WO2006006634A1 - 疲労度評価方法およびその利用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for evaluating the degree of human fatigue and its use, a kit for evaluating the degree of fatigue, and a method for measuring the anti-fatigue power of an anti-fatigue substance.
- Fatigue is a very familiar problem in daily life, and there are many people who suffer from various types of fatigue among modern people who are stressful.
- little research has been done.
- Patent Document 1 discloses a method for quantifying stress in saliva using the concentration of adrenal steroids and metabolites thereof as an index.
- Patent Document 2 and Patent Document 3 disclose a method for evaluating the antipsychotic fatigue activity of a test substance by measuring amino acids such as taurine, leucine and isoleucine in blood.
- herpes viruses that mainly infect humans have been identified.
- Herpesviruses are large DNA viruses that are classified into three subfamilies, ⁇ and ⁇ , mainly according to their phylogenetic tree, and have common biological properties.
- ⁇ ⁇ herpesvirus is a neurogenic virus that causes latent infection and reactivation in nerve cells
- ⁇ -herpesvirus is oncogenic.
- an objective determination method of muscle fatigue (exercise fatigue) due to muscle load (exercise load) is a proposed force.
- fatigue symptoms in daily life are a lot of Despite what humans feel, there are few reports on the objective evaluation method. Fatigue symptoms in daily life may directly lead to death from overwork, which is a sudden death due to overwork for too long. Although the problem of overwork death is recognized as being very important from a medical, economic and social viewpoint, the scientific mechanism is hardly understood. Therefore, in recent years, an objective fatigue evaluation method is required to prevent overwork death, which is a social problem.
- Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 11-038004
- Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 11-304792
- Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 11-304793
- An object of the present invention is to provide a method and method for evaluating fatigue level simply and quantitatively, a kit for evaluating fatigue level, and a method for measuring the anti-fatigue power of an anti-fatigue substance.
- the fatigue evaluation method according to the present invention is characterized in that the fatigue is evaluated using the amount of at least one HHV in the body fluid as an index in order to solve the above problems.
- the above method it is possible to evaluate human fatigue level simply and objectively, and it is also possible to quantitatively determine the effectiveness of dietary supplements such as nutritional drinks and health foods, as well as pharmaceuticals that have a fatigue recovery or suppression effect. is there.
- a fatigue evaluation kit according to the present invention is characterized in that it is for carrying out the above-described fatigue evaluation method in order to solve the above problems.
- the anti-fatigue substance measuring method of the anti-fatigue substance according to the present invention uses any force of the above-described fatigue evaluation method and fatigue evaluation kit to It is characterized by measuring anti-fatigue power.
- a fatigue evaluation method characterized by evaluating a subject's fatigue using the amount of human herpesvirus in a body fluid as an index.
- the subject evaluates that the subject is in a state of chronic fatigue due to a disease.
- the fatigue according to any one of [1] and [3] Degree evaluation method.
- the above fatigue level is medium- to long-term fatigue caused by daily life or fatigue due to disease, and is characterized by mental fatigue and Z or combined fatigue. [1] No [5] The fatigue evaluation method according to any one of the above.
- the above-mentioned body fluid is at least one kind selected from blood, saliva, cerebral bone marrow fluid, and urine urine [1], and the fatigue degree evaluation method according to any one of [6] . [8]
- the above-mentioned henorepesuinores is at least one selected from human henolepusuinoles 6, human henolepusuinoles 7, human cytomegalovirus and Epstein Barr virus (EBV) force [1]
- the fatigue evaluation method according to any one of [7].
- kits that includes a means for measuring the amount of HHV in a collected body fluid and can be used to evaluate a subject's fatigue using the amount of human herpesvirus in the body fluid as an index. [9] The kit according to [9].
- a pre-ingestion HHV amount measurement step in which the subject takes body fluid of the subject before ingesting the candidate anti-fatigue substance and measures the amount of HHV in the body fluid;
- a post-ingestion HHV amount measurement step in which the subject takes a body fluid of the subject after ingesting a substance that is a candidate for anti-fatigue substance, and measures the amount of HHV in the body fluid;
- a virus amount change calculating step for calculating a change in the amount of HHV in the body fluid before and after the intake of the substance that is a candidate for the anti-fatigue substance
- a method for evaluating an anti-fatigue effect of a substance that is a candidate for an anti-fatigue substance is a method for evaluating an anti-fatigue effect of a substance that is a candidate for an anti-fatigue substance.
- Body fluid was also collected from subjects who took a substance that was a candidate for anti-fatigue substance, and subject power that was not able to take a substance that was a candidate for anti-fatigue substance, and the amount of HHV in each body fluid was measured.
- HHV quantity measurement process (ii) Substances that are candidates for anti-fatigue substances based on the measurement results of changes in the amount of HHV due to the presence or absence of ingestion of substances that are candidates for anti-fatigue substances obtained by the HHV quantity measurement process in (i) A virus amount change calculating step for calculating a change in the amount of HHV in the body fluid depending on the presence or absence of ingestion,
- a method for evaluating an anti-fatigue effect of a substance that is a candidate for an anti-fatigue substance is a method for evaluating an anti-fatigue effect of a substance that is a candidate for an anti-fatigue substance.
- the method for evaluating an anti-fatigue effect of a substance that is a candidate for an anti-fatigue substance according to any one of [11] to [13], for screening an anti-fatigue substance.
- the subject's fatigue can be obtained by collecting the body fluid of the subject.
- the effect is that it can be quantitatively evaluated.
- both of these methods and kits are simple and do not require long-term restraint, the subject does not feel pain or annoyance.
- the method is simple for the practitioner and is very easy to handle for both the subject and the practitioner. Therefore, it can be used for screening methods for anti-fatigue substances and in vivo evaluation of foods with anti-fatigue ability, and is a very useful technique.
- kits for assessing fatigue level for example, body fluid is collected from a subject, the amount of HHV in the body fluid is measured, and the amount is calculated.
- body fluid is collected from a subject, the amount of HHV in the body fluid is measured, and the amount is calculated.
- the present invention provides a method, a kit, and a method for using the method for simply and quantitatively measuring and evaluating the degree of fatigue in daily life. For this reason, according to the present invention, it is possible to objectively know the degree of fatigue in daily life, and to avoid the occurrence of various diseases caused by the accumulation of fatigue without knowing it. Furthermore, it is possible to reduce the incidence of overwork death caused by continuing to work without being aware of fatigue.
- information such as how much the medicines and foods that demand fatigue recovery, nourishment, and nutritional supplements that are supplied to the market exert their anti-fatigue power in the living body is provided to consumers. And can be provided to society. This information can be used as a guide for consumers to select anti-fatigue foods and medicines that are effective for prevention of overwork and nourishment. Is an invention that is very useful and has a strong social impact.
- FIG. 1 is a test schedule for measuring the expression level of HHV in Example 1.
- FIG. 2 shows the results of measurement of the expression level of HHV in Example 1, and changes in the expression rate of HHV-6 in the subjects (percentage of subjects who expressed HHV-6 DNA in all subjects) It is a graph which shows. The incidences on the first inspection day (at the time of work) and the second inspection day (immediately after leave) are shown.
- FIG. 3 shows the results of measurement of the expression level and expression frequency of HHV DNA in Example 2, showing a change in the expression level and expression frequency of HHV-7 DNA in CSF patients and healthy subjects. .
- the expression level of HHV-7 DNA is plotted on the vertical axis, and each test subject is shown as a separate column.
- “Fatigue” in this specification refers to a temporary qualitative or quantitative decline in physical, mental function, and physical strength that is observed when physical or mental loads are continuously applied. It is classified into physiological fatigue and pathological fatigue.
- physiological fatigue refers to the qualitative or quantitative nature of temporary physical and mental work abilities seen when a healthy person is given physical or mental loads continuously.
- “Pathological fatigue” means fatigue associated with diseases such as chronic fatigue syndrome, mental illness, heart disease, hepatitis, anemia, various infectious diseases, and malignant tumors.
- Chronic fatigue means transient fatigue that is recovered by appropriate rest.
- Chronic fatigue means fatigue that accumulates over a long period of time due to incomplete daily recovery.
- the term “medium- to long-term fatigue” in this specification means sudden fatigue before reaching the chronic fatigue.
- “Acute fatigue” and “chronic fatigue” are classified into “mental fatigue” and “physical fatigue”, respectively.
- “Mental fatigue” in this specification refers to emotions and intentions, such as complicated calculation, memory, or feelings of patience that are driven by patience, tension, or time due to the power of psychological activities such as thinking. This means fatigue, including eye strain and mental stress, that occurs when the activity of a person is excessively demanded.
- “physical fatigue” in this specification means fatigue caused by the performance of physical work or the influence of electromagnetic waves.
- the “mental fatigue load” in this specification means giving the above mental fatigue.
- the term "persistent fatigue” in the present specification means a state in which fatigue caused by some incentive continues without recovering for a long time.
- Complex fatigue in the present specification means fatigue that also has a combined force of the various types of fatigue described above.
- the term “fatigue level” refers to a unique pathological disorder caused by excessive physical or mental activity or the effects of disease resulting from the various types of “fatigue” listed above.
- “a state of diminished physical or mental function” means qualitative or physical or mental work ability. It means a quantitative decline.
- the "overworked state” in the present specification is the physiological fatigue described above, and as a result of persisting the state of chronic fatigue, the biological rhythm is disrupted and the function of sustaining life is fatally broken. Means a condition that leads to morbid fatigue.
- the present invention is acute fatigue among physiological fatigue and preferably medium- to long-term fatigue.
- the present invention is preferably a fatigue to mental fatigue among medium- to long-term fatigue.
- the subject of the present invention is preferably fatigue (pathological fatigue) associated with diseases such as persistent fatigue and chronic fatigue syndrome (CFS), cancer, heart disease, and lifestyle-related diseases.
- CFS persistent fatigue and chronic fatigue syndrome
- Optimal virus conditions for practicing the present invention include that most humans are latently infected, and that many humans can be tested, and the virus that has been reactivated is measured. It is easy to do.
- viruses that satisfy the above conditions include human herpesvirus (HHV).
- HHV human herpesvirus
- HHV has three subfamilies, including human herpesvirus 6 (HHV-6), human herpesvirus 7 (HHV-7), and human cytomegalovirus (also known as human herpesvirus).
- Noles 5 belongs to the 13 subfamily, and Epsyutain 'Berwinores EBV belongs to the ⁇ subfamily.
- HHV-6 is a virus that is infected by all people aged 2 years and older and HHV-7 is aged 5 years and older, all adults are considered to have latent infectious viruses. Therefore, HHV-6, HHV-7, cytomegalovirus, and Epstein Barr virus (EBV) are considered suitable for the present invention.
- EBV Epstein Barr virus
- the present inventor collects the body fluid of a subject and measures the amount of HHV in the body fluid, It was found that the degree of fatigue can be measured easily and quantitatively. This method is less time-constrained for the subject because the body fluid collection time is shorter than the need for a large-scale device, and it is also a very simple method for the practitioner. .
- the virus to be the subject of the present invention may be a virus belonging to human herpesvirus (HHV), but HHV-6, HHV-7, cytomegalovirus, Epsteine Barr virus (EBV) is preferred. is there. Further, HHV-6 and HHV-7 are more preferable.
- HHV-6, HHV-7, cytomegalovirus, Epsteine Barr virus (EBV) is preferred. is there. Further, HHV-6 and HHV-7 are more preferable.
- the body fluid that is the subject of the present invention may be at least one selected from blood, saliva, cerebrospinal fluid, and urine, but saliva is preferred.
- examples of the oral treatment before collecting saliva include a method of resting without eating for a long time and a method of rinsing the oral cavity with water immediately before collecting saliva.
- a method of rinsing the oral cavity with water is preferred.
- the measurement of the amount of HHV in the body fluid can be appropriately set by those skilled in the art with specific methods and conditions as long as it is a conventionally known method.
- Methods for measuring the amount of virus include a method for measuring the amount of virus nucleic acid and a method for measuring the amount of virus protein.
- a method for measuring the amount of viral nucleic acid for example, saliva and other DNA are purified, and the amount of viral DNA is determined by PCR method using PCR primers specific to each human herpesvirus.
- PCR primers specific to each human herpesvirus Reference: Journal of Medical Virology 32: 139-142 (1990) “Detection of Human Herpesvirus 6 DNA in Throat Swabs by Polymerase and Hain Reaction”
- Double-Nested PCR Measurement methods Reference: Journal of Infectious Diseases 1993, 167: 1197—1200. “Association of HHV—6 Infection of the central nervous system with recurrence of feonle convulsions”).
- a double-nested PCR method and a real-time PCR method are preferable.
- an immunoassay method (Immunoassay method) using an antibody against the viral protein.
- immunoassay methods include sandwich ELISA (reference: J. Clin. Microbiol. 1983 May; 17 (5): 942-4. 1 fyping of herpes simplex virus isolates by enzyme-linked immunosor bent assay: comparison between indirect and double -antibody sandwich techniques. "Gerna G, Battaglia M, Revello MG, Gerna MT.).
- the higher the amount of HHV in the body fluid the higher the fatigue level of the subject. This is derived from the fact that as the subject's fatigue level increases, the expression level of the subject's HHV in the body fluid increases accordingly, as shown in the examples described later.
- the fatigue evaluation method according to the present invention can be performed using a conventionally known arithmetic device (information processing device) such as a computer.
- a conventionally known arithmetic device information processing device
- the fatigue evaluation method according to the present invention includes a measurement step of measuring the amount of HHV in body fluid, and an evaluation step of evaluating the fatigue level of the subject according to the measurement result of the amount of HHV in body fluid.
- an arithmetic unit can be used for the evaluation process.
- the fatigue evaluation kit according to the present invention is a kit for evaluating fatigue in humans. That is, any kit may be used as long as it implements the fatigue evaluation method according to the present invention described in the section (1). Specifically, it may be a kit including means for measuring the amount of HHV in the body fluid of the subject. As a means for measuring the amount of HHV in the body fluid in the present invention, any means necessary for carrying out a conventionally known measurement method may be used. The means necessary for carrying out the conventionally known measurement method specifically includes, for example, reagents necessary for carrying out the method for measuring the amount of HHV in the body fluid described in the above section (1), Equipment, equipment, catalysts and other things.
- the fatigue evaluation kit according to the present invention may include means for collecting body fluid of a subject.
- the label attached to the packaging material or the attached document indicates that the amount of human herpesvirus (HHV) in the body fluid can be used as an index to evaluate the subject's fatigue level. , Techo,.
- the fatigue evaluation kit according to the present invention is a known computing device such as a computer. It becomes a kit that uses the device.
- the anti-fatigue substance is measured by measuring the amount of HHV in the body fluid before and after the subject ingests the anti-fatigue substance. It is possible to quantitatively measure and evaluate the anti-fatigue power of a fatigue substance in a subject's body.
- these methods and kits are simple and easy to handle for both the subject and the practitioner because they do not require large-scale equipment and long-term restraint. There is an advantage!
- a method for measuring the anti-fatigue power of an anti-fatigue substance using either the fatigue evaluation method or the fatigue evaluation kit according to the present invention is also included in the present invention.
- the anti-fatigue substance measurement method of such anti-fatigue substances is, for example,
- a pre-ingestion HHV amount measurement step in which the subject takes body fluid of the subject before ingesting the candidate anti-fatigue substance and measures the amount of HHV in the body fluid;
- a post-ingestion HHV amount measurement step in which the subject takes a body fluid of the subject after ingesting a substance that is a candidate for anti-fatigue substance, and measures the amount of HHV in the body fluid;
- a virus amount change calculating step for calculating a change in the amount of HHV in the body fluid before and after the intake of the substance that is a candidate for the anti-fatigue substance
- a subject administered with a substance that is a candidate for a strong anti-fatigue substance, and the substance
- This is a method for carrying out the above anti-fatigue strength measurement method in subjects who have not been administered (non-administration group).
- ingestion means not only ingestion of the substance as a food or drink in a subject, but also oral administration and parenteral administration of the substance.
- Anti-fatigue in the present specification means a recovery, suppression, or prevention effect of fatigue.
- Anti-fatigue substances include substances that have an effect of recovering, suppressing or preventing fatigue, and substances that complement biological functions.
- Biological function-complementing substance means a substance that adjusts the balance of the living body, and includes substances having a function of enhancing immune function.
- the fatigue evaluation method and the fatigue evaluation kit according to the present invention can be used, for example, as a screening method for anti-fatigue substances. That is, the anti-fatigue substance screening method according to the present invention may be any specific method as long as it is a method for screening anti-fatigue substances using either the fatigue evaluation method or the fatigue evaluation kit. The conditions are not limited.
- a food that is considered to be usable as an anti-fatigue food is orally ingested by a subject, and a food that actually exhibits excellent anti-fatigue ability in vivo is easily and objectively obtained. You can choose. Therefore, the anti-fatigue substance or anti-fatigue food obtained by the above screening method has been proven to be effective in the living body, and can be highly evaluated in the field.
- the anti-fatigue substance obtained by the screening method described above is also included in the present invention as long as the novel anti-fatigue substance according to the present invention is obtained by the screening method.
- the present invention is the result of a study on the needs of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's Science and Technology Promotion Coordinator for Consumer Needs, "Molecules of fatigue and fatigue"
- the collected saliva was stored frozen (-80 ° C) on the same day.
- DNA was purified from the collected saliva sample in the presence of carrier RNA.
- Herpesvirus DNA levels were measured in double nested using four specific PCR primers for HHV-6, HHV-7, human cytomegalovirus, and Epstein Barr virus (EBV). Measurement was performed using the PCR method.
- P specific to HHV-6 CR primer sequences are SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2
- 2nd PCR primer sequences are SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and PCR primer sequences specific to HHV-7.
- the IstPCR primer sequence is SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and the 2nd PCR primer sequence is SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and is a PCR primer sequence specific for human cytomegalovirus,
- the sequence is SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10
- the 2nd PCR primer sequence is SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and the PCR primer sequence specific to Epstein Barr virus (EBV).
- the IstPCR and 2nd PCR primer sequences are described in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14. Epsteine Barr virus (EBV) used the same primer sequence in IstPCR and 2nd PCR.
- HHV-6 and HHV-7 were found to be frequently detected in healthy adult saliva.
- the detection rate of human cytomegalovirus and Epsteine virus was low compared to HHV-6 and HHV-7.
- Fig. 2 shows the measurement results of the DNA amount of HHV-6.
- Saliva 201 was used for a single measurement. During slightly overworked work (such as the first examination day) due to extended working hours, HHV-6 DNA was detected in 88% of the subjects. On the other hand, 23.8% of the subjects detected HHV-6 DNA immediately after the vacation (second examination day). This indicates that HHV-6 is significantly reactivated during work. From this result, it was found that the DNA of HHV-6 expressed in saliva by the reactivation of HHV-6 is a fatigue marker (bioindicator factor) that varies with fatigue. Therefore, reactivation of HHV-6 An objective fatigue assessment method has been developed that allows easy assessment of fatigue by detecting HHV-6 DNA released into saliva by sex.
- CFS chronic fatigue syndrome
- the subject rinsed the oral cavity twice with distilled water immediately before collecting saliva, and then contained saliva (SARSTED) batting in the oral cavity for 2 minutes, and collected saliva.
- saliva SARSTED
- HHV-7 was found to be detected frequently and in large quantities from the patient's saliva.
- the detection frequency and detection amount of human cytomegalovirus, HHV-6, and Epstein Barr virus were lower than those of HHV-7.
- Fig. 3 shows the measurement results of HHV-7.
- HHV-7 DNA was measured semi-quantitatively using the double nested PCR method.
- HHV-7 DNA was detected in 92% of CSF patients.
- HHV-7 DNA was detected only in 50% of subjects during work and 30% during rest.
- the HHV-7 DNA level in half of CSF patients reached 10 to 100 times the average level detected in healthy individuals. This indicates that HHV-7 is significantly reactivated in chronic fatigue associated with the disease. Based on this result, the DNA of HHV-7 expressed in saliva due to the reactivation of HHV-7 is fatigued due to chronic fatigue due to diseases, etc.
- the fatigue evaluation method according to the present invention can be used for elucidation of stress and fatigue mechanisms, and can develop a stress relieving method, evaluate the degree of fatigue, and evaluate the physical strength decline associated with a disease. Further, by using the present invention, it becomes possible to quantitatively evaluate (evaluate) the effects of anti-fatigue health foods, foods for specified health use, nutritional drinks and biological function supplements that are on the market. Therefore, the present invention can be used in a wide range of fields such as medical industry, pharmaceutical industry, health food industry, and health equipment industry.
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Abstract
被験者の体液を採取し、体液中のヒトヘルペスウイルスの量を測定することにより、日常生活や疾患にともなう疲労度を簡便かつ定量的に評価できる。さらに、抗疲労物質及び抗疲労食品の生体における抗疲労力を測定できる。
Description
明 細 書
疲労度評価方法およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、ヒトの疲労度を評価する方法およびその利用法、疲労度を評価するた めのキット、ならびに抗疲労物質の抗疲労力測定方法に関する。
背景技術
[0002] 疲労は、日常生活において非常に身近な問題であり、ストレスの多い現代人の中で は、さまざまな疲労に悩む人が多い。しかしながら、「疲労」に関する科学的'医学的 研究は、断片的に行われていたに過ぎず、「疲労」という主観的症状をいかに定量的 •客観的に表すかと 、う決定的手段または定量尺度にっ 、ては、ほとんど研究されて いない。
[0003] これまで「疲労」の代表的な例として、筋肉疲労 (運動疲労)が主に研究されており、 その指標として、筋肉中の乳酸産生量の増加が注目されていた。しかし、本来乳酸 は脳神経系にとって重要なエネルギー源であり、乳酸が筋肉活動を阻害するという 説は、現在では否定的に捉えられている。その他、筋肉疲労にともなって、体液中の ピルビン酸の上昇、および pHが低下する現象が知られている。これらは筋肉への負 荷 (運動負荷）という一定のストレスを与えたときには確かにみられる現象である力 「 疲労」は局部的な筋肉疲労とは異なり、生体に現れるもっと幅広い大きな生理現象と 考えられている。
[0004] 特許文献 1では、唾液における、副腎性性ステロイドおよびその代謝物の濃度を指 標とするストレスの定量法が開示されている。特許文献 2および特許文献 3では、血液 中のタウリン、ロイシン、イソロイシンといったアミノ酸類を測定することにより、被験物 質の抗精神疲労活性の評価方法が開示されている。これらの特許文献では生体液 中の生体因子を指標として、ストレスや疲労を評価する方法が開示されているが、ヒト の日常生活における疲労を定量ィ匕できるまでは至っていない。
[0005] ヒトが疲労すると、免疫力が低下することが考えられ、ヒトの免疫力の低下の一つの 表現系として、ウィルス感染が挙げられる。しかし、ヒトの疲労とウィルス感染との関係
は明らかにはなっていない。
[0006] 一方、主としてヒトに感染するへルぺスウィルスは、現在 8種類が同定されている。
ヘルぺスウィルスは大型の DNAウィルスで、主としてその進化の系統樹に従って、 α 、 β γの 3亜科に分類され、亜科ごとに共通した生物学的性質を持つ。例えば、 α ~ ヘルぺスウィルスは神経細胞で潜伏感染、及び再活性ィ匕を生じる神経性のウィルス で、 γ -ヘルぺスウィルスは腫瘍原性をもつ。
[0007] すべてのヘルぺスウィルスに共通する性質として、主として小児期に感染したウイ ルスが、体内に潜んで潜伏感染を成立し、このウィルスが何らかの刺激によって再び 増殖を開始する (再活性化)ことがあげられる。
[0008] この再活性化を誘導する刺激として可能性が指摘されるのが、疲労、特に精神的 疲労やストレスである。ヘルぺスウィルスの中でも、口唇へルぺスウィルスの原因とな る単純へルぺスウィルス I型の再活性化は、しばしば口唇へルぺスとして観察される が、この口唇へルぺスは、ウィルス保持者が非常に疲労したときに出現することが多 いと言われている。
[0009] しカゝし実際にはへルぺスウィルスの再活性化が、どのような刺激で誘導されるのか は、ほとんど明らかになっていない。ヘルぺスウィルスの再活性化と疲労やストレスと の関係については、学術的な証明は行われておらず、上記した単純へルぺスウィル ス I型と疲労の関係も、民間伝承にすぎない。
[0010] 上述のように、筋肉負荷 (運動負荷)による筋肉疲労 (運動疲労)の客観的な判定 方法は提案されている力 日常生活における疲労症状は、先に述べたように、多くの 現代人が感じているものであるにも関わらず、その客観的な評価方法について、ほと んど報告がなされていない。 日常生活における疲労症状は、そのまま放置すると長 時間過密の働きすぎによる突然死である過労死に直結するおそれもある。過労死の 問題は医学的、経済的、社会的にも非常に重要であると認識されているにもかかわ らず、その科学的メカニズムについてほとんど解明されていない。このため、近年、社 会問題ィ匕している過労死を防止するためにも客観的な疲労度の評価方法が必要とさ れている。
[0011] さらに、市場に氾濫する栄養ドリンクなどの医薬品または健康食品等の多くは、疲
労を回復または抑制する機能性を売り物としたものであるため、その機能性に対する 科学的な裏づけが消費者のみならず市場 '社会全体において広く求められている。
[0012] 以上のように、運動負荷による疲労にっ 、ての知見はあるものの、運動負荷による 疲労と日常生活における疲労とはまったく異なるものであり、日常生活における疲労 の評価方法は開発されていない。このため、簡便かつ客観的に in vivoにおける日常 生活における疲労についての評価方法およびその利用法の開発が強く求められて いる。
特許文献 1：特開平 11-038004号公報
特許文献 2：特開平 11-304792号公報
特許文献 3：特開平 11-304793号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明の課題は、簡便かつ定量的に疲労度を評価する方法及び利用法、疲労度 を評価するためのキット、ならびに抗疲労物質の抗疲労力測定方法を提供することに ある。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、体液中のヒトヘルぺスウィルス
(HHV)の量を測定'評価することにより、 日常生活の疲労に対する疲労度を定量的 に評価できることを独自に見出し、この実験系を利用して日常生活における疲労度を 測定することができる本発明を完成させるに至った。
[0015] すなわち、本発明にかかる疲労度評価方法は、上記の課題を解決するために、体 液中の少なくとも 1種の HHVの量を指標として疲労度を評価することを特徴とする。上 記の方法では簡便かつ客観的にヒトの疲労度を評価でき、疲労回復又は抑制効果 を持つ医薬品をはじめ、栄養ドリンクや健康食品といった栄養補助食品の効果効能 を定量的に求めることも可能である。さらに、長時間の労働などで引き起こされやす い過労状態を簡便かつ客観的に発見することも可能である。
[0016] 本発明にかかる疲労度評価キットは、上記の課題を解決するために、上述の疲労 度評価方法を実施するためのものであることを特徴としている。
[0017] 本発明にかかる抗疲労物質の抗疲労力測定方法は、上記の課題を解決するため に、上述の疲労度評価方法および疲労度評価キットのいずれ力を用いて、抗疲労物 質の抗疲労力を測定することを特徴としている。
[0018] すなわち、上記の課題を解決するために、より具体的には下記の発明が提供される。
[1]
体液中のヒトヘルぺスウィルスの量を指標として、被験者の疲労度を評価することを 特徴とする疲労度評価方法。
[2]
上記ヒトヘルぺスウィルスの量が多ければ、疲労度が高 ヽと評価することを特徴とす る [1]に記載の疲労度評価方法。
[3]
ヒトヘルぺスウィルス量を、ヒトヘルぺスウィルス遺伝子の発現量として測定する、 [2 ]に記載の疲労度評価方法。
[4]
上記ヒトヘルぺスウィルス量が多ければ、被験者が日常生活で生じる中長期的急 性疲労の蓄積による過労状態にあると評価することを特徴とする [1]ないし [3]のい ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[5]
上記ヒトヘルぺスウィルスのウィルス量が多ければ、被験者が疾患による慢性疲労 の状態であると評価することを特徴とする、 [1]な 、し [3]の 、ずれか一項に記載の 疲労度評価方法。
[6]
上記疲労度が、日常生活で生じる中長期的疲労または疾患による疲労であって、精 神疲労および Zまたは複合的な疲労による疲労度であることを特徴とする、 [1]ない し [5]の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[7]
上記体液は、血液、唾液、脳骨髄液および尿カゝら選ばれる少なくとも一種類である ことを特徴とする [ 1]な 、し [6]の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[8]
上記へノレぺスゥイノレスは、ヒトへノレぺスゥイノレス 6、ヒトへノレぺスゥイノレス 7、ヒトサイトメ ガロウィルスおよびェプシユタイン ·バーウィルス (EBV)力 選ばれる少なくとも一種 であることを特徴とする [1]な 、し [7]の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[9]
上記 [1]な 、し [8]の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法を実施するための疲 労度評価キット。
[10]
採取した体液中の HHVの量を測定する手段を含むキットであって、体液中のヒトヘル ぺスウィルスの量を指標として被験者の疲労度を評価するために使用できることが表 示されている、 [9]に記載のキット。
[11]
(i) 被験者が抗疲労物質の候補である物質を摂取する前に当該被験者の体液を採 取し、体液中の HHVの量を測定する摂取前 HHV量測定工程と、
(ii) 被験者が抗疲労物質の候補である物質を摂取した後に当該被験者の体液を採 取し、体液中の HHVの量を測定する摂取後 HHV量測定工程と、
(iii) (i)の摂取前 HHV量測定工程、及び (ii)の摂取後 HHV量測定工程によって得 られた、当該抗疲労物質の候補である物質の摂取前後における HHV量の変化の測 定結果に基づき、当該抗疲労物質の候補である物質の摂取前後における体液中の HHV量の変化を算出するウィルス量変化算出工程と、
(iv) (iii)のウィルス量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質の候補であ る物質の摂取前後における体液中の HHV量変化に基づき、当該抗疲労物質の候補 である物質の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程
とを含む、抗疲労物質の候補である物質の抗疲労効果評価方法。
[12]
(i) 抗疲労物質の候補である物質を摂取した被験者と、抗疲労物質の候補である物 質を摂取しな力つた被験者力もそれぞれ体液を採取し、それぞれの体液中の HHVの 量を測定する HHV量測定工程と、
(ii) (i)の HHV量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質の候補である物質の 摂取の有無による HHV量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質の候補であ る物質の摂取の有無による体液中の HHV量の変化を算出するウィルス量変化算出 工程と、
(iii) (ii)のウィルス量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質の候補である 物質の摂取の有無による体液中の HHV量変化に基づき、当該抗疲労物質の候補で ある物質の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程
とを含む、抗疲労物質の候補である物質の抗疲労効果評価方法。
[13]
上記 [1]ないし [8]のいずれか一項に記載の疲労度評価方法および [9]または [1 0]の 、ずれか一項に記載の疲労度評価キットの 、ずれかを用いて、抗疲労物質の 候補である物質の抗疲労効果を測定することを特徴とする、 [ 11 ]または [ 12]のいず れか一項に記載の抗疲労効果評価方法。
[14]
抗疲労物質をスクリーニングするための、 [11]ないし [13]のいずれか一項に記載の 抗疲労物質の候補である物質の抗疲労効果評価方法。
発明の効果
[0019] 本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キット、その利用方法、及び抗疲労 物質の抗疲労力測定方法によれば、被験者の体液を採取することにより、被験者の 当該疲労度が定量的に評価できるという効果を奏する。さらに、かかる方法及びキッ トは、いずれも簡便であるだけでなぐ長時間にわたる拘束も必要としないため、被験 者にとっては苦痛やわずらわしさを感じさせることがない。また、方法等も実施者にと つても簡便であり、被験者及び実施者の両者にとって非常に取り扱いやすいもので あるという効果を奏する。それゆえ、抗疲労物質のスクリーニング方法や、抗疲労能を 謳った食品等の in vivo評価に利用することができ、非常に有用な技術である。
[0020] 本発明に力かる疲労度評価キットによれば、例えば、被験者から体液を採取し、体 液中の HHVの量を測定し、その量を算出することで、疲労抑制又は回復効果がある 医薬品及び食品の効果効能を評価できる。すなわち、疲労抑制又は回復効果があ
る医薬品又は食品の生体における効果効能を簡便かつ定量的に求めることができる
[0021] 本発明の方法によれば、ヒトの疲労症状に対して、抗疲労物質がどの程度改善効 果を有するのか、すなわち、抗疲労物質の有する抗疲労力について、簡便かつ確実 、さらに定量的に、測定することができる。
[0022] 本発明は、日常生活における疲労度を簡便かつ定量的に測定'評価するための方 法、キット及びその利用法を提供するものである。このため、本発明によれば、日常 生活において、疲労度を客観的に知ることができ、疲労が知らず知らずのうちに蓄積 して引き起こされる種々の疾患の発生を回避できる。さらに、疲労を意識せずに働き 続けることにより発生する過労死の発生率を低下させることもできる。
[0023] さらに、本発明によれば、市場に数多く供給される、疲労回復、滋養強壮'栄養補 給を謳う医薬品や食品がどの程度生体において抗疲労力を発揮するの力 といった 情報を消費者及び社会に提供することができる。これらの情報は、消費者にとって、 過労の予防や、滋養強壮に有効な抗疲労食品や医薬品を選択する際の一つの目 安として利用することができるものであり、これらの点において、本発明は非常に有用 かつ社会的インパクトの強 、発明である。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]実施例 1における HHVの発現量を測定するための試験の日程表である。
[図 2]実施例 1における HHVの発現量の測定結果であって、被験者における HHV-6 の発現率 (被験者全体における、 HHV-6の DNAを発現した被験者の割合（％) )の変 化を示すグラフである。第一検査日（労作時)及び第二検査日（休暇直後）それぞれ の発現率を示す。
[図 3]実施例 2における HHVの DNAの発現量及び発現頻度の測定結果であって、 CS F患者及び健常者における HHV-7の DNAの発現量及び発現頻度の変化を示すダラ フである。 HHV-7の DNAの発現量を縦軸とし、発現が認められた各被験者をそれぞ れのカラムとして示して ヽる。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、本発明にかかる疲労度評価方法、キット、及び利用法について説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。
[0026] 本明細書における「疲労」とは、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えられた ときにみられる一時的な身体的，精神的機能および体力の質的あるいは量的な低下 現象で、生理的疲労と病的疲労に分類される。本明細書における「生理的疲労」とは 、健康な人が、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えられたときにみられる一時 的な身体的および精神的作業能力の質的あるいは量的な低下現象を意味し、「病的 疲労」とは、慢性疲労症候群、精神疾患、心臓病、肝炎、貧血、各種感染症、悪性腫 瘍などの疾患にともなう疲労を意味する。
[0027] 「生理的疲労」はさらに、「急性疲労」と「慢性疲労」に分類される。本明細書におけ る「急性疲労」とは、適切な休息によって回復する一過性の疲労を意味する。また、「 慢性疲労」とは、日々の回復が不完全なために，疲労が蓄積して長期間にわたる疲 労を意味する。本明細書における中長期的疲労とは、上記慢性疲労に至る前の急 性疲労を意味する。
[0028] 「急性疲労」、及び「慢性疲労」はそれぞれ、「精神疲労」と「肉体疲労」に分類され る。本明細書における「精神疲労」とは、複雑な計算や記憶、または思考などの心理 活動ば力りでなぐ我慢や緊張または時間に追われて作業をすることの焦操感など、 感情や意思の活動が過度に要求された場合に生じる、眼精疲労、心的ストレスを含 む疲労を意味する。また、本明細書における「肉体疲労」とは、肉体的作業の遂行や 電磁波の影響によって起こる疲労を意味する。さらに、本明細書における「精神疲労 負荷」とは、上記精神的疲労を与えることを意味する。
[0029] 本明細書における「遷延性疲労」とは、何らかの誘因によってもたらされた疲労が長 時間回復せずに継続する状態を意味する。
[0030] 本明細書における「複合的な疲労」とは、上記した各種の疲労の組み合わせ力もなる 疲労を意味する。
[0031] 本明細書における「疲労度」とは、上記に挙げた各種の「疲労」の結果生じた、過度 の肉体的、精神的な活動または、疾患の影響により生じた独特の病的不快感と休養 を求める欲求を伴う身体 ·精神機能および体力の減弱状態の度合いをいう。ここで「 身体あるいは精神機能の減弱状態」とは、身体および精神作業能力の質的あるいは
量的な低下を意味する。
[0032] 本明細書における「過労状態」とは、上記生理的疲労であって、慢性疲労である状 態が持続した結果、生体リズムが崩壊し、生命を維持する機能に致命的破綻をきた した状態であって、病的疲労に至る状態を意味する。
[0033] 本発明は、上記に挙げた各種の「疲労」の全てを対象とするものである力 なかでも、 生理的疲労の中でも急性疲労であって、中長期的疲労であることが好ましい。本発 明はさらに、中長期的疲労のうちの、精神疲労負荷に対する疲労であることが好まし い。また、本発明の対象は、遷延性疲労および慢性疲労症候群 (CFS)、癌、心臓病 、生活習慣病といった疾患に伴う疲労 (病的疲労)が好ましい。
[0034] 本発明を実施するために最適なウィルスの条件としては、ほとんどのヒトに潜伏感染 しており、多くのヒトを被験対象にすることができること、および再活性ィ匕したウィルス を測定することが簡単に行えることが挙げられる。
[0035] 上記条件を満たすウィルスとしては、ヒトヘルぺスウィルス (HHV)が挙げられる。上 記したように、 HHVには 3つの亜科があるが、たとえばヒトヘルぺスウィルス 6 (HHV-6) 、ヒトヘルぺスウィルス 7 (HHV- 7)、及びヒトサイトメガロウィルス（別名ヒトヘルぺスウイ ノレス 5)は、 13亜科に属し、ェプシユタイン'バーウイノレス EBVは γ亜科に属している。 上記ウィルスは、日本人の成人では、 9割以上のヒトが既感染で、体内に潜伏感染ゥ ィルスを保有している。特に、 HHV-6は 2歳以上で、 HHV-7は 5歳以上ですベての人 が感染するウィルスであるので、すべての成人が体内に潜伏感染ウィルスを保有して いると考えられる。したがって、本発明には、 HHV-6、 HHV-7,サイトメガロウィルス、 及びェプシユタイン ·バーウィルス (EBV)が好適であると考えられる。
[0036] また、これらのウィルスは再活性ィ匕した場合、唾液中にウィルス DNAが放出されること が知られているので、唾液中のウィルス DNAを測定すれば、ウィルスの再活性化を簡 便に測定することができる。
[0037] 以下に、本発明の概要を簡単に説明する。ここで述べる方法の概要は、後述する キット及び利用方法にも共通する部分が多分に存在する。
[0038] (1)疲労度評価方法
本発明者は、被験者の体液を採取し、体液中の HHVの量を測定することにより、ヒト
の疲労度を簡便かつ定量的に測定することができることを見出した。この方法は、大 掛カりな装置が必要ないだけでなぐ体液の採取時間が短いことから、被験者にとつ て時間的拘束が少なぐまた、方法の実施者にとっても非常に簡便な方法である。
[0039] 本発明の対象となるウィルスは、ヒトヘルぺスウィルス (HHV)に属すウィルスであれ ばよいが、 HHV- 6、 HHV- 7、サイトメガロウィルス、ェプシユタイン'バーウィルス（EBV )が好適である。さらに、 HHV-6、及び HHV-7がより好適である。
[0040] 本発明の対象となる体液は血液、唾液、脳脊髄液及び尿から選ばれる少なくとも一 種以上であればよいが、唾液が好適である。
[0041] 唾液の採取方法は、咽頭部の粘性液を綿棒で拭！ヽ取る方法、唾液を採取管に直 接吐き出す方法、唾液採取器具、例えばサリベット等を用いる方法力 選ばれる少な くとも一種以上であればよいが、サリベットを用いた方法が好適である。
[0042] また、唾液を採取する前の口腔内処理は、例えば、長時間食事をせずに安静にす る方法や唾液採取直前に水で口腔内をゆすぐ方法があげられるが、唾液採取直前 に水で口腔内をゆすぐ方法が好適である。
[0043] 体液中の HHVの量の測定は従来公知の方法であればよぐ具体的な手法、条件な どは、当業者であれば適宜設定可能である。ウィルス量を測定する方法としては、ゥ ィルス核酸の量を測定する方法、ウィルスタンパクの量を測定する方法などがある。
[0044] ウィルス核酸の量を測定する方法としては、例えば、唾液カゝら DNAを精製し、それ ぞれのヒトヘルぺスウィルスに特異的な PCRプライマーを用いて、ウィルス DNA量を P CR法により測定する方法（参考文献: Journal of Medical Virology 32:139- 142(1990)「 Detection of Human Herpesvirus 6 DNA in Throat Swabs by Polymeraseし hain Reac tion」）、ダブルネステッド PCR法（Double— Nested PCR)により測定する方法（参考文 献： Journal of Infectious Diseases 1993, 167:1197— 1200.「Association of HHV— 6 Infe ction of the central nervous system with recurrence of feonle convulsions.」)等 a罕 げられる。本発明においては、ダブルネステッド PCR法 (Double— Nested PCR)および リアルタイム PCR法（Rea卜 time PCR)が好適である。
[0045] ウィルスタンパクの量を測定する方法としては、例えば、ウィルスタンパクに対する 抗体を用いた免疫測定法 (ィムノアッセィ法）がある。代表的な免疫測定法として、例
えばサンドイッチ ELISA法などが挙げられる（参考文献: J. Clin. Microbiol. 1983 May; 17 (5): 942-4. 1 fyping of herpes simplex virus isolates by enzyme-linked immunosor bent assay: comparison between indirect and double-antibody sandwich techniques. 」Gerna G, Battaglia M, Revello MG, Gerna MT.)。
[0046] また、本発明に係る疲労度測定方法においては、上記体液中の HHVの量がより高 ければ、被験者の疲労度がより高いと評価することが好適である。これは、後述する 実施例に示すように、被験者の疲労度が高まれば、それに応じて被験者の HHVの体 液中の発現量が上昇することから導かれる。
[0047] さらに、本発明にかかる疲労度評価方法の一部あるいは全部をコンピュータ等の従 来公知の演算装置 (情報処理装置)を利用して行うことも可能であることは、当業者 には明らかである。例えば、本発明にかかる疲労度評価方法は、体液中の HHVの量 を測定する測定工程と、体液中の HHVの量の測定結果に応じて被験者の疲労度を 評価する評価工程とを含むと換言できるが、この中でも、特に評価工程に演算装置 を利用することができる。
[0048] (2)疲労度評価キット
次に、本発明にかかる疲労度評価キットについて説明する。本発明にかかる疲労 度評価キットは、ヒトにおける疲労度を評価するキットである。すなわち、上記（1)欄で 説明した本発明にかかる疲労度評価方法を実施するためのキットであればよい。詳 細には、被験者の体液中の HHVの量を測定する手段を含むキットであればよい。本 発明における体液中の HHVの量を測定する手段としては、従来公知の測定方法を 実施するために必要な手段であればよ!、。従来公知の測定方法を実施するために 必要な手段とは、具体的には、例えば、上記（1)欄で説明した体液中の HHVの量を 測定する方法を実施するために必要な試薬、器具、装置、触媒その他のものをいう。 本発明にかかる疲労度評価キットは、被験者の体液を採取するための手段を含んで いてもよい。また、その包装材に付されたラベル又は添付された文書に、体液中のヒ トヘルぺスウィルス (HHV)の量を指標として被験者の疲労度を評価するために使用 でさることが表示されて 、てちょ 、。
[0049] さらに本発明にかかる疲労度評価キットは、コンピュータなどの従来公知の演算装
置を用いてなるキットとなって 、てもよ 、。
[0050] (3)疲労度評価方法及び疲労度評価キットの利用法
以上のように、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットによれば、被験 者が抗疲労物質を摂取する前後において、被験者の体液中の HHVの量を測定する ことで、当該抗疲労物質の被験者生体内における抗疲労力を定量的に測定'評価 することができる。さらに、かかる方法、キットはいずれも簡便であるだけでなぐ大掛 力りな装置や長時間における拘束が必要ないため、被験者及び実施者の両者にとつ て非常に取り扱 、やす 、ものであると!/、う利点がある。
[0051] このため、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットのいずれかを用いて 、抗疲労物質の抗疲労力を測定する方法も本発明に含まれる。かかる抗疲労物質の 抗疲労力測定方法は、例えば、
(i) 被験者が抗疲労物質の候補である物質を摂取する前に当該被験者の体液を採 取し、体液中の HHVの量を測定する摂取前 HHV量測定工程と、
(ii) 被験者が抗疲労物質の候補である物質を摂取した後に当該被験者の体液を採 取し、体液中の HHV量を測定する摂取後 HHV量測定工程と、
(iii) (i)の摂取前 HHV量測定工程、及び (ii)の摂取後 HHV量測定工程によって得 られた、当該抗疲労物質の候補である物質の摂取前後における HHV量の変化の測 定結果に基づき、当該抗疲労物質の候補である物質の摂取前後における体液中の HHV量の変化を算出するウィルス量変化算出工程と、
(iv) (iii)のウィルス量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質の候補であ る物質の摂取前後における体液中の HHV量変化に基づき、当該抗疲労物質の候補 である物質の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程
とを含む方法と換言することもできる。
[0052] 本発明の抗疲労物質の候補である物質の抗疲労力を測定する方法においては、 さらに、力かる抗疲労物質の候補である物質を投与した被験者 (投与群)と、当該物 質を投与しなかった被験者 (非投与群）において、上記抗疲労力測定方法を実施す る方法とすることちでさる。
[0053] 被験者における抗疲労物質の候補である物質の摂取方法は、当業者であれば適
宜設定可能である。本明細書における「摂取」とは、被験者における当該物質の飲食 品としての摂取のみならず、当該物質の経口投与、及び非経口投与のいずれをも意 味する。
[0054] 本明細書における「抗疲労」とは、疲労の回復、抑制、または予防効果を意味する。
「抗疲労物質」とは、疲労を回復、抑制または予防する効果を有する物質、及び生体 機能補完物質を含む。「生体機能補完物質」とは、生体のバランスを整える物質を意 味し、免疫機能を高める機能を有する物質等を含む。
[0055] また、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットは、例えば、抗疲労物質 のスクリーニング方法に利用することができる。すなわち、本発明にかかる抗疲労物 質のスクリーニング方法は、上記疲労度評価方法、疲労度評価キットのいずれかを 利用して、抗疲労物質をスクリーニングする方法であればよぐその具体的な方法、 条件などは限定されるものではな 、。
[0056] 上記スクリーニング方法によれば、例えば、抗疲労食品として利用可能と思われる 食品を被験者に経口摂取させて、実際に in vivoで優れた抗疲労能を示す食品を簡 便かつ客観的に選択することができる。したがって、上記スクリーニング方法により得 られた抗疲労物質ゃ抗疲労食品は、生体における効果が証明されたものであり、巿 場にぉ 、て高 、評価を獲得することができる。
[0057] 本発明にかかる新規抗疲労物質は、上記スクリーニング方法により取得されたもの であればよぐ上記のスクリーニング方法により取得された抗疲労物質も本発明に含 まれる。
[0058] また、疲労が社会問題化されるにつれて、抗疲労機能を謳った抗疲労物質、抗疲 労食品が種類、数量とともに増カロしてきており、これらの食品の抗疲労力を適切に評 価する方法の開発も強く求められているが、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労 度評価キットおよびその利用法によれば、この要求にも応えることができる。
[0059] 以下、添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに 詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなぐ細部 につ 、ては様々な態様が可能であることは 、うまでもな!/、。さらに本発明は上述した 実施形態に限定されるものではなぐ種々の変更が可能であり、それぞれ開示された
技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲 に含まれる。
[0060] 本発明は文部科学省科学技術振興調整費生活者ニーズ対応研究「疲労および疲 労感の分子'神経メカニズムとその防御に関する研究」の成果である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例 1
[0061] 健常者を対象とし、労作時、及び休暇前後における被験者の唾液中の HHV-6の D NAの発現を測定した。対象被験者は 20人 (うち男性 11人、女性 9人)であり、平均年 齢は 34.45±8.92歳であった。本実施例は、インフォームド 'コンセントの条件を満たし た上で、本研究に参加した被験者カゝら得られた試料を用いて実施したものである。
[0062] (1)疲労度の測定
(1 1)試験日程
被験者は、図 1に示す試験日程に従って、唾液採取をおこなった。休暇期間中、被 験者は一切の労作は行わず、また過度の運動は避けている。
[0063] (1 - 2)唾液採取方法
検査当日は、前日の夜 9時より絶食とした。被験者は、唾液採取の直前に蒸留水で 口腔内を 2度ゆすいだ後、 2分間、サリベット（SARSTED社製)の中綿を口腔内に含 み、唾液を採取した。
[0064] (1 - 3)サンプル保存方法
採取した唾液は、即日、凍結保存 (-80°C)した。
[0065] (l -4) DNA|f¾
市販の DNA精製キット（QIAamp MinElute Virus Spin Kit, QIAGEN社製）を使用し 、採取した唾液サンプルより、キャリアー RNA存在下で DNA精製を行った。
[0066] (1 - 5) HHVウィルス DNA量の測定
ヘルぺスウィルス DNA量の測定は、 HHV- 6、 HHV- 7、ヒトサイトメガロウィルス、及 びェプシユタイン'バーウィルス (EBV)の 4種に関し、それぞれ特異的な PCRプライマ 一を用いて、ダブルネステッド PCR法を用いて測定した。なお、 HHV-6に特異的な P
CRプライマー配列であって、 IstPCRプライマー配列を配列番号： 1および配列番号： 2、および 2ndPCRプライマー配列を配列番号： 3および配列番号： 4に、 HHV-7に特 異的な PCRプライマー配列であって、 IstPCRプライマー配列を配列番号： 5および配 列番号： 6、および 2ndPCRプライマー配列を配列番号： 7および配列番号： 8に、ヒトサ イトメガロウィルスに特異的な PCRプライマー配列であって、 IstPCRプライマー配列を 配列番号： 9および配列番号： 10、および 2ndPCRプライマー配列を配列番号： 11およ び配列番号： 12に、ならびにェプシユタイン'バーウィルス（EBV)に特異的な PCRプラ イマ一配列であって、 IstPCRおよび 2ndPCRプライマー配列を配列番号： 13および配 列番号： 14に記載する。なお、ェプシユタイン'バーウィルス（EBV)は、 IstPCRおよび 2ndPCRにお 、て同じプライマー配列を用いた。
[0067] HHV-6の DNA量測定に関する参考文献
Journal of Virol. 2002, 76(8): 4145-4151, K. Kondo他、 "Identification of human her pesvirus 6 latency-associated transcripts.
ヒトサイトメガロウィルスの DNA量測定に関する参考文献
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93: 11137-11142, K. Kondo他、 "Human cytomeg alovirus latent gene expression in granulocyte-macrophage progenitors in culture an d in healthy seropositive individuals.
[0068] (2)結果
上記 4種のウィルスのうち、 HHV-6及び HHV-7が健康な成人の唾液から高頻度に 検出されることが見出された。一方、ヒトサイトメガロウィルスおよびェプシユタイン'バ 一ウィルスの検出率は、 HHV-6及び HHV-7と比べて低!、ものであった。
[0069] HHV-6の DNA量の測定結果を図 2に示す。唾液 20 1を一回の測定に用いた。勤 務時間の延長などによるやや過度の労作時 (第一検査日）にお 、ては、被験者のう ち 88%において、 HHV-6の DNAが検出された。これに対し休暇直後（第二検査日） では、 HHV-6の DNAが検出されたのは、被験者のうち 23.8%であった。これは、労作 時には HHV-6が有意に再活性ィ匕していることを示している。この結果より、 HHV-6の 再活性ィ匕によって唾液中に発現する HHV-6の DNAは、疲労によって変動する疲労 ノィォマーカー（生体指標因子)であることが見出された。したがって、 HHV-6の再活
性ィ匕によって唾液中に放出される HHV-6の DNAを検出することによって、簡便に疲 労度を評価できる客観的な疲労度評価方法が開発された。
実施例 2
[0070] (3)慢性疲労症候群 (CFS)患者における HHV-7の発現量
(3— 1)試験方法
慢性疲労症候群 (CFS)患者 24名および実施例 1の健常者 20名を対象とした。患者 は、大阪大学医学部附属病院の CFS外来を受診した CFS患者で、厚生労働省の診 断基準を満たす患者を対象とした。 本実施例は、インフォームド 'コンセントの条件を 満たした上で、本研究に参加した被験者カゝら得られた試料を用いて実施したもので ある。
[0071] (3— 2)唾液採取方法
被験者は、唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を 2度ゆすいだ後、 2分間、サリベッ ト（SARSTED社製)の中綿を口腔内に含み、唾液を採取した。
[0072] (3— 3)検出方法
実施例 1における項目（1— 3)から（1— 5)と同様に、 HHVの検出及び測定を行なつ た。
[0073] (4)結果
上記 4種のウィルスのうち、特に HHV-7が患者の唾液から高頻度、かつ大量に検出 されることが見出された。一方、 HHV-7に比べ、ヒトサイトメガロウィルス、 HHV-6、お よびェプシユタイン.バーウィルスの検出頻度及び検出量は、低レベルであった。
[0074] HHV-7の測定結果を図 3に示す。唾液 20 μ 1を段階的に希釈した後、ダブルネステ ッド PCR法を用いて HHV-7 DNAを半定量的に測定した。被験者のうち、 CSF患者の 92%において HHV-7 DNAが検出された。これに対し、健常者においては、就労中に おいて 50%、休息時においては 30%の被験者においてのみ、 HHV-7 DNAが検出さ れた。また、半数の CSF患者の HHV-7 DNA量は、健常人で平均的に検出される量 の 10倍から 100倍に達していた。これは、疾患にともなう慢性疲労では、 HHV-7が有 意に再活性ィ匕していることを示している。この結果より、 HHV-7の再活性ィ匕によって 唾液中に発現する HHV-7の DNAは、疾患などによる慢性疲労によって変動する疲
労バイオマーカー（生体指標因子)であることが見出された。したがって、 HHV-7の再 活性ィ匕によって唾液中に放出される HHV-7の DNAを検出することによって、簡便に 慢性疲労による体力の低下を評価できる客観的な疲労度評価方法が開発された。 産業上の利用可能性
本発明にかかる疲労度評価方法は、ストレスや疲労メカニズムの解明に利用するこ とができ、ストレス解消方法の開発、疲労の程度評価、疾患にともなう体力低下の評 価をすることができる。また、本発明を利用することにより、市場に出回る抗疲労を謳 う健康食品、特定保健用食品、栄養ドリンクおよび生体機能補完物質などの効果の 定量ィ匕 (評価)が可能になる。よって本発明は、医療業、製薬業、健康食品産業、健 康機器産業等の広範な分野に利用が可能である。
Claims
請求の範囲
[I] 体液中のヒトヘルぺスウィルスの量を指標として、被験者の疲労度を評価することを 特徴とする疲労度評価方法。
[2] 上記ヒトヘルぺスウィルスの量が多ければ、疲労度が高いと評価することを特徴とす る請求項 1に記載の疲労度評価方法。
[3] ヒトヘルぺスウィルス量を、ヒトヘルぺスウィルス遺伝子の発現量として測定する、請 求項 2に記載の疲労度評価方法。
[4] 上記ヒトヘルぺスウィルス量が多ければ、被験者が日常生活で生じる中長期的急 性疲労の蓄積による過労状態にあると評価することを特徴とする請求項 1ないし 3の
V、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[5] 上記ヒトヘルぺスウィルスのウィルス量が多ければ、被験者が疾患による慢性疲労 の状態であると評価することを特徴とする、請求項 1ないし 3のいずれか一項に記載 の疲労度評価方法。
[6] 上記疲労度が、日常生活で生じる中長期的疲労または疾患による疲労であって、精 神疲労および Zまたは複合的な疲労による疲労度であることを特徴とする、請求項 1 な！、し 5の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[7] 上記体液は、血液、唾液、脳骨髄液および尿カゝら選ばれる少なくとも一種類である ことを特徴とする請求項 1な 、し 6の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[8] 上記へルぺスウィルスは、ヒトヘルぺスウィルス 6、ヒトヘルぺスウィルス 7、ヒトサイトメ ガロウィルスおよびェプシユタイン ·バーウィルス (EBV)力 選ばれる少なくとも一種 であることを特徴とする請求項 1な 、し 7の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法。
[9] 上記請求項 1な!、し 8の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法を実施するための 疲労度評価キット。
[10] 採取した体液中の HHVの量を測定する手段を含むキットであって、体液中のヒトヘル ぺスウィルスの量を指標として被験者の疲労度を評価するために使用できることが表 示されている、請求項 9に記載のキット。
[II] (i) 被験者が抗疲労物質の候補である物質を摂取する前に当該被験者の体液を採 取し、体液中の HHVの量を測定する摂取前 HHV量測定工程と、
(ii) 被験者が抗疲労物質の候補である物質を摂取した後に当該被験者の体液を採 取し、体液中の HHVの量を測定する摂取後 HHV量測定工程と、
(iii) (i)の摂取前 HHV量測定工程、及び (ii)の摂取後 HHV量測定工程によって得 られた、当該抗疲労物質の候補である物質の摂取前後における HHV量の変化の測 定結果に基づき、当該抗疲労物質の候補である物質の摂取前後における体液中の HHV量の変化を算出するウィルス量変化算出工程と、
(iv) (iii)のウィルス量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質の候補であ る物質の摂取前後における体液中の HHV量変化に基づき、当該抗疲労物質の候補 である物質の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程
とを含む、抗疲労物質の候補である物質の抗疲労効果評価方法。
[12] (i) 抗疲労物質の候補である物質を摂取した被験者と、抗疲労物質の候補である物 質を摂取しな力つた被験者力もそれぞれ体液を採取し、それぞれの体液中の HHVの 量を測定する HHV量測定工程と、
(ii) (i)の HHV量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質の候補である物質の 摂取の有無による HHV量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質の候補であ る物質の摂取の有無による体液中の HHV量の変化を算出するウィルス量変化算出 工程と、
(iii) (ii)のウィルス量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質の候補である 物質の摂取の有無による体液中の HHV量変化に基づき、当該抗疲労物質の候補で ある物質の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程
とを含む、抗疲労物質の候補である物質の抗疲労効果評価方法。
[13] 上記請求項 1な!、し 8の 、ずれか一項に記載の疲労度評価方法および請求項 9ま たは 10の 、ずれか一項に記載の疲労度評価キットの 、ずれかを用いて、抗疲労物 質の候補である物質の抗疲労効果を測定することを特徴とする、請求項 11または 12 の!、ずれか一項に記載の抗疲労効果評価方法。
[14] 抗疲労物質をスクリーニングするための、請求項 11ないし 13のいずれか一項に記載 の抗疲労物質の候補である物質の抗疲労効果評価方法。
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