WO2006003854A1 - 植物を用いたエストロゲン様物質の検出方法 - Google Patents

植物を用いたエストロゲン様物質の検出方法 Download PDF

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WO2006003854A1
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estrogen
sequence
effector
plant
gene
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PCT/JP2005/011706
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Kenichi Yamazaki
Kenichi Tuda
Takuto Toujyo
Tomoko Wada
Kazunori Yamashita
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National University Corporation Hokkaido University
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an estrogen-like substance (including estrogen) using a transformed plant.
  • Endocrine disrupting chemicals commonly called “environmental hormones”
  • environmental hormones are known to exist in the environment for a long period of time, with many having properties that are difficult to be degraded in the environment.
  • Many of the environmental hormones act on nuclear receptors and are carried out in the body, disturbing the information transmission of the original endocrine system, suggesting that it has a significant impact on the functions of the organism, particularly the reproductive function.
  • the impact on the ecosystem is also a concern.
  • Nuclear receptors form a large gene family with a conserved domain structure (A / B, C, D, and E).
  • the C domain is involved in binding to DNA
  • the E domain is involved in binding to steroid hormones (ligands)
  • AF-2 Activation Function 2 present in the E domain causes transcriptional activity depending on the ligand. Is necessary. Binding of the ligand to the nuclear receptor promotes the interaction between AF-2 and the pl60 family transcription coactivator and activates transcription of the target gene in a ligand-dependent manner.
  • the estrogen receptor belongs to the nuclear receptor family and is activated by binding to estrogen and activates transcription of the target gene.
  • Patent Document 1 Development of biosensors that detect estrogen-like substances using cells in which such nuclear receptors and reporter genes are expressed has been widely carried out. These are usually based on the fact that estrogen-like substances bind to nuclear receptors to promote the expression of reporter genes S, until estrogen-like substances bind to nuclear receptors and until reporter genes are expressed.
  • Various mechanisms have been proposed for this mechanism. For example, an estrogen-like substance detection method using a two-hybrid method utilizing a ligand-dependent interaction between a ligand binding site of an estrogen receptor and a coactivator using yeast has been reported ( Non-patent document 1). However, this yeast two-hybrid method requires aseptic operation, and there is concern about secondary pollution of the environment due to the organic solvent itself used for extraction.
  • Non-patent Document 2 A system has also been devised in which a chimeric transcription factor that combines a DNA binding site, a transcriptional activity site and a nuclear receptor is introduced into a plant that does not require aseptic manipulation (Arabidopsis thaliana) (Non-patent Document 2). This is preferable because it has a simple mechanism, but has a disadvantage of low sensitivity as a biosensor.
  • Patent Document 2 a method for detecting estrogen using a transformant introduced with a ligand-dependent transcription factor, a coactivator, and a reporter gene has been proposed.
  • Patent Document 1 JP 2002-330759 A
  • Patent Document 2 JP 2002-247986
  • Non-Patent Document 1 Toxicology and Applied Pharmacology 154, 76-83 (1999)
  • Non-Patent Document 2 The Plant Journal (2000) 24 (2), 265-273
  • the present invention provides a method for detecting an estrogen-like substance inexpensively and easily, and does not require a complicated operation such as an aseptic operation by using a plant, and provides a detection method with high sensitivity as a sensor. For the purpose.
  • the effector 1 in which the transcription activator domain is linked by changing the coactivator by changing to the effector 1 having a nuclear receptor and a DNA binding site.
  • ligands can be detected by utilizing ligand-dependent interaction with coactivator 1 with which the product of effector 1 originally interacts (a phenomenon that occurs in the presence of a low concentration of ligand).
  • the sensitivity as a sensor can be remarkably improved, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a plant transformed by introducing an effector 1 sequence, an effector 2 sequence, a target DNA and a reporter 1 gene, wherein the effector 1 sequence comprises a promoter, a nuclear localization signal and It has a chimeric gene consisting of a region that encodes a polypeptide that binds to the target DNA and a region that encodes the ligand-binding polypeptide of the nuclear receptor of estrogen-like substance, and the effector 2 sequence is a promoter, nuclear localization A chimeric gene comprising a nuclear receptor interaction region of a transcriptional signal and a transcriptional coactivator and a polynucleotide region encoding the transcriptional activation region, and the reporter gene is located downstream of the target DNA It is a characteristic transformation.
  • the present invention also relates to a method for detecting an estrogen-like substance comprising contacting the transformed product with an estrogen-like substance and detecting the expression of the reporter gene in the plant.
  • Fig. 2 shows how a substance having estrogenic activity is detected using a transformed plant in the present invention.
  • the gene integrated into the transformed plant is a ligand-dependent interaction between two effector gene products, the chimeric estrogen receptor and the chimeric transcription coactivator that are always expressed in plant cells.
  • a reporter gene for example, j8-gnorechronidase
  • force that activates transcription may also be constituted.
  • the "effector 1 sequence” is a chimera that also has a promoter, a nuclear localization signal and a region encoding a binding polypeptide to a target DNA and a region encoding an estrogen-like substance nuclear receptor ligand-binding polypeptide. It also has gene power. In addition to these, the effector 1 sequence is a region encoding all or a part of other nuclear receptors derived from eukaryotes. You may have.
  • promoter examples include those derived from plant viruses such as 35S promoter, those derived from plant-related bacteria such as nopaline synthase promoter, and other natural or synthetic promoters that function in plant cells.
  • nuclear localization signal refers to a polypeptide sequence recognized by a protein involved in direct transport to the nucleus, such as the nuclear translocation signal of the T antigen of SV40 virus, and indirectly via a protein having the nuclear translocation signal. Polypeptide sequences necessary to be transported in a normal manner.
  • a "region encoding a polypeptide that binds to a target DNA” is a polypeptide region that binds to the target DNA.
  • target DNA linear polynucleotide sequences of various lengths of 4 bases or more are used. Is mentioned.
  • the target DNA binding region is a polypeptide region that recognizes and specifically binds to the target DNA sequence.
  • estrogen-like substance includes both estrogen and so-called estrogen-like substances.
  • Estrogen-like substance includes both estrogen and so-called estrogen-like substances.
  • the compounds described in Table 1 at the end of the specification) (Nishiha ra et. Al., J Health Science, 46 (4): 282-298, 2000).
  • the “region encoding a ligand-binding polypeptide of a nuclear receptor of an estrogen-like substance” is a region containing a polypeptide sequence having binding activity to estrogen derived from a eukaryote.
  • a “chimeric gene consisting of a region encoding a polypeptide that binds to a target DNA and a region encoding a ligand-binding polypeptide of an estrogen-like substance in a nuclear receptor” refers to a polynucleotide that encodes a polypeptide region containing these. Connected and formed.
  • Effective 2 sequence consists of a chimeric gene consisting of a promoter, a nuclear localization signal, and a nuclear receptor interaction site of a transcriptional coactivator and a polynucleotide region encoding a transcriptional active region. .
  • the effector 2 sequence may have a polynucleotide region encoding a transcription inactivation region as appropriate.
  • the “promoter” and “nuclear localization signal” can be selected from the range defined in the effector 1 sequence, and may be the same as or different from those used in the effector 1 sequence.
  • Transcriptional coactivators include CBP / p300, pl60 family proteins (TIF2, SRC1, A Examples thereof include polypeptides having a function of increasing transcriptional activity by interacting with eukaryotic nuclear receptors including CTR, TRAP220, TIP60) and the like.
  • Transcriptional activity region refers to a polypeptide region that contains many basic amino acids in a straight chain, a polypeptide region that contains many glutamines in a straight line, and other basic transcription factors and transcription devices. A polypeptide region that acts to activate transcription.
  • a “chimeric gene comprising a nuclear coactivator nuclear receptor interaction region and a polynucleotide region encoding a transcription activation region” is formed by linking polynucleotides encoding the polypeptide region containing them.
  • Target DNA refers to a polynucleotide that is specifically recognized and bound by a DNA-binding protein, and two or more units of such polynucleotides linked may be used. Rather than using the above DNA sequence as it is, the arrangement of a plurality of units in series increases the frequency of binding to the chimeric estrogen receptor force S and increases the estrogen detection sensitivity.
  • reporter gene examples include a fluorescent protein, an enzyme having a measurable activity, and a polynucleotide region encoding a protein other than an enzyme whose activity can be detected. This reporter gene is located downstream of the target DNA.
  • an S / MII sequence polynucleotide sequence having a binding property to the nuclear scaffold
  • Omega sequences for increasing protein synthesis in plants polynucleotide sequences encoding sequences on messenger RNA that increase translation activity
  • TATA BOX etc.
  • a polynucleotide sequence that affects transcription activity and translation activity may be linked.
  • dicotyledonous plants such as Arabidopsis, tobacco, tomato, goldfish, potato, legumes, and monocotyledonous plants such as corn, rice, and wheat can be used.
  • plants When plants are used for detection as in the present invention, there are various advantages. In the case of plants, from the roots Since chemical substances in the environment can be absorbed directly, it is not necessary to extract and purify chemical substances from samples, and aseptic operations are not required. Furthermore, seeds can be stored stably for a long period of time, and no special equipment for storage is required, so that it is less expensive to store the sensor compared to other bioassay methods. In addition, for example, approximately 2000 seeds of individual Arabidopsis can be obtained, which enables low-cost measurement by mass production.
  • the effector 1 sequence, effector 2 sequence, target DNA and reporter gene are introduced into these plants.
  • a method there can be used a flower dating method, an erect mouth pore method, a microprojectile bombardment method, a microinjection method and the like via soil bacteria (such as agrobacterium).
  • the method for detecting a reporter gene varies depending on the type of reporter gene. For example, when a fluorescent protein is used as a reporter gene, a detection method using a fluorescence microscope / fluorescence colorimeter, or when an enzyme having a measurable activity is used as a reporter gene, a method based on enzyme activity measurement, a reporter gene When a protein other than an enzyme whose activity can be detected is used as a gene, a method based on observation of plant physiological function / morphological change due to activity expression can be used.
  • Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter a promoter that strongly controls transcription of downstream genes in plants, chimera transcription including hER a LBD and LexA DBD, and chimera transcription including TIF2 NID and VP16 AD Coactivator is always over-expressed in transgenic Arabidopsis individuals.
  • These two chimeric proteins contain the nuclear translocation signal of SV40 virus-derived T antigen and are always localized in the nucleus. Exist. In the nucleus, the chimeric estrogen receptor is bound to the target sequence (OLexA) of the LexA protein located upstream of the reporter gene GUS gene.
  • the conformation of hER a LBD changes, and interaction with the TIF2 NID part of the chimeric transcription coactivator occurs.
  • the transcriptional activity signal of the herpes simplex virus-derived VP16 AD fused to TIF 2 NID is transmitted to the plant transcription apparatus, and transcription and translation of the GUS gene are induced in an estrogen-dependent manner.
  • Estrogen can be detected by measuring the enzyme activity of GUS protein in the transformed product.
  • the effector 1 gene encoding the chimeric estrogen receptor is located downstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (P35S), the nuclear localization signal (NLS) of the SV40 virus T-antigen, and the LexA DNA binding domain (LexA DBD).
  • P35S cauliflower mosaic virus 35S promoter
  • NLS nuclear localization signal
  • LexA DBD LexA DNA binding domain
  • effector 1 gene a fragment encoding P35S to NLS (P35S-NLS), a fragment encoding LexA DBD, a fragment encoding hER a LBD, and a fragment of TNOS were prepared by PCR reaction. .
  • the P35S-NLS fragment was provided by 35S-NLS-GFP (Shizuoka Prefectural University, Faculty of Food and Nutrition Science, Shizuoka Yakuta No. 52 No. 1, Yasuo Niwa. Curr Biol, 6: 325-30 (1996) Perform PCR reaction using the 5′-GGAAGCTTGC ATGCTGC AGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-GGGCTAGCGACCTTT CTCTTCTTCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 2) primers as the primer, Hindll I site on the 5 ′ side, 3 ′ side The Nhel site was prepared.
  • LexA DBD fragment was obtained by performing a PCR reaction using 5'-GGGCTAGCATGAAAGCGTTA ACGGCC-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-GGGGCCGGCCTGGTTCACCGGCAGCCAC-3' (SEQ ID NO: 4) as primers.
  • LexA (SEQ ID NOs: 5, 6) was prepared so that the Nhel site was located 5 'and the Fsel site was located 3' of the region encoding the 87th amino acid at positions 1 to 87.
  • hER a LBD fragment contains 43 amino acids from 281 to 323 of hER (GenBank: NM—0000125). Amplification was carried out by dividing into a coding N-terminal fragment and a C-terminal fragment encoding 272 to 595th amino acids and a stop codon.
  • Both fragments are human ovarian cDNA libraries in a vertical form, and N-terminal fragments are 5'-GGGGCCGG CCGTCTGCTGGAGACATGAGA-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-GGGCTCAGCATCCAA CAAGGCACTGAC-3' (SEQ ID NO: 8) as primers.
  • the Fsel site was on the 5 ′ side and the Bpul 1021 site was on the 3 ′ side.
  • the C-terminal fragment destroys the internal Hindlll site by base substitution, and 5'-GGGCTGAGCC
  • PCR reaction was performed using (SEQ ID NO: 9) and 5 GGGCGGCCGCTCAGACTGTGGCAGGGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10) as primers, and prepared so that the Bpull02I site was on the 5 ′ side and the Notl site was on the 3 ′ side.
  • the TNOS fragment is pBI221 (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA), and the 5'-GGGC GGCCGCGAATTTCCCCGATCGTTC-3 '(SEQ ID NO: 11) and 5 GGGAATTCACT AGTCCGATCTAGTAACATAGA-3' (SEQ ID NO: 12) primers
  • the PCR reaction was carried out to prepare a Notl site on the 5 'side and an EcoRI site on the 3' side.
  • the effector 1 plasmid was prepared by inserting the above four fragments into the Hin dm 'EcoRI site of pBI221 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA).
  • the effector 2 gene encoding the chimeric coactivator 1 is located downstream of P35S, and is a nuclear localization signal of the T antigen (NLS) 'part of the human transcription coactivator 1 (hTIF2 NID) (human trans criptional intermediately factor 2 nuclear receptor interaction domain) ⁇
  • a gene encoding a polypeptide linked to the transcriptional activation domain (VP16 AD) of VP16 of single-virus virus and TNOS were linked.
  • a fragment encoding P35S to NLS, a fragment encoding hTIF 2 NID, and a fragment encoding VP16 AD were amplified by PCR and prepared.
  • the P35S-NLS fragment is 35S-NLS-GFP in a saddle shape, and 5'-GGAAGCTTGCATGCTGCAGG-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'-GGGGGGGGATCCGACCTTTCTCTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 14) are used as primers for PCR reaction. 5 'side, Hindlll site, 3' side, BamHI site Prepared to come.
  • hTIF2 NID fragment For the hTIF2 NID fragment, a human liver cDNA library is used as a saddle type, and PCR is performed using 5'-GGGGATCCGAGAGA GCTGACGGGCAG-3 '(SEQ ID NO: 15) and 5'-GGTCATGAAGTGCTCTGTGAAAT TCG-3' (SEQ ID NO: 16) as primers, and hTIF2 A region encoding 246 amino acids from position 624 to position 869 was prepared so that the BamHI site was located on the 5 ′ side and the BspHI site was located on the 3 ′ side.
  • the VP16 AD fragment is a simple herpesvirus transcription factor VP16 gene (GenBank M15621,
  • GCACGCCGACGCGCT-3 '(SEQ ID NO: 17) and 5 and CCGAGCTCCTACCCACCGTA CTCGTC-3' (SEQ ID NO: 18) were used as primers to perform PCR reaction, and the region coding for 78 amino acids from 413th to 490th of VP16 and a stop codon was encoded.
  • the Ncol site on the 5 'side and the Sad site on the 3' side were prepared. At this time, the internal Sail site was destroyed by base substitution.
  • the reporter gene encoding glucurodase is the target DNA sequence of LexA protein
  • the translation amplification sequence ( ⁇ sequence)
  • the full-length gene encoding Escherichia coli dalk mouth-dase and TNOS were linked.
  • an Otama fragment of the target sequence of LexA, a TATA- ⁇ fragment from the T35 box of P35S to the ⁇ sequence, and a Hindm-BamHI linker were prepared.
  • the target sequence of LexA is annealed to 5'-GATCCATACTGTATGAGCATACAGTATACTGTATGA GCATACAGTA-3 '(SEQ ID NO: 19) and 5'-GATCTACTGTATGCTCATACAGTATACT GTATGCTC ATAC AGTATG-3' (SEQ ID NO: 20), and is sandwiched between the restriction enzyme sites of BamHI and Bglll. A dimer fragment of the target sequence of LexA was prepared.
  • the TATA- ⁇ fragment is 35S—NLS—GFP in a saddle type and PCR using 5′—GGAGACTCGCATGCGCAAGA CCCTTCCTC-3-3 ′ (SEQ ID NO: 21) and 5′-CCCGGGACTAGTTGTAATTGTAAATA GTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 22) as primers.
  • 5′—GGAGACTCGCATGCGCAAGA CCCTTCCTC-3-3 ′ (SEQ ID NO: 21) and 5′-CCCGGGACTAGTTGTAATTGTAAATA GTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 22) as primers.
  • the Hindm-BamHI linker was prepared by aligning single-stranded oligo DNA 5 with AGCTTGGACTAGAGCTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 23) and 5′-GATCCAAGCTCTAGTCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 24) in double strands.
  • a reporter plasmid was prepared by successively inserting the above three fragments into the Hindlll-Smal site of pBI221 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA).
  • the Tabacco genomic DNA is used as a saddle type 5 Perform PCR reaction using GAATTCGAGTCCAAAATGTTGGCATTTAG-3 '(SEQ ID NO: 25) and 5'-GAATTCAAGCTTTTCGAAATCAACGTTTGT-3' (SEQ ID NO: 26) as primers, and EcoRI site on the 5 'side of S / M II and Hindlll on the 3' side. A DNA fragment was prepared so that the EcoRI site was present.
  • This fragment was inserted into pGEM-T vector (Promega Corp., Madison, Wis., USA) to prepare S / M II plasmid.
  • Effector 1 fragment (Hind III-EcoRI fragment), effector 2 fragment (Hind III-EcoRI fragment), S / M II fragment (EcoRI-Hind III fragment) obtained by treating each prepared plasmid with restriction enzymes ) was inserted into the Hind III site of the reporter plasmid, to produce a plasmid containing two effector genes and one reporter gene (hereinafter referred to as “two-function plasmid”).
  • the gene was introduced into Arabidopsis thaliana using the two-effector plasmid prepared above.
  • the Arabidopsis Columbia strain wild type was used in the preparation of this transformed sickle.
  • transformation is performed by infecting Agrobacterium with Arabidopsis thaliana. Went. Seed the transformed Arabidopsis seed (T1 seed) on MS agar medium containing 1% sue rose, 0.8% plant agar, 50 ⁇ g / ml kanamycin, 100 ⁇ g / ml kraforan, Transformed plants with the transgene were selected. T1 seeds with kanamycin resistance were also obtained. In addition, T3 seeds also obtained T3 seeds.
  • T3 seeds were sown in MS agar medium containing 17 j8 -estradiol (WAKO Pure Chemical Inds.). Using the transformed individuals grown for 1 week, the expression state of the GUS gene was examined by the GUS activity staining method and the GUS activity measurement method.
  • Induction of reporter gene expression in transformed Arabidopsis thaliana was performed by the following method. Seed transformed Arabidopsis seeds on MS agar medium (DMS 0, WAKO Pure Chemical Inds.) With estrogen (17 ⁇ -estradiol) dissolved in MS agar medium (1 / 10,000 calorie). 3 days at 4 ° C in the dark. Thereafter, germination and growth were carried out for a predetermined number of days at 22 ° C. in the light. During that period, the transgenic white tuna was continuously exposed to estrogen.
  • the GUS activity staining method was performed as follows. GUS staining was performed on transgenic Shiro nunazuna exposed to estrogen. Plants were stained (2 mM 5-bromo-black mouth-indolyl-j8—D-glucurode (X—Gluc), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 10 mM ED TA, 0.1% Triton X -Soaked in 100, 0.5 mM ferricyanide, 0.5 mM ferrocyanide) and subjected to vacuum treatment in a desiccator for 15 minutes. Then, it was left to stand at 37 ° C for 3 hours, and the plant body was immersed in 70% ethanol to remove chlorophyll and observed. The results are shown in Fig. 3.
  • the GUS staining method is performed on the whole plant, and the indigo blue coloring ability obtained by degrading X-Glue, which is a substrate of GUS protein, is observed at the root part of transformed individuals at an estrogen concentration of 0.05 nM or more. It was done.
  • the part where GUS staining was observed was the part that was in direct contact with the agar medium, which is probably the result of diffusion of estrogen from the medium into the plant body.
  • the GUS activity was measured by the following method. Transformed silo exposed to estrogen The GUS activity in the protein extracted from Nunazunaka et al. was measured. Twenty treated plants were frozen in liquid nitrogen and then powdered using a homogenizer. Extraction buffer (50 mM NaH PO, 10 mM EDTA ⁇ 0.1% Triton X-100, 0.1% N-Laurenore
  • the soluble protein was extracted by adding sarcosine sodium (10 mM j8-mercaptoethanol).
  • sarcosine sodium 10 mM j8-mercaptoethanol
  • 4-methylumbelliferyl-j8-D-glucyl chloride (4-MU G) was used as a substrate.
  • the extracted protein solution was collected in an extraction buffer containing 4-MUG to a final concentration of 1 mM and reacted at 37 ° C for 1 hour. 1 hour later 0.2 M Na CO
  • the enzyme reaction was stopped.
  • the concentration of 4-MU released by the catalytic action of GUS was measured using a fluorescence spectrophotometer (Hitachi F-4500) (the wavelength of 455 nm emitted by excitation with 365 nm wavelength light). Measurement).
  • the protein concentration in the solution was measured, and the value obtained by measurement with a fluorescence spectrophotometer was corrected by the total amount of protein contained in the solution to standardize the data. The results are shown in Fig. 4.
  • T3 seeds were sown on MS agar medium containing 1 nM 17 ⁇ -estradiol and grown for 3-14 days.
  • the grown transformants were collected and examined for GUS gene expression by GUS activity assay. The results are shown in Fig. 5.
  • the second generation (T2) seeds were treated with different concentrations of estrogen-like substances such as getylstilbestrol (DES) (ICN Biomedicals Inc. (CT, USA)), p-n-nourphenol ( NP) (WAKO Pure Chemical Inds.), Bisphenol A (BPA) (WAKO Pure Chemical Inds.), And Genistin (EXTRASYNTHESE SA (Genay, France)) were seeded and grown for 1 week.
  • DES getylstilbestrol
  • CT p-n-nourphenol
  • NP p-n-nourphenol
  • BPA Bisphenol A
  • EXTRASYNTHESE SA Genay, France
  • NP showed an increase in GUS gene expression from 1000 nM.
  • the sensitivity is the same as that obtained in an agar medium containing estrogen. Therefore, when the test sample is an aqueous solution, the estrogen concentration can be measured by a very simple operation of simply putting seeds into the sample.
  • coactivators can interact with many nuclear receptors, it is possible to cope with the development of many other environmental hormone detection systems by changing the receptors used. Since the concentration of environmental hormones present in the actual environment is very low, and the detection method of the present invention has high detection sensitivity, a reporter assembly system can be constructed.
  • FIG. 1 shows the structure of a gene introduced into Arabidopsis thaliana.
  • NPT II Neomycin Phosphotransferase gene
  • NLS Nuclear localization signal of T antigen from SV40 virus
  • LexA DBD DNA binding site of Lex A protein from E. coli
  • hER a LBD Ligand of human estrogen receptor Binding site
  • TIF2 Transcription coactivator of human origin TIF2 code gene
  • VP16 AD Transcription activation region of VP16 protein of herpes simplex virus
  • GUS J8-Darc mouth-dase gene coding region of E. coli Pnos: promoter of nopaline synthase from soil bacteria
  • P35S 35S RNA promoter of cauliflower mosaic virus
  • Tnos transcription termination sequence from soil bacteria
  • 0 * 8 8 consecutive LexA tags
  • Protein DNA target sequence S / M2: Tobacco-derived nuclear matrix interaction DNA region II, ⁇ : Translation-activated DNA sequence
  • FIG. 2 is a diagram showing the molecular mechanism of estrogen detection by a plant two-effector system.
  • a chimeric estrogen receptor containing hER a LBD and LexA DBD that are always expressed in the nucleus is bound to OLex A upstream of the reporter GUS gene. Binding of estrogen to hER a LBD results in a ligand-dependent interaction between TIF2 and a chimeric transcriptional coactivator containing VP16 AD. As a result, the transcriptional activity of VP16 AD is transmitted to the plant transcription apparatus, which causes transcription and translation of the GUS gene. Estrogen can be detected by measuring the enzyme activity of GUS protein.
  • FIG. 3 shows changes in reporter gene expression dependent on 17 ⁇ -estradiol concentration.
  • the horizontal bar in the figure indicates 1 mm.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in reporter gene expression dependent on 17 ⁇ -estradiol concentration.
  • the vertical axis shows the GUS specific activity (pmols 4-MU h " 1 mg protein” 1 ). The error was calculated by performing three independent experiments.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in the expression level of a reporter gene depending on the number of days exposed to 17 ⁇ -estradiol.
  • the vertical axis shows the GUS specific activity (pmols 4-MU h " 1 mg protein” 1 ). The error was calculated by performing three independent experiments.
  • [6] This is a graph showing the responsiveness of the reporter gene to various estrogen-like substances. As the estrogen-like substance, (A) jetylstilbestrol (DES), (B) genistein, (C) bisphenol A (BPA), (D) pn-norphenol (NP) was used. The vertical axis shows the GUS specific activity (pmols 4-MU h " 1 mg protein” 1 ). The error is calculated by performing three independent experiments three times.

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Abstract

【課題】植物を使うことによって無菌操作などの煩雑な操作を必要とせず、センサーとしての感度が高いエストロゲン様物質の検出法を提供する。 　【解決手段】エフェクター１配列、エフェクター２配列、標的DNA及びレポーター遺伝子を導入することにより形質転換された植物であって、該エフェクター１配列が プロモーター、核局在化シグナル及び標的DNAへの結合ポリペプチドをコードする領域とエストロゲン様物質の核内受容体のリガンド結合ポリペプチドをコードする領域からなるキメラ遺伝子を有し、該エフェクター２配列がプロモータ、核局在化シグナル及び転写コアクチベータの核内受容体相互作用部位と転写活性化領域をコードするポリヌクレオチド領域からなるキメラ遺伝子を有し、該レポーター遺伝子が該標的DNAの下流に位置することを特徴とする形質転換植物である。この形質転換植物をエストロゲン様物質と接触させ、この植物におけるレポータ遺伝子の発現を検出する。 　

Description

明 細 書
植物を用いたエストロゲン様物質の検出方法
技術分野
[0001] この発明は、形質転換植物を利用してエストロゲン様物質 (エストロゲンを含む)を 検出する方法に関する。
背景技術
[0002] 内分泌撹乱化学物質、通称「環境ホルモン」は、環境中で分解されにくい性質を持 つものが多ぐ長期にわたり環境中に存在することが知られている。環境ホルモンの 多くは核内受容体に作用し、生体内で行われて 、る本来の内分泌系の情報伝達を 撹乱するため、生物の機能、特に生殖機能に重大な影響を与えることが示唆されて おり、生態系への影響も危惧されている。
動物の内分泌系で運ばれるステロイドホルモンは、一般に標的細胞内で核内受容 体と結合し、標的遺伝子の発現制御を行うことが知られている。核内受容体は大きな 遺伝子ファミリーを形成しており、保存されたドメイン構造 (A/B, C, D, and E)を持つ ている。 Cドメインは DNAへの結合に、 Eドメインはステロイドホルモン（リガンド）との 結合に関わっており、 Eドメインに存在する AF- 2 (Activation Function 2)はリガンド 依存的に転写活性ィ匕を起こすのに必要である。核内受容体へのリガンドの結合によ り、 AF-2と pl60ファミリー転写コアクチベータ一との相互作用が促進され、リガンド依 存的に標的遺伝子の転写が活性化される。エストロゲン受容体は核内受容体ファミリ 一に属しており、エストロゲンとの結合により活性ィ匕され、標的遺伝子の転写を活性 化する。
[0003] このような核内受容体とレポーター遺伝子を発現させた細胞等を利用してエストロ ゲン様物質を検出するバイオセンサーの開発は広く行われている (特許文献 1等)。 これらは通常エストロゲン様物質が核内受容体と結合することによりレポーター遺伝 子の発現を促すことに基づいている力 S、エストロゲン様物質が核内受容体と結合した 後からレポーター遺伝子を発現させるまでの機構にっ 、ては様々な仕組みが提案さ れている。 例えば、酵母を利用して、エストロゲン受容体のリガンド結合部位とコアクチベータ 一との間のリガンド依存的な相互作用を利用したツーハイブリッド法を用いたエストロ ゲン様物質検出法が報告されている（非特許文献 1)。しかし、この酵母ツーハイプリ ッド法は無菌操作が必要であり、抽出に用いる有機溶媒自体による環境の二次汚染 が懸念される。
また、無菌操作の要らない植物 (シロイヌナズナ）に、 DNA結合部位、転写活性ィ匕 部位及び核内受容体を組み合わせたキメラ転写因子を導入したシステムも考案され ている（非特許文献 2)。これは仕組みがシンプルであり好ましいが、バイオセンサー としての感度の低 、ことが欠点である。
更に、リガンド依存性転写因子、コアクチベータ及びレポーター遺伝子を導入した 形質転換体により、エストロゲンを検知する方法も提案されている（特許文献 2)。
[0004] 特許文献 1：特開 2002-330759
特許文献 2：特開 2002-247986
非特許文献 1 : Toxicology and Applied Pharmacology 154, 76-83 (1999)
非特許文献 2 : The Plant Journal (2000) 24(2), 265-273
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、エストロゲン様物質を安価で簡便に検出する方法であって、植物を使う ことによって無菌操作などの煩雑な操作を必要とせず、センサーとしての感度が高い 検出法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 従来法、例えば、特許文献 2の方法のように、コアクチベータ一をそのまま植物中で 発現させただけでは、強い転写活性ィ匕は見られない。また非特許文献 2の方法のよう にダルココルチコイド受容体やエストロゲン受容体をそのまま用いただけでは、これら は通常核外に常駐してリガンドと結合することにより核内に移行するため、センサーと しての感度が悪い。
しかるに、本発明の方法においては、核内受容体と DNA結合部位を備えたエフヱク ター 1にカ卩え、コアクチベータ一を改変して転写活性ィ匕ドメインを連結したェフエクタ 一 2を新たに導入することにより、本来エフェクター 1の産物が相互作用するコアクチ ベータ一とのリガンド依存的な相互作用（低濃度のリガンドの存在下で起こる現象)を 利用してリガンドを検出できるようになり、センサーとしての感度を格段に向上させるこ とができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0007] 即ち、本発明は、エフェクター 1配列、エフェクター 2配列、標的 DNA及びレポータ 一遺伝子を導入することにより形質転換された植物であって、該エフェクター 1配列 がプロモーター、核局在化シグナル及び標的 DNAへの結合ポリペプチドをコードす る領域とエストロゲン様物質の核内受容体のリガンド結合ポリペプチドをコードする領 域とからなるキメラ遺伝子を有し、該エフェクター 2配列がプロモータ、核局在化シグ ナル及び転写コアクチベータの核内受容体相互作用領域と転写活性化領域をコー ドするポリヌクレオチド領域とからなるキメラ遺伝子を有し、該レポーター遺伝子が該 標的 DNAの下流に位置することを特徴とする形質転,物である。
また本発明は、この形質転,物をエストロゲン様物質と接触させ、この植物にお ける前記レポータ遺伝子の発現を検出することから成るエストロゲン様物質の検出方 法である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明において、形質転換植物を用いてエストロゲン活性を持つ物質を検出する 様子を図 2に示す。形質転換植物に組み込まれた遺伝子は、常時植物細胞内で発 現されているキメラエストロゲン受容体とキメラ転写コアクチベータ一の 2種のエフエタ ター遺伝子と、エフェクター遺伝子産物間のリガンド依存的な相互作用によって転写 が活性化されるレポーター遺伝子 (例えば、 j8 -グノレクロニダーゼ)力も構成されて ヽ る。これをエストロゲン様物質 (リガンド）により生産される形質転 ^¾物のレポーター 遺伝子産物の活性を測定することにより、試料中にエストロゲン活性を有する物質を 高感度で検出できる。
[0009] 「エフェクター 1配列」は、プロモーター、核局在化シグナル及び標的 DNAへの結合 ポリペプチドをコードする領域とエストロゲン様物質の核内受容体のリガンド結合ポリ ペプチドをコードする領域力もなるキメラ遺伝子力も成る。エフェクター 1配列はこれら の他適宜、真核生物由来の他の核内受容体の全部又は一部分をコードする領域等 を有していてもよい。
「プロモータ」としては、 35Sプロモーターのような植物ウィルス由来のもの、ノパリン シンターゼプロモータのような植物関連細菌由来のもの、その他植物細胞内で機能 する天然あるいは合成されたプロモーター等が挙げられる。
「核局在化シグナル」としては、 SV40ウィルスの T抗原の核移行シグナルのように直 接核への輸送に関わる蛋白質に認識されるポリペプチド配列、及び核移行シグナル を有する蛋白質を介して間接的に輸送されるのに必要なポリペプチド配列等が挙げ られる。
[0010] 「標的 DNAへの結合ポリペプチドをコードする領域」は標的 DNAへ結合するポリべ プチド領域であり、「標的 DNA」として、様々な 4塩基以上の長さの直鎖状ポリヌクレオ チド配列が挙げられる。標的 DNAへの結合領域はこの標的 DNAの配列を認識して特 異的に結合するポリペプチド領域である。
[0011] 本発明において「エストロゲン様物質」はエストロゲン及びいわゆるエストロゲン様物 質の双方を含み、このような化合物として表 1 (明細書末尾）に記載の化合物 (Nishiha ra et. al.， J Health Science, 46(4):282- 298, 2000)が挙げられる。
「エストロゲン様物質の核内受容体のリガンド結合ポリペプチドをコードする領域」と は、真核生物由来のエストロゲンに結合活性を有するポリペプチド配列を含む領域 である。
「標的 DNAへの結合ポリペプチドをコードする領域とエストロゲン様物質の核内受 容体のリガンド結合ポリペプチドをコードする領域とからなるキメラ遺伝子」は、これら を含むポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチドを連結して形成される。
[0012] 「エフェクター 2配列」は、プロモータ、核局在化シグナル及び転写コアクチベータ の核内受容体相互作用部位と転写活性ィ匕領域をコードするポリヌクレオチド領域か らなるキメラ遺伝子カゝら成る。エフェクター 2配列はこれらの他適宜転写不活性化領 域をコードするポリヌクレオチド領域等を有して 、てもよ 、。
「プロモータ」及び「核局在化シグナル」は上記エフェクター 1配列で定義した範囲か ら選択でき、上記エフェクター 1配列で用いたものと同じであつても異なってもよい。
[0013] 「転写コアクチベータ」としては、 CBP/p300, pl60ファミリー蛋白質（TIF2, SRC1, A CTR, TRAP220, TIP60)等を含む真核生物由来の核内受容体と相互作用して転写 活性を上昇させる機能を持つポリペプチド等が挙げられる。
「転写コアクチベータの核内受容体相互作用領域」とは、 NIDと呼ばれるポリべプチ ド領域で LXXLL(L=leusine)モチーフを持っているポリペプチド領域である。
「転写活性ィ匕領域」とは、塩基性アミノ酸を直鎖状に多く含むポリペプチド領域、グ ルタミンを直鎖状に多く含むポリペプチド領域などのように、基本的転写因子 ·転写 装置と相互作用して転写を活性ィ匕するポリペプチド領域である。
「転写コアクチベータの核内受容体相互作用領域と転写活性化領域をコードする ポリヌクレオチド領域とからなるキメラ遺伝子」はこれらを含むポリペプチド領域をコー ドするポリヌクレオチドを連結して形成される。
[0014] 「標的 DNA」とは、 DNA結合性タンパク質が特異的に認識して結合するポリヌクレオ チドのことであり、このようなポリヌクレオチドを 2単位以上連結したものを用いてもよい 。上記の DNA配列をそのまま用いるよりも、複数単位直列に配置したほうがキメラエス トロゲン受容体力 Sこの DNA配列に結合する頻度が高くなりエストロゲンの検出感度が 上昇する。
「レポーター遺伝子」としては、蛍光蛋白質、測定可能な活性を有する酵素、活性 検出可能な酵素以外の蛋白質をコードするポリヌクレオチド領域などが挙げられる。 このレポーター遺伝子は標的 DNAの下流に位置する。
[0015] レポーター遺伝子発現領域には、これら標的 DNA及びレポーター遺伝子の他、植 物の中での発現を安定ィ匕させるための S/MII配列（核スキヤッフォールドに結合性を 有するポリヌクレオチド配列。）や、植物でのタンパク質合成を増やすためのオメガ配 列 (翻訳活性を上昇させるメッセンジャー RNA上の配列をコードするポリヌクレオチド 配列）、 TATA BOX等を連結してもよい。これら以外に、適宜必要に応じて、転写活 性や翻訳活性に影響を与えるポリヌクレオチド配列等を連結してもよい。
[0016] 本発明の形質転換する植物として、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、キンギヨソゥ、ジ ャガイモ、マメ科植物等の双子葉植物、及びトウモロコシ、イネ、コムギ等の単子葉植 物を用いることができる。
本発明のように植物を検出に用いるとさまざまな利点がある。植物の場合、根から 直接環境中の化学物質を吸収できるので、化学物質を試料から抽出精製する必要 がなぐまた、無菌操作が必要ない。さらに、種子は長期間、安定に保存ができ、保 管のための特別な装置もいらないので、他のバイオアツセィ法と比べてセンサーの保 存にコストがかからない。また、例えば、 1シロイヌナズナ個体力 約 2000粒の種子が 得られるため、大量生産による測定の低コストィ匕が可能である。
[0017] これら植物に、上記エフェクター 1配列、エフェクター 2配列、標的 DNA及びレポ一 ター遺伝子を導入する。このような方法として、土壌細菌（ァグロバタテリゥムなど）を 介したフラワーデイツビング法、エレクト口ポアレーシヨン法、マイクロプロジェクタィル ボンバードメント法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。
[0018] 形質転,物とエストロゲン様物質とを接触させる方法としては、エストロゲンを含 む水 '土'寒天培地などに播種し接触させる。又はエストロゲンを含まな!/ヽ水'土 '寒 天培地などに播種して生育させた個体を、エストロゲンを含む水 ·土'寒天培地など に移植して接触させる方法がある。
[0019] レポーター遺伝子の検出方法は、レポーター遺伝子の種類により異なる。例えば、 レポーター遺伝子として蛍光蛋白質を用いた場合には、蛍光顕微鏡 ·蛍光比色計に よる検出方法、レポーター遺伝子として測定可能な活性を有する酵素を用いた場合 には、酵素活性測定による方法、レポーター遺伝子として活性検出可能な酵素以外 の蛋白質を用いた場合には活性発現による植物生理機能 ·形態変化の観察による 方法を用いることができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
実施例 1
[0020] 本実施例では図 1に示すような遺伝子を組み込んで形質転換植物を形成した。
植物内で強力に下流の遺伝子の転写を制御するプロモーターであるカリフラワー モザイクウィルス（CaMV ) 35Sプロモーターにより、 hER a LBDと LexA DBDを含むキ メラエストロゲン受容体、及び TIF2 NIDと VP16 ADを含むキメラ転写コアクチベータ一 が形質転換シロイヌナズナ個体内で常時過剰に発現して 、る。この 2つのキメラタン パク質は、 SV40ウィルス由来 T抗原の核移行シグナルを含んでおり、常時核内に局 在している。核内において、キメラエストロゲン受容体はレポーター遺伝子である GUS 遺伝子の上流に位置する LexAタンパク質の標的配列（OLexA )に結合している。ェ ストロゲンがキメラエストロゲン受容体の hER a LBD部分と結合することにより、 hER a LBDの立体構造の変化が起こり、キメラ転写コアクチベータ一の TIF2 NID部分との 相互作用が起こる。この相互作用により TIF 2 NIDに融合した単純へルぺスウィルス 由来 VP16 ADの転写活性ィ匕シグナルが植物の転写装置に伝わり、エストロゲン依存 的に GUS遺伝子の転写及び翻訳が弓 Iき起こされる。形質転,物における GUSタン ノ ク質の酵素活性を測定することでエストロゲンを検出することができる。
[0021] まず、シロイヌナズナに導入する遺伝子を構築した。
キメラエストロゲン受容体をコードするエフェクター 1遺伝子はカリフラワーモザイクゥ ィルスの 35Sプロモーター（P35S)の下流に、 SV40ウィルスの T-抗原の核局在シグナ ル（NLS) · LexA DNA結合性ドメイン（LexA DBD) ·ヒトエストロゲン受容体 αのリガンド 結合ドメイン (hER a LBD)を連結したポリペプチドをコードする遺伝子及びァグロバタ テリゥムのノパリン合成酵素遺伝子のターミネータ一 (TNOS)を連結した。
エフェクター 1遺伝子を構築するために、 P35Sから NLSまでをコードする断片 (P35S - NLS)、 LexA DBDをコードする断片、 hER a LBDをコードする断片、 TNOSの断片を PCR反応によりそれぞれ増幅し調製した。
P35S-NLS断片は 35S-NLS-GFP (静岡県立大学食品栄養科学部、静岡巿谷田 52 番 1号、丹羽康夫氏より分与していただいた。 Curr Biol, 6: 325-30 (1996》を铸型、 5' -GGAAGCTTGC ATGCTGC AGG-3 ' (配列番号 1)及び 5'- GGGCTAGCGACCTTT CTCTTCTTCTT-3' (配列番号 2)をプライマーとして PCR反応を行い、 5'側に Hindll I部位、 3'側に Nhel部位が来るように調製した。
[0022] LexA DBD断片は大腸菌のゲノムを铸型とし、 5'- GGGCTAGCATGAAAGCGTTA ACGGCC-3' (配列番号 3)及び 5'- GGGCCGGCCTGGTTCACCGGCAGCCAC- 3' ( 配列番号 4)をプライマーとして PCR反応を行い、大腸菌のリブレッサーである LexA ( 配列番号 5, 6)の 1〜87番目の 87アミノ酸をコードする領域の 5'側に Nhel部位、 3'側 に Fsel部位が来るように調製した。
hER a LBD断片は、 hER(GenBank: NM— 0000125)の 281〜323番目の 43アミノ酸を コードする N末端側断片と、 324〜595番目の 272アミノ酸と終止コドンをコードする C 末端側断片に分けて増幅した。
両断片ともヒト卵巣 cDNAライブラリーを铸型とし、 N末端側断片は 5'- GGGGCCGG CCGTCTGCTGGAGACATGAGA- 3' (配列番号 7)及び 5'- GGGCTCAGCATCCAA CAAGGCACTGAC-3' (配列番号 8)をプライマーとして PCR反応を行い、 5'側に Fsel 部位、 3'側に Bpul 1021部位が来るように調製した。
C末端側断片は内部の Hindlll部位を塩基置換により破壊し、 5'- GGGCTGAGCC
(配列番号 9)及び 5し GGGCGGCCGCTCAGACTGTGGCAGGGAA- 3' (配列番号 1 0)をプライマーとして PCR反応を行い、 5'側に Bpull02I部位、 3'側に Notl部位が来 るように調製した。
[0023] TNOS断片は pBI221(CLONTECH, Palo Alto , CA , USA)を铸型とし、 5'- GGGC GGCCGCGAATTTCCCCGATCGTTC-3' (配列番号 11)及び 5し GGGAATTCACT AGTCCGATCTAGTAACATAGA-3' (配列番号 12)をプライマーとして PCR反応を 行い、 5'側に Notl部位、 3'側に EcoRI部位が来るように調製した。
上記の 4つの断片を pBI221 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)の Hin dm 'EcoRI部位に挿入することによりエフェクター 1プラスミドを作製した。
[0024] キメラコアクチベータ一をコードするエフェクター 2遺伝子は P35Sの下流に、 T抗原 の核局在シグナル (NLS)'ヒト転写コアクチベータ一の一部（hTIF2 NID) (human trans criptional intermediately factor 2 nuclear receptor interaction domain) ·単 ¾へノレへ スウィルスの VP16の転写活性化ドメイン (VP16 AD)を連結したポリペプチドをコードす る遺伝子及び TNOSを連結した。
エフェクター 2遺伝子を構築するために、 P35Sから NLSまでをコードする断片、 hTIF 2 NIDをコードする断片、 VP16 ADをコードする断片を PCRによりそれぞれ増幅し調 製した。
[0025] P35S-NLS断片は 35S- NLS- GFPを铸型とし、 5'- GGAAGCTTGCATGCTGCAGG -3' (配列番号 13)及び 5 '-GGGGGGGGATCCGACCTTTCTCTTCTTC- 3' (配列番 号 14)をプライマーとして PCR反応を行い、 5'側に Hindlll部位、 3'側に BamHI部位 が来るように調製した。
hTIF2 NID断片はヒト肝臓 cDNAライブラリーを铸型とし、 5'- GGGGATCCGAGAGA GCTGACGGGCAG- 3' (配列番号 15)及び 5 '-GGTCATGAAGTGCTCTGTGAAAT TCG-3' (配列番号 16)をプライマーとして PCR反応を行い、 hTIF2の 624番目から 869 番目までの 246アミノ酸をコードする領域を、 5'側に BamHI部位、 3'側に BspHI部位 が来るように調製した。
[0026] VP16 AD断片は単純へルぺスウィルスの転写因子 VP16遺伝子 (GenBank M15621,
Clontech, Palo Alto, CA, USA)を铸型とし、 5し GGCCATGGGCCCCCCCGACCGA
GCACGCCGACGCGCT- 3' (配列番号 17)及び 5し CCGAGCTCCTACCCACCGTA CTCGTC-3' (配列番号 18)をプライマーとして PCR反応を行い、 VP16の 413番目力 ら 490番目までの 78アミノ酸と終止コドンをコードする領域を、 5'側に Ncol部位、 3'側 に Sad部位が来るように調製した。このとき、内部の Sail部位を塩基置換により破壊し た。
上記の 3つの断片を pBI221の Hindlll-Sacl部位に連続して挿入することにより、エフ エタター 2プラスミドを作製した。
[0027] グルクロ-ダーゼをコードするレポーター遺伝子は LexA蛋白質の標的 DNA配列
(8回繰り返した配列）に P35Sの TATA配列を連結したキメラプロモーターの下流に、 翻訳増幅配列 ( Ω配列)、大腸菌のダルク口-ダーゼをコードする遺伝子の全長及び TNOSを連結してある。レポーター遺伝子を構築するために、 LexAの標的配列のオタ タマ一断片、 P35Sの TATAボックスから Ω配列までの TATA- Ω断片、 Hindm-BamHI リンカ一を調製した。
LexAの標的配列は、 5'- GATCCATACTGTATGAGCATACAGTATACTGTATGA GCATACAGTA- 3' (配列番号 19)と 5'- GATCTACTGTATGCTCATACAGTATACT GTATGCTC ATAC AGTATG-3 ' (配列番号 20)をアニーリングさせ、 BamHIと Bglllの 制限酵素部位にはさまれた LexAの標的配列のダイマー断片を調製した。
これを 4コピー縦列につなぎ、 LexAの標的配列のォクタマー断片を、 5'側に BamHI 部位、 3'側に Bglll部位が来るように調製した。 [0028] TATA- Ω断片は、 35S— NLS— GFPを铸型とし、 5 '—GGAGACTCGCATGCGCAAGA CCCTTCCTC- 3' (配列番号 21)及び 5'- CCCGGGACTAGTTGTAATTGTAAATA GTAA-3' (配列番号 22)をプライマーとして PCRを行い、 5'側に Bglll部位、 3'側に S mal部位が来るように調製した。
Hindm- BamHIリンカ一は、一本鎖オリゴ DNA 5し AGCTTGGACTAGAGCTTG- 3' (配列番号 23)と 5'- GATCCAAGCTCTAGTCCA-3' (配列番号 24)を二本鎖にァ- 一リングさせ、調製した。上記の 3つの断片を pBI221(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)の Hindlll-Smal部位に連続して挿入することにより、レポータープラス ミドを作製した。
[0029] 形質転^ ¾物における、このレポーター遺伝子の発現を安定ィ匕させるためにタバコ
(Nicotiana tabacum)の Matrix attachment regionである Scaffold/Matrix attachment r egions II(S/M II)を LexAの標的配列のォクタマー断片の 5'側に導入するために、タ バコゲノム DNAを铸型とし、 5し GAATTCGAGTCCAAAATGTTGGCATTTAG- 3' (配 列番号 25)及び 5 '-GAATTCAAGCTTTTCGAAATCAACGTTTGT- 3' (配列番号 2 6)をプライマーとして PCR反応を行い、 S/M IIの 5'側に EcoRI部位， 3'側に Hindlll及 び EcoRI部位が来るように DNA断片を調製した。
この断片を pGEM- T vector(Promega Corp., Madison, WI, USA)に挿入することに より、 S/M IIプラスミドを作製した。
[0030] 作製した各プラスミドを制限酵素処理することで得られたエフェクター 1断片（Hind III - EcoRI断片）、エフェクター 2断片（Hind III - EcoRI断片）、 S/M II断片（EcoRI - Hind III断片）を、レポータープラスミドの Hind III部位に挿入することにより、二つの エフェクター遺伝子と一つのレポーター遺伝子を含むプラスミド（以下「ツーエフエタ タープラスミド」という。）を作製した。
[0031] 次に上記で作製したツーエフェクタープラスミドを用いてシロイヌナズナヘの遺伝子 導入をした。この形質転鎌物作製においてシロイヌナズナの Columbia株（野生種） を用いた。
ツーエフェクタープラスミドをエレクト口ポアレーシヨン法でァグロバタテリゥム C58株 に導入後、このァグロバクテリウムをシロイヌナズナに感染させることにより、形質転換 を行った。形質転換処理をしたシロイヌナズナカも得られた種子 (T1種子）を 1 % sue rose, 0.8 %植物用寒天、 50 μ g/mlカナマイシン、 100 μ g/mlクラフォランを含む MS 寒天培地に播種し、導入遺伝子を持つ形質転換植物体の選抜を行った。カナマイシ ン耐性を持つ T1個体力も T2種子得た。また、 T2個体力も T3種子を得た。
実施例 2
[0032] 本実施例では、実施例 1で得た形質転換シロイヌナズナにおける GUS遺伝子のェ ストロゲン濃度依存的な発現誘導を調べた。
T3の種子を 17 j8 -エストラジオール（WAKO Pure Chemical Inds.)を含む MS寒天 培地に播種した。 1週間生育させた形質転換個体を用いて、 GUS遺伝子の発現の様 子を GUS活性染色法及び GUS活性測定法により調べた。
[0033] エストロゲンによる形質転換シロイヌナズナにおけるレポーター遺伝子発現誘導は 以下の方法で行った。エストロゲン（17 β -エストラジオール）を含 MS寒天培地（DMS 0, WAKO Pure Chemical Inds.)に溶解した状態で MS寒天培地に 10000分の 1量添 カロした）上に形質転換シロイヌナズナの種子を播種し、 3日間 4°C暗所に置いた。そ の後、 22°C、明所において、所定日数だけ発芽 ·生育させ、その期間、形質転換シロ ィヌナズナは連続的にエストロゲンに曝露された。
[0034] GUS活性染色法は以下の方法で行った。エストロゲンに曝露された形質転換シロイ ヌナズナの GUS染色を行った。植物体を染色液（2 mM 5-ブロモ -クロ口-インドリル- j8— D—グルクロ-ド（X— Gluc)、 50 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0)、 10 mM ED TA、 0.1% Triton X- 100, 0.5 mMフェリシア-ド、 0.5 mMフエロシア-ド)に浸し、 15分 間デシケーターの中で減圧処理を行った。その後、 37°Cで 3時間静置し、植物体を 7 0%エタノールに浸して葉緑素を取り除き、観察を行った。その結果を図 3に示す。
GUS染色法は、植物体全体を用いて行われ、 GUSタンパク質が基質である X- Glue を分解して得られるインディゴブルーの発色力 0.05 nM以上のエストロゲン濃度で 形質転換個体の根の部分に観察された。 GUS染色が観察された部分は直接寒天培 地に接触していた部位であり、培地から植物体内にエストロゲンが拡散によって浸透 した結果であると思われる。
[0035] GUS活性測定法は以下の方法で行った。エストロゲンに曝露された形質転換シロイ ヌナズナカゝら抽出したタンパク質中の GUS活性を測定した。処理した植物体 20個体 を液体窒素中で凍らせた後、ホモジナイザーを用いてパウダー状にした。そこに抽出 バッファー（50 mM NaH PO、 10 mM EDTAゝ 0.1% Triton X— 100、 0.1% N—ラウロイノレ
2 4
サルコシンナトリウム、 10 mM j8 -メルカプトエタノール)を加えて可溶性タンパク質を 抽出した。 GUS活性の測定には 4-メチルゥンベリフェリル - j8 - D-グルクロ-ド (4-MU G)を基質として用いた。終濃度 1 mMとなるように 4-MUGをカ卩えた抽出バッファーに抽 出したタンパク質液をカ卩えて、 37°Cで 1時間反応させた。 1時間後に 0.2 M Na COを
2 3 加えて酵素反応を停止させた。 GUSの触媒作用により 4-MUG力 遊離した 4-MUの 濃度を蛍光分光光度計（日立 F-4500)を用いて測定した (波長 365 nmの光で励起し て放出される 455 nmの波長を測定)。また、溶液中のタンパク質濃度を測定し、蛍光 分光光度計での測定で得られた値を溶液中に含まれる全タンパク質量によって補正 してデータを標準化した。その結果を図 4に示す。
[0036] 形質転換植物は 17 β -エストラジオール 0.05 ηΜから 0.8 ηΜまでの間で GUS遺伝子 の発現上昇を示し、 5 nM以上の濃度では GUS遺伝子の発現の減少が見られた。 実施例 3
[0037] 本実施例では、形質転換シロイヌナズナエストロゲン曝露日数におけるレポーター 遺伝子の活性の変化を調べた。エストロゲンによる形質転換シロイヌナズナにおける レポーター遺伝子発現誘導は実施例 2と同様の方法で行った。
T3種子を 1 nMの 17 β -エストラジオールを含む MS寒天培地に播種し、 3〜14日間 生育させた。生育させた形質転換個体を回収し、 GUS遺伝子の発現の様子を GUS活 性測定法により調べた。その結果を図 5に示す。
GUS遺伝子の活性は曝露日数を経るごとに減少して!/、く様子が見られた。 実施例 4
[0038] 本実施例では、形質転換シロイヌナズナのエストロゲンァゴ-スト活性を示す物質 への応答を調べた。エストロゲンによる形質転換シロイヌナズナにおけるレポーター 遺伝子発現誘導は実施例 2と同様の方法で行った。
形質転換後 2世代目 (T2)種子を異なる濃度のエストロゲン様物質であるジェチルス チルべステロール（DES) (ICN Biomedicals Inc. (CT, USA))、 p- n-ノユルフェノール（ NP) (WAKO Pure Chemical Inds.)、ビスフエノーノレ A (BPA) (WAKO Pure Chemical I nds.)、ゲニスティン（EXTRASYNTHESE S. A. (Genay, France))を含む MS寒天培地 に播種し、 1週間生育させた。形質転換個体における、 GUS遺伝子の発現の様子を GUS活性測定法により調べた。その結果を図 6 (A)〜（D)に示す。
[0039] DESは 0.1 nMから応答を示す発現プロフィールが得られた。また、 NPは 1000 nM より、 BPAは 100 nMより、ゲニスティンは 1 nMよりそれぞれ GUS遺伝子の発現の上 昇が見られた。また、 GUS遺伝子発現のための各々のァゴ-ストの至適濃度は、 DES
10 nM, BPA 100 nM,ゲ-スティン 10 nMであった。 NPは 1000 nMから GUS遺伝子 発現の上昇が見られた。
産業上の利用可能性
[0040] 本発明の形質転換植物の種子をエストロゲン用物質を含む水の中に入れ、光照射 下で発芽 '育成させると、エストロゲンを含む寒天培地で行った場合と同等の感度を 示す。このことから、被検試料が水溶液の場合、試料中に種子を入れるだけという非 常に簡単な操作でエストロゲン濃度の測定を行うことができる。また、コアクチベータ 一は多くの核内受容体と相互作用することができるので、用いる受容体を変えること で他の多くの環境ホルモン検出系の開発に対応することができる。実際の環境中に 存在する環境ホルモンの濃度は非常に低濃度であり、本発明の検出方法は検出感 度が高いため、レポーターアツセィシステムの構築が可能となった。
[0041] 「表 1」
丄, 1,1,2— Tetrachloroethane, 1,2, 3-Trichiorobenzene , 1,2, 3-Trichloroethane , 1,2,3— Trimethylbenzene, 1,2,4,5— Tetramethylbenzene, 1,2,4-Trichlorobenzene, 1,2,4— Tri methylbenzene, 1 ,2-Dibromoethane, 1,2— Dichlorobenzene, 1 ,2-Diethylbenzene, 1,2 -Dimethylnaphthalene , 1,2— Dinitrobenzene, 1,2— Epoxyethlbenzene, 1,3,5— Triethylt oluene, 1,3,5— Trimethylbenzene, 1,3,5— Triphenylcyclohexane, 1,3— Dichloro— 2— prop anol, 1 ,3-Dichloropropene, mixture, 1, «3— Diphenylpropane, 1,4— Dicnlorobenzene, 1,4 -Diethylbenzene, 1,4— Dioxane, 1,6— Dinitropyrene, 1,8— Dimethylnaphthalene, 1,8— D initropyrene, 1.2- Dibromo- 3- chloropropane, 10- Hydroxy benzo[a]pyrene, 11- Hydr oxy benzo[a]pyrene, 12— Hydroxy benzo[a]pyrene, 17a— Estradiol, 17a— Ethynylestrad y¾¾¾q,,,,yy Ilersl:nButlIleilol 4nHetl!ssl:nHexlIleilol
yyyyy¾, loxethl trimeritic acid 4MetIlacrloloxethl trimeritic acid 4MethlII
ypyyysyOyy,,, droxbihenl:Mdroxtamoxireil:lsopromethlIleilol:MetIlacrloIllll II
yy¾yyyyyy,,,:HdroxacetoIlenone:idroxbenzaldehde:Hdroxbenzolc acidm:HIlII }IIIl I ¾y,,, mmolweilzolc acid 4BromoIleilol 4rrI!loro35xlssl 4:ΓΙΊ10ΓΟ3IlllΙΙι
yyy ,,,, e1:hl trimeritic acid nndrate 4Ammo 13utl!;>enzoate 4Ammol;>enzolc acid 4AIII
ypy¾yyyyyyyy,,, droxbihenl rl!101;>llleill 4ACrloloxethl trimeritic acid:ACrlolox III
yOy¾yyO,,,() rtroutlIlenolbrancIledNOnlIlenolDihdroxbenzoIlenonelI I
yy¾,,,( Ethltoluene 3MethlcI101anthreneMr 3NitrofIuorantIlene 3Nitronenol 3teIIIl
¾yy¾ ,,,,,,, 34DldlloroIlenol 38Dlhdrox28dicI!lorodibenzofaran 3AmmoIlenol 3IIllI1
ypyppy,,,() 2secButlhenol 2tertroutlhenol 44¾ntachlorobihenlpcro 126llll y¾¾,,, 1:e 2Mercaol;>eilzotIuazole 2Mercaoimiaazoline 2Me1:hllroailol 2Me1:IIIllI.
¾yyyyyyyyy,,,arene 2Hdrox iluorine 2Haroxalbenzofaran 2Hdroxethl methacrlaIII
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lyy O,,,, acene 2Ammoanthracumone 2Ammotoluene 2BUtoxethlhtllalateIII
yp,,,,,, utane 25Dldlloroanillne 26Dlmethlnahtalene 2 Ammoetlianol 2AmmoanthrIII
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Oyyy fyyy¾,,o(o(llenlethtetralin lepnenl4elsenlethtetralm
y,,,,( Butanol lchloro24dinitrobenzene lrnloro2nltrobenzene y¾yyy Oyy,,,()(o ιοΐ laphenl4:arIlenlethltetralin laphenl4:elllenlethtetralin oxide, 4— Nitrotoluene, 4— n— Nonylphenol, 4— n— Octylphenol, 4— Nonylphenol polyethy oxylate(lO), 4- Nonylphenol polyethyoxylate(15), 4- Nonylphenol polyethy oxylate(2) , 4— Nonylphenol, olyethyoxylate(23), 4— Nonylphenol polyethy oxylate(5) , 4— n— Pentylp henol, 4— n— Propylphenol, 4— sec— Butylphenol, 4— tert— Butylbenzoic acid, 4— tert— But ylphenol, 4— tert— Octylphenol, 4— tert— Octylphenol, 4— tert— Octylphenol polyethoxyla te(10), 4— tert— Octylphenol, polyethoxylate( 15) , 4— tert— Octylphenol polyethoxylate( 2), 4— tert— Octylphenol, polyethoxylate(23), 4— tert— Octylphenol polyethoxylate(5), 4 —tert— Pentylphenol, 4— Toluenesulfonamide, 5— Hydroxy benso[a]pyrene, 6— Hydroxy benso[a]pyrene, 6- Hydroxy- 3,4- dichlorodibenzoiUran, 7- Hydroxy benzo[a]pyrene, 7— Hydroxy— l，2，3，6，8—pentachlorodibenzofuran， 7— Hydroxy— 3,4— dichlorodibenzofura n， 8— Hydroxy enzo[a]pyrene, 8— Hydroxy— 2,3,4— trichlorodibenzofuran, 8— Hydroxy— 2 -menochlorodibenzofuran, 8— Hydroxy— 3,4,6— trichlorodibenzoiUran, 8— Hydroxy— 3— m onochlorodibenzoiuran, 8— Hydrozy— 3,4— dichlorodibensofuran, 9— Hydroxy benso[a]p yrene, 9— Hydroxy fluorine, 9— Hydroxy— 2,6— dichlorodibenzofuran, 9— Hydroxy— 3,4— di chlorodibenzoiuran, Acephate, Acetaldehyde, Acetamide, Acetyleugenol, Acylamide ， Adipic acid, Aflatoxin Bl, a— Hexachlorocyclohexane, Alachlor, Aldicarb, Aldrin, a— Methylstyrene, Amitrole, Aniline, Anthracene, Antimony(III) chloride, Apigenin, Apl ysiaterpenoid A, Atrazine, Benz [a] antharacene , Benzaldehyde, Benzalkonium chlori de, Benzo[a]pyrene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo[e]pyrene, Benzo[g，h，i]perylen， Be nzo[k]fluoranthene, Benzoepinesulfate, Benzoic acid, Benzophenone, Benzylalcohol, Benzylbutyl phthalate, b— Estradiol— 17— acetate, b-Hexachlorocyclohexane, Bifenox, Biochanin A, Biphenyl, Bis(2- chloroethyl)ether， Bis (4~hy droxypheny)methane , Bis( 4-hydroxyphenyl)sulfone, Bisphenol A, Bisphenol-Abischloroformate, Bisphenoト A- diglycidyl, ether, Bisphenol— A— dimethacrylate, Bisphenol— A— ehoxylate, Bisphenol-A -ehoxylate diacrylate, Bisphenol— A— proxylate, Bisphenolo— A— bischloroformate, Bisp henolo— A— diglycidyl ether, Bisphenolo— A— dimethacrylate, Bisphenolo— A— ethoxylate, Bisphenolo— A— ethoxylate diacrylate, Bisphenolo— A— proxylate, Boric acid, BPMC, B romobutide, Bromodichloromethane , Bromoform, b— Sitosterol, Butylated hydroxyani sole, Butylated hydroxytoluene, Cadmium chloride, Campharquinone, Captans, Cara vacrol, Carbaryl, Carbendazim, Carbofuran, Catechol, Chinomethionat, Chlorhexidi ne gluconate, Chlornitrofen, Chlorobenside, Chlorobenze, Chlorobenzilate, Chlorodi bromomethane, Chloropropham, Chlorothalonil, Chlorpyrifos— methyl, cis— 1,2— Diphe nylcyclobutane, cis- Stilbene, Clomiphene, compound, Copper(II) sulfate, Coumaric, acid, Coumestrin, Coumestrol, Cucumechinoside D， Cumene, Cyanazin, Cyclohexan ol, Cyclohexanone, Cyclohexylamine , Cyclosporin A, Cyfluthrin, Cyhalothrin, Cyper metrin, Daidzein, Daidzin, D ethyl adipate, Dexamethasone, Di— 2— ethylhexyl adipate ， Di- 2- ethylhexyl phathalate, Diazinon, Dibenz[a,h]anthracene, Dibenzyl ether, Dib utyl adipate, Dibutyl phthalate, Dichlorvos, Dicloran, dicyclohexyl phthalate, Dicycl ohexylamine, Dicyclopentadiene, Didecyldimethylammmonium， hloride, Dieldrin, Di ethoxyleneglycol dimethacrylate, Diethyl phthalate, Diethyl sulfate, Diethylbenzene, mixture, Diethylene glycol, Diethylstilbesterol, Diflubenzuron, Diheptyl, phthalate, Dihidroglycitein, Dihydrogenistein, Dihydrotestosterone, Di—iso— butyl adipate, Di— is o— butylphathalate, Di—iso— decyl phathalate, Di—iso— nonyl phthalate, Di—iso— octyl, p hthalate, Di—iso— propyl adipate, Di—iso— prppyl phthalate, Dimepiperate, Dimethoate ， Dimethyl adipate, Dimethyl phthalate, Di-n-butyl phthalate, Di-n-hexyl phthalate,
Di—n— pentyl phthalate, Di—n— propyl phthalate, Diphenyl carbonate, Diphenylamine, Diphenylmethane, Dipropyl phthalate, Dodecyl polyethoxylate(15), Dodecyl polyeth oxylate(3), Dodecyl polyethoxylate(5), Dodecyl polyethoxylate(9), Endosulfan(a- Ben zoepin), Endosulfan(b— Benzoepin), Endosulfan(Benzoepin), Endrin, Epichlorohydrin, EPN, Equol, Esprocarb, Estriol, Estrone, Ethanolamine, Ethyl 4-hydroxybenzoate, Ethyl benzene, Ethyl parathion, Ethylcarbamate, Ethylene glycol, Ethylene glycol m onoethyl ether, Ethylenediaminetetraacettic acid 2Na, Eugenol, Fenbutatin oxide, F enitrothion, Fenobcarb, Fenvalerate, Feruic acid, Flavone, Fluazifop— butyl, Flucyth rinate, Fluvalinate, Formaldehyde, Genistein, Genistin, g-Hexachlorocyclohexane, Glutar aldehyde, Glycitein, Glycitin, Glycyrrhizic acid 2K, Glyoxal, Heptachlor epoxi de, Hexachloro— 1,3— butadiene, Hexachlorophene, Hinokitiol, Hinokitiol acetylglucos
y¾y¾¾,,,,()o)y riae Trls2dllor〇:hl〇sIlate Trls;>ut〇:hl〇sIlate Trp2 Trammlll
y¾¾yy¾¾y¾y,,( rimethlroane triacrlate Trlmethlroane trimethacrlate TriIlenltinIV chlo
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Figure imgf000018_0001
yyy¾yyypy,,, oxlamme sulfate HdroxtetrachlorolIlenl HdroxtrldllorolDlIlenlll pO, iae hmoKitlol Hiurlc e, Tyrosine, Urethane dimethacrylate, Vinclozolin, Vinylacetic acid, Xylylcarb, Zine b, Ziram
図面の簡単な説明
[図 1]シロイヌナズナに導入した遺伝子の構造を示す図である。 NPT II：ネオマイシン リン酸基転移酵素コード遺伝子、 NLS: SV40ウィルス由来 T抗原の核局在シグナル、 LexA DBD:大腸菌由来 Lex Aタンパク質の DNA結合部位， hER a LBD:ヒト由来ェ ストロゲン受容体のリガンド結合部位、 TIF2:ヒト由来転写コアクチベータ一 TIF 2コ ード遺伝子、 VP16 AD:単純へルぺスウィルスの VP16タンパク質の転写活性化領域 、 GUS:大腸菌由来 j8 -ダルク口-ダーゼ遺伝子コード領域、 Pnos:土壌細菌由来の ノパリン合成酵素のプロモーター、 P35S:カリフラワーモザイクウィルスの 35S RNAプロ モーター、 Tnos:土壌細菌由来の転写終結配列、 0 * 8:連続した 8個の LexAタ
LexA
ンパク質の DNA標的配列、 S/M2:タバコ由来の核マトリックス相互作用 DNA領域 II, Ω :翻訳活性化 DNA配列
[図 2]植物ツーエフェクターシステムによるエストロゲン検出の分子メカニズムを示す 図である。常時核内に発現する hER a LBDと LexA DBDを含むキメラエストロゲン受 容体が、レポーターである GUS遺伝子の上流にある OLex Aに結合している。エストロ ゲンの hER a LBDへの結合により、 TIF2と VP16 ADを含むキメラ転写コアクチベータ 一とのリガンド依存的な相互作用が起こる。これにより VP16 ADの転写活性ィ匕シダナ ルが植物の転写装置に伝わり、 GUS遺伝子の転写、翻訳が引き起こされる。 GUSタン ノ ク質の酵素活性を測定することでエストロゲンを検出することができる。
[図 3]17 β -エストラジオール濃度依存的レポーター遺伝子発現の変化を示す図で ある。図中の横棒は 1 mmを示す。
[図 4] 17 β -エストラジオール濃度依存的レポーター遺伝子発現の変化を示す図で ある。縦軸は GUS比活性 (pmols 4-MU h"1 mg protein"1 )を示す。誤差は独立した実 験を 3回行って算出した。
[図 5]17 β -エストラジオール曝露日数に依存したレポーター遺伝子の発現量の変動 を示す図である。縦軸は GUS比活性 (pmols 4-MU h"1 mg protein"1 )を示す。誤差は 独立した実験を 3回行って算出した。 圆 6]さまざまなエストロゲン様物質に対するレポーター遺伝子の応答性を示す図で ある。エストロゲン様物質として (A)ジェチルスチルべステロール (DES)、（B)ゲニスティ ン、（C)ビスフエノール A(BPA)、（D)p- n-ノ-ルフエノール (NP)を用いた。縦軸は GUS 比活性 (pmols 4-MU h"1 mg protein"1 )を示す。誤差は独立した実験を 3回行って算 出し 7こ。

Claims

請求の範囲
[1] エフェクター 1配列、エフェクター 2配列、標的 DNA及びレポーター遺伝子を導入す ることにより形質転換された植物であって、該エフェクター 1配列がプロモーター、核 局在化シグナル及び標的 DNAへの結合ポリペプチドをコードする領域とエストロゲン 様物質の核内受容体のリガンド結合ポリペプチドをコードする領域とからなるキメラ遺 伝子を有し、該エフェクター 2配列がプロモータ、核局在化シグナル及び転写コアク チベータの核内受容体相互作用領域と転写活性ィヒ領域をコードするポリヌクレオチ ド領域とからなるキメラ遺伝子を有し、該レポーター遺伝子が該標的 DNAの下流に位 置することを特徴とする形質転換植物。
[2] 請求項 1に記載の植物をエストロゲン様物質と接触させ、該植物における前記レポ一 タ遺伝子の発現を検出することから成るエストロゲン様物質の検出方法。
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