WO2005121750A1 - フローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置 - Google Patents

フローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置 Download PDF

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WO2005121750A1
WO2005121750A1 PCT/JP2005/010420 JP2005010420W WO2005121750A1 WO 2005121750 A1 WO2005121750 A1 WO 2005121750A1 JP 2005010420 W JP2005010420 W JP 2005010420W WO 2005121750 A1 WO2005121750 A1 WO 2005121750A1
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WO
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excitation light
flow path
detection area
light incident
flow cell
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PCT/JP2005/010420
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French (fr)
Inventor
Hideki Shimoi
Hiroyuki Kyushima
Yutaka Hasegawa
Original Assignee
Hamamatsu Photonics K.K.
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
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    • G01N2021/0346—Capillary cells; Microcells

Definitions

  • the present invention relates to a flow cell and a fluorescence correlation spectrometer using the same.
  • Fluorescence correlation spectroscopy which is one of the methods for detecting trace molecules, includes fluorescence correlation spectroscopy (hereinafter simply referred to as FCS) and fluorescence cross correlation spectroscopy (hereinafter referred to as FCS).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • trace simply FCC and himself “Rika s Meri, as an apparatus using the F and S, flowing solution to be measured in the wire carrier bi Larry flow tube, and focus the excitation light to the sample liquid flowing through the Kiyabira Rifuro tube
  • a small (pinpoint) observation region is set, and molecular information of brown movement in an extremely small observation region is obtained by detecting fluorescence emission of fluorescent molecules (for example, see Patent Document 1). reference).
  • Patent Document 1 Patent No. 3517241
  • the capillary flow tube is made extremely thin so as not to waste a small amount of sample solution. It is necessary to use such an ultra-fine structure, so that the focal point of the excitation light approaches the inner wall of the tube.
  • the Brownian motion is constrained by the effect of the inner wall of the tube, or the light is scattered and reflected by the inner wall of the tube.
  • the detection accuracy decreases. In particular, when the edge (corner) of the tube wall enters the optical path of the excitation light, the excitation light is scattered and unexpectedly refracted, and the detection accuracy is further reduced.
  • the present invention has been made to solve such a problem, and has been adopted for fluorescence correlation spectroscopy, which enables efficient detection of a small amount of sample solution and detection accuracy of the fluorescence correlation spectroscopy. It is an object of the present invention to provide a flow cell and a fluorescence correlation spectrometer using the same.
  • a flow cell according to the present invention is employed in a fluorescence correlation spectroscopy method in which excitation light is focused on a small amount of sample liquid and fluorescence emission is detected, and includes a cell body formed by stacking a plurality of flat plates, In the cell body, the detection area where the focus of the excitation light is set, the introduction flow path for introducing the small amount of sample liquid introduced from the inlet into the detection area, and the small amount of sample liquid discharged from the detection area to the outlet And a discharge channel, and the detection region is formed by enlarging the channel, and the peripheral wall surrounding the optical axis of the excitation light is configured not to enter the optical path of the excitation light.
  • a discharge channel and the detection region is formed by enlarging the channel, and the peripheral wall surrounding the optical axis of the excitation light is configured not to enter the optical path of the excitation light.
  • the detection region in which the focus of the excitation light with respect to the small amount of sample liquid is set is expanded with respect to the flow path of the small amount of sample liquid, and in other words, the flow region excluding the detection region is excluded. Since the path is reduced with respect to the detection area, a small amount of sample liquid is used without waste. In addition, since the detection area is expanded with respect to the flow path in this manner, the influence of the inner wall of the detection area on Brownian motion and the inner wall of the pipe are smaller than when the detection area and the flow path are made to be almost the same ultrafine. The effect of scattered light and reflected light due to the light is reduced.
  • peripheral wall of the detection region is configured so as not to enter the optical path of the excitation light, scattering of the excitation light and unexpected refraction are prevented. If the flow path and the detection area are washed through the inlet and outlet every time a non-identical trace of sample is detected, if multiple samples are stored, for example, a multi-sheet can be used to adjust the optical axis for each sheet change. The throughput (the number of processes per unit time) is improved as compared with the case where detection is performed.
  • a fluorescence correlation spectrometer using the above-mentioned flow cell and including an excitation light source, a focusing optical system, a detection unit, and an analysis unit.
  • a small amount of a sample liquid is used without waste and is efficiently used for detection, and the influence on the Brownian motion of molecules and the effects of scattered light and reflected light due to the inner wall of the tube are reduced.
  • the flow of excitation light is reduced, and the detection accuracy of fluorescence correlation spectroscopy is reduced by reducing the unexpected refraction, the throughput is improved, and the detection cost is reduced.
  • a correlation spectrometer can be provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an FCS device provided with a flow cell according to a first embodiment of the present invention. It is a block diagram.
  • FIG. 2 is a longitudinal sectional view showing the flow cell in FIG.
  • FIG. 3 is a top view of the flow cell shown in FIG. 2.
  • FIG. 4 is a view taken in the direction of arrows IV—IV in FIG. 3.
  • FIG. 5 is an enlarged view of a detection region and a flow path of the flow cell shown in FIG. 2.
  • FIG. 6 is an explanatory view showing a state where excitation light is focused on the detection region of the flow cell shown in FIG.
  • FIG. 7 is a top view showing the upper plate in FIG. 2.
  • FIG. 8 is a top view showing the intermediate plate in FIG. 2.
  • FIG. 9 is a view showing another example of the detection area in FIG. 3, and is a top view showing a state in which an upper plate is removed.
  • FIG. 10 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a second embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a top view showing a detection area and a flow path in FIG. 10 without an upper plate.
  • FIG. 12 is a diagram showing another example of the detection area in FIG.
  • FIG. 13 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a third embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a top view showing a detection area and a flow path in FIG. 13 without an upper plate.
  • FIG. 15 is a diagram showing another example of the detection area in FIG.
  • FIG. 16 is a diagram showing still another example of the detection area in FIG.
  • FIG. 17 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a fourth embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a fifth embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a sixth embodiment of the present invention.
  • FIG. 20 is a top view showing a detection area and a flow path in FIG. 19 without an upper plate.
  • FIG. 21 is a diagram showing another example of the detection area in FIG. 20.
  • FIG. 22 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a seventh embodiment of the present invention.
  • FIG. 23 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to an eighth embodiment of the present invention.
  • FIG. 24 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a ninth embodiment of the present invention.
  • FIG. 25 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a tenth embodiment of the present invention.
  • FIG. 26 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to an eleventh embodiment of the present invention.
  • FIG. 27 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a twelfth embodiment of the present invention.
  • FIG. 28 is a top view of the flow cell shown in FIG. 27.
  • FIG. 29 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a thirteenth embodiment of the present invention. Explanation of symbols
  • FIGS. 1 to 9 show a flow cell according to the first embodiment of the present invention
  • FIGS. 10 to 29 show flow cells according to the second to thirteenth embodiments of the present invention.
  • the same elements are denoted by the same reference numerals, and redundant description will be omitted.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an FCS device as a fluorescence correlation spectrometer equipped with a flow cell according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a longitudinal sectional view showing the flow cell in FIG.
  • FIG. 7 is a top view showing the upper plate in FIG. 2
  • FIG. 8 is a top view showing the intermediate plate in FIG. 2
  • FIG. 9 is another example of the detection area in FIG. It is a figure which shows and is a top view which shows in the state which removed the upper plate.
  • the FCS device used in the present embodiment is used, for example, for detecting an antigen-antibody reaction, and utilizes the property that the Brownian motion is slowed by the increase in molecular weight due to the antigen-antibody reaction. , To determine the presence or absence of an antigen-antibody reaction.
  • the FCS device 1 interferes with the excitation light from a laser 2 as an excitation light source, passes through a finolator 3 and a dichroic mirror 4 and an objective lens 5 as a focusing optical system.
  • a microscopic (pinpoint) observation area is set by focusing on a small amount of sample solution in the sample, and fluorescence emission from fluorescent molecules in the small amount of sample solution is passed through the objective lens 5, finoleta 6, and pinhole 7, and The background light other than the focal plane is removed by the pinhole 7 and then guided to the photomultiplier tube 8 as a detection unit, and analyzed by the digital correlator 9 as the analysis unit.
  • the FCS device 1 of the present embodiment can of course be used for purposes other than detection of an antigen-antibody reaction, and each configuration of the FCS device 1 can be appropriately changed.
  • the optical system that guides and focuses the excitation light on a small amount of sample solution in the flow cell 10 and the optical system that collects the fluorescence emission from the fluorescent molecules in the small amount of sample solution may be different, and the detection unit is an avalanche photodiode. Semiconductor detector may be used.
  • the flow cell 10 used in the FCS device 1 includes a cell body 30 formed by stacking three flat plates.
  • the upper plate 31 shown in the figure, the lower plate 32 shown in the figure, and the intermediate plate 33 sandwiched between the upper plate 31 and the lower plate 32 are, for example, transparent plates such as glass plates. Have been.
  • the upper plate 31 and the intermediate plate 33 have the same thickness (for example, 0.5 mm), the lower plate 32 is thinner (for example, 0.15 mm), and the lower plate 32 Is placed on the excitation light incident side (see Fig. 6).
  • a detection area 34 having a cylindrical space shape in which the focal point P of the excitation light R (see FIG. 6) is set, and a small amount of sample liquid are stored in the cell body 30.
  • An inlet channel 37 connecting the inlet 35 for introduction into the chamber 30 and the detection area 34, and an outlet stream connecting the outlet 36 for discharging a small amount of sample liquid out of the cell body 30 and the detection area 34.
  • the upper plate 31 has an inlet 35 at one end side (left side in the drawing) in the longitudinal direction, and has a through-hole penetrating vertically (stacking direction). 37c is provided, and a through hole 38c having a discharge port 36 and vertically penetrating is provided on the other end side (the right side in the figure) in the longitudinal direction.
  • the intermediate plate 33 is provided with a through hole 34a vertically penetrating at a position corresponding to the middle between the through holes 37c and 38c of the upper plate 31, and through the upper plate 31.
  • a through hole 37b penetrating vertically is provided at a position coaxial with the hole 37c, and a lower surface groove 37a connected to the lower surface side of the through holes 34a and 37b is provided on the lower surface thereof.
  • the upper surface side groove 38a is provided on the upper surface side of the through hole 34a and extends to a position corresponding to the through hole 38c of the upper plate 31. Then, as shown in FIGS.
  • the through hole 34 a of the intermediate plate 33 becomes the detection area 34, and
  • the groove 37a on the lower surface side of the intermediate plate 33, the through hole 37b, and the through hole 37c of the upper plate 31 are used as the introduction flow path 37, and the groove 38a on the upper surface side of the intermediate plate 33 and the through hole 38c of the upper plate 31 are formed.
  • the discharge passage 38 is provided.
  • the bottom wall 34d, the peripheral wall 34e, and the upper wall 34f of the detection region 34 form an inner wall of the detection region 34.
  • the introduction flow path 37 is connected to the peripheral wall 34e so as to be flush with the bottom wall 34d which is the end face of the detection area 34 on the excitation light incident side, and the discharge flow path 38 is formed.
  • the detection area 34 is connected to the peripheral wall 34e so as to be flush with an upper wall 34f which is an end face of the detection area 34 opposite to the excitation light incident side.
  • the longitudinal direction of the cell body 30 is the X direction
  • the horizontal direction perpendicular thereto is the y direction
  • the vertical direction is the z direction
  • the width in the y direction of the inlet channel 37 and the outlet channel 38 is yb
  • the width in the z direction of the detection region 34 is za
  • the width of the inlet channel 37 and the outlet channel 38 in the z direction is zb
  • the width of the detection region 34 is zb.
  • the sizes of the detection area 34, the introduction flow path 37, and the discharge flow path 38 are set so as to satisfy the relations ya> yb, za> zb, xa> zb, yb. .
  • the size of the groove of the intermediate plate 33 excluding the through hole 38c is defined as the size of the introduction flow channel 37 and the discharge flow channel 38.
  • the flow cell 10 of the present embodiment has a configuration in which the focal point P of the excitation light R is set and the detection area 34 is formed by enlarging the introduction flow path 37 and the discharge flow path 38. It has been.
  • the numerical aperture of the objective lens is NA
  • the refractive index of the solvent is n
  • the width of the excitation light R at a position a away from the focal point P as shown in FIG. It is expressed by the following equation.
  • the pipette (not shown) force of the dispenser A small amount of the sample liquid is dropped into the inlet 35 and the suction pump (not shown) connected to the outlet 36
  • the minute amount of the sample liquid reaches the detection area 34 through the introduction channel 37.
  • the excitation light R is focused on the detection area 34 and the fluorescence is detected.
  • the trace amount of the sample in the detection area 34 is discharged to the outside of the flow cell 10 through the discharge channel 38 and the discharge port 36.
  • the size of the detection volume of the trace sample solution is preferably 0.2 / ⁇ to 20 ⁇ .
  • the detection area 34 is enlarged with respect to the flow paths 37 and 38 of the trace amount of sample liquid, in other words, the flow paths 37 and 38 except the detection area 34 are , A small amount of sample liquid is used without waste. For this reason, the minute sample liquid is efficiently provided for detection.
  • the detection area 34 is enlarged with respect to the flow paths 37 and 38 as described above, compared to the case where the detection area 34 and the flow paths 37 and 38 are made to be substantially the same ultrafine,
  • the effect of the inner wall (bottom wall 34d, peripheral wall 34e, and upper wall 34f) of the detection area 34 on Brownian motion and the effects of scattered light and reflected light by the inner wall are reduced, and the excitation light R is prevented from entering the optical path. Since the peripheral wall 34e of the detection area 34 is formed, scattering of the excitation light R and unexpected refraction are prevented. For this reason, the detection accuracy of FCS has been improved.
  • the numerical aperture NA of the objective lens 5 is high as described above, and the focal length of the excitation light R is short.
  • the lower plate 32 which is the flat plate on the excitation light incident side, is thinner than the other flat plates 31 and 33. Thereby, the focal point P of the excitation light R is appropriately formed in the detection area 34, and the detection accuracy is improved.
  • the working distance of the objective lens may be shortened on the premise of measuring the fluorescence in a minute area.
  • the thin configuration described above is also effective in terms of the working distance of such a lens.
  • the introduction flow channel 37 and the discharge flow channel 38 are located on both sides of the detection region 34 with the optical axis of the excitation light R interposed therebetween and are separated along the optical axis direction (z direction). As a result, the introduction / discharge of the small amount of sample liquid into / from the detection area 34 is smoothly performed.
  • the inlet 35 and the outlet 36 are provided on the opposite side (upper side in FIG. 1) of the force cell main body 30 from the excitation light incident side.
  • the objective lens may need to be close to the flow cell.
  • the inlet 35 and the outlet 36 are provided on the side opposite to the excitation light incident side. According to the configuration, fluorescence correlation spectrometry using the flow cell 10 can be suitably performed.
  • the guide light of the excitation light to the small amount of sample liquid in the flow cell 10 and the light guide of the fluorescence emission from the small amount of sample liquid to the detection unit are provided on one side of the flow cell 10.
  • the inlet 35 and the outlet 36 are provided on the side opposite to the excitation light incidence side, so that the fluorescence emission detection side can be used together with the excitation light incidence side. Similar effects can be obtained.
  • the cell body 30 is formed by laminating three flat plates 3 :! to 33, and the intermediate plate 33 is provided with a through hole 34a penetrating the intermediate plate 33 in the laminating direction.
  • the lower surface of the intermediate plate 33 is provided with a lower groove 37a connected to the lower end of the detection region 34 to form an introduction flow channel 37, and the lower surface of the intermediate plate 33 is formed.
  • the upper surface is provided with an upper groove 38a connected to the upper end side of the detection area 34 to form the discharge channel 38, so that the manufacturing cost is greatly reduced.
  • the introduction flow path 37 and the discharge flow path 38 communicating with the detection area 34 are provided on the upper surface of the lower plate 32 and the lower surface of the upper plate 31, which are not provided by the intermediate plate 3, so as not to obstruct the optical path. It is also possible to provide each. In the configuration in which the lower plate 32 on the excitation light incident side is made thinner as described above, it is preferable that the introduction channel 37 be formed in the intermediate plate 33 as in the above-described groove 37a.
  • an introduction channel 37 is provided between the intermediate plate 33 and the lower plate 32 on the excitation light incident side
  • a discharge channel 38 is provided between the intermediate plate 33 and the excitation plate. It is preferable to provide between the upper plate 31 on the side opposite to the light incident side. In the configuration shown in FIG. 2, it is preferable to make the lower plate 32 of the excitation light incident side thin, but in this case, by arranging the introduction flow channel 37 and the discharge flow channel 38 as described above, the Since the discharge channel 38 to which the suction pressure is directly applied is on the opposite side of the thin lower plate 32, the strength of the cell body 30 against the suction pressure is improved.
  • FIG. 1 is provided between the intermediate plate 33 and the lower plate 32 on the excitation light incident side
  • a discharge channel 38 is provided between the intermediate plate 33 and the excitation plate. It is preferable to provide between the upper plate 31 on the side opposite to the light incident side. In the configuration shown in FIG. 2, it is preferable to make the lower plate 32 of the excitation light incident side thin, but in this case, by
  • a groove 37a of the introduction flow path 37 is provided on the lower surface which is the end face of the intermediate plate 33 on the excitation light incidence side, and the end face of the intermediate plate 33 on the opposite side to the excitation light incidence side is provided.
  • the above arrangement is realized by providing the groove 38a of the discharge channel 38 on the upper surface.
  • a quadrangular prism space-shaped detection region 50 can be employed instead of the detection region 34, as shown in Fig. 9, a quadrangular prism space-shaped detection region 50 can be employed.
  • the flow tube through which the solution flows is disclosed in International Publication WO02 / 103323 pamphlet (see Japanese Patent Application Publication No. 2004-530894).
  • this microfluidic system is applied to an absorbance detection method and the like, and is different from the flow cell according to the present invention employed in the fluorescence correlation spectrometry.
  • FIG. 10 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a second embodiment of the present invention
  • FIG. 11 is a top view showing a detection region and a flow path in FIG. 10 without an upper plate. It is.
  • the difference between the flow cell 11 of the second embodiment and the flow cell 10 of the first embodiment is that, instead of the detection area 34, a predetermined connection portion 51G for the introduction flow path 37 is provided in a cylindrical space surrounded by a peripheral wall 51e. This is the point that the detection area 51 composed of
  • the detection region 51 has a connection portion 51G force with respect to the introduction flow channel 37, has a substantially semicircular shape in plan view, and is directed to the optical axis side at a position opposite to the excitation light incident side.
  • the structure has an inclined surface 51g that expands upward (toward the right side in the figure) and is opposite to the excitation light incident side.
  • the detection area 51 can be moved in the flow direction (not shown) without obstructing the optical path of the excitation light R by the inclined surface 51g. (Horizontal direction) and the small amount of sample liquid is smoothly introduced into the detection region 51.
  • a rectangular shape in a plan view is formed on the side of the introduction flow path 37 in the form of a square prism surrounded by the peripheral wall 52e, and is opposite to the excitation light incidence side. It is also possible to employ a detection area 52 provided with a connecting portion 52G having an inclined surface 52g that expands upward as it moves toward the optical axis at the side position.
  • FIG. 13 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a third embodiment of the present invention
  • FIG. 14 is a top view showing a detection region and a flow path in FIG. 13 without an upper plate. It is.
  • the difference between the flow cell 12 of the third embodiment and the flow cell 10 of the first embodiment is that, instead of the detection region 34, a predetermined connection portion 53G for the discharge flow path 38 is provided in a cylindrical space surrounded by a peripheral wall 53e. This is the point that the detection area 53 composed of
  • connection portion 53G to the discharge flow path 38 has a substantially semicircular shape in plan view, and moves toward the optical axis toward the excitation light incident side (left side in the figure). (Toward), an inclined surface 53g that expands to the lower side which is the excitation light incident side. According to the flow cell 12 having such a detection region 53, in addition to the effect of the first embodiment, the inclined surface 53 g allows the trace amount of the sample to be discharged from the detection region 53 smoothly.
  • a substantially semicircular shape in a plan view is formed on the cylindrical space-shaped discharge flow path 38 surrounded by the peripheral wall 54e, and the excitation light incident side is formed.
  • a rectangular prism-shaped discharge channel 38 surrounded by a peripheral wall 55e and having a rectangular shape in a plan view is provided at a position on the excitation light incident side. It is also possible to employ a detection area 55 provided with a connecting portion 55G having an inclined surface 55g that expands downward according to the directional force on the optical axis side.
  • FIG. 17 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a fourth embodiment of the present invention.
  • the difference between the flow cell 13 of the fourth embodiment and the flow cell 12 of the third embodiment is that, instead of the detection region 53, the flow cell 13 is connected to the discharge channel 38 having a cylindrical or quadrangular prism space shape surrounded by a peripheral wall 56e.
  • the part 53G is different from the part 53G in that a detection area 56 having a connection part 56G having a different shape is used.
  • connection portion 56G to the discharge flow path 38 has a substantially semicircular shape in plan view or a rectangular shape in plan view, and is located on the excitation light incident side and on the optical axis side. It is configured to have an inclined surface 56g that expands to the lower side, which is the excitation light incident side, as it goes (towards the left side in the figure), and the inclined surface 56g is configured to be inclined from substantially the center of the peripheral wall 56e in the optical axis direction. I have.
  • the flow cell 13 having such a detection region 56 also has substantially the same operation and effect as the third embodiment.
  • FIG. 18 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a fifth embodiment of the present invention.
  • the flow cell 14 according to the fifth embodiment is different from the flow cell 13 according to the fourth embodiment in that a step portion 57g is provided instead of the detection region 56 including a connection portion 56G having an inclined surface 56g. This is the point that the detection area 57 including the connecting portion 57G is adopted.
  • the detection area 57 is located on the excitation light incident side as the connecting portion 57G to the discharge channel 38 moves toward the optical axis side (left side in the figure). It is configured to have a step portion 57g that expands to the side.
  • the flow cell 14 having such a detection region 57, if there is a bubble in the trace amount of the sample liquid due to the effect of the fourth embodiment, the bubble smoothly escapes to the step portion 57 g. Therefore, the detection accuracy is further improved.
  • FIG. 19 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a sixth embodiment of the present invention
  • FIG. 20 is a top view showing a detection area and a flow path in FIG. 19 without an upper plate. It is.
  • a substantially semicircular shape in a plan view is formed on the side of the introduction flow path 37 with respect to the cylindrical space shape forming the detection region, and the side opposite to the excitation light incidence side.
  • a connection 58G having an inclined surface 58g that expands upward according to the directional force on the optical axis side (right side in the figure) is attached to the position, and the discharge channel 38 side has a substantially semicircular shape in plan view and is excited.
  • a connection portion 58H having an inclined surface 58h expanding downward toward the optical axis side (left side in the figure) is attached. The inclination angles of these inclined surfaces 58g and 58h are the same.
  • connection area 58G reduces the detection area 58 in the flow direction (left and right directions in the drawing) without obstructing the optical path of the excitation light R, and smoothly introduces a small amount of the sample liquid into the detection area 58.
  • the connection 58H facilitates the discharge of the detection area 58 force of the trace sample liquid.
  • the cylindrical space shape is a square prism space shape, and the rectangular shape in plan view is provided on the side of the introduction flow channel 37 with respect to the square pillar space shape.
  • a connecting portion 59G having an inclined surface 59g that expands upward toward the optical axis (right side in the figure) is provided at a position opposite to the excitation light incident side, and a rectangular shape in a plan view is formed on the discharge flow channel 38 side.
  • a detection area 59 that has a connection 59H that has a shape and has an inclined surface 59h that expands downward according to the directional force on the optical axis side (left side in the figure) at the position where the excitation light enters. Noh.
  • FIG. 22 is a longitudinal sectional view showing a main part of a flow cell according to a seventh embodiment of the present invention.
  • the optical axis side (the right side in the figure) is positioned on the side of the introduction flow path 37 opposite to the excitation light incidence side with respect to the space shape constituting the detection region.
  • a connecting portion 60G having an inclined surface 60g that expands upward in accordance with the directional force is additionally provided, and at the discharge flow channel 38 side, the position toward the excitation light incident side and toward the optical axis side (left side in the figure).
  • a connecting portion 60H having a sloping surface 60h extending downward is provided, and the inclination angle ⁇ 2 between the vertical surface of the sloping surface 60h and the perpendicular to the inclined surface 60g is larger than the inclination angle ⁇ 1 of the sloping surface 60g.
  • FIG. 23 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to the eighth embodiment of the present invention.
  • the flow cell 17 of the eighth embodiment is different from the flow cell 10 of the first embodiment in that an introduction flow path 37A is provided above the intermediate plate 33 and a discharge flow path 38A is provided below the intermediate plate 33. It is a point.
  • connection of the detection area 34 to the introduction flow path 37A is located at the position on the excitation light incident side. As it goes toward the axial side (the right side in the figure), it is configured to have an inclined surface that expands to the lower side, which is the excitation light incident side. Thus, the introduction of the trace amount of the sample liquid into the detection region 34 is smoothly performed.
  • connection of the detection area 34 to the 38A is located at a position opposite to the excitation light incidence side, and an inclined surface or an upwardly expanding inclined surface that is opposite to the excitation light incidence side toward the optical axis side (left side in the figure). It is configured to have a step surface. Accordingly, the detection region 34 is reduced in the flow direction (left and right directions in the drawing) without obstructing the optical path of the excitation light R, and the trace sample liquid is smoothly discharged from the detection region 34. In particular, in the case of a stepped portion, air bubbles in a trace amount of the sump nore solution may cause the stepped portion. And the detection accuracy is further improved.
  • the connecting portion of the detection area 34 to the introduction flow channel 37A is required.
  • an inclined surface is formed which expands to the lower side which is the pumping light incident side toward the optical axis side (right side in the figure).
  • the connection portion has a configuration in which a slope is provided at a position opposite to the excitation light incident side, and the inclined surface expands upward, which is opposite to the excitation light incidence side, toward the optical axis (left side in the figure). .
  • the detection area 34 is reduced in the flow path direction (left and right directions in the drawing) without obstructing the optical path of the excitation light R, and the trace amount of the sample is discharged from the detection area 34 smoothly.
  • bubbles in the trace amount of the sump-no-re liquid smoothly escape to the connection portion on the discharge flow path 38A side, and the detection accuracy is further improved.
  • FIG. 24 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a ninth embodiment of the present invention.
  • the difference between the flow cell 18 of the ninth embodiment and the flow cell 17 of the eighth embodiment is that the lower plate 32 is provided with a through hole communicating with the discharge flow path 38A, and the opening on the lower surface thereof is formed as a discharge port 36A. It is.
  • the diffusion constant D is expressed by the following equation as an Einstein-Stokes equation using its radius r.
  • k is Boltzmann's constant
  • T is the absolute temperature
  • r? Is the viscosity of the solvent (water).
  • a temperature control element is provided.
  • FIG. 25 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to the tenth embodiment of the present invention. This second
  • the flow cells of the first to seventh embodiments are used.
  • an introduction flow path 37 is provided on the lower plate 32 side (the lower surface of the intermediate plate 33 or the upper surface of the lower plate 32) which is the flat plate side on the excitation light incident side. I have.
  • the flow cell 19 of the tenth embodiment is different from the flow cell 1 of the first to seventh embodiments.
  • the points different from 0 to 16 correspond to the introduction flow path 37 on the lower surface of the lower plate 32, which is a flat plate on the excitation light incident side, and are located at positions not entering the optical path of the excitation light, for example, a temperature control element such as a heater or a Peltier. That is, 80 is provided.
  • the temperature control of the introduction channel 37 by the temperature control element 80 through the thin lower plate 32 is facilitated, and a small amount of the sample liquid is quickly brought to a predetermined temperature to increase the detection accuracy. 'The effect is added.
  • FIG. 26 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to an eleventh embodiment of the present invention. This second
  • the difference between the flow cell 20 of the eleventh embodiment and the flow cells 10 to 19 of the first to tenth embodiments is that the detection areas 34, 50 to 50 on the upper surface of the upper plate 31, which is the flat plate on the side opposite to the excitation light incident side.
  • the point that a filter 85 that transmits the excitation light R and reflects the fluorescence is provided at a position corresponding to 60.
  • the finoletor 85 is composed of, for example, a dichroic mirror, and is fixed to the upper plate 31 by, for example, vapor deposition.
  • the noise component due to the reflection of the excitation light R is reduced by the finoletor 85, and the fluorescence is returned to the detection regions 34, 50 to 60 to be efficiently detected, and the detection accuracy is improved. It has the effect of being enhanced.
  • the cell main body 30 is particularly preferably formed by stacking three flat plates 31 to 33.
  • the cell main body is formed of two flat plates. It is configured.
  • FIG. 27 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a twelfth embodiment of the present invention
  • FIG. 28 is a top view of the flow cell shown in FIG.
  • the cell body 90 is formed by laminating two flat plates 91 and 92, and the lower plate 92 on the excitation light incident side is thinner than the upper plate 91. .
  • the detection area 61 which is formed by enlarging the introduction flow path 37B and the discharge flow path 38B of the trace amount of the sample liquid, the introduction flow path 37B and the discharge flow path 38B, and in which the excitation light R is focused, is provided by the upper plate 91. Each is provided by recessing the lower surface.
  • the introduction flow path 37B and the discharge flow path 38B can be provided on the upper surface of the lower plate 92.
  • the detection area 61 and its connection part are the same as those in the above embodiments. Of course, it may be configured as follows.
  • FIG. 29 is a longitudinal sectional view showing a flow cell according to a thirteenth embodiment of the present invention.
  • the thirteenth embodiment shows a modification of the flow cell 10 of the first embodiment shown in FIG.
  • the flow cell 10B shown in FIG. 29 includes a cell body 30 formed by stacking an upper plate 31, a lower plate 32, and an intermediate plate 33. Further, inside the cell body 30, a detection region 34 having a cylindrical space shape, an introduction flow path 37 connecting an inlet 35B for introducing a small amount of sample liquid into the cell body 30 and the detection region 34, and a small amount of sample An outlet 36B for discharging the liquid out of the cell body 30 and a discharge channel 38 connecting the detection area 34 are provided.
  • the upper plate 31 is provided with a through hole 37e having an inlet 35B at one end in the longitudinal direction and penetrating vertically, and at the other end in the longitudinal direction, A through hole 38e having a discharge port 36B and penetrating vertically is provided.
  • the intermediate plate 33 is provided with a through hole 37d vertically penetrating therethrough at a position coaxial with the through hole 37e of the upper plate 31, and further, on the lower surface thereof, the through hole of the detection area 34 and the lower surface of the through hole 37d.
  • a groove is provided on the upper side of the detection area 34 and extends to a position corresponding to the through hole 38e of the upper plate 31. There is a groove to be the discharge channel 38
  • the diameter DA of the inlet 35B and the diameter DB of the outlet 36B are substantially equal.
  • the diameter DC of the through hole 37d of the intermediate plate 33 that connects the introduction flow channel 37 on the lower surface side of the intermediate plate 33 and the through hole 37e of the upper plate 31 is the diameter of the inlet 35B and the diameter of the outlet 36B. It is set to be larger than (DC> DA DB).
  • the groove formed on the upper surface side of the intermediate plate 33 and serving as the discharge channel 38 has a groove portion 38d extending slightly beyond a position corresponding to the through hole 38e of the upper plate 31.
  • the positioning of the through holes 37d and 37e at the time of manufacturing becomes easy.
  • the groove that becomes the discharge channel 38 on the upper surface side of the intermediate plate 33 has a length that extends slightly beyond the position corresponding to the through hole 38e of the upper plate 31, so that the position of the through hole 38e during manufacturing can be improved. Alignment is easy.
  • the diameter DA of the inlet 35B and the diameter DB of the outlet 36B are set to be substantially equal. Such a configuration may be adopted when the same coupling member is used for the inlet 35B and the outlet 36B.
  • the present invention has been specifically described based on the embodiment, the present invention is not limited to the above embodiment.
  • the inlet 35 is provided on the upper surfaces of the cell bodies 30 and 90 in order to efficiently and efficiently drop a small amount of sample liquid onto the cell bodies 30 and 90. Even if it is provided on the side surface or lower surface of 90, the position of the discharge port 36 is not limited.
  • the formation of the introduction flow path 37 and the discharge flow path 38 is not limited to the configuration in which only the intermediate plate 33 or only the upper plate 31 and the lower plate 32 are formed. The other may be formed on another plate.
  • the cell bodies 30, 90 may be formed by stacking three or two flat plates, and by stacking four or more flat plates. is there.
  • the shapes of the detection regions 34 and 50 to 61 have a circular cross section or a square cross section as being particularly preferable, but are not limited to these shapes. .
  • the flow cell according to the present invention is employed in a fluorescence correlation spectroscopy method for detecting fluorescence by focusing excitation light on a small amount of sample liquid, and includes a cell body constituted by stacking a plurality of flat plates, In the cell body, the detection area where the focus of the excitation light is set, the introduction flow path for introducing the small amount of sample liquid introduced from the inlet into the detection area, and the small amount of sample liquid discharged from the detection area to the outlet It is preferable that a discharge channel and a discharge channel are provided, and that the detection region be formed by enlarging the channel, and that a peripheral wall surrounding the optical axis of the excitation light not enter the optical path of the excitation light.
  • the introduction flow path and the discharge flow path are located on both sides of the optical axis of the excitation light with respect to the detection area and are spaced apart along the optical axis direction. Introduces a small amount of sample liquid into the detection area, and facilitates Z discharge.
  • the flow path is connected to the peripheral wall so as to be flush with the end face of the detection area on the excitation light incident side, and the connection portion of the detection area to the flow path is on the opposite side to the excitation light incidence side. If the position has an inclined surface that expands to the opposite side from the excitation light incident side as it moves toward the optical axis, the inclined surface allows the detection area to move in the flow direction without obstructing the optical path of the excitation light. In addition to this, the introduction / discharge of a small amount of sample liquid into / from the detection area is smoothly performed.
  • the discharge flow path is connected to the peripheral wall of the detection area on the side opposite to the excitation light incident side, and the connection portion of the detection area to the discharge flow path is provided at the position on the excitation light incident side and on the optical axis side.
  • the inclined surface that expands toward the excitation light incident side as it goes, the inclined surface facilitates the discharge of a small amount of the sample from the detection region.
  • the discharge flow path is connected to the peripheral wall of the detection area on the side opposite to the excitation light incident side, and the connection portion of the detection area to the discharge flow path is provided at the position on the excitation light incident side and on the optical axis side. If the sample liquid has bubbles in the sample liquid, the bubbles smoothly escape to the steps, and the detection accuracy is improved.
  • the flat plate on the excitation light incident side is preferably thinner than the other flat plates. Therefore, the focus of the excitation light is appropriately formed in the detection area, and the detection accuracy is improved.
  • an introduction flow path is provided on the flat plate side on the excitation light incident side
  • the temperature control element is provided on the flat plate on the excitation light incidence side at a position corresponding to the introduction flow path on the end face on the excitation light incident side.
  • the temperature control element through the thin flat plate facilitates temperature control of the introduction channel, and the trace sample liquid is quickly brought to a predetermined temperature to improve detection accuracy.
  • the cell body is formed by stacking three flat plates, and the intermediate plate is sandwiched between the flat plates on both sides in the stacking direction. It is preferable that a through-hole penetrating through is provided as a detection area.
  • one end of the intermediate plate is provided with a groove on one side connected to one side of the detection area to serve as an introduction flow path, and the end face of the intermediate plate on the other side is provided with a detection groove. It is preferable that a groove on the other side provided continuously with the other side of the region is provided to serve as a discharge channel.
  • the configuration for efficiently introducing a small amount of sample liquid into the cell body without waste is as follows. More specifically, the flat plate on the side opposite to the excitation light incident side is further provided with an introduction flow passage penetrating the flat plate in the laminating direction and communicating with the introduction flow passage. A small amount of the sample is placed with the introduction port facing upward.
  • a filter that transmits the excitation light and reflects the fluorescence is provided at a position corresponding to the detection area on the end surface opposite to the excitation light incident side.
  • the filter reduces the noise component due to the reflection of the excitation light, and returns the fluorescence to the detection area to be efficiently detected, thereby improving the detection accuracy.
  • the introduction flow path is provided between the intermediate plate and the flat plate on the excitation light incidence side among the flat plates on both sides of the intermediate plate, and the discharge flow path is provided. It is preferably provided between the intermediate plate and a flat plate on the opposite side of the excitation light incident side among the flat plates on both sides of the intermediate plate.
  • a groove serving as an introduction flow path is provided on the end face of the intermediate plate on the excitation light incidence side, and a groove serving as a discharge flow path is provided on the end face of the intermediate plate opposite to the excitation light incidence side.
  • the inlet and the outlet are preferably provided on the side opposite to the excitation light input side with respect to the cell body.
  • a fluorescence correlation spectrometer using the above-mentioned flow cell and including an excitation light source, a focusing optical system, a detection unit, and an analysis unit.
  • the present invention is employed in fluorescence correlation spectrometry, and provides a flow cell that efficiently detects a small amount of sample solution and improves the detection accuracy of the fluorescence correlation spectrometry, and a fluorescence correlation spectrometer using the same.

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Abstract

　微量サンプル液に対する励起光Ｒの焦点Ｐが設定される検出領域３４を、微量サンプル液の流路３７，３８に対して拡大し、サンプル液を無駄無く用いる。また、これにより、検出領域３４の内壁によるブラウン運動への影響を低減する。また、励起光Ｒの光路に入らないように検出領域３４の周壁３４ｅを構成し、励起光Ｒの散乱、予期せぬ屈折を防止する。また、同一では無い微量サンプル液の検出の度に、導入口及び排出口を通して流路３７，３８及び検出領域３４を洗浄することで、スループットを向上する。これにより、微量サンプル液を効率良く検出に供すると共に蛍光相関分光測定法の検出精度を向上するフローセル、及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置が実現される。

Description

明 細 書
フローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置
技術分野
[0001] 本発明は、フローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置に関する。
背景技術
[0002] 微量分子検出法の一つである蛍光相関分光測定法には、蛍光相関分光法（Fluor escence Correlation Spectroscopy :以降単に FCSと記す）や蛍光相互相関分光法（F luorescence Cross Correlation Spectroscopy：以降単に FCC と 己 "リカ sめり、 Fし S を用いた装置として、測定対象となる溶液をキヤビラリーフロー管に流し、このキヤビラ リーフロー管を流れるサンプル液に励起光を合焦して極微少（ピンポイント)観察領域 を設定し、蛍光分子の蛍光発光を検出することで、極微少観察領域内をブラウン運 動している分子情報を得るものが知られている（例えば、特許文献 1参照）。
特許文献 1 :特許第 3517241号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] ここで、測定対象となる溶液が例えば貴重で量の少なレ、微量サンプノレ液の場合に あっては、微量サンプル液を無駄にしないように、上記キヤビラリーフロー管を極細に する必要があるが、このように極細とすると、励起光の焦点が管内壁に接近すること 力 管内壁の影響を受けてブラウン運動が束縛されたり、管内壁による散乱光や反 射光の影響によって、検出精度が低下してしまう。特に、励起光の光路に管壁の縁 部 (角部）が入ってしまうと、励起光が散乱、予期せぬ屈折を生じ、検出精度が一層 低下してしまう。
[0004] 本発明は、このような課題を解決するために成されたものであり、蛍光相関分光測 定法に採用され、微量サンプル液を効率良く検出に供すると共に蛍光相関分光測 定法の検出精度を向上するフローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0005] 本発明によるフローセルは、微量サンプノレ液に励起光を合焦し蛍光発光を検出す る蛍光相関分光測定法に採用され、複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を 具備し、セル本体内には、励起光の焦点が設定される検出領域と、導入口から導入 される微量サンプル液を検出領域に導入する導入流路及び検出領域から微量サン プノレ液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、検出領域は、流路を拡大して 成ると共に、励起光の光軸を囲繞する周壁が、励起光の光路に入らない構成とされ ていることを特徴としている。
[0006] このようなフローセルによれば、微量サンプル液に対する励起光の焦点が設定され る検出領域が、微量サンプノレ液の流路に対して拡大されるため、換言すれば、検出 領域を除く流路が当該検出領域に対して縮小されるため、微量サンプル液が無駄無 く用いられる。また、このように検出領域が流路に対して拡大されるため、検出領域と 流路とを略同一の極細とする場合に比して、検出領域の内壁によるブラウン運動へ の影響や管内壁による散乱光や反射光の影響が低減される。また、励起光の光路に 入らないように、検出領域の周壁が構成されているため、励起光の散乱、予期せぬ 屈折が防止される。また、同一では無い微量サンプノレ液の検出の度に、導入口及び 排出口を通して流路及び検出領域を洗浄すれば、複数のサンプノレを収容した例え ばマルチシートを用いシート替えごとに光軸調整等を行い検出してレ、く場合に比して 、スループット（単位時間当りの処理数）が向上される。
[0007] また、本発明によれば、上記フローセルを用い、励起光源、焦点光学系、検出部、 分析部を備えた蛍光相関分光測定装置を提供できる。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、微量サンプル液が無駄無く用いられて効率良く検出に供され、 且つ、分子のブラウン運動への影響及び管内壁による散乱光や反射光の影響が低 減されると共に励起光の散乱、予期せぬ屈折が低減されて蛍光相関分光測定法の 検出精度が向上され、且つ、スループットが向上されて検出コストが低減されるフロ 一セル、及び、これを用いた蛍光相関分光測定装置を提供することが可能となる。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]図 1は、本発明の第 1実施形態に係るフローセルを備えた FCS装置を示す概略 構成図である。
園 2]図 2は、図 1中のフローセルを示す縦断面図である。
[図 3]図 3は、図 2に示すフローセルの上面図である。
[図 4]図 4は、図 3の IV—IV矢視図である。
[図 5]図 5は、図 2に示すフローセルの検出領域及び流路の拡大図である。
園 6]図 6は、図 5に示すフローセルの検出領域に励起光を合焦した状態説明図であ る。
[図 7]図 7は、図 2中の上板を示す上面図である。
[図 8]図 8は、図 2中の中間板を示す上面図である。
園 9]図 9は、図 3中の検出領域の他の例を示す図であり上板を除いた状態で示す上 面図である。
[図 10]図 10は、本発明の第 2実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図で ある。
[図 11]図 11は、図 10中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図で ある。
[図 12]図 12は、図 11中の検出領域の他の例を示す図である。
園 13]図 13は、本発明の第 3実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図で ある。
[図 14]図 14は、図 13中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図で ある。
[図 15]図 15は、図 14中の検出領域の他の例を示す図である。
[図 16]図 16は、図 14中の検出領域のさらに他の例を示す図である。
園 17]図 17は、本発明の第 4実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図で ある。
[図 18]図 18は、本発明の第 5実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図で ある。
園 19]図 19は、本発明の第 6実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図で ある。 [図 20]図 20は、図 19中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図で ある。
[図 21]図 21は、図 20中の検出領域の他の例を示す図である。
[図 22]図 22は、本発明の第 7実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図で ある。
[図 23]図 23は、本発明の第 8実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
[図 24]図 24は、本発明の第 9実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
[図 25]図 25は、本発明の第 10実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
[図 26]図 26は、本発明の第 11実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
[図 27]図 27は、本発明の第 12実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
[図 28]図 28は、図 27に示すフローセルの上面図である。
[図 29]図 29は、本発明の第 13実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。 符号の説明
[0010] l 'FCS装置、 10〜21 · · ·フローセノレ、 30, 90· · ·セノレ本体、 31, 91 · · ·上板、 32, 9 2…下板、 33…中間板、 34, 50〜61 · · ·検出領域、 34a…中間板の貫通孔、 34e, 5 le〜57e…検出領域の光軸を囲繞する周壁、 35…導入口、 36， 36A…排出口、 3 7, 37A, 37B…導入流路、 37a…中間板の一方側の溝、 38, 38A, 38B…排出流 路、 38a…中間板の他方側の溝、 51G〜60G, 54H, 58H, 59H, 60H…接続部、 51g〜56g, 58g〜60g, 54h, 58h, 59h, 60h…傾斜面、 57g…段差部、 80…温 度制御素子、 85…フィルタ、 P…焦点、 R…励起光。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明によるフローセルの好適な実施形態について図 1〜図 29を参照しな がら説明する。図 1〜図 9は、本発明の第一実施形態に係るフローセルを、以降の図 10〜図 29は、本発明の第 2〜第 13実施形態に係るフローセルを各々示している。 なお、各図において、同一の要素には同一符号を付し、重複する説明は省略する。 先ず、第 1実施形態について詳説する。図 1は、本発明の第 1実施形態に係るフロー セルを備えた蛍光相関分光測定装置としての FCS装置を示す概略構成図、図 2は、 図 1中のフローセルを示す縦断面図、図 3は、図 2に示すフローセルの上面図、図 4 は、図 3の IV— IV矢視図、図 5は、図 2に示すフローセルの検出領域及び流路の拡 大図、図 6は、図 5に示すフローセルの検出領域に励起光を合焦した状態説明図、 図 7は、図 2中の上板を示す上面図、図 8は、図 2中の中間板を示す上面図、図 9は、 図 3中の検出領域の他の例を示す図であり上板を除いた状態で示す上面図である。
[0012] ここで、本実施形態に用いられる FCS装置は、例えば抗原抗体反応の検出に用い られるものであり、抗原抗体反応によって分子量が大きくなることによりブラウン運動 が遅くなるという性質を利用して、抗原抗体反応の有無を判定するものである。
[0013] 図 1に示すように、 FCS装置 1は、励起光源としてのレーザー 2からの励起光を干渉 フイノレタ 3、ダイクロイツクミラー 4を経由して、焦点光学系である対物レンズ 5によって フローセル 10中の微量サンプル液に導き合焦して極微少（ピンポイント)観察領域を 設定し、微量サンプノレ液中の蛍光分子からの蛍光発光を、対物レンズ 5、フイノレタ 6、 ピンホール 7を通し、当該ピンホール 7で焦点面以外のバックグラウンド光を取り除い てから検出部である光電子増倍管 8へと導き、分析部としてのデジタル相関器 9で解 析する構成とされている。なお、本実施形態の FCS装置 1を、抗原抗体反応の検出 以外に用いることも勿論可能であるし、 FCS装置 1の各構成も適宜変更可能である。 例えば、フローセル 10中の微量サンプル液に励起光を導き合焦する光学系と微量 サンプノレ液中の蛍光分子からの蛍光発光を集光する光学系は別でも良いし、検出 部はアバランシェフオトダイオード等の半導体検出器でも良い。
[0014] この FCS装置 1に用いられるフローセル 10は、図 2〜図 4に示すように、平板を三 枚積層して成るセル本体 30を備えている。図示上側の上板 31、図示下側の下板 32 及びこれらの上板 31、下板 32に挟まれる中間板 33は、例えばガラス板等の透明板 であり、例えば熱圧着等で重ねて固定されている。図 2に示すように、上板 31及び中 間板 33は、同程度の厚さ（例えば 0. 5mm)とされ、下板 32はこれらより薄くされ (例 えば 0. 15mm) ,下板 32が励起光入射側となるように配置される（図 6参照）。
[0015] 図 2〜図 6に示すように、セル本体 30内には、励起光 Rの焦点 P (図 6参照）が設定 される円柱空間形状の検出領域 34と、微量サンプル液をセル本体 30内に導入する ための導入口 35と検出領域 34とを接続する導入流路 37と、微量サンプル液をセル 本体 30外に排出するための排出口 36と検出領域 34とを接続する排出流路 38と、が 設けられている。
[0016] 具体的には、上板 31には、図 7に示すように、長手方向の一方の端側（図示左側） に、導入口 35を有し上下 (積層方向）に貫通する貫通孔 37cが設けられると共に、長 手方向の他方端側（図示右側）に、排出口 36を有し上下に貫通する貫通孔 38cが設 けられている。また、中間板 33には、図 8に示すように、上板 31の貫通孔 37c, 38c の中間に対応する位置に、上下方向に貫通する貫通孔 34aが設けられると共に、上 板 31の貫通孔 37cと同軸位置に、上下に貫通する貫通孔 37bが設けられ、さらに、 その下面に、貫通孔 34a， 37bの下面側に連設される下面側の溝 37aが設けられる と共に、その上面に、貫通孔 34aの上面側に連設され上板 31の貫通孔 38cに対応 する位置迄延びる上面側の溝 38aが設けられている。そして、図 2〜図 4に示すよう に、これらの上板 31、中間板 33及び平板状の下板 32を積層することで、中間板 33 の貫通孔 34aが検出領域 34とされると共に、中間板 33の下面側の溝 37a、貫通孔 3 7b及び上板 31の貫通孔 37cが導入流路 37とされ、さらに、中間板 33の上面側の溝 38a及び上板 31の貫通孔 38cが排出流路 38とされている。
[0017] また、このように構成することで、検出領域 34の底壁 34d、周壁 34e及び上壁 34f により検出領域 34の内壁が構成されている。また、このような構成において、導入流 路 37が、検出領域 34の励起光入射側の端面である底壁 34dと面一を成すように周 壁 34eに接続され、且つ、排出流路 38が、検出領域 34の励起光入射側とは反対側 の端面である上壁 34fと面一を成すように周壁 34eに接続されている。
[0018] ここで、図 4及び図 5に示すように、セル本体 30の長手方向を X方向、これに直交す る水平方向を y方向、上下方向を z方向、検出領域 34の y方向幅を ya、導入流路 37 及び排出流路 38の y方向幅を yb、検出領域 34の z方向幅を za、導入流路 37及び排 出流路 38の z方向幅を zb、検出領域 34の X方向幅を xaとすると、 ya >yb、 za > zb、 xa > zb, ybの関係を満足するように、検出領域 34、導入流路 37及び排出流路 38の 大きさが設定されている。なお、本実施形態では、導入流路 37の導入端部を構成す る上板 31の貫通孔 37c及び中間板 33の貫通孔 37b、排出流路 38の排出端部を構 成する上板 31の貫通孔 38cを除いた部分である中間板 33の溝の大きさを、導入流 路 37、排出流路 38の大きさと定義している。 [0019] このように、本実施形態のフローセル 10にあっては、励起光 Rの焦点 Pが設定され ると共に導入流路 37、排出流路 38を拡大して成る検出領域 34を備える構成とされ ている。
[0020] ところで、対物レンズの開口数を NA、溶媒の屈折率を n、図 6に示すように焦点 Pか ら距離 a離れた位置での励起光 Rの幅を bとすると、幅 bは次式で表される。
[0021] b = 2 · a · tan (sin→ (NA/n) )
[0022] そして、 NA= 1 . 15、 n (水） = 1. 33、 a = 200 x mとすると、 b = 682 x mとなる。
[0023] 従って、本実施形態では、検出領域 34の底壁 34dの幅 > b = 682 μ mとされてい て、検出領域 34の励起光軸を囲繞する周壁 34eが、励起光 Rの光路に入らない構 成とされている。
[0024] このような FCS装置 1によれば、分注器のピペット（不図示）力 微量サンプル液の 液滴が導入口 35に滴下され、排出口 36に接続される吸引ポンプ（不図示）が駆動さ れることで、微量サンプル液は、導入流路 37を通して検出領域 34に至る。そして、当 該微量サンプノレ液がポンプ停止により検出領域 34に停止している間、又は、検出領 域 34を移動している間に、検出領域 34に励起光 Rが合焦して蛍光が検出され、検 出が終了すると、検出領域 34の微量サンプノレ液は、排出流路 38、排出口 36を通し てフローセル 10の外部へ排出される。なお、微量サンプル液の検出ボリュームの大 きさは 0. 2 /ΐ πι〜20 μ ΐηが好ましい。
[0025] この検出にあっては、検出領域 34が微量サンプル液の流路 37, 38に対して拡大 されているため、言い換えれば、検出領域 34を除く流路 37, 38が当該検出領域 34 に対して縮小されているため、微量サンプル液が無駄無く用いられる。このため、微 量サンプル液が効率良く検出に供される。
[0026] また、このように検出領域 34が流路 37, 38に対して拡大されているため、検出領 域 34と流路 37, 38とを略同一の極細とする場合に比して、検出領域 34の内壁 (底 壁 34d、周壁 34e及び上壁 34f)によるブラウン運動への影響及び同内壁による散乱 光や反射光の影響が低減されると共に、励起光 Rの光路に入らないように、検出領 域 34の周壁 34eが構成されているため、励起光 Rの散乱、予期せぬ屈折が防止され ている。このため、 FCSの検出精度が向上されている。 [0027] また、同一では無い微量サンプノレ液の検出の度に、導入口 35及び排出口 36を通 して流路 37, 38及び検出領域 34を洗浄するようにすれば、複数のサンプルを収容 した例えばマルチシートを用いシート替えごとに光軸調整等を行い検出してレ、く場合 に比して、スループット（単位時間当りの処理数）が向上される。このため、検出コスト の低減が可能とされている。
[0028] また、対物レンズ 5の開口数 NAは上述のように高く励起光 Rの焦点距離は短レ、。こ れに対して、上記実施形態では、励起光入射側の平板である下板 32が、他の平板 3 1、 33に比して薄くされている。これにより、検出領域 34に励起光 Rの焦点 Pが適切 に形成され、検出精度が高められている。特に、このフローセル 10は蛍光相関分光 測定法に採用されるものであるため、微小領域の蛍光測定を前提として対物レンズ の作動距離が短くなる場合があるが、励起光入射側の下板 32が薄い上記構成は、こ のようなレンズの作動距離の点に関しても有効である。
[0029] また、導入流路 37及び排出流路 38は各々、検出領域 34に対して、励起光 Rの光 軸を挟んだ両側に位置すると共に光軸方向（z方向）に沿って離間して配設されてい るため、微量サンプル液の検出領域 34に対する導入/排出が円滑に成される。
[0030] また、導入口 35を上側にして微量サンプノレ液が滴下される構成としているため、微 量サンプノレ液が無駄無く効率良くセル本体 30に導入される。また、導入口 35は排出 口 36よりも大きくなつている。このような構成とすることも、微量サンプル液を効率良く セル本体 30に導入する上で、また、排出口 36から微量サンプノレ液を吸引する際に 必要な吸引力を減らしたり、検出領域 34への導入時間を短縮する上でも有効である
[0031] また、本実施形態によるフローセル 10では、その導入口 35及び排出口 36力 セル 本体 30に対して励起光入射側とは反対側（図 1中の上側）に設けられている。蛍光 相関分光測定法に採用されるフローセルでは、対物レンズをフローセルに対して近 接させることが必要な場合がある。このような場合には、セル本体に対して励起光入 射側に導入口及び排出口が設けられていると、フローセルに対して対物レンズを配 置する際の妨げとなり、あるいは、対物レンズが汚染されることが考えられる。これに 対して、上記のように導入口 35及び排出口 36を励起光入射側とは反対側に設ける 構成によれば、フローセル 10を用いた蛍光相関分光測定を好適に行うことができる。 また、図 1に示したように、フローセル 10中の微量サンプル液への励起光の導光と、 微量サンプル液からの蛍光発光の検出部への導光とを、フローセル 10の一方側に 設けられた同一の対物レンズ 5を用いて行う構成では、導入口 35及び排出口 36を 励起光入射側とは反対側に設けることにより、励起光入射側と併せて蛍光発光の検 出側についても同様の効果を得ることができる。
[0032] また、上記実施形態では、セル本体 30が、平板 3：!〜 33を三枚積層して構成され、 中間板 33に、当該中間板 33を積層方向に貫通する貫通孔 34aが設けられて検出 領域 34とされ、当該中間板 33の下面に、検出領域 34の下端側に連設される下側の 溝 37aが設けられて導入流路 37とされると共に、当該中間板 33の上面に、検出領域 34の上端側に連設される上側の溝 38aが設けられて排出流路 38とされる構成のた め、製造コストが大幅に低減されている。因みに、コストは多少上がるが、検出領域 3 4に連通する導入流路 37及び排出流路 38を、中間板 3では無ぐ下板 32の上面、 上板 31の下面に、光路を妨げないように、各々設けることも可能である。なお、上記 したように励起光入射側の下板 32を薄くした構成では、導入流路 37は、上記した溝 37aのように中間板 33に形成することが好ましい。
[0033] また、図 2に示すように、導入流路 37を、中間板 33と、励起光入射側の下板 32との 間に設けるとともに、排出流路 38を、中間板 33と、励起光入射側とは反対側の上板 31との間に設けることが好ましい。図 2に示す構成では、励起光入射側の下板 32を 薄くすることが好ましいが、この場合、導入流路 37及び排出流路 38を上記のように 配置することにより、排出口 36からの吸引圧が直接力かる排出流路 38が、薄い下板 32とは反対側となるので、吸引圧に対するセル本体 30の強度が向上される。なお、 図 2においては、具体的には、中間板 33の励起光入射側の端面である下面に導入 流路 37の溝 37aを設け、中間板 33の励起光入射側とは反対側の端面である上面に 排出流路 38の溝 38aを設けることによって上記した配置構成を実現している。
[0034] なお、検出領域 34に代えて、図 9に示すように、四角柱空間形状の検出領域 50を 採用することも可能である。また、溶液を流すフロー管については、国際公開 WO02 /103323号パンフレット（特表 2004— 530894号公報参照）に開示されたミクロ流 体システムがある。ただし、このミクロ流体システムは吸光度検出法等に適用されるも のであり、蛍光相関分光測定法に採用される本発明によるフローセルとは異なるもの である。
[0035] 図 10は、本発明の第 2実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図、図 11 は、図 10中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。この第 2 実施形態のフローセル 11が第 1実施形態のフローセル 10と違う点は、検出領域 34 に代えて、周壁 51eで囲まれる円柱空間形状に、導入流路 37に対する所定の接続 部 51Gを付設して成る検出領域 51を採用した点である。
[0036] 具体的には、検出領域 51は、導入流路 37に対する接続部 51G力 平面視略半円 形形状を成し、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側に向かう（図示右側に向 かう）に従い励起光入射側とは反対側である上側に拡大する傾斜面 51gを有する構 成とされている。
[0037] このような検出領域 51を有するフローセル 11によれば、第 1実施形態の効果にカロ えて、傾斜面 51gにより、励起光 Rの光路を妨げること無く検出領域 51が流路方向（ 図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域 51に対する導入 が円滑に成される。
[0038] なお、検出領域 51に代えて、図 12に示すように、周壁 52eで囲まれる四角柱空間 形状の導入流路 37側に、平面視長方形形状を成し励起光入射側とは反対側の位 置に光軸側に向力うに従い上側に拡大する傾斜面 52gを有する接続部 52Gを付設 した検出領域 52を採用することも可能である。
[0039] 図 13は、本発明の第 3実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図、図 14 は、図 13中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。この第 3 実施形態のフローセル 12が第 1実施形態のフローセル 10と違う点は、検出領域 34 に代えて、周壁 53eで囲まれる円柱空間形状に、排出流路 38に対する所定の接続 部 53Gを付設して成る検出領域 53を採用した点である。
[0040] 具体的には、検出領域 53は、排出流路 38に対する接続部 53Gが、平面視略半円 形形状を成し、励起光入射側の位置に、光軸側に向かう（図示左側に向かう）に従い 励起光入射側である下側に拡大する傾斜面 53gを有する構成とされている。 [0041] このような検出領域 53を有するフローセル 12によれば、第 1実施形態の効果にカロ えて、傾斜面 53gにより、微量サンプノレ液の検出領域 53からの排出が円滑に成され る。
[0042] なお、検出領域 53に代えて、図 15に示すように、周壁 54eで囲まれる円柱空間形 状の排出流路 38側に、平面視略半円形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側 に向力 に従い下側に拡大する傾斜面 54gを有する接続部 54Gと、この接続部 54G の上側でさらに排出流路 38側に、平面視略半円形形状を成し励起光入射側の位置 に光軸側に向力 に従い下側に異なる傾斜角で拡大する傾斜面 54hを有する接続 部 54Hと、を付設して成る検出領域 54を採用することも可能である。
[0043] また、検出領域 53に代えて、図 16に示すように、周壁 55eで囲まれる四角柱空間 形状の排出流路 38側に、平面視長方形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側 に向力 に従い下側に拡大する傾斜面 55gを有する接続部 55Gを付設した検出領 域 55を採用することも可能である。
[0044] 図 17は、本発明の第 4実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
この第 4実施形態のフローセル 13が第 3実施形態のフローセル 12と違う点は、検出 領域 53に代えて、周壁 56eで囲まれる円柱空間形状又は四角柱空間形状の排出流 路 38側に、接続部 53Gとは形状が異なる接続部 56Gを有する検出領域 56を採用し た点である。
[0045] 具体的には、検出領域 56は、排出流路 38に対する接続部 56Gが、平面視略半円 形状又は平面視長方形形状を成し、励起光入射側の位置に、光軸側に向かう（図示 左側に向かう）に従い励起光入射側である下側に拡大する傾斜面 56gを有する構成 とされ、当該傾斜面 56gが、周壁 56eの光軸方向の略中央から傾斜する構成とされ ている。
[0046] このような検出領域 56を有するフローセル 13にあっても、第 3実施形態と略同様な 作用'効果を奏する。
[0047] 図 18は、本発明の第 5実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
この第 5実施形態のフローセル 14が第 4実施形態のフローセル 13と違う点は、傾斜 面 56gを有する接続部 56Gを備えて成る検出領域 56に代えて、段差部 57gを有す る接続部 57Gを備えて成る検出領域 57を採用した点である。
[0048] 具体的には、検出領域 57は、排出流路 38に対する接続部 57Gが、励起光入射側 の位置に、光軸側（図示左側）に向力うに従い励起光入射側である下側に拡大する 段差部 57gを有する構成とされてレ、る。
[0049] このような検出領域 57を有するフローセル 14によれば、第 4実施形態の効果にカロ えて、微量サンプノレ液中に気泡がある場合には当該気泡が段差部 57gに円滑に逃 げるため、検出精度が一層高められる。
[0050] 図 19は、本発明の第 6実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図、図 20 は、図 19中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。この第 6 実施形態のフローセル 15にあっては、検出領域を構成する円柱空間形状に対して、 その導入流路 37側に、平面視略半円形状を成し励起光入射側とは反対側の位置に 光軸側（図示右側）に向力 に従い上側に拡大する傾斜面 58gを有する接続部 58G が付設されると共に、その排出流路 38側に、平面視略半円形状を成し励起光入射 側の位置に光軸側（図示左側）に向かうに従い下側に拡大する傾斜面 58hを有する 接続部 58Hが付設されている。そして、これらの傾斜面 58g, 58hの傾斜角は同じと されている。
[0051] このような検出領域 58を有するフローセル 15によれば、概念的には第 2実施形態 と第 3実施形態を組み合わせたものであるから、第 2実施形態及び第 3実施形態の効 果、すなわち、接続部 58Gにより、励起光 Rの光路を妨げること無く検出領域 58が流 路方向（図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域 58に対 する導入が円滑に成され、且つ、接続部 58Hにより、微量サンプル液の検出領域 58 力 の排出が円滑に成される。
[0052] なお、検出領域 58に代えて、図 21に示すように、円柱空間形状を四角柱空間形状 とし当該四角柱空間形状に対して、その導入流路 37側に、平面視長方形形状を成 し励起光入射側とは反対側の位置に光軸側（図示右側）に向かうに従い上側に拡大 する傾斜面 59gを有する接続部 59Gを備えると共に、その排出流路 38側に、平面視 長方形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側（図示左側）に向力 に従い下側に 拡大する傾斜面 59hを有する接続部 59Hを備える検出領域 59を採用することも可 能である。
[0053] 図 22は、本発明の第 7実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
この第 7実施形態のフローセル 16にあっては、検出領域を構成する空間形状に対し て、その導入流路 37側で、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側（図示右側） に向力 に従い上側に拡大する傾斜面 60gを有する接続部 60Gが付設されると共に 、その排出流路 38側で、励起光入射側の位置に、光軸側（図示左側）に向かうに従 い下側に拡大する傾斜面 60hを有する接続部 60Hが付設され、傾斜面 60hの垂線 との成す傾斜角 Θ 2が傾斜面 60gの垂線との成す傾斜角 θ 1より大きくされている。
[0054] このような検出領域 60によれば、傾斜角 Θ 2が大きいため、微量サンプル液中に気 泡がある場合には当該気泡が接続部 60Hに円滑に逃げ、第 6実施形態に比して検 出精度が高められている。
[0055] 図 23は、本発明の第 8実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第 8 実施形態のフローセル 17が第 1実施形態のフローセル 10と違う点は、中間板 33の 上側に導入流路 37Aを設けると共に、中間板 33の下側に排出流路 38 Aを設けた点 である。
[0056] このように構成しても、第 1実施形態と同様な効果を得ることができるというのはいう までもない。
[0057] なお、第 8実施形態に、図 10に示す第 2実施形態の構成を適用する場合には、導 入流路 37Aに対する検出領域 34の接続部が、励起光入射側の位置に、光軸側（図 示右側）に向かうに従レ、励起光入射側である下側に拡大する傾斜面を有する構成と される。これにより、微量サンプル液の検出領域 34に対する導入が円滑に成される。
[0058] また、第 8実施形態に、図 13に示す第 3実施形態、図 17に示す第 4実施形態、図 1 8に示す第 5実施形態の構成を適用する場合には、排出流路 38Aに対する検出領 域 34の接続部が、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側（図示左側）に向かう に従い励起光入射側とは反対側である上側に拡大する傾斜面又は段差面を有する 構成とされる。これにより、励起光 Rの光路を妨げること無く検出領域 34が流路方向（ 図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域 34からの排出が 円滑に成される。特に、段差部の場合には、微量サンプノレ液中の気泡が当該段差部 に円滑に逃げ、検出精度が一層高められる。
[0059] また、第 8実施形態に、図 19に示す第 6実施形態、図 22に示す第 7実施形態の構 成を適用する場合には、導入流路 37Aに対する検出領域 34の接続部が、励起光入 射側の位置に、光軸側（図示右側）に向かうに従い励起光入射側である下側に拡大 する傾斜面を有する構成とされると共に、排出流路 38Aに対する検出領域 34の接 続部が、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側（図示左側）に向かうに従い励 起光入射側とは反対側である上側に拡大する傾斜面を有する構成とされる。これに より、励起光 Rの光路を妨げること無く検出領域 34が流路方向（図示左右方向）に小 さくされると共に、微量サンプノレ液の検出領域 34からの排出が円滑に成される。特に 、第 7実施形態に適用する場合には、微量サンプノレ液中の気泡が排出流路 38A側 の接続部に円滑に逃げ、検出精度が一層高められる。
[0060] 図 24は、本発明の第 9実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第 9 実施形態のフローセル 18が第 8実施形態のフローセル 17と違う点は、下板 32に、排 出流路 38Aに連通する貫通孔を設けてその下面の開口を排出口 36Aとした点であ る。
[0061] このように構成しても、第 8実施形態と同様な効果を得ることができるというのはいう までもない。
[0062] ところで、拡散定数 Dは、分子を球と仮定すると、その半径 rを用いてアインシュタイ ン.スト一タス（Einstein-Stokes)の式として次式のように表される。
[0063] D= (k ·Τ) / (6 π · η τ)
Β
[0064] 但し、 kはボルツマン定数、 Tは絶対温度、 r?は溶媒 (水）の粘性である。
B
[0065] このように、拡散定数 Dは温度に比例するため、微量サンプル液を所定温度に維 持するのが重要である。そこで、第 10実施形態では、温度制御素子を設ける。
[0066] 図 25は、本発明の第 10実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第
10実施形態では、第 1〜第 7実施形態のフローセルを利用している。具体的には、 本実施形態のフローセル 19には、励起光入射側の平板側である下板 32側（中間板 33の下面又は下板 32の上面）に、導入流路 37が設けられている。
[0067] そして、この第 10実施形態のフローセル 19が、第 1〜第 7実施形態のフローセル 1 0〜： 16と違う点は、励起光入射側の平板である下板 32の下面の導入流路 37に対応 し、励起光の光路に入らない位置に、例えばヒーターやペルチェ等の温度制御素子 80を設けた点である。
[0068] このようなフローセル 19によれば、薄い下板 32を通して温度制御素子 80による導 入流路 37に対する温度制御が容易とされ、微量サンプル液が素早く所定温度とされ 検出精度が高められるという作用 '効果が加えられる。なお、導入流路 37を蛇行させ る等して流路を長くし、温度制御を一層し易くするのが好ましい。
[0069] 図 26は、本発明の第 11実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第
11実施形態のフローセル 20が、第 1〜第 10実施形態のフローセル 10〜： 19と違う点 は、励起光入射側とは反対側の平板である上板 31の上面における検出領域 34， 50 〜60に対応する位置に、励起光 Rを透過すると共に蛍光を反射するフィルタ 85を設 けた点である。このフイノレタ 85は、例えばダイクロイツクミラー等より成り、例えば蒸着 等により上板 31に固着されている。
[0070] このようなフローセル 20によれば、フイノレタ 85により、励起光 Rの反射によるノイズ 成分が低減されると共に蛍光が検出領域 34, 50〜60に戻されて効率良く検出され 、検出精度が高められるという作用 ·効果が加えられる。
[0071] 以上の実施形態では、特に好ましいとしてセル本体 30を三枚の平板 31〜33を積 層して構成しているが、以下の第 12実施形態では、セル本体が二枚の平板で構成 されている。図 27は、本発明の第 12実施形態に係るフローセルを示す縦断面図、図 28は、図 27に示すフローセルの上面図である。
[0072] この実施形態のフローセル 21は、そのセル本体 90が二枚の平板 91 , 92を積層し て成り、励起光入射側である下板 92が上板 91に比して薄くされている。そして、微量 サンプル液の導入流路 37B及び排出流路 38B、これらの導入流路 37B及び排出流 路 38Bを拡大して成ると共に励起光 Rが合焦される検出領域 61は、上板 91の下面 を凹設することで各々設けられている。なお、導入流路 37B及び排出流路 38Bは、 下板 92の上面に設けることも可能である。
[0073] このように平板が二枚であっても、 FCS装置 1に適用されるフローセル 21を提供す ることが可能である。なお、検出領域 61の形状及びその接続部を、上記各実施形態 のように構成しても勿論良い。
[0074] 図 29は、本発明の第 13実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第 13実施形態は、図 2に示した第 1実施形態のフローセル 10の変形例を示している。
[0075] 図 29に示すフローセル 10Bは、上板 31、下板 32、及び中間板 33を積層して成る セル本体 30を備えている。また、セル本体 30内には、円柱空間形状の検出領域 34 と、微量サンプル液をセル本体 30内に導入するための導入口 35Bと検出領域 34と を接続する導入流路 37と、微量サンプル液をセル本体 30外に排出するための排出 口 36Bと検出領域 34とを接続する排出流路 38と、が設けられてレ、る。
[0076] 具体的には、上板 31には、長手方向の一方の端側に、導入口 35Bを有し上下に 貫通する貫通孔 37eが設けられると共に、長手方向の他方の端側に、排出口 36Bを 有し上下に貫通する貫通孔 38eが設けられている。また、中間板 33には、上板 31の 貫通孔 37eと同軸位置に、上下に貫通する貫通孔 37dが設けられ、さらに、その下面 に、検出領域 34の貫通孔、及び貫通孔 37dの下面側に連設されて導入流路 37とな る溝が設けられると共に、その上面に、検出領域 34の貫通孔の上面側に連設され上 板 31の貫通孔 38eに対応する位置迄延びて排出流路 38となる溝が設けられている
[0077] また、本実施形態では、導入口 35Bの径 DAと、排出口 36Bの径 DBとがほぼ等しく
(DA DB)設定されている。また、中間板 33の下面側の導入流路 37と、上板 31の 貫通孔 37eとを接続する中間板 33の貫通孔 37dについて、その径 DCが、導入口 35 B及び排出口 36Bの径よりも大きく（DC >DA DB)なるように設定されている。また 、中間板 33の上面側に形成されて排出流路 38となる溝は、上板 31の貫通孔 38eに 対応する位置をやや超えて延びる溝部分 38dを有している。
[0078] このように、中間板 33の貫通孔 37dの径 DCを導入口 35Bの径 DAよりも大きくする ことにより、製造時における貫通孔 37d、 37eの位置合わせが容易となる。同様に、中 間板 33の上面側で排出流路 38となる溝を、上板 31の貫通孔 38eに対応する位置を やや超えて延びる長さとすることにより、製造時における貫通孔 38eの位置合わせが 容易となる。また、このように位置合わせが容易な構成とした場合、貫通孔及び溝等 の加工において、特別に高精度な加工方法を用いる必要がない。 [0079] また、本実施形態においては、導入口 35Bの径 DAと排出口 36Bの径 DBとをほぼ 等しく設定している。導入口 35B及び排出口 36Bにおいて同じ結合部材を用いるな どの場合には、このような構成としても良い。
[0080] 以上、本発明をその実施形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上記実施 形態に限定されるものではない。例えば、上記実施形態においては、微量サンプル 液を無駄無く効率良くセル本体 30、 90に滴下するため、導入口 35をセル本体 30， 90の上面に設けている力 導入口 35をセル本体 30, 90の側面又は下面に設けるよ うにしても良ぐ排出口 36の位置も限定されるものではなレ、。また、導入流路 37及び 排出流路 38の形成についても、中間板 33のみ、または上板 31及び下板 32のみに 形成する構成に限らず、どちらか一方のみを中間板 33に形成し、他方を別の板に形 成する構成としても良い。
[0081] また、上記実施形態においては、セル本体 30, 90を、三枚又は二枚の平板を積層 することで構成している力 四枚以上の平板を積層して構成することも可能である。
[0082] また、上記実施形態においては、検出領域 34, 50〜61の形状を、特に好適である として、円形断面又は四角形断面を有する形状としているが、これらの形状に限定さ れるものではない。
[0083] また、上記実施形態においては、 FCSに採用されるフローセル 10〜21について述 ベているが、勿論 FCCSにも適用することが可能である。
[0084] 本発明によるフローセルは、微量サンプノレ液に励起光を合焦し蛍光発光を検出す る蛍光相関分光測定法に採用され、複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を 具備し、セル本体内には、励起光の焦点が設定される検出領域と、導入口から導入 される微量サンプル液を検出領域に導入する導入流路及び検出領域から微量サン プノレ液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、検出領域は、流路を拡大して 成ると共に、励起光の光軸を囲繞する周壁が、励起光の光路に入らない構成とされ ていることが好ましい。
[0085] ここで、導入流路及び排出流路は各々、検出領域に対して、励起光の光軸を挟ん だ両側に位置すると共に光軸方向に沿って離間して配設されていると、微量サンプ ル液の検出領域に対する導入 Z排出が円滑に成される。 [0086] また、流路は、検出領域の励起光入射側の端面と面一を成すように周壁に接続さ れ、検出領域の流路に対する接続部は、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸 側に向力うに従い励起光入射側とは反対側に拡大する傾斜面を有していると、この 傾斜面により、励起光の光路を妨げること無く検出領域が流路方向に小さくされると 共に、微量サンプル液の検出領域に対する導入/排出が円滑に成される。
[0087] また、排出流路は、検出領域の周壁の励起光入射側とは反対側に接続され、検出 領域の排出流路に対する接続部は、励起光入射側の位置に、光軸側に向かうに従 い励起光入射側に拡大する傾斜面を有していると、この傾斜面により、微量サンプノレ 液の検出領域からの排出が円滑に成される。
[0088] また、排出流路は、検出領域の周壁の励起光入射側とは反対側に接続され、検出 領域の排出流路に対する接続部は、励起光入射側の位置に、光軸側に向かうに従 レ、励起光入射側に拡大する段差部を有してレ、ると、サンプル液中に気泡がある場合 には当該気泡が段差部に円滑に逃げ、検出精度が高められる。
[0089] ここで、対物レンズの開口数 NAは高く励起光の焦点距離は短いため、励起光入 射側の平板は、他の平板に比して薄くされているのが好ましい。これにより、上記検 出領域に励起光の焦点が適切に形成されて検出精度が高められる。
[0090] また、励起光入射側の平板側に、導入流路が設けられ、励起光入射側の平板には 、その励起光入射側の端面で導入流路に対応する位置に、温度制御素子が設けら れていると、薄い平板を通して温度制御素子による導入流路に対する温度制御が容 易とされ、微量サンプル液が素早く所定温度とされ検出精度が高められる。
[0091] ここで、上記作用を効果的に奏する具体的な構成としては、セル本体は、平板を三 枚積層して構成され、両側の平板に挟まれる中間板に、当該中間板を積層方向に 貫通する貫通孔が設けられて検出領域とされていることが好ましい。あるいはさらに、 当該中間板の一方側の端面に、検出領域の一方側に連設される一方側の溝が設け られて導入流路とされると共に、当該中間板の他方側の端面に、検出領域の他方側 に連設される他方側の溝が設けられて排出流路とされる構成とすることが好ましい。 このような構成を採用することで、製造コストが大幅に低減される。
[0092] また、微量サンプル液を無駄無く効率良くセル本体に導入する構成としては、具体 的には、励起光入射側とは反対側の平板には、当該平板を積層方向に貫通し上記 導入流路に連通する導入流路がさらに設けられ、この導入流路の外部に対する開口 が導入口とされ、この導入口を上側にして微量サンプノレ液が滴下される構成が挙げ られる。
[0093] また、励起光入射側とは反対側の平板には、その励起光入射側とは反対側の端面 で検出領域に対応する位置に、励起光を透過すると共に蛍光を反射するフィルタが 設けられてレ、ると、当該フィルタにより、励起光の反射によるノイズ成分が低減される と共に蛍光が検出領域に戻されて効率良く検出され、検出精度が高められる。
[0094] また、上記した構成においては、導入流路は、中間板と、中間板を挟む両側の平 板のうちで励起光入射側の平板との間に設けられており、排出流路は、中間板と、中 間板を挟む両側の平板のうちで励起光入射側とは反対側の平板との間に設けられ ていることが好ましい。具体的な構成としては、例えば、中間板の励起光入射側の端 面に導入流路となる溝を設け、中間板の励起光入射側とは反対側の端面に排出流 路となる溝を設ける構成がある。
[0095] また、フローセルにおいては、導入口及び排出口は、セル本体に対して励起光入 射側とは反対側に設けられていることが好ましい。
[0096] また、本発明によれば、上記フローセルを用い、励起光源、焦点光学系、検出部、 分析部を備えた蛍光相関分光測定装置を提供できる。
産業上の利用可能性
[0097] 本発明は、蛍光相関分光測定法に採用され、微量サンプル液を効率良く検出に供 すると共に蛍光相関分光測定法の検出精度を向上するフローセル、及びこれを用い た蛍光相関分光測定装置として利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 微量サンプノレ液に励起光を合焦し蛍光発光を検出する蛍光相関分光測定法に採 用され、
複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を具備し、
前記セル本体内には、前記励起光の焦点が設定される検出領域と、
導入口から導入される前記微量サンプル液を前記検出領域に導入する導入流路 及び前記検出領域から前記微量サンプル液を排出口へ排出する排出流路と、が配 設され、
前記検出領域は、前記流路を拡大して成ると共に、前記励起光の光軸を囲繞する 周壁が、前記励起光の光路に入らない構成とされていることを特徴とするフローセル
[2] 前記導入流路及び前記排出流路は各々、前記検出領域に対して、前記励起光の 光軸を挟んだ両側に位置すると共に前記光軸方向に沿って離間して配設されている ことを特徴とする請求項 1記載のフローセル。
[3] 前記流路は、前記検出領域の励起光入射側の端面と面一を成すように前記周壁 に接続され、
前記検出領域の前記流路に対する接続部は、前記励起光入射側とは反対側の位 置に、前記光軸側に向力 に従い前記励起光入射側とは反対側に拡大する傾斜面 を有することを特徴とする請求項 1又は 2記載のフローセル。
[4] 前記排出流路は、前記検出領域の前記周壁の励起光入射側とは反対側に接続さ れ、
前記検出領域の前記排出流路に対する接続部は、前記励起光入射側の位置に、 前記光軸側に向かうに従い前記励起光入射側に拡大する傾斜面を有することを特 徴とする請求項 1又は 2記載のフローセル。
[5] 前記排出流路は、前記検出領域の前記周壁の励起光入射側とは反対側に接続さ れ、
前記検出領域の前記排出流路に対する接続部は、前記励起光入射側の位置に、 前記光軸側に向かうに従い前記励起光入射側に拡大する段差部を有することを特 徴とする請求項 1又は 2記載のフローセル。
[6] 前記励起光入射側の平板は、他の平板に比して薄くされていることを特徴とする請 求項 1〜5の何れか一項に記載のフローセル。
[7] 前記励起光入射側の平板側に、前記導入流路が設けられ、
前記励起光入射側の平板には、その励起光入射側の端面で前記導入流路に対応 する位置に、温度制御素子が設けられていることを特徴とする請求項 6記載のフロー セル。
[8] 前記セル本体は、前記平板を三枚積層して構成され、
両側の平板に挟まれる中間板に、当該中間板を積層方向に貫通する貫通孔が設 けられて前記検出領域とされていることを特徴とする請求項:!〜 7の何れか一項に記 載のフローセノレ。
[9] 前記中間板の一方側の端面に、前記検出領域の一方側に連設される一方側の溝 が設けられて前記導入流路とされると共に、
前記中間板の他方側の端面に、前記検出領域の他方側に連設される他方側の溝 が設けられて前記排出流路とされていることを特徴とする請求項 8記載のフローセル
[10] 前記励起光入射側とは反対側の平板には、当該平板を積層方向に貫通し前記導 入流路に連通する導入流路がさらに設けられ、
この導入流路の外部に対する開口が、前記導入口とされ、この導入口を上側にして 前記微量サンプノレ液が滴下されることを特徴とする請求項 8または 9記載のフローセ ノレ。
[11] 前記励起光入射側とは反対側の平板には、その励起光入射側とは反対側の端面 で前記検出領域に対応する位置に、前記励起光を透過すると共に前記蛍光を反射 するフィルタが設けられていることを特徴とする請求項 8〜： 10の何れか一項に記載の フローセノレ。
[12] 前記導入流路は、前記中間板と、前記中間板を挟む両側の平板のうちで励起光入 射側の平板との間に設けられており、前記排出流路は、前記中間板と、前記中間板 を挟む両側の平板のうちで励起光入射側とは反対側の平板との間に設けられている ことを特徴とする請求項 8〜： 11の何れか一項に記載のフローセル。
前記導入口及び前記排出口は、前記セル本体に対して励起光入射側とは反対側 に設けられていることを特徴とする請求項 1〜： 12の何れか一項に記載のフローセル。 請求項 1〜： 13の何れか一項に記載のフローセルを用レ、、励起光源、焦点光学系、 検出部、分析部を備えた蛍光相関分光測定装置。
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