WO2006003927A1

WO2006003927A1 - 非炎症性ストレス応答の指標剤およびその利用

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Publication number: WO2006003927A1
Application number: PCT/JP2005/011933
Authority: WO
Inventors: Atsuo Sekiyama
Original assignee: Atsuo Sekiyama
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2006-01-12
Also published as: NZ552908A; EP2177907B1; US20140065641A1; EP1780542A1; AU2005258569B2; DK2177907T3; EP2177907A2; US20120258468A1; HK1143416A1; AU2005258569A1; EP2177907A3; US20090004683A1; JP5069000B2; JPWO2006003927A1; EP1780542A4

Abstract

　ストレスに曝された生体内の事象を分子生物学的に可視化し、定量的に検出できる系、およびストレスを管理可能な手段を提供する。スーパーオキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤であって、ＩＬ－１８を含有してなる指標剤、前記指標剤を検出するための非炎症性ストレス応答の可視化剤、前記可視化剤を用いることを特徴とする非炎症性ストレスの程度を測定する方法、前記可視化剤を動物に適用することを特徴とする非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法、および前記指標剤の量または活性を低減させるための非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤。

Description

明細書

非炎症性ストレス応答の指標剤およびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、非炎症性ストレス応答の指標剤およびその利用に関するものである。詳しくは、分子生物学的にストレスを解明してメンタルヘルス分野の科学的発展に寄与するものである。

背景技術

[0002] 精神的および Zまたは肉体的ストレスは、神経、内分泌および免疫系を含む宿主の防御に影響を及ぼす (非特許文献 1および 2を参照)。種々のサイト力イン (例えば、 IL- 1 β、 IL— 6、 TNF- aなど）は、ストレスによってアップレギュレートする（非特許文献 1および 3を参照)。このことは、サイト力インが宿主防御の妨害に関与している可能性を示唆する (非特許文献 4を参照)。しかしながら、ストレスが宿主防御を損なうサイト力インを誘導する分子機構は、十分に理解されて、な、。

[0003] インターロイキン一 18 (IL— 18)は、インターフェロン一 γ (IFN— γ )誘導因子として発見されたサイト力インである（非特許文献 5および特許文献 1を参照)。 IL— 18は、 Fasリガンドの誘導、 T細胞の細胞溶解活性の上昇 (非特許文献 6を参照）ならびに IL— 4および IL— 13の産生 (非特許文献 7を参照）を初めとする多彩な生物活性を有する（非特許文献 8を参照)。 IL— 18は、 Toll— likeレセプター 2を活性ィ匕させ (非特許文献 9を参照）、骨髄分化タンパク質 (Myd)—88を活性化させる (非特許文献 1 0を参照)。これらの活性ィ匕は IL— 6の誘導に必要である（非特許文献 11を参照)。したがって、 IL—18は、 Thlおよび Th2両サイト力インの産生に関与している（非特許文献 12を参照)。

[0004] IL- 18は、 24kDの前駆体タンパク質として産生され、 IL—Ι β変換酵素（ICE、またはカスパーゼ— 1ともいう）により、 18kDの成熟活性型にプロセッシングされる（非特許文献 13を参照)。カスパーゼ 1は、不活性型前駆体タンパク質プロカスパーゼ —1として誘導され、カスパーゼ— 11によって活性化される (非特許文献 14を参照）。カスパーゼ— l lmRNAの発現は、 NF— κ Βのトランス活性化を必要とし（非特許文献 15を参照）、この活性ィ匕は P38MAPキナーゼが媒介することが報告されている (非特許文献 16を参照）。カスパーゼ— l lmRNAの LPS (リポポリサッカリド）による誘導ならびにその後のカスパーゼー 1の活性ィ匕は、神経膠腫細胞株 C6において、 P 38MAPキナーゼ阻害剤である SB203580により抑制されることが報告されている（非特許文献 17を参照)。

[0005] 最近の研究では、 IL— 18mRNAは副腎にお!、て副腎皮質刺激ホルモン (ACTH )および寒冷ストレスに応答して発現することが報告されている（非特許文献 18を参照）。また、副腎と免疫細胞とでは IL—18mRNAについては異なるプロモーターを使用していることが報告されている (非特許文献 19を参照)。しかしながら、成熟型の IL— 18の誘導は、前記両研究では示されていない。他方、精神医学的患者において、血漿中の IL— 18の上昇が報告されている (非特許文献 20を参照)。

[0006] 現代社会においては、ヒトは様々なストレスに曝されて労働し、生活している。一般に、ストレスの感じ方には個人差があり、ストレスの有無や強弱について明確な指標がなかった。これまでの研究では、ストレスが IL— 18などのサイト力インの上昇を招いているのかどうか、ならびに IL— 18がストレスにより誘導される宿主防御の障害に役割を果たして、るのかどうかは明らかにされてヽな、。

特許文献 1：特開平 8— 193098号公報

非特許文献 l : Dugue, B. et al. Scand. J. Clin. Invest. 53, 555 - 561 (1993)

非特許文献 2 :Kiecolt— Glaser, J. K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 93, 3043- 3047 (1996)

非特許文献 3 : Endocrinology 133, 2523- 2530 (1993)

非特許文献 4: Schubert, C. et al. Psychosom. Med. 61, 876— 88

2 (1999)

非特許文献 5 : Zhou, D. et al. Nature 378, 88— 91 (1995) 非特許文献 6 :Nakanishi, K. et al. Annu. Rev. Immunol. 19 423

-474 (2001)

非特許文献 7 :Hoshino, T. et al. J. Immunol. 162, 5070- 5077 ( 1999)

非特許文献 8:Dinarello, C. A. et al. J. Leukoc. Biol. 63, 658— 664 (1998)

非特許文献 9:Blease, K. et al. Inflamm. Res. 50, 552— 560 (20 01)

非特許文献 10:Adachi, O. et al. Immunity 9, 143— 150 (1998) 非特許文献 ll:Takeuchi, O. et al. J. Immunol. 165, 5392-5396 (2000)

非特許文献 12:Hoshino, T. et al. J. Immunol. 166, 7014— 7018 (2001)

非特許文献 13: Gu, Y. et al. Science 275, 206— 209 (1997) 非特許文献 14:Wang, S. et al. Cell 92, 501-509 (1998) 非特許文献 15:Schauvliege, R. et al. J. Biol. Chem. 277, 41624

-41630 (2002)

非特許文献 16:Vanden Berghe, W. et al. J. Biol. Chem. 273, 3 285-3290 (1998)

非特許文献 17:Hur, J. et al. FEBS Lett. 507, 157—162 (2001) 非特許文献 18:Conti, B. et al. J. Biol. Chem. 272, 2035— 2037 (1997)

非特許文献 19:Suganuma， S. et al. J. Immunol. 165, 6287— 629 2 (2000)

非特許文献 20:Kokai, M. et al. J. Immunother. 25, 68— 71 (200 2)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

本発明の目的は、ストレスに曝された生体内の事象を分子生物学的に可視化し、定量的に検出できる系を提供することにある。本発明の別の目的は、ストレスによる身体障害を管理回避可能な手段を提供することにある。課題を解決するための手段

[0008] 本発明者は、拘束ストレスを受けたマウスにおけるサイト力インの発現を調べるに際し、 IL— 18前駆体タンパク質のプロセッシングと血漿中への成熟型 IL— 18の放出に焦点を定めて研究を進めていったところ、ストレスにより IL— 18を活性ィ匕させる生体内のカスケードが誘導されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

[0009] すなわち、本発明は、

[I]スーパーォキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤であって、非炎症性ストレスカスケードに関与する成分を含有してなる指標剤、

[2]前記非炎症性ストレスカスケードに関与する成分力 IL—18、活性型 IL—18、 P 38MAPキナーゼ、リン酸化 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11、カスパーゼ 1、活性ィ匕カスパーゼ 1からなる群力選択される 1または 2以上のタンパク質を含有することを特徴とする上記 [ 1 ]記載の指標剤、

[3]前記非炎症性ストレスカスケードに関与する成分力 IL 18である上記 [1]記載の指標剤、

[4]前記 IL 18が血中に存在する活性型 IL 18である上記 [3]に記載の指標剤、 [5]さらに P38MAPキナーゼを含有してなる上記 [3]または [4]に記載の指標剤、 [6]前記 P38MAPキナーゼがリン酸ィ匕されたものである上記 [5]に記載の指標剤、 [7]前記 P38MAPキナーゼがマウス由来であり、当該キナーゼのリン酸ィ匕部位が T hrl80または Tyrl82である上記 [6]に記載の指標剤、

[8]前記 P38MAPキナーゼがヒト由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位が Thrl 85または Tyrl87である上記 [6]に記載の指標剤、

[9]さらにカスパーゼー 11を含有してなる上記 [3]〜 [8] V、ずれかに記載の指標剤、 [10]さらにカスパーゼー 1を含有してなる上記 [3]〜 [9] V、ずれかに記載の指標剤、

[I I]前記カスパーゼ 1が活性ィヒカスパーゼ 1である上記 [ 10]に記載の指標剤

[12]前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである上記 [3]〜 [11] 、ずれかに記載の指標剤、

[13]前記精神的ストレスが拘束ストレスである上記 [12]に記載の指標剤、 [14]上記 [1]〜[13]いずれかに記載の指標剤を検出するための非炎症性ストレス応答の可視化剤、

[15]IL— 18抗体を含有する上記 [14]に記載の可視化剤、

[16]前記 IL 18抗体が活性型 IL 18を特異的に認識するものである、上記 [ 15] に記載の可視化剤、

[17]さらに P38MAPキナーゼ抗体を含有する上記 [ 15]または [ 16]に記載の可視化剤、

[18]前記 P38MAPキナーゼ抗体が抗リン酸化 P38MAPキナーゼ抗体である上記 [17]に記載の可視化剤、

[19]前記抗リン酸化 P38MAPキナーゼ抗体がリン酸化 Thrl80もしくは Tyrl82を有する P38MAPキナーゼ、またはリン酸化 Thrl85もしくは Tyrl87を有する P38M APキナーゼを認識するものである上記 [18]に記載の可視化剤、

[20]さらにカスパーゼ 11抗体を含有する上記 [ 15]〜 [ 19] 、ずれかに記載の可視化剤、

[21]さらにカスパーゼ 1抗体またはカスパーゼー 1の基質を含有する上記 [ 15]〜 [20]いずれかに記載の可視化剤、

[22]前記カスパーゼー 1抗体が活性ィヒカスパーゼー 1を特異的に認識するものである、上記 [21]に記載の可視化剤、

[23]上記 [1]〜 [13]いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする非炎症性ストレスの程度を測定する方法、

[24]指標剤が、 IL— 18または活性型 IL— 18である上記 [23]記載の方法。

[25]上記 [14]〜 [22] V、ずれかに記載の可視化剤を用いることを特徴とする上記 [

23]または [24]に記載の方法、

[26]前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである上記 [23]〜 [25]の、ずれかに記載の方法、

[27]前記精神的ストレスが拘束ストレスである上記 [26]に記載の方法、

[28]上記 [14]〜 [22] V、ずれかに記載の可視化剤を含む非炎症性ストレスの測定キット。 [29]前記可視化剤が IL 18抗体を含有する上記 [28]記載のキット、

[30]前記 IL— 18抗体が活性型 IL— 18を認識するものである上記 [29]記載のキット、

[31]上記 [14]〜[22]いずれかに記載の可視化剤を動物に適用することを特徴とする、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法、

[32]前記動物がヒトを除く脊椎動物である上記 [31]に記載の予防、改善または予想方法、

[33]上記 [1]〜 [13] 、ずれかに記載の指標剤の量または活性を低減させるための非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤、

[34]前記治療剤の有効成分が IL 18抗体または抗 IL 18受容体抗体である上記 [33]に記載の治療剤、

[35]前記有効成分が IL 18抗体であり、当該 IL 18抗体が活性型 IL 18に特異的に結合するものである [34]に記載の治療剤、

[36]前記治療剤の有効成分がスーパーォキシドジムスターゼまたはビタミン Eである上記 [33]記載の治療剤、

[37]上記 [1]〜[13]いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質をスクリーニングする方法、

[38]前記指標剤が、 IL 18または活性型 IL 18である上記 [37]記載の方法。

[39]前記疾患が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、気管支喘息、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、月経異常、子宫内膜症または性欲低下である上記 [37]または [38]記載の方法、

[40]上記 [1]〜 [13]いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、酸化ストレスに対する抑制効果若しくは防止効果を有する物質をスクリー- ングする方法、

に関する。

発明の効果 [0010] 本発明の指標剤によれば、 IL 18成分、および非炎症性ストレスにより発生したス一パーォキシドが介在する P38MAPキナーゼを開始点とするカスケード (以下、ストレスカスケードと称する）レベルが明らかになり、個々の生体が受ける非炎症性ストレスの程度のみならず、宿主防御崩壊の危険を評価または予測する指標として役立つ

[0011] また、本発明の指標剤によれば、ストレスカスケードに関与する成分を含むことから、これらの成分および活性を減少させる物質のスクリーニングに利用することができ、力かる物質を有効成分とする医薬品ならびに保健機能食品 (特定保健用食品および栄養機能食品)の開発に役立つ。

[0012] 本発明の可視化剤によれば、 IL— 18およびストレスカスケードのレベルを定量することができ、制御が困難であった非炎症性ストレスを制御する途を開くことができる。

[0013] 本発明の非炎症性ストレスの程度を測定する方法によれば、個々の生体が受けるストレスの程度を容易に定量することが可能であり、特に労働者のメンタルヘルスに配慮した対策を講じるために有用である。

[0014] 本発明の非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法によれば、家畜または愛玩動物等の動物に適用することによって、人工的に飼育することがストレスを負荷することにつながりやすい畜産またはペット産業の分野において、動物の免疫状態を良好に維持し、病気に罹りにくい動物を飼育できるという効果を発揮する。

[0015] 本発明の免疫状態変動の治療剤によれば、非炎症性ストレスにより発症、悪化または再発する疾患の治療に役立つ。

[0016] ケラチノサイトは、表皮を形成しているので、 IL— 18の放出は皮膚の炎症と免疫に重大な影響を与えると考えられる。実際に、本発明者は IL— 18を発現しないマウスでは紫外線による炎症、免疫低下が乏しぐまた皮膚硬化と肥厚が起きないことを確認している。よって、本発明の治療剤によれば、 IL— 18の放出、ひいては皮膚の炎症、免疫変動、分化'増殖の調節異常を防ぐことができる。これは全くの新概念であり、紫外線などによる皮膚障害、また、 IL— 18が関与することが推測されているアトピ一性皮膚炎、乾癬、尋常性挫創、天疱瘡、魚鱗癬、光線過敏症のほか、皮膚における炎症性変化を病態に含む熱傷、放射線皮膚障害、創傷治癒などに対しても、本発明の治療剤が有効である。さらに本発明の可視化剤を用いることが病態の解明、創薬開発、治療モデル開発に役立つ。

[0017] マイクログリアゃァストロサイトは中枢神経系に分布し、神経細胞の生存や中枢神経系における炎症や生体防御システムの中核をになっている。 IL— 18は、急性に作用した場合炎症を弓 Iき起こすなどの効果を持つので、これによりマイクログリアゃァストロサイトが関与する脳の炎症、神経細胞の脱落、脳機能異常に対して本発明の治療剤が適用可能である。たとえば、アルッノヽイマ一病、アルツハイマー型老年痴呆、びまん性レビー小体病、ピック病、ビンスワンガー病、パーキンソン氏病、パーキンソン症候群、脳虚血、脳虚血 ·再還流性障害、一酸化炭素中毒、シンナー中毒、新生児出血性脳症、低酸素脳症、高血圧性脳症、てんかん、多発性硬化症、 HIV脳症、脳循環障害、脳血管障害などの疾患に対して適用可能である。また、ァストロサイトやマイクログリアは視床下部 ·下垂体などの内分泌関連箇所においても存在し、神経内分泌の制御に関与しているので、日周リズム異常、食欲異常、アジソン病や末端肥大症や性腺発達障害などの下垂体機能異常症、甲状腺機能異常症、肥満、血糖制御異常、二次的には原発性アルドステロン症、クッシング病などの副腎機能異常症、さらに消化管運動の制御や骨形成の異常などに対してもそれらグリア細胞からの IL— 18は関与しており、本発明の治療剤によって、非炎症ストレスによって上記の疾患や機能異常症が発症悪ィ匕するプロセスを回避制御できる。

[0018] マクロファージは生体のいたるところに存在し、血管中力も組織中に遊走するなどして生体防御反応 '炎症の制御の中心的役割をになっている。本発明の治療剤によれば、非炎症ストレスが関与してマクロファージ、 IL— 18が介在するあらゆる炎症性疾患と自己免疫性疾患、生体防御系の調節異常を回避制御できる。

[0019] 滑膜細胞は関節包を形成し、特に関節リウマチにおいては滑膜細胞とマクロファージが関与した炎症が病態の中核をなすことが知られている。また、関節炎などによつて滑膜細胞において炎症が発生した場合は、肥厚変形によって関節機能の障害や可動域制限が生じる。これらの現象にはサイト力インの関与が示唆されていた力サイト力イン放出カスケードの下流にあるサイト力インを制御することでは炎症の制御に限界があり、リバウンドによる炎症の激ィ匕などが問題であった。本発明の治療剤によれば、マクロファージにカ卩えて滑膜組織からの IL— 18の放出を抑制回避でき、それに続くサイト力インの放出や炎症機転を制御できる。これにより、関節リウマチや痛風や関節炎などの関節の炎症を病態の中核とする疾患が寒冷や精神的ストレス、睡眠不足や血流障害、物理的重量の負荷などの非炎症性ストレスによって発症 '再発'増悪することを、本発明の可視化剤 ·指標剤を制御することで回避制御できる。

[0020] 腎尿細管上皮細胞は体液調節において重要な役割を持ち、その局所における障害は腎不全、体液調節の異常、カリウム 'ナトリウム '塩素イオンのバランスの崩壊、浮腫、糖尿病などの耐糖能障害、るいそう、痙攣、心不全、肺水腫、低蛋白血症、出血傾向などを招く。本発明の治療剤によれば、感染や毒物、腎尿細管を傷害するシスブラチン'カルボブラチンなどの抗ガン剤によって、あるいは特発性の機序をもって腎尿細管上皮細胞の脱落、炎症を病態の中核とする疾患の発症増悪を回避制御できる。

[0021] また、血中 IL 18の上昇力副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、卵胞刺激ホルモン (FSH)、黄体刺激ホルモン (LH)の血中レベルの変動を惹き起こすことから、本発明の治療剤によって、血中 IL— 18の放出をコントロールすることにより、月経異常、子宮内膜症、性欲低下などの下垂体機能異常に起因する疾患が寒冷や精神的ストレス、睡眠不足や血流障害、物理的重量の負荷などの非炎症性ストレスによって発症 '再発'増悪することを、本発明の可視化剤 ·指標剤を制御することで回避制御できる。

図面の簡単な説明

[0022] [図 1A]拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中 IL— 18および ACTHレべルを示す図である。

[図 1B]拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中 IL— 18レベルが抗 ACTH 抗体またはデキサメタゾンにより抑制されることを示す図である。

[図 1C]拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中 IL— 18が抗 ACTH抗体またはデキサメタゾンにより抑制されることを示す図である。

[図 1D]ACTH を投与した後の血漿中 IL— 18と拘束ストレス負荷後の血漿中 IL— 1 8とを比較した図である。

[図 1E]ACTH を投与した後の副腎中 IL— 18と拘束ストレス負荷後の副腎中 IL— 1 8とを比較した図である。

[図 1F]副腎（レーン 1 3)および血漿（レーン 4 6)中の IL 18タンパク質をウェスタンブロッテイングにより調べた結果を示す図である。レーン 1および 4は対照、レーン 2および 5は ACTH投与した後、レーン 3および 6は拘束ストレスを負荷した後を示す

[図 2A]副腎中のプロカスパーゼ 1をウェスタンブロッテイングにより調べた結果を示す図である。レーン 1は対照、レーン 2は ACTH投与後、レーン 3は拘束ストレス負荷後である。

[図 2B]拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中カスパーゼー 1活性がカスパーゼー 1阻害剤 YVAD— CHOにより抑制されることを示す図である。

[図 2C]拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中 IL—18が YVAD— CHO により抑制されることを示す図である。

[図 2D]拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中 IL— 18は YVAD— CHO により抑制されな、ことを示す図である。

[図 2E]拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中カスパーゼー 1活性がカスパーゼ一 11阻害剤 Z—FA—fmkにより抑制されることを示す図である。

[図 2F]拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中 IL— 18活性がカスパーゼ

— 11阻害剤 Z— FA— fmkにより抑制されることを示す図である。

[図 3A]拘束ストレスによりアップレギュレートされるカスパーゼ 11前駆体力P38MA

Pキナーゼ阻害剤である SB203580により抑制されることを示す図である。

[図 3B]拘束ストレスにより誘導されるカスパーゼ一 1活性が SB203580により抑制されることを示す図である。

[図 3C]拘束ストレスにより誘導される血漿中 IL—18が SB203580により抑制されることを示す図である。

[図 3D]副腎中のリン酸化 P38MAPキナーゼをウェスタンブロッテイングにより調べた結果を示す図である。レーン 1はストレスなし、レーン 2はストレス負荷、レーン 3は YV AD— CHOを添加、レーン 4は Z— FA— fmkを添加、レーン 5はストレス負荷した力スパーゼ 1KOマウスの場合を示す。

圆 3E]ストレス負荷マウスの副腎の免疫組織ィ匕学を用いた染色の結果を示す写真である。副腎皮質の網状帯の重複した領域で、 IL 18 (パネル 1)、プロ Zカスパーゼ 1 (パネル 2)、プロ Zカスパーゼー 11 (パネル 3)、および活性化（リン酸化） P38M APキナーゼ (パネル 4)の誘導を示す。

[図 3F]カスパーゼ阻害剤の存在下で活性化（リン酸化) P38MAPキナーゼの発現を示す写真である。パネル丄はー八ー；^^を添加、ノネル 2は YVAD— CHOを添加した場合を示す。

[図 4A]拘束ストレスによりアップレギュレートされる活性ィ匕（リン酸化） P38MAPキナーゼが SODにより抑制されることを示す図である。

[図 4B]拘束ストレスによりアップレギュレートされるプロカスパーゼ 11が SODにより抑制されることを示す図である。

[図 4C]拘束ストレスにより誘導されるカスパーゼー1活性が SODにより抑制されることを示す図である。

[図 4D]拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中 IL— 18が SODにより抑制されることを示す図である。

[図 4E]拘束ストレスによりアップレギュレートされる副腎中 IL— 18が SODにより抑制されな、ことを示す図である。

[図 4F]拘束ストレスによりアップレギュレートされる血漿中 IL— 18が DPIにより抑制されることを示す図である。

[図 5A]ストレス負荷したマウスにおける血漿中 IL 6レベルを示す図である。

[図 5B]ストレス負荷した野生型マウスにおいて、アップレギュレートされる血漿中 IL 6レベルがカスパーゼ 1阻害剤、 SODおよび抗 IL— 18抗体により抑制されることを示す図である。

[図 6]MRLZlprマウスにおいて、ストレス負荷によるループス腎炎の増悪が抗 IL 6 抗体または抗 IL— 18受容体抗体投与により抑制されることを示す図である

[図 7A]パラコート刺激によるケラチノサイトからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤 (SOD)の効果を示す図である。

[図 7B]パラコート刺激によるケラチノサイトからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（ビタミン E)の効果を示す図である。

[図 7C]UV— B線照射によるケラチノサイトからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤 (SOD)の効果を示す図である。

[図 7D]UV—B線照射によるケラチノサイトからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（ビタミン E)の効果を示す図である。

[図 8A]パラコート刺激によるマイクログリア細胞力もの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（SOD)の効果を示す図である。

[図 8B]パラコート刺激によるマイクログリアからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（ビタミン E)の効果を示す図である。

[図 9A]パラコート刺激によるァストロサイトからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤 (SOD)の効果を示す図である。

[図 9B]パラコート刺激によるァストロサイトからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（ビタミン E)の効果を示す図である。

[図 10A]パラコート刺激によるマクロファージからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤 (SOD)の効果を示す図である。

[図 10B]パラコート刺激によるマクロファージからの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（ビタミン E)の効果を示す図である。

圆 11A]ノラコート刺激による滑膜組織からの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（SOD)の効果を示す図である。

圆 11B]ノラコート刺激による滑膜組織からの IL— 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤ビタミン E)の効果を示す図である。

[図 12A]パラコート刺激による腎尿細管上皮細胞からの IL 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤 (SOD)の効果を示す図である。

[図 12B]パラコート刺激による腎尿細管上皮細胞からの IL 18放出に対するスーパーォキシドの抑制剤（ビタミン E)の効果を示す図である。

圆 13A]IL— 18投与により惹き起こされる血漿中 ACTH濃度の変動を示す図。 [図 13B]IL— 18投与により惹き起こされる血漿中 FSH濃度の変動を示す図。

[図 13C]IL— 18投与により惹き起こされる血漿中 LH濃度の変動を示す図。

発明を実施するための最良の形態

[0023] 本発明は、非炎症性ストレスにより誘導されるスーパーォキシドが介在する新規カスケード (ストレスカスケード）を見出し、力かる知見力も非炎症性ストレスを可視化および管理することを可能ならしめたものである。

[0024] 以下、本明細書にぉ、て、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、 IUPAC— IUBの規定〔IUPAC— IUB Communication on Bio logical Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 138 : 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。

[0025] 本明細書にぉ、て「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号： 2、 4、 6、 8または 10)で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなぐこれらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体 (ホモ口グゃスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらは HomoloGene (http : ZZwww. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/)により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 95%、さらにより好ましくは 97%相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。

[0026] 従って本明細書にぉ、て「IL— 18タンパク質」または単に「IL— 18」 t 、つた用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列 (配列番号 2)で示されるヒト IL 18やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号： 2 (GenBank Accession N o. NM— 001562)に記載のアミノ酸配列を有するヒト IL— 18 や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。

[0027] また本明細書にぉ、て「P38MAPキナーゼタンパク質」または単に「P38MAPキナーゼ」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号 4)で示されるヒト P38MAPキナーゼやその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号： 4 (GenBank Accession No. NM— 138957)に記載のアミノ酸配列を有するヒト P38MAPキナーゼゃ、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。

[0028] また本明細書にぉ、て「カスパーゼ 11タンパク質」または単に「カスパーゼー 11」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号 6)で示されるマウスカスパーゼー 11やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号: 6 ( GenBank Accession No. MMCASP11)に記載のアミノ酸配列を有するマウスカスパーゼ 11や、そのヒトホモログ、ラットホモログなどが包含される。

[0029] また本明細書にぉ、て「カスパーゼ 1タンパク質」または単に「カスパーゼ 1」といった用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号 8)で示されるヒトカスパーゼー 1やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号: 8 (GenB ank Accession No. NM— 033292)に記載のアミノ酸配列を有するヒトカスバーゼー 1や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。

[0030] また本発明にお、て「IL— 6タンパク質」または単に「IL— 6」 t 、つた用語を用いる場合も、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列 (配列番号 10)で示されるヒト IL 6やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号： 10 (GenBank Accession No.

NM— 000600)に記載のアミノ酸配列を有するヒト IL 6や、そのマウスホモログ、ラットホモログなどが包含される。

[0031] 本発明における「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、または Fabフラグメントや Fab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。

[0032] また、本発明において、「生体防御系」とは、免疫系機能による防御系、神経 '内分泌系機能による防御系、特に、大脳皮質一視床下部—下垂体—副腎皮質系と自律神経系による防御系、並びにサイト力インを介した神経、内分泌及び免疫系による宿主の防御系を指す。

[0033] 本明細書において「非炎症性ストレス」とは、感染、腫瘍などによる炎症性ストレスを除くストレスをいい、スーパーォキシドが介在する、いわゆる酸化ストレスをも含むものであり、以下、単に「ストレス」と省略する場合がある。非炎症性ストレスとしては、具体的には、高温、低温、高圧、低圧、騒音、放射線、紫外線などによる物理的ストレス、酸素欠乏、重金属、ヒ素などの有害化学物質による化学的ストレス、怒り、不安、恐怖、緊張、拘束などによる精神的ストレスが例示できる力本発明においては物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスが好ましぐ精神ストレスとしては拘束ストレスがより好ましぐ特に長時間の拘束ストレスが好ましい。ここで、長時間とは生物や個体差により一概には言えないが、動物の場合で 6時間以上が例示される。物理的ストレスとしては、紫外線照射によるストレスが好ましぐ化学的ストレスとしては、有害化学物質曝露によるストレス、特にパラコート曝露によるストレスが好ま、。

[0034] 本明細書において「非炎症性ストレス応答」とは、非炎症性ストレスに曝された生体のストレスに対する生体内反応を、う。

[0035] 本明細書にぉ、て「スーパーォキシド」とは、生体内で生じる活性酸素の一種をヽい、スーパーォキシドア-オンまたはラジカルが代表的であり、体内でスーパーォキシドデイスムターゼ (SOD)により除去されたり、他の物質と反応することが知られている力本発明ではスーパーォキシドの代謝産物を含めた意味で用いられる。

[0036] 本発明の「指標剤」とは、スーパーォキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標となるものであって、以下の知見に基づいて本発明者により初めて明らかにされた「非炎症性ストレスにおけるサイト力インカスケード (ストレスカスケードと称する）」の発見によって完成されたものである。

[0037] 動物に拘束ストレスを与えると、副腎では 24kDの IL— 18前駆体タンパク質を、および血漿中では 18kD成熟型のレベルを増加させる（図 1)。このような増加は、ストレスによって血漿中の副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)が上昇した後に起こる。このことは、副腎中では IL— 18前駆体の誘導に ACTHが関与することを示す。これは、抗 ACTH抗血清投与が成熟型および前駆体型 IL 18の両方のレベルの増加を阻害することと、ストレスにより誘導された ACTH放出がデキサメタゾンによって阻害され、それにより成熟型および前駆体型 IL— 18も阻害されることの発見力支持される。これらの結果は、拘束ストレスが ACTHを誘導し、次に副腎中の IL 18前駆体を誘導することを示す。

[0038] ストレス負荷された動物の副腎では、 IL— 18前駆体タンパク質のみならず成熟型 I L— 18も誘導され（図 1F)、ストレスによって前駆体型力も成熟型への変換が生じていることを示唆する。 ACTHによる副腎中の IL 18前駆体誘導を阻害すると、血漿中の IL— 18レベルの抑制につながる。以上まとめると、 ACTHによって誘導される副腎中の IL 18前駆体は成熟型に変換されて血漿中に分泌されることが示唆される。 IL 18前駆体の成熟型への変換は、ストレス負荷された動物で血漿中の成熟 IL 18の蓄積における重要な制御過程である。

[0039] カスパーゼ 1前駆体とその活性は、 LPSによって副腎で誘導されることが報告されている。本発明では、カスパーゼ 1前駆体はストレスによっても副腎で誘導されることが示された（図 2A)。カスパーゼ一 1阻害剤である YVAD— CHOは、血漿 IL— 1 8の上昇を阻害する（図 2B)が、副腎の IL— 18前駆体誘導は阻害しない（図 2D)。ストレス負荷したカスパーゼー 1ノックアウト (KO)動物では、 IL- 18前駆体は副腎でァップレギュレートされる力血漿 IL— 18は検出不可能であった。これらの結果から、ストレスにより誘導されたカスパーゼ 1は、血漿中の成熟 IL— 18の蓄積に関して副腎中の IL— 18前駆体のプロセッシングを生じさせていることが示唆される。

[0040] カスパーゼ一 11は、カスパーゼ一 1を活性ィ匕させることが報告されている。本発明では、カスパーゼ 11の阻害剤である Z—FA—fmkがストレスによって活性化されるカスパーゼー 1の活性ィ匕を阻害したことから、ストレス負荷動物のカスパーゼー 1活性ィ匕におけるカスパーゼ 11の関与が示唆される。カスパーゼ 11前駆体の誘導は、 NF- κ Bのトランス活性化を必要とすること、および P38MAPキナーゼが NF— _K Bのトランス活性ィ匕を媒介することが報告されている。さら〖こ、 P38MAPキナーゼ阻害剤である SB203580がカスパーゼー 11の誘導をダウンレギュレートすることが報告されている。

[0041] 本発明者は、前記 SB203580がストレスにより誘導されたカスパーゼ 11のタンパク質レベル（図 3A)、カスパーゼー 1活性（図 3B)および血漿 IL 18レベル（図 3C) それぞれの増加を阻害して、ることを発見した。カスパーゼ 1阻害剤 YVAD - CH Oとカスパーゼー11阻害剤2— 八ー&^は、 P38MAPキナーゼのリン酸化に影響を与えることなぐ血漿 IL— 18レベルのストレスによって誘導される上昇を抑制する（図 3Dおよび 3F)。 P38MAPキナーゼタンパク質のストレスによって誘導されるリン酸化は、カスパーゼー 1KO動物でも野生型動物でも起こった（図 3C)。これらの結果から、 P38MAPキナーゼはカスパーゼー 11の上流にあり、 P38MAPキナーゼ→カスパーゼー 11→カスパーゼー 1カスケードを形成して、副腎で IL 18前駆体から成熟型への変換をもたらし、ストレス負荷動物で血漿中に活性型 (成熟型) IL— 18を放出することが示唆される。

[0042] 活性酸素種は、肺の繊維芽細胞、好中球および単球にぉ、て P38MAPキナーゼのリン酸ィ匕を媒介していることが報告されている。本発明においては、スーパーォキシドデイスムターゼ（SOD)力 P38MAPキナーゼの活性化（図 4A)、カスパーゼー1 1の誘導、副腎でのカスパーゼ 1の活性化および血漿中の IL 18レベルの上昇（図 4B, C, D)を阻害した。しかしながら、副腎での IL— 18前駆体の誘導は SODによつて影響されな力つた（図 4E)。これらの結果より、ストレスがスーパーォキシドを誘導し、これが P38MAPキナーゼカスケードを活性ィ匕させることが示唆される。したがつて、ストレス負荷動物における血漿中の IL— 18が生成する過程は以下のようにまとめられる。ストレスが視床下部―下垂体-副腎 (HPA)軸を活性ィ匕して ACTHを誘導する。また、ストレスはスーパーォキシドを生成させ、これが P38MAPキナーゼのリン酸化（Thrl80ZTyrl82)を誘導し、リン酸化された MAPキナーゼがカスパーゼ 11を誘導し、カスパーゼ 11が今度はカスパーゼ 1を活性ィ匕する。このように活性ィ匕されたカスパーゼ 1が副腎で IL 18前駆体をプロセッシングして成熟型にし、この成熟型が血漿中に分泌される。このような経路を「非炎症性ストレスにおけるサイト力インカスケード (ストレスカスケード） Jと称する。

[0043] IL- 18は、 IL— 6の誘導に必要な TLR2および Myd88を活性化させることから、 I L— 18が IL— 6を誘導する可能性が示唆される。本発明者は、ストレス負荷した野生型動物で血漿中の IL 6レベルが上昇するが IL 18KO動物では上昇しな!、ことを見出した（図 5A)。このことは、 IL— 6が IL— 18依存的に誘導されることを示唆する。これは、カスパーゼ 1阻害剤と SODで動物を処理すると血漿中の IL— 18および I L— 6のストレスによって誘導される上昇が阻害されたという結果、ならびにストレス負荷動物で抗 IL— 18抗体が IL— 6レベルを抑制するという結果により支持される。このような結果は、非炎症性ストレスが IL 18依存的に血漿中の IL 6レベルを上昇させるという最初の実証である。

[0044] すなわち、本発明のスーパーォキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤は、非炎症性ストレスにおけるサイト力インカスケードに関与する成分を含有することを特徴とする。サイト力インカスケードに関与する成分は、 IL— 18、活性型 IL— 18、 P38MAPキナーゼ、リン酸化 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11、カスパーゼ 1、活性ィ匕カスパーゼ 1からなる群力選択される 1または 2以上のタンパク質を含有すること力子ましく、 IL— 18を含有することがさらに好ましい。前記 IL— 18は、ヒトまたはマウスにお、ては 24kD前駆体または 18kD成熟体 (または活性型とも、う）タンパク質として存在するが、前記知見から、血中、より好ましくは血漿中に存在する活性型 IL —18であることが好ましい。前記活性型 IL— 18は、ヒトの場合、配列番号 2のァミノ酸配列において、 37〜193番目のアミノ酸配列を有するものが例示される。

[0045] 本発明の指標剤は、 IL— 18に加えて、前記知見から、 P38MAPキナーゼを含有することが好ましい。前記 P38MAPキナーゼは、リン酸ィ匕されたものであることがより好ましぐ前記 P38MAPキナーゼのリン酸化部位は、マウスの場合 Thrl80または T yrl82であること、またはヒトの場合 Thrl85または Tyrl87であることがさらに好ましい。

[0046] 本発明の指標剤は、 IL— 18および P38MAPキナーゼに加えて、前記知見から、カスパーゼ― 11を含有することが好まし、。

[0047] 本発明の指標剤は、 IL 18、 P38MAPキナーゼおよびカスパーゼー 11に加えて、前記知見から、カスパーゼ 1を含有することが好ましい。前記カスパーゼ 1は、プロカスパーゼー 1であっても活性化カスパーゼー 1 (成熟体）であってもよいが、 IL

- 18前駆体のプロセッシングを生じさせることから、活性ィ匕カスパーゼ一 1が好ましい。前記活性ィ匕カスパーゼ 1は、ヒトの場合、配列番号 8のアミノ酸配列において、 120〜404番目のアミノ酸配列を有するものが例示される。

[0048] 本発明の指標剤は、少なくとも IL— 18を含有していれば、 P38MAPキナーゼ、力スパーゼ 11およびカスパーゼ 1の 1種または 2種以上を含有するものであってもよいが、指標剤を構成する前記サイト力インおよび酵素は、別々の容器に格納されていることが好ましい。また、本発明の指標剤は、前記サイト力インおよび酵素を主成分とする限り、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、緩衝液、生理食塩水等の溶媒、安定化剤、静菌剤、防腐剤などがあげられるが、これに限定されるものではない。

[0049] 本発明の指標剤は、非炎症性ストレス、好ましくは物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレス、より好ましくは紫外線照射によるストレス、化学物質暴露によるストレス、拘束ストレスおよびこれらに起因する酸化ストレス、特に好ましくは拘束ストレスに動物が曝され、応答していることの指標となるものである。特に動物の血中、好ましくは血漿中の活性型 IL— 18を指標とすることにより、ストレスの程度を容易かつ定量的に知ることができる。血漿中の IL— 18の量は、例えばマウスの場合、ストレス負荷前は lOOpgZml以下であったものが 1時間のストレス負荷の後 5時間での値カ 120〜200 ₈ 1111、 6時間のストレス負荷後には lOOOpg/mlを超える値となり、ストレスの負荷が増すにつれて IL— 18の量も増加する。さらに、 IL— 18の半減期は、約 10時間であることからも、 IL— 18を含有する指標剤が非炎症性ストレス応答の指標として好適である。 IL—18に加え、副腎中の P38MAPキナーゼのリン酸化の上昇、カスパーゼー 11の量の増大またはカスパーゼー 1の活性の上昇も非炎症性ストレス応答の指標となる。具体的には、本発明の指標剤に含まれる IL— 18 の濃度を正常値力も弱、ストレスな、しは強、ストレスの場合の濃度までのものを準備し、検体と比較できるようにしておくことが好ま、。

[0050] また、本発明の指標剤は、 IL— 18を始めとするストレスカスケードに関与する成分を含むことから、これらの成分および活性を減少させる物質のスクリーニングに利用することができる。本発明の指標剤を用いるスクリーニング方法としては特に限定されるものではないが、例えば、ストレス負荷した動物に種々の物質を投与し、血中の活性型 IL— 18の量を有意に減少させる物質を選択する方法があげられる。かかるスクリー-ング方法によって選別された物質は、ストレスを管理可能な医薬品または保健機能食品の有効成分として使用することができる。

[0051] 本発明の非炎症性ストレス応答の可視化剤は、前記指標剤を検出するためのものである。したがって、本発明の可視化剤は、 IL— 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11およびカスパーゼ 1の少なくとも 1種または 2種以上を検出するものであれば特に制限されるものではなぐ前記サイト力インまたは酵素に特異的に結合する各種化合物、前記酵素の特異的基質を含有するものがあげられる。

[0052] 本発明の可視化剤は、 IL— 18を検出するためには、 IL— 18抗体を含有することが好ましぐ前記 IL— 18抗体は活性型 IL— 18を特異的に認識するものであることがより好ましい。

[0053] 本発明の可視化剤は、 IL— 18抗体に加え、さらに P38MAPキナーゼ抗体を含有することが好ましぐ当該 P38MAPキナーゼ抗体は、抗リン酸化 P38MAPキナーゼ抗体であることがより好ましい。前記抗リン酸ィ匕 P38MAPキナーゼ抗体は、マウスの場合リン酸化 Thrl80または Tyrl82を有する P38MAPキナーゼを認識するものであり、ヒトの場合リン酸化 Thrl85または Tyrl87を有する P38MAPキナーゼを認識するものであることがより好まし、。

[0054] 本発明の可視化剤は、 IL— 18抗体および P38MAPキナーゼ抗体に加え、さらにカスパーゼ 11抗体を含有することが好ましヽ。

[0055] 本発明の可視化剤は、 IL 18抗体、 P38MAPキナーゼ抗体およびカスパーゼー 11にカ卩え、さらにカスパーゼ— 1抗体を含有することが好ましい。前記カスパーゼ— 1抗体は、活性ィ匕カスパーゼ— 1を特異的に認識するものであることがより好ましい。

[0056] 本発明の可視化剤は、 IL 18抗体、 P38MAPキナーゼ抗体およびカスパーゼー 11に加え、さらにカスパーゼ— 1活性を測定可能な基質を含有することが好ましい。前記基質は、検出を容易にするため、酵素で切断されると蛍光を発するものであることがより好ましい。このような基質としては、例えば、実施例に記載されている Ac— Y VAD - MCAがあげられる。

[0057] 本発明の可視化剤は、少なくとも IL— 18抗体を含有しているものが好ましぐさらに P38MAPキナーゼ抗体、カスパーゼー 11抗体、カスパーゼー 1抗体およびカスバーゼ 1基質の 1種または 2種以上を含有するものであってもよいが、可視化剤を構成する前記抗体または基質は、別々の容器に格納されていることが好ましい。また、本発明の可視化剤は、前記抗体または基質を主成分とする限り、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、緩衝液、生理食塩水等の溶媒、安定化剤、静菌剤、防腐剤などがあげられるが、これに限定されるものではない。

[0058] 前記抗体または基質は、被験者における前記指標剤の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が非炎症性ストレスに曝されている力否かまたはそのストレス応答の程度を測定することのできるツール (ストレスマーカー）として有用である。

[0059] また前記抗体は、後述する非炎症性ストレスに基づく免疫状態の変動の予防、改善または予想において、 IL 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼー 11およびカスパーゼー 1のいずれかの発現変動を検出するためのツール (ストレスマーカー）としても有用である。

[0060] 前記抗体は、その形態に特に制限はなぐ IL 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ— 11およびカスパーゼ— 1のいずれかを免疫抗原とするポリクローナル抗体であつても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらにこれらタンパク質のァミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常 8アミノ酸、好ましくは 15アミノ酸、より好ましくは 20アミノ酸力もなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。

[0061] これらの抗体の製造方法は、公知であり、前記抗体も常法に従って製造することができる (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11. 12〜11. 13 (2000) )。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した IL— 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ— 11またはカスパーゼ 1を用いて、あるいは常法に従ってこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した IL— 18、 P38MAPキナーゼ、カスバーゼー 11もしくはカスパーゼー 1、またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols m Molecular Biology edit. Ausubei et al. (1987) Publis h. John Wiley and Sons. Section 11. 4〜11. 11)。

[0062] 抗体の作製に免疫抗原として使用され、かつ本発明の指標剤に含まれる IL 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11またはカスパーゼ 1は、本発明により提供される遺伝子の配列情報 (配列番号 1、 3、 5、 7)に基づいて、 DNAクローユング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフエクシヨン、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T. Maniatis et al. , CSH Laboratory (1983) , DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRES S (1985) )などに準じて行うことができる。

[0063] 具体的には、 IL 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11またはカスパーゼ 1 をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換え DNA (発現ベクター )を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これら IL— 18、 P38MAP キナーゼ、カスパーゼ 11またはカスパーゼ 1の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報 (配列番号 2、 4、 6、 8)に従って、一般的な化学合成法 ( ペプチド合成）によって製造することもできる。抗リン酸化 P38MAPキナーゼ抗体を製造するためには、リン酸ィ匕された Thrまたは Tyrを含むペプチドを合成すればょヽ

[0064] 本発明の非炎症性ストレスの程度を測定する方法は、本発明の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする。指標剤としては、 IL— 18が好ましぐ活性型 IL— 1 8がさらに好ましい。

[0065] 上記方法にお!、て「非炎症性ストレス」としては、好ましくは物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレス、より好ましくは、紫外線照射によるストレス、化学物質暴露によるストレス、拘束ストレス、およびこれらに起因する酸化ストレス、特に好ましくは拘束ストレスを挙げることができる。

[0066] 本方法の測定対象としては、動物から採取された血液、体液、組織、細胞、排泄物またはそれらの抽出物や、培養細胞から得られる細胞抽出液 (抽出物）、細胞培養液等を挙げることができるが、動物から採取した血液や、培養細胞の培養液が好ましい。前記動物としては、例えば、ヒト、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ィヌ、ネコ、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ノ、ムスター、 -ヮトリ等を挙げることができる。前記培養細胞としては、 IL— 18を産生する能力を有する細胞が好ましぐ例えば、滑膜細胞、腎尿細管上皮細胞、マイクログリア、ァストロサイト、マクロファージ、ケラチノサイト等を挙げることができる。

[0067] 上記方法において、指標剤の検出、定量等は、従来公知の方法がいずれも使用可能であるが、本発明の可視化剤を用いることが好ましぐこれら可視化剤を用いて、例えば、 ELISA法、ウェスタンブロット解析法等およびこれに準ずる方法に従い行うことができる。前記可視化剤は、 IL—18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11またはカスパーゼー 1に特異的に結合する性質を有することから、動物の組織内に発現した前記サイト力インまたは酵素を特異的に検出することができる。

[0068] 上記方法は、例えば、 IL 18を指標とする場合、血中または血漿中に放出された活性型 IL— 18を検出すればよいので、測定が容易である。前述したように、血漿中の IL— 18の量は、例えばマウスの場合、ストレス負荷前は lOOpgZml以下であったものが 1時間のストレス負荷の後 5時間での値が 120〜200pgZml、 6時間のストレス負荷後には lOOOpgZmlを超える値となり、ストレスの負荷が増すにつれて IL— 1 8の量も増加する。さらに、 IL— 18の半減期は、約 10時間であること力もも、 IL- 18 を含有する指標剤が非炎症性ストレス応答の指標として好適である。動物の代わりに培養細胞を用いて、培地 (または培養液）中に放出された IL— 18を検出、定量してもよい。 [0069] また、カスパーゼ 11またはカスパーゼ 1の場合、前記した基質との反応により生じた生成物を検出することによつても、ストレスの程度を測定することができる。具体的には、例えば、切断されると蛍光を発するようにしたカスパーゼー 11またはカスバーゼー 1の基質を動物に投与し、副腎中で切断されて血中に放出された蛍光を検出することができる。動物の代わりに培養細胞を用いた場合には、細胞抽出液中の蛍光を検出、定量することができる。検出された蛍光の強度から前記酵素活性の上昇の程度がわかり、あら力じめ決定しておいた基準値と比較することにより、非炎症性ストレスの程度を測定することができる。あるいは、上記抗体に蛍光剤、放射性分子または金属を結合させたものを動物に投与し、副腎での蛍光、放射性分子または金属の蓄橫を CT (computed tomographyノ、 MRI ^magnetic resonance imaging )、 PET、positron emission tomography)ま 7こ ίま： sPECT (single photon e mission computed tomography)などを用いて調べ、 IL— 18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ一 11またはカスパーゼ一 1を検出することができる。検出された蓄積量力これらストレス応答指標剤の各成分の有無またはその量の多少がわかり、あらカじめ決定しておいた基準値と比較することにより、検体におけるストレスの程度を柳』定することができる。

[0070] 本発明によれば、上記可視化剤を含む非炎症性ストレスの測定キットが提供される

[0071] 本発明のキットに含まれる可視化剤としては、 IL— 18、 P38MAPキナーゼ、カスバーゼ 11およびカスパーゼ 1の少なくとも 1種または 2種以上を検出するものであれば特に制限されるものではなぐ前記サイト力インまたは酵素に特異的に結合する各種化合物、前記酵素の特異的基質を含有するものを挙げることができるが、 IL- 1 8抗体を含有することが好ましぐ前記 IL 18抗体は活性型 IL 18を特異的に認識するものであることがより好ましい。本発明のキットによれば、測定対象の非炎症性ストレスの程度を簡便かつ迅速に測定することが可能となる。また、本発明の測定キットには、本発明の可視化剤のほか、測定、検出を実施するに際して必要な任意の他の試薬を更に包含することができる。具体的には、例えば、蛍光標識した IL— 18ゃ活性型 IL— 18、アツセィ緩衝液等を例示することができる。 [0072] 上記キットにおいて「非炎症性ストレス」としては、好ましくは物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレス、より好ましくは、紫外線照射によるストレス、化学物質暴露によるストレス、拘束ストレス、およびこれらに起因する酸化ストレス、特に好ましくは拘束ストレスを挙げることができる。

[0073] 非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動の診断に際しては、動物の種類に応じて血中の IL— 18の正常値 (対照値)を決定しておき、診断対象の血中の IL— 1 8の量を測定して正常値と比較して判定することが好ま、。測定値が正常値 (対照値)と比べて有意に高い場合、免疫状態の変動が起きていると判断することができる

[0074] 本発明にお、ては、スーパーォキシドが介在する非炎症性ストレス応答が免疫状態の変動を起こしていることから、前記測定方法、測定キットにおいて、または下記予防、改善または予想方法において、スーパーォキシドによりもたらされる血液、髄液、尿または唾液中の過酸ィ匕物をさらに測定することが好ましい。

[0075] 前記過酸化物としては、特に限定されるものではないが、脂質の過酸化反応によつて生成するァクロレイン、 4—ヒドロキシノネナール、マロンジアルデヒド、 4ーヒドロキシー 2—へキセナール、クロトンアルデヒド等の過酸化脂質、メチルダリオキザール等の過酸化糖質、 8—ヒドロキシ一 2，一デォキシグアノシン等の酸ィ匕塩基があげられる。過酸化物の有意な上昇と本発明による指標剤の有意な上昇とが確認された場合、動物が免疫状態の変動を起こしていることの有力な証拠となり、好ましい。

[0076] 前記可視化剤のうち、抗体を含有する可視化剤は、動物に適用することによって、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想することができ、本発明はカゝかる方法を提供する。

[0077] 前記動物は、ヒトを除く脊椎動物であることが好ましぐ特にゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ャギ、 -ヮトリ、ィヌ、ネコ等の家畜または愛玩動物が好ましい。本発明の予防、改善または予想方法を家畜または愛玩動物に適用することによって、人工的に飼育することがストレスを負荷することにつながりやすい畜産またはペット産業の分野において、動物の免疫状態を良好に維持し、病気に罹りにくい動物を飼育できるという効果を発揮する。 [0078] 本発明は、前記指標剤の量または活性を低減させるための非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤を提供する。

[0079] 本発明の治療剤は、前記指標剤の量または活性を低減させるためのものである。したがって、本発明の治療剤は、 IL—18、 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11およびカスパーゼー 1の少なくとも 1種または 2種以上の量または活性を低減させるものであれば特に制限されるものではなぐ前記サイト力インまたは酵素に特異的に結合する各種ィ匕合物またはスーパーォキシドの抑制剤 (抗酸ィ匕物質、抗酸化剤ともいう。）を有効成分として含有するものがあげられる。

[0080] 前記化合物としては、前記各種抗体があげられ、好ましくは IL— 18抗体または抗 I L— 18受容体抗体であり、より好ましくは活性型 IL— 18に特異的に結合する抗体である。

[0081] 前記スーパーォキシドの抑制剤としては、チオール化合物、抗酸ィヒペプチド 'アミノ酸、植物由来の各種ポリフエノール、大豆レシチン、コレステロール、クロロフィル、ノヽーブ抽出物（例えば、 Carnosol)、ヮサビ抽出物、スルフオラフアン（sulforaphane) およびその誘導体アナログ、イソチオシァネート（isothiocyanate)およびその誘導体アナログ、 6— (meththylsufinyl) hexyl isothiocyanate,カロチノイド、ビタミン B2、ビタミン E、亜鉛、グルタチオン、グルタチオンペルォキシダーゼ、カタラーゼ、クルクミン、ゴマリグニン、ビタミン C (ァスコルビン酸誘導体を含む）、カロテン類 (例えば、 β一力ロチン、リコピン）、キサントフイノレ類 (例えば、ァスタキサンチン）、エイコサペンタエン酸（ΕΡΑ)、コェンザィム Q 、ピクノジェノール、ォレイン酸、リノール酸な

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どの食品成分、スーパーォキシドジスムターゼ（SOD)、ジフエ-レンョードニゥムクロリド（DPI)、ミエ口パーォキシダーゼ ZNADPHォキシダーゼ抗体などの酵素由来成分、インスリン、エストロゲン、メラトニン、 IGF (インスリン様成長因子）などのホルモン、脳保護剤（例えば、エダラボン（商品名 ) )、 DETA NONOate (diethylenetria mine NONOate)などの NO (—酸化窒素）供与化合物などがあげられる。また、二次的な抑制剤として、キナクリンなどのフォスフォリパーゼ抑制剤、インドメタシンなどのァラキドン酸遊離抑制剤、プロブコールなどの高脂血症治療薬、 ATIブロッカー、 ACEインヒビターなどの経口血糖降下剤、マイナートランキライザーなどの精神安定剤が挙げられ、好ましくは SOD、ビタミン E、コェンザィム Q であり、より好ましくは S

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ODまたはビタミン Eである。

[0082] 本発明の治療剤は、前記有効成分そのままであってもよぐ公知の薬学的に許容される担体 (賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる)や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製したものであってもよぐ当該医薬組成物は、目的に応じて各種の形態、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤;注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤等に調製してちょい。

[0083] 上記担体としては、例えば乳糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケィ酸等の賦开剤、水、エタノール、プロピルアルコール、単シロップ

、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、カルメロースカルシウム、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第 4級アンモ-ゥム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸等の吸着剤、タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用することができる。

[0084] さらに錠剤については、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶性被包錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。

[0085] 丸剤の形態に成形するに際しては、担体として従来この分野で公知のものを広く使用できる。その例としては、例えば結晶セルロース、乳糖、デンプン、硬化植物油、力ォリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、カルメロースカルシウム、カンテン等の崩壊剤等が挙げられる。

[0086] カプセル剤は、常法に従い通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。

[0087] 注射剤として調製する場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かっ血液と等張であることが好ましぐこれらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているもの、例えば水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。この場合等張性の溶液を調製するのに必要な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよぐまた通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

[0088] 坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用することができる。その例としては、例えば半合成ダリセライド、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。

[0089] さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を医薬製剤中に含有させることもできる。本発明のこれらの医薬製剤中に含有されるべき有効成分化合物の量は、特に限定されずに広範囲から適宜選択されるが、通常製剤組成物中に約 1〜70重量％、好ましくは約 5〜 50重量％とするのがよ、。

[0090] 本発明のこれら医薬製剤の投与方法は特に制限はなぐ各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の程度およびその他の条件に応じた方法で経口投与または非経口投与することができる。例えば、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカブセル剤の場合には、経口投与され、注射剤の場合は、単独でまたはブドウ糖、ァミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で筋肉内、皮下もしくは腹腔内投与される。

坐剤の場合は直腸内投与される。

[0091] また、投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、 1日投与用量として、数 mg〜 2g程度、好ましくは数十 mg程度を、 1日 1〜数回にわけて投与することができる。

[0092] 治療目的である疾患 (非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患)または状態は、スーパーォキシドが介在する非炎症性ストレス応答により生じた免疫変動に基づくものであれば特に限定されるものではなぐこれには IL 18および IL 1 8が誘導するサイト力イン群が関与して発症、悪化、または再発する疾患も含まれる。具体的には、自己免疫疾患、自己免疫疾患の悪化もしくは再発、精神的疾患、悪性腫瘍などを挙げることができる。

具体的な非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、脾炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、ァカラシァ、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、（気管支）喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイド一シス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、肺水腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルぺス感染、 HIV 感染、 B型肝炎ウィルス感染、 C型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、ァテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆、びまん性レビー小体病、ピック症、ビンスワンガー病、パーキンソン氏病、パーキンソン症候群、脳虚血、脳虚血 •再還流性障害、新生児出血性脳症、てんかん、 HIV脳症、脳循環障害、脳血管障害、セリアツク病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、関節リウマチ、関節炎、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（SLE)、グッドパスチヤ一症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、 I型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、 II型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ホジキン病、肝硬変、腎不全、アレルギー性喘息、腎炎、心筋梗塞、シエーダレン症候群、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害、尋常性坐瘡、天疱瘡、魚鱗癬、乾癬、熱傷、光線過敏症、紫外線皮膚障害、創傷治癒、または放射性障害、一酸化炭素中毒、シンナー中毒、低酸素症もしくはそれらの二次性障害、子宮内膜症、副腎機能異常、月経異常、心筋症、心身症、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、精子減少、性欲低下、下垂体機能低下症、下垂体機能異常症などがあげられる。

[0094] 前記自己免疫疾患または精神的疾患としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、脾炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、了力ラシ了、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルぺス感染、 HIV感染、 B型肝炎ウィルス感染、 C型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、ァテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアツク病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチヤ一症候群、ペーチエツト症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、 I型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、 II型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ホジキン病、 SLE、肝硬変、腎不全、アレルギー性喘息、腎炎、心筋梗塞、シエーダレン症候群、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害、尋常性坐瘡、天疱瘡、魚鱗癬、乾癬、熱傷、光線過敏症、紫外線皮膚障害、または放射性障害、一酸化炭素中毒、低酸素症もしくはそれらの二次性障害などがあげられる。

[0095] 悪性腫瘍としては、急性白血病、慢性白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症などの造血器腫瘍の他、大腸癌、脳腫瘍、頭頸部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膝癌、脾島細胞癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫などの固形腫瘍を挙げることができる。

血中において IL— 18が上昇すると、それに引き続いて各種のサイト力インが放出される。なかでも IL— 6は、数多くの炎症性疾患に関与し増悪因子として注目されている。全身性にこれらのサイト力インが上昇することで引き起こされるあるいは増悪することが知られている疾患としては、上記した疾患群のなかでも、虫垂炎、腹膜炎、脾炎、潰瘍性，偽膜性，急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、皮膚炎、皮膚筋炎、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、ァテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、骨髄炎、筋膜炎、リウマチ熱、髄膜炎、脳炎、パジェット病、痛風、歯周病、甲状腺炎、神経炎、ブドウ膜炎、 I型糖尿病、胃潰瘍、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍などの炎症性メカニズムが関与する疾患の他、クローン病、潰瘍性大腸炎、シエーダレン症候群、多発性硬化症、ギランバレー症候群、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、気管支喘息、免疫複合体疾患、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、関節リウマチ、結節性動脈周囲炎、強直性脊椎炎、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、悪性異常高熱症、習慣性流産、子宮内膜症などサイト力インや自己免疫機構の関与が知られる疾患、さらに枯草熱、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルぺス感染、 HIV感染、 B型肝炎ウィルス感染、 C型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞などの感染症、カロえて、病態が完全に明らかにはなって!/ヽな、が上記サイト力インの関与が示されて、るァカラシァ、ホイップル病、火傷、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、ァルツハイマー病、セリアツク病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳卒中、痛風、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、甲状腺炎、バーガー病、 II型糖尿病、肥満、ライター症候群、ホジキン病、肝硬変、腎不全、心筋梗塞、シエーダレン症候群、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害などがあげられる。 [0097] IL- 18およびそれによつて放出されるサイト力イン群が関与して発症、悪化、または再発する他の疾患'状態としては、神経，内分泌系の制御異常である日周リズム異常、食欲異常、アジソン病や末端肥大症、性腺発達障害などの下垂体機能異常症、甲状腺機能異常症、肥満、血糖制御異常、二次的には原発性アルドステロン症、クッシング病や、関節リウマチ、痛風および関節炎などの関節の炎症を病態の中核とする疾患の寒冷や精神的ストレス、睡眠不足、血流障害、物理的重量の負荷等の非炎症性ストレスによる発症、再発または増悪、感染や毒物、腎尿細管を傷害するシスプラチン'カルボブラチン等の抗癌剤による、あるいは特発性の機序による腎尿細管上皮細胞の脱落を挙げることができる。

[0098] 本発明の治療剤は上記いずれの疾患の治療、改善に有効と考えられるが、自己免疫疾患、皮膚病、中枢神経系疾患、下垂体機能障害に起因する諸疾患等にさらに有効であり、全身性エリテマトーデス (SLE)、ループス腎炎、多発性硬化症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、月経異常、子宫内膜症、性欲低下などにさらに有効であり、ループス腎炎に特に有効である。

[0099] さらに、本発明によれば、上記指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質、または酸化ストレスに対する抑制効若しくは防止効果を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。本発明の方法によれば、非炎症性ストレスが直接的または間接的に関与する疾患に対する治療、改善または予防効果を有する物質のスクリーニングを大量、迅速かつ簡便に行うことができる。力かる方法によりスクリーニングされた物質は、非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療薬、改善薬または予防薬として有効である。また、本スクリーニング方法によれば、酸化ストレスに対する抑制効果または防止効果を有する物質をスクリーニングすることができる。非炎症性ストレスにおけるサイト力インカスケード上流にスーパーォキシドが介在しているため、本スクリーニング方法によれば、酸化ストレスに対する抑制効果または防止効果を有する物質を、前述の指標剤を指標にしてスクリーニングすることができ、力かる物質を有効成分とする医薬品ならびに保健機能食品 (特定保健用食品および栄養機能食品）の開発に役立つ。 [0100] 本発明のスクリーニング方法は、具体的には例えば以下の工程、

1)培養細胞を被検物質存在条件下で培養する、または、動物を被検物質投与条件下で飼育する工程、

2)前記培養細胞または前記動物から調製した検体中の指標剤を定量する工程、および、

3)被検物質存在条件下または被検物質投与条件下における指標剤の量を被検物質非存在条件下または被検物質非投与条件下における指標剤の量と比較し、有意に指標剤の量を減少または増加させた前記被検物質を、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質と判定する工程、または酸化ストレスに対する抑制効果若しくは防止効果を有する物質と判定する工程、を含む。

[0101] 本スクリーニング方法で使用される動物としては、例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ノ、ムスター、 -ヮトリ等を挙げることができる力操作が容易である点で、特にマウスやラットが好ましい。また、非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患のモデル動物、トランスジエニック動物を用いてもよい。使用される前記培養細胞としては、サイト力インを産生する能力を有する細胞、特に、 IL— 18を産生する能力を有する細胞が好ましぐ例えば、滑膜細胞、腎尿細管上皮細胞、マイクロダリァ、ァストロサイト、マクロファージ、ケラチノサイト、腸管腺細胞等を挙げることができる。

[0102] また、動物および培養細胞は、非炎症性ストレスを予め負荷して、るもの、負荷していないものいずれを用いてもよい。例えば、非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療効果および改善効果を有する物質をスクリーニングする場合には、あら力じめ培養細胞または動物に非炎症性ストレスを負荷し、その後被検物質を投与等してもよい。一方、前記疾患に対する予防効果を有する物質をスクリ一-ングする場合には、培養細胞または動物に非炎症性ストレスを負荷する前に被検物質を投与等してもよい。ここで、非炎症性ストレスとしては、物理的ストレス、化学的ストレス、精神的ストレスおよび酸化ストレスが好ましぐ紫外線照射ストレス、化学物質暴露ストレスまたは拘束ストレスおよびこれらに起因する酸化ストレスがさらに好ましぐ拘束ストレスが特に好ましい。

[0103] 前記被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、合成化合物、細胞や植物の抽出物等を挙げることができ、これらは、新規物質であっても、公知物質であってもょ、。酸化ストレスに対する抑制効果または防止効果を有する物質をスクリーニングする場合の被検物質としては、例えば、各種ビタミン類、チオール化合物、植物由来の各種ポリフエノール、抗酸ィ匕ペプチド 'アミノ酸類、高脂血症治療薬として用いられるプロブコール、降圧剤として用いられるカプトプリルや前述のスーパーォキシド抑制剤を挙げることができる。

[0104] 培養細胞または動物力調製した検体としては、細胞培養液、細胞抽出液、ある、は動物から採取された血液、体液、組織、細胞、排泄物またはそれらの抽出物等を挙げることができるが、前記動物から採取した血液または前記培養細胞の培養液を用いることが好ましい。

[0105] 前記指標剤としては、 IL— 18、活性型 IL— 18が好ましぐ特に活性型 IL— 18が好ましい。検体中の指標剤の定量は、従来公知の方法がいずれも使用できるが、本発明の可視化剤を用いることが好ましぐこれら可視化剤を用いて、例えば、 ELISA法、ウェスタンプロット解析法等およびこれに準ずる方法に従、行うことができる。

[0106] 上記非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患としては、前述の自己免疫疾患、皮膚病、種々の感染症、精神的疾患、循環器系疾患、下垂体機能障害に起因する諸疾患、悪性腫瘍等を挙げることができるが、本スクリーニング方法は、好ましくは自己免疫疾患、皮膚病、虚血性疾患、精神的疾患、循環器系疾患、下垂体機能障害に起因する諸疾患、さらに好ましくは、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、多発性硬化症、気管支喘息、心筋症、月経異常、子宮内膜症、性欲低下、特に好ましくはルーブス腎炎、に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質をスクリー二ングする場合に好適に用いることができる。

[0107] 培養細胞としてケラチノサイトを使用した場合、紫外線などによる皮膚障害、アトピ一性皮膚炎、乾癬、尋常性挫創、天疱瘡、魚鱗癬、光線過敏症のほか、皮膚における炎症性変化を病態に含む熱傷、放射線皮膚障害、創傷治癒などの疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。

[0108] 培養細胞としてマイクログリアゃァストロサイトを使用した場合、脳の炎症、神経細胞の脱落、脳機能異常、たとえば、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆、びまん性レビー小体病、ピック病、ビンスワンガー病、パーキンソン氏病、パーキンソン症候群、脳虚血、脳虚血 ·再還流性障害、一酸化炭素中毒、シンナー中毒、新生児出血性脳症、低酸素脳症、高血圧性脳症、てんかん、多発性硬化症、 HIV脳症、脳循環障害、脳血管障害などの疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質や、日周リズム異常、食欲異常、アジソン病や末端肥大症や性腺発達障害などの下垂体機能異常症、甲状腺機能異常症、肥満、血糖制御異常、二次的には原発性アルドステロン症、クッシング病などの副腎機能異常症、さらに消化管運動の制御や骨形成の異常などに対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。

[0109] 培養細胞としてマクロファージを使用した場合、例えば、非炎症ストレスが関与してマクロファージ、 IL— 18が介在するあらゆる炎症性疾患と自己免疫性疾患、生体防御系の調節異常に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。

[0110] 滑膜細胞を用いた場合には、関節リウマチや痛風や関節炎などの関節の炎症を病態の中核とする疾患が寒冷や精神的ストレス、睡眠不足や血流障害、物理的重量の負荷などの非炎症性ストレスによって発症 ·再発 *増悪に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる。

[0111] 腎尿細管上皮細胞を用いた場合には、感染や毒物、腎尿細管を傷害するシスブラチン'カルボブラチンなどの抗ガン剤によって、あるいは特発性の機序をもって腎尿細管上皮細胞の脱落、炎症を病態の中核とする疾患の発症、増悪に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質を好適にスクリーニングすることができる

[0112] 本スクリーニング方法は、例えば以下のように行われる。

[0113] 培養細胞を用いる場合には、ストレス状態にある培養細胞を被検物質存在条件下で培養し、細胞力も培養液中に放出された IL— 18を本発明の可視化剤を用いて検出、定量し、被検物質存在条件下における IL— 18の放出量を被検物質非存在条件下における IL— 18の放出量と比較し、有意に IL— 18の放出量を減少または増加させた前記被検物質を非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質と判定することにより行う。動物を用いる場合には、ストレス状態にある動物を被検物質投与条件下で飼育し、前記動物の血液中に含まれる IL 18の濃度を測定し、これを被検物質非投与条件下で飼育した場合の IL 18の血中濃度と比較し、有意に IL 18の血中濃度を減少または増加させた前記被検物質を非炎症性ストレスにより発症、悪化、または再発する疾患に対する治療効果、改善効果または予防効果を有する物質と判定することにより行う。

実施例

[0114] 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。

[0115] [動物]

雄性 C57B6マウスは、 Seac YoshitomUり購入した。 IL— 18ノックアウト（KO) マウス（C57ZB6バックグランド、 Immunity. 8, 383— 390 (1998) )および力スパーゼ一 1ノックアウト（KO)マウス（BalbZCバックグランド、 Science. 267, 2 000- 2003 (1995) )は、それぞれ竹田博士および杭田博士より供与された。 MR L/MpJUmmCrj -lpr/lpr (MRL/lpr)マウスは、日本チヤ一ルスリバ一株式会社より購入した。マウスは、 20°Cでケージ当たり 1匹格納された。マウスを用いる実験は、 10時に開始した。

[0116] [試薬]

抗 ACTH抗血清は Progen Biotechnik (ドイツ）製、抗マウス IL— 18モノクローナル抗体は MBL (日本）製、抗マウスカスパーゼ 1抗体（sc— 515)は Santa Cruz ( 米国)製、抗マウス Zラットカスパーゼ— 11抗体は BIOMOL (米国)製、および抗リン酸ィ匕（Thrl80ZTyrl82) P38 MAPキナーゼ抗体は Cell Signaling Techn ology (米国)製を使用した。抗マウス IL— 6ポリクローナル抗体は、ケミコン社製を使用した。抗マウス IL— 18受容体抗体は、常法にしたがって、マウス IL— 18受容体の膜貫通領域直近の親水性領域の部分ペプチド (20アミノ酸)を合成し、ゥサギに免疫し、得られた抗血清を使用した。

[0117] 合成 ACTH (1— 24アミノ酸）は、 Peninsula Laboratories Inc. (米国）より購入した。 Ac— YVAD— CHOおよび Ac— YVAD— MCAは、ペプチド研究所より購入した。 Z— FA— fmk (j. Biol. Chem. 276, 21153— 21157 (2000) )は C albiochem - Novabiochem (米国）より、 SB203580は BIOMOLリサーチ研究所よりそれぞれ購入した。ジフエ-レンョードニゥムクロリド (DPI)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADPH)ォキシダーゼ阻害剤およびスーパーォキシドジスムターゼ (SOD)— 1は、シグマ（米国）力も購入した。

[0118] [拘束ストレス]

拘束ストレスとして、マウスを拘束器（27mmの直径の丸型プラスチックチューブ）中に 1、 3または 6時間置き、 IL— 18レベルを測定した。 IL— 6の分析に関しては、マウスを前述のように拘束し、次いで元のケージに 6時間収容した後に測定した。

[0119] [サイト力インのアツセィ]

拘束後、マウスをジェチルエーテルで麻酔し、血液を EDTA含有チューブに採血した。血漿は、 4°C、 10000 X gで 10分間遠心分離により分離し、— 80°Cで保存した。 IL— 18および IL— 6は、それぞれ QuantikineTMィムノアッセィキット（R&Dシステムズ）および OptEIATM (BD-Pharmingen)を用いる ELISAで分析した。

[0120] [統計学的分析]

すべての実験データは、 3回以上の独立した実験の平均士 S. D.として示した。異なる処理間の統計学的比較は、 GraphPad Prism プログラム（GraphPad Soft ware Inc. )を用いる Studentの t検定により行った。 0. 05未満の P値を統計学的に有意であると見なした。図に表された符号は、以下の通りである。

*；対照に対して P< 0. 05

* *；対照に対して P< 0. 01

* * *；対照に対して p< 0. 001

*；ストレス負荷に対して Pく 0. 01 (n=4— 9) ストレス負荷に対して Pく 0. 05 (n=4— 9) (図 4の場合）

野生型に対して P< 0. 05 (図 5の場合）

# #；ストレス負荷に対して Pく 0. 001 (n=4— 9)

ストレス負荷に対して Pく 0. 01 (n=4— 9) (図 4の場合）

野生型に対して P< 0. 01 (図 5の場合）

+ ;ストレス負荷した野生型に対して P< 0. 01 (n=6)。

[0121] [実施例 1]

拘束ストレスマウスにおける血漿 IL 18タンパク質レベルの測定

抗 ACTH抗血清（50 1、 1 : 1)、デキサメタゾン（IngZSO /z lPBS (—））または抗 IL — 18抗体（50 1、 1 : 1)をマウスの腹腔内に投与し、 10分経過後、拘束チューブ中に 6時間置いた。合成八01¾ (250

1? 3 (—) )を左肢に注入し、 6時間経過後マウスを実験に供した。結果を図 1に示す。

[0122] (1)血漿中の ACTHレベルの上昇は、血漿中の IL 18レベルの増加に先行する図 1Aより、拘束ストレスに曝されたマウスの血漿中の IL— 18レベルは、 43± 34. 3 pgZml (ストレス負荷前）、 330±64. 3pgZml (ストレス負荷後 3時間）および 1059 ± 30. 022pgZml (ストレス負荷後 6時間）であった。血漿中の ACTHは、 IL— 18よりも迅速に増加し、ストレス負荷後 1時間以内に約 500pgZmlに到達した力 3時間で元のレベルに減少した。このことより、血漿中の ACTHレベルの上昇は、血漿中の IL— 18レベルの増加に先行していることがわかる。なお、血漿中の ACTHレベルの上昇は、視床下部-下垂体-副腎 (HPA)軸の活性ィ匕を表している。

[0123] (2) ACTHが血漿 IL— 18のストレス誘導的上昇に関与する

ACTHは、 IL— 18mRNAの副腎特異的発現を引き起こすことが知られている。よつて、 ACTHが血漿 IL— 18のストレス誘導的上昇に関与するかどうかについて調べた。マウスを抗 ACTH抗血清またはデキサメタゾンで処置し、血漿中または副腎中の IL 18レベルを分析した。図 1Bおよび図 1Cより、抗 ACTH抗血清およびデキサメタゾンは、血漿中（図 1B)および副腎（図 1C)においてストレスにより誘導された IL— 18レベルの増加を阻害することがわ力つた。片方の副腎を摘出したマウスでは、ストレス後の IL— 18レベルは擬似操作したマウスよりも低かった。これらの結果から、ストレスにより誘導された ACTHによって血漿および副腎中の IL— 18レベルの上昇が弓 Iき起こされることが示唆された。

[0124] (3) ACTHは、まず副腎中の IL— 18タンパク質レベルに影響を及ぼす

ACTHを投与すると、血漿中の IL— 18レベルが上昇する力ストレス負荷の場合よりも程度が低い（図 1D)。副腎中の IL— 18レベルは、ストレス負荷の場合と同じ程度に上昇した（図 1E)。これらの結果から、ストレス負荷マウスでは、 ACTHは主として副腎中の IL— 18のストレス誘導性上昇を招く力血漿 IL 18レベルの上昇には他の因子が関与していることが示唆される。

[0125] (4) IL 18タンパク質の性状

IL- 18タンパク質のウェスタンブロッテイングによる分析の結果、 IL— 18は血漿中では 18kDの成熟型タンパク質で存在し（図 1F、レーン 1— 3)、一方、副腎中では主として 24kDの前駆体型で存在している（図 1F、レーン 4— 6)ことがわかった。これらの結果から、副腎中の IL— 18前駆体がプロセッシングされ、血漿中に放出されることが示唆される。

[0126] [実施例 2]

ストレスにおけるカスパーゼ 1の役割

マウスを拘束器中に 1時間置き、 Ac—YVAD—CHO (200 μ Μ /50 μ 1PBS ( ―) )、 Z— FA— fmk (100 μ M /50 μ 1PBS (―) )および SB— 203580 (マウスあたり 100 μ g/50 μ 1PBS (-) )を腹腔内に投与した。拘束開始後 1および 3時間で、 SOD—1 (20U)および DPI (30 /z g)をマウス腹腔内に投与し、ウェスタンブロッテイングにより解析した。結果を図 2に示す。

[0127] カスパーゼー 1は、副腎で ACTH (図 2A、レーン 2)およびストレス（図 2A、レーン 3 )により誘導された。副腎中のカスパーゼ— 1活性は、ストレス負荷後 10倍高くなつた (図 2B)。カスパーゼー1の阻害剤 YVAD— CHOは、血漿中の IL— 18レベルのストレス誘導性増加を有効に阻害した (図 2C)が、副腎中の IL— 18前駆体タンパク質レベルを阻害しなかった（図 2D)。カスパーゼ 1ノックアウト（KO)マウスにおいて、ストレス前後に血漿中に IL― 18が検出されな力つたが、ストレス負荷後に IL― 18前駆体レベルが増加した。これらの結果から、カスパーゼ— 1は副腎において IL— 18前駆体のプロセッシングに必須であり、ストレス負荷マウスにおいて血漿 IL 18の上昇に必須であることが示唆される。

[0128] [実施例 3]

ウェスタンブロッテイングによるカスパーゼ 11および MAPキナーゼの解析副腎組織中の IL 18およびリン酸化 P38MAPキナーゼのウェスタンブロット分析は、以下のように行った。副腎組織を、プロテアーゼ阻害剤混合液 (ロシュダイァグノスティックス製）を含む免疫沈降（IP)緩衝液（50mM Tris pH7. 4、 150mM Na CI, 0. 5%NP— 40および 0. 5%ナトリウムデォキシコレート）中でポリトロンホモジナィザ一でホモジナイズした。得られたホモジネート（100 μ gタンパク質）をプロテイン AZGァガロース（Exalpha Biologicals, Inc. )で前もって清澄化させ、抗マウス I L—18モノクローナル抗体または抗リン酸化（Thrl80ZTyrl82) P38 MAPキナーゼ抗体とプロテイン AZGァガロース（50 μ 1)とでインキュベートし、遠心分離（130 00 X gで 25分間、 4°C)した。沈殿物をボイルして副腎タンパク質を回収し、 10- 20 %SDS ポリアクリルアミド勾配ゲル中で電気泳動し、 Hybond ECL (Amersham 製)ニトロセルロース膜に電気的に移した。前記膜を、抗体 (IL— 18、リン酸化 (Thrl 80/Tyrl82) P38 MAPキナーゼ、カスパーゼ 1またはカスパーゼ 11)とともにインキュベートし、反応したタンパク質を ECLプラスシステム（Amersham bioscie nces製）で検出した。プロカスパーゼ— 11および活性化 P38 MAPキナーゼは、 S cience Lab 99 イメージアナリシスシステム（Fujifilm製）を用いて定量化した。

[0129] (1)カスパーゼ 1活性のアップレギュレーションにおけるカスパーゼ 11の関与カスパーゼ 1がカスパーゼ 11により活'性ィ匕されることが報告されているので、血漿中 IL— 18レベルにおけるカスパーゼ— 11阻害剤 Z— FA— fmkの影響を調べた。結果を図 2Eおよび 2Fに示す。

[0130] Z— FA— fmkは、副腎におけるストレス誘導性カスパーゼー 1活性の増加を抑制し

(図 2E)、および血漿 IL— 18レベルを抑制する（図 2F)ことがわかった。このことから、カスパーゼ 11は副腎中のカスパーゼ 1のストレス誘導性活性化に関与してヽることが示唆される。

[0131] (2)カスパーゼ 1活性のアップレギュレーションにおける P38MAPキナーゼの関与

LPSによるカスパーゼ— 11の誘導は NF— κ Bの活性化を必要とし、 NF— κ Bの活性ィ匕は P38MAPキナーゼにより媒介されることが報告されている。インビトロでは、カスパーゼー 11の誘導が P38MAPキナーゼ阻害剤 SB203580で抑制されることが報告されている。本発明においては、インビボで、すなわち、ストレス負荷したマウスでカスパーゼ— 11の誘導における SB203580の影響を調べた。結果を図 3に示す。

[0132] SB203580は、プロカスパーゼー 1 1タンパク質のストレスにより誘導された増加を阻害した（図 3A)。 SB203580処理したマウスでは、副腎におけるカスパーゼ一 1活性（図 3B)および血漿中 IL— 18レベルも、対照マウス（図 3C)に比べて低かった。 S B203580と Z— FA— fmkとを併用した処理では、カスパーゼ一 1の活性（図 3B)、血漿 IL—18レベル（図 3C)および副腎中の 24kD IL— 18前駆体レベル（図示せず）のさらなる減少が起こらなかった。 YVAD—CHO または Z— FA— fmk のいずれも、副腎中の P38MAPキナーゼのリン酸化に影響を与えなかった（図 3D)。 P3 8MAPキナーゼのリン酸化は、野生型マウス（図 3D、レーン 2)と同様に、カスパーゼ — 1KOマウス（図 3D、レーン 5)でストレスにより誘導された。したがって、かかるリン酸化は、カスパーゼ一 1に依存しな力つた。

[0133] [実施例 4]

免疫糸且織化学による IL 18、カスパーゼ 1、カスパーゼー11ぉょびP38MAP キナーゼの局在

副腎をホルマリン固定し、ノラフィンで包埋し、 4 mの切片に切断した。前記組織切片を抗体（P38 MAPキナーゼ、カスパーゼー 11、カスパーゼー 1 (前三者は 20 0倍希釈)または IL— 18 (400倍希釈) )とともにインキュベートした。西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合二次抗体（Santa Cruz製）およびジァミノべンジジン (DBA)を用いて、発色させた。対照として、一次抗体なしの切片およびストレスなしのマウス由来の切片を用いた。結果を図 3Eおよび 3Fに示す。

[0134] ストレス負荷されたマウスにおいて、 IL—18、カスパーゼ 1、カスパーゼ 11および活性化 P38MAPキナーゼは、副腎皮質の網状帯に共に局在していた（図 3E)が、対照マウスではいずれも検出されなかった。カスパーゼー1の阻害剤（図 3F、パネル 1)およびカスパーゼー 11の阻害剤（図 3F、パネル 2)は、副腎皮質においてリン酸ィ匕された P38MAPキナーゼの蓄積には影響な力つた。

[0135] 上記実施例 3 (2)および実施例 4の結果より、 P38MAPキナーゼは、カスパーゼー

11の誘導を介して血漿 IL— 18レベルのストレスにより誘導された上昇に関与し、これが次にはカスパーゼ 1を活性ィ匕することが示される。

[0136] [実施例 5]

カスパーゼー 1活性の分析

副腎中のカスパーゼ— 1活性を、カスパーゼアツセィキット（BD— Pharmingen製）を用いて測定した。簡潔に記載すると、副腎組織のホモジヱネートをカスパーゼー 1 蛍光基質である Ac— YVAD— MCA (acetyl— L— tyrosyl— L— valyl— L— alanyl— L― aspartic acid 4— methyl— coumaryl— 7— amide)とインキュべートし、前記基質から遊離した MCAを、蛍光プレートリーダー (励起波長 380nm、放射波長 420— 460nm)を用いて測定した。

[0137] [実施例 6]

P38MAPキナーゼのアップレギュレーションにおけるスーパーォキシドの関与活性酸素種は、肺の繊維芽細胞、好中球および単球において P38MAPキナーゼのリン酸ィ匕を媒介することが報告されている。ストレスを負荷したマウスにおいて、 P3 8MAPキナーゼのリン酸ィ匕に対する SODの影響を調べた。結果を図 4に示す。

[0138] SODは、副腎において P38MAPキナーゼのリン酸化を約 70%阻害することがわかる（図 4A)。また、 SODは、ストレス負荷したマウスでは、プロカスパーゼ 11 ( 図 4B)、カスパーゼ— 1活性（図 4C)および血漿 IL— 18 (図 4D)のレベルをも低下させたが、副腎 IL— 18前駆体タンパク質（図 4E)のレベルは低下させなかった。 SOD と SB203580、 2—？八ー&^または¥¥八0—じ110との併用処理は、それぞれ、プ口カスパーゼー 11、カスパーゼー 1または血漿 IL 18のレベルをさらに低下させる結果にはならなかった。血漿 IL— 18のストレスによる誘導は、 DPI、すなわち NADP Hォキシダーゼ阻害剤により抑制された（図 4F)。これは、 P38MAPキナーゼリン酸化を介する血漿 IL— 18のストレスによる誘導にスーパーォキシドア-オンが関与しているという見解を支持する。

[0139] [実施例 7]

ストレス負荷したマウスの血漿 IL— 6レベルの制御における IL— 18の関与 IL— 18欠損マウスを用いて、もうひとつのストレス関連サイト力インである IL— 6と、 I L— 18との間の関連性を調べた。ストレスなしでは、 IL— 6は WTおよび IL— 18KO で検出不可能であった力 3時間のストレスの後に、 IL 6レベルは WTで 230pgZ mlおよび IL— 18KOで 25pgZmlであった（図 5A)。ストレスから開放された後、 WT では血漿 IL— 6は約 80pgZmlに維持された力 IL— 18KOでは 5pgZmlに減少した（図 5A)。 YVAD-CHO, SODおよび抗 IL 18抗体での処理は、 WTで血漿 IL 6レベルのストレスにより誘導された増加を 70%阻害した（図 5B)。これらの結果から、ストレスが IL 18依存的に血漿中 IL 6を誘導することが示唆される。

[0140] [実施例 8]

IL- 18受容体抗体投与によるループス腎炎の治療

10週令の MRLZlprマウスに 3時間の拘束ストレスを負荷し、血漿中の IL— 6の濃度を調べた。また、前記マウスにストレス負荷 10分前に抗 IL— 18受容体抗体を投与し、 IL— 6の濃度の変化を調べた。その結果、ストレス負荷 6時間後における血漿中 I L— 18の濃度は、 1132、 882および 793pgZmlまで上昇しており、血漿中 IL— 6の濃度の上昇は、ストレス負荷後 3時間でピークに達した。ストレス負荷後の MRLZlpr マウスは、血漿中 IL— 6の上昇が見られた力ストレス負荷しないマウスでは IL— 6は検出されなかった。抗 IL— 18受容体抗体を投与したマウスにストレスを負荷すると、 I L 6の上昇は抑制された。

[0141] MRLZlprマウスは、ループス腎炎を自然発症している。 12週令の MRLZlprマウスを 3週間に亘つて 2日毎（3回 Z週）に 6時間の拘束ストレスを負荷した。前記マウスをストレスのみの群、抗 IL 6抗体投与群、および抗 IL 18受容体抗体投与群に分け、一日尿中のアルブミン量 (タンパク尿）を調べた。対照として、ストレスを負荷しな Vヽ MRLZlprマウスにっ、ても調べた。結果を図 6に示す。

[0142] 図 6より、 MRL/lprマウスは、ストレスを負荷することによってタンパク尿が増加し、ループス腎炎の増悪が見られた。しかし、抗 IL— 6抗体または抗 IL— 18受容体抗体を投与することにより、 MRLZlprマウスは、ストレスによるループス腎炎の増悪が抑制されていることがわかる。特に、抗 IL— 18受容体抗体の投与が有効であった。

[0143] [実施例 9]

ヒト初代培養皮膚角化細胞 (ケラチノサイト）を、 6cm径の細胞培養用ペトリ皿にケラチノサイト用基礎培地中、 1. 0— 2. 0 X 10 ⁶ / dishになるように培養した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを 1 μ Μ 含む同培地中で 15分培養した後でパラコート非含有培地に交換し、さらに 1時間培養した後で培地を採取し、培地中の IL— 18 蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤である SO Dもしくは水溶性ビタミン Eを SOD (1, 2. 5, 5, 10, 20 U / ml) , ビタミン E (100 nM, 1, 2. 5, 5, 10 mM / ml)を含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。ケラチノサイトにおいて、活性酸素分子種による IL— 18の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 7Aおよび 7B)。

[0144] ヒト初代培養皮膚角化細胞 (ケラチノサイト： CAMBREX 社から購入)を、 6 cm 径の細胞培養用ペトリ皿にてケラチノサイト用基礎培地中、 1. 0- 2. 0 X 10 ⁶ / dish になるように培養した。これに紫外線 B 線（UV— B線）を 100 mj 照射し、その後 1時間培養した後で培地を採取して、培地中の IL 18 蛋白の濃度を測定した。また、 UV— B線処理後に、活性酸素除去剤である SODもしくは水溶性ビタミン Eを SOD (1, 2. 5, 5, 10, 20 U / ml) , ビタミン E (100 nM, 1, 2. 5, 5, 10mM Z ml)を含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。ケラチノサイトにおいて、活性酸素分子種による IL— 18の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 7Cおよび 7D)。

[0145] [実施例 11]

マウス新生児脳から、 Hassanらの方法（Hassan NF, Rifat S, Campbell DE, McCawley LJ, Douglas SD. J. Leukoc Biol. 1991 Jul; 50 (1 ) : 86— 92)で単離した脳マイクログリアを 1. 5- 2. 0 X 10⁶Zmlになるように培養した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを 100 nM含むダルベッコミニマムエツセンシャル培地中で 1時間培養した後でパラコート非含有培地に交換。さらに 3時間培養した後で培地を採取し、培地中の IL— 18 蛋白の濃度を測定した。また、ノラコート処理後に活性酸素除去剤である SODもしくは水溶性ビタミン Eを SOD (1, 2 . 5, 5, 10, 20 U /ml)、ビタミン E (100 nM, 1, 2. 5, 5, 10 m M / ml)含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。マイクログリアにおいて、活性酸素分子種による IL— 18の活性ィ匕と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 8Aおよび 8B)。

[0146] [実施例 12]

マウス新生児脳から、 Yangらの方法（Yang P, Hernandez MR. Brain Re s Brain Res Protoc. 2003 Oct ; 12 (2) : 67— 76)で単離した脳ァスト口サイトを 1. 5— 2. 0 X 10 ⁶ /mlになるように調製した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを 100 nM含むダルベッコミニマムエッセンシャル培地中で 1時間培養した後でパラコート非含有培地に交換。さらに 3時間培養した後で培地を採取し、培地中の IL— 18 蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理後に、活性酸素除去剤である SODもしくは水溶性ビタミン Eを SOD (1, 2. 5, 5, 10, 20 U / ml )，ビタミン E ( 100 nM, 1, 2. 5, 5, 10 mMZml)含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。ァストロサイトにおいて、活性酸素分子種による IL— 18の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 9Aおよび 9B)。

[0147] [実施例 13]

Hamiltonらの方法（Hamilton TA, Weiel JE, Adams DO. J Immuno 1. 1984 May; 132 (5) : 2285— 90)でマウス力も単離した腹腔マクロファージを 1. 0- 2. 0 X 10⁵ Zdishになるようダルベッコミニマムエッセンシャル培地中で培養した。培地を、活性酸素発生剤であるパラコートを 100 nM含む同培地に交換して 15分培養した後でパラコート非含有培地に交換し、さらに 3時間培養した後で培地を採取して、培地中の IL— 18 蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤である SODを（1, 2. 5, 5, 10, 20U/ml)含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。マクロファージにおいて、活性酸素分子種による IL— 18の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 1 OAおよび 10B)。

[0148] [実施例 14]

関節リウマチ患者の病変部位の関節滑膜から採取した滑膜組織を Tanakaらの方法 (Tanaka M, Harigai M, Kawagucni Y, Ohta ¾, Sugiura T, T akagi K, Ohsako― Higami S, Fukasawa C, Hara M, Kamatani N . J Rheumatol. 2001 Aug ; 28 (8)： 1779— 87)でゥシ胎児血清10%含有1^ PMI- 1640 培地中で組織培養した。活性酸素発生剤であるパラコートを 100 n M含む同培地に交換して 15分培養した後、ノラコート非含有培地に交換し、さらに 1 時間培養した後で培地を採取して、培地中の IL— 18 蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤である SOD (1, 2. 5, 5, 10, 20 U / ml)を含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。滑膜組織において、活性酸素分子種による IL— 18の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 11Aおよび 11B)。

[0149] [実施例 15]

ヒト初代培養腎近位尿細管上皮細胞 (CAMBREX 社から購入)を、 6 cm 径の細胞培養用ペトリ皿に腎尿細管細胞用基本培地：内容 10 /z gZml hEGF (組換ぇヒト上皮細胞成長因子） 0. 5 ml、 5 mg/ml インシュリン 0. 5 ml、 0. 5 mg/ml ヒドロコノレチゾン 0. 5 ml、 FBS (ゥシ胎児血清） 2. 5 ml, 0. 5 m g/ml ェピネフリン 0. 5 ml, 6. 5 μ g/ml トリョードチ口-ン 0. 5 ml、 10 m g/ml トランスフェリン 0. 5 ml, 50 mg/ml ゲンタマイシン、 50 ^ g/ml ァンホテリシン一 B 0. 5 ml)中 1. 0— 2. 0 X 10 dish になるように培養した。これを活性酸素発生剤であるパラコートを 100 nM含む同培地中で 15分培養し、その後でパラコート非含有同培地に交換した。さらに 1時間培養した後で培地を採取し、培地中の IL— 18 蛋白の濃度を測定した。また、パラコート処理時に、活性酸素除去剤である SODもしくは水溶性ビタミン Eを SOD (1, 2. 5, 5, 10, 20 U / ml) , ビタミン E (100 nM, 1, 2. 5, 5, 10 mM / ml) を含む培地中で細胞を培養し、培地中の IL— 18蛋白の濃度を測定した。腎尿細管細胞において、活性酸素分子種による IL— 18の活性化と放出が認められた。さらに、これらは活性酸素除去剤である SOD、あるいは活性酸素を中和するビタミン Eによって、用量依存的に抑制された（図 12Aおよび 12B)。

[0150] [実施例 16]

IL—18は、 ACTH、 FSH、 LHの放出を惹き起す

遺伝子組換え技術により作製した IL— 18を C57B/6マウスに 1. 5 μ g静脈注射し、以後の血中の ACTH、 FSHおよび LHのレベルを調べた。図 13Aに示すように、血中 ACTH濃度は IL— 18の投与によって上昇した。図 13B、 13Cに IL— 18投与 1 時間後のマウスから採取した血漿中 FSHおよび LHのレベルを示す。 IL— 18の投与により、 FSHおよび LHの血漿中濃度が上昇することが示された。このことから、血中に IL—18の上昇が起きることで ACTH、 FSH、 LHの血中レベルに変動が起きることが理解され、ストレスや活性酸素による血中 IL— 18の上昇が全身状態を大きく左右することがゎカゝる。

産業上の利用可能性

[0151] 本発明は、非炎症性ストレス応答の指標剤、可視化剤、治療剤およびその利用に関し、生体が受ける非炎症性ストレスの程度の測定、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の予防、改善または予想、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患の予防または治療、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質、または酸化ストレスに対する抑制効若しくは防止効果を有する物質のスクリーニング等に適用できる

Claims

請求の範囲

[I] スーパーォキシドが介在する非炎症性ストレス応答の指標剤であって、非炎症性ストレスカスケードに関与する成分を含有してなる指標剤。

[2] 前記非炎症性ストレスカスケードに関与する成分が、 IL— 18、活性型 IL— 18、 P3 8MAPキナーゼ、リン酸化 P38MAPキナーゼ、カスパーゼ 11、カスパーゼ 1、活性化カスパーゼ 1からなる群力選択される 1または 2以上のタンパク質を含有することを特徴とする請求項 1記載の指標剤。

[3] 前記非炎症性ストレスカスケードに関与する成分が、 IL 18である請求項 1記載の指標剤。

[4] 前記 IL 18が血中に存在する活性型 IL 18である請求項 3に記載の指標剤。

[5] さらに P38MAPキナーゼを含有してなる請求項 3または 4に記載の指標剤。

[6] 前記 P38MAPキナーゼがリン酸ィ匕されたものである請求項 5に記載の指標剤。

[7] 前記 P38MAPキナーゼがマウス由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位が Thr

180または Tyrl82である請求項 6に記載の指標剤。

[8] 前記 P38MAPキナーゼがヒト由来であり、当該キナーゼのリン酸化部位が Thrl8

5または Tyrl87である請求項 6に記載の指標剤。

[9] さらにカスパーゼ 11を含有してなる請求項 3〜8いずれかに記載の指標剤。

[10] さらにカスパーゼー 1を含有してなる請求項 3〜9いずれかに記載の指標剤。

[II] 前記カスパーゼー 1が活性ィ匕カスパーゼー 1である請求項 10に記載の指標剤。

[12] 前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである請求項 3〜11いずれかに記載の指標剤。

[13] 前記精神的ストレスが拘束ストレスである請求項 12に記載の指標剤。

[14] 請求項 1〜13いずれかに記載の指標剤を検出するための非炎症性ストレス応答の可視化剤。

[15] IL- 18抗体を含有する請求項 14に記載の可視化剤。

[16] 前記 IL— 18抗体が活性型 IL— 18を特異的に認識するものである、請求項 15に記載の可視化剤。

[17] さらに P38MAPキナーゼ抗体を含有する請求項 15または 16に記載の可視化剤。

[18] 前記 P38MAPキナーゼ抗体が抗リン酸ィ匕 P38MAPキナーゼ抗体である請求項 1 7に記載の可視化剤。

[19] 前記抗リン酸化 P38MAPキナーゼ抗体がリン酸化 Thrl80もしくは Tyrl82を有する P38MAPキナーゼ、またはリン酸化 Thrl85もしくは Tyrl87を有する P38MAP キナーゼを認識するものである請求項 18に記載の可視化剤。

[20] さらにカスパーゼ 11抗体を含有する請求項 15〜 19 ヽずれかに記載の可視化剤

[21] さらにカスパーゼー 1抗体またはカスパーゼー 1の基質を含有する請求項 15〜20

V、ずれかに記載の可視化剤。

[22] 前記カスパーゼ 1抗体が活性ィ匕カスパーゼ 1を特異的に認識するものである、請求項 21に記載の可視化剤。

[23] 請求項 1〜13いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする非炎症性ストレスの程度を測定する方法。

[24] 前記指標剤が、 IL— 18または活性型 IL— 18である請求項 23記載の方法。

[25] 請求項 14〜22いずれかに記載の可視化剤を用いることを特徴とする、請求項 23 または 24に記載の方法。

[26] 前記非炎症性ストレスが精神的ストレスである請求項 23〜25いずれかに記載の方法。

[27] 前記精神的ストレスが拘束ストレスである請求項 26に記載の方法。

[28] 請求項 14〜22 、ずれかに記載の可視化剤を含む非炎症性ストレスの測定キット。

[29] 前記可視化剤が IL 18抗体を含有する請求項 28記載のキット。

[30] 前記 IL— 18抗体が活性型 IL— 18を認識するものである請求項 29記載のキット。

[31] 請求項 14〜22いずれかに記載の可視化剤を動物に適用することを特徴とする、非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態の変動を予防、改善または予想する方法。

[32] 前記動物がヒトを除く脊椎動物である請求項 31に記載の予防、改善または予想方法。

[33] 請求項 1〜13いずれかに記載の指標剤の量または活性を低減させるための非炎症性ストレス応答に基づく免疫状態変動の治療剤。

[34] 前記治療剤の有効成分が IL 18抗体または抗 IL 18受容体抗体である請求項 33に記載の治療剤。

[35] 前記有効成分が IL 18抗体であり、当該 IL 18抗体が活性型 IL 18に特異的に結合するものである請求項 34に記載の治療剤。

[36] 前記治療剤の有効成分がスーパーォキシドジムスターゼまたはビタミン Eである請求項 33記載の治療剤。

[37] 請求項 1〜13いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、非炎症性ストレスにより発症、悪化若しくは再発する疾患に対する治療効果、改善効果若しくは予防効果を有する物質をスクリーニングする方法。

[38] 前記指標剤が、 IL— 18または活性型 IL— 18である請求項 37記載の方法。

[39] 前記疾患が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、気管支喘息、乾癬、脳虚血、脳変性、脳炎、関節リウマチ、月経異常、子宮内膜症または性欲低下である請求項 37または 38記載の方法。

[40] 請求項 1〜13いずれかに記載の指標剤の量または活性を測定することを特徴とする、酸化ストレスに対する抑制効果若しくは防止効果を有する物質をスクリーニングする方法。