not recognize BrdU (5-bromodeoxyuridine) incorporation without exception, and the fact that the cell cycle was arrested by ATBF1 was clarified.
  • Cancer cells are similar to normal neuroepithelial cells in that they are undifferentiated and have the ability to divide, and are also similar in that ATBF1 is present in the cytoplasm. In normal neuroepithelial cells, ATBF1 is transferred to the cytoplasmic nucleus and finally differentiates into neuronal cells that have stopped cell growth and change their properties. There are two types of cancer cells with respect to the intracellular localization of ATBF1. ATBF1 is present only in the cytoplasm and a high grade malignancy. ATB F1 is present in the nucleus and a relatively low grade type. Can be classified.
  • ATBF1 functions by binding protein-protein to the tumor suppressor gene P53 in the cultured cells of gastric cancer as already shown in the previous report (Non-patent Document 6). It is assumed that this ATBF1 and p53 complex activates the promoter of the tumor suppressor gene p21, leads to increased expression of p21, and causes cancer cells to fall into apoptosis. It is also clear that the action of certain anticancer drugs (alkylating agents) to activate the DNA modification signal induces ATBF1 expression. It is. The therapeutic effect on cancer depends largely on the induction of ATBF1 and the effect of transferring ATBF1 to the nucleus. This is the principle by which the present inventors evaluate the effects of apoptosis and various treatments of various cancer cells from the mode of ATBF1 expression in clinical application experiments.
  • ATBF1 tends to be more abundant in the cytoplasm than in the nucleus or localized only in the cytoplasm, and in some cases with poor prognosis, both the nucleus and cytoplasm There was an example where ATBF1 was missing.
  • the staining properties of ATBF1 in the whole cell, cytoplasm, and nucleus are as follows: (1) When the nucleus is mainly localized, (2) When the cytoplasm is mainly localized, (3) The nucleus It was clear that the malignancy of cancer cells differed when the tendency of the cytoplasm to be lost was different, and that the malignancy of cancer cells could be determined by distinguishing them.
  • the present inventors conducted a more detailed study on the relationship between ATBF1 and malignancy of cancer cells. That is, the antibody D1-120 (the antibody specifically recognizing the region corresponding to exon 10 of the ATBF1 gene) used in each of the above experiments was compared with the N of the ATFF1-A protein. Two types of antibodies that specifically recognize the terminal side (region corresponding to exon 3 of the ATBF1 gene) (antibody names; NT440 and 1-12, see Fig. 31) and the C-terminal side of the ATBF1 protein (ATBF1 gene) Specific region) We examined the localization of ATBF1 protein in various cancer cells using the antibody (antibody name; AT6, see Fig. 31). As a result, the following knowledge was obtained.
  • ATBF1 is subject to processing of proteins that are not always present as a single large protein, depending on the type of tumor or malignancy, or sometimes It has been clarified that there are pathological conditions in which exon skipping occurs due to alternate splicing of mRNA during transcription of the ATBF1 gene, resulting in changes in protein structure. (See Figure 47).
  • Both NT440 and 1-12 dyeability tended to be localized mainly in the nucleus. Therefore, detection of the sites recognized by these antibodies, ie, the N-terminal A TBF1 site corresponding to exon 3 of the ATBF1 gene, is an indicator of whether the amount of ATBF1 in the whole cell has increased or decreased, or ATBF1 is missing. become.
  • NT440 remains in the cytoplasm and 1-12 is present in the nucleus, it means that there is a movement in which the N-terminal of ATBF1 is transferred to the nucleus due to the presence of serine 148 at the 148th serine. If the ratio of the amount of protein stained in 1-12 is obtained, it is possible to know the ratio of nuclear migration in the same part.
  • the presence or absence of NT440 site or 1-12 site, localization of nucleocytoplasm should be compared with the staining ability of the antibody recognizing the center of ATBF1 protein (D1-120) and the antibody recognizing the Z or C-terminal side.
  • a huge transcription factor it encodes not only the antibody corresponding to exon 10 that encodes an important DNA binding domain but also the N-terminus. Stained with an antibody corresponding to exon 3 (and an antibody corresponding to exon 11 encoding the C terminus). It is effective to compare.
  • the localization of the AT6 site is mainly cytoplasmic in most tumors.
  • the D1-120 site and AT6 site are detected simultaneously in the cytoplasm.
  • the staining of AT6 was localized in the nucleus, not in the cytoplasm. A certain part).
  • it may be judged that the degree of malignancy is extremely high only by observation that the D1-120 site is missing, but it is theoretically that Bcl-2 is suppressed when AT6 is localized in the nucleus. And the observation itself proves it.
  • the localization of the ATBF1 site that can be detected by D1-120 can be regarded as the most important in determining the malignancy of cancer.
  • NT440, 1-12, Dl-120, and AT6 Due to the staining properties of NT440, 1-12, Dl-120, and AT6 described above, in the same tumor, the N-terminal site of ATBF1 (NT440, 1-12), the site near the center (Dl-120), and the C-terminal site (AT6 If all of the three dyeing properties are mainly nuclear or cytoplasmic, there is no unity in each case.
  • the overall structure of the protein Represents the fact that there are pathological conditions that cause changes in structure.
  • the present invention has been completed based on the above results, and provides the following configurations. That is, the present invention is a method for determining the malignancy of a test cancer cell, comprising the step of detecting the amount of ATBF1 in the test cancer cell separated from a living body.
  • one or more selected from the group consisting of the following (1) to (3) is detected as the ATBF1 amount.
  • At least (1) is detected. In a more preferred embodiment of the present invention, the above (1) to (3) are detected.
  • an immunohistological staining method is preferably used as a detection method.
  • the present invention provides reagents (reagents for determining malignancy of test cancer cells) and kits (kits for determining malignancy of test cancer cells) that can be used in the method of the present invention.
  • the reagent of the present invention comprises an anti-ATBF1 antibody.
  • anti-ATBF1 As anti-ATBF1, (l) an antibody that recognizes the region corresponding to exon 10 of the ATBFl gene, (2) an antibody that recognizes a region corresponding to exon 11 of the ATBF1 gene, or (3) corresponds to exon 3 of the ATBF1 gene It is possible to use an antibody that recognizes the region to be treated.
  • the kit of the present invention comprises one or more antibodies selected from the group consisting of the following (1) to (3).
  • the kit of the present invention optionally includes ATBF1. Further, when an antibody produced using an antigen that is a fusion protein with a tag or carrier protein is used in the kit, the kit may further include a tag or a carrier protein. The invention's effect
  • the malignancy of a test cancer cell can be easily determined.
  • the malignancy judging method of the present invention can be used for predicting the proliferative ability of cancer expressed by the indicators of growth rate, tendency to infiltrate, and metastasis in various types of cancer.
  • the determination result of the present invention can be used to predict the effectiveness of chemotherapy or radiation therapy, for example.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the relationship between ATBF1 and p21 and p53. It outlines the mechanism by which cell cycle is stopped by DNA damage.
  • FIG. 2 shows ATBF1 expression in P19 cells and search by flow cytometry.
  • the upper row shows triple-stained images of DAPI (nuclear DNA staining) and ATBF1, j8-tubulin.
  • Figure 2a shows P19 cells without retinoic acid (RA) action. Neither ATBF1 nor j8-tubulin is observed.
  • Figure 2b shows P19 cells 24 hours after the action of retinoic acid (RA), negative for ⁇ -tubul in. The cytoplasm is stained for ATBF1.
  • Figure 2c shows P19 cells that ceased retinoic acid (RA) action and continued to culture for an additional 4 days.
  • FIGS. 2d, 2e, and 2f are flow cytometric analyzes of P19 cells shown in Figures 2a, 2b, and 2c, respectively. Only the cell cycle arrest is observed in Figure 2f.
  • Fig. 3a shows the potential position of ATBF1 in the nuclear retention signal by computer analysis. Presence of sequences similar to the consensus sequence is expected in two places (amino acids 277 and 2987, respectively).
  • Figure 3b also shows the potential location of extranuclear export signals in ATBF1. The presence of nuclear export signals is expected at three locations (starting with amino acids 1267, 2471, and 2504, respectively).
  • FIG. 4 shows the expression site of ATBF1 in P19 cells with and without fibronectin and poly-L ornithine applied to the culture dish after retinoic acid treatment.
  • Figure 4a shows ATBF1 expression in P19 cells without application. The cells are floating and ATBF1 is It does not move to the nucleus that appears in the cytoplasm.
  • Figure 4b shows ATBF1 expression in P19 cells 3 hours after the application of fibronectin and poly-L-ornithine to the culture dish. Transition of ATBF1 to the nucleus is observed.
  • Figure 4c shows the state after 24 hours, and nuclear ATBF1 expression is clearly enhanced.
  • FIG. 5 shows the effect of Leptomycin B on the nuclear translocation of ATBF1 in P19 cultured cells.
  • Fig. 5a shows the state of ATBF1 expression in P19 cells when Leptomycin B is not allowed to act! Recognize the presence of ATBF1 in the nucleus.
  • Fig. 5b shows the ATBF expression in P19 cells when LeptomysinB was allowed to act. It is clear that the concentration of ATBF1 in the nucleus has increased.
  • FIG. 6 shows the results of experiments for examining the effects of three PI3K family protein antagonists (Wortmannin, LY294002, caffeine) on the translocation of ATBF1 to the nucleus in P19 cells.
  • Figure 6a shows ATBF1 expression in the nucleus of P19 cells.
  • Figure 6b shows that the action of Wortmannin inhibits ATBF1 translocation into the nucleus, and ATBF1 is present in the cytoplasmic center.
  • Figure 6c shows that the action of LY294002 partially inhibits ATBF1 translocation into the nucleus. However, it is understood that the inhibitory effect is smaller than Wortmannin.
  • Figure 6d shows the effect of caffeine. It can be seen that the transfer of ATBFl to the nucleus was more completely inhibited compared to Wortmannin, LY294002.
  • FIG. 7 shows the findings of confocal laser micrographs in which full-length ATBFl cDNA was forcibly expressed in the mouse neuroblastoma-derived cell line Neuro2A cells.
  • BrdU was added to the culture medium for 1 hour just before the cells were observed for fixation, and DNA-synthesized cells were labeled.
  • BrdU incorporation cells were detected with a secondary antibody that emitted green fluorescence, and at the same time, the HA tag added to the forced expression vector was detected with a secondary antibody that emitted red fluorescence.
  • the green power of BrdU-positive cells was detected.
  • the cell cycle of each cell group was further tested using FACScan.
  • the cell cycle of the gene transfer group of ATBF1 cDNA shown in Fig. 7e is 10 ml for the Ml region, that is, the G1 / G0 phase cell group.
  • the cell cycle was almost completely stopped in the G1 / G0 phase by the forced expression of ATBF1 when combined with the DNA transfer efficiency.
  • FIG. 8 shows the histological findings of the isthmus of the rat brain on the 14th day of fetal period.
  • Figure 8a is a Br dU stained image. The expression of BrdU is clearly different between the paraventricular region (solid line) and the differentiation region (dotted line). There are many BrdU positive cells in the parabrain tissue region, and most of them are BrdU negative in the differentiated region.
  • Figure 8b is an ATBF1-stained image. In the paraventricular region (solid line), ATBF1 is localized in the cytoplasm, whereas in the segmental region (dotted line), ATBF1 is localized mainly in the nucleus. The enlarged parts are shown in FIGS. 8c and 8d. As shown by the black arrow in Fig.
  • DAB reactant black
  • Fig. 8e is a fluorescence-stained image (white is positive)
  • ATBF1 exists mainly in the nucleus as indicated by white arrows.
  • the DAB reaction product black
  • Fig. 8f the fluorescence-stained image in Fig. 8f (white is positive)
  • ATBF1 is present in the cytoplasm, and as shown by the white arrow, the nucleus is missing in black tone and no expression is observed.
  • FIG. 9 shows the difference in staining by the antigen activation method performed in noninvasive cancer and invasive cancer cases among urothelial cancers of the bladder. Auto-tarbing was performed using various buffers, and ATBF1 staining was performed. The black circle ( ⁇ ) indicates that the result of staining with nuclei was obtained. Open circles ( ⁇ ) indicate that cytoplasmic staining results were obtained.
  • Figure 10 shows the difference in staining by the antigen activation method performed in noninvasive and invasive cases of urothelial carcinoma of the bladder. Electron range treatment was performed using various buffers, and ATBF1 staining was performed. The black circle ( ⁇ ) indicates that the result of staining mainly of nuclei was obtained. Open circles ( ⁇ ) indicate that cytoplasmic staining results were obtained.
  • FIG. 11 shows the anti-tumor activity of urinary tract epithelial cancer of the urinary bladder in noninvasive cancer and invasive cancer cases, respectively. The difference in dyeability by the original activation method is shown. Pressure buffer processing was performed using various buffers, and ATBF1 staining was performed. The black circle ( ⁇ ) indicates that the result of staining with nuclei was obtained. Open circles ( ⁇ ) indicate that cytoplasmic staining results were obtained.
  • Figure 12 presents a representative example of the difference in staining by the selection of the antigen activation method performed in noninvasive cancer and invasive cancer cases among bladder urothelial cancer.
  • the upper row shows non-invasive cancer
  • the lower row shows invasive cancer cases.
  • the left shows a case of autoclaving using 50 mM Tris-HCl buffer ⁇ . ⁇ .
  • Both non-invasive cancer (Fig. 12a) and invasive cancer (Fig. 12b) show ATBF1 staining in the nucleus.
  • the middle (Fig. 12c, d) shows a case where D AKO TRS pH6.0 was used for microwave treatment.
  • Non-invasive cancer Fig. 12c
  • invasive cancer Fig. 12d
  • the right Fig. 12e, f
  • ATBF1 is localized in the nucleus
  • Fig. 12f ATBF1 is localized mainly in the cytoplasm around the nucleus as shown by an arrow, and the difference in localization between the nucleus and cytoplasm is highlighted. Show that it is possible.
  • FIG. 13 shows the results of ATBF1 staining in resected cases and biopsy cases of breast cancer cases.
  • Figures 13a (HE staining) and b (ATBFl staining) are 53-year-old females, showing sites confined within the ducts of papillary ductal carcinoma. Histologically, the site within the mammary gland (Fig. 13a, boxed with an arrow) is stained with ATBF1, and as shown by the white arrow, it is mixed with cells where ATBF1 is localized in the cytoplasm. The mixing of cells is evident (Fig. 13b).
  • Figure 13c (HE staining), d, e (AT BF1 staining) is a 66-year-old female patient with papillary ductal carcinoma presenting in the duct and necrotic at the center.
  • Figure 13c As shown by the arrow, ATBFl is localized mainly in the nucleus in most ductal vesicular carcinomas (Figs. 13d and e).
  • Fig. 13 HE staining) and g (ATBFl staining) are 50-year-old females and are papillary ductal carcinomas that infiltrate locally in the mammary gland (Fig. 13f). ATBF1 is confined to the cytoplasm of almost all cells (Fig.
  • Figures 13g shows coarse granular staining as indicated by the arrows.
  • Figures 13h (HE staining) and i (ATBFl staining) are 73-year-old females, which are papillary ductal carcinomas that infiltrate from the mammary gland tissue to the surrounding fatty tissue (Fig. 13h). As shown by the arrow, ATBF1 localized in the cytoplasm is observed (Fig. 13i). Compared to the dyeability in Fig. 13g, the amount of ATBF1 tends to be small.
  • Figures 13j (HE staining) and k (ATBFll staining) are for a 53-year-old female.
  • the tumor is a hard cancer that shows infiltrating with individual tumors (Fig. 13j).
  • ATBF1 is partially localized in the cytoplasm as indicated by the black arrow, but a portion of the cancer cell where ATBF1 is missing is also observed as indicated by the white arrow (Fig. 13k).
  • FIG. 14 shows HE-stained human bladder cancer cell lines (upper a, d, g, left-forced RT4, T24, ⁇ T1376 stained), ATBF1-stained image (middle b, e, h, From left to right, RT4, T24, and HT1376 stained images), and ⁇ 53 stained image (bottom c, f, i, left force is also sequentially stained RT4, T24, and HT1376).
  • RT4 ATBF1 is also present in the cytoplasm.
  • Fig. 14b there are cells that are clearly localized in the nucleus
  • p53 also shows strong staining in the nucleus (Fig. 14c).
  • T24 A TBF1 is almost confined to the cytoplasm as shown by the black arrow, and the staining is coarse granular (Fig. 14e).
  • p53 shows very thin staining in the nucleus (Fig. 14f).
  • HT1376 is very small in ATBF1, limited to the nucleus as shown by the black arrow (Fig. 14h).
  • p53 has staining in the nucleus (Fig. 14i).
  • Figure 15 shows human bladder urothelial carcinoma tissues (a case of papillary intramucosal cancer WHO Grade I low grade, b papillary intramucosal cancer WHO Grade 1 (low grade), WHO Grade II (moderate) Grade), c submucosal invasive cancer, WHO Grade II moderate grade, d submucosal invasive cancer WHO Grade III high grade, and HE staining (al , bl, cl, d 1), and ATBF1 stained images (a2, b2, c2, d2, d3).
  • the papillary carcinoma in situ in Fig. 15a can be judged as WHO Grade I (al) because the nuclei are small and arranged.
  • a TBF1 expression at the black box is restricted to the nucleus as indicated by the black arrow (a2).
  • the papillary carcinoma in situ in Figure 15b is a mixture of WHO Grade I (upper bl) with small nuclei and well-ordered, and WHO Grade II (below bl) with larger nuclei and slightly disturbed arrangement. It is.
  • ATBF1 is localized at the nucleus center as indicated by the black arrow at the Grade I site, and at the cytoplasm center as indicated by the white arrow at the Grade II site (b2). .
  • FIG. 15c shows that the tumor has invaded and spread in the subepithelial connective tissue and vasculature, and can be judged as WHO Grade II from the size of the cells (cl).
  • the cytoplasm shows coarse granular staining (c2).
  • Figure 15d shows a WHO Grade III invasive cancer with densely arranged cells and very large nuclei (dl).
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm as shown by the white arrow (d2), and ATBF1 is expressed very little in the nucleus and cytoplasm as shown by the black arrow.
  • the part (d3) that tends to be missing is mixed.
  • FIG. 16 shows ATBF1 expression in an adenoma diagnosed as group III of the stomach.
  • Figure 16a1 is a gastric adenoma or atypical epithelial nest showing dense growth of atypical ducts with cubic eosinophilic cell power.
  • ATBF1 is localized in the nucleus as indicated by the arrow (a2), and expression of p53 in the nucleus (a3) and expression of p21 in the nucleus (a4) are clear.
  • Figure 16bl is a moderately atypical adenoma with irregular intestinal microtubules, and is an atypical epithelial nest.
  • ATBF1 is localized in the nucleus as shown by the arrow (b2), and the expression of p53 and p21 is also observed (b3, b4).
  • Figure 16cl is an intestinal gland duct that is a highly atypical or borderline adenoma or atypical epithelial nest with an elongated nucleus and a high stratification tendency.
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm as indicated by the arrow (c2), and although p53 staining is observed (c3), p21 expression is lost (c4).
  • FIG. 17 shows ATBF1 expression in histologically highly differentiated or moderately differentiated tubular adenocarcinoma among cancers diagnosed with Group V in the stomach.
  • Figure 17al HE-stained is a well-differentiated tubular adenocarcinoma consisting of large and small glandular duct structures that grow invasively under the esophageal squamous epithelium (dashed arrow).
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm (a2, ATBF1 staining) and ATBF1 is missing (a3, ATBFl staining).
  • 17bl (HE-stained) is a medium-sized tubule adenocarcinoma with large and small gland ducts closely and irregularly coherent.
  • a TBF1 is localized in the cytoplasm as indicated by the arrow in most cells (b2, ATBFl staining).
  • FIG. 18 shows ATBF1 expression in poorly differentiated adenocarcinoma among cancers diagnosed as Group V in the stomach.
  • Figure 18al shows adenocarcinoma with solid growth
  • a2, a4 HE staining
  • HE staining is an enlargement of the boxed area. It turns out that it is solid and lacks glandular tube formation.
  • the histological images in HE staining are similar, there are sites where ATBF1 is missing (a3, ATBF1 staining) and sites where ATBF1 is localized in the cytoplasm (a5, ATBFl staining) as indicated by the arrows.
  • Fig. 18bl shows that anaplastic cancer cells with a high nucleus / cytoplasm ratio are infiltrated individually. ATBF1 is restricted to the cytoplasm as indicated by the arrow (b2, ATBF1 staining).
  • Fig. 19 shows ATBF1 expression in the infiltrated part of the stomach (Fig. 19a) and metastatic infiltrating part of the gallbladder (Fig. 19b) among cancers diagnosed as Group V in the stomach.
  • Fig. 19al shows invasion of signet ring cells with nuclei pushed around by viscous droplets.
  • ATBF1 is restricted to the cytoplasm of the signet ring cells as indicated by the black arrow, and stainability as indicated by the dotted arrow. May be missing, and an infiltrating part is formed by mixing these cells.
  • Fig. 19 shows ATBF1 expression in the infiltrated part of the stomach (Fig. 19a) and metastatic infiltrating part of the gallbladder (Fig. 19b) among cancers diagnosed as Group V in the stomach.
  • Fig. 19al shows invasion of signet ring cells with nuclei pushed around by viscous droplets.
  • ATBF1 is restricted to the cytoplasm of the signe
  • ATBF1 is absent in both lymphatic vessels (b2, ATBF1 staining) and infiltrated areas (b3, ATBFl staining).
  • FIG. 20 shows ATBF1 expression at various grades of Paget's disease of extramammary disease that occurred in the penis.
  • Figure 20a HE-stained
  • Figure 20bl HE staining
  • Fig. 20cl HE staining
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm as indicated by the arrow (c2, ATBFl staining).
  • ATBFl expression in the tumor formation (a, HE staining) is mainly on the tumor surface (d, the part indicated by the arrow in ATBFl staining), and tends to be lost in the deep part of the tumor.
  • Fig. 20el and fl both HE staining
  • cord-like tumors are both infiltrated.
  • ATBFl is highly localized in the cytoplasm on the surface of the tumor as shown by the arrow in Fig. 20e2 (ATBFl staining), and ATBF1 is missing in the deep part of the tumor as shown by the arrow in Fig. 2012 (ATBF1 staining).
  • Figure 20gl (HE-stained) is an inguinal lymph node that shows tumor metastasis in lymphoid tissues and lymphatic vessels (dotted arrows).
  • Fig. 20g2 (ATBFl staining) shows that ATBF1 is missing as indicated by the arrow in the Paget cells present in the lymphatic vessels (dotted arrows).
  • FIG. 21 shows ATBF1 expression in bone marrow.
  • Fig. 12a is a bone marrow tissue image by HE staining, which shows mildly hyperplastic bone marrow cells. Although not clearly shown in the figure, there are a mixture of three types of hematopoietic cells, leukocytes, erythrocytes, and platelets.
  • Figure 21b (ATBFl staining) shows that ATBF1 is positive in some cell groups of bone marrow. A partial enlargement of this cell is shown in Fig. 21c (ATBFl staining).
  • FIG. 22 shows histological images and ATBF1 expression in small peripheral lung tumor tissues.
  • Figure 22al (ATBFl staining) shows the formation of a tumor with a diameter of about 1 cm in the lung as indicated by the arrow.
  • Figure 22a2 (ATBFl staining) is an enlarged image of tumor cells that replace the alveolar epithelium. It can be seen that it has proliferated and the growth of interstitial connective tissue has increased. Tumor cells tend to be flat, orderly arranged, and the size of the nuclei is mild, allowing diagnosis of low-grade atypical adenomatous hyperplasia (1 ow-grade AAH). When the magnification is further increased, the presence of ATBF1 is observed in the nucleus of the tumor cell as shown in FIG.
  • Figure 22a3 (ATBFl staining).
  • Figure 22bl (HE staining) shows the formation of a tumor with a diameter of about 0.7 cm that exists around the bronchiole of the lung as shown by the arrows.
  • Figure 22b2 (HE-stained) shows the enlargement of tumor cells present to replace the alveolar epithelium, stromal growth, lymphocyte infiltration, tumor cell size, cells from low-grade AAH in Figure 22a High density It is clear that the height of the cells is high, and it can be diagnosed as high grade adenoma-like hyperplasia (high-grade AA H).
  • Figures 22b3 and b4 show that ATBF 1 is localized mainly in the nucleus of most tumor cells.
  • Fig. 22cl HE staining
  • Figure 22c2 HE-stained image
  • Figure 22c3 HE staining
  • tumors in areas with alveolar collapse and fibrosis are arranged densely.
  • BAC bronchioloalveolar carcinoma
  • Noguchi type B bronchioloalveolar carcinoma
  • the part where staining is present in the nucleus partially exists as shown by the white arrow in Fig. 22c4 (AT BF1 staining).
  • ATBF1 has a staining property in the cytoplasm.
  • FIG. 22c5 shows the alveolar collapse and fibrosis, and it is clear that ATBF1 is localized in the cytoplasm in most cells as indicated by the arrows.
  • FIG. 23 shows ATBF1 expression in atypical adenomatous hyperplasia (al, HE staining) and localized bronchioloalveolar carcinoma (bl, HE staining).
  • ATBF1 is strongly localized in the nucleus within the range indicated by the arrow (a2, ATBF1 staining), and the boundary with normal tissue is very clear.
  • ATBF1 is strongly localized in the cytoplasm within the range indicated by the arrow (b2, ATBF1 staining), and the boundary with normal tissue is very clear.
  • FIG. 24 shows preparations in lung adenocarcinoma tissues of 1 case (a, ATBF1 staining) in which chemotherapy was effective and 3 cases (b, c, d, ATBF1 staining) in which chemotherapy was ineffective.
  • Invalid The three preparations are Macroscopically, DAB brown is very light (b, c, d), while the preparation in one case is dark brown. Although the brown color of the preparation is difficult to understand on the naked eye, the ATBF1 staining at low magnification shows that the ATBF1 staining is strong (a2) as shown by the arrow in the effective case.
  • Fig.25 shows pre-treatment (al, bl) and treatment of cases (a, 65 years old, male) who responded well to chemotherapy and cases (b, 65 years old, female) who were ineffective.
  • a2, b2 CT images
  • lung adenocarcinoma histology a3, b3, HE staining
  • ATBF1 expression site a4, b4, ATBF1 staining
  • the CT images of the most effective cases show swelling (al, white arrows) and disappearance (a2, white arrows) of the tracheobronchial lymph nodes.
  • the tumor is a low fractional adenocarcinoma ( a3 ) with a partial lumen.
  • Tumor cell ATBF1 expression (a4) has a mixture of sites localized in the cytoplasm (white arrows) and sites localized in the nucleus (black arrows).
  • the ineffective CT images show the presence of metastatic tumor (bl, black arrow) and increase (b2, black and white arrow) at the upper pole of the left kidney. Histologically, the tumor is a tubular adenocarcinoma (b3).
  • ATBF1 is expressed in small amounts, all localized in the cytoplasm (b4, black arrow), and no localization in the nucleus is observed.
  • FIG. 26 shows a histological image (a, HE staining) and ATBFl (b-g, AT BF1 staining) of a 74-year-old male. Histologically, as shown in Fig. 26a, a small round or short spindle cell is a tumor that grows densely and solidly with a small amount of vascular connective tissue. Many fission images indicate a fast-growing tumor. Its sequence is solid and alveolar.
  • Figure 26b shows low ATBF1 staining, indicating that tumors have very high ATBF1 expression compared to other types of tumor cells. As shown in Figs.
  • Fig. 26c and 26d there are some sites that show staining mainly in the nucleus (c) and mainly in the cytoplasm (d).
  • Fig. 26e shows a nuclear-stained site, which shows strong ATBF1 expression in the nucleus, as indicated by the white arrow.
  • ATBF1 shows staining in the cytoplasm around the nucleus, and it is clear that tumor cells may be stained in both nucleus and cytoplasm.
  • Fig. 26f shows the site where the nucleus (dashed arrow) and cytoplasm (arrow) are mixed, and Fig. 26g shows the site mainly composed of cytoplasm (arrow).
  • Fig.27 shows the histology of neuroblastoma (a, c, HE staining) and subcellular localization of ATBF1 (b, d) in surviving (a, b) and dead (c, d) , ATBF1 staining).
  • Fig. 27a is a left adrenal tumor of an 8-month-old girl who was diagnosed as a poorly differentiated neuroblastoma, low MKI, and favora history history group. ATBF1 removes a small number of cells as indicated by the arrows in Figure 27b. Almost all cells were confined to the nucleus.
  • Fig.27 shows the histology of neuroblastoma (a, c, HE staining) and subcellular localization of ATBF1 (b, d) in surviving (a, b) and dead (c, d) , ATBF1 staining).
  • Fig. 27a is a left adrenal tumor of an 8-month-old girl who was diagnosed as a poorly differentiated neuroblasto
  • 27c is a 2-year-old boy, histological image of retroperitoneal lymph nodes, showing tumor cells invading the vasculature, and histologically diagnosed as poorly differentiated neuroblastoma ⁇ low MKI, unfavorable histology group. Observed at low MKI, anaplasia is conspicuous, and mitosis is often recognized as 10 / high magnification field of view). ATBF1 tended to be localized in the cytoplasm in most cells as shown by the arrow in FIG. 27d.
  • Figure 28 shows HE-stained images (al, bl), c-kit-stained images (a2, b2), and CD34-stained in order from the left for GIST tissues (a: GIST primary, b: colon primary GIST). Image (a3, b3) and ATBF1-stained image (a4, b4) are shown.
  • GIST of the stomach has tumor formation in the muscle layer below the gastric mucosa shown by the wavy arrow in Fig. 28al (arrow), and the border with the surrounding is relatively clear.
  • the majority of tumor cells are positive for c-kit and CD34 in the cytoplasm.
  • FIG. 28b4 As shown by the arrow in 8a4, ATBF1 is localized in the nucleus in the majority of tumor cells.
  • GIST of the colon in the death case shows invasive growth in the submucosa below the colonic mucosa as indicated by the wavy arrow in Fig. 28bl, and the boundary with the surrounding tissue is from the surviving case (see Fig. 28al). It is unclear.
  • Tumor cells are c-kit positive (arrow in Fig. 28b2) but CD34 negative (note that only the small blood vessels shown in the arrow in Fig. 28 b3 are CD34 positive).
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm in the majority of tumor cells as shown by the arrow in FIG. 28b4.
  • FIG. 29 shows various meningioma tissues; fibrous meningiomas WHO grade I (a), meningiocutaneous meningioma WHO grade I (b), atypical meningioma WHO grade II ( c), clear cell meningioma WHO grade I 1 (d) shows HE-stained image (al, bl, cl, dl), ATBF1-stained image (a2, b2, c2, d2).
  • Fig. 29al is a fibrous meningioma consisting of a long and thin fibrocarcinoma tumor cell, and ATBF1 is localized only in the nucleus of the long cell as shown by the arrow (a2).
  • Figure 29bl is a meningiocutaneous meningioma with partial whorl formation.
  • ATBF1 is localized only in the nuclei of tumor cells (b2).
  • Fig. 29cl shows partial brain infiltration, atypical live meningioma with a clear cell density compared to the meningioma in Fig. Al, bl, and ATBF1 in the cytoplasm in the majority of tumor cells as indicated by the arrows Localized (c2).
  • Figure 29dl is a clear cell meningioma mainly composed of glycogen-rich cells with a bright cytoplasm.
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm in the majority of tumor cells as shown by the arrow (d2).
  • FIG. 30 All micrographs are from prostate cancer biopsy specimens of 61-, 66-, and 76-year-old male cases. The material was subjected to ATBFl staining. Histologically, the photos were arranged in the order of Gleason grade and compared with A TBF1 staining. In the figure, 3A-5B indicates Gleason grade. Grade 3A is an irregular gland duct size but does not show a fusion tendency. Grade B is a mixture of smaller gland ducts. 3 ⁇ 4B. did. If the cancer cells did not form solid masses or showed a tendency to infiltrate in isolation, it was judged as 5B.
  • the black arrow shows an example in which ATBF1 is localized in the nucleus of the tumor cell
  • the wavy arrow shows an example in which ATBF 1 is localized in the cytoplasm of the tumor cell.
  • ATBFl is localized in the nucleus
  • 5B it is localized in the cytoplasm.
  • grade 3B to grade 4B tumor cells showing the nucleus and cytoplasm are mixed.
  • FIG. 31 shows NT440, 1-12, which recognizes the N-terminal part of ATBF1, D1-1 20, which recognizes the central part, AT6 part which recognizes the C-terminal, each exon and protein of the ATBF1 gene Correspondence of sequence, amino acid sequence of polypeptide used for immunization is shown. NT440 and 1-12 showed differences between ATBF1 sequences in humans and mice.
  • FIG. 32 shows the histological findings of a normal lymph node in a 71-year-old male.
  • FIG. 32A shows the distribution of Be 2 at sites including lymphoid follicle cells and marginal regions.
  • FIG. 32B-1 is AT6 staining of the same site
  • FIG. 32B-2 is an enlarged view of the lymph follicle site
  • FIG. 32B-3 is an enlarged view of the marginal region.
  • FIG. 32C (NT440), FIG. 32D (1-12), and FIG. 32E (D1-120) show ATBF1 staining other than AT6 for the region including the marginal region and lymphoid follicle.
  • FIG. 33 shows a summary of ATBF1 staining in normal lymph nodes of a 71-year-old male.
  • Figure 33A is a schematic of the position of the antibody in the ATBF1-A protein.
  • Figures 33B and C show the staining intensity of each antibody in the region including the lymphoid follicle and the marginal region, the localization ratio in the nucleus and cytoplasm, the position of protein processing assumed from the staining property, and the nuclear AT6 site. It is shown schematically that the transcription of be ⁇ 2 gene is repressed, and that the transcription of be ⁇ 2 gene is deregulated when the location of AT6 site is changed to cytoplasm.
  • FIG. 34 is a Western blotting search for changes in the molecular weight of ATBF1 protein depending on the presence or absence of retinoic acid treatment of three types of cultured cells (P19, NB1, GOTO).
  • the antibody used is D1-120 corresponding to Exon 10.
  • FIG. 35 shows a GIST histology of a 52-year-old male stomach.
  • Fig.35A c-kit
  • Fig.35B CD34
  • Figure 35C AT6 part of ATBF1
  • Figure 35D Bc2
  • the arrows in Figs. 35C and D show that the localization of AT6 and Be ⁇ 2 is complementary, and details of the staining properties of ATB Fl and Bc ⁇ 2 in the area of circle 1 and circle 2 are shown.
  • Search in Figure 36 shows that the localization of AT6 and Be ⁇ 2 is complementary, and details of the staining properties of ATB Fl and Bc ⁇ 2 in the area of circle 1 and circle 2 are shown.
  • FIG. 36 shows the details and summary of the histology of a 52-year-old male stomach GIST. Dyeability at the area of mouth circle l (Al-El) and mouth circle 2 (B2-E2) in Fig. 35, (A) NT440, (B) 1-12, (C) D1-120, (D) A summary of ATBF1 staining at AT6, (E) Bcl-2 and Bd_2 expression missing sites (F) and Bd_2 expression sites (G) is shown.
  • FIG. 37 is a histological image of a 56-year-old female, large-cell diffuse B-cell lymphoma.
  • HE A1 weak enlargement, A2 strong enlargement
  • CD20 B
  • AT6 C1 weak enlargement, C2 strong enlargement
  • PCNA D1 weak enlargement, D2 strong enlargement
  • Bcl-2 El weak enlargement, E2 strong enlargement
  • FIG. 38 summarizes and summarizes the staining properties of ATBF1 and Be ⁇ 2 in a 56-year-old female, large-cell diffuse B-cell lymphoma.
  • the stained images of NT440 (A), l-12 (B), D1-120 (C), AT6 (D), and Bcl-2 (E), and a summary of staining (F) are shown.
  • Figure 39 shows a histological image of a glioblastoma of the cerebrum, a 63-year-old male.
  • the localization of GFAP (A2, B2) in solid tumor sites (Al, HE) and necrotic sites (B1, HE) is shown.
  • B1 and B2 arrows indicate the range of necrotic tissue.
  • FIG. 40 is a stained image of GFAP, Dl-120, AT6 of a glioblastoma glioblastoma of a 63-year-old male. Details of staining properties (al, a2) at the GFAP missing site (A, mouth 1) and GFAP positive site (A, mouth 2) are shown. D1-120 (B) and AT 6 (C) are similar to the staining pattern (B arrow, C arrow). Dl-120 (bl), AT6 (cl) staining is predominantly nuclear (bl, cl arrow) at the GFAP missing site (A, mouth 1), and Dl- at the GFAP positive site (A, mouth 2). 120 (b2), AT6 (c2) staining is mainly cytoplasmic (b2, c2 arrows).
  • FIG. 41 is a stained image of MIB1, Bcl-2, Be ⁇ xL of a glioblastoma of the cerebrum, a 63-year-old male.
  • GFAP deletion site in Fig. 40 (Fig. 40A, box 1), staining pattern in GFAP positive site (Fig. 40A, box 2) and MIBKA), Bcl-2 (B), Bcl-xL ( C) Staining pattern (A, B, C arrows) is similar.
  • MIB1 (al, a2), Bcl-2 (bl, b2), Bcl-xL (cl, c2) in GFAP deletion site (A, mouth 1) and GFAP positive site (A, mouth 2) Details of dyeing The details are shown.
  • FIG. 42 is a summary of NT440, 1-12 stained images and ATBF1 staining of a 63-year-old male, cerebral glioblastoma multiforme. Details of staining of NT440 (Al, A2) and 1-12 (Bl, B2) in the GFAP missing site in Fig. 40 (Fig. 40A, box 1) and GFAP positive site (Fig. 40A, box 2) Indicates. A summary of ATBF1 staining (C) at sites without GFAP production and ATBF1 staining (D) at sites showing GFAP production in this tumor is shown.
  • Figure 43 shows the findings of HE and NCAM in a 52-year-old male, esophageal neuroendocrine cancer. Esophageal mass formation (A, HE), NCAM (CD56) positive image (B), lymphatic vessel invasion (C, HE), histologically showing a ribbon-like arrangement (D, HE, black arrows) , And a portion (D, HE, white arrow) indicating a solid sequence is illustrated.
  • Figure 44 shows a comparison of tissue organization and ATBF1 expression in a 52-year-old male esophageal endocrine cancer.
  • HE A1, 2)
  • NT440 Bl, 2 of the part (A1-E1) showing a highly differentiated sequence in the form of a ribbon
  • A2-E2 showing a dense, nest-like and poorly differentiated sequence , 1-12 (CI, 2), Dl-120 (Dl, 2), AT6 (El, 2) staining results and summary (F, G) are shown.
  • Figure 15 shows the findings of a 56-year-old male, undifferentiated carcinoma of the sinuses, and lymph node metastasis. Summary of MIBl (A), Bc ⁇ 2 (B) expression, NT440 (C), 1-12 (D), D1-120 (E), AT6 (F) expression and staining (G) of tumors Illustrated.
  • Figure 16 shows the findings of a 47-year-old female, large-cell diffuse B-cell lymphoma of the brain.
  • Tumor HE Al, 2)
  • CD20 B
  • CD79a C
  • Be 2 D
  • NT440 E
  • 1-12 F
  • Dl- 120 G
  • AT 6 H
  • I ATBF1 staining
  • Fig. 17 shows the mechanism of ATBF1-A and B2 types of mRNA produced by using different promoters as shown in Non-Patent Documents 1 and 9, and alternative splicing, and abnormal skipping of etason 10 in human malignant tumors. It is a schematic explanatory drawing of the mutant protein production by.
  • Figure 47 shows an example of a 47-year-old female, large-cell diffuse B lymphoma of the brain, whose lack of staining at site D1-120 is shown in Figure 46.
  • Figure 48 shows the findings of a 68-year-old female, large-cell diffuse B-lymphoma of the brain. As shown in the figure, the difference in ATBF1 expression and Be 2 staining between the central part (A) and the peripheral part (B) of the tumor is shown.
  • NT440 ( ⁇ , ⁇ ), 1-12 ( ⁇ 2, ⁇ 2), Dl—120 (A3, B3), AT6 (A4, B4), Bel- 2 (A5, B5) Shows the stained image.
  • FIG. 49 is a summary of ATBF1 expression in a 68-year-old female, brain large cell diffuse B lymphoma. The staining of the central part of the tumor (A) and the peripheral part of the tumor (B) are summarized and illustrated.
  • FIG. 50 is a diagram showing the sequence of each exon (exons 2 to 11) of ATBF1.
  • the underlined part is the exon area.
  • An exon number is attached to the upper right of each exon sequence.
  • the exon number is the ATBF1-B-specific untranslated region exon located at the 5 'upstream end of the TBF1 gene, followed by the ATBF1-A-specific untranslated region exon, the first ATBF1- Exon including the A translation region is number 3 and the following exons are 4 to: L 1 in order.
  • the “test cancer cell” refers to a cell for which malignancy is determined by the method of the present invention.
  • the test cancer cell is separated from the living body. That is, the present invention is applied to a test cancer cell in a state separated from a living body.
  • “Separated from the living body” refers to a state in which the test cancer cell is completely isolated from the organism from which it is removed by removing a part of the living tissue in which the test cancer cell exists.
  • the test cancer cells are usually prepared in a state existing in the living body, that is, in a state of being bound to surrounding cells, and used in the method of the present invention.
  • the test cancer cells may be used in the method of the present invention after the surrounding cell force is also separated (isolated).
  • test cancer cells in the present invention include cells that are judged to be cancer by other diagnostic methods, cells that are judged to be highly likely to be cancer, and cells that have the possibility of being cancer. .
  • cells that are judged to be cancer by other diagnostic methods or cells that are judged to have a high probability of being cancerous are used.
  • Other diagnostic methods here include, for example, X-ray contrast examination, endoscopy, ultrasonic examination, CT examination, MRI examination, PET examination, and diagnostic method using one tumor marker.
  • test cancer cells are collected from tissue suspected of having cancer due to one or more of these.
  • cancer is to be interpreted broadly and includes carcinoma and sarcoma.
  • cancer is used interchangeably with “tumor”.
  • Pathological diagnosis is confirmed It may include benign tumors, benign malignant border lesions, and malignant tumors in general before being determined, that is, before benign or malignant as a tumor is determined.
  • ATBF1 refers to AT motif binding factor 1 (AT motif binding factor 1).
  • ATBF1 is known to be a transcription factor that binds to the AT rich domain of an AFP (alphafetoprotein) regulator and down-regulates the expression of the AFP gene (see Non-Patent Document 1).
  • AFP alphafetoprotein
  • ATBF1 has two isoforms (ATBF1-A and ATBF1-B).
  • ATBF1 is used as an expression encompassing these two isoforms. Therefore, unless otherwise specified, “ATBF1 amount” means the total abundance of each isoform. In the method of the present invention, in principle, the sum is used as a detection target. However, this does not prevent the detection of only the amount of either isoform. It should be noted that when “ATBF1” is simply described, it means ATBF1 protein except when it is clear that it has other meanings.
  • the structure of the ATBF1 gene is shown in FIG. 47 (see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 9).
  • the sequences of exon 2 to L1 of the ATBF1 gene are shown in FIGS.
  • the ATBF1 gene contains exons 1 to: L1, and ATBF1-A and ATBF1-B mRNAs are formed as a result of alternative splicing. Note that the regions indicated as exons 10 and 11 in FIG. 47 are described as exons 9 and 10 in Non-Patent Document 9, respectively.
  • amino acid sequences and base sequences corresponding to exon 3, exon 10, and exon 11 are described by the following SEQ ID NOs in the attached sequence table.
  • amino acid sequence of the region corresponding to exon 3 (SEQ ID NO: 11), the base sequence of exon 3 (SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of the region corresponding to exon 10 (SEQ ID NO: 13), the base sequence of exon 10 (SEQ ID NO: 14), amino acid sequence of the region corresponding to exon 11 (SEQ ID NO: 15), base sequence of exon 11 (SEQ ID NO: 16).
  • the “ATBF1 amount in the test cancer cell” refers to the total amount of ATBF 1 present in the nucleus and cytoplasm of the test cancer cell.
  • the amount of ATBF1 in the test cancer cell is also referred to as “the amount of ATBF1 in the whole cell of the test cancer cell”!
  • the amount of ATBF1 in the nucleus of the test cancer cell refers to the amount of ATBF1 present in the nucleus of the test cancer cell.
  • the amount of ATBF1 in the cytoplasm of the test cancer cell refers to the amount of ATBF1 present in the cytoplasm of the test cancer cell.
  • Detecting the amount of ATBF1 means grasping the amount of ATBF1 as an absolute amount or a relative amount.
  • the reference of the relative amount here can be, for example, the amount of ATBF1 of the standard sample prepared according to the grade of malignancy.
  • the amount of ATBF1 in the nucleus can be used as a reference.
  • the amount of ATBF1 in the cytoplasm is the detection target, the amount of ATBF1 in the nucleus can be used as the reference.
  • detecting the amount of ATBF1 includes examining whether ATBF1 exists. Usually, the presence of ATBF1 and, if present, its amount will be examined.
  • the amount of ATBF1 is measured to the extent that it is possible to determine the malignancy of the test cancer cell by comparing with the amount of ATBF1 in the control that is an index of malignancy. I can do it.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for determining the malignancy of a test cancer cell (malignancy determination method).
  • the “malignancy determination method” refers to a method of determining the malignancy of a test cancer cell.
  • the grade of malignancy of cancer is generally classified (determined) based on cell atypia, cell, tissue architecture atypia, proliferation, invasiveness, metastasis, and the like.
  • the grade of malignancy is low, and it is difficult to cause invasion and metastasis with slow cell proliferation in cancer. Cases are conceivable, and these combine to improve the prognosis.
  • malignancy is high, and in cancers, the rate of cell proliferation is fast, and invasion and metastasis are likely to occur, so surgical resection is likely to be difficult.
  • malignancy determination is carried out by predicting the ease of invasion and metastasis due to the growth rate of cancer, that is, the prediction of the growth ability of cancer and the ability to obtain an effective therapeutic effect by chemotherapy or radiation therapy Can be used as a standard. Therefore, proliferative potential is low (cell cycle arrest is likely to occur), and chemotherapy or radiotherapy is expected to be effective (apoptosis is easily introduced due to DNA damage).
  • Predicting high proliferative ability based on the intensity of cytoplasmic staining means that invasion, metastasis, and progression progress quickly, and surgical treatment is often impossible, and it is judged as highly malignant.
  • apoptosis is more likely to be introduced due to DNA damage than the strong staining of the nucleus, cancer cells can be completely killed when reacting easily to chemotherapy, so low-grade cancer It will also be judged. Therefore, in determining the degree of adverse effects, it is a reality that it is necessary to always consider the two factors of cancer proliferative ability and the effectiveness of chemotherapy or radiotherapy, and it is practical and practical. It is also a cautionary point when considering the degree of maliciousness.
  • the malignancy of cancer can be evaluated using either of the above two factors as an index.
  • a) a step of detecting the amount of ATBF1 in the test cancer cell is performed. Based on the detected amount of ATBF1 obtained as a result, the malignancy of the test cancer cell is determined. As shown in the examples described later, for example, the amount of ATBF1 is low in the whole cell (both nucleus and cytoplasm), and the malignancy of the case is very high, whereas the expression level of ATBF1 is high, In many cases, the prognosis was good and they were likely to respond to various therapies. Therefore, the amount of AT BF1 in the whole cell is effective as an index for determining malignancy.
  • the amount of ATBF1 in the whole cell can also be quantified by the quantification of ATBF1 mRNA using the PCR method and the scoring method.
  • b) a step of detecting the amount of ATBF1 in the nucleus of the test cancer cell is performed. Based on the detected amount of ATBF1 obtained as a result, the malignancy of the test cancer cell is determined.
  • the overall malignancy is determined by individually judging the proliferative ability, sensitivity of chemotherapy or radiotherapy. It is desirable to do.
  • a step of detecting the amount of ATBF1 in the cytoplasm of the test cancer cell is performed.
  • the malignancy of the test cancer cell is determined based on the presence or absence of the amount of ATBF1 present in the cytoplasm of the test cell. Specifically, for example, when a large amount of ATBF1 is detected in the cytoplasm, it can be determined that the proliferation ability of the test cancer cell is maintained. Further, even when ATBF1 is not detected in the cytoplasm or when the detection amount is small, it can be determined that the proliferation ability of the test cancer cell is maintained under the condition that there is no ATBF1 expression in the nucleus. Here again, it is preferable to make a comprehensive judgment that takes into account the state of expression in the nucleus.
  • a) a step of detecting the amount of ATBF1 in the test cancer cell b) a step of detecting the amount of ATBF1 in the nucleus of the test cancer cell, and c) a test cancer
  • ATBF1 is compared between the nucleus and cytoplasm of the test cell.
  • the grade of malignancy of the test cell is determined mainly based on the localized state of AT BF1.
  • ATBF1 tends to be localized in the nucleus in cancer cells that have low proliferative ability or high sensitivity to chemotherapy or radiation therapy and can be predicted and judged to have low malignancy. There was found.
  • ATBF1 is confined to the cytoplasm (that is, when the amount of ATBF1 in the nucleus is relatively small)
  • histologically the progression of cancer, such as subepithelial invasion, becomes stronger, and chemotherapy or radiation It was found that the sensitivity of the therapy tends to be low, and the malignancy is higher.
  • ATBF1 is missing in both the nucleus and cytoplasm through the search for highly malignant types of cancer and the search for metastases in general cancers, the tendency to become more malignant becomes clearer. became.
  • it is determined to which of a plurality of categories the malignancy becomes higher in order.
  • the number of divisions here is not particularly limited.
  • grade 1 (low): ATBF1 tends to localize in the nucleus
  • grade 2 (medium): ATBF1 tends to localize in the cytoplasm
  • grade 3 (high): ATBF1 tends to be missing in both nucleocytoplasm
  • grade 4 specifically, for example, grade 1 (low: ATBF1 tends to be highly localized in the nucleus, grade 2 (medium): ATBF1 Mild to moderately localized in the nucleus
  • grade 3 (high): ATBF1 is confined to the cytoplasm
  • grade 4 (very high): ATBF1 is in the nucleus and cytoplasm
  • the nucleus' cytoplasm shows high ATBF1 expression, and the proliferation ability is high but the sensitivity to chemotherapy is also high. How to treat high cancer as a malignancy belonging to any of the above grades 1 to 3 or 1 to 4 The law is expected to be difficult decision.
  • the type of cancer targeted by the present invention is not particularly limited.
  • the present invention is applied to determine the malignancy of various tumors including breast cancer, bladder cancer, stomach cancer, lung cancer, neuroblastoma, gastrointestinal stromal tumor (GIST), prostate cancer, meningioma, etc. be able to.
  • Example 1 In an examination of 153 human breast cancer cases using ATBF1 mRNA expression as an index, the expression level of ATBF1 mRNA is high or the prognosis of the case group is better than the case group with low or no expression level. There was found. From this result, in the method of the present invention, for example, as a result of measuring the amount of ATBF1 in a suspected breast cancer cell as a test cancer cell, the expression level is high, and in some cases, the malignancy is low (or the test cancer cell is derived) The prognosis of the subject is good).
  • Example 2 In a bladder cancer cell line (Int J Cancer. 1996 Nov 15; 68 (4): 501-5) where the effects of the tumor suppressor genes p21 and p53 and the anticancer drug cisbratin have already been confirmed, In cell lines that could induce tumor apoptosis with the agent, ATBF1 was present in the nucleus.
  • the anti-cancer agent did not show any effect, and the cell line had a low expression level of ATBF1, or was localized in the cytoplasm even if the total expression amount was large, and it was strong that staining in the nucleus was not recognized. From these results, in the method of the present invention, for example, as a result of measuring the amount of ATB F1 in a cell with a suspected bladder cancer cell as a test cancer cell, it can be determined that the malignancy is low when the expression level is large. . Alternatively, when ATBF1 is localized in the nucleus in the test cancer cell, it can be determined that the grade of malignancy is low.
  • the amount of ATBF1 in the test cancer cell is small, it can be determined that the malignancy is high.
  • the amount of ATBF1 in a test cancer cell is localized in the cytoplasm and V, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 3 A clinical case of human bladder cancer, papillary urothelial carcinoma showed a tendency for ATBF1 to localize in the nucleus. Invasion to the subepithelium showed a tendency for ATBF1 to localize in the cytoplasm. From this result, in the method of the present invention, for example, as a result of investigating the presence state of ATBF1 in a suspected papillary urothelial cancer cell or suspected invasive bladder cancer cell as a test cancer cell, ATBF1 is a nucleus. It can be determined that the grade of malignancy is low. On the other hand, when ATBF1 is localized in the cytoplasm of the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 4 Searching for a series of adenomas to carcinomas in the stomach (biopsy diagnosis, Group III-V)
  • ATBF1 localized to the nucleus in group III adenomas, mild variants, and moderate variants.
  • ATBF1 localized to the cytoplasm in group III adenomas and severe variants.
  • Group V carcinomas ATBF1 was present in the cytoplasm and was absent.
  • ABF-producing gastric cancer which is considered to be highly malignant, lacks ATBF1.
  • signet ring cell carcinoma of the stomach cancer cells lacking ATBF1 and cancer cells where ATBF1 is localized only in the cytoplasm were mixed.
  • the malignancy is low when ATBF1 is localized in the nucleus in the test cancer cell.
  • the amount of ATBF1 in the test cancer cell is small, it can be determined that the malignancy is high.
  • ATBF1 is localized in the cytoplasm in a test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 5 In lung adenocarcinomas that responded to chemotherapy and the tumors shrunk, the whole cell showed high expression of ATBF 1 in both the nucleus and cytoplasm, but in cases that did not respond to treatment, AT BF1 The expression itself was small and localized to the cytoplasm only. From this result, in the method of the present invention, for example, as a result of measuring the amount of ATBF1 in the suspected lung adenocarcinoma cell as the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is low when the amount of ATBF1 is large. . Alternatively, it can be determined that the malignancy is low when ATBF1 is also present in the nucleus or is localized in the nucleus in the test cancer cell.
  • the amount of intracellular ATBF1 in the test cancer cell is small, it can be determined that the malignancy is high. Alternatively, it can be determined that the malignancy is high when ATBF1 is localized in the cytoplasm in the test cancer cell.
  • Example 6 In atypical adenoma-like hyperplasia, a precancerous lesion of lung adenocarcinoma, ATBF1 was also present in the nucleus, not just in the cytoplasm. On the other hand, in cases where adenocarcinoma could be determined, ATBF1 tended to be localized in the cytoplasm where the nucleus was not stained. From this result, in the method of the present invention, for example, when the suspected lung adenocarcinoma cell was used as a test cancer cell and the presence state of ATBF1 in the cell was examined, malignancy was found when ATBF1 was also present in the nucleus. Can be determined to be low. On the other hand, when ATBF1 is confined to the cytoplasm in the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 7 Normal spinal cord hematopoietic cells showed high ATBF1 expression in both the nucleus and cytoplasm. This fact indicates that bone marrow hematopoietic cells are a group of cells with proliferative proliferation, and that when treating various cancers, bone marrow cells that have a hematopoietic function are most susceptible to normal cells! Supporting the thing (called bone marrow suppression. DNA damage easily causes apoptosis)
  • Example 8 Like bone marrow hematopoietic cells, small amounts of ATBF1 in the nucleus and cytoplasm are also present in small cell carcinoma of the lung (oat cell carcinoma). This supports the ease of reaction.
  • the presence of ATBF1 in the suspected small cell lung cancer cell as a test cancer cell was examined, and as a result, when ATBF1 was localized in the cytoplasm, the malignancy was It can be determined to be high. On the other hand, when the amount of ATBF1 is localized in the nucleus in the test cancer cell, it can be determined that the grade of malignancy is low.
  • Example 9 In high-grade prostate cancer, when ATBF1 was localized in the nucleus, moderately differentiated, or poorly differentiated, ATBF1 tended to be localized in the cytoplasm or lacked expression. From this result, in the method of the present invention, for example, as a result of measuring the amount of ATBF1 in the suspected prostate cancer cell as the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is low when the amount of ATBF1 is large. Alternatively, when ATBF1 is confined to the nucleus in the test cancer cells, it can be determined that the grade of malignancy is low. On the other hand, when the amount of intracellular ATBF1 in the test cancer cell is small (particularly when ATBF1 expression is not observed), it can be determined that the malignancy is high. Alternatively, when AT BF1 is localized in the cytoplasm in the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 10 Among the adrenal tumors of newborns and infants, neuroblastoma is known that has died but spontaneously disappears. The prognosis is an important issue for both the physician and the parents of the child. As a result, AT BF1 was localized in the nucleus in most tumor cells of cases that were benign and ultimately survived. On the other hand, in cases where the patient finally survived, dissection revealed that the tumor showed invasion, metastasis, vascular invasion, etc., and tumor death due to the malignancy of the tumor itself was obvious. In some tumor cells, ATBF1 was localized in the cytoplasm. This implies the possibility of predicting tumor progression and patient prognosis at the biopsy stage.
  • the ATBF1 is aggravated when localized in the nucleus. It can be determined that the degree is low. On the other hand, when ATBF1 is localized in the cytoplasm in the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 11 In gastrointestinal stromal tumors (GIST), ATBF1 is usually confined to the nucleus, but it died of liver metastasis, and ATBF1 was present in the cytoplasm in cases diagnosed as highly malignant GIST. As a result Thus, in the method of the present invention, for example, as a result of examining the presence of ATBF1 in the suspected GIST cell as a test cancer cell, it is determined that the grade of malignancy is low when ATBF1 is localized in the nucleus. Can do. On the other hand, if ATBF1 is also present in the cytoplasm in the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • Example 12 In meningiomas (WHO Grade I) tumor cells classified as benign tumors, ATBF1 is localized to the nucleus but is considered to have a malignant course (WHO Grade ⁇ ), specification In alveolar meningiomas (WHO Grade II), ATBF1 was expressed in the cytoplasm. From this result, in the method of the present invention, for example, as a result of examining the presence of ATBF1 in the suspected meningioma cell as a test cancer cell, the malignancy is low when ATBF1 is confined to the nucleus. Can be determined. On the other hand, if ATBF1 is also present in the cytoplasm in the test cancer cell, it can be determined that the malignancy is high.
  • detecting a specific region of ATBF1 is effective in determining the malignancy of a test cancer cell. Based on this finding, in a preferred embodiment of the present invention, at least one of the following (1) to (3) is detected as the amount of ATBF1 in the test cancer cell separated from the biological force.
  • first region of ATBF1 protein a region corresponding to exon 10 of the ATBF1 gene (partial protein.
  • first region of ATBF1 protein also referred to as “first region”.
  • Amino acid sequence of the region) (SEQ ID NO: 13 and the nucleotide sequence encoding the region is shown in SEQ ID NO: 14), and the abundance in the nucleus and Z or cytoplasmic abundance are to be detected.
  • the amount of the first region using several test cancer cells As a result of verifying the relationship between the localization mode and the malignancy, generally, (a) the first region is localized mainly in the nucleus, the malignancy is low, and (b) the first region is localized mainly in the cytoplasm. It was confirmed that if present, the malignancy was high, and (c) if the first region was missing (in the cytoplasm, in the nucleus), the malignancy was high. That is, it has been found that (a) to (c) are suitable and important indexes for determining the malignancy of cancer cells.
  • the malignancy of the test cancer cell is low. Can be judged.
  • the malignancy of the test cancer cell is high, Can be determined.
  • the lack of the first region is observed in the test cancer cell (or when the abundance is very small), it can be determined that the malignancy of the test cancer cell is high.
  • the nuclear abundance and cytoplasmic abundance of the first region are usually detected simultaneously. Then, the localization of the first region is examined by comparing the detection results.When the first region is localized mainly in the cytoplasm or when the lack of the first region is observed, malignancy of the test cancer cell Judgment is high. Thus, by comparing the detection amount in the nucleus and the detection amount in the cytoplasm, it is possible to clearly grasp the intracellular localization mode of the first region. It should be noted that the detection result of either the nuclear abundance in the first region or the cytoplasmic abundance may be determined by predicting the intracellular localization in the first region. In this case, only one of the abundances needs to be detected.
  • the second region of ATBF1 protein a region corresponding to exon 11 of the ATBF1 gene (partial protein.
  • the second region of ATBF1 protein or abbreviated as “second region”.
  • Amino acid sequence of the region) (SEQ ID NO: 15 and the nucleotide sequence encoding the region is shown in SEQ ID NO: 16), and the abundance in the nucleus and Z or cytoplasmic abundance are to be detected.
  • the second region is mainly nuclear If the second region is localized mainly in the cytoplasm, it is malignant.
  • (a) and (b) are suitable and important indicators for determining the malignancy of cancer cells. Therefore, for example, when a large amount of the second region is detected in the nucleus of the test cancer cell (or when the second region is localized mainly in the nucleus), it can be determined that the malignancy of the test cancer cell is low . Similarly, for example, when a large amount of the second region is detected in the cytoplasm of the test cancer cell (or when the second region is localized mainly in the cytoplasm), the malignancy of the test cancer cell is high, Can be determined.
  • the nuclear abundance and cytoplasmic abundance of the second region are usually detected simultaneously. Then, by comparing the detection results, the localization mode of the second region is examined, and when the second region is localized mainly in the cytoplasm, it is determined that the malignancy of the test cancer cell is high. Thus, by comparing the detection amount in the nucleus with the detection amount in the cytoplasm, it becomes possible to clearly grasp the intracellular localization mode of the second region.
  • the detection result of either the nuclear abundance in the second region or the cytoplasmic abundance may be determined by predicting the intracellular localization of the second region. In this case, it is only necessary to detect the abundance of the deviation!
  • a region corresponding to exon 3 of the ATBF1 gene (partial protein.
  • the third region of ATBF1 protein or abbreviated as “the third region”.
  • Amino acid sequence of the region (SEQ ID NO: 11 and the nucleotide sequence encoding the region is shown in SEQ ID NO: 12) and the abundance in the nucleus and the abundance in Z or cytoplasm are to be detected.
  • detection of the third region is an indicator of whether the amount of ATBF1 in the entire cell has increased, decreased, or is missing. It is also possible to know the ratio of nuclear transfer in the third region by detecting the phosphate state of 148 serine in the third region. Furthermore, by comparing the presence, absence, and location of the nucleocytoplasm with the localization of the central region of the ATBF1 protein (i.e., the first region), the processing status of the ATBF1 protein, and further occurs at the mRNA level. It is possible to determine the Etason skip due to abnormal splicing. As mentioned above, the third area Detection provides useful but useful information in determining the grade of cancer.
  • two or more of the above (1) to (3) are detected, and the degree of maliciousness of the test cancer cell is determined in consideration of each detection result. If two or more detections are performed in this manner, a more detailed and accurate determination / evaluation can be performed.
  • the detection item preferably includes the above (1), that is, the detection of the first region. It can be said that the abundance or subcellular localization of the first region detected in (1) is the most characteristic of cancer malignancy. Therefore, detection of (1) is particularly important in determining malignancy.
  • a form for detecting the above (1) and (2) and a form for detecting the above (1) and (3) can be mentioned. If the number of detection items is increased in this way, determination with higher accuracy can be performed. Among these, it is most preferable to detect the above (1) to (3) and perform comprehensive evaluation using each detection result. This is because detailed information can be obtained and determination with higher accuracy can be made.
  • the grade 1 is the lowest grade, and the higher the number, the higher the grade.
  • grade 4 include partial sinus cancer and part of diffuse malignant lymphoma.
  • a representative example of grade 3 glioblastoma, a part of diffuse malignant lymphoma, a typical example of grade 2 of GIST (Bd-2 +), a meningioma Part of the GIST as a representative example of grade 1 (Be ⁇ 1) can include a part of meningiomas
  • exons 1 to L1 exist in the ATBF1 gene (see Fig. 47).
  • Exon 10 has the longest alignment ability and encodes all four homeodomains. As shown in the examples below, it was suggested that ATBF1 was cut into multiple parts in the post-translational process. In addition, due to abnormal skipping of Exon 10, it corresponds to Exon 10. It was reported that a mutant protein lacking the region was produced (Non-patent Document 9). If ATBF1 is intact in the cell (if it exists as a full-length protein!
  • ATBF1 gene region corresponding to exon 10 ie, first region
  • ATBF1 gene The “region corresponding to exon 11 of the child (ie, the second region)” and “region corresponding to exon 3 of the ATBF1 gene (ie, the third region)” each exist as part of such ATBF1.
  • each region exists as one (or part of) one of the partial ATBF1 generated by the division.
  • the first region is recognized by antibody D1-120, which is prepared by using a part of the central region of ATBF1-A protein (region other than the home domain of exon 10) as an antigen.
  • the second region is recognized by antibody AT6, which is produced by using part of the C-terminal region of ATBF1-A protein as an antigen
  • the third region is obtained by using part of the N-terminal region of ATBF1-A protein as an antigen. Recognized by the prepared antibodies NT440 and 1-12. Methods for producing these antibodies are described in detail in the Examples section below.
  • the test cancer cells can also collect suspicious cancer tissue power. Specifically, a part of the suspicious cancer tissue can be collected by biopsy and used as a sample containing the test cancer cells for the method of the present invention.
  • detection of the amount of ATBF1 and detection of the first region, the second region, and the third region of ATBF1 protein are not limited to these, but preferably immunohistological staining Use the law.
  • the amount of ATBF1 can be detected quickly and with high sensitivity.
  • the operation is simple. Therefore, the burden on the subject (patient) associated with the detection of the amount of ATBF1 and the like is reduced.
  • antibodies that specifically recognize the detection target are used, and the amount of ATBF1 is detected using the binding (binding amount) of the antibody as an index. .
  • a test cancer cell is first contacted with an antibody (for example, an anti-ATBF1 antibody) specific to the detection target. Thereafter, the amount of the antibody bound to the whole cell, nucleus, and Z or cytoplasm is measured. From the measurement results, the abundance of the detection target in the whole cell, nucleus, and Z or cytoplasm of the test cancer cell is calculated.
  • an antibody for example, an anti-ATBF1 antibody
  • the method of the present invention can be carried out according to the following immunohistological staining method.
  • immunohistochemical staining of biological tissue is performed by the following procedures (1) to (9).
  • the tissue surgically collected from the living body is fixed with formalin, paraformaldehyde, anhydrous ethyl alcohol, or the like. Then embedded in paraffin. Generally dehydrated with alcohol, treated with xylene, and finally embedded in paraffin. A specimen embedded with norafin is sliced into a desired thickness (eg, 3-5 ⁇ m thick) and spread on a glass slide. Instead of paraffin-embedded specimens, alcohol-fixed specimens, dry-sealed specimens, frozen specimens, etc. may be used.
  • the treatment is performed sequentially with xylene, alcohol, and purified water.
  • Enzyme treatment, heat treatment and Z or pressure treatment are performed for antigen activation as necessary.
  • peroxidase When peroxidase is used as a labeling substance during staining, it is treated with hydrogen peroxide to remove endogenous peroxidase activity.
  • the section is treated with ushi serum albumin solution (eg 1% solution) for several minutes to several tens of minutes to inhibit non-specific reactions. It should be noted that this step may be omitted by carrying out the next primary antibody reaction using an antibody solution containing ushi serum albumin.
  • ushi serum albumin solution eg 1% solution
  • An antibody diluted to an appropriate concentration is dropped onto a section on a slide glass, and then allowed to react for several tens of minutes to several hours. After completion of the reaction, wash with an appropriate buffer such as phosphate buffer.
  • DAB (3,3'-diaminobenzidine)
  • Tris buffer a Tris buffer
  • hydrogen peroxide is added.
  • the coloring solution thus prepared is allowed to penetrate the section for several minutes (for example, 5 minutes) to develop a color. After color development, the section is washed thoroughly with tap water to remove DAB.
  • Nuclear staining is performed by reacting Meyer's hematoxylin for several seconds to several tens of seconds. Wash with running water and color (usually for a few minutes).
  • the type and origin of the antibody (detection antibody) used in the immunohistochemical staining method is not particularly limited as long as the antibody has specific binding properties.
  • the detection antibody may be any of a polyclonal antibody, an oligoclonal antibody (mixture of several to several tens of antibodies), and a monoclonal antibody.
  • a polyclonal antibody or an oligoclonal antibody an anti-serum-derived IgG fraction obtained by animal immunization, or a purified antibody using an antigen can be used.
  • Anti-ATBF1 antibody strength Anti-antibodies such as Fab, Fab ', F (ab'), scFv, dsFv antibody
  • the D1-120 antibody shown in the examples described later can be used.
  • This antibody specifically recognizes the D1-120 site (a region corresponding to exon 10 and a part of home domain 1 and a region immediately before it) that is a common part of ATBF1-A and ATBF1-B. Therefore, it is possible to detect both ATBF1-A and ATBF1-B simultaneously using this antibody.
  • this antibody specifically binds to the first region of ATBF1, the amount detected by this antibody reflects the abundance of the first region. Therefore, if this antibody is used, it is possible to grasp the amount of the first region or its localization.
  • antibody AT6 that recognizes the region corresponding to exon 11 of the ATBF1 gene was used.
  • the amount or location of the second region which is the C-terminal region, can be ascertained, and if the antibody NT440 or 1-12 that recognizes the region corresponding to exon 3 of the ATBF 1 gene is used, It becomes possible to grasp the amount of the third region or its localization.
  • Anti-ATBF1 antibody and the like can be prepared by using an immunological technique, a phage display method, a ribosome display method, and the like.
  • Preparation of a polyclonal antibody by an immunological technique can be performed by the following procedure.
  • Prepare an antigen for example, D1-120 site of ATBF1 or a part of it
  • ATBF1 or a part thereof
  • the antigen can be obtained by purifying a biological sample.
  • an antigen obtained using a gene recombination technique can also be used.
  • Recombinant human ATBF1 is prepared, for example, by introducing a gene encoding ATBF1 (which may be a part of the gene) into a suitable host using a vector and expressing it in the obtained recombinant cell.
  • an antigen bound with a carrier protein When effective immune-inducing action cannot be expected due to the low molecular weight, it is preferable to use an antigen bound with a carrier protein.
  • Carrier proteins such as KLM (Keyhole Light Hemocyanin), BSA (Bovine Serum Albumin), OVA (Ovalbumin), etc. are used.
  • KLM Keyhole Light Hemocyanin
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • OVA Optalbumin
  • the carposiimide method, dartalaldehyde method, diazo condensation method, MBS (maleimidobenzoyl succinimide) method and the like can be used.
  • an antigen in which ATBF1 (or a part thereof) is expressed as a fusion protein with GST, ⁇ -galactosidase, maltose-binding protein, histidine (His) tag or the like can also be used.
  • a fusion protein can be easily purified by a general method.
  • the present inventors have used Western blotting in fetal and adult rat brain tissues, undifferentiated embryonic cancer cell lines (P19 cells) and two neuroblastoma cell lines (NB-1, GOTO).
  • the size of ATBF1 protein in actual tissues was tested.
  • the antibody used at that time was D1-120 which detects the central part of AT BF1-A (404 kDa) protein.
  • the size of the protein that the antibody recognizes i.e., ATBF1 protein
  • the ATBF1 gene (part of the gene) Selected from the gene part encoding the D1-120 site of the AT BF1-A amino acid sequence (the site corresponding to exon 10) and introducing it into a suitable host using a vector.
  • the detection results (localization mode, etc.) when using anti-ATBF1 antibody that recognizes sites that are significantly separated from D1-120 site force are D1
  • the result is completely different from the detection result when -120 is used.
  • the site (first region) detected by D1-120 can be detected in the same manner using an antibody that recognizes a site other than the D1-120 site.
  • the antibody has the same specificity as 3 ⁇ 41-120 is determined by preliminary experiments using P19 cells, etc., and ATBF1 localization experiments using cancer cells (specifically Western plotting etc.) Can be verified.
  • the antibody can be used for the same purpose as D1-120.
  • a monoclonal antibody can be prepared by the following procedure. First, immunization is performed in the same procedure as above. Immunization is repeated as necessary, and when the antibody titer rises sufficiently, immunized animal antibody-producing cells are removed. Next, the obtained antibody-producing cells and myeloma cells are fused to obtain a hyperidoma. Subsequently, after this hybridoma is monoclonalized, a clone producing an antibody having high specificity for the target protein is selected.
  • the target antibody can be obtained by purifying the culture medium of the selected clone.
  • the desired antibody can also be obtained by growing Hypridoma to a desired number or more and then transplanting it into the abdominal cavity of an animal (for example, mouse) and growing it in ascites to purify the ascites.
  • affinity chromatography using protein G, protein A or the like is preferably used.
  • the antigen A modified affinity chromatography can also be used.
  • methods such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, ammonium sulfate fractionation, and centrifugation can be used. These methods can be used alone or in any combination.
  • a labeled antibody is used as the anti-ATBF1 antibody or the like, it is possible to directly detect the amount of the bound antibody using the labeled amount as an index. Therefore, it becomes a simpler method.
  • an indirect detection method such as a method using a secondary antibody to which a labeling substance is bound or a method using a polymer to which a secondary antibody and a labeling substance are bound.
  • the secondary antibody herein is an antibody having specific binding properties to anti-ATBF1 antibody and the like.
  • anti-ATBF1 antibody or the like when prepared as a rabbit antibody, an anti-rabbit IgG antibody is used.
  • Labeled secondary antibodies that can be used for various types of antibodies such as rabbits, goats, and mice are commercially available (for example, Funakoshi Co., Ltd., Cosmo Bio Co., Ltd., etc.), and anti-ATBF1 antibodies used in the present invention Appropriate ones can be selected and used according to the situation.
  • Labeling substances include peroxidase, j8-D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate. Any one selected from (RITC), alkaline phosphatase, piotin, and a radioactive substance is preferably used.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • rhodamine isothiocyanate Any one selected from (RITC), alkaline phosphatase, piotin, and a radioactive substance is preferably used.
  • a method of reacting avidin peroxidase using biotin as a labeling substance enables detection with higher sensitivity.
  • a second aspect of the present invention provides a reagent (reagent for determining malignancy of a test cancer cell) and a kit (kit for determining malignancy of a test cancer cell) for carrying out the method of the present invention.
  • a reagent reagent for determining malignancy of a test cancer cell
  • a kit kit for determining malignancy of a test cancer cell
  • One form of the reagent of the present invention is an anti-ATBF1 antibody (anti-first region antibody, anti-second region antibody, anti-third antibody) used when the method of the present invention is performed by an immunological technique as described above. Including region antibodies, and so on).
  • the antibody here may be any of a polyclonal antibody, an oligoclonal antibody (mixture of several to several tens of antibodies), and a monoclonal antibody. Good.
  • an anti-serum-derived IgG fraction obtained by animal immunization and a purified antibody antibody with an antigen can be used.
  • the anti-ATBF 1 antibody may be an antibody fragment such as Fab, Fab ′, F (ab ′), scFv, or dsFv antibody. Desired
  • the above-mentioned label may be applied to the antibody.
  • an antibody that recognizes a region corresponding to exon 10 of the ATBF1 gene (2) an antibody that recognizes a region corresponding to exon 11 of the ATBF1 gene, or (3) an antibody of the ATBF1 gene.
  • An antibody that recognizes a region corresponding to exon 3 can be preferably used.
  • a region corresponding to exon 10 (the first region of the ATBF1 protein) can be detected.
  • a region corresponding to exon 11 (ATBF1 protein second region) can be detected.
  • a region corresponding to exon 3 (ATB F1 protein third region) can be detected.
  • antibody (1) Specific examples of the antibody (1), the antibody (2), and the antibody (3) include the following which are used in the examples described later.
  • Antibody (1) Dl-120
  • Antibody (2) AT6,
  • Antibody (3) 1-12
  • NT440 mixture of NT440-1, NT440-2, NT440-3)
  • the kit of the present invention contains a reagent having specific binding property to ATBF1 or a part of ATBF1 such as the first region.
  • a suitable example of the reagent is not limited to the anti-ATBF1 antibody.
  • an immunoassay (detection) kit containing an anti-ATBF1 antibody is provided.
  • a labeled anti-ATBF1 antibody is used.
  • an unlabeled anti-ATBF1 antibody is used.
  • a secondary antibody labeled with a labeling substance may be included in the kit.
  • the polymer may be included in the kit. Yes.
  • ATBF1 (antigen) may be further included in the kit.
  • ATBF1 that is substantially the same as or equivalent to that used as an antigen in preparing the anti-ATBF1 antibody used in the kit is included in the kit. Therefore, it does not have to be a full-length ATBF1. Further, it may be a recombination ATBF1.
  • ATBF1 is used to confirm that the staining obtained using the kit is based on the specific binding between the anti-ATBF1 antibody and ATBF1. Specifically, first, anti-ATBF1 antibody is treated with ATBF1. Perform immunostaining using the treated anti-ATBF1 antibody. The obtained stained image is compared with the stained image obtained using the untreated anti-ATBF1 antibody.
  • the staining property is based on the specific binding between the anti-ATBF1 antibody and ATBF1.
  • an anti-ATBF1 antibody prepared using a fusion protein with a tag or carrier protein (hereinafter referred to as a tag) as an antigen is used in the kit, the tag used may be further included in the kit. Good. If the anti-ATBF1 antibody that constitutes the kit contains a reactive antibody in the tag used in the preparation process, the tag is required. If the tag is used as described below, it can be confirmed that the staining obtained using the kit is based on the specific binding between the anti-ATBF1 antibody and the ATBF1 antibody.
  • the anti-ATBF1 antibody is treated with this tag or the like. Perform immunostaining of the specimen using the treated anti-ATBF1 antibody. The obtained stained image is compared with the stained image obtained using the untreated anti-ATBF1 antibody. If there is no difference in staining between the two, it can be confirmed that the staining in the latter stained image is based on the specific binding between the anti-ATBF1 antibody and ATBF1.
  • kits of the present invention Necessary for immunostaining such as antigen-antibody reaction and staining in the kit of the present invention-more reagents (for example, formalin and paraffin for tissue fixation / embedding, BSA for inhibiting non-specific binding) Further, a coloring reagent such as DAB, a hematoxylin solution for nuclear staining, etc.) and instruments may be further included. Usually, an instruction manual is attached to the kit of the present invention.
  • reagents for example, formalin and paraffin for tissue fixation / embedding, BSA for inhibiting non-specific binding
  • a coloring reagent such as DAB, a hematoxylin solution for nuclear staining, etc.
  • instruments may be further included.
  • an instruction manual is attached to the kit of the present invention.
  • ATBF1 a DNA-binding transcription regulator
  • cytoskeleton protein GFAP glial fibrillar acidic protein
  • Non-patent Document 6 In addition, in another experimental system using gastric cancer cultured cells as previously reported (Non-patent Document 6), the present inventors bind ATBF1 to p53 protein in the nucleus, activate the p21 promoter, and I discovered that it works to suppress the cycle (see Figure 1). Therefore, we focused on the cell cycle control function of ATBF1, and investigated the trend of ATBF1 in various cancer cells.
  • the antigen was prepared by the following procedures (1) and (2). Details of antigen preparation and antibody production are described in a previous report (J. Compartive Neurology (2003) 465: 57-71: Non-Patent Document 3).
  • (1) As described above, the target amino acid portion was excised from mouse cDNA and recombined (subcloned) into the vector pGEX-KT for producing GST fusion protein.
  • (2) The gene was introduced into E. coli AD 202 !, and the protein expressed in AD 202 was purified in a conventional manner using Sepharose-glutthione beaded agarose (Sigma) (for example, “Recombination for the first time”). (See “Protein Purification Knowbook”, published in 1999, Amersham Armasia Biotech Co., Ltd.).
  • anti-ATBF1 antibody D1-120 was obtained by the following procedures (1) to (4).
  • fibronectin or the like is not applied to the culture dish, the cells are floating and ATBF1 appears in the cytoplasm, but does not migrate to the nucleus! (See Fig. 4a), whereas fibronectin and poly L
  • ATBF1 translocation into the nucleus is observed in a significant number of cells within 3 hours of culture (see Figure 4b), and almost all cells are observed in 24 hours.
  • ATBF1 was observed in the nucleus (see Figure 4c).
  • laminin-gelatin was applied to the culture dish, P19 cells were able to adhere well to the surface of the culture dish, and the transfer of ATBF1 to the nucleus was observed even under these conditions.
  • ATBF1 translocation of ATBF1 to the cytoplasmic nucleus is regulated by the influence of factors such as fibronectin that promote cell adhesion to the culture dish (which is the adhesion stimulus itself!).
  • the change from the floating state to the attached state may involve receptors present on the cell surface, and it was thought that the intracellular localization of ATBF1 was changed by transmitting information according to the extracellular environment into the cell. .
  • ATBF1 The trend of ATBF1 was observed by carrying out ATBF1 staining by the method described in 1). As a result, the concentration of ATBF1 in P19 cells is clearly increased by the action of Leptomysin B compared to the expression level when Leptomycin B is not acted (see Figure 5a). ) And the number of cells that fall into apoptosis clearly increased. In addition, when one day culture was added, most cells died the next day. The results of this experiment indicate that the export of ATBF1 to the nucleus is controlled by CRM1, and that the increased ATBF1 concentration in the nucleus is a condition that promotes apoptosis of cancer cells, and the cancer treatment policy. Seemed to give important suggestions.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase family proteins have been well studied, and recently, like ATBF1, N- and oR (The nuclear) function in the nucleus and cytoplasm.
  • Cytoplasmic ATBF1 gathers like a ring in the cytoplasmic part around the nucleus (predicted inside the endoplasmic reticulum). That means there is no ATBF1 transfer to the nucleus!
  • Telangiectasia Mutated is a causative gene of telangiectasia cerebellar ataxia and is a representative gene encoding a PI 3K family protein. Although its functions are diverse, it is known to control cell death and cell cycle, especially as a DNA damage monitoring system due to radiation.
  • the present inventors conducted an experiment using a drug caffeine that specifically inhibits the action of ATM. First, after confirming that P19 cells were cultured and became adherent to the culture dish, retinoic acid treatment was performed, and then caffeine was allowed to act.
  • ATBF1 was switched to the cytoplasmic nucleus and further to the cytoplasm, so that the cell cycle period and the proliferation state were switched.
  • ATBF1 single expression vector Forced expression experiments were performed on a cultured cell line derived from a transblastoma, Neuro2A cells. Neuro2A After introducing the ATBF1 expression vector and forcibly expressing ATBF1, the ATBF1 staining was observed by the ATBF1 staining method described in 3-1 above, and the cell cycle was searched by flow cytometry. .
  • ATBF1 nuclear translocation and proliferation ability in embryonic day 14 rat fetal brain and nerve cells were examined.
  • the neurons in the basal cerebrum during the embryonic period maintain an undivided state (called neuroepithelial cells) in the paraventricular region directly under the ventricle, and the cells that have finished the final division are the ventricles. It passes through the lower region, moves to the differentiation region, and is finally differentiated into nerve cells.
  • BrdU was administered intraperitoneally to mother rats and sacrificed 3 hours later, and fetuses were examined.
  • immunohistochemical staining was performed according to the following procedure. First, the collected fetal tissues were fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, sliced to a thickness of about 3 m, and spread on a glass slide. After deparaffinization, heat treatment was performed for 4 minutes (110 ° C) in a pressure cooker using citrate buffer (PH6.0) (see Example 7 for the reason for selecting this antigen activation method). reference). Subsequent treatment with peroxyhydrogen water removed endogenous peroxidase.
  • citrate buffer PH6.0
  • the anti-ATBF1 antibody prepared in Example 2 was dissolved in 0.05 M Tris buffer (pH 7.6, 1% solution of urine serum albumin, containing sodium azide) so as to be 5 / zg / ml.
  • the primary antibody solution was dropped onto the slice and allowed to react at room temperature for about 1 hour (primary antibody reaction). After thorough washing, the secondary antibody (DAK0).
  • ATBF1 intracellular localization of ATBF1
  • cytoplasm cytoplasm
  • the results of staining were outlined.
  • the staining intensity of non-invasive cancer and invasive cancer, and the nuclear and cytoplasmic staining patterns changed depending on the heat treatment method and buffer type. Although all 27 types of staining were different, the major tendency was that when autoclaving was performed, the staining of the nucleus was prominent and cytoplasmic staining could not be obtained depending on the choice of the koffer (see Fig. 9). On the other hand, it became difficult to obtain nuclear staining with a microwave treatment, and there was a tendency for cytoplasmic staining to stand out (see Fig. 10).
  • the temperature setting was in the middle of the autoclave and microwave oven, and showed a tendency to simultaneously produce nuclei and cytoplasmic staining (see Figure 11).
  • no staining was obtained for any non-invasive cancer or invasive cancer by any of the enzyme treatments.
  • ATBF1 is localized in both the nucleus and cytoplasm in non-invasive cancers (see Figure 12a, c) and in both nuclei and cytoplasm in invasive cancers (see Figures 12b, d), depending on the antigen activation method and type of buffer I was very puzzled about the evaluation. Objective evaluation is impossible at first glance However, it was possible to evaluate trends throughout the 27 types of staining as shown in (1) and (2) below.
  • (l) ATBFl is a protein that can exist in both the nucleus and cytoplasm, but not in membranes or plasma components.
  • ATBF1 is present in both nucleus and cytoplasm.
  • the protein ratio of the nuclear / cytoplasmic subcellular localization there is a difference in the protein ratio of the nuclear / cytoplasmic subcellular localization, and it can be judged that the nucleus is mainly for non-invasive cancer and the cytoplasm is mainly for invasive cancer. Based on these two assessments, the response to surgically excised and formalin-fixed specimens can be determined.
  • Real-time semi-quantitative PCR was performed on 153 clinical specimens of breast cancer surgery to examine the expression level of ATBF1 mRNA.
  • Real-time semi-quantitative PCR was performed in a conventional manner using LightCycler ver.3.0 (Roche Diagnostics) with reference to the attached manual.
  • LightCycler ver.3.0 Roche Diagnostics
  • parameters that are important as conventional prognostic factors such as the size of the primary lesion, the presence or absence of lymph node metastasis, and the presence or absence of estrogen receptor expression, and changes in the expression level of ATBF1 mRNA show a statistically significant correlation.
  • the facts are known (results not shown). In simple terms, in the case of tumors with high expression levels of ATBF1,
  • ATBF1 staining was performed according to the procedure shown in Example 6. Carried out . Examples are papillary ductal carcinoma and hard carcinoma. Histologically confined within the duct and immersed around the duct There was a tendency for ATBF1 nuclei to be stained (see Figures 13b, d, and e) in carcinomas that did not show moisture (see Figures 13a and c). In the mammary gland, at sites showing invasive growth in adipose tissue (see Fig. 13f, h, j), ATBF1 is localized only in the cytoplasm (see Fig.
  • ATBF1 is also localized in the nucleus in a state where it is confined in the ductal epithelium and does not show infiltration, that is, in a low malignant state. The tendency to infiltrate and progress to fat showed that ATBF1 had a localized force in the cytoplasm and a tendency to lack expression.
  • ATBF1 The ability to observe the transition of ATBF1 to the nucleus or cytoplasm in an actual tumor. is important.
  • the inventors of the present invention are p21, p53, which are very closely related to ATBF1, respectively (see Fig. 1 again).
  • ATBF1 staining using 3 cultured cell lines RT4, T24, HT1366
  • These three strains have already been searched for the effectiveness of the anticancer drug cisbratin and whether p21 is introduced (Int J Cancer. 1996 Nov 15; 68 (4): 501-5). . Therefore, it seems to be an optimal material for assessing the malignancy of tumors expressing ATBF1.
  • RT4 HE-stained image
  • ATBF1-stained image middle
  • p53-stained image lower
  • RT4 is derived from human bladder papilloma
  • both p21 and p53 are mutated in cisbratin and can induce apoptosis, and the malignancy is the lowest among the three cultures.
  • the staining ability of ATBF1 is also present in a small amount in the cytoplasm, indicating that the main force is the nucleus, indicating that ATBF1 has been introduced into the nucleus.
  • p53 without mutation can be introduced into the nuclei of most cells.
  • the center of Fig. 14 is the T24 HE-stained image (upper), ATBF1-stained image (middle), and p53-stained image (lower).
  • T24 has no p21 mutation, but is a p53 nonsense mutant, and the p53 protein is cleaved in the middle. Because the normal ⁇ 53 ⁇ ⁇ 21 pathway (see Figure 1) does not work, this cell cannot induce apoptosis by cisplatin, and its malignancy is higher than RT4.
  • ATBF1 is a force that is also present in the nucleus. ⁇ 53, which has a nonsense mutation, has almost been introduced into the cell nucleus.
  • Fig. 14 shows an HE-stained image of HT1376 (upper), an ATBF1-stained image (middle), and a p53-stained image (lower).
  • HT1376 cannot introduce apoptosis with cisplatin due to the p53 missense mutation and the presence of a point mutation in the protein, as well as the p21 frameshift mutation. Therefore, it is a highly malignant culture similar to T24. In this cell line, unlike the difference between RT4 and T24, the weak expression of ATBF1 was present in the nucleus! In some cases, p53 with a missense mutation has been introduced into the cell nucleus.
  • Bladder cancer (Usefulness of ATBF1 in determining the grade of human bladder cancer)
  • FIG. 15a is a stained image (al: HE-stained image, a2: ATBFl-stained) of a case of a 65-year-old male with papillary intramucosal carcinoma, WHO Grade I, and histologically low grade.
  • ATBF1 staining is observed only in the nucleus. This staining is similar to cultured cells RT4 (see 9-1 above and Figure 14b).
  • Figure 15b shows a stained image of an 81-year-old male with a mixture of papillary intramucosal cancer, WHO Grade 1 (histologically low grade), and WHO Grade II (histologically moderate grade) ( Figure 15bl).
  • Fig. 15b2 ATBFl-stained image
  • ATBF1 staining is observed only in the nucleus.
  • ATBF1 staining is observed in the cytoplasm.
  • the staining in the nucleus is still similar to cultured cell RT4 (see 9-1 above and Figure 14b).
  • cytoplasmic staining is similar to cultured cell T24 (see 91 above and Figure 14e).
  • Fig. 15c is a submucosal invasive carcinoma of a 55-year-old male. Stained images of WHO Grade II (moderate histological grade) (Fig. 15c 1: HE-stained image, Fig. 15c2: ATBFl-stained image) is there. ATB F1 staining is observed in the cytoplasm. Staining is similar to cultured cell T24 (see 91 above and Figure 14e).
  • Fig. 15d is a stained image of a case of an 84-year-old male invasive cancer under the mucosa and WHO Grade III (Fig. 15dl: HE-stained image, Fig. 15d2, d3: ATBFl-stained image).
  • ATBF1 staining is observed in the cytoplasm (Fig. 15d2, staining is similar to cultured cell T24), and ATBF1 staining tends to be slightly lost (Fig. 15d3: Staining is HT1376 among 3 types of cultured cells) Cells with (close) are mixed.
  • Gastric adenoma (shown here is a 55-year-old female who has undergone polypectomy for several polyps in the same stomach), among which is a gastric atypical epithelial nest or adenoma (Group III, see Fig. 16al) is a benign lesion with a long course, and the size may not change much even after several years of follow-up.
  • ATBF1 staining was restricted to the nucleus (see Figure 16a2), p53 staining in the nucleus was present (see Figure 16a3), and p21 was also introduced into the nucleus (see Figure 16a4). reference).
  • Intestinal atypical epithelial nest or adenoma (Group III, see Fig. 16al) is a benign lesion with a long course, and the size may not change much even after several years of follow-up.
  • ATBF1 staining was restricted to the nucleus (see Figure 16a2)
  • p53 staining in the nucleus was present
  • ATBF1 Even in lesions with moderate atypia (see Fig. 16b 1), ATBF1 is mainly confined to the nucleus (see Fig. 16b2), although there is a difference in intensity of staining with gastric adenoma, but p53, The expression of p21 was confirmed (see Fig. 16b3 and b4).
  • ATBF1 shows granular staining in the cytoplasm (see Fig. 16c2) P53 expression was also mildly diffuse (see Fig. 16c3) and p21 was not introduced into the nucleus (see Fig. 16c4).
  • ATBF1 introduced into the nucleus binds p53 and protein-protein and p21 If it is considered to be involved in cell cycle arrest and apoptosis, p21 can be introduced as long as ATBF1 is localized in the nucleus, even if the same adenoma is mildly or moderately atypical. It can be considered that adenoma growth can not be stopped because p21 is transferred to the cytoplasm and p21 cannot be introduced. As a result, it is possible to predict the grade of adenoma by ATBF1 staining (as adenoma is not a malignant tumor, it is possible to predict proliferative ability and ease of apoptosis rather than grade of malignancy). It can be said that it is useful for distinguishing from border areas and lesions that require differentiation.
  • adenocarcinoma Tubl, Group V
  • An example of a gastric cancer (78 years old, male, see Fig. 17al) occurring in the esophageal subcutaneous region and cardia.
  • ATBF1 was a mixture of sites in the cytoplasm of cancer cells (see Fig. 17a2) and sites lacking ATBF1 expression (see Fig. 17a3).
  • ATBF1 was predominantly cytoplasmic (see Figure 17b2).
  • a biopsy of a 68-year-old woman is shown. Porl showing expansible growth in the mucous membrane (see Fig. 18al, a2, and a4).
  • ATBF1 staining is a site where staining is missing in the whole cell (see Fig. 18a3) and is localized in the cytoplasm. (See Figure 18a5).
  • ATBF1 is predominantly cytochrome-stained and has no strong nuclear staining (See Figure 18b2.)
  • ATBF1 was a mixture of cells present in the cytoplasm and cells lacking ATBF1 (see Figure 19a2).
  • ATBF1 is a signet-ring cell carcinoma in a normal gastric cancer primary site and shows a mixture of cells that are localized in the cytoplasm and cells that lack ATBF1 (see Figure 19a2).
  • both the lymphatic invasion site (see Fig. 19b2) and the invasion site into the connective tissue of the gallbladder wall (see Fig. 19b3) are completely ATBF1.
  • Non-Patent Documents 2, 5, and 7 ATBF1 expression was completely absent at the AFP-producing site of AFP-producing gastric cancer (results not shown).
  • ATBF1 loss can be expected to significantly increase the malignancy of gastric cancer.
  • the site where ATBF1 is confined only to the nucleus is a part of a well-differentiated cancer and a part of solid low-grade cancer Can be found in
  • ATBF1 is either one that lacks the force that is mostly present in the cytoplasm. This result suggests that gastric cancer is generally a tumor with high malignancy, and that the absence of cytoplasmic ATB F1 staining can indicate a further increase in malignancy.
  • ATBF1 staining could play an important role in the prediction of tumor malignancy or prognosis in the stomach as well.
  • Paget's disease was originally a skin disease concept proposed by Dr. Paget in the breast teat in 1874. Actually, it is an adenocarcinoma that also occurs in various sites other than the mammary gland. Initially, there are only a limited number of large Paget cells in the epidermis with histologically rich nuclei rich in chromatin and abundant and bright vesicles (so-called Carcinoma in situ). It is a malignant disease that infiltrates the dermis as the disease progresses, and further causes lymphatic metastasis and multiple organ invasion.
  • ATBF1 expression search (using D1-120) V, went (see Figure 20a).
  • Cancer cells that showed distant metastasis have higher malignancy! From the viewpoint of ⁇ and ⁇ ⁇ , the cancer cells in the lymph node metastasis tend to lack ATBF1, corresponding to the results obtained by ATBF1 staining, and Cancer cells present in the tumor-forming tumor can be judged to have the highest malignancy, and the site where ATBF1 on the surface of the dermis begins to infiltrate or the surface of the tumor is in the cytoplasm is the next highest malignancy It can be judged that the site where ATBF1 is localized in the nucleus is the least malignant.
  • Paget cells remain in the epithelium as long as ATBF1 is localized in the nucleus, appear in the cytoplasm, infiltrate and form a tumor, and may also be metastasized due to lack of expression.
  • ATBF1 staining may be useful for predicting tumor progression and prognosis even in adenocarcinoma such as Paget's disease outside the breast.
  • a sample of a 67-year-old woman who was diagnosed as having normal bone marrow puncture due to suspected hematological disease was treated with ATBF1 staining (using D1-120) after formalin fixation.
  • the staining of ATBF1 in the bone marrow must be consistent with the group of cells in which bone marrow hematopoietic cells maintain their proliferative capacity and the group of cells that are very susceptible to chemotherapy and radiation (referred to as myelosuppression). It is thought to provide important information for understanding the staining of cancer.
  • ATBF1 expression of blood cells released to the periphery is completely different from that in the bone marrow, and expression in the nucleus is very small. Only the cytoplasmic expression was present in the cells (retrieval of lymph nodes and veins of various organs, not shown).
  • Small peripheral lung cancer (Development of small peripheral lung cancer, study of progression process, study of usefulness of ATBF1 in determining malignancy)
  • GGO gland glass op acity
  • AAH pathologically adenomas atypical hyperplasia
  • AAH adeno ma-carcinoma sequence concept
  • Noguchi classification is applied to BAC of 2 cm or less.
  • Noguchi's Type A and B are considered to correspond to non-invasive cancer with 5-year survival rate of 100% without metastasis to lymph nodes.
  • AAH or BAC represents lymph node metastasis in 30% and corresponds to early invasive cancer with a 5-year survival rate of 75%.
  • GGO pre-cancerous lesions and early lung adenocarcinoma
  • the carcinogenesis mechanism in peripheral lung adenocarcinoma is examined by histomorphology, cell biology, molecular biology and pathology It is clear that it is an important issue from the viewpoint of decision of treatment policy and prognosis prediction.
  • diagnosis of AAH or BAC lacks definitive diagnostic criteria, such as biopsy diagnosis, cytodiagnosis diagnosis or rapid diagnosis at the time of surgery, and it is a problem for pathologists and surgeons who are not so easy. The current situation is.
  • BAC Localized bronchioloalveolar carcinoma
  • ATBF1 nucleus Intracytoplasmic site
  • ATBF1 staining is attracting attention in the development of small peripheral-type adenocarcinoma, study of the progression process, and determination of the malignancy of carcinomas detected early.
  • AAH Like AAH, high-grade AAH was mainly stained with 1S nuclei, which also contains ATBF1-stained sites in the cytoplasm.
  • ATBF1 was predominantly localized in the cytoplasm in all cases (results not shown).
  • AAH the difference between the main body of nuclei and in BAC (Noguchi Type A and B), the cytoplasmic body and ATBF1 expression sites were clear.
  • ATBF1 staining will be applied to surgically resected peripheral small lung tumors to investigate not only future prognostic studies but also cell biological characteristics. Useful for improving the accuracy of qualitative pathological diagnosis and preventing excessive surgical treatment It is expected to lead to.
  • Normal lung is originally a tissue with a high expression level of ATBF1, and even normal lung tissue is type 2 alveolar epithelial cells, etc., and shows a small amount of ATBF1 staining (using D1-120).
  • alveolar epithelial cancer or atypical adenomatous hyperplasia
  • the ATBF1 level in the whole cells of the cancer cells was overwhelmingly increased by microscopic observation at low magnification (64-year-old male, 57-year-old male).
  • a female example is presented, see Figure 23). Therefore, it was expected that cancer tissue or precancerous lesion could be distinguished from normal tissue only by the fact that ATBF1 staining was high.
  • the AT BF1 staining method can be a useful discrimination tool for beginners of pathological diagnosis.
  • Lung adenocarcinoma (Possibility as an index for selection of chemotherapy for advanced lung adenocarcinoma) Advanced lung cancer has a high possibility of recurrence after surgery. Treatment for relapses and metastases is becoming an increasingly important choice for prolonging life and giving patients a better life expectancy. In particular, there is no standard treatment for adenocarcinoma that continues to increase. Depending on the case, chemotherapy may be effective or ineffective, and for patients with local recurrence, lymph nodes and other organ metastases, there is no indication of chemical therapy selection, and the patient is burdened with unnecessary chemotherapy In some cases, as a result, surgical removal may be a regret.
  • CT shows clear swelling of the tracheobronchial lymph nodes (see Fig. 25al), but almost 4 months after chemotherapy. Disappeared (see Figure 25a2).
  • ATBF1 had a mixture of sites showing clear staining in the cytoplasm and sites showing nuclear staining (see Figure 25a4).
  • the ineffective case was a histologically well-differentiated adenocarcinoma (see Figure 25b3), and a CT showed a metastatic tumor (see Figure 25bl) at the upper left pole.
  • a CT showed a metastatic tumor (see Figure 25bl) at the upper left pole.
  • the tumors clearly increased after 4 months (see Figure 25b2).
  • the expression of ATBF1 was small, all was restricted to the cytoplasm, and nuclear staining was not observed (see Figure 25b4).
  • ATBF1 in the nucleus is thought to mean cell cycle arrest via p21, ease of chemical and radiotherapy, while the presence of ATBF1 cytoplasm is the proliferation of cells. It is assumed that it means a strong nature and the difficulty of various treatments. In this case, tumor cells with ATBF1 localization coexisted in the nucleus where the expression level of ATBF1 in the tumor cells is markedly large in the chemotherapy effective cases. On the other hand, ineffective cases, the amount of ATBF1 expressed in tumor cells was small, and ATBF1 was localized in the cytoplasm or tended to lack expression.
  • Small cell lung cancer accounts for about 15-20% of all lung cancers. Compared to non-small cell carcinoma, it is characterized by early metastasis.At diagnosis, more than 70% of mediastinal lymph node metastases are recognized, and about 60% have distant metastases. It is only 4% force that no metastasis is recognized.
  • ATBF1 staining using D1-120
  • 4 cases all males 78, 52, 67, and 70 years
  • ATBF1 in tumor cells It was investigated.
  • the amount of ATBF1 in small cell carcinoma cells is very large.
  • cytoplasmic staining sites There are various types of cytoplasmic staining sites, nuclei staining sites, and a mixture of both staining sites. (See Figure 26). The proportions varied from case to case and were not constant.
  • the presence of ATBF1 in the nucleus means cell cycle arrest via p21, ease of chemical and radiotherapy, and the presence of ATBF1 cytoplasm has a strong cell proliferative potential. It is assumed to mean the difficulty of various treatments.
  • the expression level of ATBF1 is significantly higher than the other types of tumor cells searched for in addition to the various cytoplasm, as well as various tumor cells in which ATBF1 is localized in the nucleus. It was a characteristic that it was mixed at the rate of. This search result seems to fit well with the characteristics that small cell lung cancer has a very high tumor growth rate but is highly sensitive to anticancer drugs and radiation therapy.
  • biopsy specimens will be stained with ATBF1, and in particular, by searching the total proportion of tumor cells where ATBF1 is localized in the nucleus, it is possible to treat curable cases (mostly showing staining in the nucleus). Prediction! It is possible that a certain acupuncture can point out cases that are refractory to chemotherapy (predicting that most tumor cells show cytoplasmic staining).
  • Neuroblastoma is the most common type of malignant solid tumor in children, with age, stage, Prognostic factors such as the site of occurrence, number of genes and chromosomal abnormalities are known, and the treatment method and prognosis are affected.
  • the treatment policy is completely different depending on the judgment of the degree of malignancy, and when treatment is completed by surgery alone, there are cases where treatment can be cured only by chemotherapy.
  • advanced cases and high-grade neuroblastomas require powerful and long-term chemotherapy, sometimes requiring ultrahigh-dose chemotherapy using bone marrow transplantation for lifesaving. . Therefore, the current trend is to aim for a more reduced chemotherapeutic protocol for advanced neuroblastoma with a poor prognosis, with the aim of reducing treatment for infant neuroblastoma with a good prognosis.
  • ATBF1 was localized in the cytoplasm in most tumor cells (see Figure 27). This result suggests that the presence of cytoplasmic staining by ATBF1 staining can be one of the criteria for determining the high malignancy of tumor groups.
  • GIST Gastrointestinal Stromal Tumor
  • Surgical treatment is the first choice of effective treatment for GIST, but there are known cases of recurrent metastasis even after complete resection.
  • a tyrosine kinase inhibitor imatib mesylate
  • imatib mesylate a tyrosine kinase inhibitor
  • the absolute criteria for good or malignant GIST are metastasis to distant organs and invasion of surrounding organs.
  • the size of the tumor is now used as an important criterion because of the prognosis!
  • FIG. 28 shows ATBF1 staining for two cases of GIST (58-year-old female) with primary colon.
  • FIG. 28 shows HE stained image, c-kit (CD117) stained image, CD34 stained image, and ATBF1 stained image in order from left to right in both upper and lower stages.
  • Meningioma (Study on the usefulness of ATBF1 in the pathological diagnosis and prognosis of meningioma) Meningioma, one of the brain tumors, is derived from meningeal skin cells and has a relatively slow course. It is a tumor with a good prognosis among all brain tumors. Although there are overwhelmingly benign tumors, there are rare cases of malignant progression depending on the histological type, and WHO is graded from low to high atypical grade corresponding to the histological type. The MIB1 labeling index is used as a prognostic estimate, but the prognosis is not easy.
  • FIG. Figure 29 shows HE-stained images (al, bl, cl, dl) and ATBF1-stained images (a2, b2, c2, d2) for each case. All tissues in fibrotic meningiomas (low grade g rade I, Fig. 29al, a2) and meningiocutaneous meningiomas (low grade grade I, Fig. 29bl, b2) with no clinical recurrence In the part, ATBF1 staining was observed in the nuclei and no cytoplasmic staining was observed.
  • atypical meningioma (intermediate grade grade II, Fig. 29cl, c 2) that repeats recurrent bleeding, and histologically the tumor growth rate is considered to be fast, and the possibility of recurrence in the future is high.
  • Clear cell meningioma (intermediate grade grade II, Fig. 29dl, d2) contained cells that showed nuclear ATBF1 staining, nuclear and cytoplasmic ATBF1 staining, and cytoplasmic ATBF1 staining only.
  • ATBF1 in the nucleus means cell cycle arrest, ease of chemotherapy and radiotherapy, while the presence in the cytoplasm has strong cell proliferation and the effectiveness of various treatments. It means difficulty. ATBF1 expression sites in Grade I and Grade II tumors The difference was obvious. In the future, it is possible to predict the grade of meningiomas regardless of the histological type by performing ATBF1 staining on surgically removed meningiomas (for example, finding cytoplasmic staining may at least suspect an intermediate variant) In addition, the possibility of recurrence is considered, suggesting the possibility of predicting the need for additional treatments.
  • prostate cancer In addition to aging, prostate cancer is increasing year by year due to lifestyle habits and westernization of diets.
  • PSA prostate-specific antigen
  • the progression of prostate cancer is generally slow, and prostate cancer in the elderly is not treated and only a follow-up policy may be adopted, but the mortality rate after long-term follow-up may be adopted.
  • the usefulness of local therapies such as surgery, endocrine therapy, and radiation therapy to prevent elevation has also been demonstrated.
  • Recent diagnoses are usually screened by an increase in serum PSA levels and systematic biopsy (eg, 14 power stations) under transrectal ultrasound.
  • Prostate cancer is generally adenocarcinoma, Gleason grade system is widely used. This system is not well-organized and accurate in relation to treatment policy decisions and prognosis, and there is still debate among pathologists on the ideal grade sy stem.
  • ATBF1 tends to be localized in the nucleus, while Gleason grade is poorly differentiated and prostate cancer with obvious invasion tendency (Gleason grade) In 5B), the presence of ATBF1 tended to be localized in the cytoplasm.
  • Gleason grade 3B-4B where Gleason grade is intermediate and histologically determined to be moderately divided, ATBF1 is localized in cases and regions with mixed staining in the nucleus and cytoplasm.
  • the localization of Gleason grade and ATBF1 is not completely consistent, it was judged as a large tendency that the difference in the localization of ATBF1 is highly likely to be parallel with the level of the Gleason grade.
  • ATBF1 is present in the nucleus in cell cycle arrest, chemotherapy, and radiation. It means the effectiveness of therapy, while the presence in the cytoplasm means that the proliferation of cells is strong and the effectiveness of various treatments is difficult.
  • the result of this study is that, when searching for biopsy prostate cancer tissue, in addition to determining Gleason grade, combining the search for subcellular localization of ATBF1 makes it possible to determine the prognosis of the patient and determine the treatment policy. It shows the possibility of providing accurate indicators.
  • B-cell neoplasm Mantle cell lymphoma
  • ATBFl showed a tendency to be lost in most tumor cells with a site present in the cytoplasm.
  • ATBFl was either localized in the cytoplasm or missing.
  • ATBFl 62-year-old male moderately to poorly differentiated hepa to cellular carcinoma; ATBFl tended to be present in the cytoplasm at the site of the tumor bordering the surrounding capsule. However, there was a tendency for ATBF1 to be lost as it reached the center of the tumor.
  • B-cell neoplasma Follicular lymphoma, Grade I
  • ATBFl was localized in the cytoplasm in most tumor cells.
  • ATBFl was localized in the cytoplasm.
  • ATBFl was localized in the cytoplasm in almost all cells.
  • ATBF1 is localized in the nucleus in most tumor cells.
  • Endocrine tumor ATBFl was confined to the nucleus in almost all tumor cells.
  • ATBFl palmar fibromatosis
  • each antigen was prepared by the following procedure.
  • An antibody (polyclonal or monoclonal) was prepared using each prepared antigen and purified.
  • Polyclonal antibodies were prepared and purified in the same manner as described in the D1-120 antibody section, and monoclonal antibodies were prepared and purified in the same manner as in various literatures and documents (for example, ⁇ Enzyme antibody method , Revised 3rd edition ", edited by Keiichi Watanabe and Kazuho Nakane, interdisciplinary planning)
  • ATBF1 expression (NT440, 1-12, Dl-120, AT6) in lymphocytes of normal lymphoid tissues around a bronchial lung of a 71-year-old male.
  • Lymphoid tissue contains lymphoid follicles, the place where B lymphocytes mature. There is a germinal center in the center of the lymphoid follicle, and B lymphoblasts are present and are dividing and proliferating.
  • Be ⁇ 2 expression is absent (see Figure 32A), and the cells undergo proliferative cell proliferation. At the same time, cells undergo apoptotic cells that are frequently transferred to apoptosis.
  • Macrophages that phagocytose foreign substances
  • the surrounding marginal area In the place where mature B lymphocytes that have completed sorting are stored, these B lymphocytes show high levels of Be 2 expression (see Figure 32A).
  • Be 2 protein functions to inhibit apoptosis by inhibiting mitochondrial force and releasing cytochrome c into the cytoplasm.
  • normal B cells stored in the marginal region have acquired a function to suppress apoptosis.
  • the staining of ATBF1 obtained with NT440, 1-12, and D1-120 is not particularly different between the germinal center and the marginal region B lymphocytes. NT440, 1-12 is the nucleus, and D1-120 has very high staining.
  • ATBF1 is known to bind the oncogene protein c-myb with protein-protein and suppress its function (see Non-Patent Document 8).
  • the Myb protein family 1 introduces Be 2 and is considered to be O because it has a function to suppress cell apoptosis ( ⁇ jrassilli, E. et al. Resistance to Apoptosis in CTLL— 2 Cells Overexpressing B-Myb Is Associated with B—Myb— dependent bcl-2 Induction, CAN CER
  • This ATBF1 translocation from the nucleus to the cytoplasm of ATBF1 assumes that ATBF1 is processed and functions at an intermediate position between Dl-120 and AT6, and also expresses the Be 2 protein and escapes apoptosis. If an AT6 site is present in the nucleus, the Be-2 expression is suppressed, and it can be determined that the tumor has low malignancy, and the AT6 site is transferred to the cytoplasm. If this is the case, the suppression of Be ⁇ 2 expression is released, indicating that the malignancy can be judged to be higher (see Fig. 33). [0104] 10-3. Expression of ATBF1 protein in cultured tumor cells (examination of protein fragments by Western blotting using Dl-120)
  • ATBF1 assumed in 10-2 is cleaved at several sites and functions in each fraction of cells, a cultured cell line derived from human neuroblastoma, NB1, GOTO; Mouse undifferentiated embryonic cancer cell line P19, SDS-PAGE using anti-ATBF1 antibody (D1 -120) using the above three types of cultured cells,
  • P19 cells have neurites-induced to differentiate into eurons.
  • the culture dish was peeled off and suspended in PBS (pH 7.4). Suspended cells were collected in a pellet by centrifugation at 200 g for 10 minutes, and the proteinase inhibitor was chilled in ice-cold 1 ysis buffer (10
  • SDS-PAGE sample buffer (0.0625 M Tris-HC1, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% ⁇ -mercaptoethanol) was mixed and boiled for 2 minutes. After centrifugation at 21,880 g and 4 ° C for 30 minutes, the supernatant was separated and electrophoresed on a polyacrylamide gel. Since the molecular weight of the ATBF1-A full length is 404 kDa, 4% of the gel for SDS-PAGE was selected. 20 g of protein was mounted on each gel lane.
  • PVDF polyvinyldifluoride
  • Blocking was performed at Ace (Snow Brand Milk Products, Japan) for 1 hour at room temperature.
  • GOTO did not respond to retinoic acid treatment, and there was no change in the protein expression level before and after treatment. From the beginning, protein expression of 230 kDa and 210 kDa was already predominant (see Figure 34 lanes 6 and 7).
  • the small size-based ATBF1 expression in GOTO and the fact that 404-kDa ATBF1 cannot be detected are likely to result in the protein being cytoplasmic and simultaneously being fragmented by processing.
  • mRNA encoding a small protein may be produced, and a 404-kDa protein cannot be expressed! /, And there is a possibility that a mechanism exists.
  • ATBF1 NT440, 1-12, Dl-120, AT6
  • GIST Gastrointestinal stromal tumor
  • Be ⁇ 2 protein Be ⁇ 2 protein.
  • c-kit positive, CD34 positive Fig. 35A
  • this is a more detailed judgment than the search results of the grade of malignancy with the addition of AT6, and searching for the number of sites in which AT6 is cytoplasmic or missing is the relapse and metastasis of this type of tumor. This suggests the possibility of being an index for predicting the likelihood of occurrence.
  • a 56-year-old woman a lymphoma with an enlargement of 3 cm in diameter in the upper right clavicle and right axillary lymph node.
  • Pathologically diffuse large cell proliferation see Figure 37A
  • B lymphocytes LCA
  • CD20 see Figure 37B
  • CD79a was positive, almost all tumor cells showed Be 2 protein expression (see Fig. 37E), and were judged to be malignant lymphoma (large cell diffuse B cell).
  • ATBF1 NT440, 1-12, Dl-120, AT6
  • ATBF1 NT440, 1-12, Dl-120, AT6
  • GFAP GFAP
  • Bcl-2 GFAP
  • BexL GFAP
  • MIB1 MIB1
  • Glioblastoma is a malignant glioma that occurs frequently in middle-aged and elderly and is a common brain tumor. It is called glioblastoma multiforme because it shows various images both macroscopically and histologically.
  • the tissue has large and small necrotic lesions within the tumor, and is characterized by pseudopalisading necrosis.
  • Glial fibrillary acidic protein GFAP
  • the brain tumor treatment code states that “GFAP is expressed in some cells by immunohistochemistry. The frequency and morphology of positive cells are extremely diverse.” The fact that the frequency and form in this text are diverse means that the relationship between GFA P expression and tumor site has not yet been clarified.
  • ATBF1 nuclear and cytoplasmic transfer was Yeast two This was a proof of protein-protein binding between ATBF1 and GFAP by the -hybrid method. The binding site is almost the center of AT BF1-A and the C-terminal of GFAP protein. Furthermore, luciferase analysis reveals that ATBF1 increases GFAP promoter activity. By using the four antibodies, the theoretically predicted molecular mechanism could be demonstrated by an actual clinical specimen of glioblastoma multiforme.
  • the inventors first compared GFAP expression at the tumor site that forms a solid alveoli and at the necrotic lesion and its surrounding sites.
  • the solid growth site shown in Figure 39A1 almost all cells showed strong GFAP expression (see Figure 39A2).
  • This tumor is known to have a high frequency of bleeding and necrosis.
  • the part surrounded by the arrow in Fig. 39B1 is the part considered to be necrotic tissue, and it is interpreted as the result of necrosis and dropout because the blood flow for nutrition with strong growth is not obscure (ischemic).
  • D1-120 is mainly nuclear ( Figure 40bl)
  • AT6 is also mainly nuclear ( Figure 40cl)
  • MIB1 labeling index is low ( Figure 41al).
  • Bc 2 Fig. 41bl
  • Bd-XL Fig. 41cl expression
  • D1-120 is mainly cytoplasmic ( Figure 40b2)
  • AT6 is also mainly cytoplasmic ( Figure 40c2).
  • the labeling index was high (Fig. 41a2), and the expression of Bc ⁇ 2 (Fig. 41b2) and Be ⁇ xL (Fig. 41c2) tended to be high.
  • NT440 and 1-12 which can detect the N-terminus in ATBF1 expression, are related to the presence or absence of GFAP production.
  • the expression was mainly nuclear (see Figs. 42A and B).
  • the actual glioblastoma is still a highly malignant tumor, and 80% of the force died within one year when it was discovered. It ’s not possible, the situation continues. Even if the tumor shrinks temporarily with chemotherapy, the gap can be understood by ATBF1 staining that the remaining treatment-resistant cancer cells re-grow, reappear, and progress to death.
  • the inventors consider the relationship between ATBF1 localization and GFAP, considering the hypothesis of growth progression from the occurrence of tumor as follows.
  • Tumor growth begins early in glioblastoma development. Naturally, tumor blood vessels also grow, but ATBF1 appears in the nucleus when ischemia occurs and DNA damage is applied to the tumor cells (any part of NT440, 1-12, D1-120, AT6 is the nucleus). This stops the cell cycle and promotes the transition to apoptosis. At the same time, ATBF1 expression in the nucleus causes activation of the GFAP promoter. At this stage, there are many cells that are induced to apoptosis before GFAP is expressed (scatter of necrotic areas. Reasons for few GFAP positive cells in the vicinity of necrotic areas).
  • Glioblastoma is a tumor with a particularly high malignancy and a poor prognosis. Although the molecular biological mechanism was unknown from the conventional pathological diagnosis, empirically, the ability to produce GFAP has become one of the targets for one evil degree!
  • ATBF1 In glioblastoma multiforme, GFAP production is activated due to the expression of ATBF1 in the nucleus. Since ATBF1 and C-terminal half are stabilized in the cytoplasm by protein binding of ATBF1-GFAP, nuclear translocation of ATBF1 is blocked and malignancy is expected to increase.
  • the tumor was a 4.0 x 2.8 x 1.7 cm large, superficially elevated tumor present approximately 30 cm from the incisor row (see Figure 43A).
  • the tumor cells were diagnosed as neuroendocrine cancer because NSE, S-100 protein were mostly positive, chromograninA, CD56 (NCAM) (see Fig. 43 B) and Synaptophisin were also positive. Invasion to lymphatic vessels was also observed (see Figure 43C).
  • the tumor was judged to be a tumor with various divergence directions with a mixture of AE1 / AE3, CAM5.2 positive and clearly epithelial characters, and Vimentin positive and sarcoma-like sites.
  • NT440, 1-12 was the nucleus
  • Dl-120 and AT6 were cytoplasmic stains at sites showing nest-like and poorly differentiated sequences (see Figure 44A2-E2, G).
  • the grade of malignancy is determined by ATBF1
  • the well-differentiated sites are both Dl-120 and AT6, and the low-grade malignant sites of both Dl-120 and AT6 can be judged to be both cytoplasmic and high in malignancy. It was.
  • tumor pathology suggests that morphologically highly sensitive sites within a tumor are considered to develop slowly, and the tumor grows faster and becomes less differentiated as the malignancy of the tumor increases. It is thought that the shape of the tumor changes mainly in dense sites and eventually shows high progress and distant metastasis. In this case, the grade of malignancy using ATBF1 was judged to be a tumor in which highly differentiated sites had low malignancy but low-grade sites were mixed with those sites with high malignancy. This is interpreted as demonstrating traditional pathological observations using ATBF1. I can do it.
  • the first example is a 56-year-old male with a site of lymph node metastasis in unhealthy vaginal cancer of the sinuses.
  • MIB1 is a high-grade tumor with most tumor cells labeled (see Figure 45A) and very high expression of Be 2 protein.
  • the second example is a 47-year-old female with a site of large-cell diffuse B-cell lymphoma in the brain. It shows diffuse growth around the cerebral blood vessels (see Fig. 46A), CD20 and CD79a are positive (see Fig. 46B and C), can be judged as B cell malignant lymphoma, and Bel-2 protein expression is strong ( (See Figure 46D) High-grade tumor. In these two cases, A TBF1 (NT440, 1-12,
  • ATBF1 is used to determine the malignancy of cancer, D1-120 is missing, AT6 is localized mainly in the cytoplasm, and it can be determined that the malignancy is very high.
  • ATBF1 ATBF1
  • the sites around the tumor are NT440, 1-12 localized in the nucleus (see Bl, B2 and Fig. 49B in Fig. 48), Dl-120 and AT6 are localized mainly in the cytoplasm (B3, B4, Fig. 48 in Fig. 48) 49B).
  • the presence of D120 in the cytoplasm means that the tumor is highly malignant, and AT6 is the cytoplasmic main body and there is no contradiction in the expression of Be 2.
  • D1-120 are missing (see Figure 48A1, A2, A3, Figure 49A), and AT6 is localized in the nucleus (See Figure 48A4 and Figure 49A).
  • the lack of D1-120 means that this tumor is highly malignant, and there is no contradiction that AT6 is mainly cytoplasmic and Be-2 expression is suppressed.
  • the staining property that the site corresponding to exon 3 and 10 is missing and only the site corresponding to exon 11 is localized in the nucleus is a new pattern that the inventors have never experienced.
  • the search results in this example may increase the degree of malignancy while the processing status of ATBF1 and the localization of expression change depending on the site, even within the same tumor that appears to be completely histologically similar. Means.
  • the various large cell diffuse type B lymphomas presented here have different localization sites of ATBF1, and ATBF1 may contribute to a new grade of malignancy within the established tumor concept. It seems to have shown.
  • ATBF1 functions by binding protein to the tumor suppressor gene P53. It was assumed that this ATBF1 and p53 complex activated the promoter of the tumor suppressor gene P21, leading to increased expression of p21, stopping the cell cycle, and causing cancer cells to fall into apoptosis. It has also been clarified that when the DNA modification signal is activated by actually acting an alkylating agent (anticancer agent), the expression of ATBF1 can be induced.
  • ATBF1 is known to bind to the oncogene protein c-myb and to suppress its function (see Non-Patent Document 8).
  • the Myb protein family is also considered to have a function of introducing Bd-2 and suppressing cell apoptosis (Grassilli,
  • Anti-ATBF1 antibody recognizes exon 11 of ATBF1, which binds protein-protein to oncogene c-myb (see Non-Patent Document 8). O The result of this histological search is ATBF1 When the protein moves to the nucleus, it can interact with the Myb cancer gene protein, suggesting that it may be involved in the suppression of the be ⁇ 2 gene.
  • the cell cycle arrest and transition to apoptosis in cancer cells is not only the total amount of ATBF1 expression but also the intracellular localization of its functional fragments. The fact that it depends heavily on the existence became clear. This is the theoretical basis for the use of multiple antibodies against ATBF1 (including NT440, 1-12, and AT6, which are only D1-120).
  • Non-Patent Document 9 clarified that various mutations exist in the gene encoding ATBF1 in prostate cancer, and reported that dysfunction of ATBF1 is one of the causes of prostate cancer. Numerous chromosomal aberrations of number 16 have been reported in various cancer cells other than prostate cancer, but the responsible gene involved in each canceration has not been identified. Non-Patent Document 9 clarifies that ATBF1, which exists in the long arm of No. 16, plays an important role in determining the malignancy of tumors as one of tumor suppressor genes (tumor suppressor genes). .
  • Reagent A Anti-ATBF1 antibody stock solution (D1-120)
  • B reagent ATBF1 antigen solution
  • the reagent A is obtained by adjusting the anti-ATBF1 antibody prepared in Example 2 to 250 / z g / ml.
  • the B reagent can be obtained by adjusting the recombinant peptide in which 41 amino acid residues (2114 to 2154: L QTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQNKR: SEQ ID NO: 1) of mouse ATBF1 prepared at the time of D1-120 antibody preparation are fused to 2 mg / ml.
  • the C reagent can be obtained by adjusting GST (for example, Sigma) to 2 mg / ml.
  • test tissue excised at the time of surgery or necropsy is fixed with 10% formalin and embedded in paraffin in the same procedure as the usual pathological examination.
  • Paraformaldehyde fixation may be used instead of formalin for specimens of animal experiments using rats, mice, etc.
  • ATBF1 staining and formalin and paraformaldehyde fixation There is no particular difference between ATBF1 staining and formalin and paraformaldehyde fixation.
  • the basic method is to use surgical pathological tissue fixed in formalin immediately after collection.
  • citrate buffer put 2 liters of citrate buffer in a pressure cooker (which can be used for general cooking) and boil on high heat.
  • a commercially available citrate buffer for example, an instant citrate buffer [20-fold concentrated solution RM-102C], pH 6.0, manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd.
  • RM-102C instant citrate buffer
  • pH 6.0 pH 6.0
  • anti-ATBF1 antibody (A reagent) may have mixed reactivity with GST! To confirm that DAB color development is not a result of the reactivity of anti-ATBF1 antibody to GST, perform the following procedure.
  • the present invention can be used to predict characteristics (including malignancy, prognosis, responsiveness to various treatments) of various cancers (including sarcomas). If the present invention is used, although it is highly likely to cause metastasis or recurrence, it may be pointed out, for example, as intermediate malignancy, even if it is generally regarded as a benign tumor depending on the judgment method used so far. It will be possible. On the other hand, the patient's ability to predict the malignancy of the tumor and the therapeutic effect has resulted in more patient ADL (Activit) in cases where it is necessary to select unnecessary and excessive treatment. It seems to enable treatment that focuses on the improvement of quality of life (y of daily living) and quality of life (QOL).
  • the value of the present invention for judging the malignancy of neuroblastoma may be particularly important. Life prognosis and treatment policy of infant patients It is anticipated that the present invention could become a global standard pathological diagnostic criterion as a means of providing an important indicator for making rapid decisions.

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Abstract

　癌細胞の悪性度を簡便に判定するための手段を提供する。生体から分離された被検癌細胞の細胞全体のATBF1量を検出し、検出結果を用いて被検癌細胞の悪性度を判定する。または生体から分離された被検癌細胞の核内のATBF1量を検出し、検出結果を用いて被検癌細胞の悪性度を判定する。または、生体から分離された被検癌細胞の細胞質内のATBF1量を検出し、検出結果を用いて被検癌細胞の悪性度を判定する。好ましい一形態では、ATBF1量として、(1)ATBF1遺伝子のエクソン１０に対応する領域の核内存在量及び／又は細胞質内存在量、(2)ATBF1遺伝子のエクソン１１に対応する領域の核内存在量及び／又は細胞質内存在量、並びに(3)ATBF1遺伝子のエクソン３に対応する領域の核内存在量及び／又は細胞質内存在量のいずれか一以上を検出する。

Description

明 細 書
癌細胞の悪性度判定法
技術分野
[0001] 本発明は癌細胞の悪性度を判定する手段に関する。詳しくは、癌細胞の悪性度判 定法、並びにそれに使用される試薬及びキットに関する。
背景技術
[0002] 悪性腫瘍全般を指す癌は、それが形成される組織、患者の遺伝的素因、環境要因 などによって様々な病態を呈する。癌の治療では一般に、化学療法や放射線療法或 いは外科的手術などの中から有効性の最も高いと考えられる療法が優先的に選択さ れる。癌の治療方針の決定にあたっては癌細胞の悪性度を正確に把握することが極 めて重要である。癌の悪性度は一般に癌細胞の増殖能と化学療法または放射線療 法の効果により決定される。悪性度が低い癌とは増殖能が低く外科的切除が容易で あるか、化学療法又は放射線療法が有効であり予後が良好となる。悪性度が高い癌 は増殖能が高ぐ外科的切除が困難か、化学療法や放射線療法が無効であり予後 が不良となる。悪性度が特に高い癌の場合には迅速、的確な外科的摘出が望まれる し、的確な補助治療 (放射線療法又は化学療法)が必須となる。もし悪性度の判定を 誤れば、期待される治療効果が得られず、病態の悪化や、重篤な副作用の発生、或 いは再発が引き起こされる。実際、癌の特性、とくに悪性度を判定する有効な手段が な！、ために誤った治療方針の下で治療が実施され、有効な治療効果が得られな 、ま ま不幸な結果に至った症例報告も多 、。
これまでのところ、病態や腫瘍マーカー、病理組織検査などによって癌の悪性度を 判定 (鑑別）することが試みられている。しかしながら、ほぼすベての悪性腫瘍に共通 して採用できる決定的な判定手法は確立されていないのが現状である。また、従来 の判定手法では、同程度の悪性度と判定される二つの病態であってもそれらの予後 が全く異なることも多く経験されるために、それらの鑑別が望まれているところである。 尚、本発明に関連する報告を以下に列挙する。
[0003] 非特千文献 1 : Miura et al.し loning and characterization of an ATBF1 isoform thatex presses in a neuronal differentiation- dependent manner. J. Biol. Chem. (1995)270: 2 6840-26848
非特許文献 2 : Kataoka et al. Alpha- fetoprotein producing gastric cancer lackstransc ription factor ATBF1. Oncogene (2001) 20: 869—873
非特言午文献 3 : Ishu et al. ATBF1- A protein, but not ATBF1- B， ispreferentialyexpre ssed in developing rat brain. J. Compartive Neurology (2003)465: 57-71
非特言午文献 4 : Kataoka et al., INGl represses transcription by direct DNA binding and through eifectson p53. Cancer Res. (2003)15:5785-92.
非特許文献 5 :野口ら.脳転移をきたした AFP産生胃癌の長期生存の一例. 日消外会 誌（2003) 36 (12):1659-1664
非特 S午文献 b : Miura et al. Susceptibility to killer T cells of gastric cancercells enhan cea by mitomycin- C induction of ATBF1 and activation of p21(Wafl-/Cipl) promot er. Microbiol. Immunol (2004) 48: 137—145
非特言午文献 7 : Iida et al. Alteration of the AT motif binding factor- 1 expressionin alp ha— fetoprotein producing gastric cancer: is it an event fordifferentiation and prolifer ation of the tumors? Oncology Report (2004) 11: 3-7
非特言午文献 8 : Kaspar et al. Myb- interacting protein, ATBF1, repressestranscription al activity of Myb oncoprotein. J. Biol. Chem. (1999) 274:14422-1442
非特言午文献 9 : Sun X et al. Frequentsomatic mutations of the transcription factor ATBF丄 in human prostate cancer. Nat Genet. (2005) Mar 6; [Epub ahead of print] 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
以上のように、癌の悪性度を正確に判定することは、治療方針を決定する上で極め て重要である。一方、癌の悪性度の判定では、正確であることは勿論のこと迅速性も 要求される。即ち、正確で且つ迅速な治療方針の決定が行えてはじめて高い治療効 果を期待できる。正確であることに加えて、迅速に且つ過度の負担を患者にかけるこ となく癌の悪性度を判定できる手法が開発されれば、癌治療に対する貢献は計り知 れず、癌患者への大きな福音となる。 本発明は以上の背景に鑑み、癌細胞の悪性度を簡便に判定するための手段を提 供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 以上の目的の下、本発明者らは ATBFl (ATモチーフ結合因子 1)に注目し、そのタ ンパク質の細胞内局在に関する様々な検討を行った。尚、 ATBF1は異なったプロモ 一ターの使用及び選択的スプライシングにより形成される、分子量の異なった 2つの ァイソフォームである ATBFl-A(404kDa、アミノ酸配列を配列番号 2に示す。また、 A TBF1-Aをコードする塩基配列（GenBank accession
number: L32832を参照）を配列番号 3に示す。）と ATBFl- B (306kDa、アミノ酸配列を 配列番号 4に示す。また、 ATBF1-Bをコードする塩基配列（GenBank accession number: L32833を参照）を配列番号 5に示す。 )の存在が知られている（非特許文献 1を参照）。尚、 ATBFl- Aはタンパク質 N末端側が ATBFl- Bよりも 920アミノ酸長い構 造を有している。
[0006] まず、培養癌細胞を用いて、 ATBF1の核 ·細胞質移行と細胞周期との関連性につ いて検討した (基礎実験 1)。即ち、 P19マウス未分化胚性癌細胞株の培養細胞を使 用し、レチノイン酸刺激により、未分化な癌細胞を神経細胞に分化させる実験を行つ た。その結果、（1) P19癌細胞に特に分化刺激を加えない未分化増殖状態で、 ATBF 1は核、細胞質ともに発現を認めず、癌細胞は増殖状態を示した。（2)神経分化を促 してもなお癌細胞が未分化増殖状態を維持する場合、 ATBF1の細胞質での発現が 始まるが、癌細胞はなお増殖状態を維持した。（3)癌細胞が神経突起を有する分ィ匕 した細胞群に変化すると、 ATBF1は細胞質から核に移動し、核主体の発現に変化し た。細胞周期の停止、増殖抑制が認められた。これらの実験結果は ATBF1が、 2箇 所の核内保留シグナルの存在より予想されたごとぐ実際に細胞質力 核に移行す るタンパク質である事と、この移行が細胞周期の停止と関連する事を意味して 、る。
[0007] 次に、培養癌細胞を用いて、 ATBF1の細胞質力 核への移行と、核から細胞質へ の移出の調節機構に関して検討した (基礎実験 2)。その結果、 P19細胞を使用した、 ATBF1の細胞質と核の移行に関する制御系への関連の検討で、フイブロネクチン、 ラミニン、ゲラチン、ポリ L—オル-チンなどを培養皿へ塗布した場合にのみ P19細 胞培養皿によく付着することができ、その条件下で ATBF1の核への移行が観察され た。これは浮遊状態力 付着状態への変化で細胞表面に存在する受容体が関与し 、細胞外部環境に応じた情報を細胞内へ伝えることで ATBF1の細胞内局在が決定さ れている可能性を示唆する。次に、 ATBF1の核力も細胞質への移出機序に関連した 板—^ ίで、 CRMl(Exportin 1 or chromosome region maintenance 1の阻舍: ^ljLeptomyc in Bの作用で、実際に核からの細胞質への ATBF1核外輸出阻害が起こり ATBF1の 核内濃度が明らかに増大する事実と、アポトーシスに陥る細胞数が明らかに増加す る事実が証明された。これらの実験結果から ATBF1濃度が核内で増加する状態は、 癌細胞のアポトーシスを促進する状態であると判断でき、癌の治療方針に重要な示 唆を与えていると考えられる。さらに、 ATBF1の核移行の調節機構に関する検討で、 培養皿接着状態で、さらにレチノイン酸処理を行った P19培養細胞に PI3K(phosphati dylinositol 3— 36)の拮抗剤2種（\^01" & LY294002)を作用させると、 P19細 胞の ATBF1産生自体は影響を受けな力つた力 核周囲の細胞質部分に ATBF1タン ノ ク質が核周囲リング状となるように集合するも、核内へのタンパク質の移行は阻止 される傾向（作用は Wortmanninが LY294002より強い）を示すとともに、細胞自体は増 殖状態を維持した。この実験結果は ATBF1の核への移行が PI3Kに依存した事象で ある事、核への ATBF1移行が行われない場合、細胞は増殖状態を維持出来る事を 意味している。続いて、上記検討の際に確認した PI3Kファミリータンパク質の中で、ど のタンパク質が ATBF1の核移行の際のリン酸ィ匕に関与しているかを決定する検討で 、 ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated,毛細血管拡張性小脳運動失調症の原因遺 伝子)の作用を特に特異的に阻害するとされる薬剤、カフェインを作用させた。その結 果、 PI3K阻害剤、 Wortmannin, LY294002を使用した場合には核移行の阻害が不完 全であったのに比較して、カフェインによって、殆ど全ての培養細胞における ATBF1 の核への移行が阻害された。この結果は ATBF1の核内保留シグナル部位のリン酸ィ匕 に関与する PI3Kは ATMである事を意味している。さらに ATBF1が核に導入されるの には ATMの活性ィ匕（リン酸化）、すなわち放射線などによる DNA障害の感知によって 促進される事を意味して ヽる。
以上の基礎実験 1、 2の結果、 ATBF1が細胞質から核へ、さらに細胞質へと行き来 をする事で細胞周期の時期や増殖状態に切り替わる事が明ら力となった。 ATBFlの みが主な原因でそれらの事象が起こったの力、他の何らかの因子が作用した結果な のかを明らかにする目的で、 ATBF1単独発現ベクターを用いて、マウス神経芽細胞 腫由来の培養細胞株 Neur02A細胞で強制発現実験を行った (基礎実験 3)。その結 果、 ATBF1の強制発現を認める細胞は、例外なく BrdU(5— bromodeoxyuridine)取り 込みを認めない事が明ら力となり、 ATBF1が誘因となり細胞周期が停止する事実が 明らかとなった。
[0009] 続 、て、胎生 14日ラット胎仔脳の神経細胞における ATBF1の核移行と神経細胞の 増殖能との関連性について検討した (基礎実験 4)。まず、胎生 14日のラット胎仔脳 組織を検索したところ、傍脳室領域に存在する神経上皮細胞は BrdU取り込みを認め るとともに ATBF1が細胞質に局在していた。分化領域に存在する神経細胞は BrdU取 り込みが無いこと力も細胞周期が停止していることが分かり、 ATBF1は核に局在した 。胎仔期の、分裂増殖能を有した神経上皮細胞と、分裂能を失い最終分化した神経 細胞における ATBF1の細胞内局在の比較観察は、癌の悪性度を考える上で非常に 参考になる。癌細胞は、未分化で分裂能を有する点で正常神経上皮細胞に類似し、 また、 ATBF1が細胞質に存在する点においても類似している。正常神経上皮細胞で は ATBF1が細胞質力 核へ移行することによって、細胞増殖を停止した神経細胞へ と最終分化して性質を変える。癌細胞にお 、ても ATBF1の細胞内局在に関して二つ の様式が認められ、 ATBF1が細胞質だけに存在する悪性度の高い種類と、核に ATB F1が存在する比較的悪性度が低い種類に分類できる。
[0010] 一方、 ATBF1の核内濃度の増大は細胞周期の停止を誘導し、細胞の分化傾向の 指標となることを実証した。 ATBF1の核への移行の分子機構には、 PI3Kファミリータ ンパク質の一員である ATMが直接関与することを実験的に確認した。
また既報 (非特許文献 6)ですでに示したごとぐ胃癌の培養細胞において、 ATBF1 は癌抑制遺伝子 P53と蛋白-蛋白結合し機能する。この ATBF1と p53複合体が癌抑 制遺伝子 p21のプロモーターを活性ィ匕して、 p21の発現上昇を導き、癌細胞をアポト 一シスに陥らせることが想定される。実際にある種の抗ガン剤 (アルキル化剤）を作用 させて DNA修飾シグナルを活性ィ匕すると ATBF1の発現を誘導する事実も明らかにな つている。癌治療効果は ATBF1の誘導および、 ATBF1を細胞質力も核へ移動させる 効果に大きく依存する。これは本発明者らが、以下臨床的な応用実験で ATBF1の発 現様式から各種癌細胞のアポトーシス、各種治療の効果を評価する原理となって 、 る。
[0011] 上記基礎実験による ATMシグナルによる ATBF1の細胞質から核への移行、 ATBF1 と p53の結合、さらに p21の発現誘導、 DNA修復シグナルによる活性ィ匕などの事実を 踏まえ、本発明者らは、乳癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、神経芽細胞腫、消化管間質腫 瘍（GIST)、髄膜腫、前立腺癌をはじめとする各種癌細胞 (ここでの癌細胞には、良性 腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍に至る一連の細胞も含む）における ATBF1の細 胞内存在量及び局在態様を検索した (比較検討材料として腫瘍以外の正常ヒト細胞 についても検討した)。さらに患者の予後を検討できる症例は、 ATBF1発現様式と予 後との関連も検討した。その結果、ヒト各種癌細胞で ATBF1発現を認める症例は、そ の発現部位が核か細胞質かを問わず、発現を認めない症例よりも予後が良好な傾向 があった。さらに ATBF1の核 ·細胞質局在を含めて検討すると、予後不良であった症 例では細胞の核内 ATBF1量が減少しており、癌の悪性度と核内 ATBF1量とが明らか に関連することが判明した。具体的には、予後不良の症例では、 ATBF1が核よりも細 胞質内に多量に存在するか、細胞質のみに局在する傾向を示し、さらに予後不良な 例の中には核、細胞質ともに ATBF1が欠落する例が存在した。
[0012] 以上の結果から、 ATBF1の細胞全体、細胞質、核での染色性は、（1)核主体の局 在を示す場合、（2)細胞質主体の局在を示す場合、（3)核細胞質ともに欠落する傾 向を示す場合で癌の悪性度が異なり、その区別により癌細胞における悪性度を判定 できることが明ら力となった。
[0013] 本発明者らは ATBF1と癌細胞の悪性度との関係について更に詳細な検討を行つ た。即ち、以上の各実験で使用した抗体 D1— 120 (ATBF1タンパク質の中央部、即ち ATBF1遺伝子のェクソン 10に対応する領域を特異的に認識する抗体）にカ卩えて、 A TBF1-Aタンパク質の N末端側 (ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域)を特異 的に認識する 2種類の抗体 (抗体名； NT440及び 1-12、図 31を参照）及び ATBF1タ ンパク質の C末端側 (ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域)を特異的に認識 する抗体 (抗体名； AT6、図 31を参照）を使用して各種癌細胞における ATBF1タンパ ク質の局在部位の検討を行った。その結果、以下の知見が得られた。
(1)癌の悪性度によって局在が大きく異なるのは D1-120が認識する部位 (D1-120部 位）と AT6が認識する部位 (AT6部位)である。従ってこれらの部位を検出することは、 癌の悪性度を判定する上での重要度が高い。また、 D1-120単独での検索が癌の悪 性度の判定の指標となることが明らかとなっており（後述の実施例を参照）、癌細胞の 悪性度判定において D1-120部位の検出が最も重要であると考えられる。一方で、 D1 -120部位と AT6部位の局在を同時に検討する事により、より特異性の高い悪性度判 定法を提供できることが判明した。
(2) D1-120以外の抗体を使用した研究により、 ATBF1は腫瘍の種類あるいは悪性ィ匕 に伴い、一つの巨大タンパク質として常に存在している訳ではなぐタンパク質のプロ セッシングを受けたり、あるいは時には ATBF1遺伝子転写の際に mRNAの altenative splicingによりェクソンのスキッピングが起こり、タンパク質構造に変化が起こる病態が 存在する事が明らかになった。（図 47を参照)。
(3) NT440と 1-12の染色性はともに概して核主体に局在する傾向であった。従って、 これらの抗体が認識する部位、即ち ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する N末端の A TBF1部位の検出は細胞全体での ATBF1量が増カロ、減少したのか、あるいは ATBF1 が欠落するかの指標になる。また NT440が細胞質に残り 1-12が核に存在する場合に は 148番のセリンがリン酸ィ匕を受け ATBF1の N末端が核に移行するという動きが存在 する事を意味するから、 NT440と 1-12で染色されるタンパク質量の比率を求めれば同 部の核移行の比率を知る事が可能である。さらに NT440部位又は 1-12部位の存在、 欠落、核細胞質の局在位置を、 ATBF1タンパク質中央を認識する抗体 (D1-120)及び Z又は C末端側を認識する抗体の染色性と比較する事で、 ATBF1タンパク質のプロ セッシングの状況、さらには mRNAレベルで起こる異常なスプライシングによるェクソ ンスキップの判定が可能である。以上の理由から巨大な転写因子である ATBF1のゲ ノム構造異常の全体像を正確に把握するには、重要な DNA結合ドメインをコードする のェクソン 10に対応する抗体のみならず、 N末端をコードするェクソン 3に対応する 抗体 (さらには C末端をコードするェクソン 11に対応する抗体)でそれぞれ染色して 比較することが有効である。このように、 ATBF1-Aの N末端側を認識する抗体の染色 性を調べることは、癌の悪性度を判定する上で補助的ながらも有益な情報を与える。 (4)現在までの検討結果を、 D1-120部位が核主体に存在する場合と細胞質主体或 いは欠落する場合の二つに分けて考える。まず、 D1-120が核主体に存在する場合 はさらに、 AT6部位が核主体に存在する症例と、細胞質主体に存在する症例の二つ に分かれる。 Be卜 2や Bd-xが発現する腫瘍においてその発現を ATBF1発現と関連 し
づけると、 [A] AT6部位が核主体に存在すれば、 Bcl-2, Bcl-xの発現が抑制される し
傾向が明確であり、悪性度が低いと判定できる。 [B] AT6部位が細胞質主体に存在 すれば、腫瘍によっては Be卜 2, Bcl-xの発現が抑制できず、 AT6部位が核主体に存 し
在する場合よりは悪性度が高いと判定できる。
次に、 D1-120部位が細胞質主体に存在する場合、あるいは欠落する傾向のある場 合であるが、大部分の腫瘍で AT6部位の局在は細胞質主体となる。一般に D1-120 部位と AT6部位は同時に細胞質に検出される。し力しながらある種の腫瘍で D1-120 部位が欠落した場合でも、 AT6の染色性が細胞質ではなく核に局在する例外が認め られた (現在までの検索では後述のごとく B細胞リンパ腫のある特定の部位)。この場 合、 D1-120部位が欠落する観察だけでは極めて悪性度が高いと判断される可能性 があるが、実際には AT6が核に局在すると Bcl-2が抑制される事が理論的に予想され 、かつ観察自体がそれを証明している。従って同じ D1-120部位が欠落する悪性度が 高い腫瘍の中でも、 AT6が核に局在する腫瘍の診断は注意を要し、 AT6が細胞質に 存在する腫瘍に比較すると悪性度は低いと判断する必要があると考えられる。
以上をまとめると、 D1-120で検出できる ATBF1部位の局在検討が癌の悪性度判定 の際に最も重要と位置づける事が可能である。し力し、ここに AT6, 1-12, NT440によ る所見を加える事によりさらに詳細な判定が可能であるといえる。
上述した NT440, 1-12, Dl-120, AT6の染色性から、同一腫瘍において、 ATBF1の N末端部位（NT440, 1-12)、中央に近い部位（Dl-120)、 C末端部位（AT6)の三箇 所の染色性が全て核主体、あるいは全て細胞質主体であると 、つた統一性が症例ご とに存在しないことは、 ATBF1はタンパク質プロセシングによる断片化や、ェクソンの 使われ方や突然変異など遺伝子レベルの変異などの影響で、タンパク質の全体構 造に変化が起こる病態が存在する事実を表して ヽる。
[0015] ここで、ェクソン 3に対応する領域を認識する抗体の中で 1-12は 148番のセリンがリ ン酸化されて ヽる状態を認識し、 NT440はリン酸ィ匕の有無にかかわらず N末端の ATB F1部位を認識する。ェクソン 3に対応する領域には核内保留シグナルが存在する一 方、核外輸出シグナルは存在しないことがわ力つており（図 31および図 33を参照）、 この領域が他の領域から分断された場合には、核だけに存在して、細胞質には存在 しない特異的な状態となる。 1-12抗体と NT440抗体はこの特異的状態を検出すること が可能である。一方、 AT-6はェクソン 11に対応する領域を認識する。この領域には 核内保留シグナルも核外輸出シグナルも構造的には存在しないために（図 31および 図 33を参照）、他の領域力も分断された場合には、核には積極的に移動できない断 片となり、主に細胞質に集積することが予想される。この状態を AT-6は特異的に検出 することが可能である。以上のことから、 ATBF1がプロセシングを受けることなどにより ATBF1の全体構造に変化が起こる病態が予想される全ての癌 (腫瘍）において、 D1- 120に加えて、 1-12、 NT440, AT-6の所見も総合して検討することが好ましい。結論と して、 4つの抗体を同時に使用し、 D1-120の所見を中心とし、他の抗体の所見、特に AT6の所見を総合し、悪性度判定を行うことによって、判定の確実性が一層向上する といえる。
[0016] 理論的なさらなる側面として、前立腺癌で見出された ATBF1ゲノムに蓄積する各種 の変異、 mRNA段階での Altenative splicing異常の可能性を詳細に検討していくと、 ホメォドメイン 1から 4を含むェクソン 10がスキップされた ATBF1タンパク質の存在の 可能性を指摘出来る（非特許文献 9、及び図 37を参照)。これはつまり、種々の腫瘍 における D1-120部位 (エタソン 10に対応、図 31を参照）の染色性の欠落が（後述の 実施例を参照）、腫瘍の悪性度の高さを指摘できる事だけに止まらずに、ェクソン 10 力 Sスキップされた異常タンパク質の存在をすでに指摘できて 、る可能性もある。しか もこの D1-120染色性の欠落は前立腺癌以外の腫瘍でもすでに観察されており、前 立腺癌ですでに認められた ATBF1ゲノムの変異、 mRNAレベルの Alternative splicing異常は広く他の腫瘍にも共通して存在する可能性が示唆される。またこのよう に工クソン 3, 10, 11に対応する抗体を使用した ATBF1の特定の部位の細胞内の発 現、核、細胞質の局在検索をゲノムのシークェンス、 mRNAのシークェンスの異常の 検索と平行して継続することにより、種々の腫瘍の悪性度だけでなぐ予想される mR NAの Alternative splicingの遺伝子レベルの異常を容易に検出できるようになる。 本発明は以上の成果に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。 即ち本発明は、生体から分離された被検癌細胞内の ATBF1量を検出するステップを 含んでなる、被検癌細胞の悪性度判定法である。
本発明の一形態では、 ATBF1量として、以下の (1)〜(3)からなる群より選択される一 又は二以上が検出される。
(l)ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量、（2)ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域の核内存在量及び Z又は細 胞質内存在量、（3)ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域の核内存在量及び Z 又は細胞質内存在量。
本発明の好ま 、一形態では少なくとも (1)が検出される。本発明のさらに好ま Uヽ 一形態では上記 (1)〜(3)が検出される。
本発明の方法では、検出法として免疫組織ィ匕学的染色法が好適に利用される。 本発明は他の局面として、本発明の方法に利用可能な試薬 (被検癌細胞の悪性度 判定用試薬)及びキット (被検癌細胞の悪性度判定用キット)を提供する。本発明の 試薬は抗 ATBF1抗体からなる。抗 ATBF1として、（l)ATBFl遺伝子のェクソン 10に対 応する領域を認識する抗体、（2)ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域を認識 する抗体、又は (3)ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域を認識する抗体を用い ることがでさる。
本発明のキットは以下の (1)〜(3)からなる群より選択される一以上の抗体を含む。 (l)ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域を認識する抗体、（2)ATBF1遺伝子 のェクソン 11に対応する領域を認識する抗体、及び (3)ATBF1遺伝子のェクソン 3〖こ 対応する領域を認識する抗体。
好ましい形態では、本発明のキットは付カ卩的に ATBF1を含む。また、タグ又はキヤリ ァタンパク質との融合タンパク質である抗原を用いて作製された抗体をキットに使用 する場合には、付カロ的にタグ又はキャリアタンパク質を更に含めてキットとしてもよい。 発明の効果
[0018] 本発明によれば、被検癌細胞の悪性度を簡便に判定することができる。本発明の 悪性度判定法は様々な種類の癌において、増殖速度、浸潤傾向、易転移性という指 標で表現される癌の増殖能の予測に利用され得る。さらに本発明の判定結果は例え ば化学療法又は放射線療法の有効性を予測することにも利用され得る。このよう〖こ 癌の悪性度を決定するのに重要な因子である 2項目、（1)癌の増殖能および（2)各 種治療の有効性を予測、判定する事により、本発明は、治療法の選択における有用 な情報を提供することとなる。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1は、 ATBF1と p21及び p53との関連を模式的に示す図である。 DNA傷害が起 こることにより細胞周期が止まる機構を概説してある。
[図 2]図 2は P19細胞における ATBF1発現と、フローサイトメトリーによる検索を示す。 上段はいずれも DAPI (核 DNAの染色）， ATBF1, j8 -tubulinの 3重染色像を示す。図 2aはレチノイン酸 (RA)を作用させてない P19細胞である。 ATBF1、 j8 -tubulinともに発 現を認めない。図 2bはレチノイン酸 (RA)の作用後 24時間の P19細胞であり、 β -tubul inは陰性だ力 細胞質に ATBF1が染色される。図 2cはレチノイン酸 (RA)作用を中止 し、さらに 4日間培養を続けた P19細胞である。核に ATBF1の染色性が集中し、細胞 質からは細胞群の周辺には、 j8 -tubulin陽性の神経突起が伸びてくる。図 2d、 2e、 及び 2fはそれぞれ図 2a、 2b、及び 2cに示した P19細胞のフローサイトメトリーによる解 析である。図 2fにのみ細胞周期の停止を認める。
[図 3]図 3aは ATBF1における核内保留シグナルのコンピュータ解析による潜在的な 位置を示す。共通配列に類似の配列の存在が 2箇所 (それぞれ、アミノ酸 277番、及 び 2987番カも始まる）に予想される。図 3bは同じく ATBF1における核外輸出シグナ ルの潜在的位置を示す。核外輸出シグナルの存在が三箇所 (それぞれ、アミノ酸 12 67番、 2471番、 2504番カら始まる）に予想される。
[図 4]レチノイン酸処理後、培養皿にフイブロネクチンと、ポリ L オル二チンを塗布 した場合と塗布しない場合の、 P19細胞における ATBF1の発現部位を示す。図 4aは 塗布しない場合の P19細胞の ATBF1発現を示す。細胞は浮遊状態にあり、 ATBF1は 細胞質には出現する力 核へ移行しない。図 4bは培養皿にフイブロネクチンと、ポリ — L—オル二チンを塗布後培養 3時間の P19細胞の ATBF1発現である。 ATBF1の核 への移行が観察される。図 4cは 24時間後の状態を示し、核の ATBF1発現は明らか に増強する。
[図 5]図 5は P19培養細胞における ATBF1の核移行に対する、 Leptomycin Bの影響を 示す。図 5aは LeptomycinBを作用させな!/、場合の P19細胞での ATBF1の発現状態で ある。核での ATBF1の存在を認める。図 5bは LeptomysinBを作用させた時の、 P19細 胞における ATBFの発現状態である。 ATBF1の核内濃度が増大した事が明らかであ る。
[図 6]図 6は P19細胞における ATBF1の核への移行に関し、 PI3Kファミリータンパク質 の拮抗剤 3種 (Wortmannin, LY294002,カフヱイン）を作用させた場合の影響を調べる ための実験の結果である。図 6aは P19細胞の核での ATBF1発現を示す。図 6bは Wor tmanninの作用により ATBF1が核内に移行が阻害され、 ATBF1が細胞質中心に存在 する事を示す。図 6cは LY294002の作用により部分的に ATBF1の核への移行が阻害 される事を示す。しかしその阻害効果は Wortmanninより小さい事が解る。図 6dはカフ ェインの作用を示す。 Wortmannin, LY294002に比較してより完全に ATBFlの核への 移行が阻害された事が解る。
[図 7]図 7はマウス神経芽腫由来細胞株 Neuro2A細胞へ完全長の ATBFl cDNAを強 制発現させた共焦点レーザ顕微鏡写真の所見を示して 、る。細胞を固定観察する 直前の 1時間だけ培養液に BrdUを添加して DNA合成細胞を標識した。 BrdU取込み 細胞を緑の蛍光を発する二次抗体で検出すると同時に強制発現ベクターに付加さ れている HAタグを赤の蛍光を発する二次抗体で検出した。図 7aの矢印で示されるよ うに BrdU陽性細胞の緑色力 HAタグの赤色と重なり、黄色の発色をしている細胞群 が検出された。一方図 7bの矢印の頭で示されるように HAタグ付きの ATBF1導入細胞 群はすべて赤色を呈し、 BrdU陽性細胞の緑色と重ならないことを示している。この実 験結果は ATBFlcDNAの強制発現によって細胞周期が完全に抑制されることを示し ている。これらの事実は図 7cの棒グラフとしてまとめられる。図 7cには ATBF1のない H Aタグだけの導入実験結果で、斜線部分に示されるように、約 40%の BrdU陽性細胞 が HAタグと二重陽性となり黄色を呈したことを示して ヽる。一方 ATBF1の cDNAを含 む HAタグの遺伝子導入細胞は、すべて赤色を呈し BrdU陰性であることが示されて ヽ る。これらの遺伝子導入実験の結果に加え、さらに FACScanを使ってそれぞれの細 胞群の細胞周期を検定した。図 7dに示した HAタグだけ入った遺伝子導入群の細胞 周期に比較して、図 7eに示した ATBF1 cDNAの遺伝子導入群の細胞周期は Ml領 域、即ち G1/G0期の細胞群が 10%以上増加していることから、 DNA導入効率と合わ せて考えると ATBF1の強制発現によってほぼ完全に細胞周期が G1/G0期に停止さ れることが明ら力となった。
[図 8]図 8は胎仔期 14日目のラット脳の峡部 (isthmus)の組織所見を示す。図 8aは Br dU染色像である。傍脳室領域 (実線)および分化領域 (点線)の位置で BrdUの発現 が明らかに異なる。傍脳組織領域では BrdU陽性細胞が多数存在し、分化領域では 大部分で BrdU陰性となる。図 8bは ATBF1染色像である。傍脳室領域 (実線)では AT BF1は細胞質にも局在を認めるのに比較して、分ィ匕領域 (点線)では核主体に ATBF 1が局在する。その部位を拡大したものを図 8c, 8dに示す。図 8cの黒矢印で示すごと く DABの反応物（黒色）が核主体に存在する。図 8eは蛍光染色像（白色が陽性)であ り、 ATBF1が白矢印で示すごとく核主体に存在する事が明らかである。図 8dの黒矢 印で示すごとぐ DABの反応物（黒色）は細胞質にも局在する。図 8fの蛍光染色像（ 白色が陽性)では ATBF1は細胞質に存在する事が明瞭で、白矢印で示すごとく核は 黒色調で抜けており発現を認めな 、。
[図 9]図 9は膀胱の尿路上皮癌のうち非浸潤癌、浸潤癌症例それぞれに行った抗原 賦活法による染色性の差異を示したものである。各種バッファーを使用しオートタレ ーブ処理を行い、 ATBF1染色を施行した。黒丸（參）は核主体の染色結果が得られ た事を示す。白丸 (〇）は細胞質主体の染色結果が得られた事を示す。
圆 10]図 10は膀胱の尿路上皮癌のうち非浸潤癌、浸潤癌症例それぞれに行った抗 原賦活法による染色性の差異を示したものである。各種バッファーを使用し電子レン ジ処理を行い、 ATBF1染色を施行した。黒丸（參）は核主体の染色結果が得られた 事を示す。白丸 (〇）は細胞質主体の染色結果が得られた事を示す。
[図 11]図 11は膀胱の尿路上皮癌のうち非浸潤癌、浸潤癌症例それぞれに行った抗 原賦活法による染色性の差異を示したものである。各種バッファーを使用し圧力釜処 理を行い、 ATBF1染色を施行した。黒丸（參）は核主体の染色結果が得られた事を 示す。白丸 (〇）は細胞質主体の染色結果が得られた事を示す。
圆 12]図 12は膀胱の尿路上皮癌のうち非浸潤癌、浸潤癌症例それぞれに行った抗 原賦活法選択による染色性の差異の代表例を提示したものである。上段（図 12a, c, e)は非浸潤癌、下段は（図 12b, d, f)は浸潤癌例を示す。左（図 12a, b)は 50mMトリ ス塩酸バッファー ρΗΙΟ.Οを使用し、オートクレーブ処理を行った症例を示す。非浸潤 癌 (図 12a)、浸潤癌 (図 12b)ともに核での ATBF1染色性を認める。中（図 12c, d)は D AKO TRS pH6.0を使用し電子レンジ処理を行った症例を示す。非浸潤癌 (図 12c)、 浸潤癌（図 12d)ともに矢印に示した細胞のごとく核周囲の細胞質主体の染色性を認 める。右（図 12e, f)は 10mMクェン酸バッファー pH6.0を使用し圧力釜処理を行った 症例を示す。非浸潤癌 (図 12e)では ATBF1が核に、浸潤癌（図 12f)では ATBF1が矢 印で示すごとく核周囲の細胞質主体に局在を示し、核と細胞質主体の局在の差を際 立たせる事が可能となる事を示して 、る。
[図 13]図 13は乳癌症例の切除例、生検例における ATBF1染色結果を示す。図 13a ( HE染色)， b(ATBFl染色)は 53歳女性例で、乳頭腺管癌の乳管内に限局する部位を 示す。組織学的に乳腺内の部位（図 13a、矢印四角囲み）を ATBF1染色すると白矢 印で示すごとく細胞質に ATBF1が局在する細胞に混在して、黒矢印で示すごとく核 に染色性が限局する細胞の混在が明らかである（図 13b)。図 13c(HE染色)， d, e(AT BF1染色)は 66歳女性例で、乳頭腺管癌が乳管内に存在し中心部が壊死に陥り、い わゆる面疱癌の様式を取る（図 13c)。ATBFlは矢印で示すごとく乳管内面疱癌の大 部分で核を中心とする局在を示す (図 13d, e)。図 13 HE染色)， g(ATBFl染色)は 50 歳女性例で、乳腺内に限局して浸潤する乳頭腺管癌である（図 13f)。 ATBF1は殆ど 全ての細胞の細胞質に限局しており（図 13g)、矢印に示すごとく粗大顆粒状の染色 性を示す。図 13h(HE染色), i(ATBFl染色)は 73歳女性例で、乳腺組織からさらに周 囲の脂肪組織に浸潤を示す乳頭腺管癌である（図 13h)。矢印のごとく細胞質に局在 する ATBF1を認める（図 13i)。図 13gの染色性に比較して、 ATBF1の量は明らかに 少ない傾向を示す。図 13j(HE染色)， k(ATBFll染色)は 53歳女性例である。乳腺内 に腫瘍が個々、バラバラとなる浸潤を示す硬癌である（図 13j)。 ATBF1は部分的に 黒矢印のごとく細胞質に局在するが、白矢印のごとく癌細胞で ATBF1が欠落する部 位も観察される（図 13k)。
[図 14]図 14は、ヒト膀胱癌細胞株の HE染色像 (上段 a, d, g、左力 順に RT4、 T24、 Η T1376の染色像）、 ATBF1染色像（中段 b, e, h、左から順に RT4、 T24、 HT1376の染 色像）、及び Ρ53染色像（下段 c, f, i、左力も順に RT4、 T24、 HT1376の染色像)である 。 RT4では ATBF1は細胞質にも存在する力 黒矢印で示すごとく明らかに核に局在 を示す細胞が存在する（図 14b)。 p53も核に強い染色性を示す（図 14c)。 T24では A TBF1は黒矢印に示すごとく殆ど細胞質に限局し、染色性は粗大顆粒状である（図 1 4e)。 p53は核にごく薄い染色性を認める（図 14f)。 HT1376は ATBF1はごく少量、黒 矢印のごとく核に限局（図 14h)。p53は核に染色性を認める（図 14i)。
[図 15]図 15は、ヒト膀胱尿路上皮癌組織 (a乳頭状粘膜内癌 WHO Grade I低異型 度の症例、 b乳頭状粘膜内癌 WHOGrade 1(低異型度)、 WHO Grade II (中等度悪 性度)が混在する症例、 c粘膜下への浸潤癌 WHO Grade II中等度異型度の症例、 d 粘膜下への浸潤癌 WHOGrade III高異型度の症例）であり、 HE染色像（al, bl, cl, d 1)、および ATBF1染色像（a2, b2, c2, d2, d3)を示す。図 15aの乳頭状上皮内癌は、 核が小型で配列が整っており WHO Grade I (al)と判断できる。黒囲みの部位での A TBF1の発現は黒矢印のごとく核に限局する（a2)。図 15bの乳頭状上皮内癌は、核 が小型で配列が整った WHO Grade I (blの上方)および、それより核が大型で配列に やや乱れのある WHO Grade II(blの下方)の混在である。黒囲みの境界部位での AT BF1発現を検索すると、 Grade Iの部位では ATBF1が黒矢印のごとく核中心に局在し 、 Grade IIの部位では白矢印のごとく細胞質中心に局在する (b2)。図 15cの浸潤癌は 、上皮下の結合組織、脈管内に腫瘍が浸潤、進展を示し細胞の大小不同から WHO Grade IIと判断できる (cl)。黒囲みの結合組織に浸潤する細胞での ATBF1発現を見 ると黒矢印のごとく細胞質に粗大顆粒状の染色性を示す (c2)。図 15dは細胞が密に 配列し、非常に大型の核が混在する WHO Grade IIIの浸潤癌である (dl)。 2箇所の黒 囲みの浸潤部位で ATBF1の発現を検索すると、白矢印に示すごとく ATBF1が細胞 質に局在を示す部位 (d2)、黒矢印のごとく ATBF1の発現が核、細胞質とも非常に少 なく欠落する傾向がある部位 (d3)が混在する。
[図 16]図 16は胃の Group IIIと診断される腺腫における ATBF1の発現を示す。図 16a 1は立方状の好酸性細胞力もなる異型腺管の密な増殖を示す胃型腺腫あるいは異 型上皮巣である。 ATBF1は矢印で示すごとく核に局在を示し (a2), p53の核での発現 ( a3),p21の核での発現 (a4)が明らかである。図 16blは不整な腸型小腺管の集まる中 等度異型の腺腫ある 、は異型上皮巣である。 ATBF1は矢印で示すごとく核主体に局 在し (b2), p53, p21の発現も認める (b3,b4)。図 16clは腸型の腺管で、核が細長ぐ重 層傾向が高度となる高度異型あるいは境界領域の腺腫あるいは異型上皮巣である。 ATBF1は矢印で示すごとく細胞質に局在を示し (c2)、 p53の染色は認めるものの (c3) 、 p21発現が欠落する (c4)。
[図 17]図 17は胃で Group Vと診断される癌のうち、組織学的に高分ィ匕型あるいは中 分化型の管状腺癌での ATBF1発現を示す。図 17al (HE染色）は食道扁平上皮 (波 線矢印)の上皮下に浸潤性に発育する大小の腺管構造よりなる高分化型管状腺癌 である。部位により（四角黒枠) ATBF1が矢印で示すごとく細胞質に限局する部位 (a2 ,ATBF1染色）と、 ATBF1が欠落する部位（a3,ATBFl染色）が混在する。図 17bl (HE 染色）は大小の腺管が密に不規則癒合性に存在する中分ィ匕型の管状腺癌である。 A TBF1は大部分の細胞で矢印に示すごとく細胞質に局在を示す (b2,ATBFl染色)。
[図 18]図 18は胃で Group Vと診断される癌のうち、低分化腺癌での ATBF1発現を示 す。図 18al (HE染色）は充実性発育を示す腺癌を示し、 a2,a4 (HE染色）は四角囲み の部位の拡大である。充実性で腺管形成を欠く事が解る。 HE染色における組織像 は類似しているにもかかわらず、 ATBF1が欠落する部位 (a3, ATBF1染色）、および 矢印で示すごとく ATBF1が細胞質に限局する部位 (a5,ATBFl染色）が混在する。図 18bl(HE染色)は核/細胞質比の高い退形成性の癌細胞が個々バラバラに浸潤を示 す。 ATBF1は矢印で示すごとく細胞質に限局する (b2, ATBF1染色)。
[図 19]図 19は胃で Group Vと診断される癌のうち、印環細胞癌での胃での浸潤部（ 図 19a)および胆嚢への転移浸潤部 (図 19b)での ATBF1発現を示す。図 19al (HE染 色)は粘液滴により核が周辺に押しやられた印環細胞の浸潤を示す。 ATBF1は黒矢 印で示すごとく印環細胞の細胞質に限局する場合と、点線矢印で示すごとく染色性 が欠落する場合があり、それらの細胞の混合で浸潤部が形成される。図 19bl (HE染 色)は胆嚢壁のリンパ管内 (左上部の四角囲い）および結合組織内に浸潤を示す (右 下部の四角囲い）印環細胞が存在する。 ATBF1はリンパ管内 (b2, ATBF1染色)およ び浸潤部 (b3,ATBFl染色)ともに欠落する。
[図 20]図 20は陰茎に生じた乳房外パジェット病の各種悪性度段階での ATBF1発現 を示したものである。図 20a (HE染色)は陰茎皮膚に表皮内にパジェット細胞が存在 する（aの左側の部位）と、徐々に浸潤し、腫瘤形成を来した部位 (aの右側の部）を示 す。図 20bl(HE染色)では表皮内に限局して存在するパジェット細胞の散在を示し、 その部位では ATBF1は核中心に局在する（b2, ATBFl染色）。図 20cl(HE染色)は表 皮から下方に浸潤傾向が出てきた部位を示す。その部で ATBF1が矢印で示すごとく 細胞質に限局する (c2, ATBFl染色)。腫瘤形成部（a,HE染色)での ATBFl発現は腫 瘍表面主体で (d, ATBFl染色の矢印で示す部位）、腫瘍の内深部で欠落する傾向 を認める。図 20elと fl (ともに HE染色)ではともに索状の腫瘍が浸潤を示す。図 20e2( ATBFl染色)で矢印に示すごとくの腫瘤表面では高度に ATBFlが細胞質に局在して おり、図 2012(ATBF1染色)で矢印で示すごとく腫瘤内深部では ATBF1が欠落する。 図 20gl(HE染色)は鼠径部リンパ節で、リンパ組織内およびリンパ管（点線矢印）内に 腫瘍の転移を認める。図 20g2(ATBFl染色)ではリンパ管内（点線矢印）内に存在す るパジェット細胞では矢印で示すごとく ATBF1が欠落する事を示す。
[図 21]図 21は骨髄における ATBF1の発現を示す。図 12aは HE染色による骨髄の組 織像で、軽度過形成性となる骨髄細胞で、図では明確でないが白血球系、赤血球系 、血小板系 3種類の造血細胞が混在する。図 21b (ATBFl染色）では骨髄の一部の 細胞群で、 ATBF1が陽性となることを示している。その一部の拡大を図 21c(ATBFl 染色)に示す力 波線矢印に示す細胞質主体に ATBFlの局在を認める細胞とともに 、矢印で示すごとく核にも細胞質にも ATBF1の染色性が強い細胞群が存在する事が 明らかである。
[図 22]図 22は、小型末梢型肺腫瘍組織における組織像及び ATBF1発現を示す。図 22al (ATBFl染色）は矢印で示すごとく肺内に存在する直径 lcm程度の腫瘤形成で ある。図 22a2(ATBFl染色)はその拡大像で、肺胞上皮を置換するように腫瘍細胞が 増殖し、間質の結合組織が増生している事が解る。腫瘍細胞は扁平な傾向があり規 則正しく配列を示し、核腫大も軽度に留まるため、低グレードの異型腺腫様過形成 (1 ow-grade AAH)と診断できる。さらに拡大を上げると、図 22a3(ATBFl染色)で示すご とぐ腫瘍細胞の核に ATBF1の存在を認める。図 22bl(HE染色)は矢印で示すごとく 肺の細気管支周囲に存在する直径 0.7cm程度の腫瘤形成である。図 22b2(HE染色） はその拡大で、肺胞上皮を置換するように存在する腫瘍細胞の存在、間質の増生、 リンパ球浸潤、腫瘍細胞の大小不同、図 22aの low-grade AAHより細胞密度が高ぐ 細胞の丈が高い事が明らかであり、高グレードの異型腺腫様過形成 (high-grade AA H)と診断できる。図 22b3,b4(ATBFl染色、矢印)は殆どの腫瘍細胞の核主体に ATBF 1が局在する事を示す。図 22cl(HE染色)は矢印で示す範囲に存在する直径約 1.8 c m大の腫瘤形成で、波線矢印で示すように肺胞が虚脱し線維増生を示す部位が混 在する。図 22c2(HE染色)はその拡大で、図 22b2の組織像と類似するが、やや細胞 密度が高ぐ核腫大の目立つ細胞が混在する。図 22c3(HE染色)に示すごとく肺胞虚 脱、線維化を伴う部での腫瘍は細胞密に配列しており、図 22c2は AAHとの鑑別も問 題となるが、図 22c2と総合的に判断して、細気管支肺胞上皮癌 (BAC)、野口の type Bと判断できる。肺胞上皮を置換するように腫瘍細胞が配列する部位では図 22c4(AT BF1染色)の白矢印のごとぐ部分的に核に染色が存在する部位が混在するものの大 部分、黒矢印に示すごとぐ ATBF1は細胞質に染色性を認める。さらに図 22c5(ATB F1染色)は肺胞虚脱、線維化を示す部位で ATBF1は矢印で示すごとく殆どの細胞で 細胞質に局在する事が明らかである。
圆 23]図 23は異型腺腫様過形成 (al, HE染色)および限局型の細気管支肺胞上皮 癌 (bl, HE染色)での ATBF1の発現を示す。異型腺腫様過形成では矢印で示す範囲 で ATBF1が核に強く局在する事で (a2, ATBF1染色)正常組織との境界が非常に明確 である。さらに肺胞上皮癌では矢印で示す範囲で ATBF1が細胞質に強く局在する事 で (b2, ATBF1染色)正常組織との境界が非常に明確である。
[図 24]図 24は化学療法が有効であった 1症例 (a, ATBF1染色)及び化学療法が無効 であった 3症例 (b, c, d, ATBF1染色)の肺腺癌組織におけるプレパラート肉眼像 (al- dl)ならびに顕微鏡観察された低倍 ATBF1染色像である。無効 3例のプレパラートは 肉眼的に DABの茶色が非常に薄いのに対し (b, c, d)、著効例 1例のプレパラートは 茶色で濃染している。肉眼像ではプレパラートの茶色の染色性が解りにくいが、低倍 の ATBF1染色を見ると、著効例では矢印に示すごとく ATBF1の染色性が濃い (a2)の が明らかである。
[図 25]図 25は、化学療法に著効を示した症例 (a, 65歳、男性)及び無効であった症 例 (b,65歳、女性)の治療前 (al, bl)、治療後 (a2, b2)の CT像、初発時の肺腺癌の組 織像 (a3, b3, HE染色)及び ATBF1発現部位 (a4,b4, ATBF1染色)を示す。著効例の C T像は気管気管支リンパ節の腫脹 (al,白矢印)及び消失 (a2,白矢印)を示す。腫瘍 は一部管腔を有する低分ィ匕腺癌 (a3)である。腫瘍細胞の ATBF1発現 (a4)は細胞質に 局在する部位（白矢印）、核に局在する部位 (黒矢印)が混在している。無効例の CT 像は左腎臓上極に転移性腫瘍 (bl,黒矢印)の存在、及び増大 (b2,白黒矢印)を示 す。組織学的に高分ィ匕の管状型腺癌 (b3)である。 ATBF1の発現は少量で、全てが 細胞質に限局し (b4,黒矢印）、核での局在は認めない。
[図 26]図 26は 74歳の男性の小細胞癌の組織像 (a, HE染色）および ATBFl(b-g,AT BF1染色)を示す。図 26aに示すごとく組織学的には、小型円形ないし短紡錘形細胞 が、少量の血管結合織を伴って密に充実性に増生する腫瘍である。核分裂像は多く 、増殖の速い腫瘍であることを示している。その配列は充実性、胞巣状を示す。図 26 bは ATBF1染色低倍で、腫瘍の ATBF1発現が他の種類の腫瘍細胞に比較して非常 に大量である事が解る。図 26c,dに示すごとく部位によっては核主体 (c)、細胞質主体 (d)の染色を示す部位が混在する。図 26eは核主体の染色部位で、白矢印に示すご とく核に強い ATBF1発現を認める。同時に核周囲の細胞質にも ATBF1は染色を示し 、腫瘍細胞が核、細胞質ともに染色される場合がある事が明らかである。図 26fは核（ 波線矢印）、細胞質 (矢印）が混在する部位、図 26gは細胞質 (矢印）主体の部位で ある。
[図 27]図 27は生存例 (a, b)、死亡例の (c, d)の神経芽細胞腫の組織像 (a, c, HE染色) および ATBF1の細胞内局在 (b, d, ATBF1染色)を示す。図 27aは生後 8ヶ月の女児 の左副腎腫瘍で糸且織学的に poorly differentiated neuroblastoma, low MKI、 favorabl e histology groupと診断した。 ATBF1は図 27bの矢印で示すごとぐ少数の細胞を除 く殆ど全ての細胞で核に限局した。それに対し、図 27cは 2歳男児、後腹膜リンパ節 の組織像で、脈管内に侵襲する腫瘍細胞を認め、組織学的には poorly differentiate d neuroblastomaゝ low MKI、 unfavorable histology groupと診断した 羊糸田に観察する と、 low MKIだが、 anaplasiaが目立ち、 mitosisも 10個/高倍率視野程度と多く認められ る）。 ATBF1は図 27dの矢印に示すごとぐ殆どの細胞で細胞質に限局する傾向を示 した。
[図 28]図 28は、 GIST組織 (a:胃原発 GIST、 b :結腸原発 GIST)について、左から順に HE染色像 (al, bl)、 c- kit染色像 (a2, b2)、 CD34染色像（a3, b3)、 ATBF1染色像 (a4, b4)を示す。生存例胃原発の GISTは図 28alの波線矢印で示す胃粘膜の下方に存在 する筋層内で腫瘍形成を認め（矢印）、比較的周囲との境界が明瞭である。図 28a2, a3の矢印に示すごとく腫瘍細胞の大部分は細胞質に c-kit, CD34が陽性となる。図 2 8a4の矢印に示すごとく腫瘍細胞の大部分で ATBF1が核に局在を示す。それに対し 死亡例で結腸原発の GISTは図 28blの波線矢印で示す結腸粘膜の下方の粘膜下 組織に浸潤性の発育を示しており、周囲組織との境界が生存例（図 28alを参照)より 不明瞭である。腫瘍細胞は c-kit陽性（図 28b2の矢印）だが、 CD34陰性である（図 28 b3の矢印に示す小血管のみが CD34陽性であることに注意）。 ATBF1は図 28b4の矢 印で示すごとく腫瘍細胞の大部分で細胞質に局在を示す。
[図 29]図 29は、各種の髄膜腫組織;線維性髄膜腫 WHO grade I (a)、髄膜皮性髄膜 腫 WHO grade I (b)、異型性髄膜腫 WHO grade II (c)、明細胞髄膜腫 WHO grade I 1(d)について、 HE染色像 (al, bl, cl, dl)、 ATBF1染色像（a2, b2, c2, d2)を示す。図 29alは細長 ヽ線維性の腫瘍細胞カゝらなる線維性髄膜腫で、矢印に示すごとく細長 い細胞の核のみに ATBF1は局在する（a2)。図 29blは一部 whorl formationを示す髄 膜皮性髄膜腫で、 ATBF1は腫瘍細胞の核のみに局在する (b2)。図 29clは一部脳浸 潤を示し、図 al, blの髄膜腫に比較して明らかに細胞密度の高い異型生髄膜腫で、 ATBF1は矢印に示すごとく腫瘍細胞の大部分で細胞質に局在する (c2)。図 29dlは 細胞質が明るく抜けたグリコーゲンに富む細胞が主体となる明細胞髄膜腫で、矢印 に示すごとく腫瘍細胞の大部分で、 ATBF1が細胞質に局在する (d2)。
圆 30]図 30全ての顕微鏡像は、 61歳、 66歳、 76歳男性症例の前立腺癌生検検体 に ATBFl染色を施したものである。組織学的に Gleason gradeの順に写真を配列し A TBF1染色性との比較検討を行った。図中の 3A-5Bの記載は Gleason gradeを示す。 腺管の大きさが不規則ながら癒合傾向を示さないものが Grade 3Aで、より小型の腺 管の混在力 ¾B、さらに腺管が癒合傾向を示すと 4A, hypernephroid patternを示すと 4 Bと判断した。癌細胞が充実性集塊を形成ないし、孤立性に浸潤傾向を示すと 5Bと 判断した。黒矢印は ATBF1が腫瘍細胞の核に局在する例を示し、波線矢印は ATBF 1が腫瘍細胞の細胞質に局在する例を示す。 Gleason grade 3Aでは ATBFlは核に、 g rade 5Bでは細胞質に局在しており、 grade 3Bから grade 4Bでは核、細胞質の局在を 示す腫瘍細胞が混在する。
[図 31]図 31は、 ATBF1の N末端部を認識する NT440, 1-12,中央部を認識する D1-1 20、 C末端を認識する AT6の部位の概略、 ATBF1遺伝子の各ェクソンと蛋白配列の 対応、免疫に使用したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 NT440, 1-12についてはヒ トとマウスにおける ATBF1の配列との差異を示した。
[図 32]図 32は、 71歳男性の正常リンパ節の組織所見である。図 32Aはリンパ濾胞ぉ よび辺縁領域を含む部位での Be卜 2の分布を示す。図 32B-1は同部位の AT6染色で 、図 32B-2はリンパ濾胞部位の拡大、図 32B-3は辺縁領域の拡大図である。辺縁領 域およびリンパ濾胞部を同時に含む部位に対する AT6以外の ATBF1染色を図 32C( NT440)、図 32D(1- 12)、図 32E(D1- 120)に示す。
[図 33]図 33は、 71歳男性の正常リンパ節の ATBF1の染色性のまとめを示す。図 33A は ATBF1-A蛋白における抗体の位置の概略。図 33B, Cはリンパ濾胞および辺縁領 域を含む部位での各抗体の染色強度、核と細胞質での局在比率、染色性から想定 される蛋白のプロッセシングの位置、さらに核主体の AT6部位の局在が be卜 2遺伝子 の転写を抑制、 AT6部位の局在が細胞質に変化すると be卜 2遺伝子転写の抑制がは ずれる状態を模式して示してある。
[図 34]図 34は、培養細胞 3種類（P19, NB1, GOTO)のレチノイン酸処理の有無によ る ATBF1蛋白の分子量の変化を検索したウェスタンブロッテングである。使用した抗 体はェクソン 10に対応する D1-120である。
[図 35]図 35は、 52歳男性、胃の GISTの組織像を示す。図 35A(c- kit),図 35B(CD34 ),図 35C(ATBF1の AT6部分)，図 35D(Bcト 2)の局在を示す。図 35C, Dの矢印は AT 6, Be卜 2の局在が相補的であることを図示しており、口囲み 1,口囲み 2の部位の ATB Fl,Bc卜 2の染色性の詳細を図 36で検索している。
[図 36]図 36は、 52歳男性、胃の GISTの組織像の詳細とまとめである。図 35の口囲 み l (Al-El) ,口囲み 2(B2-E2)の部位での染色性、 （A)NT440, (B)1-12,(C)D1-120, (D)AT6, (E)Bcl-2および、 Bd_2発現が欠落する部位 (F) , Bd_2発現を認める部位（ G)での ATBF1染色性のまとめを示す。
[図 37]図 37は、 56歳女性、大細胞びまん型 B細胞リンパ腫の組織像である。 HE (A1 弱拡大， A2強拡大）、 CD20 (B),AT6 (C1弱拡大， C2強拡大)， PCNA (D1弱拡大， D2強拡大)， Bcl-2 (El弱拡大， E2強拡大)の各染色性を示す。
[図 38]図 38は、 56歳女性、大細胞びまん型 B細胞リンパ腫の ATBF1および Be卜 2の 染色性の詳細とまとめである。 NT440 (A),l-12 (B), D1- 120 (C), AT6 (D), Bcl-2 (E) の染色像および、染色性のまとめ（F)を示す。
圆 39]図 39は 63歳男性、大脳の多形膠芽腫の組織像である。充実性の腫瘍部位（ Al, HE)と壊死の散在する部位（Bl, HE)における GFAPの局在 (A2, B2)を示す。 B1, B2の矢印は壊死組織の範囲を示す。
[図 40]図 40は 63歳男性、大脳の多形膠芽腫の GFAP, Dl-120, AT6の染色像であ る。 GFAPの欠落部位 (A,口囲み 1)、 GFAP陽性部位 (A,口囲み 2)での染色性の詳 細（al, a2)を示すとともに、その染色性のパターンの差異 (A矢印）が、 D1-120(B),AT 6(C)の染色性のパターンと類似 (B矢印、 C矢印）する事を示す。 GFAPの欠落部位 (A ,口囲み 1)では Dl-120(bl), AT6 (cl)染色性が核主体 (bl, cl矢印）となり、 GFAP陽 性部位 (A,口囲み 2)では Dl-120(b2), AT6(c2)染色性が細胞質主体 (b2, c2矢印)と なる。
[図 41]図 41は 63歳男性、大脳の多形膠芽腫の MIB1, Bcl-2, Be卜 xLの染色像である 。図 40での GFAPの欠落部位 (図 40A,口囲み 1)、 GFAP陽性部位（図 40A,口囲み 2 )での染色性のパターンと、 MIBKA), Bcl-2 (B), Bcl-xL (C)染色性のパターン (A, B, C矢印）が類似する事を示す。さらに GFAPの欠落部位 (A,口囲み 1)、 GFAP陽性部 位 (A,口囲み 2)における MIB1 (al, a2),Bcl-2 (bl, b2), Bcl-xL (cl, c2)の染色の詳 細が図示してある。
[図 42]図 42は 63歳男性、大脳の多形膠芽腫の NT440, 1-12の染色像および ATBF1 染色性のまとめである。図 40での GFAPの欠落部位 (図 40A,口囲み 1)、 GFAP陽性 部位（図 40A,口囲み 2)での NT440 (Al, A2)および 1-12 (Bl, B2)の染色性の詳細を 示す。本腫瘍における GFAP産生の無い部位の ATBF1染色性 (C)、 GFAP産生を示 す部位での ATBF1染色性 (D)のまとめを図示する。
[図 43]図 43は 52歳、男性、食道神経内分泌癌の HE、 NCAMの所見である。食道の 腫瘤形成像 (A, HE)、 NCAM (CD56)陽性像 (B)、リンパ管侵襲 (C, HE)、組織学的 に索状リボン状配列を示す部位 (D, HE,黒矢印）、および充実性配列を示す部位 (D , HE,白矢印）を図示する。
圆 44]図 44は 52歳、男性、食道内分泌癌の組織構築と ATBF1発現の比較を示す。 索状リボン状で高分化な配列を示す部位 (A1-E1)と密、巣状で低分化な配列を示す 部位 (A2-E2)の、 HE(A1, 2),NT440 (Bl, 2), 1-12 (CI, 2), Dl- 120 (Dl, 2), AT6 (El, 2)染色の結果とまとめ (F, G)を図示する。
圆 45]図 15は 56歳、男性、副鼻腔の未分化癌、リンパ節転移部位の所見である。腫 瘍の MIBl(A),Bc卜 2 (B)発現、 NT440 (C), 1-12 (D), D1- 120 (E), AT6 (F)発現とその 染色性のまとめ (G)を図示する。
[図 46]図 16は 47歳女性、脳の大細胞びまん型 B細胞リンパ腫の所見である。腫瘍の HE (Al, 2),CD20 (B), CD79a (C), Beト 2 (D), NT440 (E), 1-12 (F), Dl- 120 (G), AT 6 (H)の染色像と、 ATBF1染色性のまとめ (I)を図示する。
[図 47]図 17は非特許文献 1、 9に示された異なるプロモータ使用と、 Alternative splici ngにより、 ATBF1-A, B2種類の mRNAが出来る仕組みと、ヒト悪性腫瘍におけるエタ ソン 10の異常スキッピングによる変異蛋白産生の概略説明図である。 D1-120部位の 染色性の欠落を図 46で示した 47歳女性、脳の大細胞びまん型 Bリンパ腫を例に取り 図示する。
[図 48]図 48は 68歳女性、脳の大細胞びまん型 Bリンパ腫の所見である。図示したよ うに腫瘍の中心部 (A)と腫瘍の辺縁部 (B)での ATBF1発現、 Be卜 2染色性の差異を示 す。腫瘍での NT440 (ΑΙ,ΒΙ), 1-12 (Α2, Β2), Dl— 120 (A3, B3), AT6 (A4, B4), Bel- 2 (A5, B5)染色像を図示する。
[図 49]図 49は 68歳女性、脳の大細胞びまん型 Bリンパ腫の ATBF1発現所見のまとめ である。腫瘍の中心部 (A)、および腫瘍の辺縁部 (B)の染色性をまとめ、図示する。
[図 50]ATBF1の各ェクソン（ェクソン 2〜11)の配列を示す図である。下線部がェクソ ン領域である。各ェクソンの配列の右上にェクソン番号を付した。ェクソン番号は、 A TBF1遺伝子の 5'側最上流に存在する ATBF1-B特異的な非翻訳領域ェクソンを 1 番、それに続く ATBF1-A特異的な非翻訳領域ェクソンを 2番、最初の ATBF1-A翻訳 領域を含むェクソンを 3番とし、以下これに続くェクソンを順に 4〜： L 1番としている。
[図 51]図 50の続き。
[図 52]図 51の続き。
[図 53]図 52の続き。
発明を実施するための最良の形態
本発明にお 、て「被検癌細胞」とは、本発明の方法にぉ 、て悪性度を判定する対 象の細胞である。被検癌細胞は生体より分離される。即ち、生体より分離された状態 の被検癌細胞に対して本発明が適用される。「生体より分離された」とは、被検癌細 胞が存在する生体組織の一部を摘出することによって、被検癌細胞がその由来の生 体と完全に隔離されている状態をいう。被検癌細胞は通常、生体で存在していた状 態、即ち周囲の細胞と結合した状態で調製され、本発明の方法に使用される。尚、 被検癌細胞を周囲の細胞力も分離 (単離)した後に本発明の方法に使用してもよい。 本発明における被検癌細胞には、他の診断法によって癌であると判断される細胞、 癌である蓋然性が高!、と判断される細胞、及び癌である可能性を有する細胞が含ま れる。好ましくは、他の診断法によって癌であると判断される細胞、又は癌である蓋然 性が高いと判断される細胞が用いられる。ここでの他の診断法としては例えば、 X線 造影検査、内視鏡検査、超音波検査、 CT検査、 MRI検査、 PET検査、腫瘍マーカ 一を用いた診断法などが該当する。通常は、これらの一つ以上によって癌が疑われ る組織から被検癌細胞が採取される。
本発明において「癌」は広義に解釈することとし、癌腫及び肉腫を含む。また、本発 明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定 される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、 良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。
「ATBF1」とは、 AT motif binding factor 1 (ATモチーフ結合因子 1)をいう。 ATBF1 は、 AFP (アルファフエトプロテイン)調節因子の ATリッチドメインに結合し、 AFP遺伝 子の発現を下方調節する転写因子であることが知られている (非特許文献 1を参照） 。上記の通り「ATBF1」には 2つのアイソフォーム（ATBFl- A及び ATBFl- B)が存在す る。本明細書では用語「ATBF1」をこれら 2つのァイソフォームを包括する表現として 使用する。従って、特に言及しない限り、「ATBF1量」とは各ァイソフォームの存在量 の総和を意味する。本発明の方法では原則として当該総和を検出対象とする。但し、 いずれかのアイソフォームの量のみを検出対象にすることを妨げるものではない。尚 、単に「ATBF1」と記載した場合、その他の意味であることが明らかであるときを除い て、それは ATBF1タンパク質を意味する。
ATBF1遺伝子の構造を図 47に示す (非特許文献 1、非特許文献 9を参照)。また、 ATBF1遺伝子のェクソン 2〜： L 1の配列を図 50〜図 53に示す。 ATBF1遺伝子にはェ クソン 1〜： L 1が存在し、選択的スプライシングの結果として ATBF1-A及び ATBF1-B の mRNAが形成される。尚、図 47においてェクソン 10及び 11として示した領域は、非 特許文献 9ではそれぞれェクソン 9及び 10と記載されている。
ェクソン 3、ェクソン 10、及びェクソン 11に対応するアミノ酸配列及び塩基配列につ V、ては、添付の配列表に以下の配列番号で記載する。
ェクソン 3に対応する領域のアミノ酸配列（配列番号： 11)、ェクソン 3の塩基配列（ 配列番号： 12)、ェクソン 10に対応する領域のアミノ酸配列（配列番号： 13)、ェクソ ン 10の塩基配列（配列番号： 14)、ェクソン 11に対応する領域のアミノ酸配列（配列 番号： 15)、ェクソン 11の塩基配列（配列番号： 16)。
「被検癌細胞内の ATBF1量」とは、被検癌細胞の核内および細胞質における ATBF 1の存在量の総計をいう。本明細書において、「被検癌細胞内の ATBF1量」のことを「 被検癌細胞の細胞全体の ATBF1量」とも!/、う。一方「被検癌細胞の核内の ATBF1量 」とは、被検癌細胞の核内における ATBF1の存在量をいう。同様に、「被検癌細胞の 細胞質内の ATBF1量」とは、被検癌細胞の細胞質内における ATBF1の存在量をいう 「ATBF1量を検出する」とは、 ATBF1の存在量を絶対量として又は相対量として把 握することをいう。ここでの相対量の基準は例えば、悪性度に応じて用意した標準試 料の ATBF1量とすることができる。或いは核内の ATBF1量が検出対象のときに、細胞 質内の ATBF1量を基準とし、同様に細胞質内の ATBF1量が検出対象のときに核内 の ATBF1量を基準とすることもできる。尚、「ATBF1量を検出する」は、 ATBF1が存在 するか否かを調べることも含む。通常は、 ATBF1の存否及び、存在する場合にはそ の量が調べられることになる。厳密に ATBF1量を定量することは必須でなぐ例えば、 悪性度の指標となる対照の ATBF1量と比較することによって、被検癌細胞の悪性度 を判定することが可能な程度に ATBF1量を測定できればよい。
本発明の第 1の局面は、被検癌細胞の悪性度を判定する方法 (悪性度判定法）に 関する。
本発明にお ヽて「悪性度判定法」とは、被検癌細胞の悪性度を判定する方法を ヽぅ 。癌の悪性度は一般に細胞異型、細胞、組織構築の異形性、増殖性、浸潤性、転移 性などを基準に分類 (判定)される。一般に悪性度が低 、癌では細胞の増殖速度が 遅ぐ浸潤転移を来し難いため外科的切除が容易である場合と、化学療法や放射線 療法が有効であるが故に腫瘍を容易に縮小させ得る場合が考えられ、これらが組み 合わさって予後が良好となる。これに対して悪性度が高 、癌では細胞の増殖速度が 早ぐ浸潤転移を来し易いため外科的切除が困難となりやすい場合と、化学療法や 放射線療法が無効であるが故に腫瘍を縮小させるのが困難な場合が考えられ、これ らが組み合わさって予後が不良となる。悪性度が特に高い癌の場合には迅速、的確 な外科的摘出が望まれるし、的確な補助治療 (放射線療法又は化学療法)を含む集 学的治療が必須となる。本発明では、癌の増殖速度に起因する浸潤、転移の容易さ 、すなわち癌の増殖能の予測、および化学療法又は放射線療法による有効な治療 効果が得られる力否かの予測をもって、悪性度判定の基準とすることができる。従つ て、増殖能が低く (細胞周期停止を来し易く）、化学療法又は放射線療法が有効と予 測される（DNAダメージによりアポトーシスが導入され易 、)癌の場合に悪性度が低 いということができ、逆に増殖能が高く (細胞周期停止を来し難く）、化学療法又は放 射線療法が無効と予測される（DNAダメージによってもアポトーシスが導入され難 ヽ） 癌の場合に悪性度が高いということができる。ここで、増殖能、化学療法又は放射線 療法の有効さという 2つの因子を考慮すべき理由および注意点に関して、肺の小細 胞癌 (燕麦細胞癌)を例にあげて説明することにする。一般的に肺の小細胞癌は高 度悪性とされ、予後が悪い事で有名な癌である。し力 希ながら症例によっては、早 期に化学療法を施行する事により完全治癒が可能な場合もある。本発明者らの検索 では、肺の小細胞癌は核にも細胞質にも強い ATBF1の発現を認めた (ェクソン 10に 対応する抗体を使用）。細胞質の染色性の強さから高い増殖能を予測すれば、早急 に浸潤、転移して進展するため外科治療が不可能な場合が多い事を意味し、それは 高度悪性と判断する事になる。しかし一方で、核の強い染色性より DNAダメージによ りアポトーシスを導入しやすい事を予測すると、化学療法に反応し易ぐ時に癌細胞 を完全に死滅させ得る可能性から、低悪性度の癌と判断する事にもなる。従って悪 性度を決める際には、癌の増殖能、化学療法又は放射線療法の有効さの 2つの因 子を常に考慮する必要があるのが現実であり、また実際的、実用的である。さらに悪 性度を考える時の注意点でもある。但し、以上の 2つの因子のいずれかを指標として 癌の悪性度を評価することもできる。
[0022] 本発明では、 a)被検癌細胞内の ATBF1量を検出するステップが実施される。その 結果得られた ATBF1検出量に基づ ヽて被検癌細胞の悪性度を判定する。後述の実 施例に示すように、例えば、細胞全体 (核及び細胞質の両方）において ATBF1量が 少な 、症例の悪性度は非常に高 、ものであるのに対し、 ATBF1の発現量が多 、場 合、予後が良好で、各種療法に反応しやすい事が多かった。従って、細胞全体の AT BF1量がまず悪性度の判定指標として有効である。後述する乳癌の検討のごとぐ免 疫組織学的染色を施さな 、場合には PCR法を使用した ATBF1 mRNAの定量と ヽぅ方 法によっても細胞全体の ATBF1量を定量可能である。本発明にお 、て被検細胞の 悪性度を判定する際に、まず第 1に被検癌細胞の核内及び細胞質内を含む細胞全 体の ATBF1量を考慮することが好まし 、。
[0023] 本発明の一形態では、 b)被検癌細胞の核内の ATBF1量を検出するステップが実施 される。その結果得られた ATBF1検出量に基づ ヽて被検癌細胞の悪性度を判定す る。具体的には例えば、核内に多量の ATBF1が検出された場合に、増殖能が低ぐ 化学療法又は放射線療法に感受性が高いと予測され、一般的には被検癌細胞の悪 性度は低いと判定できる。し力 前述の肺小細胞癌のごとぐ核にも細胞質にも同時 に ATBF1発現を示す場合は、増殖能、化学療法又は放射線療法の感受性を個別に 判断しつつ、総合的に悪性度を決定することが望まれる。
[0024] 本発明の一形態では、 c)被検癌細胞の細胞質内の ATBF1量を検出するステップが 実施される。この形態では、被検細胞の細胞質中に存在する ATBF1量の有無に基 づいて被検癌細胞の悪性度が判定される。具体的には例えば、細胞質内に多量の ATBF1が検出された場合に、被検癌細胞の増殖能が維持されていると判定すること ができる。また細胞質内に ATBF1が検出されない場合又は検出量が少ない場合にも 、核での ATBF1発現が無いという条件下では、被検癌細胞の増殖能は維持されてい ると判定できる。ここでも最終的には核での発現状態を考慮した総合判定が好ましい
[0025] 本発明の好適な一形態では、 a)被検癌細胞内の ATBF1量を検出するステップ、 b) 被検癌細胞の核内の ATBF1量を検出するステップ、さらに c)被検癌細胞の細胞質内 の ATBF1量を検出するステップを実施した後、 d)ステップ bで得られた核内 ATBF1量 と、ステップ cで得られた細胞質内 ATBF1量とを比較するステップを実施する。この形 態では ATBF1量力 被検細胞の核内と細胞質内との間で比較される。そして主に AT BF1の局在状態に基づいて被検細胞の悪性度が判定される。このように核内と細胞 質内の ATBF1量を比較するようにすれば、より正確に悪性度を評価できる。後述の 実施例に示すように、増殖能が低い、あるいは化学療法又は放射線療法の感受性 が高いとされ、悪性度が低いと予測、判断できる癌細胞では ATBF1が核に局在する 傾向がある事が判明した。一方、 ATBF1が細胞質に限局している場合 (即ち、相対 的に核内の ATBF1量が少ない場合）には、組織学的に癌の上皮下浸潤など進展性 が強くなるとともに、化学療法又は放射線療法の感受性が低くなる傾向を示し、より 悪性度が高くなることが判った。さらに高度悪性とされる種類の癌の検索や、一般の 癌でもその転移巣での検索などを通して、 ATBF1が核にも細胞質にも欠落するように なると、より悪性度の高くなる傾向が明確となった。 本発明の方法では、典型的には、悪性度が順に高くなる複数の区分のいずれに被 検癌細胞が分類されるかを判定する。ここでの区分の数は特に限定されない。例え ば 3区分 (具体的には例えば悪性度 1 (低い）： ATBF1が核に局在する傾向、悪性度 2 (中程度）： ATBF1が細胞質に局在する傾向、悪性度 3 (高い）： ATBF1が核細胞質 ともに欠落する傾向とする。あるいは悪性度 4区分 (具体的には例えば悪性度 1 (低 い: ATBF1が核に高度に局在する傾向、悪性度 2 (中程度）： ATBF1が核に軽度から 中等度局在する傾向、悪性度 3 (高い）： ATBF1が細胞質に限局し、核での発現が少 ない傾向、悪性度 4 (非常に高い）： ATBF1が核にも細胞質にも欠落する傾向とする） などを設けることが可能である。なお前述した化学療法前の肺小細胞癌のごとく核' 細胞質ともに高度の ATBF1発現を示し、増殖能も高度だが化学療法の感受性も高 い癌を上記悪性度 1〜3、あるいは 1〜4のどの範疇に属する悪性度と捉えるかにつ いては一律には判断が難しいと予想される。このような場合には、増殖能、化学療法 又は放射線療法の感受性という悪性度の指標 2つを個別に考慮するとよい。
本発明が対象とする癌の種類は特に限定されない。例えば、乳癌、膀胱癌、胃癌、 肺癌、神経芽細胞腫、消化管間質腫瘍 (GIST)、前立腺癌、髄膜腫などを含む各種 の腫瘍の悪性度を判定することに本発明を適用することができる。
後述の実施例に示すように、本発明者らの検討によって様々な種類の癌において 、その悪性度と細胞内 ATBF1発現量との間に関連性が存在することが明ら力となつ た。また、癌の悪性度と癌細胞の核内及び細胞質内の ATBF1量 (ATBF1の核 ·細胞 質局在)との間にも関連性が認められた。以下、ヒト各種癌 (腫瘍）についての検討結 果の概略を示す (例 1〜例 12)。
例 1) ATBF1 mRNA発現を指標としたヒト乳癌症例 153例の検討で、 ATBF1 mRNA の発現量の多 、症例群は、発現量が低下または欠落して 、る症例群より予後が良好 であることが判明した。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑乳癌細胞を被 検癌細胞としてその細胞内 ATBF1量を測定した結果、発現量が多 、場合に悪性度 が低い (または、被検癌細胞が由来する対象の予後が良好である）と判定することが できる。これとは逆に、被検癌細胞内の ATBF1量が少ない場合に悪性度が高い（ま たは、被検癌細胞が由来する対象の予後が不良である）と判定することができる。 例 2) 癌抑制遺伝子 p21, p53の変異および抗ガン剤シスブラチンの効果がすでに 確認されている膀胱癌培養細胞（Int J Cancer. 1996 Nov 15;68(4):501- 5)において、 抗ガン剤で腫瘍のアポトーシスを誘導できる細胞株では ATBF1が核に存在した。こ れに対して抗ガン剤が効果を示さな 、細胞株では ATBF1発現量が少な 、か、発現 総量は多くても細胞質に局在し、核での染色性が認められな力つた。これらの結果か ら、本発明の方法では例えば、被疑膀胱癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内 ATB F1量を測定した結果、発現量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。 または、被検癌細胞にぉ 、て ATBF1が核に局在して ヽる場合に悪性度が低!ヽと判 定することができる。一方、被検癌細胞内の ATBF1量が少ない場合に悪性度が高い と判定することができる。または、被検癌細胞において ATBF1量が細胞質に局在して V、る場合に悪性度が高 、と判定することができる。
例 3) ヒトの膀胱癌の臨床例、乳頭状尿路上皮癌では ATBF1が核に局在する傾向 を示した力 上皮下への浸潤癌は ATBF1が細胞質に局在する傾向を示した。この結 果から、本発明の方法では例えば、被疑乳頭状尿路上皮癌細胞又は被疑浸潤性膀 胱癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内における ATBF1の存在状態を調べた結果 、 ATBF1が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被 検癌細胞にぉ 、て ATBF1が細胞質に局在して 、る場合に悪性度が高 、と判定する ことができる。
例 4) 胃における一連の腺腫から癌腫のシリーズ (生検診断、 Group III〜V)の検 索で、 Group
IIIの腺腫、軽度異型、中等度異型では ATBF1が核に局在した力 Group IIIの腺腫、 高度異型では ATBF1が細胞質に局在した。 Group Vの癌腫では、 ATBF1が細胞質 に存在する場合と欠落する場合を認めた。高悪性度とされる AFP産生胃癌では既報 (非特許文献 2、 5、 7)のごとく ATBF1は欠落した。また胃原発の印環細胞癌の症例 では ATBF1欠落する癌細胞と ATBF1が細胞質のみに局在する癌細胞が混在した。 さらに胃原発の印環細胞癌が胆嚢へ転移し浸潤性となった部位の観察で、印環細 胞癌細胞で ATBF1が完全に欠落していた症例を見出した。この例では、転移能のよ り高い癌細胞がリンパ行性に転移し、浸潤を示したと判断出来、 ATBF1の欠落が悪 性度をより高める可能性をも指摘できた。これらの結果から、本発明の方法では例え ば、被疑腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内 ATBF1量を測定した結果、 ATBF 1量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検癌細胞におい て ATBF1が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被 検癌細胞の細胞内 ATBF1量が少ない場合に悪性度が高いと判定することができる。 または、被検癌細胞において ATBF1が細胞質に局在している場合にも悪性度が高 いと判定することができる。
例 5) 肺腺癌で、化学療法に反応を示し腫瘍が縮小した例では細胞全体の ATBF 1発現量が多ぐ核、細胞質ともに発現を認めたが、治療に反応しない症例では、 AT BF1の発現自体が少量で、細胞質のみに限局した。この結果から、本発明の方法で は例えば、被疑肺腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内 ATBF1量を測定した結 果、 ATBF1量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検癌細 胞にお 、て ATBF1が核にも存在して 、る場合若しくは核に局在して 、る場合に悪性 度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞の細胞内 ATBF1量が少ない場 合に悪性度が高いと判定することができる。または、被検癌細胞において ATBF1が 細胞質に限局している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例 6) 肺腺癌の前癌病変とされる異型腺腫様過形成では ATBF1が細胞質だけで なぐ核にも存在した。それに対し、腺癌と判定できる場合は、大部分は核の染色性 が無ぐ細胞質に ATBF1が限局する傾向があった。この結果から、本発明の方法で は例えば、被疑肺腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内における ATBF1の存在 状態を調べた結果、 ATBF1が核にも存在している場合に悪性度が低いと判定するこ とができる。一方、被検癌細胞において ATBF1が細胞質に限局している場合に悪性 度が高 、と判定することができる。
例 7) 正常の脊髄の造血細胞は核'細胞質ともに高度の ATBF1発現を示した。こ の事実は骨髄造血細胞が増殖分裂の盛んな細胞群であることと、各種癌治療の際、 正常細胞の中では造血機能を有する骨髄細胞が最も影響を受けやす!、細胞群であ る事 (骨髄抑制と称する。 DNAダメージでアポトーシスに陥りやす 、）の裏付けとなる 例 8) 骨髄造血細胞同様に、肺の小細胞癌 (燕麦細胞癌)でも核，細胞質ともに非 常に大量の ATBF1が存在しており、これもやはり、小細胞癌の増殖の速さと化学療法 への反応しやすさの裏付けとなる。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑肺 小細胞癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内における ATBF1の存在状態を調べた 結果、 ATBF1が細胞質に局在している場合に悪性度が高いと判定することができる。 一方、被検癌細胞にぉ 、て ATBF1量が核に局在して ヽる場合に悪性度が低!ヽと判 定することができる。
例 9) 高分ィ匕前立腺癌では ATBF1が核に限局、中分化、低分化となると ATBF1が 細胞質に限局あるいは発現が欠落する傾向を認めた。この結果から、本発明の方法 では例えば、被疑前立腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内 ATBF1量を測定し た結果、 ATBF1量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検 癌細胞にぉ 、て ATBF1が核に限局して 、る場合に悪性度が低!、と判定することがで きる。一方、被検癌細胞の細胞内 ATBF1量が少ない場合 (特に ATBF1の発現を認め ない場合）に悪性度が高いと判定することができる。または、被検癌細胞において AT BF1が細胞質に限局している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例 10) 新生児、幼児の副腎腫瘍の中で、死亡例もあるが自然消退もある神経芽 細胞腫が知られる。その予後予測は、医師にとっても、児の両親にとっても重要な問 題である。結果として良性であり、最終的に生存し得た症例の殆どの腫瘍細胞で AT BF1は核に局在した。逆に最終的に生存し得な力つた症例で、解剖の結果、腫瘍が 浸潤、転移、脈管侵襲などを示し、腫瘍の悪性度自体に起因する腫瘍死が明らかで あった症例では、大部分の腫瘍細胞で ATBF1が細胞質に局在していた。これは生検 の段階で、腫瘍の進展、患者の予後を予測できる可能性を意味している。これらの結 果から、本発明の方法では例えば、被疑神経芽腫細胞を被検癌細胞としてその細胞 内における ATBF1の存在状態を調べた結果、 ATBF1が核に局在している場合に悪 性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞において ATBF1が細胞質に 局在して 、る場合に悪性度が高 、と判定することができる。
例 11) 消化管間質腫瘍（GIST)は通常 ATBF1が核に限局するが、肝転移で死亡 し、高度悪性 GISTと診断された症例では ATBF1が細胞質に存在していた。この結果 から、本発明の方法では例えば、被疑 GIST細胞を被検癌細胞としてその細胞内に おける ATBF1の存在状態を調べた結果、 ATBF1が核に限局している場合に悪性度 が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞において ATBF1が細胞質にも存 在して 、る場合に悪性度が高 、と判定することができる。
例 12) 良性腫瘍に分類される髄膜腫 (WHO Grade I)の腫瘍細胞では、 ATBF1は 核に限局したが、悪性の経過を取りうるとされる異型髄膜腫 (WHO Grade Π)、明細 胞髄膜腫 (WHO Grade II)においては、 ATBF1は細胞質で発現を認めた。この結果 から、本発明の方法では例えば、被疑髄膜腫細胞を被検癌細胞としてその細胞内に おける ATBF1の存在状態を調べた結果、 ATBF1が核に限局している場合に悪性度 が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞において ATBF1が細胞質にも存 在して 、る場合に悪性度が高 、と判定することができる。
[0027] 本発明者らの検討によって、 ATBF1の特定の領域を検出することが被検癌細胞の 悪性度を判定する上で有効であることが判明した。この知見に基づき、本発明の好ま しい一形態では、生体力 分離された被検癌細胞内の ATBF1量として、以下の (1)〜 (3)の中の少なくとも一つが検出される。
(1) ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量。
(2) ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域 (C末端領域)の核内存在量及び Z 又は細胞質内存在量。
(3) ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域 (N末端領域)の核内存在量及び Z 又は細胞質内存在量。
[0028] (l)ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量の検出
この検出では、被検癌細胞において、 ATBF1遺伝子のェクソン 10に対応する領域 (部分タンパク質。以下、「ATBF1タンパク質の第 1領域」又は省略して「第 1領域」とも いう。当該領域のアミノ酸配列を配列番号： 13に、当該領域をコードする塩基配列を 配列番号： 14にそれぞれ示す)の核内存在量及び Z又は細胞質内存在量が検出対 象となる。後述の実施例に示すように、いくつかの被検癌細胞を用いて第 1領域の量 及び局在態様と悪性度との関係を検証した結果、一般に、（a)第 1領域が核主体に局 在していると悪性度が低いこと、（b)第 1領域が細胞質主体に局在していると悪性度が 高いこと、及び (c)第 1領域が欠落 (細胞質内、核内）していると悪性度が高いことを認 めた。即ち (a)〜(c)が、癌細胞の悪性度を判定するための好適且つ重要な指標にな ることが判明した。従って例えば、被検癌細胞の核内に多量の第 1領域が検出された とき (又は第 1領域が核主体に局在して 、たとき）、被検癌細胞の悪性度が低 、と判 定できる。同様に例えば、被検癌細胞の細胞質内に多量の第 1領域が検出されたと き (又は第 1領域が細胞質主体に局在して 、たとき）、被検癌細胞の悪性度が高 、と 判定できる。さらに例えば、被検癌細胞において第 1領域の欠落が認められたとき（ 又は存在量が微量であったとき）、被検癌細胞の悪性度が高いと判定できる。
ここで、被検癌細胞内における第 1領域の局在態様を指標として判定を行う場合は 通常、第 1領域の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出 結果を比較することで第 1領域の局在態様を調べ、第 1領域が細胞質主体に局在し ていたとき又は第 1領域の欠落が認められたとき、被検癌細胞の悪性度が高いと判 定する。このように核内での検出量と細胞質での検出量とを比較することによって、第 1領域の細胞内局在態様を明確に把握することが可能となる。尚、第 1領域の核内存 在量及び細胞質内存在量のいずれかの検出結果力 第 1領域の細胞内局在を予想 し判定することにしてもよい。この場合、いずれかの存在量のみを検出すればよいこ とになる。
(2)ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域 (ATBF1-Aタンパク質の C末端に位 置する）の核内存在量及び Z又は細胞質内存在量の検出
この検出では、被検癌細胞において、 ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域 (部分タンパク質。以下、「ATBF1タンパク質の第 2領域」又は省略して「第 2領域」とも いう。当該領域のアミノ酸配列を配列番号： 15に、当該領域をコードする塩基配列を 配列番号： 16にそれぞれ示す)の核内存在量及び Z又は細胞質内存在量が検出対 象となる。後述の実施例に示すように、いくつかの被検癌細胞を用いて第 2領域の量 及び局在態様と悪性度との関係を検証した結果、一般に、（a)第 2領域が核主体に局 在して!/、ると悪性度が低!、こと、及び (b)第 2領域が細胞質主体に局在して 、ると悪性 度が高いことを認めた。即ち (a)及び (b)が、癌細胞の悪性度を判定するための好適且 つ重要な指標になることが判明した。従って例えば、被検癌細胞の核内に多量の第 2領域が検出されたとき (又は第 2領域が核主体に局在していたとき）、被検癌細胞の 悪性度が低いと判定できる。同様に例えば、被検癌細胞の細胞質内に多量の第 2領 域が検出されたとき (又は第 2領域が細胞質主体に局在していたとき）、被検癌細胞 の悪性度が高 、と判定できる。
ここで、被検癌細胞内における第 2領域の局在態様を指標として判定を行う場合は 通常、第 2領域の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出 結果を比較することで第 2領域の局在態様を調べ、第 2領域が細胞質主体に局在し ていたとき、被検癌細胞の悪性度が高いと判定する。このように核内での検出量と細 胞質での検出量とを比較することによって、第 2領域の細胞内局在態様を明確に把 握することが可能となる。尚、第 2領域の核内存在量及び細胞質内存在量のいずれ かの検出結果力 第 2領域の細胞内局在を予想し判定することにしてもよい。この場 合、 、ずれかの存在量のみを検出すればよ!、こと〖こなる。
(3)ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域 (ATBF1-Aタンパク質の N末端に位 置する）の核内存在量及び Z又は細胞質内存在量の検出
この検出では、被検癌細胞において、 ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域（ 部分タンパク質。以下、「ATBF1タンパク質の第 3領域」又は省略して「第 3領域」とも いう。当該領域のアミノ酸配列を配列番号： 11に、当該領域をコードする塩基配列を 配列番号： 12にそれぞれ示す)の核内存在量及び Z又は細胞質内存在量が検出対 象となる。
後述の実施例に示すように、第 3領域 (NT440、 1-12が認識する部位)の検出は細 胞全体での ATBF1量が増加、減少したのか、あるいは欠落するかの指標になる。ま た、第 3領域における 148番セリンのリン酸ィ匕状態を検出することによって、第 3領域 の核移行の比率を知る事が可能である。さらにその存在、欠落、核細胞質の局在位 置を、 ATBF1タンパク質の中央領域 (即ち第 1領域)の局在状態などと比較する事で 、 ATBF1タンパク質のプロセッシングの状況、さらには mRNAレベルで起こる異常なス プライシングによるエタソンスキップの判定が可能である。以上のように、第 3領域の 検出は、癌の悪性度を判定する上で補助的ながらも有益な情報を与える。
[0031] 好ましくは上記 (1)〜(3)の二以上を検出し、各検出結果を考慮して被検癌細胞の悪 性度を判定する。このように二以上の検出を行えば、より詳細且つ正確な判定'評価 が行える。
検出項目の中に、上記 (1)、即ち第 1領域の検出を含めることが好ましい。（1)で検出 される第 1領域の存在量又は細胞内局在態様は癌の悪性度を最も特徴付けるものと いえる。従って、悪性度の判定において (1)の検出は特に重要度が高い。
[0032] 一層好ましい形態として、上記 (1)と (2)を検出する形態、上記 (1)と (3)を検出する形 態を挙げることができる。このように検出項目を増加させれば、より確度の高い判定を 行える。中でも上記 (1)〜(3)を検出し、各検出結果を用いて総合評価することが最も 好ましい。詳細な情報が得られ、より一層確度の高い判定を行えるからである。
[0033] ここで、上記 (1)と (2)を検出する形態 (第 1領域と第 2領域の検を検出する形態）にお ける具体的な判定基準の例を以下に示す。尚、悪性度 1が最も悪性度の低い区分で あり、数字が大きい区分ほどその悪性度が高いとする。
悪性度 第 1領域の存在量又は局在 第 2領域の存在量又は局在
4 欠落 (検出されず） 細胞質に局在
3 細胞質に局在 細胞質に局在
2 核に局在 細胞質に局在
1 核に局在 核に局在
尚、悪性度 4の代表例として副鼻腔の未分ィ匕癌、びまん性悪性リンパ腫の一部を挙 げることができる。同様に悪性度 3の代表例として多形膠芽腫の一部、びまん性悪性 リンパ腫の一部を、悪性度 2の代表例として GISTの一部（Bd-2+)、髄膜腫の一部を 、悪性度 1の代表例として GISTの一部（Be卜 2一）、髄膜腫の一部を挙げることができる
[0034] ここで、 ATBF1遺伝子にはェクソン 1〜： L 1が存在する（図 47参照）。この中でェクソ ン 10は最も長い配列力もなり、 4個のホメォドメインすべてをコードする。後述の実施 例に示すように ATBF1は翻訳後のプロセスにおいて、複数の部分に切断されること が示唆された。また、ェクソン 10の異常スキッピングによって、ェクソン 10に対応する 領域が欠落した変異タンパク質が産生されることが報告された (非特許文献 9)。 細胞内にぉ 、て ATBF1が完全な状態であれば (全長タンパク質として存在して!/ヽ れば）、「ATBF1遺伝子のェクソン 10に対応する領域 (即ち第 1領域)」、「ATBF1遺 伝子のェクソン 11に対応する領域 (即ち第 2領域)」、及び「ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域 (即ち第 3領域)」はそれぞれ、このような ATBF1の一部として存在 する。一方、翻訳後のプロセスにおいて ATBF1が分断されたときは、分断によって生 じた部分 ATBF1の一つ（又はその中の一部）として各領域は存在する。
尚、第 1領域は、 ATBF1-Aタンパク質の中央領域の一部（ェクソン 10のホメォドメイ ン以外の領域)を抗原として作製された抗体 D1-120によって認識される。同様に第 2 領域は、 ATBF1-Aタンパク質の C末端領域の一部を抗原として作製された抗体 AT6 によって認識され、第 3領域は、 ATBF1-Aタンパク質の N末端領域の一部を抗原とし て作製された抗体 NT440及び 1-12によって認識される。これらの抗体の作製方法は 後述の実施例の欄で詳述される。
[0035] 被検癌細胞は、被疑癌組織力も採取することができる。具体的には、被疑癌組織の 一部をバイオプシー（生検)で採取し、被検癌細胞を含む試料としてそれを本発明の 方法に供することができる。
[0036] 本発明において ATBF1量の検出や、 ATBF1タンパク質の第 1領域、第 2領域及び 第 3領域の検出は、これに限定されるものではないが、好ましくは免疫組織ィ匕学的染 色法を利用して行う。免疫組織化学的染色法によれば、迅速に且つ感度よく ATBF1 量等を検出できる。また、操作も簡便である。従って、 ATBF1量等の検出に伴う被検 者 (患者)への負担も小さくなる。
免疫組織化学的染色法では検出対象を特異的に認識する抗体 (抗 ATBF1抗体、 抗第 1領域抗体など)が使用され、当該抗体の結合性 (結合量)を指標として ATBF1 量が検出される。
免疫組織化学的染色法では通常、まず被検癌細胞に対して、検出対象に特的な 抗体 (例えば抗 ATBF1抗体)を接触させる。その後、細胞全体、核、及び Z又は細胞 質に対する当該抗体の結合量を測定する。そして測定結果から、被検癌細胞の細胞 全体、核内、及び Z又は細胞質内の検出対象の存在量を算出する。具体的には、 以下に示す免疫組織ィ匕学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。 生体組織の免疫組織ィ匕学的染色は一般に以下の手順 (1)〜(9)で実施される。尚、 生体組織の免疫組織ィ匕学的染色法につ!ヽては様々な文献及び成書を参照すること ができる (例えば、「酵素抗体法、改訂第 3版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画
) o
(1)固定'パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンゃパラフオルムアルデヒド、無水ェチル アルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱 水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。ノ ラフィンで包埋された標 本を所望の厚さ（例えば 3〜5 μ m厚）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パ ラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本など を用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理 (抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び Z又は加圧処理等を行
(4)内因性ペルォキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルォキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処 理して内因性ペルォキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をゥシ血清アルブミン溶液 (例えば 1%溶液)で数分から数十分程度処理して非 特異的反応を阻害する。尚、ゥシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して 次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)—次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数 時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加 標識物質としてペルォキシダーゼが頻用される。ペルォキシダーゼを結合させた 2 次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応 終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液に DAB (3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続 、て過酸化水素水を添 加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間 (例えば 5分間)切片に浸透させ 、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、 DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのへマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し 色出しする (通常、数分間)。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴ ムシロップなどで封入する。
免疫組織化学的染色法に使用する抗体 (検出用抗体)は、検出対象に特異的結 合性を有する限りその種類や由来などは特に限定されない。検出用抗体はポリクロ ーナル抗体、オリゴクローナル抗体 (数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクロ ーナル抗体の 、ずれでもよ ヽ。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体として は、動物免疫して得た抗血清由来の IgG画分のほか、抗原によるァフィユティー精製 抗体を使用できる。抗 ATBF1抗体力 Fab、 Fab'、 F(ab')、 scFv、 dsFv抗体などの抗
2
体断片であってもよい。
尚、 ATBF1量の測定には、後述の実施例に示す D1-120抗体を使用することができ る。この抗体は、 ATBF1-Aと ATBF1-Bの共通部分である D1-120部位（ェクソン 10に 対応する領域であってホメォドメイン 1のごく一部およびその直前の領域)を特異的に 認識する。従って、この抗体を用いれば ATBF1-Aと ATBF1-Bの両者を同時に検出 することが可能である。一方、この抗体は ATBF1の第 1領域に対して特異的に結合 することから、この抗体による検出量は第 1領域の存在量を反映したものとなる。従つ て、この抗体を用いれば、第 1領域の量又はその局在を把握することが可能となる。 同様に、 ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域を認識する抗体 AT6を用いれ ば、 C末端領域である第 2領域の量又はその局在を把握することが可能となり、 ATBF 1遺伝子のェクソン 3に対応する領域を認識する抗体 NT440又は 1-12を用いれば N 末端領域である第 3領域の量又はその局在を把握することが可能となる。
[0039] 抗 ATBF1抗体等は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレ ィ法などを利用して調製することができる。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗 原 (例えば ATBF1の D1-120部位又はその一部）を調製し、これを用いてゥサギ等の 動物に免疫を施す。ヒト以外の種 (例えばマウス）の ATBF1 (又はその一部）を抗原と して用いることができる。抗原は生体試料を精製することにより得ることができる。また 、遺伝子組換え技術を利用して得た抗原を用いることもできる。組換えヒト ATBF1は 例えば、 ATBF1をコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用 いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される 低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キャリアタンパク 質を結合させた抗原を用いることが好まし 、。キャリアタンパク質としては KLM (Keyho le Light Hemocyanin)、 BSA (Bovine Serum Albumin)、 OVA (Ovalbumin)など;^使用 される。キャリアタンパク質の結合にはカルポジイミド法、ダルタルアルデヒド法、ジァ ゾ縮合法、 MBS (マレイミドベンゾィルォキシコハク酸イミド)法などを使用できる。一方 、 ATBF1 (又はその一部）を、 GST、 βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又 はヒスチジン (His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもでき る。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
[0040] 本発明者らは、胎仔および成ラットの脳組織、未分化胚性癌細胞株 (P19細胞)さら に 2種類の神経芽細胞腫細胞株 (NB-1, GOTO)においてウェスタンブロットによる実 際の組織中での ATBF1タンパク質のサイズを検定した。その際に使用した抗体は AT BF1-A (404kDa)タンパク質の中央部を検出する D1-120である。これらの抗体を用い たウェスタンプロットの結果、抗体が認識するタンパク質 (即ち ATBF1タンパク質)の サイズは腫瘍細胞によって 404kDaを示す場合と、その約半分の 210kDa、さらにそれ より短い多数のサイズを示す場合があった。し力しながら、本発明の実施にあたり - 120に相当する部位に対する抗体を癌細胞の悪性度判定に使用する場合には、この タンパク質サイズの差異を考慮する必要は無いと考えられる。但し、組換え ATBF1を 用いる場合にぉ 、て後述の実施例に示した結果 (D 1-120を使用した染色結果）と同 等の結果を出すためには、 ATBF1遺伝子 (遺伝子の一部であってもよい）のうち、 AT BF1-Aアミノ酸配列の D1-120部位をコードする遺伝子部分 (ェクソン 10に対応する 部位)を選択し、ベクターを用いて適当な宿主に導入して調製した抗原を用いて作製 した抗体を使用することが必要と考えられる。 NT440、 1-12、及び AT6を使用した実 験の結果が示すように D1-120部位力も大きく離れた部位を認識する抗 ATBF1抗体 を使用した場合の検出結果 (局在態様など）は、 D1-120を使用した場合の検出結果 と全く異なったものとなる。しかしながらその近傍であれば、 D1-120部位以外の部位 を認識する抗体を用いても、 D1-120が検出する部位 (第 1領域)を同様に検出できる 可能性がある。ある抗体力 ¾1-120と同様の特異性を有する力否かは P19細胞等を用 いた予備実験、癌細胞を使用した ATBF1の局在の検索実験 (具体的にはウェスタン プロッティングなど)などによって検証することができる。その結果 D1-120と同等の特 異性を当該抗体が有すると判断されれば、当該抗体を D1-120と同様の目的で使用 することができる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理 などによって血清を得る。得られた抗血清をァフィユティー精製する。一方、モノクロ ーナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順 で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時 点で免疫動物力 抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫 細胞とを融合してハイプリドーマを得る。続いて、このハイプリドーマをモノクローナル 化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選 択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる 。一方、ハイプリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物 (例えばマウス)の 腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得 することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテイン G、プロテイン A等を用いたァフィユティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相 化したァフィユティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロ マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用 V、ることもできる。これらの方法は単独な 、し任意に組み合わされて用いられる。
[0042] 検出対象への特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の 改変を施すことができる。本発明では、このような改変抗体を利用してもよい。
[0043] 抗 ATBF1抗体等として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合抗体量を 直接検出することが可能である。従って、より簡易な方法となる。その反面、標識物質 を結合させた抗 ATBF1抗体等を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般 に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する 方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法など、間接的検出 方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは、抗 ATBF1抗体等に特異的結 合性を有する抗体であって例えばゥサギ抗体として抗 ATBF1抗体等を調製した場合 には抗ゥサギ IgG抗体が使用される。ゥサギやャギ、マウスなど様々な種の抗体に対 して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ株式会社やコスモ · バイオ株式会社など）、本発明で使用する抗 ATBF1抗体等に応じて適切なものを適 宜選択して使用することができる。
[0044] 標識物質には、ペルォキシダーゼ、 j8— D—ガラクトシダーゼ、マイクロペルォキシ ダーゼ、ホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP)、フルォレセインイソチオシァネ ート（FITC)、ローダミンイソチオシァネート（RITC)、アルカリホスファターゼ、ピオチン 、及び放射性物質の中から任意に選択されるものが好適に用いられる。特に、ビォチ ンを標識物質として用いてアビジンペルォキシダーゼを反応させる方法によれば、よ り高感度の検出が可能である。
[0045] 本発明の第 2の局面は、上記本発明の方法を実施するための試薬 (被検癌細胞の 悪性度判定用試薬)及びキット (被検癌細胞の悪性度判定用キット)を提供する。 本発明の試薬の一形態は、上記のように免疫学的手法によって本発明の方法を実 施する際に使用される抗 ATBF1抗体 (抗第 1領域抗体、抗第 2領域抗体、抗第 3領 域抗体を含む。以下同様)である。ここでの抗体はポリクローナル抗体、オリゴクロー ナル抗体 (数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでも よい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血 清由来の IgG画分のほか、抗原によるァフィユティー精製抗体を使用できる。抗 ATBF 1抗体が、 Fab、 Fab'、 F(ab')、 scFv、 dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。所望
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の標識ィ匕が施されて 、る抗体であってもよ 、ことは上記の通りである。
検出用抗体の抗体として、（l)ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域を認識す る抗体、（2)ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域を認識する抗体、又は (3)AT BF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域を認識する抗体を好適に用いることができる
(1)の抗体によれば、ェクソン 10に対応する領域 (ATBF1タンパク質の第 1領域)を 検出可能である。（2)の抗体によれば、ェクソン 11に対応する領域 (ATBF1タンパク質 の第 2領域)を検出可能である。（3)の抗体によれば、ェクソン 3に対応する領域 (ATB F1タンパク質の第 3領域)をを検出可能である。
(1)の抗体、（2)の抗体、及び (3)の抗体の具体例として、後述の実施例において使用 される以下のものを挙げることができる。
(1)の抗体： Dl-120、（2)の抗体: AT6、（3)の抗体： 1-12、 NT440 (NT440-1、 NT440-2 、 NT440-3の混合物）
尚、認識する部位、 ATBF1遺伝子のェクソンとの対応など、これらの抗体の特性の 詳細については図 31に示される。
本発明のキットは、 ATBF1に対して、又は第 1領域など ATBF1の一部に対して特異 的結合性を有する試薬を含む。当該試薬の好適な例は抗 ATBF1抗体である力 これ に限られるものではない。本発明のキットを用いることによって、本発明の方法をより 簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。
好ましい一形態として、抗 ATBF1抗体を含む免疫学的測定 (検出)用キットが提供 される。抗 ATBF1抗体の結合量を直接検出する方法用のキットの場合には、標識ィ匕 された抗 ATBF1抗体が用いられる。一方、間接的検出方法用のキットの場合には、 未標識の抗 ATBF1抗体が用いられる。この場合には、標識物質で標識化された二次 抗体 (標識二次抗体)をキットに含めてもよい。二次抗体と標識物質を結合させたポリ マーを利用した検出法用のキットとする場合には、当該ポリマーをキットに含めてもよ い。
一方、キットに ATBF1 (抗原）を更に含めることにしてもよい。典型的には、キットに 使用する抗 ATBF1抗体を作製する際の抗原として用いたものと実質的に同一、又は 同等の ATBF1をキットに含める。従って完全長の ATBF1でなくともよい。また、組み換 え ATBF1であってもよい。 ATBF1は、キットを使用して得られた染色性が抗 ATBF1抗 体と ATBF1との特異的結合に基づくものであることを確認するために使用される。具 体的にはまず、 ATBF1で抗 ATBF1抗体を処理する。処理後の抗 ATBF1抗体を用い て免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗 ATBF1抗体を使用して得られた 染色像とを比較する。後者の染色像の方に強い染色性が認められれば、その染色 性は抗 ATBF1抗体と ATBF1との特異的結合に基づくものであることを確認できる。 また一方で、タグやキャリアタンパク質 (以下、タグ等という）との融合タンパク質を抗 原として作製した抗 ATBF1抗体をキットに使用する場合には、用いたタグ等をキット に更に含めることにしてもよい。キットを構成する抗 ATBF1抗体中に、その作製過程 で使用したタグ等に反応性を有する抗体が混在しているおそれのある場合に当該タ グ等が必要となる。以下のように当該タグ等を利用すれば、キットを使用して得られた 染色性が抗 ATBF1抗体と ATBF1抗体との特異的結合に基づくものであることを確認 することができる。まず、このタグ等で抗 ATBF1抗体を処理する。処理後の抗 ATBF1 抗体を用いて検体の免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗 ATBF1抗体を 使用して得られた染色像とを比較する。両者の間で染色性に相違がなければ、後者 の染色像における染色性は抗 ATBF1抗体と ATBF1との特異的結合に基づくもので あることを確認できる。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要なー以 上の試薬 (例えば、組織固定 ·包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻 害するための BSA、 DAB等の発色試薬、核染色用のへマトキシリン溶液など)や器具 などを更に含めてもよい。また通常は、本発明のキットには取り扱い説明書が添付さ れる。
以下、実施例（実験例を含む)を用いて本発明をより詳細に説明する。
実施例 1 [0048] < ATBF1と細胞周期制御系との関連性の検討 >
本発明者らは分子生物学的手法である酵母ツーハイブリッド (yeast two-hybrid)法 による分子相互作用の研究成果として、 DNA結合転写調節因子である ATBF1が、 D NAと結合するば力りでなく細胞質に存在する細胞骨格タンパク質 GFAP (glial fibrilla ry acidic protein)と結合する新事実を発見した。従来から生理的な状態では DNA結 合タンパク質は核に存在することが当然のように予想され、観察される力 ATBF1も 核タンパク質と予想されながら、核で機能するだけでなく細胞質でも細胞骨格タンパ ク質と結合して存在する可能性が示されたわけである。これは今回の核細胞質移行 を見出す原点となった。しかも、既報 (非特許文献 6)のごとく胃癌培養細胞を使用し た別の実験系で、本発明者らは ATBF1が核内では p53タンパク質と結合し、 p21のプ 口モーターを活性化、細胞周期を抑制する働きがあることを発見した（図 1を参照)。 故に、 ATBF1の細胞周期制御機能に着目することとなり、種々の癌細胞における AT BF1の動向を調べる事となった。その結果、癌細胞の中には核タンパク質として ATB F1が核に局在する細胞以外に、細胞周期制御系が乱れ、増殖性の強くなつた癌細 胞においては、 ATBF1が核力 細胞質に移出が観察され、核の ATBF1の染色性が 極端に低下する例が存在するという新事実の重要性に本発明者らは気付く事となつ た (後述の種々の実施例を参照)。
実施例 2
[0049] <¾ATBF1抗体の作製 >
2- 1.抗原の調製
マウス ATBFl (Ido et al, (1996). Gene, 168, 227- 231)の 41アミノ酸残基（2114〜21 54: LQTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQQNKR:配列番号 1)を ダルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)に融合した組み換えペプチドを抗原として使 用した。尚、上記の 41アミノ酸残基は、ヒト ATBF1のアミノ酸残基 (2170〜2147)と完全 に一致する。
具体的には、以下（1)及び (2)の手順で当該抗原を調製した。抗原調製、抗体作 製の詳細は既報（J. Compartive Neurology (2003) 465: 57-71：非特許文献 3)に記 載される。 (1)上記のごとく標的アミノ酸部分をマウス cDNAより切り出し、 GST融合タンパク質 作製用のベクター pGEX- KTに組換え (サブクロー-ング)を行った。（2)大腸菌 AD 202に遺伝子導入を行!、、 AD202に発現させたタンパク質を Sepharose- glutathione beaded agarose (Sigma社)を使用して常法で精製を行った (例えば、「はじめての組換 えタンパク質精製ノヽンドブック」 1999年発行、アマシャムフアルマシアバイオテク株 式会社、を参照)。
[0050] 2- 2.免疫及び抗体の分離'精製
2- 1.で調製した抗原 (ATBF1- GST融合タンパク質)を用いて、以下（1)〜(4)の 手順で抗 ATBF1抗体 (D1-120)を取得した。
(l) PBS(pH7.5)に融解した抗原 (1 mg/ml)を Titer Max Gold (CytRx社)と等量混合し て、免疫用ェマルジヨンを作成した。（2) 2mlのェマルジヨンをゥサギ背部に皮下注射 して免疫（0, 14, 28, 49, 70日目の 5度にわたり）を行った。（3) 91日間経過した時 点で、屠殺採血して血清を分離した。（4)免疫に使用した抗原による抗原カラムを作 成し、血清力 抗原抗体カラム精製後に抗 ATBF1抗体を取得した (例えば、「はじめ ての抗体精製ハンドブック」 2000年発行、アマシャム
フアルマシアバイオテク株式会社、を参照)。
実施例 3
[0051] <培養癌細胞における ATBF1発現と細胞周期の関係 >
P19マウス胎児性癌 (embryonal caricinoma)培養細胞を使用し、未分化な癌培養細 胞を神経細胞に分化させる実験を行い、その過程における ATBF1発現と細胞周期 制御との関連に着目した検討を行った。
[0052] 3- 1. P19培養開始時の ATBF1発現、細胞周期
P19癌細胞培養開始時、特に分化刺激を加えな!/ヽ未分化増殖状態の細胞を採取 し以下に示す手順で免疫組織ィ匕学的染色 (ATBF1染色、 D1-120使用）を実施した。 細胞をチャンバースライドで培養し PBSで調整した 4%パラフオルムアルデヒドで固定し 、固定後洗浄を行った。抗 ATBF1抗体を 5 g/mlとなるように、 0.05Mトリス緩衝液 (p H7.6、ゥシ血清アルブミン 1%溶液、アジィ匕ナトリウム含有）に溶解した一次抗体溶液を 切片に滴下し、 37度で約 30分反応させた (一次抗体反応)。十分に洗浄した後、 2 次抗体 Alexa Fluor 594— conjugated goat anti-rabbit IgG (以下の実施例中で示され るごとく、他のモノクローナル抗体と 2重染色を行う場合は Alexa Fluor 488-conjugate d goat anti-mouse IgGも同時に使用する。尚、いずれも Molecular Probes社製）を標 本に作用させ、室温で約 1時間反応させた (二次抗体反応)。十分に洗浄した後、封 入を行い。蛍光顕微鏡 (AX70;オリンノス社製） 、共焦点レーザー顕微鏡 (LSM5; ZWISS社製)で観察を行った。染色の結果、 ATBF1は核、細胞質ともに発現を認めず (図 2aを参照）、フローサイトメトリーを使用した検索では細胞は増殖状態を示し、細 胞周期 G1期の細胞とともに、 S期の細胞、 G2,
M期の細胞が高 、割合で混在した（図 2dを参照)。
[0053] 3- 2. P19、レチノイン酸処理後、 24時間での ATBF1発現、細胞周期
培養細胞に神経分化を促す薬剤、レチノイン酸を投与した 24時間後、上記 3— 1に 記載した方法で ATBF1染色、さらにフローサイトメトリー検索を行った。形態的には細 胞はやはり未分ィ匕増殖状態を維持したが、 ATBF1の細胞質での発現を認めるように なった（図 2bを参照)。フローサイトメトリーを使用した検索では細胞はやはり増殖状 態を示し、 G1期の細胞とともに、 S期の細胞、 G2,
M期の細胞の割合は依然高力つた（図 2eを参照)。
[0054] 3- 3. レチノイン酸中断、 4日後の ATBF1発現、細胞周期
レチノイン酸を中断し、さらに 4日間培養後に上記 3— 1に記載した方法で ATBF1染 色、さらにフローサイトメトリー検索を行った。形態的に培養細胞は神経突起を有する 分化した細胞群に変化した。すると ATBF1は細胞質力 核に移動し、核主体の発現 に変化した（図 2cを参照)。フローサイトメトリーを使用した検索では S期の細胞、 G2、 M期の細胞の割合が極端に減少し、ほとんどが G1期の細胞集団に変化した（図 2fを 参照)。これは明らかな細胞周期の停止を意味し、 G1期停止、言い換えると増殖抑制 が認められた。この実験結果は、そのアミノ酸配列番号 277及び 2987から始まる 2箇 所の推定核内保留シグナル（Nuclear localization signal)の存在（図 3aを参照）から 予想されたごとく ATBF1が実際に細胞質力も核へ移行を示すタンパク質であることを 証明しただけでなぐ核への ATBF1移行により細胞周期の停止が起こることをも示す ものである。 実施例 4
[0055] く培養癌細胞における ATBF1の細胞質力 核への移行、核から細胞質への移出の 調節機構の検討 >
4 1.ATBF1の核への移入の促進機序の検討
P19細胞では、レチノイン酸又はその誘導化学物質を作用させると、 ATBF1の mRN A転写量、細胞内タンパク量が増加する。し力しながら P19細胞を培養液に浮遊する 状態で培養する限り、 ATBF1は細胞質に留まり、核移行は観察されない。ここでは細 胞を培養皿に接着するような条件設定をすることにより ATBF1発現がどのように変化 するかを検索するための検討を行った。生体内の細胞外部環境に類する特徴を持 っフイブロネクチン、ラミニンゃ、ゲラチン、ポリ— L オル-チン、ポリ- Lリジンを培養 皿へ塗布した後の細胞における ATBF1の局在を観察した。上記 3— 1.に記載したの と同様の方法で ATBF1染色 (D1-120を使用）を施行した。フイブロネクチンなどを培 養皿へ塗布しない場合、細胞は浮遊状態で ATBF1は細胞質には出現するが、核へ 移行しな!ヽ（図 4aを参照）のに対して、培養皿にフイブロネクチンとポリ L オル- チンを塗布し細胞が付着できる状態にした場合、培養後 3時間以内に、かなりの細胞 において ATBF1の核への移行が観察され（図 4bを参照）、 24時間では殆ど全ての細 胞で ATBF1の核への移行が観察された（図 4cを参照)。ラミニンゃゲラチンを培養皿 へ塗布した場合でも、培養皿表面に P19細胞はよく付着することができ、その条件で もやはり ATBF1の核への移行が観察された。これは ATBF1の細胞質力 核への移行 は、細胞の培養皿への接着を促進するフイブロネクチンのごとき因子 (ある 、は接着 刺激それ自体)の影響で調節される事を意味して!/、る。浮遊状態から付着状態への 変化は細胞表面に存在する受容体が関与する可能性があり、細胞外部環境に応じ た情報を細胞内へ伝えることで ATBF1の細胞内局在が変化すると思われた。
[0056] 4- 2.核力 細胞質への ATBF1輸出機序の検討
最近、し RMl(Exportin 丄 or chromosome region maintenance 1)【こより械々な因ナの 核力ゝら細胞質への運搬移出が調節される事実が報告されている。 ATBF1では、 CRM 1の標的配列、即ち核外輸出シグナル (Nuclear export signal)の存在が三箇所（アミ ノ酸配列の 1267番目、 2471番目、及び 2504番目からそれぞれ始まる）想定されて いる（図 3bを参照）。従って CRM1の阻害剤である抗生剤 Leptomycin Bの作用により 、核力 の細胞質への ATBF1移出阻害が起こる事が予想された。今回、 P19細胞を 使用し、上記のフイブロネクチンおよびポリ—L—オル-チンを塗布した培養皿にレ チノイン酸を作用させ、さらに抗生剤 Leptomycin Bをカ卩える実験を行い、上記 3— 1. に記載した方法で ATBF1染色を施行することで ATBF1の動向を観察した。その結果 、 Leptomycin Bを作用させない場合の発現量に比較して（図 5aを参照）、 Leptomysin Bを作用させる事で、 P19細胞における ATBF1の核内濃度が明らかに増大する（図 5 bを参照）とともに、アポトーシスに陥る細胞数が明らかに増加した。また、さらに 1日培 養を追加すると、翌日には殆どの細胞が死滅した。この実験結果は ATBF1の核外輸 出は CRM1に制御されている事と、 ATBF1濃度が核内で増加する状態は、癌細胞の アポトーシスを促進する状態である事を示すとともに、癌の治療方針に重要な示唆を 与えると思われた。
4 3.細胞質力 核への移行の調節機序の検討
細胞周期に関連する種々の因子などに関して過去に検討された事実として、タン ノ ク質の核 ·細胞質移行にはアミノ酸のリン酸ィ匕が関係する事が知られ、特に核移行 には核内保留シグナルのリン酸化及び脱リン酸ィ匕が重要であることが判明している。 リン酸化反応を触媒する酵素の中でも PI3K (phosphatidylinositol 3- kinase)ファミリー タンパク質は良く研究されており、最近 ATBF1と同様に、核，細胞質を移行し機能す る N-し oR (The nuclear
receptor co-repressor)の核から細胞質へ局在が移行する際、 401番セリンのリン酸 ィ匕に PI3Kが関与している事が報告された (2002, Nature 419, 934-939)。本発明者ら はラット胎仔の脳神経細胞における ATBF1発現と N-CoR発現が相補的であるという 事実から、 N-CoRが核力も細胞質に輸出される場合とは逆に、 ATBF1が細胞質から 核への移行する際に、 PI3Kによる核内保留シグナルのリン酸ィ匕が関与する事を予想 した。そこで上記同様に、 P19細胞を使用し、フイブロネクチン塗布培養皿でレチノィ ン酸を作用させた後に PI3Kの拮抗剤 2種 (Wortmannin, LY294002)を作用させる実 験を行い、上記 3— 1.に記載した方法で ATBF1染色を施すことで ATBF1の動向を 観察した。その結果、薬剤を加えない場合の P19細胞内の ATBF1は核への移行を示 す（図 6aを参照）のに比較し、薬剤をカ卩えた場合の P19細胞では ATBF1産生自体は 影響を受けなカゝつたものの、核内へのタンパク質の移行は阻止される傾向（作用は W ortmanninが LY294002より強い）を示した（図 6b, 6cを参照）。その際、細胞は分裂像 が散在し増殖状態を維持した。細胞質の ATBF1は核周囲の細胞質部分 (小胞体内 を予想）にリング状となるように集合する像を認め、これは、 ATBF1の細胞質 (小胞体 )力 核への移行が PI3Kに依存した事象である事、核への ATBF1移行が無!、と細胞 は増殖状態を維持出来る事を意味して 、る。
[0058] 続いて上記実験で確認した PI3Kファミリータンパク質の中で何れが ATBF1の核移 行の際のリン酸化に関与して ヽるかを決定する検討を行った。 ATM(Ataxia
Telangiectasia Mutated)は毛細血管拡張性小脳運動失調症の原因遺伝子であり、 PI 3Kファミリータンパク質をコードする遺伝子の代表である。その機能は多彩であるが、 特に放射線などによる DNA傷害の監視システムとして細胞死や細胞周期を制御して いる事が知られている。今回本発明者らは ATMの作用を特異的に阻害する薬剤カフ エインを使用した実験を行った。まず、 P19細胞を培養して培養皿接着性となったの を確認した後、レチノイン酸処理を行い、続いてカフェインを作用させた。その結果、 PI3K阻害剤、 Wortmannin, LY294002を使用した場合に核移行の阻害が不完全であ つたのに比較して（図 6b、 6cを参照）、カフェインでは殆ど全ての培養細胞における A TBF1の核への移行が阻害され（図 6dを参照）、細胞の増殖性は完全に保たれた。こ の結果は ATBF1の核内保留シグナル部位のリン酸ィ匕に関与する PI3Kは ATMである 事を意味している。さらに、 ATBF1の核への導入が、 ATMの活性化（リン酸化）、すな わち放射線などによる DNA傷害の感知によって促進される事を示唆している。
実施例 5
[0059] < ATBF1強制発現と細胞周期の関連の検討 >
実施例 3、 4により、 ATBF1が細胞質力 核へ、さらに細胞質へと行き来をする事で 細胞周期の時期や増殖状態が切り替わる事が明ら力となった。 ATBF1のみが主な原 因でこれらの事象が起こったの力、それとも他の何らかの因子が作用した結果なのか を明らかにするために、本発明者らは ATBF1単独発現ベクターを用いて、マウス神 経芽細胞腫由来の培養細胞株 Neuro2A細胞で強制発現実験を行った。 Neuro2A〖こ ATBF1発現ベクターを導入して強制的に ATBF1を発現させた後、上記 3— 1.に記 載した方法で ATBF1染色を施すことで ATBF1の動向を観察するとともに、フローサイ トメトリーで細胞周期を検索した。また同時に培養液に BrdU (5-bromodeoxyuridine) を混入し、細胞の DNA複製のためのチミジン取り込みが行われているかどうかも検索 した。その結果、 ATBF1を強制発現させることで核への集積を認める細胞は BrdUが 取り込まれない事が明らかとなり（図 7bを参照）、培養細胞全体では細胞周期を停止 している細胞の割合が増加した（図 7cを参照)。この実験結果は、 ATBF1の核での発 現が、細胞の DNA複製の停止、細胞周期の停止の直接的原因となる事を意味して いる。
一方、 ATBF1発現ベクターの遺伝子導入と同時に培養液に BrdU
(5-bromodeoxyuridine)を添カ卩し、 DNA複製中の細胞を標識した。その結果、 ATBF1 の強制発現を認める細胞では、例外なく BrdUの取り込みを認めな 、事が明ら力とな り、 ATBF1が主な原因で細胞周期が停止する事実が明ら力となった。
実施例 6
<胎生 14日ラット胎仔脳、神経細胞における ATBF1の核移行と増殖能との関連 > さらに本発明者らは、胎生 14日のラット胎仔脳を使用して ATBF1の核移行、増殖 能との関係を検索した。胎生期の大脳基底部の神経細胞は脳室直下の傍脳室領域 では未分ィ匕な状態 (神経上皮細胞と称される)を維持しており、そこで最終分裂を終え た細胞は脳室下領域を通過し、分化領域に移動し神経細胞に最終分化するとされる 。ATBF1発現と BrdU取り込みとの関係を検索するために母親ラットの腹腔内に BrdU を投与して 3時間後に屠殺し、胎仔の検索を行った。実際の ATBF1および BrdUの染 色性の確認するため、以下に示す手順で免疫組織ィ匕学的染色を実施した。まず採 取した胎仔組織を 4%パラフオルムアルデヒドで固定'パラフィン包埋し、約 3 m厚に 薄切し、スライドガラス上に伸展させた。脱パラフィン後、クェン酸緩衝液 (PH6.0)を使 用して圧力釜で 4分間 (110°C)熱処理を実施した（当該抗原賦活法を選択した理由 につ ヽては実施例 7を参照)。続ヽて過酸ィ匕水素水で処理して内因性ペルォキシダ ーゼを除去した。次に、実施例 2で調製した抗 ATBF1抗体を 5 /z g/mlとなるように 0.0 5Mトリス緩衝液 (pH7.6、ゥシ血清アルブミン 1%溶液、アジィ匕ナトリウム含有）に溶解し た一次抗体溶液を切片に滴下し、室温で約 1時間反応させた (一次抗体反応)。十分 に洗浄した後、二次抗体 (DAK0
Enivision, Labelled polymer, HRP [し oae No. K1491] Anti-mouse ana Anti rabbit)を 標本に作用させ、室温で約 1時間反応させた (二次抗体反応)。十分に洗浄した後、 トリス緩衝液に DABを溶解し、過酸ィ匕水素水を添加した発色溶液を 5分間標本に浸 透させて発色させた (発色反応)。発色後、標本を水道水で十分に洗浄し、 DABを除 去した。続いて、マイヤーのへマトキシリンで 15秒程度染色した後、流水で 8分間洗浄 して色出しを行った。最後にアルコール系列及びキシレン系列を通し、透徹及び封 入を行った。以上の手順で胎仔ラット脳組織を染色することにより、 ATBF1 (D1-120を 使用）の核 ·細胞質の局在を明確に出来た。 BrdU染色は一次抗体として抗 BrdU抗 体を使用し同様な染色手技を行った。 DAB発色より核細胞質の染色性の差異は蛍 光発色が解りやすい場合もあり、実施例 3 (3— 1. )に示す同様の方法で蛍光染色も 行い、蛍光顕微鏡 (AX70;ォリンパス社製)による観察も同時に行った。その結果、傍 脳室領域に存在する神経上皮細胞は BrdU取り込みを認めるとともに ATBF1が細胞 質に局在した（図 8a、 b、 d、 fを参照)。分化領域に存在する神経細胞は BrdU取り込 みが無 、こと力 細胞周期が停止して 、ることが分かり、 ATBF1は核に局在した（図 8 a、 b、 c、 eを参照)。今回の結果は、未分化で分裂能を有する性質で癌細胞との類似 性がある正常神経上皮細胞では、 ATBF1が細胞質力 核へ移行することによって、 細胞増殖を停止した神経細胞へと最終分化して性質を変える事を示して!/ゝる。胎仔 期の、分裂増殖能を有した神経上皮細胞と、分裂能を失い最終分化した神経細胞に おける ATBF1の細胞内局在の比較観察は、癌の悪性度を考える上で非常に参考に なる。以下の実施例で詳述するが、癌細胞においても ATBF1の細胞内局在に関して 二つの様式が認められており、 ATBF1が細胞質だけに存在する悪性度の高!、種類 と、核に ATBF1が存在する比較的悪性度が低い種類に分類できる点において、胎仔 期の神経細胞の観察で得られる結果と同一であると判断できる。
実施例 7
<¾ATBF1抗体使用時の、最適な ATBF1検出条件 (抗原の賦活化条件）の検討 > 外科的に採取され、ホルマリン固定後にパラフィン包埋された通常の病理検体から ATBF1を抗体で精密に検出するには、抗原の賦活ィヒ反応条件を決定することが重 要となる。核 ·細胞質ともに程良く抗原が賦活される事が ATBF1の核細胞質移行を検 索する上では特に重要となる。今回、外科的に採取され、診断された膀胱癌のうち、 上皮内の乳頭状非浸潤性膀胱尿路上皮癌 (非浸潤癌と略す)及び上皮下の浸潤性 膀胱尿路上皮癌 (浸潤癌と略す)を各一例使用し、最適な抗原賦活法を見出すべく 以下の検討を行った。まず、ホルマリン固定後、パラフィン切片を作成し、実施例 6と 同様の手技で ATBF1染色 (D1-120を使用）を行った。ただし抗原賦活法として、以下 に示すごとぐ熱処理 3種類と賦活液 9種類の組合せ (計 27種類の組み合わせ）と、 酵素処理 3種類を使用しその染色性を検討した。熱処理 3種類：（1)オートクレープ、 121°C、 15分、（2)圧力釜、 4分、（3)電子レンジ、煮沸しない程度の温度設定、 15 分。抗原賦活液 9種類：（l) DAKO Target Retrieval Solution PH 6.0, (2) DAKO Target Retrieval Solution High pH, pH 10.0, (3) lOmMクェン酸バッファー pH6.0, (4 ) 10 mM NaOH加クェン酸バッファー pH7.0, (5) TEバッファー
(ImM EDTA + 10 mMトリス塩酸バッファー） pH9.0, (6) 50 mMトリス塩酸バッファー p H10.0, (7) 20 mMトリス/ 0.65 mM EDTA/0.0005% Tween 20, (8) ImM EDTA溶液， p H8.0、（9) 5% Urea溶液。酵素処理 3種類：（1)トリプシン、 （2)ペプシン、 （3)プロティ ナーゼ K;である。
染色結果を概説すると、熱処理法、バッファーの種類により、非浸潤癌、浸潤癌に おける染色強度、細胞内で核、細胞質の染色パターンが変化した。 27種類の染色 性は全て異なったが、大きな傾向として、オートクレープ処理を行うと核の染色性が 際立ちやすぐノ ッファーの選択によっては細胞質の染色が得られなくなった（図 9を 参照)。逆に電子レンジ処理では核の染色性を出すのが難しくなり、細胞質の染色性 が際だつ傾向があった（図 10を参照)。圧力釜処理は、温度設定がオートクレープ、 電子レンジの中間で、核と細胞質の染色性を同時に出せる傾向を示した（図 11を参 照)。またいずれの酵素処理でも、非浸潤癌、浸潤癌とも全く染色性は得られなかつ た。抗原賦活法およびバッファーの種類により、非浸潤癌で核及び細胞質の両方に (図 12a、 cを参照）、浸潤癌でも核及び細胞質の両方に（図 12b、 dを参照) ATBF1 は局在することになり、その評価に非常に困惑した。客観的な評価は一見不可能に も思われたが、 27種類の染色全体を通しての傾向の評価は、以下の（1)及び（2)に 示すように可能であった。つまり（l)ATBFlは核、細胞質両方に存在し得るタンパク 質で、膜や血漿成分中には存在しない。（2)今回使用した非浸潤癌及び浸潤癌で は、 ATBF1は核、細胞質ともに存在を認める。しかし核/細胞質の細胞内局在のタン パク比率に差があり、非浸潤癌では核主体、浸潤癌では細胞質主体と判断できる。こ の 2つの評価を基礎に考えると、外科的に切除されホルマリン固定された標本に対す る対応を決定できる。すなわち、 ATBF1染色後に、癌の悪性度を決定するためには、 癌細胞での ATBF1発現の有無だけでなぐ核、細胞質の ATBF1量の相対的な比較 を実現することが重要であると思われ、 10mMクェン酸緩衝液 (pH6.0)を使用し圧力釜 で 4分間（110°C)熱処理することが最適であると判断された（図 12e、 fを参照)。さらに 、マイクロウエーブ（95°C)や、オートクレーブ（121°C)使用による熱処理は、核と細胞 質を移動する ATBF1局在の検出を明確には表現することは出来ないため ATBF1染 色には不適当であると考えられた。
実施例 8
[0063] <乳癌の悪性度と ATBF1発現との関連性の検討 >
8- 1.乳癌 153症例を使った ATBF1 mRNA発現量と予後の評価
乳癌手術症例 153例の臨床検体について、 ATBF1 mRNAの発現量を調べるため にリアルタイム半定量 PCRを実施した。尚、リアルタイム半定量 PCRは、 LightCycler v er.3.0 (ロッシュダイァグノスティックス社製)を使用し、添付のマニュアルを参考にした 上、常法で実施した。その結果、原発巣の大きさ、リンパ節転移の有無、エストロゲン レセプターの発現の有無などの従来の予後因子として重要なパラメータと、 ATBF1 m RNAの発現量変化は統計学的に有意な相関を示す事実が判明した (結果は図示せ ず)。簡略に表現すれば、 ATBF1の発現量が多い腫瘍の場合、患者の
予後が良ぐ発現量が低下するとより悪性で、予後が悪くなる事が明確であった。
[0064] 8- 2.乳癌における ATBF1局在と組織学的な腫瘍の浸潤性との関連
組織切片上で 4例の乳癌症例（73、 66, 53、 50歳）に対し、実際の ATBF1の染色 性の確認するため、実施例 6に示す手順で ATBF1染色 (D1-120を使用）を実施した 。乳頭腺管癌、硬癌の場合を例示する。組織学的に乳管内に限局し、乳管周囲に浸 潤を示さない癌腫 (図 13a, cを参照）では ATBF1核主体の染色性を認める傾向があ つた（図 13b, d, eを参照)。乳腺内、脂肪組織に浸潤性の発育を示す部位 (図 13f, h , jを参照）では、 ATBF1が細胞質のみに局在する（図 13g, i, k,を参照）場合と、 ATB F1の染色性が欠落する場合 (図 13kを参照）が混在した。組織学的な浸潤性との関 連で、 ATBF1の細胞内局在を比較すると、乳管上皮内に限局し浸潤を示してない状 態、つまり悪性度の低い状態では ATBF1は核にも局在する力 浸潤傾向、脂肪への 進展傾向を示すと ATBF1が細胞質に限局する力、発現欠落する傾向が明らかであ つた。これは実施例 8の 8— 1で示した ATBF1 mRNAの発現量の有無が予後を左右 するという事実と矛盾しない結果であり、 ATBF1の局在検討は乳癌の悪性度の予測 に有用であると判断できる。
実施例 9
[0065] <ヒトの各種癌における悪性度と ATBF1発現との関連性の検討 >
以下に示す例はすべて、ヒト癌細胞における ATBF1染色と、腫瘍の悪性度の関連 に関する検討及びその結果である。すべての検討にお!、て実施例 6に示す手順で A TBF1染色 (D1- 120を使用)を実施した。
[0066] 9- 1.膀胱癌培養細胞（3種類のヒト膀胱癌細胞株における ATBF1の発現の差異） 発明者の一人である三浦らが既に報告したように（非特許文献 6 :Microbilo.Immuno 1. 48(2), 137-145, 2004)、 ATBF1は腫瘍の核の中において、 p53と蛋白 蛋白結合し て機能し、腫瘍の悪性度と関与する可能性のあることが解ってきている。すなわちそ の第一はアルファフエトプロテイン遺伝子の転写抑制する機能、第二は p21遺伝子の 活性ィ匕による細胞周期抑制する機能である。特に p21を活性ィ匕して細胞周期を抑制 する機能は放射線、化学物質などで細胞 DNAが損傷される事がきっかけで発揮され る（図 1を参照)。
さて、実際の腫瘍の中で ATBF1の核又は細胞質への移行が観察される力 癌の悪 性度を考える場合、その意味するところをより正確に解明するためには他因子との関 連も重要である。本発明者らはその第一歩として、 p21、 p53という、それぞれ ATBF1と 非常に関連の深い (再度図 1を参照) 2種の癌抑制遺伝子の異常がすでに明確とな つているヒト膀胱癌由来の培養細胞 3株 (RT4, T24, HT1376)を用いて ATBF1染色を 行い、これらの培養細胞のどこに ATBF1が局在するかを検討した。これら 3種の培養 株は抗ガン剤シスブラチンの効果の有無、 p21が導入されるかどうかについてもすで に検索されている (Int J Cancer. 1996 Nov 15;68(4):501- 5)。従って ATBF1発現の腫 瘍の悪性度評価のためには最適な材料となると思われる。
[0067] ATBF1染色の結果をに示す（図 14を参照）。図 14の左は RT4の HE染色像（上段） 、 ATBF1染色像（中段)及び p53染色像（下段)である。 RT4はヒトの膀胱乳頭腫由来 で、 p21, p53ともに変異は無ぐシスブラチンでアポトーシスを誘導でき、悪性度は 3 種の培養株で最も低い。 ATBF1の染色性は細胞質にも少量存在する力 主体は核 であり、 ATBF1が核に導入されていることを示している。また変異の無い p53がほとん どの細胞の核に導入出来て 、る。
図 14の中央は T24の HE染色像 (上段）、 ATBF1染色像（中段)及び p53染色像（下 段）である。 T24は、 p21の変異は無いが、 p53ナンセンス変異株であり、 p53タンパク 質は途中で切断されて 、る。通常の ρ53 ·ρ21の経路（図 1を参照）が働かな 、ために 、この細胞はシスプラチンによりアポトーシスを導入できず、悪性度は RT4より高い。 Τ 24では ATBF1は核にも存在する力 細胞質主体に顆粒状の染色性を示している。ナ ンセンス変異を持つ ρ53が細胞の核に殆ど導入されて 、な 、。
図 14の右は HT1376の HE染色像 (上段）、 ATBF1染色像（中段)及び p53染色像（ 下段）である。 HT1376は、 p53ミスセンス変異でタンパク質にポイントミューテイシヨン が存在する事に加え、 p21フレームシフト変異を伴うことで、シスプラチンでアポトーシ スを導入できない。従って T24同様に悪性度の高い培養株である。この細胞株では R T4及び T24の ヽずれとも異なり、 ATBF1の弱 ヽ発現が核に存在すると!/ヽぅ特徴を示し た。一部、細胞の核でミスセンス変異を持つ p53が導入されている。
[0068] 上記 3種の培養株はともに定常状態では p21の導入は軽微である。抗ガン剤シスプ ラチンを作用させると、 RT4のみが p21を導入出来、細胞をアポトーシスに至らしめる 事が可能となる。腫瘍の核内に導入された ATBF1が野生型の p53と蛋白—蛋白結合 して安定ィ匕し、 p21のプロモーター活性を上昇させるという考え方に従えば、 RT4では p53が野生型であること力 p53-ATBFlが安定して核内に存在でき、これによつて p21 が正常に活性ィ匕されてアポトーシスを導入できると考えうる。しかし T24では p53が途 中で切断されているので ATBF1は核内に留まりにくく細胞質に移動してしまうと想定 され、正常に p21を導入できないと判断できる。また HT1376においても p53タンパク質 に変異が入って 、るためやはり RT4のように ATBF1が大量に核内に存在できな!/、。さ らに p21に変異があるため、 p21が正常に機能しない。従って結果として、これら二つ の細胞株ではともにアポトーシスが導入されず、高い悪性度を示すと解釈する事が 可能である。いずれにしても ATBF1が核に大量に染色されることが、悪性度が低い事 の指標となり得る。さらには ATBF1の細胞内での局在を知ることで、 p53の導入の有 無や、変異の有無を予想することも可能となると思われる。これら膀胱癌培養細胞の 染色性および P53発現との関連は、実際の膀胱癌において ATBF染色後に癌の悪性 度を考える際に、非常に重要な情報を提供してくれると判断される。
9- 2.膀胱癌 (ヒト膀胱癌の悪性度判定における ATBF1の有用性）
ヒト膀胱尿路上皮癌における悪性度判定における ATBF1染色の有用性を検討す ベぐ悪性度の一つの指標となると考えられる腫瘍細胞の組織学的異型度から分類 される様々な WHOグレードの症例について ATBF1染色性を検索した（図 15を参照） 。図 15aは、 65歳男性例の乳頭状粘膜内癌、 WHO Grade I、組織学的低異型度の 症例の染色像 (al : HE染色像、 a2 :ATBFl染色）である。 ATBF1染色性は核のみに 認められる。この染色性は培養細胞 RT4 (上記 9— 1.および図 14bを参照）に類似す る。
図 15bは、 81歳男性例の乳頭状粘膜内癌、 WHO Grade 1(組織学的低異型度)、 W HO Grade II (組織学的中等度異型度)が混在する症例の染色像（図 15bl : HE染色 像、図 15b2 :ATBFl染色像）である。 Grade Iの部分では ATBF1染色性は核のみに 認められる。 Grade IIの部分では ATBF1染色性は細胞質に認められる。核での染色 性はやはり培養細胞 RT4 (上記 9— 1.および図 14bを参照）に類似する。一方、細胞 質での染色性は培養細胞 T24 (上記 9 1.および図 14eを参照）に類似する。
図 15cは、 55歳男性例の粘膜下への浸潤癌で、 WHO Grade II (組織学的中等度 異型度)症例の染色像（図 15c 1 : HE染色像、図 15c2 :ATBFl染色像)である。 ATB F1染色性は細胞質に認められる。染色性は培養細胞 T24 (上記 9 1.および図 14e を参照）に類似する。 図 15dは、 84歳男性例の粘膜下への浸潤癌、 WHO Grade IIIの症例の染色像（図 15dl : HE染色像、図 15d2, d3 :ATBFl染色像）である。 ATBF1染色性が細胞質 (図 15d2、染色性は培養細胞 T24に類似)に認められる細胞と、 ATBF1染色性が薄く欠 落する傾向（図 15d3 :染色性は 3種の培養細胞のうちで HT1376に近い）の認められ る細胞が混在する。
WHOのグレードである組織異型度と ATBF1の発現が完全に一致するとは言えない 力 WHOのグレードが上がるにつれ、また乳頭状の上皮内尿路上皮癌から浸潤性 尿路上皮癌に移行するにつれ、 ATBF1力 S核〖こ局在、そして ATBF1が細胞質に局在 、さらには ATBF1が欠落すると順番に移行する傾向があると考えられた。従って上記 9- 1.の結果をあわせて考えると、 ATBF1の局在により膀胱癌の悪性度を判定する 事が可能であると思われる。
[0070] 9- 3.胃腺腫、胃癌（胃の生検診断、一連のシリーズ、 Group III〜Group Vと ATBF1 の発現の検討）
異型度の異なる胃腺腫、悪性が確実な胃癌について ATBF1染色 (D1-120を使用） を実施し、 ATBF1の発現局在との関連を検索した。
[0071] 胃腺腫 (ここで示すのは 55歳女性、同一胃内で数個のポリープに対してポリぺクトミ 一が施行された例である）、のなかで胃型の異型上皮巣あるいは腺腫 (Group III、図 16alを参照）は、経過の長い良性病変であることが多ぐ数年の経過観察でも大きさ にあまり変化がない場合があるとされる。本例では ATBF1の染色性は核に限局して おり（図 16a2を参照）、核での p53染色性が存在し（図 16a3を参照）、 p21の核への 導入も認めた（図 16a4を参照)。腸型の異型上皮巣あるいは腺腫 (Group
III)で中等度異型を認める病変（図 16b 1を参照）でも、 ATBF1は主に核に限局し（図 16b2を参照）、胃型の腺腫との染色性の強弱の差はあるものの p53, p21の発現を認 めた（図 16b3、 b4を参照)。これに対し高度異型を伴い境界領域の病変と思われる 腸型の異型上皮巣あるいは腺腫 (Group III、図 16clを参照)では、 ATBF1は細胞質 に顆粒状の染色性を認め（図 16c2を参照）、 p53の発現も軽度散在性であり（図 16c 3を参照）、 p21の核への導入を認めなかつた（図 16c4を参照）。
図 1で示したごとく、核に導入された ATBF1が p53と蛋白一蛋白結合を行って p21を 導入し、細胞周期停止やアポトーシスに関わると考えると、同じ腺腫でも軽度、中等 度異型の場合、核に ATBF1が局在するうちは p21を導入できるが、高度異型と判断さ れるようになると ATBF1が細胞質へ移行し、 p21を導入できないために腺腫の増殖を 止められなくなると考える事が出来る。この結果は ATBF1染色によって腺腫の悪性度 (腺腫は悪性腫瘍ではないので、悪性度というよりは増殖能、アポトーシスに陥りやす さ）を予想する事が可能で、良性病変に留まる腺腫と、癌との鑑別が必要な境界領域 病変との区別に有用であると言える。
以下、各種の組織型の胃癌例にっ ヽて ATBF1染色を施行した結果を示す。
(1)高分化腺癌 (tubl, Group V) :食道上皮下、噴門部に発生した胃癌の一例（78歳、 男性、図 17alを参照）を示す。 ATBF1は癌細胞の細胞質に存在する部位（図 17a2 を参照）、および ATBF1発現が欠落する部位（図 17a3を参照）が混在した。
(2)中分化腺癌（tub2, Group V)
44歳女性の生検例を示す（図 17b 1を参照)。この例では細胞質主体に ATBF1が 存在した（図 17b2を参照)。
(3)低分化腺癌、充実型 (por 1, Group V)
68歳女性の生検例を示す。粘膜内で膨張性の発育を示す porlで（図 18al、 a2、 a 4を参照）、 ATBF1の染色性は、細胞全体で染色性が欠落する部位（図 18a3を参照 )、細胞質での局在を示す部位 (図 18a5を参照）が混在した。
(4)低分ィ匕腺癌、非充実型（por2)及び印環細胞癌 (signet ring cell carcinoma, sig)
72歳女性の生検例を示す。粘膜内および胃壁全層にわたり浸潤性の発育を示す p or2, sig (図 18blを参照）では、 ATBF1は細胞質に限局する染色性が主体であり、核 での染色は全く認められな力つた（図 18b2を参照)。印環細胞癌の部位では（図 19a 1を参照）、 ATBF1は細胞質に存在する細胞および ATBF1の欠落する細胞（図 19a2 を参照）が混在した。
(5)転移性の印環細胞癌 (sig)
74歳のスキルス胃癌、切除不能例である。胆石症のために胆嚢摘出を行った際に 胆嚢への転移が発見された症例である。リンパ管侵襲を経由して胆嚢壁に進展、浸 潤を示した転移先（図 19blを参照)で ATBF1の発現を示す。通常の胃癌原発部に おける印環細胞癌で ATBF1は細胞質に限局する細胞、 ATBF1が欠落する細胞の混 在（図 19a2を参照）を示す。しかし本例の胆嚢への転移を示す部位（図 19blを参照 )では、リンパ管侵襲部位 (図 19b2を参照）、胆嚢壁の結合組織内への浸潤部位 (図 19b3を参照）ともに完全に ATBF1が欠落して ヽた。
(6)AFP産生胃癌
既報 (非特許文献 2, 5, 7)の通り、 AFP産生胃癌の AFP産生部位では ATBF1発現 が完全に欠落した (結果は図示せず)。
まず AFP産生胃癌が非常に悪性度の高い癌である事実を考えれば、 ATBF1発現 が欠落する現象は胃癌の悪性度を著しく高めると予想しうる。上記および現在継続 中の多数の症例での ATBF1発現検索によると、 ATBF1が核のみに限局する部位が 局所的ではあるが高分化癌の一部および、充実型の低分ィヒ癌の一部において見出 す事が出来る。し力し大部分の症例のあらゆる組織型の種々の癌に於いて、 ATBF1 は大部分が細胞質に存在する力 欠落するかのいずれかである。この結果は、胃癌 が全般的に悪性度の高い腫瘍であることを意味しているとともに、細胞質主体の ATB F1染色性が欠落すると、さらに悪性度が高まる可能性を指摘出来ると考える。胃腺腫 、胃癌一連の発現検索を通して、胃においてもやはり ATBF1染色は、腫瘍の悪性度 、あるいは予後の予想に重要な役割を果たし得ると判断した。
9-4.陰茎の乳房外パジェット病
72歳男性、陰茎摘出、鼠径リンパ節郭清を施行した症例を呈示する。パジェット病 は元来、 1874年、パジヱット博士が乳腺の乳頭部で提唱した皮膚疾患の概念である 。実際は乳腺以外の種々の部位にも起こる腺癌であり、初期には組織学的にクロマ チンに富んだ核と豊富で明るい胞体を有する大型のパジェット細胞が表皮内に限局 して存在する（いわゆる上皮内癌、 carinoma in situ)。病態が進行するにつれて真皮 に浸潤、さらにリンパ行性転移、多臓器浸潤を来す悪性疾患である。本症例ではパ ジェット細胞が陰茎皮膚の表皮内に限局する部位、真皮に浸潤する部位、さらに腫 瘤形成を伴う部位、鼠径部のリンパ節転移部位といわゆる悪性度の異なる種々の段 階の病態を同時に観察できたので、 ATBF1発現検索 (D1-120を使用）を各部位につ V、て行つた（図 20aを参照）。
[0074] まず腫瘤形成部からやや離れた部位の陰茎皮膚上皮内を観察した（図 20bを参照 )。 HE染色では大型で明調な胞体を有し、粘液を含有するパジェット細胞の散在を 認めた。真皮への微少浸潤も無ぐ上皮内に限局する癌と判定できる状態である（図 20b 1を参照）。 ATBF1はパジェット細胞の核主体の染色性を認めた（図 20b 2を参照 )。次に腫瘤形成部近傍の表皮内にも連続性にパジェット細胞が存在し、真皮内に 微少浸潤を伴うようになる部位では（図 20clを参照）、 ATBF1は細胞質に染色を認 めるようになり（図 20c2を参照）、核には全く染色性を認めな力つた。さらに浸潤が高 度となり、表皮はびらん状で腫瘤形成を伴う部位では（図 20a、 dを参照）、 ATBF1の 細胞質での存在はより明瞭となった（図 20e2を参照)。しかし腫瘤の表面、内深部で は ATBF1の発現状況は全く異なっており、内部に行くに従い ATBF1は欠落する傾向 が明らかであった（図 20f2を参照)。鼠径部のリンパ節内に転移した腫瘍の大部分は ATBF1が欠落する細胞より構成され (図 20g2を参照)、 ATBF1が少量細胞質に存在 する細胞の少量混在を認めた。遠隔転移を示した癌細胞は悪性度がより高!ヽと ヽぅ 観点から考えると、 ATBF1染色で得られた結果と対応させ、 ATBF1が欠落する傾向 のあるリンパ節転移部の癌細胞、そして腫瘤形成性を示す腫瘍の内部に存在する癌 細胞が最も悪性度が高 、と判断でき、真皮に浸潤を始める部位あるいは腫瘤表面の ATBF1が細胞質に存在する部位は次に悪性度高ぐ表皮内に限局して核に ATBF1 が局在する部位は最も悪性度が低 、と判断できる。つまりパジェット細胞は ATBF1が 核に局在するうちは上皮内に留まり、細胞質に出て浸潤、腫瘤形成を来たし、さらに 発現が欠落する事で転移を起こすとも言 、換える事が可能と考える。この結果は乳 房外パジェット病のごとき腺癌においても ATBF1染色が腫瘍の進展、予後予測に有 用である可能性を明確に示している。
[0075] 9- 5.正常ヒト骨髄造血細胞と ATBF1との関連性の検討
血液疾患の疑!、で骨髄穿刺を施行されたものの正常と診断された症例 (67歳女性 )の検体を使用、ホルマリン固定後に ATBF1染色 (D1-120を使用）を施行した。
[0076] 正常ヒト骨髄は造血のため細胞増殖およびアポトーシスの活発な組織であり、その 細胞群における ATBF1の発現を知ることは癌の悪性度、各種治療の効果を考える上 で参考になると思われる。胎児期の組織以外の成熟したヒトにお 、ては免疫組織学 的に検討する限り、 ATBF1の発現は骨髄でかなり多量であり、細胞質に高度の ATBF 1染色性だけでなく核の染色性をも有した（図 21b、 cを参照)。現在の研究で、細胞 質の ATBF1の発現は増殖性維持を意味し、核での発現は DNA傷害に応じてその細 胞をアポトーシスに陥らせることが容易であることを意味する。従って骨髄での ATBF1 の染色性は骨髄造血細胞が増殖能を維持する細胞群であるとともに化学療法、放射 線の影響を非常に受け易い (骨髄抑制と称する）細胞群であることに矛盾しないと考 えられ、癌の染色性を理解するのに重要な情報を提供してくれると思われる。
[0077] 骨髄で増殖後、アポトーシスに陥るのを免れ、末梢（リンパ節、末梢血）に出た血液 細胞の ATBF1発現は骨髄内とは全く異なり、核での発現は全く無ぐごく一部の細胞 に細胞質での発現が存在するのみであった (リンパ節、各種臓器の静脈内を検索、 図は提示せず)。
[0078] 9-6.小型末梢型肺癌 (小型末梢型肺癌の発生、進展過程検討、悪性度判定にお ける ATBF1の有用性の検討）
近年、画像診断技術の進歩、 CTを使用した検診の普及などに伴い、非常に小型 の末梢発生腺癌が数多く発見されるようになっている。それらは CT上、 gland glass op acity (GGO)として知られ、病理学的には異型腺腫様過形成（adenomatous atypical h yperplasia.AAH)、および限局型細気管支肺胞上皮癌
(Bronchiolo-Alveolar Carcinoma, BAC)、野口分類（Aから C)と診断され、予後に関す るデータが蓄積しつつある。
1999年の肺癌の WHO分類では AAHが記述され、大腸癌で提唱されたごとき adeno ma-carcinoma sequenceの考え方（AAHは大腸腺腫に対応）が導入され、すでに全て の AAHが腺癌に進行する訳では無 、ことや、 AAHを経ることなく発生する de novoの BACの存在も示されている。 GGOで AAHと診断された場合、手術選択の決断 は難しぐ経過観察の判断がなされる場合もある。
一方、 2 cm以下の BACには野口分類が適応される。野口の Type A, Bは、リンパ節 に転移を認めず 5年生存率 100%で非浸潤癌に相当するとされ、 Type
Cは 30%にリンパ節転移を示し 5年生存率 75 %の初期浸潤癌に相当するとされる。 このように GGOとして前癌病変、初期肺腺癌が多数見つけられるようになった現在 、末梢肺腺癌における発癌機構を組織形態学的、細胞生物学的、分子生物学的に 検討し病理学的に記述する事が、治療方針の決定、予後予測などの上から重要な 課題である事は明らかである。し力しながら生検診断、細胞診診断あるいは手術時の 迅速診断などで AAHか BACかの診断は決定的な診断基準を欠き、それほど簡単で はなぐ病理医、外科医にとって悩みの種となっているのが現状である。
[0079] 今回、 CT検診で GGOと診断された 4症例 (low-grade AAHから BAC野口の typeBま で)について、肺腫瘍に ATBF1染色（D1-120を使用）を施したところ、グレードの低い 異型腺腫様過形成 (low-grade AAH),グレードの高い異型腺腫様過形成 (high-grad e AAH)を含む前癌病変の疾患群と、肺胞上皮を置換するように増殖し病巣内部の 間質に活動性の線維芽細胞出現を伴わない限局型細気管支肺胞上皮癌（BAC,野 口の type A, B相当病変)、いわゆる早期非浸潤癌の群を ATBF1の核、細胞質内局 在により明確に区別できる可能性を示すことが出来た。従って小型末梢型腺癌の発 生、進展過程研究、早期発見された癌腫の悪性度判定において、 ATBF1染色の有 用性が注目される。
[0080] まず、前癌病変 AAHの症例として、 78歳女性例、 Low-grade AAHに (図 22aを参照 )ATBF1染色を行い、 ATBF1の局在部位を検索した。一部の細胞において ATBF1の 細胞質局在を認めた力 大部分の細胞では核局在が主体であった（図 22a3を参照） 。次にややグレードの高い腫瘍について、 57歳女性例で、 high- grade AAHの検索を 行った (図 22bを参照)。 Low-grade
AAH同様に high- grade AAHでも細胞質に ATBF1染色性の存在する部位も混在した 1S 核の染色性が主体であった。
[0081] 肺の早期の非浸潤癌に相当する BAC (野口の type A, B相当の腺癌)に関して 77歳 女性 (図 22cを参照）、および 64歳男性の腫瘍 (図示せず)を検索した。肺胞上皮を 置換して増殖する部位 (図 22c4を参照)でも、周囲肺胞組織の虚脱を示し線維増生 を伴う部位（図 22c5を参照）でも、 ATBF1の局在部位は AAH症例の場合とは全く異 なっていた。すなわち野口の Type A, B相当の BACでは、一部 ATBF1の局在が核の 部位が混在するものの、大部分 ATBF1は細胞質主体に局在を示した。 参考までに言及するが、野口の type c相当の初期浸潤癌、さらに進行した浸潤癌 で BACと判断できる腺癌については別に検討を行っている。その結果、 ATBF1はい ずれの症例でも細胞質での局在が主体であった (結果は図示せず)。
現在までの研究によって、 ATBF1の核での存在は p21を介した細胞周期の停止、 化学療法、放射線療法の効き易さを意味すると考えられた。それに対し、 ATBF1の 細胞質の存在は細胞の増殖性が強!、事、各種治療の効き難さを意味すると想定さ れる。上 dのよつに low— grade AAH、 high-grade
AAHでは核主体、 BAC (野口の Type A, B)では細胞質主体と ATBF1発現部位の違い は明らかであった。
今回検討のために選択した症例は、いずれも GGOで、腫瘤の大きさは直径 2cm以 下、さらに肺の部分切除、あるいは肺葉切除がなされている。従っておそらくいずれ もリンパ節転移を来さず、 5年生存率は 100%近くなると予想される。また組織学的に lo w- grade AAH, high-grade AAH, BAC (type
A, B)との最終診断が明確になっている症例に対する ATBF1染色結果であり、 AAHと BACが ATBF1の核、細胞質の局在で区別出来ても、臨床的にはたして意味を持つ のかという疑問もでてくる可能性がある。し力しながら実際の臨床の現場では完全に 切除された腫瘤に対する診断確定を行うという理想的な状況ばかりとは限らない上に AAHと BACの組織学的な鑑別は容易ではないのが実状なのである。例えば、 CT検 診で非常に小さな腫瘤を指摘され、細胞診、あるいは生検を行った小検体に対して 組織学的な観察を通して今後の予後予想、手術適応に関する示唆を行う状況は必 ず生じてくると思われる。そのような場合、 AAH, BACの鑑別はまぎらわしいが、「ATB F1が核に限局するので、 AAHの可能性が高ぐ腫瘍径が特に小さいため、年齢も考 慮して経過観察を行っても良い」と力、「ATBF1が細胞質に限局するので、 BACの可 能性が高ぐ今後の腫瘍の増殖速度が速い可能性も想定し、手術が勧められる」とい うような本当の意味での質的診断が、 ATBF1染色により出来る可能性があると考える 。今後、外科的に切除された末梢小型肺腫瘍に対し、 AAH, BACの判断、野口分類 に加え、 ATBF1染色を施す事で、今後の予後研究のみならず細胞生物学的特性を 検討するのに役立ち、質的な病理診断の精度を上げる事、過剰な外科治療を防ぐ事 にもつながると予想される。
[0083] 9- 7.肺胞上皮癌
正常肺はもともと ATBF1の発現量の多 、組織であり、正常肺組織でも 2型肺胞上皮 細胞などで、量的には少ないが ATBF1染色性 (D1-120を使用）を示す。肺胞上皮癌 (あるいは異型腺腫様過形成）になると、癌細胞の細胞全体の ATBF1量が圧倒的に 増加することが、低倍の顕微鏡観察によっても認められた (64歳男性例、 57歳女性 例を提示、図 23を参照)。従って、 ATBF1染色性が高いという事実だけによつても、 癌組織あるいは前癌病変を正常組織と鑑別できることが期待された。このように、 AT BF1染色法が病理診断初学者にとって役にたつ鑑別手段となりうることが示された。
[0084] 9-8.肺腺癌 (進行した肺腺癌に対する化学療法選択決定の指標となる可能性） 進行した肺癌は手術後再発の可能性が高い。再発、転移に対する治療法は、延命 や、患者に良質な余命を送ってもらうために、ますます重要な選択となる。中でも、増 加を続ける腺癌の治療には定型が無いのが現状である。症例によって、化学療法が 著効を示す場合と無効な場合があり、局所再発、リンパ節や他臓器転移に対し、化 学療法選択の指標が無ぐ無駄な化学療法で患者に負担を強いる場合や、結果的 に手術的摘出が第一の選択肢であつたと後悔する例も存在する。今回、再発肺腺癌 症例 4例、化学療法著効 1例 (65歳男性)、無効 3例、（53歳男性、 65歳女性、 78歳 男性)を用い、初回手術時の摘出標本に対して ATBF1免疫染色を施し比較検討を 行った。
[0085] 摘出標本に対する ATBF1免疫染色 (D1-120を使用、 DAB発色）終了後、実際の検 鏡前の段階で、各プレパラートの状態で肉眼的な観察を行った（図 24al- dl及び a2- d2を参照)。著効例 1例はプレパラートを肉眼的に見ただけで DABの茶色の着色が 濃いことが明らかで、腫瘍の ATBF1発現量が、無効例 3例に比較して明らかに多力つ た。詳細に顕微鏡で検鏡後に観察すると、化学療法が著効を示した症例は腫瘍での ATBF1量力多く、部位により ATBF1の核での局在を認めた（図 25a4を参照、図 24aと 同一症例)。それに対しィ匕学療法が無効であった症例では腫瘍での ATBF1量が少 ない上に、 ATBF1が細胞質のみに局在を示す力 （図 25b4を参照、図 24bと同一症例 )、 ATBF1が欠落する傾向を示した (詳細を図示せず)。 [0086] 化学療法著効例（図 25al-a4を参照、 65歳、男性)及び化学療法無効例（図 25bl -b4を参照、 65歳、女性)を例に取り、化学療法前の CT像、化学療法後の CT像、 HE 染色像、及び ATBF1染色像を検討した。
著効例は組織学的に低分ィ匕の腺癌（図 25a3を参照)で、 CTで、気管気管支リンパ 節の腫脹（図 25alを参照）が明らかであるが、化学療法 4ヶ月でほとんど消失した（図 25a2を参照)。 ATBF1は細胞質に明らかな染色性を示す部位と、核の染色性を示す 部位が混在した（図 25a4を参照)。
無効例は組織学的に高分化の腺癌で (図 25b3を参照)、 CTで、左腎上極に転移性 腫瘍（図 25blを参照）を認めた。化学療法にもかかわらず、 4ヶ月後には腫瘍は明ら かに増大を示した（図 25b2を参照)。 ATBF1の発現は少量で、全てが細胞質に限局 し、核の染色性は認めな力つた（図 25b4を参照)。
[0087] 現在までの研究によって、 ATBF1の核での存在は p21を介しての細胞周期停止、 化学、放射線療法の効き易さを意味すると考え、一方で ATBF1の細胞質の存在は細 胞の増殖性が強い事、各種治療の効き難さを意味すると想定している。今回、化学 療法著効例では腫瘍細胞の ATBF1の発現量が際立って多ぐ核に ATBF1が局在す る腫瘍細胞が混在した。それに対し、無効例は腫瘍細胞の ATBF1発現量は少なぐ ATBF1が細胞質に局在するか、発現が欠落する傾向を認めた。従って ATBF1染色 の結果に基づき、腺癌に対する化学療法選択の成否を予測するともに、患者に無駄 な化学療法の負担 (骨髄抑制、脱毛などの全身的な副作用）を減ずる事、さらに手術 療法など他の治療法選択へのシフトの適切な判断を行うことが可能になると考えられ た。さらに今回の結果は、プレパラートを肉眼的に観察するだけで、 ATBF1量を判断 し、化学療法の効果を大まかに予測できる事を示しており、顕微鏡による詳細な観察 に不慣れな医師に対しても、化学療法選択の正否に対する簡便な資料を提供できる ようになる可能性もある。
[0088] 9- 9.肺小細胞癌
肺小細胞癌は肺癌全体の約 15〜20%を占めて 、る。非小細胞癌と比較した場合、 早期に転移を認めるのが特徴であり、診断時には 70%以上に縦隔リンパ節転移を認 め、約 60%が遠隔転移を有し、剖検の際、遠隔転移を認めないのはわず力 4%であ る。
通常、ほとんどの場合手術適応がないのが特徴で、放置しておくと急速な増大を示 し、有効な治療が施されない場合、ほとんどの症例力 年以内に死亡する悪性度の 高い腫瘍である。腫瘍の増殖速度が速い反面、抗癌剤、放射線治療に対する感受 性が高ぐ腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌などとは著しく異なる臨床上の特徴を有して いる。近年の化学療法を中心とした治療法の進歩により、小細胞肺癌の治療成績は 向上し、治療による明らかな延命効果が期待され、少数ではあるが治癒する症例も 認められている。また一方で、同じ組織像を呈しながら化学療法に不応性を示す小 細胞癌の存在も少な力 ずある事も知られて 、る。
我々は診断目的で、肺の生検が行われた 4症例（78、 52、 67、 70歳いずれも男性 )について、 ATBF1染色（D1-120を使用）を行い、 ATBF1の腫瘍細胞における局在を 検討した。いずれの症例においても小細胞癌の細胞内の ATBF1量は非常に多ぐ細 胞質に染色性を示す部位、核に染色性を示す部位、両方とも染色性を有する部位 の様々な混在を認めた（図 26を参照)。症例によってその割合は種々で一定してな かった。
[0089] 現在までの研究で、 ATBF1の核での存在は p21を介しての細胞周期停止、化学、 放射線療法の効き易さを意味し、 ATBF1の細胞質の存在は細胞の増殖性が強い事 、各種治療の効き難さを意味すると想定している。今回検索した肺小細胞癌腫瘍細 胞では、他に検索した種々の種類の腫瘍細胞に比較して ATBF1発現量が際立って 多ぐ細胞質のみならず、核に ATBF1が局在する腫瘍細胞が種々の割合で混在する 事が特徴であった。この検索結果は、肺小細胞癌が、腫瘍の増殖速度が非常に速い 反面、抗癌剤、放射線治療に対する感受性が高いという特徴に良く合致する事実と 思われる。今後生検された腫瘍切片に ATBF1染色を施し、特に核に ATBF1が局在 する腫瘍細胞の全体での割合を検索する事により、治癒可能な症例 (殆どが核での 染色性を示す事を予測)ある!ヽは化学療法への不応性を示す症例 (殆どの腫瘍細胞 で細胞質での染色性を示す事を予測)を指摘出来る可能性があると思われる。
[0090] 9- 10.神経芽細胞腫
神経芽細胞腫は、小児悪性固形腫瘍のなかでは、最も多い腫瘍で、年齢、病期、 発生部位、遺伝子数や染色体異常などの予後因子が知られ、治療法、予後が左右 される。悪性度予測の判断で治療方針が全く異なり、手術だけで治療を終了する場 合、化学療法だけで治癒する症例も存在するだけでなぐ最近は、自然治癒を期待 し様子を見る場合もある。それに対し、進行した例や悪性度の高い神経芽細胞腫で は、強力で長期間の化学療法が必要で、時に救命のために骨髄移植を用いた超大 量化学療法が必要になる場合もある。従って現在は、予後良好な乳児神経芽細胞 腫にはより軽減した治療を目ざし、予後不良の進行神経芽細胞腫にはより強力な化 学療法のプロトコールの開発を目指す、という動向がある。
年齢、病期、部位といった臨床的な予後因子に加え、生検による種々の予後因子 検査の追加される場合、腫瘍の組織像の他に、 N-mycの増幅の有無、 DNA ploidy検 索（aneuoloidの腫瘍は予後良好で、 diploidや tetraploidの腫瘍は予後不良）、染色体 の異常解析（1番染色体の短椀欠損の存在は予後不良）、 Trk-A, Ha-rasの発現解 析 (これらのタンパク質発現が多 、と予後良好)などの検索が行われる。
[0091] 今回、これらの予後因子検索の補助因子として ATBF1細胞内局在の判定力 有効 か否かを検討する目的で、 9症例の生存例 (男児、女児を含む。全例、発見時 1歳お よび 0歳)および死亡例 3例 (いずれも男児、死亡時それぞれ 10歳、 3歳、 2歳)を用 いて ATBF1染色（D1-120を使用）を行った。その結果、生存例 9症例では、ほとんど の腫瘍細胞において核主体の ATBF1染色性が存在した。それに対し死亡し、剖検し 得た 3例のうち、組織学的に腫瘍が浸潤、転移、脈管侵襲などを示し、腫瘍の悪性度 が高ぐ 11ヶ月の短期間で死亡し、腫瘍自体に起因する腫瘍死と考えられる 2歳男 児の 1症例にぉ 、て、殆どの腫瘍細胞で ATBF1が細胞質に局在して 、た（図 27を参 照)。この結果は、 ATBF1染色による細胞質主体の染色性の存在が、悪性度の高い 腫瘍群の判断材料の一つとなりうる事を示唆している。
[0092] 9- 11.消化管間質腫瘍 (GIST)、GISTの予後予想における ATBF1の有用性の検討 消化管に発生する間葉系腫瘍において、組織学的に平滑筋や神経細胞の形質を 併せ持つ腫瘍、いずれの形質も有さない腫瘍の存在が明らかになつてきており、消 化管間質腫瘍、 gastrointestinal storomal tumor (GIST)という概念が確立してきている 。 GISTは消化管自動運動のペースメーカー細胞である力ハール介在細胞由来とさ れ、未分化間葉系細胞抗原である CD34、および c-kitタンパク質 (CD117)が診断時 のマーカーとして使用される。腫瘍ィ匕の機序には c-kit遺伝子の機能獲得性突然変 異によるチロシンキナーゼの持続的活性ィ匕が関与している。 GISTに対する有効な治 療法の第一選択は外科的手術療法であるが、完全切除が出来ても再発転移を起こ す例が知られている。最近、チロシンキナーゼ阻害剤 (メシル酸ィマチ-ブ）が胃原 発 GISTの再発転移例に有効であるとの報告がされ、再発予防、切除不能例の治療 薬として臨床使用が開始された。 GISTの良、悪性の絶対的な判定基準は遠隔臓器 への転移と周囲臓器への浸潤の有無である。しかし予後予想と!/、う必要性から現在 では腫瘍の大きさが重要な基準として使用されている。 2cm以下は超低リスク (経過 観察）、 2から 5 cmは低〜中リスク（手術も考慮）、 5cm以上は高リスク（手術）とするな どの基準が使用されている。その他、細胞密度、核分裂像の有無、患者の年齢、腫 瘍の発生部位、 DNA aneuploidy, MIB 1 labeling indexなどの有用性も指摘され、現 状ではこれらの指標を組み合わせて、予後予測を行わざるを得な 、。
今回 GIST2例について ATBF1染色（D1-120を使用）を行い、核、細胞質の染色性 を検索し、 GISTの新しい予後予測のマーカーになる可能性を検討した。発見時 2.0 X 1.8 cmで、良性に経過し再発も認めない胃の GIST1例（52歳男性）、および発見時 3.3 X 2.9 cm,腹膜播腫を来たし 5力月後には死の転帰をとつた結腸原発 GIST (58歳 の女性）の 2例について ATBF1染色性を図 28に示す。尚、図 28は上下段ともに、左 カゝら順に HE染色像、 c-kit (CD117)染色像、及び CD34染色像、 ATBF1染色像を示 す。
臨床的に再発傾向の無い、胃原発 GIST (図 28の上段、 CD117陽性、 CD34陽性） では全ての組織部分で、核に ATBF1の染色性を認め、細胞質の ATBF1染色性は散 在性で、軽度であった。それに対して、腹膜播腫で死去した結腸原発 GIST症例（図 2 8の下段、 CD117陽性、 CD34陰性)では核の ATBF1染色性も残存した力 大部分の 細胞の細胞質にぉ 、て高度で、顆粒状の ATBF1染色性が存在した。
現在までの研究で、 ATBF1の核での存在は p21を介する細胞周期の停止を意味し 、細胞質での存在は細胞の増殖傾向が強い事を意味することが想定されている。今 回再発傾向の無い GISTおよび、増大傾向が著しくすでに患者が死去した GISTでの ATBF1発現の違いは明らかであった。外科的に切除、生検された GIST検体に ATBF 1染色を施し、染色性が核か細胞質かを明らかにする事により、腫瘍の再発、発育傾 向を知り、予後や、各種治療追加の必要性を予測することが可能になると考えられる
[0094] 9- 12.髄膜腫 (髄膜腫の病理診断、予後予想における ATBF1の有用性の検討） 脳腫瘍のひとつである髄膜腫は髄膜皮細胞由来で、比較的緩徐な経過を取り、脳 腫瘍全体の中では予後の良い腫瘍である。圧倒的に良性腫瘍が多いが、稀ながら 組織型によって悪性の経過を迪るものがあり、 WHOにより組織型に対応して低異型 度から高異型度まで Gradingされている。 MIB1 labeling indexなどが予後予想として 使用されているが、その予後予測は容易でないのが現状である。今回、良性に経過 し再発も認めない低異型度髄膜腫 2例、 60歳女性、（線維性髄膜腫 WHO grade 1)、 68歳男性 (髄膜皮性髄膜腫 WHO grade I)と、再発および激しい出血を繰り返した 中間異型度髄膜腫 1例、 52歳女性（異型性髄膜腫 WHO grade Π)、組織型から今後 の経過観察が必要と思われる中間異型度髄膜腫 1例、 63歳男性 (明細胞髄膜腫 W HO grade II)について、 ATBF1染色（D1-120を使用）を行った。
[0095] 染色結果を図 29に示す。図 29は各症例の HE染色像 (al, bl, cl, dl)、 ATBF1染 色像 (a2, b2, c2, d2)である。臨床的に再発傾向の無い、線維性髄膜腫（低異型度 g rade I、図 29al, a2)、髄膜皮性髄膜腫 (低異型度 grade I、図 29bl, b2)では全ての 組織部分にお!、て核に ATBF1の染色性を認め、細胞質の染色性は全く認めなかつ た。
一方、すでに再発出血を繰り返す異型性髄膜腫（中間異型度 grade II、図 29cl, c 2)、および組織学的に腫瘍の増殖速度が速いとされ、今後の再発の可能性が高いと 予想される明細胞髄膜腫（中間異型度 grade II、図 29dl, d2)では核の ATBF1染色 性、核と細胞質の ATBF1染色性、細胞質のみの ATBF1染色性を示す細胞が混在し た。
現在までの研究で、 ATBF1の核での存在は細胞周期の停止、化学療法、放射線 療法の効き易さを意味し、一方で細胞質での存在は細胞の増殖性が強い事、各種 治療の効き難さを意味している。今回 Grade I, Grade IIの腫瘍での ATBF1発現部位 の違いは明らかであった。今後、外科的に切除された髄膜腫に ATBF1染色を施す事 で、組織型にかかわらず髄膜腫の gradeを予測出来る可能性 (例えば細胞質の染色 を見つけたら少なくとも中間異型以上を疑う事が出来る）、さらには再発の可能性を 考慮し、各種治療追加の必要性などを予測できる可能性が示唆されると考える。
[0096] 9 13.前立腺癌
高齢化に加えて、生活習慣、食餌の欧米化などが原因で、前立腺癌は年々増加し ている。前立腺特異抗原 Prostate-specificantigen(PSA)検査の日常診療への導入に より早い段階で発見されるようになったことも症例数増加の一因である。一般的に前 立腺癌の進行は遅 、と 、われ、高齢者の前立腺癌は無治療で経過観察のみと 、う 方針も採用されることがあるが、長期間経過観察後の死亡率の上昇を予防するため の外科手術、内分泌療法、放射線療法など局所療法の有用性も証明されてきている 。最近の診断は血清中の PSA値の上昇によりスクリーニングし、経直腸的超音波下に Systematic biopsy (14力所など)を行うのが一般的である。前立腺癌は一般に腺癌で 、 Gleasonによるグレードシステムが汎用される。このシステムは治療方針決定、予後 との関連についてよく整理されている力 正確ではない場合もあり、理想的な grade sy stemにつ 、て病理学者の間でまだ議論がある。
[0097] 今回、 ATBF1染色による ATBF1局在部位の評価が前立腺癌の悪性度判定の一助 となる可能性を探るために、 61歳、 66歳、 76歳男性症例の前立腺癌生検検体に AT BF1染色（D1-120を使用）を施して Gleason gradeと染色性の比較検討を行った（図 3 0を参照）。 Gleason gradeが低ぐ組織学的に高分化である前立腺癌 (Gleason grade 3A)では ATBF1が核に限局する傾向を認め、 Gleason gradeが高ぐ低分化で浸潤傾 向の明らかな前立腺癌 (Gleason grade 5B)では ATBF1の存在が細胞質に限局する 傾向を認めた。しかしながら Gleason gradeが中間で、組織学的に中分ィ匕と判断され る前立腺癌 (Gleason grade 3B-4B)では ATBF1の局在部位は症例、部位により核、細 胞質での染色性が混在していた。 Gleason gradeと ATBF1の局在が完全に合致する わけではないが、大きな傾向として、 ATBF1の局在の差異が Gleason gradeの高低と 力なりの程度で平行する可能性が高いと判断した。
現在までの研究で、 ATBF1の核での存在は細胞周期の停止、化学療法、放射線 療法の効き易さを意味し、一方で細胞質での存在は細胞の増殖性が強い事、各種 治療の効き難さを意味している。今回の結果は、生検前立腺癌組織を検索する際に 、 Gleason gradeを決定する事に加え、 ATBF1の細胞内局在の検索を組み合わせる 事により、患者の予後判定、治療方針決定のためのより正確な指標を提供できる可 能性を示すものである。
9 - 14.その他の腫瘍における ATBF1発現解析
現在までに検索した上記以外種々の腫瘍における ATBF1染色 (D1-120を使用）結 果を以下に列挙する (いずれも図示せず)。
(1) 64歳男性、悪性リンパ腫 (Mature
B- cell neoplasm, Mantle cell lymphoma) ; ATBFlは細胞質に存在する部位を認めた 力 大部分の腫瘍細胞で欠落する傾向を示した。
(2) 40歳男性 左精巣腫瘍、 (Embryonal
carcinoma 80%, Yolk sac tumor 20 %); ATBFlは細胞質に局在するか、欠落するかの いずれかであった。
(3) 62歳男性 C型肝硬変に合併した肝癌（moderately to poorly differentiated hepa tocellular carcinoma);腫瘍の辺縁部で周囲被膜に接する部位では ATBFlが細胞質 に存在する傾向を認めた。しかし腫瘍の中心部位になるに従い ATBF1が欠落する傾 向を示した。
(4) 85歳女'性、鼻のネ申 牙細包腫 (olfactory neuroblastoma of hight grade malignanc y)； ATBFlはほとんど全ての細胞で細胞質に限局した。
(5) 88歳女性、悪性リンパ腫 (Mature
B- cell neoplasma, Follicular lymphoma, Grade I);ほとんどの腫瘍細胞で ATBFlは細 胞質に局在した。
(6) 48歳男性、前縦隔腫瘍 (Seminoma);
ほとんどすべての細胞で ATBFlは細胞質に局在した。
(7) 56歳男性、胸膜腫瘍 (Malignant
mesothelioma)；ほとんどすべての細胞で ATBFlは細胞質に局在した。
(8) 33歳男性、再発性脳腫瘍 (Hemangiopericytoma, WHO Grade III);ほとんどすべての細胞で ATBFlは細胞質に 局在した。
(9) 43歳女性、甲状腺癌
(Papillary carcinoma); ATBFlが核に局在を示す部分、細胞質に局在を示す部分の 混合であった。
(10) 54歳男性の下垂体腫瘍 (pituitary
adenoma);一部細胞質に ATBFlが局在する部位が混在した力 大部分の腫瘍細胞 で ATBF1は核に局在した。
(11) 25歳男性、脾腫瘍
(Endocrine tumor);ほとんどすべての腫瘍細胞で ATBFlは核に限局した。
(12) 58歳女性、手掌腱膜腫瘤 (Dupuytren's
palmar fibromatosis);大部分の腫瘍細胞で ATBFlは核に局在した。
実施例 10
<4種類の抗体（Dl-120、 NT440、 1-12, AT6)の併用による悪性度判定 >
10- 1. ATBF1-Aの N末端を認識する 2種類の抗体（NT440、 1-12,図 31を参照）と ATBF1の C末端を認識する抗体 (AT6、（図 31を参照)）の作製
まず、以下の手順で各抗原を調製した。
(1)抗体 NT440の場合 (ポリクローナル抗体）
ヒト ATBFl- A (非特許文献 1を参照）の 3種類のアミノ酸残基（4〜15： CDSPWSGK DNG:配列番号： 6)、（429〜445： £KSSEGKDSGAAEGEKQE:配列番号： 7)、（500〜 516:£PSELDEELEDRPHEEPG:配列番号： 8)の合成ペプチドを混合してペプチド抗 原として使用した。尚、配列番号： 7および 8の合成ペプチドの N末端の下線を付した £は合成ペプチドの安定性を確保するために本来のヒトのアミノ酸配列に追カ卩してあ る。
(2)抗体 1-12の場合 (モノクローナル抗体）
ヒト ATBF1-Aのアミノ酸残基（143〜155:£IVESLS QLTQGGG:配列番号： 9)の合 成ペプチドを使用、 N末端に £ (下線付き）を付加するとともに、 148番のセリン（下線 付き、右肩に 148と付記）をリン酸ィ匕したペプチドを抗原として使用した。従って、この 抗体は ATBF1-Aの 148番のセリンがリン酸ィ匕されている場合のみを認識するように設 計してある。
(3)抗体 AT6の場合 (ポリクローナル抗体）
ヒ卜 ATBFト A, B共通のアミノ酸残基（3405〜3549： PGAPSPDKDPAKESPKPEEQK
Figure imgf000076_0001
ESALCGEEALSQHLE:配列番号： 10)をグルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)に融 合した組み換えペプチドを抗原として使用した。
[0100] 調製した各抗原を用いて抗体 (ポリクローナル又はモノクローナル)を作製し、精製 した。ポリクローナル抗体の作製、精製は D1-120抗体の項で記載した方法と同様の 方法で、モノクローナル抗体の作製、精製は様々な文献及び成書同様の方法を使 用した (例えば、「酵素抗体法、改訂第 3版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画）
[0101] 以下に示す実施例はいずれも免疫組織学的検討の結果である。 D1-120以外の抗 体 (NT440, 1-12, AT6)を使用した染色を行った場合も D1-120に使用した条件と同様 の抗原賦活条件を選択することにより、細胞 (正常、癌細胞を含む）における核およ び細胞質の ATBF1の局在の差異を良好に染色することが出来た。従って 4種類すベ ての抗 ATBF1抗体の使用は 10mMクェン酸緩衝液 (pH6.0)を使用し圧力釜で 4分間（ 110°C)熱処理することが最適と判断した。
[0102] 10- 2.正常リンパ節 Bリンパ球における ATBF1、 AT6部分の発現と Be卜 2発現の関 連の検討
71歳の男性、肺の気管支周辺の正常リンパ組織のリンパ球における、 ATBF1発現 (NT440, 1-12, Dl-120, AT6)を検討した。リンパ組織には Bリンパ球の成熟の場で あるリンパ濾胞が含まれている。リンパ濾胞の中央部には胚中心があり、 Bリンパ芽球 が存在し分裂増殖を行っている。この部位では Be卜 2の発現が欠落しており（図 32A を参照）、細胞の分裂増殖が盛んであると同時に、細胞のアポトーシスへの移行も頻 度が高ぐアポトーシスに陥った細胞を処理する異物を貪食するマクロファージ (Tingi ble body macrophage)が規則正しく配置されている。それに対して周辺の辺縁領域 は分ィ匕を終えた成熟 Bリンパ球が貯留される場でこれらの Bリンパ球には高度の Beト 2発現を認める（図 32Aを参照)。 Be卜 2タンパク質はミトコンドリア力も細胞質へのシト クロム cの放出を抑制する事によりアポトーシス抑制性に機能する。すなわち辺縁領 域に蓄えられた正常 B細胞はアポトーシスを抑制する機能を獲得している訳である。 さて NT440, 1-12, D1-120で得られる ATBF1の染色性は胚中心、辺縁領域 Bリンパ 球で特に差異はなぐ NT440, 1-12は核主体、 D1-120の染色性は非常に弱く少量で あるが細胞質と核に染色性を認めた（図 32C, D, E、図 33B, Cを参照)。それに対し 、 AT6は胚中心と辺縁領域で明らかに染色性が異なった（図 32B1を参照)。胚中心 では核主体、辺縁領域では細胞質主体であった（図 32B2, B3、図 33B, Cを参照）。
ATBF1は癌遺伝子タンパク質 c-mybと蛋白—蛋白結合を行い、その機能を抑制す ることが知られる（非特許文献 8を参照)。細胞周期停止、アポトーシスへの移行に関 し、 Mybタンパク質ファミリ一は Be卜 2を導入し、細胞のアポトーシスを抑制する機能が め Oと考 られ飞 ヽる (<jrassilli, E. et al. Resistance to Apoptosis in CTLL— 2 Cells Overexpressing B-Myb Is Associated with B—Myb— dependent bcl-2 Induction, CAN CER
RESEARCH 59, 2451-2456, 1999を参照）。追加検索の範囲ではまだ直接的な証明 には至っていないが、今回の正常の Bリンパ球での検索結果は、 ATBF1遺伝子エタ ソン 11に対応する AT6部分が核で Myb癌遺伝子タンパク質との相互作用を介し、 bcl -2遺伝子の抑制に関与している可能性を示すと発明者らは理解している（図 33Bを 参照)。さらに B細胞の成熟、移動に伴って、核で機能を果たしている AT6部分が細 胞質に移行すると、 be卜 2遺伝子に対する抑制がはずれるために リンパ球は Be卜 2タ ンパク質を発現出来るようになる可能性が示唆される（図 33Cを参照)。この ATBF1の AT6部分の核から細胞質への移動は ATBF1が Dl-120, AT6の中間位置でプロセッ シングされて機能する事を想定させるとともに、 Beト 2タンパク質を発現しアポトーシス カゝら逃れる機序を獲得して ヽる腫瘍にぉ 、て AT6部位が核に存在すれば、 Be卜 2発 現が抑制されるため、その腫瘍の悪性度は低いと判定でき、 AT6部位が細胞質に移 行していれば、 Be卜 2発現の抑制が解除されるため、悪性度はより高いと判定できる 事を示すと思われる（図 33を参照)。 [0104] 10 - 3.培養腫瘍細胞における ATBF1タンパク質の発現 (Dl-120を使用したウェス タンブロッテイングによるタンパク質断片の検討）
10- 2.で想定された ATBF1が ヽくつかの部位で切断されて細胞の各分画で機能 する可能性を確認するために、ヒト神経芽細胞腫由来の培養細胞株、 NB1, GOTO ; マウス未分化胚性癌細胞株 P19、以上 3種類の培養細胞を使用し抗 ATBF1抗体 (D1 -120)を使用した SDS-PAGE,
ウェスタンブロッテイングを行った。 P19, NB1, GOTO,それぞれ血清入り培養液で培 養した状態の細胞を採取して検索を行った対照群と、レチノイン酸処理 (P19は 4日間 ； NB1と GOTOは 24時間）による神経細胞分化誘導群に分けて検索した。ただし、 P19細胞の培養法は他の 2種の細胞株とは異なり、まず 4日間 bacterial grade dish上 に細胞を浮遊させた状態でレチノイン酸 (濃度 5x10— 7モル)処理を行い、その後、レ チノイン酸を除去した血清入り培養液で、通常の tissue
culture dishに移し 3日間継続して培養した。この方法で P19細胞は神経突起が認め られる-ユーロンへ分化誘導された。
[0105] 以下に Immunoblot分析の手技の概略を示す。手技の詳細は非特許文献 3に記載 してある。
(SDS- PAGE,ウェスタンブロッテイング（Immunoblot分析）
1) P19, NB1,
GOTOいずれの種類の培養細胞も tissue culture dishに付着培養後レチノイン酸で 神経分化誘導を行った。ただし、 P19細胞の神経分化誘導法は 3— 1. に記述のごと き手順を取った。
2)培養過程を終了した細胞は培養皿力 剥がして PBS(pH 7.4)に浮遊させた。浮遊 細胞は 200 g、 10分間遠心でペレット状に集め、 proteinase inhibitorを力卩ぇ氷冷した 1 ysis buffer(10
mM Tris-HCL, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X- 100)に再浮遊させ た。細胞浮遊液は 10分間、氷上に静置した後に、 15, 000 gで 20分間遠心し、 Triton に可溶性なフラクション部分をサンプルとし、 sodium dodecyl
sulfate— polyacrylamide gel electrophoresis (SD¾— PAGtyに使用した。 3)サンプルは
SDS- PAGE sample buffer (0.0625 M Tris- HC1, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β - mercaptoethanol)と混合し、 2分間煮沸した。 21, 880 g、 4°Cで 30分間遠心後、上 清を分離し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。 ATBF1-A全長の分子量は 404k Daであるので、 SDS-PAGEのためのゲルは 4 %を選択した。タンパク質はゲル各レー ンに 20 gずつマウントした。
4)電気泳動後、ゲル内のタンパク質は polyvinyldifluoride (PVDF)メンブレンに電気 的にトランスファーさせ、免疫染色を施行した。
5)メンブレンを Block
Ace (雪印乳業、 日本)で室温 1時間ブロッキングを行った。
6)抗 ATBF1抗体， D1-120を 0.5 μ g/mlとなるように Bolck Aceに溶解し、一次抗体溶 液中にメンブレンを浸透させ、室温で 2時間反応させた（一次抗体反応)。
7)洗浄後、 DAKO
Envision+ (DAKO社、デンマーク）と 30分反応させ洗浄、さらに ECL-kitで発色を行 い、最終的に Hyperfilm ECL (いずれも Amersham Pharmacia Biotech社製、 Buckingh amshire,
英国)で感光、観察を行った。
(結果）
P19細胞ではレチノイン酸処理をしな 、場合、 ATBF1(D1-120部位で指摘)発現は ほとんど認めなかった（図 34レーン 2を参照）。しかしレチノイン酸処理を施すと、 404k Daの部位のタンパク質 (ATBF1-Aのフルサイズに相当）のタンパク質発現が増加した (図 34レーン 3を参照)。未分化状態で P19細胞が ATBF1の発現を示さず、レチノイン 酸処理により神経細胞への分化を開始する時に劇的に ATBF1発現を示す事は mRN Aレベルでは報告されていた事実であり、 404kDa (ATBFl-Aに相当）、 306kDa (ATBF1-Bに相当）のタンパク質が検出されることが予想されていた。今回、さらに小 さな断片である 230, 210 kDaにバンドを認めることが新たな事実として明らかになった 次に、 NB1ではレチノイン酸処理前にすでに P19同様の全長 404-kDaのタンパク質 発現を認めた（図 34レーン 4を参照）、さらにレチノイン酸処理により、 ATBF1の全長 4 04-kDaより小さな、 210kDaのタンパク質が主体となる事が明ら力となった（図 34レー ン 5を参照)。
GOTOではレチノイン酸処理に反応せず、処理前後でタンパク発現量の変化が無 ぐ最初からすでに 230kDa, 210kDaと小さなサイズのタンパク質発現が主体であった (図 34レーン 6, 7を参照）。 GOTOにおける小さなサイズ主体の ATBF1発現と、 404- kDaの ATBF1が検出できない事実は、タンパク質が細胞質で出来ると同時にすベて がプロセッシングを受けて分断されてしまう可能性と、 GOTO特異的なェクソンの使 ヽ 方により小さなサイズのタンパク質をコードする mRNAが作られて、 404-kDaのタンパ ク質が発現出来な!/、機序が存在する可能性をもある。
10-4.胃 GISTにおける ATBF1、 AT6部分の発現と Be卜 2発現の関連性の検討
52歳の男性、胃に発生した GIST (Gastrointestinal stromal tumor)における ATBF1 発現 (NT440, 1-12, Dl-120, AT6)を検討し Be卜 2タンパク質の発現と比較した。本例 は c-kit陽性、 CD34陽性（図 35A,
Bを参照）、胃粘膜下に限局する径 20x18x20 mmの腫瘍で、他臓器への転移は無ぐ 核分裂像は高倍率 50視野に 2個、壊死、出血も認めてない。従って臨床的に良性に 準ずる取り扱 、で良 、と判断されて 、る。 D1-120を使用により検出可能な ATBF1部 位は腫瘍全体いずれの部位でも核に集中する染色性が主体で（図 36C1, C2を参照 )悪性度は低 、と判定できた。さらに詳細な検討のために腫瘍内での Be卜 2タンパク 質発現を 4種類の抗体を使用した ATBF1発現と比較したところ、 NT440, 1-12も D1-1 20同様核主体の発現を示したが（図 36A, B, Cを参照）、 AT6による染色性は他の抗 体による染色性とは異なる部位が見出された。すなわち腫瘍部位により AT6染色性 が明らかな部位と AT6染色性が欠落傾向を示す部位がそれぞれ散在性に認められ た（図 35Cを参照)。そのまだらな散在する染色傾向を Bd-2発現と比較すると、その 発現は相補的であり（図 35Dを参照）、 AT6の発現を認める部位では Be卜 2の染色性 が欠落し、逆に AT6の発現が欠落する部位では Be卜 2の染色性を認めた。次に AT6 局在の詳細を細胞レベルで確認した。 AT6発現を認める部位では、細胞の細胞質に も染色性が観察されたが、染色性は核主体（図 36D1を参照）で Bd-2発現はほぼ完 全に抑制されていた（図 36E1を参照）。一方 AT6が細胞質に少量局在する力、核細 胞質ともに欠落傾向を示す部位（図 36D2を参照)では Bd-2発現は全く抑制されず、 核周囲での発現を認めた（図 36E2を参照）。
[0108] この現象は前述したリンパ濾胞部位と同様に、 ATBF1遺伝子ェクソン 11に対応す る AT6部分が核で Myb癌遺伝子タンパク質との相互作用を介し、 be卜 2遺伝子を抑制 すると考える事で説明できる (非特許文献 8を参照)。この AT6部分の局在、染色性の 有無のバリエーションは ATBF1が Dl-120, AT6の中間位置（図 36F, Gを参照）でプ ロセッシングされる事を示し、核へ移行できずに細胞質に局在する AT6部分はやがて タンパク分解を受けて消失し同部位の担う機能を失う事が想定された。つまり GISTの ごとぐ腫瘍内のある部分のみで Be卜 2タンパク質が発現しアポトーシス力も逃れる機 序を獲得している腫瘍において、 AT6部位の発現量が多ぐ核局在が主体であれば 、 Be卜 2発現が抑制されるため、その腫瘍部分は腫瘍全体の中で悪性度はより低いと 判定でき、 AT6部位が細胞質に移行あるいは欠落していれば、 Bcl-2発現の抑制が 解除されるため、その腫瘍部分は腫瘍全体の中で悪性度はより高いと判定できる事 を示すと思われる。このように臨床的に良性とする扱いでよいと判定され、さらに D1-1 20染色で、 ATBF1の D1-120部位が核に存在するため腫瘍全体として悪性度は高く ないという判定がなされる腫瘍においても、 AT6を追加した悪性度の検索結果力 よ り詳細な判断であることは明らかであり、 AT6が細胞質あるいは欠落する部位の多寡 を検索する事が、この種の腫瘍の再発、転移の起こりやすさを予知する指標となる可 能性を示唆している。
[0109] 10- 5.悪性リンパ腫（大細胞びまん型 B細胞）における ATBF1のプロセッシング位 置、さらに AT6部分の発現と Be卜 2発現の関連性の検討
56歳の女性、右鎖骨の上部、右腋窩リンパ節の直径 3cm大の腫大を認めたリンパ 腫。病理学的にびまん性大型の細胞の増殖で（図 37Aを参照）、 Bリンパ球のマーカ 一を含む LCA, CD20 (図 37Bを参照)，
CD79aが陽性であり、腫瘍細胞のほとんど全てに Be卜 2タンパク質の発現を認め（図 3 7Eを参照）、悪性リンパ腫 (大細胞びまん型 B細胞）と判断した。この悪性リンパ腫に おける ATBF1発現（NT440, 1-12, Dl-120, AT6)を検討し Be卜 2タンパク質の発現と 比較した。
[0110] ATBF1の N末端を認識する NT440, 1-12は腫瘍細胞の核主体（図 38A, Bを参照） 、 ATBF1の中央部を認識する Dl-120、 C末端を認識する AT6はいずれも細胞質主 体の染色性（図 38C, Dを参照）を示した。 D1-120の染色性が細胞質主体であること はこの腫瘍の悪性度が高い事を意味する。悪性リンパ腫は一般的に悪性度の高い 腫瘍として知られ、ほとんど全ての細胞が PCNA陽性（図 37Dを参照）を発現する事も D1-120での悪性度の判断が的確である事を支持して 、る。 AT6の染色性がすべて 細胞質に存在する事は、前述したリンパ濾胞辺縁部位、あるいは GISTの腫瘍の一部 と同様であり、 ATBF1遺伝子ェクソン 11に対応する AT6部分が核に存在しな 、ため 、 bcl-2遺伝子を抑制出来ないと考える事で説明できる（非特許文献 8を参照)。
まとめると、この悪性リンパ腫は D1-120の染色性が細胞質主体であり、さらに AT6の 染色も細胞質主体で悪性度は高!、と判断できた。また 4種類の抗体の染色局在の比 較により ATBF1タンパク質がその中間位置でプロセッシングを受けている可能性が指 摘できる（図 38Fを参照)。
[0111] 10-6.脳の多形膠芽腫における GFAP発現と ATBF1タンパク質のプロセッシング位 置の関連性、さらに AT6の染色性局在と Be卜 2, Be卜 xL発現の関連性の検討
63歳の男性、大脳半球に発生した多形膠芽腫である。この腫瘍における ATBF1発 現（NT440, 1-12, Dl-120, AT6)を検討し GFAP, Bcl-2, Be卜 xLタンパク質の発現、 細胞増殖のマーカーである MIB1発現と比較検討を行った。
Glioblastomaは中高年に好発し、脳腫瘍なのかでも頻度の高い悪性膠腫である。 肉眼的にも組織学的にも多彩な像を示すので、 glioblastoma multiforme (多形膠芽 腫）と称される。組織に腫瘍内には大小の壊死巣が存在し、 pseudopalisading necrosi sが特徴である。一般にグリア系悪性腫瘍で、 Glial fibrillary acidic protein (GFAP) はグリア系細胞を特定する事を目的に使用される。脳腫瘍取り扱い規約には「免疫 組織ィ匕学的に GFAPがー部の細胞に発現される。陽性細胞の頻度と形態は極めて 多様である」とある。この文章における頻度、形態が多様であると言う事はつまり GFA P発現と腫瘍部位との関係は未だ明確にされてない事を意味すると思われる。
上述のように、 ATBF1の核、細胞質移行の機序解明の端緒となったのは Yeast two -hybrid法での ATBF1と GFAPとの蛋白 蛋白結合の証明であった。結合部位は AT BF1-Aのほぼ中央部と GFAPタンパク質の C末端である事、さらにはルシフェラーゼ 分析で ATBF1は GFAPのプロモーター活性を上げる事が明らかになつている。 4つの 抗体を使用する事によって、理論的に予測されていた分子機構が、実際の多形膠芽 腫の臨床検体によて証明することができた。
今回、まず発明者らは、充実性の胞巣を形成する腫瘍部位と、壊死巣およびその 周辺部位で GFAP発現を比較した。図 39A1に示すごとき充実性の増殖部位では,ほ とんど全ての細胞に強い GFAP発現を認めた（図 39A2を参照)。本腫瘍は出血、壊 死の頻度が高い事が知られる。図 39B1の矢印で囲んだ部位は壊死組織とされる部 位であり、増殖が強ぐ栄養のための血流がおぼっかず（阻血）、壊死や脱落を起こ した結果と解釈される。壊死巣及びその近傍で GFAP発現を観察すると、壊死に乏 しい充実性の部位に比較して、生存細胞で GFAP発現が微弱であるだけでなぐ壊 死組織にも GFAPタンパク質は全く検出されな力つた（図 39B2を参照)。これは壊死 を起こした細胞の残骸にも GFAPが染色されないことを意味し、壊死に陥ったのはもと もと GFAP発現の無 、細胞であった可能性を示唆して 、る。
次に腫瘍内で GFAP発現の有無が明確に区分けできる部位を選択して、両部位に おける ATBF1発現 (NT440, 1-12, D1- 120, AT6),Bcl-2, Be卜 xLタンパク質発現、 MIB 1発現との比較検討を行った。腫瘍内で観察される GFAPの発現の有無の差異によ る染色パターンの模様（図 40A)は、 D1- 120 (図 40B) , AT6(図 40C), MIB1 (図 41A), Be卜 2 (図 41 B) ,
Be卜 xL (図 41C)で出来る染色パターンの模様と酷似していた。詳細な観察により、 GF AP産生の欠落する部位 (図 40al)では、 D1-120は核主体 (図 40bl)、 AT6も核主体 (図 40cl)であり、 MIB1 labeling indexは低く (図 41al),Bc卜 2(図 41bl), Bd-XL (図 41cl) 発現は欠落傾向にあった。それとは逆に、 GFAP産生をしめす部位 (図 40a2)では、 D 1-120は細胞質主体 (図 40b2)、 AT6も細胞質主体 (図 40c2)であり、 MIB1
labeling indexは高く (図 41a2),Bc卜 2(図 41b2), Be卜 xL (図 41c2)発現はともに高度とな る傾向にあった。
ATBF1発現の中で N末端を検出可能な NT440, 1-12は GFAP産生の有無にかかわ らず核主体の発現を示した (図 42A, Bを参照)。
[0113] 本腫瘍に対し、 ATBF1を使用した悪性度判定法を行うと、腫瘍の内部で GFAPを発 現する部位は、 Dl-120, AT6は核主体に存在し、悪性度が低いと判定され、この部 位は化学療法、放射線療法に反応してアポトーシスへの移行が容易と予想される。こ れに対し GFAPを発現する部位では、 Dl-120, AT6が細胞質主体に存在し、悪性度 が高く化学療法、放射線療法に反応が悪いと予想される。すなわちこの多形膠芽腫 は悪性度の高 、部位、低 、部位の混在する腫瘍であるが故に多形性を示して 、ると 考免らる。
実際の多形膠芽腫は手術、化学療法の発達にもかかわらず現在も高悪性の腫瘍と され、発見されて力も一年以内に 80%が死亡し、 5年生存率の改善もほとんど期待 出来な 、状況が続 、て 、る。化学療法で一時的に腫瘍の縮小を見ても 、ずれは残 存する治療抵抗性の癌細胞が再増殖して再発、進展し患者を死に至らしめる機構が ATBF1染色によって理解できる。
[0114] 10- 7.脳の多形膠芽腫、 GFAP発現と腫瘍悪性化仮説
A. ATBF1と GFAPとの蛋白 蛋白結合 (細胞質での出来事)。
B. ATBF1の導入による GFAPプロモーター活性の刺激 (核内での出来事)。
C. GFAPの産生の有無による、 ATBF1の Dl-120, AT6部位の細胞内局在変化と細 胞増殖 (MIB1)、アポトーシス抵抗性 (Be卜 2, Bcl-x )の相関。
し
上記 A, B, Cの事実より発明者らは以下のごとく腫瘍発生から、増殖進展の仮説を 考え、 ATBF1局在と GFAPの関係を考察している。
(1)膠芽腫発生の初期、腫瘍の増殖が始まる。当然腫瘍血管も増生するが、阻血を 起こし腫瘍細胞に DNAダメージが加わると ATBF1が核に出現する（NT440, 1-12, D1 -120, AT6いずれの部位も核主体)。これは細胞周期を止め、アポトーシスへの移行 を促進する。同時に ATBF1の核での発現は GFAPプロモーターの活性化を引き起こ す。この段階で GFAPを発現する前にアポトーシスへ導かれる細胞群も多 、 (壊死部 の散在。壊死部近傍に GFAP陽性細胞が少な 、理由）。
(2)膠芽腫はやがて、 GFAPを細胞質内に持つようになる。 ATBF1の中央部は GFAP の C末端と蛋白 蛋白結合をする性質を有するため、タンパク質産生が細胞質で起 こった後に核に ATBF1が移行しょうとしても細胞質でトラップされるため、 ATBF1の N 末端側のみが核に移行するも (NT440, 1-12は核に染色性がある)、中央から C末端 側は細胞質に残ってしまう (Dl-120, AT6いずれも細胞質に染色性)。 Dl-120, AT6が 細胞質に存在する細胞は悪性度判定法が示すごとく悪性度が高ぐ化学療法により アポトーシスに陥りにくい。これは GFAP陽性となった細胞群が MIB 1 labeling indexが 高ぐ Bcl-2, Bcl-xを発現してくる事力もも明らかである。（図 42B, Cを参照)。
し
(3)上記（1)、 (2)の過程が腫瘍の各部で起こるため小型の膠芽腫はやがて GFAP 産生部位が散在し、出血、壊死の混在する多形性を有するようになる（多形膠芽腫）
(4)さらにここに化学療法などで、 ATBF1全体が核に存在し GFAP発現の無い細胞 部分をアポトーシスに移行させると、最初は腫瘍の縮小を認める力 やがて GFAP産 生を認めアポトーシスに抵抗性を持つ細胞群が主体の腫瘍に変化する。
[0115] 以上、 ATBF1を使用した悪性度判定では、悪性度の高い部位、低い部位の混在す る腫瘍であるにも力かわらず実際は非常に悪性度が高ぐ予後の悪い腫瘍である事 実に対する発明者らの解釈のまとめを以下に示す。
(1)多形膠芽腫は特に悪性度が高ぐ予後の悪い腫瘍である。従来の病理診断から はその分子生物学的メカニズムは不明であつたが経験的に、 GFAP産生能が一つの 悪'性度の旨標となって!/ヽた。
(2)多形膠芽腫は ATBF1の核での発現が原因で GFAP産生が活性ィ匕される。 ATBF1, C末端側半分が ATBF1-GFAPの蛋白 蛋白結合で細胞質内に安定ィ匕されることか ら、 ATBF1の核移行が阻止されて悪性度が増すと想定される。
(3)多形膠芽腫で、 GFAPに ATBF1がトラップされるのを予防する工夫を行えば、 ATB F1が核移行を果たして放射線治療、化学療法が有効になる事が予想される。今後、 新たな治療法が生まれる可能性がある。
[0116] 以上、 ATBF1タンパク質の各部に対する抗体の同時使用は癌細胞の悪性度判定 に加え、腫瘍に特徴的なタンパク質プロセッシングの異常や遺伝子構造変化を推定 する事にも役に立つと判断された。
[0117] 10-8.高度悪性腫瘍、食道神経内分泌癌における ATBF1蛋白の局在変化と腫瘍 形態の関連性の検討
52歳男性。食道の高度悪性とされる神経内分泌癌である。この腫瘍における ATBF 1発現 (NT440, 1-12, Dl-120, AT6)を検討し、腫瘍の形態学的特徴との比較検討を 行った。食道悪性腫瘍の大部分は扁平上皮癌であり、未分化癌は稀である。中でも 神経内分泌癌は悪性度が高く予後不良とされる。本例は食道原発の神経内分泌癌 で、術後 2ヶ月、肝転移を来たし死亡した。腫瘍は門歯列より約 30cmに存在した 4.0 X 2.8 X 1.7 cm大、表在隆起型腫瘤であった（図 43Aを参照)。術後の病理検索で、 腫瘍細胞は NSE, S-100蛋白が大部分陽性， chromograninA、 CD56 (NCAM) (図 43 Bを参照）， Synaptophisinも陽性であることより神経内分泌癌と診断した。またリンパ管 への侵襲も認めた（図 43Cを参照）。腫瘍は AE1/AE3, CAM5.2陽性で明らかに上皮 性の性格を有する部位と、 Vimentin陽性で肉腫様の部位が混在し多様な分ィ匕方向 を持つ腫瘍であると判断された。
[0118] 腫瘍組織を詳細に観察すると、組織学的に細胞が規則正しく一列につながるような 索状配列、リボン状配列を認める上皮様で高分ィ匕な部位 (図 43D黒矢印を参照）と、 密で巣状、低分ィ匕な配列を示す肉腫様な部位 (図 43D白矢印を参照）が明らかに区 別出来るだけでなぐ ATBF1の染色性が異なる事が確認された。
索状、リボン状で高分化な配列を示す部位は、 NT440, 1-12, Dl-120, AT6いずれ も核主体の染色性を認めた（図 44A1-E1,
Fを参照)。それに対し、巣状、低分化な配列を示す部位では、 NT440, 1-12が核主 体、 Dl-120, AT6は細胞質主体の染色性を認めた（図 44A2-E2, Gを参照）。 ATBF1 による悪性度判定を行うと、高分化な部位は Dl-120, AT6ともに核主体で悪性度は 低ぐ低分ィ匕な部位は Dl-120, AT6とも細胞質で悪性度が高いと判定できた。
[0119] 一般的に腫瘍病理学的には、腫瘍内で形態的に高分ィ匕な部位は腫瘍の発育が遅 いと考えられ、腫瘍の悪性度が上がるにつれて発育が早くなり、低分化な密な部位 主体に腫瘍の形態が変化し、やがて高度の進展や遠隔転移を示すようになると考え られている。今回、 ATBF1を使用した悪性度判定では、より高分化な部位は悪性度 は低いが、低分ィ匕な部位は悪性度が高ぐそれらの部位が混在する腫瘍と判断でき た。これは旧来からの病理学的な観察結果を、 ATBF1使用により実証していると解釈 出来る。つまり ATBFlの Dl-120, AT6部位が核に局在出来る場合、腫瘍の発育が遅 くアポトーシスへの移行もあるため、腫瘍の構築が高分ィ匕になる。 ATBF1の中央部で 蛋白プロセッシングが起きて、 Dl-120, AT6部位が細胞質に局在する場合、腫瘍の 発育が早くなるため、腫瘍の構築が低分化となるという理解である（図 44F, Gを参照 )。本症例のリンパ管内の腫瘍構築が低分ィ匕であった（図 43Cを参照)ことから考えて 、今回は検索し得な力つたが、肝転移の部位の腫瘍構築も低分ィ匕主体であった可能 '性がある。
以上 ATBF1蛋白の各部に対する抗体の同時利用は、癌細胞の悪性度判定に加え 、腫瘍に特徴的な蛋白プロセッシングの異常や、形態学的な特徴との関連さらに腫 瘍進展様式の意味を推定する事にも役に立つと判断された。
[0120] 10- 9.副鼻腔の未分ィ匕癌および脳の大細胞びまん型 B細胞リンパ腫におけるエタ ソン 10の異常スキッピングによる ATBF1変異蛋白産生、 ATBF1蛋白の局在の関連性 の検討
第 1の例は 56歳、男性、副鼻腔の未分ィ匕癌でリンパ節転移の部位である。 MIB1で ほとんどの腫瘍細胞がラベルされ（図 45Aを参照）、非常に高度の Be卜 2蛋白の発現 を認める高悪性度腫瘍である。第 2の例は 47歳女性、脳に発生した大細胞びまん型 B細胞リンパ腫の部位である。脳血管周囲にびまん性の発育を示し（図 46Aを参照） 、 CD20, CD79aが陽性（図 46B, Cを参照）で B細胞性の悪性リンパ腫と判断でき、 Bel -2蛋白の発現が強い（図 46Dを参照）高悪性度の腫瘍である。この 2症例において A TBF1(NT440, 1-12,
Dl-120, AT6)の染色性を検討した。
2例ともに NT440, 1-12の染色性は核に限局する傾向があり（図 45C, D, G, 16E, F , Iを参照）、 D1-120はほぼ完全に欠落していた（図 45E, G, 16G, Iを参照）。また AT 6は細胞質主体の発現を認めた（図 45F, G, 16H, Iを参照）。
[0121] ATBF1を使用し癌の悪性度を判定すれば、 D1-120は欠落し、 AT6は細胞質主体 に局在し、悪性度は非常に高いと判断できる。
[0122] この所見力も蛋白の構造あるいは、プロセッシングの部位を考えると、ェクソン 3に 対応する部位が核、ェクソン 10に対応する部位が欠落、ェクソン 11に対応する部位 が細胞質となりェクソン 10の両側でプロセッシングが起こり、し力もェクソン 10に対応 する部位だけが消失しないと説明が難しいと思われた。し力しながら今回の非特許文 献 10において、前立腺癌で見出された ATBF1ゲノムに蓄積する各種の変異、 mRNA 段階での Altenative splicing異常の可能性を詳細に検討していくと、ホメォドメイン 1 力も 4を含むェクソン 10がスキップされた ATBF1蛋白の存在の可能性を指摘出来る（ 図 47を参照)。これはつまり、発明者らがすでに示した種々の腫瘍における D1-120 部位 (ェクソン 10に対応、図 31を参照）の染色性の欠落は、この 2例のごとぐ腫瘍の 悪性度の高さを指摘出来る事だけに止まらずに、ェクソン 10がスキップされた異常蛋 白の存在を指摘出来て 、る可能性がある。
このようにェクソン 3, 10, 11に対応する抗体を使用した ATBF1部分の細胞内の発 現、核、細胞質の局在検索することは、対応する ATBF1ゲノム領域が担うタンパク質 を機能的に評価する意味として重要であり腫瘍の悪性度を決定する分子メカニズム として、予想される mRNAの Alternative splicingやゲノム DNA構造の異常をタンパク質 レベルで容易に検出することが可能になると思われた。
10- 10.大細胞びまん型 Bリンパ腫の同一腫瘍内における、 ATBF1蛋白の局在変 化と悪性度の関連性の検討
68歳女性、脳に発生した大細胞びまん型 Bリンパ腫である。 CD20, CD79a陽性で びまん性の発育を示す悪性リンパ腫で、 Be卜 2蛋白は大部分で欠落（図 48の絵 Aの 部位)していた力 腫瘍の周囲に（図 48の絵 Bの部位)少量の発現を認めた。どちら の部位も MIB1ラベル、 PCNA発現は高度であり、ともに高度悪性であることに変わり はな ヽが、 Be卜 2発現欠落部位は悪性度がやや低 ヽと判断された。
この A, Bの部位での ATBF1 (NT440, 1-12, Dl-120, AT6)の染色性を比較検討し た。腫瘍の周辺の部位は NT440, 1-12は核に局在（図 48の Bl, B2、図 49Bを参照）、 Dl-120, AT6は細胞質主体の局在（図 48の B3, B4,図 49Bを参照）を示した。 D1-12 0が細胞質に存在することはこの腫瘍の悪性度が高 、事を意味し、 AT6が細胞質主 体であり、 Be卜 2発現がある事に矛盾は無い。それに比較して、腫瘍の中心部位では NT440,
1-12, D1-120は欠落し（図 48A1, A2, A3,図 49Aを参照）、 AT6は核主体に局在した (図 48A4、図 49Aを参照)。 D1- 120が欠落する事はこの腫瘍の悪性度が高い事を意 味し、 AT6が細胞質主体であり、 Be卜 2発現が抑制されている事に矛盾はない。しかし ながらェクソン 3および 10に対応する部位が欠落して、ェクソン 11に対応する部位の みが核に局在するという染色性は発明者らが全く経験してない新たなパターンであつ た。
[0124] 本例の検索結果は、一見全く組織学的に同じように見える同一の腫瘍内でも部位 によって ATBF1のプロッセシング状況や、発現の局在が変化しながら悪性度が増し て 、く可能性を意味して 、る。また今回提示してきた各種の大細胞びまん型 Bリンパ 腫は ATBF1の局在部位は種々、異なっており、すでに確立された腫瘍概念内での新 たな悪性度分類に ATBF1が寄与する可能性を示していると思われる。
また今回のェクソン 11に対応する部位のみが核に局在するパターンは、ェクソン 1 1部位には核内移行シグナルがそれ自身の配列の中には検出されて 、な 、が、 Myb タンパク質など他の核移行シグナルを有する因子との蛋白相互作用領域を保存して V、るために、何らかの核移行タンパク質と結合して核移行を果たして!/ヽる可能性が考 えられる。
[0125] 10— 11.まとめ
すでに既報 (非特許文献 6)で示したごとぐ胃癌の培養細胞において、 ATBF1は 癌抑制遺伝子 P53と蛋白 蛋白結合して機能する。この ATBF1と p53複合体が癌抑 制遺伝子 P21のプロモーターを活性ィ匕して、 p21の発現上昇を導き、細胞周期を止め るとともに、癌細胞をアポトーシスに陥らせることが想定された。実際にアルキル化剤（ 抗ガン剤）を作用させて DNA修飾シグナルを活性化すると ATBF1の発現を誘導でき る事実も明らかになつている [細胞周期調節に関する P53タンパク質の関与する経路] 細胞周期停止、アポトーシスへの移行に関し、 ATBF1は癌遺伝子タンパク質 c-myb と蛋白 蛋白結合を行い、その機能を抑制することが知られている (非特許文献 8を 参照)。また Mybタンパク質ファミリ一は Bd-2を導入し、細胞のアポトーシスを抑制す る機能があると考えられて 、る (Grassilli,
E. et al. Resistance to Apoptosis inし TLL— 2 し ells Overexpressing B— Myb Is Associated with B— Myb— dependent be卜 2 Induction, CANCER RESEARCH 59, 2451 -2456,
1999を参照)。従ってその Mybタンパク質ファミリーの抑制はすなわち細胞周期停止、 アポトーシスの誘導につながると想定される。 [細胞周期調節に関する RB (retinoblast oma)タンパク質の関与する経路]。実際に後述の実施例で示すが、正常組織、腫瘍 にお!/、て、 ATBF1遺伝子のェクソン 11に相当する ATBF1部分 (AT6で検出)が核に存 在する部位では Be卜 2の発現が抑制され、同部位が細胞質に移行する部位で Be卜 2 の発現が活性ィ匕される例が存在している。抗 ATBF1抗体 (AT6)は、癌遺伝子 c-mybと 蛋白一蛋白結合する ATBF1のェクソン 11を等位的に認識する（非特許文献 8を参照 ) o今回の組織学的検索の結果は、 ATBF1タンパク質が核に移動することで Myb癌遺 伝子タンパク質との相互作用することが可能となり、 be卜 2遺伝子の抑制に関与してい る可能性を示唆している。
以上の 2つの細胞周期抑制経路に関する既報研究、および発明者らが行った検索 により、癌細胞での細胞周期の停止、アポトーシスへの移行は ATBF1発現総量のみ ならず、その機能断片の細胞内局在に強く依存している事実が明らかとなった。これ が ATBF1に対する複数の抗体（D1-120のみでなぐ NT440, 1-12, AT6を含む）を使 用すること〖こよる「癌細胞の悪性度判定法」の理論的な基礎となって ヽる。
さらに非特許文献 9では、前立腺癌において ATBF1をコードする遺伝子に各種の 変異が存在することが明らかとなり、 ATBF1の機能障害が前立腺癌の原因の一つで ある事実が報告された。前立腺癌以外の様々な癌細胞において 16番の染色体異常 は数多く報告されていたが、それぞれの癌化に関与する責任遺伝子は特定されてな かった。非特許文献 9は 16番の長腕に存在する ATBF1が腫瘍抑制遺伝子 (癌抑制 遺伝子）の一つとして腫瘍の悪性度を決定する重要な役割を演じて 、ることを明確に するものである。
実施例 11
<癌細胞の悪性度判定用キットの構築 >
以下の試薬を組み合わせてキットとした。
A試薬：抗 ATBF1抗体原液（D1-120) B試薬: ATBF1抗原液
C試薬: GST抗原液
A試薬は、実施例 2で調製した抗 ATBF1抗体を 250 /z g/mlに調整して得られる。 B試 薬は、 D1-120抗体作製時に調整したマウス ATBF1の 41アミノ酸残基（2114〜2154: L QTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQQNKR:配列番号 1)を GST に融合した組み換えペプチドを 2mg/mlに調整して得られる。 C試薬は、 GST (例えば Sigma社製)を 2mg/mlに調整して得られる。
以下、キットの使用方法の一例（DAB発色による免疫組織学的染色）を示す。
(1)外科的或いは剖検時に切除した被検組織を、通常の病理検査と同様の手順で 、 10%ホルマリン固定、パラフィン包埋する。ラット、マウスなどを使用した動物実験の 検体はホルマリンの代わりにパラフオルムアルデヒド固定を使用してもよい。 ATBF1の 染色性に関してホルマリンとパラフオルムアルデヒド固定では特に差はない。採取後 すぐにホルマリン固定した外科病理組織材料を使用することが基本となる。
(2)パラフィン包埋後の組織を切肖 ij、薄切してスライドガラスに載せる。スライドガラス としては例えば Superfrost、 MASコート付き、 S-9441 (商品名、マツナミ製）を使用する 。当該スライドガラスは圧力釜による熱処理に対する耐久性に優れて 、る。
(3)通常の病理標本作製に使用される、通常の脱パラフィン系列で切片を処理し、 最終的にアルコ一ルカゝら精製水に置換する。
(4) (3)の間に圧力釜 (一般的な調理に使用されるものを使用できる）にクェン酸緩衝 液を 2リットル入れ、強火で沸騰させる。市販のクェン酸緩衝液 (例えば、三菱化学ャ トロン製、インスタントクェン酸緩衝液 [20倍濃縮液 RM-102C], pH6.0)を使用すること ができる。原則、一回熱処理を行った緩衝液は再使用しない。
(5)切片を金属製の標本かごに入れ、圧力釜の蓋をとり、緩衝液中に横向きで、切 片の載っている面が上に向くように置く。
(6)蓋をした後、蒸気音が出始めるまで強火で加熱し、その後は弱火にして 4分間加 熱を続ける。加熱を停止し、 1分間放置する。
(7)流水 (水道水)で釜全体を冷却する。約 40分後に圧力釜の蓋を取り、標本かごを 釜から出して精製水に置換する。続いて内因性ペルォキシダーゼをブロックするため に、過酸化水素水で処理を行う。次に精製水に置換し、過酸化水素水を除去した後
、 20mMトリス緩衝液になじませる。その後、 0.05Mトリス緩衝液 pH7.6に置換する。
(8)アジ化ナトリウム含有ゥシ血清アルブミン 1%溶液を添カ卩した 0.05Mトリス緩衝液 pH 7.6を用意し、これで A試薬を 50倍希釈する（抗体溶液)。切片に抗体溶液を添加し、 加湿条件下 (モイストチャンバ一内）、室温で 1時間反応させる（一次抗体反応)。通 常の検体には 1回の反応に約 40 1、比較的大きな検体には約 80 1の抗体溶液を使 用する。ピペットの先をプレパラート手前にあて、切片に触れないように注意しながら 抗体溶液を切片によくなじませる。
(9) 0.05Mトリス緩衝液 pH7.6を用いて切片を洗浄する（5分間、合計 2回)。洗浄処理 後、余分な洗浄液を拭き取る。
(10) HRP標識 2次抗体 (DAKO
Enivision, Labelled polymer, HRP(Code No. K 149 l)Anti- mouse and Antト rabbit)を 切片に添加し、室温で 1時間反応させる（二次抗体反応)。
(11X9)と同様の洗浄を行う。
(12) DAB Chromogen (DAKO, Code. S3000)を 2錠、 40mlの 0.05Mトリス緩衝液 pH7.6 に溶解する。これに過酸ィ匕水素水を 30 1加えた後、切片に浸透させ (5分間）、発色 させる。
(13)流水（水道水）で DAB液を洗浄、除去する。
(14)マイヤーへマトキシリンで切片を 15秒程度染色する。
(15)切片を流水中に 8分間静置する (色出し洗浄)。
(16)通常の病理標本作製と同様にアルコール系列及びキシレン系列を通し、透徹、 封入を行う。
(17)以上の結果得られた標本を用いて顕微鏡観察を行う。
<ATBF1特異的染色であることの確認 1 >
DABによる発色 (茶褐色）が ATBF1特異的な免疫染色の結果であることを確認する ためには以下の操作を行う。
(1)A試薬 (ATBF1抗体原液） 10 μ 1、 Β試薬 (ATBF1抗原） 1 μ 1、 PBS 10 μ 1、及び 5% BSA 4 μ 1をマイクロチューブ内で混合する。 (2)チューブ全体 (全量 25 μ 1)を、 37°Cで 2時間反応させる。
(3)反応終了後、抗体希釈時に使用する緩衝液 (アジ化ナトリウム含有ゥシ血清アル ブミン 1%溶液を添カ卩した 0.05Mトリス緩衝液 pH7.6)を 25 μ 1添加する。このようにして得 られた溶液全量 50 1を 1次抗体反応用の試薬として使用し、上記の方法で免疫組織 化学染色を行う。その結果 DABによる染色が認められなければ、 ATBF1特異的な免 疫染色が行われて 、ることを確認できる。
[0129] <ATBF1特異的染色であることの確認 2>
GST融合抗原を使用して調製したため、抗 ATBF1抗体 (A試薬）には GSTに対する 反応性が混在して!/、る可能性がある。 DABによる発色が抗 ATBF1抗体の GSTに対す る反応性の結果でな 、ことを確認するためには以下の操作を行う。
(1) A試薬 (ATBF1抗体原液） 10 μ 1、 C試薬（GST) 1 μ 1、 PBS 10 μ 1、及び 5% BSA 4 μ 1をマイクロチューブ内で混合する。
(2)チューブ全体 (25 μ 1)を、 37°Cで 2時間反応させる。
(3)反応終了後、抗体希釈時に使用する緩衝液 (アジ化ナトリウム含有ゥシ血清アル ブミン 1%溶液を添カ卩した 0.05Mトリス緩衝液 pH7.6)を 25 μ 1添加する。このようにして得 られた溶液全量 50 1を 1次抗体反応用の試薬として使用し、上記の方法で免疫組織 化学染色を行う。その結果 DABによる染色が認められれば、 ATBF1特異的な免疫染 色が行われて 、ることを確認できる。
産業上の利用可能性
[0130] 本発明は様々な癌（肉腫を含む)の特性 (悪性度、予後、各種治療への反応性など )を予測することに利用され得る。本発明を利用すれば、転移や再発を起こす可能性 が高いにも拘わらずこれまでの判断手法によっては一般に良性腫瘍と捉えられてい るものに対しても、例えば中間悪性などとして指摘することも可能になると考えられる 。また逆に、腫瘍の悪性度や治療効果の予測がたてられな力 たために、結果として 不必要で過剰な治療を選択せざるを得なカゝつた症例に対して、より患者 ADL(Activit y of Daily Living,日常生活動作)や QOL(Quality Of Life,人生の質)の向上に焦点 をあてた治療を可能にすると思われる。今後、神経芽細胞腫の悪性度判断に対する 本発明の価値は特に重要となる可能性がある。幼児患者の生命予後、治療方針の 迅速な決定を下すために重要な指標を提供する手段として、本発明が世界標準の 病理診断基準となる可能性すら予想される。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

請求の範囲 [1] 生体力 分離された被検癌細胞内の ATBF1量を検出するステップを含んでなる、 被検癌細胞の悪性度判定法。 [2] 前記ステップにおける ATBF1量として、以下の (1)〜(3)からなる群より選択される一 又は二以上が検出される、請求項 1に記載の悪性度判定法： (1) ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量、 (2) ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量、 (3) ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量。 [3] 前記ステップにおける ATBF1量として、以下の (1)〜(3)が検出されることを特徴とす る、請求項 1に記載の悪性度判定法：
(1) ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量、
(2) ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量、
(3) ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域の核内存在量及び Z又は細胞質内 存在量。
[4] 前記検出が免疫組織ィ匕学的染色法を利用して実施される、請求項 1〜3のいずれ かに記載の悪性度判定法。
[5] 抗 ATBF1抗体からなる、被検癌細胞の悪性度判定用試薬。
[6] 前記抗 ATBF1抗体が、以下の (1)〜(3)からなる群より選択される抗体であることを特 徴とする、請求項 5に記載の悪性度判定用試薬：
(1) ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域を認識する抗体、
(2) ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域を認識する抗体、
(3) ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域を認識する抗体。
[7] 以下の (1)〜(3)からなる群より選択される一以上の抗体を含んでなる、被検癌細胞 の悪性度判定用キット：
(1) ATBFl遺伝子のェクソン 10に対応する領域を認識する抗体、
(2) ATBF1遺伝子のェクソン 11に対応する領域を認識する抗体、
(3) ATBF1遺伝子のェクソン 3に対応する領域を認識する抗体。
[8] ATBF1を更に含んでなる、請求項 7に記載の悪性度判定用キット。
[9] 前記抗 ATBF1抗体力 ATBF1と、タグ又はキャリアタンパク質との融合タンパク質を 抗原として作製されたものであって、
前記タグ又はキャリアタンパク質を更に含んでなる、請求項 7又は 8に記載の悪性 度判定用キット。
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