WO2005103791A1 - Vorrichtung und verfahren zur aufnahme statischer und funktionaler daten - Google Patents

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Leica Microsystems Heidelberg GmbH
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Definitions

  • the invention relates to a device in particular in a microscope for recording static and functional data of an object according to the preamble of claim 1 and a method for recording static and functional data of an object according to the preamble of claim 10.
  • confocal scanning microscopy can be used for this.
  • a sample with the focus of a light beam is scanned point by point in a plane, so that an image, albeit with a shallow depth of field, is obtained from this plane.
  • the object can then be represented three-dimensionally by recording a plurality of different planes and by corresponding image processing.
  • Such a confocal scanning microscopy method is known, for example, from US Pat. No. 6,128,077.
  • dyes which can be used to visualize certain functional processes in the object. These dyes change the intensity or the wavelength and thus the color of the fluorescent light when certain functional processes take place in the object areas in which the dyes are incorporated.
  • the functional processes can be the flow of ions or the presence of a protein in the vicinity of the marked area. Dyes that change their fluorescent color when functional processes occur in the object have proven their worth most, but changes in intensity are also frequently used.
  • the two marking options of an object can now be combined with each other so that both the marking of static structures of the object and the marking of certain functional processes in the object take place.
  • the object is marked with different dyes. Some identify the static properties of the object jekts. Other dyes react to certain physiological, so-called functional processes in the object by changing their color or intensity and are attached to those places on the object where such functional processes take place.
  • this marking now allows the simultaneous observation of static properties of the object and the localization and evaluation of functional processes. In practice, however, one is faced with the problem that when the object is excited, an overlay / mixture of fluorescent colors becomes visible, the colors no longer being able to be separated or directly assigned to the static properties or functional processes. Such mixtures cannot be easily separated from the eye itself.
  • the object of the present invention is therefore to provide a device and a method for the simultaneous recording of static and functional data of an object, with which it is possible to ensure an association of the determined data with static structures and functional processes in an object.
  • this object is achieved by a device for recording static and functional data of an object with features according to claim 1 and by a method for recording static and functional data of an object with the features according to claim 10.
  • a device in particular a microscope, which has a model memory for storing an expected model of the object. Furthermore, a “sorting device” is provided, which makes it possible to sort the data coming from the object depending on the stored model. From this, data sorted in this way can then a visualization of the object can be generated. The detected mixture of fluorescent colors can thus be numerically separated.
  • object data are recorded with a detection unit in order to generate an image of the object.
  • a model is stored in a model memory, which corresponds to the expected object image.
  • the data is sorted depending on the stored model.
  • a visualization can then be generated from the sorted data.
  • the advantage of the device according to the invention and the method according to the invention is that it is able to simultaneously acquire static and functional data from an object, in particular a living object. In general, this makes it possible to better localize the functional data, i. H. to be able to better assign the sequence of the function locally. This is particularly advantageous when examining living biological objects.
  • special dyes are usually introduced into the sample. B. via antibody coupling to certain static components of the cell, such as the gyto-skeleton, ER and others. These dyes are chosen so that they are very static, i. H. essentially do not change and thus generate a very precise identification of static morphological structures of the object.
  • the invention can be used advantageously in particular in a confocal microscope. However, it can also easily be used in other fluorescence microscopes with spectral detection. Often this is a Descriptive number of filters, SP modules, meta modules or other components required.
  • the information that can be obtained from such an object can be represented as an intensity vector /:
  • the measurement result is an intensity of
  • I slojr can be used for further processing, such as the calculation of the ion concentration.
  • r l , r_ are the limiting wheel spectra - that is, the pure forms of the spectral light distribution in extreme physiological situations - and the vector (, ⁇ ) can be used for further processing, for example for calculating the ion concentration.
  • the intensity variation and the spectral variation are mutually exclusive. However, both can be combined with the methods for static identification of the object.
  • the fluorescence of the object that is to say a set of vectors /
  • a model is stored in the model memory, which enables the user to explain the measured /.
  • This model results from the dyes used, which are known per se. If a mixture is assumed for the static dyes, you can basically choose from two models:
  • the data obtained from the object can now be sorted in the sorting device in such a way that a visualization can be generated which can ultimately be represented as a location-dependent color coding and can be output, for example, on a monitor.
  • the measurement data can be brought into line with the selected model using a suitable fit.
  • the Fit can be used to generate new images from the components ( ⁇ ,, (, ⁇ ), I sloJf ).
  • the data obtained can be sorted in such a way that static and functional parts of the image can be displayed separately or together. For example, initially only the morphological structure of the object can be displayed on a monitor. The areas in which functional data have been localized can also be displayed separately or additionally. Overlays are also possible, as are special analysis methods adapted to the nature of functional data. Examples of this are the analysis of the propagation speed of molecular ion activity according to directions and speeds.
  • the sorting device can be arranged in a computing unit, in particular a PC.
  • the sorting device can also be implemented as software in the PC.
  • the data can be reconciled with the model in the sorting device by means of a fit.
  • Fig. 1 schematically an inventive microscope
  • Fig. 2 shows schematically the process flow for generating an image of the object
  • a confocal scanning microscope 10 is particularly suitable.
  • a light beam 3 coming from an illumination system 1 is reflected by a beam splitter 5 to the beam deflection device 7, which is controlled by a control and detection unit 23 via a line 29 and which contains a gimbal-mounted scanning mirror 9 which guides the beam through microscope optics 13 over or into the interior of the object 15.
  • the light beam 3 is guided over the object surface.
  • the light beam 3 can also be guided through the surface of the object 15.
  • the light beam 3 coming from the lighting system 1 is shown as a solid line.
  • the fluorescent light 17 emanating from the object 15 passes through the microscope optics 13 and via the beam deflection device 7 to the beam splitter 5, passes through it and hits the detector 19, which is designed as a photomultiplier.
  • the fluorescent light 17 emanating from the object 15 is shown in the figure as a dashed line.
  • the position signals 25 detected in the beam deflection device 7 with the aid of an inductive or capacitive position sensor 11 can also be sent to the control and detection unit 23
  • the incoming analog signals are first digitized in the control and detection unit 23.
  • a model is stored in a model memory 31, which is based on the dyes used and is matched accordingly to the expected object structure.
  • a model of the form 1 __ ⁇ a, ⁇ i + r, + ßr_ can be stored.
  • the measurement data can be brought into line with the model by means of a fit, new images in particular of the form ⁇ a l , ⁇ a, ß), I staff ) being generated.
  • the model memory 31 can be integrated in a computing unit, for example a PC 34, or can be provided separately.
  • step 39 one of the stored models is selected from the model memory 31 or a model is stored.
  • the model can be provided from information that is already available to the user when planning the experiment. This way, the user knows which dyes have been introduced into the object and can choose an appropriate model. For example, two static dyes and one physiological, i.e. H. functional dye can be introduced into the object.
  • the data belonging to the dyes can be stored in a dye database 39 (FIG. 1). This enables simple experiment planning, because data such as the associated spectra of the dyes and the intensities to be expected are then known.
  • step 41 the object data is recorded, from which, in step 43, the assignment according to the stored model takes place simultaneously or subsequently.
  • the recorded object data are sorted in such a way that they are separated so that they are functional in each case or static values can be assigned.
  • the image of the object is then displayed separately in step 45 according to functional and static areas or a mixture thereof.
  • this object image can be output on the display 27.
  • step 46 the user specifies dyes which are to be used for the intended experiment.
  • these predetermined dyes are used for system parameterization of the confocal microscope, whereupon the data is recorded in step 47 in the first method branch 49.
  • the dyes specified in step 46 are additionally used to select a model. This takes place in step 48 in the second method branch 51. In this case, together with the selection of the model, the number of dyes and their exact identification are also determined.
  • the model is translated into parameter images, which are determined by the static and dynamic proportions of the dyes.
  • the mechanism for this activity is a mathematical fit, which is carried out in step 50.
  • a lot of parameter images are derived from the model, which contain either functional or structural information.
  • the user then has the option of selecting both the raw data and the derived parameter images, which is done in step 54.
  • control and detection unit 25 position signals

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Abstract

In einer Vorrichtung insbesondere in einem Mikroskop (10) zur Aufnahme statischer und funktionaler Daten eines Objekts (15) wird ein Modellspeicher (31) zum Ablegen eines erwarteten Modells des Objekts (15) vorgesehen. Zur Visualisierung eines Bildes (35) des Objekts (15) werden Bilddaten des Objekts in einer Sortiereinrichtung (33) in Abhängigkeit von dem gewählten Modell so sortiert, dass ein Bild (35) des Objekts (15) visualisiert werden kann.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Aufnahme statischer und funktionaler Paten
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung insbesondere in einem Mikroskop zur Aufnahme statischer und funktionaler Daten eines Objekts nach dem Ober- begriff des Anspruchs 1 sowie ein Verfahren zur Aufnahme statischer und funktionaler Daten eines Objekts gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 10.
Bei der Untersuchung von Objekten mit Hilfe eines Mikroskops besteht oftmals das Bedürfnis, die dreidimensionale Ausgestaltung der Oberfläche des Objektes zu rekonstruieren. Hierzu kann beispielsweise die konfokale Scan- mikroskopie eingesetzt werden. Dabei wird eine Probe mit dem Fokus eines Lichtstrahls punktweise in einer Ebene abgetastet, sodass ein Bild, allerdings mit geringer Tiefenschärfe, dieser Ebene erhalten wird. Durch die Aufnahme einer Mehrzahl von verschiedenen Ebenen und durch eine entsprechende Bildverarbeitung kann das Objekt dann dreidimensional dargestellt werden. Ein derartiges konfokale Scanmikroskopieverfahren ist beispielsweise aus der US 6,128,077 bekannt.
Bei der mikroskopischen Untersuchung von Objekten ist es oftmals erforderlich, bestimmte Teile oder Eigenschaften des Objektes durch Färbung zu kennzeichnen. Damit kann beispielsweise die Struktur und damit die Morpho- logie in Zellen und Geweben differenziert und kontrastreich sichtbar gemacht werden. Wie aus der US 6,055,097 bekannt ist, können hierzu in eine Probe Farbstoffe eingebracht werden, die sich zum einen an spezifische Bereiche des Objektes anlagern und die zum andern unter geeigneten Beleuchtungsbedingungen abhängig vom eingesetzten Farbstoff in unterschiedlichen Far- ben fluoreszieren, sodass mit der Bestrahlung die Lokalisierung der Farbstoffe in der Probe möglich wird. Zur Erzeugung eines räumlichen Bildes kann dann eine Anzahl von Bildern in unterschiedlichen Fokusebenen aufgenommen werden. Jedes dieser Bilder enthält Bildinformationen, die unmittelbar aus der Fokusebene stammen, ebenso wie solche Bildinformationen, die aus Raum- abschnitten des Objektes stammen, die außerhalb der Fokusebene liegen. Zur Ermittlung eines scharfen Bildes ist es erforderlich, die nicht aus der Fokusebene stammenden Bildanteile zu eliminiereπlnsbesondere bei der Untersuchung lebender Objekte, wie etwa lebender Zellen, können nach dem Eiπ- färben des Objektes bzw. dem Einbringen von Farbstoffen in das Objekt In- formationen über Teilbereiche des Objektes durch Anregung dieser Farbstoffe gewonnen werden. Die meisten Farbstoffe lagern sich jeweils nur an spezifischen Teilen des Objekts an. Zum Beispiel ist es möglich, den Zellkerns mit einem ersten Farbstoff und das Cytoskelett mit einem zweiten Farbstoff zu markieren. Die beiden Objektbereiche können dann nach der Anregung durch unterschiedliche Fluoreszenzfarben voneinander getrennt und lokalisiert werden.
Außer den Farbstoffen zur Kennzeichnung bestimmter statischer Bereiche eines Objekts sind auch Farbstoffe bekannt, mit denen bestimmte funktionelle Vorgänge in dem Objekt sichtbar gemacht werden können. Diese Farbstoffe ändern die Intensität oder die Wellenlänge und damit die Farbe des fluoreszierten Lichts, wenn bestimmte funktionelle Vorgänge in den Objektbereichen ablaufen, in denen die Farbstoffe eingebracht sind. Speziell können die funktioneilen Vorgänge der Fluss von Ionen oder etwa die Präsenz eines Proteins in der Nähe des markierten Bereichs sein. Am meisten haben sich solche Farbstoffe bewährt, die beim Ablauf funktioneller Vorgänge im Objekt ihre Fluoreszenzfarbe ändern, aber auch Inteπsitätsändereπde sind vielfach in Benutzung.
Die beiden Kennzeichnungsmöglichkeiten eines Objekts können nun miteinander kombiniert werden, so dass sowohl die Markierung statischer Strukturen des Objekts wie auch die Kennzeichnung bestimmter funktioneller Abläufe im Objekt erfolgt. Hierzu wird das Objekt mit verschieden Farbstoffen gekennzeichnet. Die einen kennzeichnen dabei die statischen Eigenschaften des Ob- jekts. Andere Farbstoffe reagieren durch Änderung ihrer Farbe oder Intensität auf bestimmte physiologische, sogenannte funktionelle Vorgänge im Objekt und werden an solchen Stellen des Objekts angelagert, an denen derartige funktionelle Vorgänge vonstatten gehen. Diese Kennzeichnung erlaubt nun im Prinzip die gleichzeitige Beobachtung statischer Eigenschaften des Objekts und die Lokalisierung und Auswertung funktioneller Vorgänge. In der Praxis ist man allerdings mit dem Problem konfrontiert, dass mit der Anregung des Objektes eine Überlagerung/Mischung von Fluoreszenzfarben sichtbar wird, wobei die Farben nicht mehr getrennt oder den statischen Eigenschaften oder funktionellen Vorgängen direkt zugeordnet werden können. Derartige Mischungen lassen sich vom Auge selber nicht gut trennen. So können sich im Fluoreszenzbild beispielsweise Variationen wiederfinden, die im Orangen ablaufen, während gleichzeitig eine Struktur im Grünen und eine andere im Roten vorliegt. Für das menschliche Auge ist es äußerst schwierig, aus diesem Farbgemenge eindeutige Zuordnungen zu treffen. Somit ist es kaum möglich Analysen durchzuführen, die einen Rückschluss auf die ablaufenden funktionellen Vorgänge und die gekennzeichneten statischen Strukturen erlauben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur gleichzeitigen Aufnahme statischer und funktionaler Daten ei- nes Objekts bereitzustellen, mit dem es möglich ist, eine Zuordnung der ermittelten Daten zu statischen Strukturen und funktionellen Vorgängen in einem Objekt zu gewährleisten.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Vorrichtung zur Aufnahme statischer und funktionaler Daten eines Objekts mit Merkmalen gemäß An- spruch 1 sowie durch ein Verfahren zur Aufnahme statischer und funktionaler Daten eines Objekts mit den Merkmalen den gemäß Anspruch 10 gelöst.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung insbesondere Mikroskop bereitgestellt, die einen Modellspeicher zum Speichern eines erwarteten Modells des Objekts aufweist. Weiterhin ist eine „Sortiereinrichtung" vorgesehen, die es ermöglicht, die vom Objekt kommenden Daten in Abhängigkeit von dem gespeicherten Modell zu sortieren. Aus diesen so sortierten Daten kann dann eine Visualisierung des Objektes erzeugt werden. Somit kann die erfasste Mischung von Fluoreszenzfarben numerisch getrennt werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zur Erzeugung eines Bildes des Objekts mit einer Erfassungseinheit Objektdaten aufgenommen. In einem Mo- dellspeicher ist ein Modell hinterlegt, welches zum erwarteten Objektbild korrespondiert. Die Daten werden in Abhängigkeit von dem hinterlegten Modell sortiert. Aus den sortierten Daten kann dann eine Visualisierung erzeugt werden.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nun gerade darin gleichzeitig statische und funktionale Daten von einem Objekt, insbesondere einem lebenden Objekt erfassen zu können. Ganz allgemein wird es damit möglich, die funktionellen Daten besser lokalisieren zu können, d. h. den Ablauf der Funktion lokal besser zuordnen zu können. Insbesondere bei der Untersuchung lebender biologischer Objekte ist dies von großem Vorteil. In der Biologie werden hierbei in der Regel spezielle Farbstoffe in die Probe eingebracht, die sich dann z. B. über Aπtikörperkopp- lung an bestimmten statischen Bestandteilen der Zelle fixieren, etwa am Gy- toskelett, ER und andere. Diese Farbstoffe werden so gewählt, dass sie sehr statisch sind, d. h. sich im wesentlichen nicht verändern und damit eine sehr genaue Kennzeichnung statischer morphologischer Strukturen des Objekts erzeugen.
Funktionelle Informationen über Vorgänge im Objekt sind an die Physiologie des zu untersuchenden Objekts gekoppelt. Um diese erkennen zu können, werden spezielle Farbstoffe eingesetzt, die ihre spektralen Eigenschaften oder ihre Intensität beim Ablauf der Vorgänge ändern. Diese Farbstoffe werden an eine in dem Objekt vorkommende Substanz gekoppelt, sodass diese messbar wird. Generell sind also die Eigenschaften dieser Farbstoffe dynamisch.
Insbesondere in einem Konfokalmikroskop lässt sich die Erfindung vorteilhaft einsetzen. Sie kann aber ohne weiteres auch in anderen Fluoreszenzmikro- skopen mit spektraler Detektion verwendet werden. Oft ist hierbei eine ent- sprechende Anzahl von Filtern, SP-Moduleπ, Meta-Modulen oder weiteren Komponenten erforderlich.
Die Information, die aus einem solchen Objekt gewonnen werden kann lässt sich als Intensitätsvektor / darstellen:
Figure imgf000007_0001
Ebenso ist eine kompatible spektrale Darstellung der Form 7(Λ) = J(Λslarl + nAÄ) = Ia möglich.
Werden von dem Objekt Daten erfasst, die auf reinen Farbstoffen basieren, die zur Kennzeichnung morphologischer Strukturen dienen, also statische Bereiche des Objekt repräsentieren, so erhält man die entsprechenden Farbstoffspektren
Figure imgf000007_0002
Entsprechend ergibt sich für die Messung eines Gemisches solcher Farbstoffe die Superposition 7 = X a,ε,,
wobei die a, die Dichte des Farbstoffs an der jeweiligen Stelle wiederspiegeln.
Bei der Messung funktionaler Farbstoffe, die nur Intensitätsvariationen aufweisen ergibt sich als Messergebnis eine Intensität von
1 - Jswjr €i >
wobei Islojr zur Weiterverarbeitung, etwa der Berechnung der lonenkonzentra- tion herangezogen werden kann.
Als funktionale Farbstoffe können allerdings auch solche gewählt werden, die Spektralvariationen aufweisen. In diesem Fall ergibt sich die Intensität zu
Figure imgf000008_0001
wobei r l , r_ die begrenzende Raπdspektren - also die puren Ausprägungen der spektralen Lichtverteilung in physiologischen Extremsituationen - sind und der Vektor ( , ß ) zur weiteren Verarbeitung, etwa zur Berechnung der lonen- konzentration herangezogen werden kann.
In der Praxis nun schließen sich die Intensitätsvariation und die Spektralvariation gegenseitig aus. Beide können jedoch jeweils mit den Methoden zur statischen Kennzeichnung des Objekts kombiniert werden.
Erfindungsgemäß wird nun zur Erzeugung einer Visualisierung eines Objekts die Fluoreszenz des Objektes erfasst, also eine Menge von Vektoren /,. auf- genommen. In dem Modellspeicher wird ein Modell hinterlegt, das dem Benutzer ermöglicht, die gemessenen /,zu erklären. Dieses Modell ergibt sich aus dem an sich bekannten eingesetzten Farbstoffen. Wird für die statischen Farbstoffe ein Gemisch angenommen, so kann grundsätzlich aus zwei Modellen gewählt werden:
(1) I = statisches Farbstoffgemisch mit Intensitätsvariation
Figure imgf000008_0002
(2) / = 2 aiεi ->r rl + ßri- statisches Farbstoffgemisch mit Spektralvariation
die sich durch die Anzahl und Art der verwendeten Statischen und dynamischen Farbstoffen unterscheiden (freie Parameter). Basierend auf den Model- len (1 ) oder (2) lassen sich nun die von dem Objekt gewonnen Daten in der Sortiereinrichtung so sortieren, dass eine Visualisierung erzeugt werden kann, die letztlich als ortsabhängige Farbkodierung darstellbar ist und beispielsweise an einem Monitor ausgegeben werden kann.
Die Messdaten könne bei der Durchführung des Verfahrens durch einen geeigneten Fit mit dem jeweils gewählten Modell in Einklang gebracht werden. Insbesondere können mit dem Fit neue Bilder aus den Komponenten (α, , ( , ß), IsloJf ) erzeugt werden.
Selbstverständlich lassen sich mit diesem Verfahren die gewonnen Daten so sortieren, dass statischen und funktionalen Bildanteile jeweils separat oder zusammen angezeigt werden können. Beispielsweise kann zunächst nur die morphologische Struktur des Objekts auf einem Monitor angezeigt werden. Auch können die Bereiche, in denen funktionelle Daten lokalisiert wurden separat oder zusätzlich angezeigt werden. Auch Überlagerungen sind ebenso möglich wie spezielle an die Natur von funktionalen Daten angepasste Analysenmethoden. Beispiele hierzu sind die Analyse der Ausbreitungsgeschwindigkeit molekularer lonenaktivität nach Richtungen und Geschwindigkeiten.
Die Sortiereinrichtuπg kann in einer Recheneinheit, insbesondere einem PC angeordnet sein. Ebenso kann die Sortiereinrichtung als Software in dem PC verwirklicht werden. Die Daten können in der Sortiereinrichtung durch einen Fit mjt dem Modell in Einklang gebracht werden.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der nachfolgenden Figuren sowie deren Beschreibungen, bei deren Darstellung zugunsten der Übersichtlichkeit auf eine maßstabsgetreue Wie- dergabe verzichtet wurde.
Es zeigen im Einzelnen:
Fig. 1. schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop
Fig. 2 schematisch den Verfahrensablauf zur Erzeugung eines Bildes des Objekts
Grundsätzlich können alle Fluoreszenzmikroskope mit spektraler Detektion für das Verfahren verwendet werden. Oft ist hierbei ein entsprechende Anzahl von Filtern, SP-Modulen oder weiteren Komponenten erforderlich. Besonders geeignet ist, wie in Figur 1 schematisch gezeigt, ein erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskop 10. Ein von einem Beleuchtungssystem 1 kommender Lichtstrahl 3 wird von einem Strahlteiler 5 zur Strahlablenkeinrichtung 7 reflek- tiert, die von einer Steuer- und Erfassungseinheit 23 über eine Leitung 29 gesteuert wird und die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9 beinhaltet, der den Strahl durch eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. in das Innere des Objektes 15 führt. Der Lichtstrahl 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präpara- ten) oder transparenten Objekten kann der Lichtstrahl 3 auch durch die Oberfläche des Objektes 15 hindurch geführt werden. Damit ist es möglich, dass verschiedene Fokusebenen des Objekts nacheinander durch den Lichtstrahl 3 abgetastet werden. Da biologische Objekte zur Kennzeichnung bestimmter Objektbereiche mit Farbstoffen versehen werden können, lässt sich für jeden Rasterpunkt aus der Anregung der Farbstoffe und dem damit emittierten Fluoreszenzlicht ein dreidimensionales Bild des Objekts 15 erzeugen. Der vom Beleuchtungssystem 1 kommende Lichtstrahl 3 ist als durchgezogene Linie dargestellt. Das vom Objekt 15 ausgehende Fluoreszenzlicht 17 gelangt durch die Mikroskopoptik 13 und über die Strahlablenkeinrichtung 7 zum Strahlteiler 5, passiert diesen und trifft auf den Detektor 19, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Das vom Objekt 15 ausgehende Fluoreszenzlicht 17 ist in der Abbildung als gestrichelte Linie dargestellt.
Im Detektor 19 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt ausgehenden Lichtes 17 proportionale Detektionssignale 21 erzeugt und an die Steuer- und Erfassungseinheit 23 weitergegeben. Die in der Strahlablenkeinrichtung 7 mit Hilfe eines induktiv oder kapazitiv arbeitenden Positionssensors 11 erfassten Positionssignale 25 können ebenfalls an die Steuer- und Erfassungseinheit 23
übergeben werden. Die eingehenden, Analogsignale werden in der Steuer- und Erfassungseinheit 23 zunächst digitalisiert.
In einem Modellspeicher 31 wird ein Modell hinterlegt, das auf den verwendeten Farbstoffen beruht und entsprechend auf die erwartete Objektstruktur ab- gestimmt ist. Insbesondere kann im Modellspeicher 31 ein Modell hinterlegt werden, das ein statisches Farbstoffgemisch mit Intensitätsvariation insbesondere der Form 1 = ^ a, ε,- + laoff ε aufweist.
Wird ein statisches Farbstoffgemisch mit Spektralvariation erwartet, so kann insbesondere ein Modell der Form 1 = __^ a,εi + r , + ßr_ hinterlegt wer- den. Die Messdaten können mit dem Model durch einen Fit in Einklang gebracht werden, wobei neue Bilder insbesondere der Form {al,{a,ß),Istaff) erzeugt werden. Der Modellspeicher 31 kann in einer Recheneinheit, etwa einem PC 34 integriert oder separat vorgesehen werden.
Fig. 2 zeit schematisch den Verfahrensablauf zur Erzeugung einer Visualisie- rung gemäß der Erfindung. Im Schritt 39 wird aus dem Modellspeicher 31 eines von hinterlegten Modellen ausgewählt oder ein Modell abgelegt. Das Modell kann aus Informationen bereitgestellt werden, die dem Benutzer schon bei der Experimentplanung zur Verfügung stehen. So weiß der Benutzer, welche Farbstoffe in das Objekt eingebracht worden sind und kann ein entsprechen- des Modell wählen. So können beispielsweise zwei statische Farbstoffe und ein physiologischer, d. h. funktioneller Farbstoff in das Objekt eingebracht werden. Die zu den Farbstoffen gehörenden Daten können dabei in einer Farbstoff-Datenbank 39 (Fig. 1) hinterlegt sein. Damit ist eine einfache Experimentplanung möglich, denn Daten wie die zugehörigen Spektren der Farb- Stoffe und die zu erwartenden Intensitäten sind dann bekannt.
Im Schritt 41 erfolgt die Aufnahme der Objektdaten, aus denen dann im Schritt 43 gleichzeitig oder darauffolgend die Zuordnung entsprechend dem hinterlegten Modell erfolgt. Bei dieser Sortierung werden die aufgenommenen Objektdaten so sortiert, dass eine Trennung so erfolgt, dass sie jeweils funktionalen oder statischen Werten zugeordnet werden können. Sobald diese Trennung erfolgt ist, dann im Schritt 45 die Anzeige des Bildes des Objekt getrennt nach funktionalen und statischen Bereichen oder einer Mischung daraus erfolgen.
Wie in Fig. 1 gezeigt kann dieses Objektbild auf dem Display 27 ausgegeben werden.
Fig. 2. zeigt schematisch den erfindungsgemäßen Verfahrensablauf im Überblick. . Vom Benutzer werden im Schritt 46 Farbstoffe vorgegeben, die für das beabsichtigte Experiment benutzt werden sollen. Entsprechend den bereits bekannten Verfahren werden dieses vorgegebenen Farbstoffe zur Systemparametrisierung des Konfokalmikroskops genutzt, woraufhin im ersten Verfahrenszweig 49 im Schritt 47 die Datenaufnahme erfolgt. Erfindungsgemäß werden die im Schritt 46 vorgegebenen Farbstoffe zusätzlich zur Selektion eines Modells benutzt. Dies erfolgt im Schritt 48 im zweiten Verfahrenszweig 51. Dabei erfolgt zu- sammen mit der Auswahl des Modells auch die Festlegung der Anzahl der Farbstoffe sowie deren exakte Identifikation. Das Modell wird zur Übersetzung der aus der Datenaufnahme 47 ermittelten Rohdaten in Parameterbilder übersetzt, welche durch die statischen und dynamischen Anteile der Farbstoffe bestimmt werden. Der Mechanismus für diese Tätigkeit besteht in einem mathematischen Fit, der im Schritt 50 ausgeführt wird. Dabei wird aus dem Modell eine Menge an Parameterbildern hergeleitet, die entweder funktionale oder strukturelle Informationen beinhalten. Für die Anzeige hat der Benutzer dann die Möglichkeit sowohl die Rohdaten als auch die abgeleiteten Parameterbilder auszu- wählen, was im Schritt 54 erfolgt. Die Anzeige, insbesondere die Ausgabe an einen Bildschirm erfolgt dann im Schritt 52.
Bezuqszeichenl iste
I Beleuchtungssystem 3 Lichtstrahl
5 Strahlteiler 7 Strahlablenkeinrichtung
9 Scanspiegel
10 Scanmikroskop
I I Positionssensor 13 Mikroskopoptik 15 Objekt
17 vom Objekt ausgehendes Licht
19 Detektor
21 Detektionssignale
23 Steuer- und Erfassungseinheit 25 Positioπssignale
27 Display
29 Leitung
31 Modellspeicher
33 Sortiereiπrichtuπg 34 PC
35 Objektbild Farbstoff Datenbank Signalauswerteeinrichtung Objektdatenaufnahme Sortierung Datenausgabe Farbstoffe vorgeben Datenaufnahme Modellselektion erster Verfahrenszweig FIT Verfahrenszweig Anzeige Selektion der Anzeige

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung, insbesondere Mikroskop (10), zur Aufnahme statischer und funktionaler Daten eines Objekts (15) mit einer Erfassungseinheit (23) zur Aufnahme von Objektdaten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Modellspeicher (31) zur Speicherung eines erwarteten Modells des Objekts (15) und eine Sortiereiπrichtung (33) zum Sortieren der Daten in Abhängigkeit von dem gespeicherten Modell vorgesehen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Mo- dellspeicher (31 ) in einer Recheneinheit, insbesondere einem PC (34) angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Sortiereinrichtung (33) in einer Recheneinheit, insbesondere einem PC (34) angeordnet ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass in der Sortiereinrichtung (33) eine Software zum Sortieren der Objektdaten vorgesehen ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass die Daten in der Sortiereinrichtung (33) durch einen Fit mit dem Modell in Einklang gebracht werden.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-5 dadurch gekennzeichnet, dass im Modellspeicher (31 ) ein Modell hinterlegt ist, das ein statisches Farbstoff gern isch mit Intensitätsvariation insbesondere der Form I = ∑ a, ει + I„njr ε aufweist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-5 dadurch gekennzeichnet, dass im Modellspeicher ein Modell hinterlegt ist, das ein statisches Farbstoffgemisch mit Spektralvariation insbesondere der Form I = _>_ a. εt + arl + ßr 2 aufweist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-7 dadurch gekennzeichnet, dass eine Farbstoffdatenbank (37) vorgesehen ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 dadurch gekennzeichnet, dass in der Farbstoffdatenbank Daten über Farbstoffe, insbesondere Daten über den Spektralbereich und die Intensität des Farbstoffs gespeichert sind. 0. Verfahren zur Erzeugung eines Bildes (35) eines Objekts (15) insbesondere in einem Mikroskop
(10) wobei mit einer Datenaufnahmeein- richtung (23) Objektdaten aufgenommen werden, dadurch gekennzeichnet, dass ein auf das Objekt (15) bezogenes Modell vorgegeben wird, die Objektdaten in Abhängigkeit von dem Modell sortiert werden und aus den sortierten Daten eine Visualisierung (35) erzeugt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass ein Modell gewählt wird, das ein statisches Farbstoffgemisch mit Intensitätsvariation insbesondere der Form I = T a,ε,- + Istoff ε aufweist.
12. Verfahren nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass ein Modell gewählt wird, das ein statisches Farbstoff gemisch mit Spektralvariation insbesondere der Form I = __ a.-εi + ar, + ßrτ aufweist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Messdaten mit dem Model durch einen Fit in Einklang gebracht werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, dass durch den Fit neue Bilder insbesondere der Form (α;,(ör, ß),7jto ) erzeugt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass auf Veranlassung des Benutzers die strukturellen Bereiche oder die funktionellen Bereiche alleine angezeigt werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass auf Veranlassung des Benutzers die strukturellen Bereiche und die funktionellen Bereiche zusammen angezeigt werden.
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