WO2005103089A1 - 魚類由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖 - Google Patents

魚類由来のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸ハイブリッド鎖 Download PDF

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WO2005103089A1
WO2005103089A1 PCT/JP2005/008326 JP2005008326W WO2005103089A1 WO 2005103089 A1 WO2005103089 A1 WO 2005103089A1 JP 2005008326 W JP2005008326 W JP 2005008326W WO 2005103089 A1 WO2005103089 A1 WO 2005103089A1
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WO
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unit
galnac
glcua
3galnac
chondroitin sulfate
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PCT/JP2005/008326
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuyuki Sugahara
Original Assignee
Maruha Corporation
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the present invention relates to a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain derived from fish, in particular, from shark skin or chrysalis.
  • chondroitin sulfate is composed of disaccharides of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-galactosamine and sulfate residues. Chondroitin sulfate is classified into types such as A, C, D, E, and K, depending on the binding position of the sulfate group. Chondroitin sulfate L is composed of L-iduronic acid instead of D-glucuronic acid, and is called dermatan sulfate.
  • Chondroitin sulphate and dermatan sulphate contain a large number of overlapping sequences built up of disaccharide units with different patterns of sulphation and show huge structural diversity comparable to heparan sulphate.
  • the present inventors have worked to elucidate that various polysulfated chondroitin sulfate and dermatan sulfate chains are involved in neural development.
  • the “D” unit a polysulfated disaccharide unit in chondroitin sulfate and dermatan sulfate with various biological functions [GlcUA (2S) — GalNAc (6S)], “iD”
  • IdoUA stands for L-iduronic acid
  • GlcUA stands for D-Darctic acid
  • GalNAc stands for N-acetyl-D-galatatosamine
  • 2S, 4S and 6S indicate that the binding site of the sulfate group is C-2. Position
  • each neuron develops a characteristic morphology and elongates its axon along a specific pathway to find the correct target cell and form a synapse.
  • Many researchers have found that treating developing brain tissue with chondroitinase ABC and decomposing and removing chondroitin sulfate contained in the tissue causes major abnormalities in neuronal morphogenesis and axonal running. I have. These observations suggest that chondroitin sulfate is involved in neurite axon guidance or in morphological differentiation of neurons.
  • Such polysulfated chondroitin sulfate and dermatan sulfate are known to bind to many heparin-binding growth factors, and their signaling is involved in morphogenesis of hippocampal neurons. Is suggested.
  • Non-Patent Document 1 Hikino, M., Mikami, ⁇ ⁇ , Faissner, A., Vilela-Silva, AC, Pavao, MS, and Sugahara, K. (2003) J. Biol. Chera. 278, 43744-43754 Literature 2 Seno, N. and Meyer, K., Biochim. Biophys. Acta. 78 (1963) 258-264.
  • a new chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain is separated and purified from a part of the fish body excluding teleost fish such as shark skin, and this fraction binds to various growth factors and promotes neurite outgrowth. It has been found that it has an anticoagulant effect, and can be expected to have an effect as a composition for treating neurological diseases. Accordingly, the present invention provides the following aspects:
  • GlcUA (2S) -GalNAc (4S) B unit
  • GlcUA-GalNAc (4S) A unit
  • GlcUA-GalNAc (6S) C unit
  • GlcUA (2S) -GalNAc (6S) D unit
  • at least one unit selected from the group consisting of GlcUA-GalNAc (4S, 6S) E unit
  • unsulfated GlcUA-GalNAc (0 unit)
  • IdoUA IdoUA.
  • chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain according to any one of the above 1 to 3, wherein the degree of sulfation per disaccharide molecule is in the range of 0.70 or more and less than 1.2.
  • a glycosaminodalican comprising the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain according to any of 1 to 5 above;
  • a growth factor binding agent comprising the glycosaminodalican according to 6 above as an active ingredient
  • a neurite outgrowth promoting agent comprising the glycosaminoglycan according to 6 above as an active ingredient
  • An anticoagulant comprising the glycosaminoglycan according to 6 above as an active ingredient
  • a pharmaceutical composition comprising the glycosaminodalican according to 6 above as an active ingredient;
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease comprising the glycosaminodalican according to 6 above as an active ingredient;
  • glycosaminodalican as described in 6 above for producing a growth factor binding agent, a neurite outgrowth promoter, an anticoagulant or a composition for treating a neurodegenerative disease
  • GlcUA-GalNAc (4S) (A unit), GlcUA (2S)-GalNAc (4S) (B unit).
  • GlcUA-GalNAc (6S) (C unit), GlcUA (2S) -GalNAc (6S) ( D unit), GlcUA-GalNAc (4S, 6S) (E unit), GlcUA (2S); 3l-3GalNAc (4S, 6S) (T unit) and unsulfated GlcUA-GalNAc (0 [ At least one unit selected from the group consisting of IdoUA al-3GalNAc (4S) (iA unit), IdoUA (2S) -GalNAc (4S) (iB unit), and IdoUA ⁇ 1 -3GalNAc (6S) (iCut), IdoUA (2S) -GalNAc (6S) (iD unit), IdoUA- GalNAc (4S, 6S) (iE unit) and IdoUA (2S) al-
  • a glycosaminodalican comprising the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain according to 13 above, comprising at least one unit selected from the group consisting of 3GalNAc (4S, 6S) (iTut); 15.
  • a growth factor binding agent comprising as an active ingredient the daricosaminodalican according to 13 or 14 above;
  • a neurite outgrowth promoter comprising the glycosaminoglycan according to 13 or 14 above as an active ingredient
  • a composition for treating a neurodegenerative disease comprising the glycosaminoglycan according to the above 13 or 14 as an active ingredient;
  • a pharmaceutical composition comprising the glycosaminodalican as described in 13 or 14 above as an active ingredient;
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease comprising the glycosaminoglycan according to the above 13 or 14 as an active ingredient;
  • daricosaminoglycan according to 13 or 14 above for producing a growth factor binding agent, a neurite outgrowth promoting agent, or a composition for treating a neurodegenerative disease.
  • FIG. 1 shows the results of anion-exchange HPLC analysis of chondroitinase digests of shark skin-derived chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains (SS-CS / DS) (Native).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of gel filtration analysis of digests of isolated SS-CS / DS (Native) with various chondroitinases.
  • SS-CS / DS (Native) (1 ⁇ g) with chondroitinase AC-1 (A), chondroitinase B (B), or chondroitinase B followed by chondroitinase AC-1 (C)
  • the digest was labeled with 2AB and analyzed on a Superdex Peptide column.
  • the elution positions of the standard disaccharide oligosaccharides are indicated by arrows: 1 (CS-10 saccharide); 2 (CS-8 saccharide); 3 (CS-6 saccharide); 4 (CS-4 saccharide); Five
  • FIG. 3 shows SS-CS / DS (Native) ( ⁇ ), SS-CS / DS1.0M NaCl elution fraction (1.0M) ( ⁇ ), and SS-CS / DS1.5M for molecular size determination.
  • FIG. 4 shows the results of gel filtration column mouth chromatography on Superdex-200 performed on the NaCl-eluting fraction (1.5 M) (fraction).
  • FIG. 4 shows the binding of various growth factors to SS-CS / DS (1.0 M, 1.5 M).
  • A The results of the responses to SS-CS / DS (1.0M) (open bars) and SS-CS / DS (1.5M) (solid bars) are shown.
  • B The results of the response to heparin are shown as a control experiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the binding between SS-CS / DS (1.5 M) and BDNF or GDNF using a BIAcore J system.
  • the black bars are SS-CS / DS (1.5M), and the white bars are chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains (HN-
  • B and C show sensorgrams (B: BDNF and C: GDNF) obtained with various concentrations of BDNF and GDNF. Arrows indicate the start of each of the association and dissociation phases.
  • Fig. 7-1 shows the neurite outgrowth-promoting action of three SS-CS / DS preparations (Native, 1.0M, 1.5M).
  • Three samples of SS-CS / DS (Native, 1.0M, 1.5M) (0.67 // g as peronic acid) were coated on a cover glass pre-coated with P-0RN, E16 Primary cultures of hippocampal neurons derived from mouse embryos were cultured thereon for 24 hours in the minimum essential medium for idal.
  • the average length of the longest neurites is 100 randomly selected cells cultured on three SS-CS / DS preparations (Native, 1.0M, 1.5M). Neurons were weighed.
  • Chondroitin sulfate chain (CS-E) derived from squid cartilage was designated as positive control (P ⁇ 0RN), and the coat with P-0RN alone was designated as negative control / (P-0RN) ( ⁇ : p ⁇ 0.001, ⁇ : p ⁇ 0 . 005).
  • B is the result of similarly examining SS-CS / DS (Native) digested with various chondroitinases (ns: no significant difference, ⁇ : p ⁇ 0. 001, *: p ⁇ 0. 05) ).
  • the number of neurites induced by each fraction not digested with the enzyme is graphed (n.s .: no significant difference, ⁇ : p ⁇ 0.001).
  • the value obtained from two separate experiments is expressed as the average soil SE.
  • Figure 7-2 is a photograph showing the neurite outgrowth-promoting effect of three SS-CS / DS preparations (Native, 1.0M, 1.5M).
  • D shows the morphology of neurons cultured on SS-DS
  • E shows the morphology of neurons cultured on a cover glass coated only with P-0RN.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the anti-factor Ila activity of three samples of SS-CS / DS (Native, 1.0M, 1.5).
  • Heparin (Hata) and DS (Garden) derived from pig skin are positive control It is a rule.
  • SS-CS / DS (Native) ( ⁇ ), SS-CS / DS (1.OM) ( ⁇ ), and SS-CS / DS (1.5M) (X) were tested.
  • Figure 9-1 shows a sensorgram of immobilized HN-CS / DS depending on the growth factor concentration.
  • the growth factors tested are FGF-2 (A) and FGF-10 (B).
  • FIG. 9-2 is a diagram showing a sensorgram of immobilized HN-CS / DS depending on the growth factor concentration.
  • the growth factors tested are FGF-16 (C) and FGF-18 (D).
  • FIG. 9-3 is a diagram showing a sensorgram of immobilized HN-CS / DS depending on the growth factor concentration.
  • the growth factors tested are position (E) and PTN (F).
  • FIG. 9-4 is a diagram showing a sensorgram of immobilized HN-CS / DS depending on the growth factor concentration.
  • the growth factors tested are HB-EGF (G) and VEGF (H).
  • FIG. 10 is a diagram showing sensorgrams superimposed when HN-CS / DS is immobilized on a sensor chip and BDNF and GDNF are allowed to flow on the sensor chip at various concentrations.
  • FIG. 11-1 is a photograph showing the neurite outgrowth-promoting effect of the HN-CS / DS digest.
  • A is a neuron cultured on a cover glass coated with HN-CS / DS, and B is a cell cultured only on the P-0RN coat on the cover glass.
  • FIG. 11-2 is a diagram showing the neurite outgrowth-promoting effect of the HN-CS / DS digest.
  • C indicates the length of the neurites, and D indicates the number of neurites.
  • the present invention relates to a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain and glycosaminodalican containing the same. Further, the present invention relates to a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain containing a disaccharide of GlcUA (2S) -GalNAc (4S), and a glycosaminoglycan containing the same.
  • Such glycosaminoglycan of the Haiburitsu de chain 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferred properly 90% or more, particularly preferably 95% or more (all w / w ), Most preferably, no other sugar chain component is detected, and glycosaminoglycans substantially consisting only of the above-mentioned hybrid chains.
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain and daricosaminodalican containing the same in the present invention are covalently bonded to the bran chain.
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain refers to a polysaccharide chain having a disaccharide unit structure, including both a disaccharide unit possessed by chondroitin sulfate and a disaccharide unit possessed by dermatan sulfate.
  • the type and content of the disaccharide unit containing the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain are not limited. For example, the following structure has been isolated from chondroitin sulfate.
  • Such a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain can be separated and purified from fish bodies other than teleost fish.
  • fish other than teleost fish include cartilaginous fish and fish belonging to the conch.
  • the fish body is not limited, but can be appropriately selected depending on the type of fish, the content of the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain, and the ease of separation / purification.
  • the notochord of shark skin ⁇ ⁇ can be used. From the sample, acetone extraction and protease treatment.
  • the daricosaminodarican fraction obtained by extraction with triclo-mouth acetate was further subjected to CPC precipitation, hyaluronidase digestion, nitrite treatment, desalting, and chondroitin sulfate / dermatan sulfate.
  • a hybrid chain fraction is obtained.
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain fraction with an anion exchange resin the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain adsorbed on the resin is removed.
  • fractions of displacement has a substantially equal molecular weight, the average molecular weight, for example, shark skin-derived chondroitin sulfate / dermatan sulfate Haipuriddo chain cases, about 65 ⁇ 7 5 kDa, preferably about 68 ⁇ 7 2 kDa, and most preferably about 70 kDa, if the j Asian swamp eel notochord derived chondroitin sulfate / dermatan sulfate Haipuriddo chain is about 18 kDa.
  • shark skin-derived chondroitin sulfate / dermatan sulfate Haipuriddo chain cases about 65 ⁇ 7 5 kDa, preferably about 68 ⁇ 7 2 kDa, and most preferably about 70 kDa, if the j Asian swamp eel notochord derived chondroitin sulfate / dermatan sulfate Haipuriddo
  • the degree of sulfation per disaccharide molecule of the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain derived from shark skin in the present invention is less than 1.2, that is, preferably about 0.70 or more and less than 1.20, more preferably about 0.80 or more and less than about 1.20, particularly preferably in the range of about 0.87 to 1.17.
  • Each step of separating and purifying chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains from fish other than teleost fish such as shark skin and eel chords may be performed by methods known to those skilled in the art. As an example, embodiments of a series of steps are described below in the Examples section, but are not limited to the described method.
  • chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain may be referred to as CS / DS.
  • those derived from shark skin may be prefixed with SS (shark skin), and those derived from dung eel chord may be prefixed with HN (hagfish notochord).
  • the fraction obtained from the above-mentioned hyaluronidase digestion, nitrous acid treatment, and desalting from a shark skin sample is subjected to SS-CS / DS (Native) and further to an anion exchange resin to obtain about 1.0 M N
  • the fraction eluted with .aCl and the fraction eluted with about 1.5M NaCl are called SS-CS / DS (1.0M) and SS-CS / DS (1.5M), respectively.
  • each fraction of these chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains derived from shark skin was performed by digestion with chondroitinase ABC, B or AC-1.
  • the major component of each SS-CS / DS fraction was GlcUA j3 1-3GalNAc (4S) (A unit) or]: doUA o _3GalNAc (4S) (iA unit) and GlcUA ⁇ l-3GalNAc (6S) (Cunit) or IdoUAall-3GalNAc (6S) (iCunit).
  • chondroitin sulfate and dermatan sulfate in these fractions consisted of very diverse disaccharide molecules, and in particular, disaccharide molecules having the structure of GlcUA (2S) -GalNAc (4S) were detected.
  • Such a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain containing a disaccharide molecule having the structure of GlcUA (2S) -GalNAc (4S) was found for the first time in the present invention, and chondroitin sulfate / dermatan sulfate derived from shark skin. It is considered to be a property peculiar to the hybrid town.
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain derived from shark skin always contains GlcUA (2S)-GalNAc (4S) (B unit), and further contains GlcUA-
  • GalNAc (4S) A unit
  • GlcUA- GalNAc (6S) C unit
  • One unit ie, one, two, three, four or four units
  • one IdoUA 1 3GalNAc (4S) iA unit
  • IdoUA-GalNAc (4S, 6S) iD unit
  • at least one unit ie one, two, three, four or five units selected from the group consisting of IdoUA-GalNAc (4S, 6S) (iE unit). Including. Since it is a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain, GlcUA (2S)-GalNAc (4S) (B unit) and GlcUA-GalNAc (4S)
  • At least one member of the group of chondroitin sulfate units consisting of GlcUA-GalNAc (0 [unit]) and IdoUA al-3GalNAc (4S) (iA unit), IdoUA (2S) -GalNAc (4S)
  • IB unit IdoUA al-3GalNAc (6S) (iC unit), IdoUA (2S) -GalNAc (6S) (iD unit) and at least one of the dermatan sulfate units consisting of IdoUA-GalNAc (4S, 6S) (iE unit).
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain derived from the eel chord of the green eel GlcUA ⁇ l-3GalNAc (4S) (A unit), GlcUA ⁇ 1-3GalNAc (6S) (C unit), GlcUA j8 3GalNAc (4S, 6S) (E unit), GlcUA (2S) ⁇ At least one unit selected from the group consisting of l-3GalNAc (4S, 6S) (T unit) and unsulfated GlcUA-GalNAc (0 unit) (ie, one, two, three units) , 4 or 5 units), and IdoUA ⁇ 1-3GalNAc (4S).
  • IA unit IdoUA11GalNAc (6S) (iC unit), IdoUA11-3GalNAc (4S) , 6S) (iE unit) and IdoUA (2S) 1-3GalNAc (4S, 6S) (iT unit) at least one unit selected from the group consisting of forces (ie one, two, three or 4 units).
  • chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains derived from fish other than teleost fish including sharks and blue eels are GlcUA-GalNAc (4S) (A unit).
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain of the present invention can be used for various growth factors (fibroblast growth factor (FGF) -2, FGF-10, FGF-18, heparin-binding epithelial cell growth factor (HB-EGF)). , Mitodocaine (MK), pleiotropin pin (PTN), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) with high affinity.
  • FGF fibroblast growth factor
  • FGF-10 fibroblast growth factor
  • FGF-18 heparin-binding epithelial cell growth factor
  • HB-EGF heparin-binding epithelial cell growth factor
  • MK Mitodocaine
  • PDN pleiotropin pin
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain of the present invention exhibits a neurite outgrowth promoting action and an anticoagulant action. .
  • chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains derived from fish other than teleost fish, such as those derived from shark skin and scallop chordae are useful as therapeutic or preventive agents for neurodegenerative diseases and promotion of neural system development. Furthermore, it is useful as an anticoagulant.
  • the present invention relates to a glycosaminoglycan comprising a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain derived from fish other than teleost fish, such as a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain contained in the above-mentioned fraction derived from shark skin and hagfish chord.
  • growth factors FGF-2, FGF-10, FGF-18, HB-EGF, MK, PTN, BDNF and GDNF binding agents, neurite outgrowth promoters, and anticoagulants.
  • daricosaminodalican containing a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain is completely or partially purified from shark skin, and the obtained fraction is, if necessary, added to a suitable carrier and / or solvent. It is good to mix with.
  • the daricosaminodalican can be used as a pharmaceutical composition.
  • the glycosaminoglycan can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases. Since a neurodegenerative disease involves degeneration and loss of neurites of nerve cells, the glycosaminodalican can prevent this or promote the growth of new neurites, so that the progression or symptom of the disease is caused by the disease. Can be reduced.
  • ⁇ 20 / _f g / ml preferably :! ⁇ 10 g / ml, more preferably :! At a concentration of ⁇ 5 / ig / ml, It is preferred that they act.
  • glycosaminodalican containing the above-mentioned chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain or a fraction containing the same is applied as a neurite outgrowth promoter
  • a glycoprotein containing a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain as described above is obtained from shark skin.
  • the fraction obtained by fully or partially purifying the saminoglycan is administered in such a way that it can contact the nerve cells of the target individual in need of promoting neurite outgrowth. be able to.
  • a person skilled in the art can select an appropriate administration method, but it is preferable to administer it locally so that the elongation can be delivered to a nerve cell or a periphery of the desired nerve cell. It is preferable to administer such that the concentration at the time of delivery is about 1 to 10 ⁇ g / ml, more preferably about 1 to 5 / z g / ml, and still more preferably about 2 ⁇ g / ml.
  • the same applies to fish other than teleost fish such as glycosaminoglycans containing chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains derived from the eel chord.
  • the above-mentioned dalicosaminodalican or a fraction containing it is applied as a growth factor binding agent, an appropriate amount (depending on the target growth factor) of the above glycosaminodalican or The fraction containing it is mixed with a growth factor and brought into contact.
  • glycosaminoglycans Dali cans 0. l / g or more, preferably mixed with the blood at a concentration of 1 ⁇ 10 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, by contacting, anticoagulant activity is exhibited.
  • the subject of these applications may be any mammal.
  • the skin of the blue shark Prionace glauca (85 g dry weight) was defatted three times by acetone extraction and air-dried completely. After suspending in water, the suspension was kept in boiling water for 30 minutes to inactivate the protease.
  • borate-NaOH buffer and calcium chloride to a final concentration of 0.1 and 10 respectively, and for 24 hours at 60 ° C protease (actinase: 2% by weight of the sample) Digested. And after 24 hours and 48 hours, allowed to newly Akuchinaze after (1 wt 0/0 of the sample) was added digestion, centrifuged added so that 50% of trichloroacetic port acetate to 5% final concentration, precipitates proteins Then, each suspension was resuspended in 5% trichloroacetic acid and centrifuged again to recover each supernatant.
  • glycosaminoglycan-containing precipitate is solubilized with 0.02 M Na 2 SO 4 , and 10% (w / v) cetylpyridinium chloride (CPC) /0.02 M Na 2 SC ⁇ is added.
  • CPC cetylpyridinium chloride
  • the obtained flocculent sediment was redissolved in a 100: 15 (v / v) 2M NaCl / ethanol solution, and 3 volumes of 99.5% ethanol was added to precipitate again.
  • the above steps were repeated three times and finally precipitated in water and dried.
  • a similar CPC precipitation step was performed while maintaining the critical electrolyte concentration at 0.5 M NaCl to remove hyaluronic acid and concentrate glycosaminodalican.
  • the precipitate obtained after hyaluronidase digestion were treated with 40 minutes at room temperature to stand at is nitrous acid obtained by mixing 0. 5 mmole nitrite Bariumu with the same amount of 0. 5 mmol e sulfate. A freshly prepared aliquot of nitrite was added again and allowed to stand for another 40 minutes.
  • the desalted glycosaminodalican was passed through a Sep-Pak C18 cartridge column and eluted with water, followed by 100% methanol.
  • the free peptide-free chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain eluted here was called SS-CS / DS (Native).
  • This preparation contains a small amount of a peptide covalently bonded to a sugar chain (about 0.6 to 1.2% by weight).
  • SS-CS / DS (Native) is passed through an anion exchanger cartridge and stepped with 300 mM phosphate buffer containing 0.15, 0.5, 1.0, 1.5 or 2.0 M NaCl. After elution, the mixture was desalted with 50 mM pyridine acetate buffer (pH 5.0; eluent) using PD-10 force column.
  • the fractions eluted with the 1.0 and 1.5 M buffers containing NaCl contain 20% and 80% chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chains, respectively, and the SS-CS / DS ( 1.0M) and SS-CS / DS (1.5M).
  • Table 1 shows the purification yields.
  • table 1 SS-CS / DS yield
  • Disaccharide composition analysis was performed by analyzing digests of chondroitinase ABC, B or AC-1.
  • the disaccharide labeled with 2AB is 16 mM Diluted by 1 and analyzed by anion exchange HPLC (PA-03 silica column using 16mM and 530mM Na ⁇ PO ⁇ solvents).
  • the 3/3 samples (Native, 1.0M, 1.5M) were digested with lOmlU chondroitinase ABC (total volume of 10 il), and 1/3 each was digested with lOmlU chondro 4- or chondro 6-.
  • the digest was subjected to sulfatase digestion, and the digest was labeled with 2AB and analyzed by HPLC as described above.
  • Table 2 shows the results of the digestion and analysis of three SS-CS / DS samples (Native, l.OM, 1.5M).
  • SS-CS / DS (Native), SS-CS / DS (l.OM) and SS-CS / DS (1.5M) all have AHexUAal-3GalNAc (ADi-OS), ⁇ at various ratios HexUA Hi 1—3GalNAc (6S)
  • the main constituents of the three SS-CS / DS standards are ⁇ Di-4S and ⁇ Di-6S, SS-CS / DS (Native), SS-CS / DS ( l.OM) and the ratio of ADi-4S and ⁇ -6S to the total disaccharide in SS-CS / DS (1.5M) were 48.9% and 21.3 ° /, respectively. , 43.5%, 21.3%, 55.0% and 16.6% (Table 2).
  • the ratio of ⁇ Di-0S is SS-CS / DS (1.0M) force 23.8%, compared with SS-CS / DS (Native) (10.5%) and SS-CS / DS (1.5M) (5.8%) And it was expensive.
  • SS- CS / DS (1.5M) is disulfated disaccharide (ADi - diS D, ADi - diS D Oyopi ADi - diS c) ratio of is 22.6%
  • SS-CS / DS (Native) has a wide variety of different sulfation degrees.
  • chondroitin sulfate and dermatan sulfate derived from marine organisms including shark cartilage, squid cartilage, sea squirt, sea squirt, sea urchin and sea eel, which have been isolated so far, are ⁇ E '' unit, ⁇ iE '' unit, and ⁇ D Unit, iD unit or iBJ
  • iA unit or IdoUA (2S) -GalNAc (4S) (iB unit), but rather as GlcUA-GalNAc (4S) (A unit) or GlcUA (2S) -GalNAc (4S) (Bunit) Suggest to do. Also, the majority of the iA units or iB units do not form clusters and are therefore considered to be resistant to chondroitinase B digestion.
  • Chondroitinase B did not release A Di-6S. Since the chondroitinase was detected to some extent after AC-1 digestion, the ability of all 6-0 sulfated units to exist as GlcUA-GalNAc (6S) (C unit) or IdoUA-GalNAc (6S) ( (iC unit). These may be resistant to the enzyme or may be contained in sequences that are resistant to the enzyme.
  • the SS-CS / DS sample was hardly detected by the chondroitinase AC-1 digestion of three SS-CS / DS samples (Native, 1.0M, 1.5M), and the SS-CS / DS sample Non-sulfated and monosulfated disaccharides, including ADi-0S, ADi-6S and ADi-4S, were detected in only about 10% of the total amount of disaccharides in them (Table 2). This result suggests that at least a part of the 4-0 sulfated unit and the 6-0 sulfated unit are present as “A” and “CJ units”.
  • Decasaccharide or larger oligosaccharides were less in chondroitinase AC-I digest (FIG. 2A) than in chondroitinase B digest (FIG. 2B). This was in favor of a somewhat higher ratio of GlcUA than IdoUA.
  • the disaccharide obtained by digestion of either chondroitinase probably consists of a unit containing GlcUA (10 ° /.) And a unit containing IdoUA (2%). Indicates the presence of adjacent sequences.
  • fractions corresponding to the two disaccharides chondroitinase AC- 1 digests, respectively A Di-diS E as a major component, A Di as a minor component - there is diS B To do so.
  • disulfated disaccharide chondroitinase B digest, A Di- diS B as main components, A Di as a small amount component - indicates that there is diS E.
  • the “B” unit containing GlcUA (GlcUA (2S) -GalNAc (4S)) was detected for the first time. Although the values for these units shown in Table 2 are very low, they are only cuttable units. Therefore, it is highly probable that other B units are frequently included. This B unit may be involved in the function of SS-CS / DS.
  • the molecular size of the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain was measured by gel filtration on a Superdex 200 column (10 ⁇ 300 mm). Three samples of SS-CS / DS (Native, 1. OM, 1.5 M) (40 ⁇ g) were loaded on the column, and eluted with 0.2 M ammonium acetate at a flow rate of 0.3 ml / min. The eluted fraction for 3 minutes was collected in one fraction, evaporated to dryness, and dissolved in 100 1 water. Measurements were as previously reported (Chandrasekhar, S., et al (1987) Anal Biochem. 161, 103-108).
  • This molecular weight is as follows: chrysalis of chrysalis (18 kDa), pig skin (l 9 kDa), eel skin
  • any SS-CS / DS preparation (1.0 ⁇ , 1.5M) Also showed a high interaction response with all growth factors except FGF-1, but the response was dependent on the growth factor.
  • the degree of coupling also differs depending on the SS-CS / DS standard (1.0M, 1.5M), and SS-CS / DS (1.5M) is higher than SS-CS / DS (1.0M) Responsiveness was induced ( Figure 4).
  • SS-CS / DS In terms of the number of growth factors that bind to glycosaminodalican chains of the same length, SS-CS / DS (1.5M) has several times higher binding ability than CS-H, even when the binding ability is expressed. (Table 3, right column). Despite several times lower than Hep, the degree of sulfation of SS-CS / DS (1.5 M)
  • Hippocampus were isolated from el 6 mouse embryos - Yulong dispersed on the cover glass at a density of 10, 000 cells / mm 2 a, 37 ° under C0 2 5% by Eagle's minimum essential medium (:, 24 hours The cells were then fixed and immunostained using monoclonal antibodies to neurofilament (NF) and microtubule-associated protein (MAP2).
  • NF neurofilament
  • MAP2 microtubule-associated protein
  • Immunostained cells on each coverslip were counted under a microscope. The length of the longest neurites and the number of neurites in randomly selected cells were measured using image analysis software (MacSCOPE; Mitani Corporation, Fukui, Japan).
  • the neurite outgrowth-promoting activity is indicated by the length of the longest neurite outstretched.
  • the neurite outgrowth promotion was observed in the three samples of SS-CS / DS (Native, 1.0 ⁇ , 1.5 ⁇ ). Also exceeded CS--(Fig. 7-1A).
  • the neurite outgrowth promoting activity was higher in the order of SS-CS / DS (Native), SS-CS / DS (1.5M), and then SS-CS / DS (1.0M).
  • Anti-factor Ila activity is 1 ⁇ 10 // ⁇ / ⁇ 1 SS-CS / DS containing 3 standards (Native, 1.0M, 1.5M) 50mM Tris-HC1 buffer containing 227mM NaCl 100 ⁇ 1 ( ⁇ 8.3) and normal human plasma 60 ⁇ 1 and human thrombin (1.2 ⁇ units / ml) 40 zl were measured by incubating at 25 ° C for 1 minute (Sakai, S et al. (2003) Carbohydr. Res. 338, 263-269). The araidolytic activity of thrombin was determined by measuring the change in absorbance at 405 nm for 100 seconds after adding 100 1 of 1.9 mol / ml chromozym TH. The change in absorbance was proportional to the residual thrombin activity. Heparin and dermatan sulfate from pig skin were used as positive control.
  • SS-CS / DS Three samples of SS-CS / DS (Native, 1.0M, 1.5M) showed the same inhibition of thrombin activity as the positive control. SS-CS / DS (Native) showed slightly higher anti-factor Ila activity than the other two SS-CS / DS (1.0 M 1.5 M) (FIG. 8).
  • Notochord of hagfish Eptatretus burgeri was treated with acetone, and the suspension was digested with pronase. The protein was precipitated and centrifuged by adding 20% trichloroacetic acid, and the supernatant was collected. Two times the amount of ethanol containing 2.5% calcium acetate was added to precipitate daricosaminodalican. Darikosami Nogurikan mixture through Dowex 1-C1- column and eluted stepwise with NaCl solution was removed by dividing the heparan sulfate for 2 ⁇ 0M fraction to follow the method of Shively and Cornad. After nitrous acid treatment, neutralized with Na 2 C0 3 in 0.
  • the fraction eluted with 2.0 M NaCl contained a chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain (CS / DS chain).
  • the CS / DS chain thus isolated from the notochord of the hagfish Eptatretus burgeri is referred to herein as HN-CS / DS.
  • Chondroitin sulfate / dermata is obtained by gel filtration on Superdex 200 column (10 X 300 mm). The molecular size of the CS / DS chain was measured. The HN- CS / DS and loaded into column and eluted with acetic acid Anmoniumu of 0. 2M at a flow rate of 0. 3 ml / min. The eluted fraction for 3 minutes was collected in one fraction, evaporated to dryness, and dissolved in 100 1 water. Measurement already reported
  • HN-CS / DS When the molecules of HN-CS / DS were examined by gel filtration column chromatography, the average molecular weight of HN-CS / DS was 18 kDa, which was close to that of dermatan sulfate (19 kDa) derived from pig skin and dermatan sulfate (14 kDa) derived from eel skin. was something.
  • Disaccharide composition analysis was performed by analyzing digests of chondroitinase ABC, B or AC-1.
  • HN-CS / DS was digested with either lOmlU chondroitinase ABC, 5 mlU chondroitinase AC-1, or lmlU chondroitinase B, and the digests were reported (Kinoshita , A., Sugahara, K (1999) Anal. Biochera. 269, 367-378), labeled with 2-aminobenzamide (2AB) (excess 2AB is water: cloth form 1: 1 (v / v) Removed with the mixture).
  • 2-aminobenzamide (2AB 2-aminobenzamide
  • HN-CS / DS was digested with chondroitinase ABC, AC-1 or B.
  • Orchid-CS / DS is composed mainly of A HexUA and 1-3GalNAc (4S, 6S) ( ⁇ Di-diS E ), ⁇ HexUA was 1-3GalNAc (4S) (ADi-4S). Also, AHexUA ⁇ 1-3GalNAc (6S) Di-6S), ⁇ HexUA al-3GalNAc ( ⁇ Di—OS), ⁇ HexUA (2S) al-3GalNAc (4S, (ADi-triS) (Table 6) Table 6
  • HN-CS / DS The interaction analysis between HN-CS / DS and various growth factors (FGF-2, FGF-10, FGF-16, FGF-18, PTN, MK, HB-EGF, VEGF) was performed using the BIAcore system (BIAcore, Uppsala, Sweden). Power rice tick parameters k a, k d Oyopi were calculated using the BIA evaluation 3 ⁇ 1 software.
  • Fig. 9-1 shows the FGF-2 (A), FGF-10 ( ⁇ ) (Fig. 9-1), FGF-16 (C), and FGF-18 (Fig. 9-4) of HN-CS / DS.
  • D (Fig. 9-2), ⁇ ( ⁇ ), PTN (F) (Fig. 9-3), HB-EGF (G), VEGF (H) (Fig. 9-4). All growth factors examined showed a typical growth factor binding pattern.
  • ⁇ -Analysis of the interaction between CS / DS, BDNF and GDNF was performed using the BIAcore J system (BIAcore, Uppsala, Sweden). Biotin-labeled micro-CS / DS was immobilized on a sensor chip coated with streptavidin, and BDNF and GDNF were allowed to flow at various concentrations over the sensor chip (high flow rate (601 / min)). . The binding phase was 2 minutes and the dissociation phase was 3 minutes. The force parameters k a , k d and K d were calculated using BIA evaluation 3.1 software (Table 8).
  • HN-CS / DS is fixed on the sensor chip, and BDNF and GDNF are mixed at various concentrations.
  • Figure 10 shows the sensorgram when it was flown over the sensor chip.
  • HN-CS / DS The affinity of HN-CS / DS for GDNF was about 10 times higher than that of heparan sulfate (HS) and GDNF, and the affinity for BDNF was significantly higher at 360 times. These high binding affinities are due to chondroitin sulfate, dermatan sulfate or
  • NF eurofilament
  • MAP2 microtubule-associated protein
  • the immunostained cells of each coverslip were counted under a microscope.
  • the length of the longest neurites and the number of neurites in randomly selected cells were measured using Image Analysis Software (Mac SCOPE; Mitani Corp., Tokyo, Japan).
  • the neurite outgrowth-promoting activity was indicated by the length of the longest neurite outgrowth, indicating that neurite outgrowth was promoted as compared to control (Fig. 11-12C).
  • the present invention provides a novel chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain and a fraction containing the same, which bind to various growth factors and exhibit a neurite outgrowth promoting action and an anticoagulant action.
  • a composition for neurological treatment is provided.
  • the chondroitin sulfate / dermatan sulfate hybrid chain of the present invention is derived from fishes other than teleost fish such as shark skin and hagfish, and useful uses of fish have been found by the present invention. All publications cited herein are incorporated by reference in their entirety. It will be readily apparent to those skilled in the art that various modifications and alterations of the present invention are possible without departing from the technical concept and the scope of the invention described in the appended claims. The present invention is intended to cover such modifications and variations.

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Abstract

　種々の増殖因子との結合作用、神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を有する、新規コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を提供し、さらに神経性疾患治療用組成物を提供する。　新規コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を硬骨魚類以外の魚類体より分離・精製した。サメ皮を用いた場合、該ハイブリッド鎖の平均分子量は65～75kDaで、硫酸化度が二糖１分子当たり0.7以上1.20未満の範囲内であり、かつGlcUA(2S)-GalNAc(4S)の二糖を含む。該ハイブリッド鎖が、種々の増殖因子と結合可能であり、さらに神経突起伸長促進作用および抗凝血作用を有している。

Description

明細書
魚類由来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖 技術分野
本発明は、 魚類由来、 特にサメ皮またはヌタウナギ脊索由来のコンドロイチン 硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖に関する。 背景技術
動物組織にはグリコサミノダリカンと呼ばれる一群の硫酸化糖鎖が存在してお り、 タンパク質に共有結合したプロテオダリカン分子として存在し、 細胞の増殖 および分化、 組織の形態形成などに必須の役割を演じている （Lewandowska, K. , Choi, H. U. , Rosenberg, L. C.， Zardi, L. , and Culp, L. A. (1987) J. Cel l Biol. 105， 1443-1454、 Yamaguchi, Y.， Mann, D. M.， and Ruoslahti, E. (1990) Nature, 346, 281-284、 Lyon, M.， Deakin, J. A. , Rahmoune, H. , Fernig, D. G. , Nakamura, T.， and Gallagher, J. T. (1998) J. Biol. Chera. 273， 271-278 , Trowbridge, J. M.， and Gal lo, R. L. (2002) Glycobiology 12, 117R-125R) 。
グリコサミノグリカンの中で、 コンドロイチン硫酸は D-グルクロン酸と N-ァセ チル -D -ガラク トサミンの 2糖と硫酸残基で構成されている。 なお、 コンドロイ チン硫酸は硫酸基の結合位置によって、 A、 C、 D、 E、 Kなどのタイプに分類され ている。 コンドロイチン硫酸 Βは D-グルクロン酸の代わりに L-ィズロン酸が構成 糠であり、 デルマタン硫酸と呼ばれている。
コンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸には、 異なるパターンの硫酸化を受けた 二糖ュニットで構築される多数の重複配列が含まれ、 へパラン硫酸に匹敵する巨 大な構造上の多様性を示す。
本発明者は、 神経発達において種々の多硫酸化コンドロイチン硫酸およびデル マタン硫酸鎖が関与していることの解明を手がけてきた。 そして、 さまざまな生 体機能を有するコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸における、 多硫酸化さ れたニ糖ユニットである 「D」 ユニット [ GlcUA (2S) — GalNAc (6S) ]、 「iD」 ュ ニット [ IdoUA (2S) -GalNAc (6S) ]、 「E」 ュニット[ GlcUA- GalNAc (4S, 6S) ] と 「iE」 ユニッ ト [ IdoUA- GalNAc ( 4S, 6S) ]の重要性に注目した （ここで、 IdoUAは L-ィズロン酸を、 GlcUAは D -ダルク口ン酸を、 GalNAcは N-ァセチル- D -ガ ラタトサミンを表す。 また 2S、 4S、 6Sは硫酸基の結合部位が C- 2位、 C - 4位、 C - 6 位に結合していることを表す） 。
神経回路の形成過程において、 各神経細胞は特徴的な形態を発達させると共に、 その軸索を特異的な経路に沿って伸長させることにより、 正しい標的細胞を見出 し、 シナプスを形成する。 これまで多くの研究者が、 発達期脳組織をコンドロイ チナーゼ ABCで処理し、 組織中に含まれるコンドロイチン硫酸を分解除去すると、 神経細胞の形態形成および軸索走行に大きな異常が生じることを見出している。 このような観察から、 コンドロイチン硫酸は、 神経突起の軸索誘導に関与する、 あるいは神経細胞の形態分化に関与すると考えられてきた。
本発明者は、 マウス 1 6ョ目胚より調製した海馬神経細胞を、 各種コンドロイ チン硫酸 （デルマタン硫酸） 標品を塗布した基質上で培養することにより、 特定 の構造を有する糖鎖が神経突起伸長促進作用を示すことを見出した。 なかでも D または iDュニットを多く含むものは樹状突起様の突起を伸展させ、 Eまたは iEュ -ットに富むものは、 長い軸索様の突起を伸長させることを見出した（Hikino, M. , Mikami, T.， Faissner, A.， Vilela - Silva, A. C.， Pavao, M. S. , and Sugahara, K. (2003) J. Biol. Chem. 278， 43744—43754、 Sugahara, K and Yamada, S. , Trends in Glycoscinence and Glycotechnology vol. 12 No. 67 pp. 321- 349を参照のこと）。
このような、 多硫酸化されたコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸は、 多 くのへパリン結合性成長因子と結合することが知られており、 これらの情報伝達 が海馬神経細胞の形態形成に関与することが示唆されている。
以上のような事実から、 神経性疾患の治療薬としての使用に有用な、 ユニーク な構造と顕著な活性を有するグリコサミノダリカンの供給源を探索することが期 待されている。 海洋生物、 例えばサメなどの皮から、 ムコ多糖が精製されたこと は既に報告されている（Seno, N. and Meyer, K. , Biochim. Biophys. Acta. 78 (1963) 258-264)。 非特許文献 1 Hikino, M.， Mikami, Τ·， Faissner, A. , Vilela - Silva, A. C.， Pavao, M. S. , and Sugahara, K. (2003) J. Biol. Chera. 278, 43744 - 43754 非特許文献 2 Seno, N. and Meyer, K. , Biochim. Biophys. Acta. 78 (1963) 258-264
非特許乂献 3 Sugahara, K and Yamada, S.， Trends in Glycoscinence and Glycotechnology vol. 12 No. 67 pp. 321-349 発明の開示
種々の増殖因子との結合作用、 神経突起伸長促進作用およぴ抗凝血作用を有す る、 魚類、 例えば硬骨魚類を除く魚類、 特にサメ皮またはヌタウナギ脊索由来の コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖を提供し、 さらに祌経性疾 患治療用組成物を提供することが、 本発明の課題である。
新規コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖を、 サメ皮等の硬骨 魚類を除く魚類の体の一部より分離，精製し、 該画分が、 種々の増殖因子と結合 すること、 さらに神経突起伸長促進作用おょぴ抗凝血作用を有していることを見 出し、 さらに神経性疾患治療用組成物としての効果が期待できる。 したがって、 本発明は以下の態様：
1 . GlcUA (2S) -GalNAc (4S) (B ユニット） の二糖を含むコンドロイチン硫酸/デ ルマタン硫酸ハイプリッド鎖； ·
2 . GlcUA (2S) -GalNAc (4S) (B ユニット） を含み、 さらに、 GlcUA-GalNAc (4S) (A ユニット） 、 GlcUA - GalNAc (6S) (C ユニット） 、 GlcUA (2S) -GalNAc (6S) (D ユニット） 、 GlcUA- GalNAc (4S， 6S) (E ユニット） および硫酸化されていない GlcUA- GalNAc (0 [ォ一]ュニット）からなる群から選択される少なくとも 1つのュ ニット、 ならびに IdoUA a l—3GalNAc (4S) (iAユニット）、 IdoUA (2S) ~GalNAc (4S) (iB ユニット) 、 IdoUA a l-3GalNAc (6S) (iCユニット）、 IdoUA (2S) -GalNAc (6S) (iD ユニット） および IdoUA - GalNAc (4S， 6S) (iEユニット） からなる群から選 択される少なくとも 1つのュ-ットを含む、 上記 1に記載のコンドロイチン硫酸 /デルマタン硫酸ハイブリツド；
3 . 平均分子量が 65〜75kDaである、 上記 1、 2記載のコンドロイチン硫酸/デル マタン硫酸ハイプリッド鎖；
4 . 二糖 1分子当たりの硫酸化度が 0. 70以上 1. 2未満の範囲内である、 上記 1〜 3記載のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖；
5 . サメ皮由来である、 上記 1〜4のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸/デ ルマタン硫酸ハイプリッド鎖；
6 . 上記 1〜 5のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブ リッド鎖を含む、 グリコサミノダリカン；
7 . 上記 6記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 増殖因子結合 剤；
8 . 上記 6記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 神経突起伸長促 進剤；
9 . 上記 6記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 抗凝血剤；
1 0 . 上記 6記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 医薬組成物；
1 1 . 上記 6記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 神経変性疾患 を予防または治療するための医薬組成物；
1 2 . 増殖因子結合剤、 神経突起伸長促進剤、 抗凝血剤または神経変性疾患治療 用組成物を製造するための上記 6記載のグリコサミノダリカンの使用；
1 3 . 硬骨魚類を除く魚類由来であるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイ プリッド鎖を含むダリコサミノダリカン；
1 4 . GlcUA-GalNAc (4S) (Aュニット） 、 GlcUA (2S) - GalNAc (4S) (B ュニット） . GlcUA - GalNAc (6S) ( C ュニッ ト） 、 GlcUA (2S) -GalNAc (6S) (D ュニッ ト） 、 GlcUA-GalNAc (4S, 6S) (E ユニット) 、 GlcUA (2S) ;3 l-3GalNAc (4S, 6S) (Tュニッ ト）および硫酸化されていない Gl cUA-GalNAc (0 [ォ一]ユニット）からなる群から選 択される少なくとも 1つのユニット、 ならびに IdoUA a l- 3GalNAc (4S) (iAュエツ ト）、 IdoUA (2S) -GalNAc (4S) (iB ユニット） 、 IdoUA α 1- 3GalNAc (6S) (iCュ-ッ ト）、 IdoUA(2S) -GalNAc (6S) ( iD ユニット） 、 IdoUA- GalNAc (4S， 6S) ( iE ュニ ット） および IdoUA (2S) a l-3GalNAc (4S, 6S) (iTュ-ット）からなる群から選択さ れる少なくとも 1つのュニットを含む、 上記 1 3記載のコンドロイチン硫酸/デ ルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノダリカン； 1 5 . 上記 1 3または 1 4に記載のダリコサミノダリカンを活性成分として含む、 増殖因子結合剤；
1 6 . 上記 1 3または 1 4に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 神経突起伸長促進剤；
1 7 . 上記 1 3または 1 4に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 神経変性疾患治療用組成物；
1 8 . 上記 1 3または 1 4に記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 医薬組成物；
1 9 . 上記 1 3または 1 4に記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物；ならびに
2 0 . 増殖因子結合剤、 神経突起伸長促進剤、 または神経変性疾患治療用組成物 を製造するための上記 1 3または 1 4に記載のダリコサミノグリカンの使用； に関する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004- 308584および米国 仮出願 60/565， 511の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 サメ皮由来コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖 （SS- CS/DS) (Native)のコンドロイチン分解酵素消化物の、 陰イオン交換 HPLCによる 分析結果を示す図である。 SS- CS/DS (Native)をコンドロイチナーゼ ABC (A) 、 コ ンドロイチナーゼ B (B) またはコンドロイチナーゼ AC— I (C) で消化し、 消化物 を 2AB標識し、 これを、 60分にわたって 16から 530mMまで NaH2P04の直線濃度勾配
(破線） によるシリカ PA- 03カラム HPLCによって分析した。 10分より前に得られ るピークは、 試薬に起因する。 矢印は、 2AB標識された不飽和 CS二糖の溶出ピー クを示す： 1 ( A HexUA o; 1 - 3GlcNAc) ； 2 ( Δ HexUAひ 1- 3GalNAc) ( A Di-OSまた は Δ 0 [ォ一]と略す） ； 3 ( A HexUAひ 1 - 3GalNAc (6S) ) ( Δ Di - 6Sまたは Δ Cと略 す） ； 4 ( Δ HexUA a l-3GalNAc (4S) ) ( Δ Di— 4Sまたは Δ Aと略す） ； 5 Δ HexUA (2S) a l-3GalNAc (6S) ( Δ Di - diS^または Δ Dと略す） ； 6 Δ HexUA (2S) ひ卜 3GalNAc (4S) ( A Di - diSBまたは Δ Βと略す） ； 7 ( A HexllAひ 1- 3GalNAc (4S, 6S) ) (△Di - diSEまたは ΔΕと略す) ; 8、 Δ HextJA(2S) a l-3GalNAc (4S, 6S) (厶 Dト triSまたは ΔΤと略す） 。
図 2は、 単離 SS- CS/DS(Native)の各種のコンドロイチナーゼによる消化物のゲ ル濾過分析の結果を示す図である。 SS - CS/DS (Native) (1 μ g) をコンドロイチナ ーゼ AC- 1 (A) 、 コンドロイチナーゼ B (B) 、 またはコンドロイチナーゼ Bに続い てコンドロイチナーゼ AC- 1 (C)で消化後、 消化物を 2ABで標識し、 Superdex Peptideのカラムの上で分析した。 スタンダードの二糖おょぴオリゴ糖の溶出位 置を矢印で示す： 1 (CS- 10糖） ； 2 (CS-8糖） ； 3 (CS- 6糖） ； 4 (CS- 4糖） ； 5
(二硫化された CS- 2糖） ； 6 (—硫化された CS- 2糖） ； 7 (硫化されていない CS - 2 糖） 。 このオリゴ糖の溶出位置は、 予め測定しておいた （Bao， Xら （2004) J. Biol. Chem. 79, 9765-9776) 。 Vflはボイド容量を表す、 そして、 総容積 （ ） は 24mlであった。 コンドロイチナーゼ AC- 1 (A) とコンドロイチナーゼ B (B) 消 化物から得られた二硫酸化二糖画分 （バーで示す画分） は、 PA - 03カラムで陰ィ オン交換 HPLCに供し、 その結果をパネル Aと Bのインサートで示している。 ァスタ リスクとブラケットで示されるピークは、 試薬に起因するものである。 アルファ ベットと矢印で示される二糖の溶出位置は、 以下の通りである ： a (ΔΗβχϋΑαΙ- 3GalNAc) (Δ0 [ォ一]) ； b ( Δ HexUA l-3GalNAc (6S) ) (AC) ； c (AHexUAa l-3GalNAc (4S) ) ( Δ A) ； d ( Δ HexUA (2S) a 1— 3GalNAc (6S) ) ( AD) ； e ( Δ HexUA (2S) a 1一 3GalNAc (4S) ) ( Δ B) ； f ( Δ HexUA a l-3GalNAc (4S， 6S) ) ( Δ E) ； g ( Δ HexUA (2S) a l-3GalNAc (4S, 6S) ) (ΔΤ) 。
図 3は、 分子サイズ決定のための、 SS-CS/DS (Native) (♦) 、 SS-CS/DS1.0M NaCl溶出画分（1.0M) (▲) 、 および SS-CS/DS1.5M NaCl溶出画分（1.5M) (画) に ついて行った Superdex - 200でのゲルろ過カラムク口マトグラフィ一の結果を示す 図である。
図 4は、 SS- CS/DS(1.0M、 1.5M)に対するさまざまな増殖因子の結合を示す図で ある。 A: SS-CS/DS(1.0M) (白抜きのバー） と、 SS - CS/DS(1.5M) (黒塗りのバ 一） に対する応答の結果を示す。 B: 対照実験としてへパリンに対する応答の結 果を示す。
図 5 - 1は、 増殖因子の濃度に依存した SS- CS/DS (1.5M)の結合センサーグラム を示す図である。 試験した増殖因子は、 FGF- 2 (A) および FGF- 10 (B) である。 図 5 - 2は、 増殖因子の濃度に依存した SS- CS/DS (1. 5M)の結合センサーグラム を示す図である。 試験した增殖因子は、 FGF- 18 (C) および HB EGF (D) である。 図 5 - 3は、 増殖因子の濃度に依存した SS- CS/DS (1. 5M)の結合センサーグラム を示す図である。 試験した增殖因子は、 MK (E) および PTN (F) である。
図 6は、 SS - CS/DS (1. 5M)と BDNFまたは GDNFとの結合を BIAcore Jシステムで解 析した結果を示す図である。 黒塗りのバ一は SS-CS/DS (1. 5M)、 白抜きのバーはヌ タウナギ由来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリ ッ ド鎖 （HN-
CS/DS) を示す （A) 。 種々の濃度の BDNFと GDNFで得られたセンサーグラム (B :BDNFおよび C : GDNF) を Bおよび Cに示す。 矢印は、 会合相および解離相それぞ れの開始を示す。
図 7 - 1は、 SS- CS/DSの 3標品 （Native, 1. 0M、 1. 5M) の神経突起伸長促進作用 を示す図である。 SS- CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) (ゥロン酸としての 0. 67の // g) は P - 0RNでプレコートされたカバーガラスの上にコートされ、 E16マ ウス胚由来の海馬ニューロン初代培養細胞をその上で 24時間の間ィーダル最小必 須培地で培養した。 Aにおいて、 最も長い軸索突起の平均の長さは、 SS- CS/DSの 3 標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) の上で培養される、 ランダムに選択された 100個の ニューロンについて計量した。 イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸鎖 （CS- E) を ポジティブコントローノレ、 P-0RNのみのコートをネガティブコントロー/レ (P- 0RN) とした （★★： p<0. 001、 ★ ： p<0. 005) 。 Bは、 各種コンドロイチナーゼ で消化した SS - CS/DS (Native) について同様に調べた結果である （n. s. ：有意差 なし、 ★★★： p<0. 001、 * ： p<0. 05) 。 ま、 酵素消化してない各画分により誘 導される祌経突起の数をグラフにしたものである （n. s. ：有意差なし、 ★★： pく 0. 001) 。 2つの別々の実験から得られる値を、 平均土 SEとして表す。
図 7 - 2は、 SS- CS/DSの 3標品 （Native, 1. 0M、 1. 5M) の神経突起伸長促進作用 を示す写真である。 （D) は、 SS-DS上で培養したニューロンの形態、 （E) は、 P - 0RNのみをコートしたカバーガラス上で培養したニューロンの形態である。 図 8は、 SS- CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5 ) の抗ファクター Ila活性測定 結果である。 へパリン （秦） およびブタ肌由来の DS (園） はポジティブコント口 ールである。 SS - CS/DS (Native) (♦) 、 SS- CS/DS (1. OM) (▲) 、 および SS - CS/DS (1. 5M) ( X ) について試験した。
図 9 - 1は、 増殖因子の濃度に依存した固定化 HN- CS/DSのセンサーグラムを示 す。 試験した増殖因子は、 FGF- 2 (A) および FGF-10 (B) である。
図 9 - 2は、 増殖因子の濃度に依存した固定化 HN-CS/DSのセンサーグラムを示 す図である。 試験した増殖因子は、 FGF- 16 (C) および FGF - 18 (D) である。
図 9 - 3は、 増殖因子の濃度に依存した固定化 HN-CS/DSのセンサーグラムを示 す図である。 試験した増殖因子は、 置 （E) および PTN (F) である。
図 9 - 4は、 増殖因子の濃度に依存した固定化 HN-CS/DSのセンサーグラムを示 す図である。 試験した増殖因子は、 HB - EGF (G)および VEGF (H)である。
図 1 0は、 HN- CS/DSをセンサ ·チップ上に固定し BDNFと GDNFをそれぞれ種々の 濃度で、 センサ ·チップ上に流した際の重ね合わせたセンサーグラムを示す図で ある。
図 1 1 - 1は、 HN- CS/DS消化物の神経突起伸長促進作用を示す写真である。 Aは HN- CS/DSをコートしたカバーガラス上で培養したニューロンであり、 Bは P- 0RNコ ートのみをカバーガラス上で培養した細胞である。
図 1 1 - 2は、 HN - CS/DS消化物の神経突起伸長促進作用を示す図である。 Cは神 経突起の長さを示し、 Dは神経突起の数を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖、 およびこれ を含むグリコサミノダリカンに関する。 さらに、 GlcUA(2S) - GalNAc (4S)の二糖を 含むコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖、 およびこれを含むグ リコサミノグリカンに関する。 かかるグリコサミノグリカンは、 上記ハイブリツ ド鎖を、 60%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ま しくは 90 %以上、 特に好ましくは95 %以上（全て w/w)、 最も好ましくは他の糖鎖 成分は全く検出されず、 実質的に上記ハイプリッド鎖のみからなるグリコサミノ グリカンである。 ただし、 本発明におけるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸 ハイプリッド鎖およびこれを含むダリコサミノダリカンは、 その糠鎖に共有結合 したペプチドを、 3重量％以下、 好ましくは、 2重量％以下、 さらに好ましくは 1. 2重量％以下 （例えば、 0. 6〜1. 2重量0/。程度） 含み得る。
本発明において、 コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖とはコ ンドロイチン硫酸が有する 2糖ュ-ットとデルマタン硫酸が有する 2糖ュニット の両方を含む、 2糖ユニット構造を有する多糖鎖をいう。 コンドロイチン硫酸/ デルマタン硫酸ハイプリッド鎖の含む 2糖ュニットの種類や含量には限定はない , 例えば、 コンドロイチン硫酸からは次のような構造が単離されている。
GlcUA j3 l-3GalNAc (6S) β l-4Gl cUA j3 l-3GalNAc (6S) j3 l-4GlcUA ,S l-3GalNAc (6S) β l-4GlcUA i3 l-3GalNAc (6S)
一方、 デルマタン硫酸からは次のような構造が単離されている。
IdoUA a l-3GalNAc (4S) β 1 - 4IdoUA a l-3GalNAc (4S) β 1— 4IdoUA l—3GalNAc (4S) β 1一 4IdoUA a 1- 3GalNAc (4S)
IdoUAと GlcUAが同じ糠鎖中に存在している構造があれば、 ハイブリッド型とい える。 例えば次のような構造が挙げられる。
1 ) GlcUA β l-3GalNAc (6S) β 1— 4IdoUA a 1一 3GalNAc (6S) β 1— 4GlcUA β 1— 3GalNAc (6S) β 1— 4GlcUA /3 1— 3GalNAc (6S)
2 ) Gl cUA β l-3GalNAc (6S) β 1— 4IdoUA a l-3GalNAc (4S) β 卜 4GlcUA β 1— 3GalNAc (6S) β l-4GlcUA β l-3GalNAc (6S)
3 ) IdoUA a l-3GalNAc (4S) β 1一 4GlcUA β 1一 3GalNAc (4S) β 1一 4IdoUA a 1— 3GalNAc (4S) β l-4IdoUA a l-3GalNAc (4S)
かかるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、 硬骨魚類以外 の魚類体、 から分離.精製することができる。 硬骨魚類以外の魚類としては、 軟 骨魚類、 や円口類に属する魚類が挙げられる。 魚類体は限定されないが、 魚類の 種類により、 コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖の含量、 分 離 ·精製処理のし易さにより適宜選択することができる。 例えばサメ皮ゃヌタウ ナギの脊索を用いることができる。 試料より、 アセトン抽出、 プロテアーゼ処理. トリクロ口酢酸抽出により得られたダリコサミノダリカン画分を、 さらに CPC沈 殿、 ヒアルロニダーゼ消化、 亜硝酸処理、 脱塩の工程を経て、 コンドロイチン硫 酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画分が得られる。 さらに、 最終的に得られた コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖画分を陰イオン交換樹脂を 用いて、 樹脂に吸着したコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖を
NaCl含有溶出剤により溶出することによりさらに分画することができる。 約 1. 0M NaClで溶出されてくる画分と、 約 1. 5M NaClで溶出されてくる画分と 2つのコンド ロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖画分が得られる。 いずれの画分も、 実質的に純粋なコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖である。 い ずれの画分に含まれるものも、 ほぼ等しい分子量を有しており、 その平均分子量 は、 例えばサメ皮由来コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖の場 合、 約65〜 75kDa、 好ましくは約68〜 72kDa、 最も好ましくは約 70kDaであり、 ヌ タウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖の場合、 約 18kDaである。 本発明中のサメ皮由来コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイ ブリツド鎖の二糖 1分子当たりの硫酸化度は、 1. 2未満、 すなわち、 好ましくは約 0· 70以上 1. 20未満、 より好ましくは約 0. 80以上約 1. 20未満、 特に好ましくは約 0. 87〜1. 17の範囲内である。
サメ皮ゃヌタウナギ脊索等の硬骨魚類以外の魚類からのコンドロイチン硫酸/ デルマタン硫酸ハイプリッド鎖の分離 ·精製の各工程は当業者に公知の方法にて 実施すればよい。 例として、 一連の工程の実施態様を実施例の欄に後述するが、 記載の方法に限定されるわけではなレ、。
本明細書中、 コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を CS/DSと称 することもある。 また、 サメ皮由来のものを SS (shark skin) という接頭語を付 し、 ヌタウナギ脊索由来のものを HN (hagfish notochord)という接頭語を付する ことがある。 例えば、 サメ皮試料より上記のヒアルロニダーゼ消化、 亜硝酸処理、 脱塩後に得られた画分を、 SS-CS/DS (Native)と、 さらにそれを陰イオン交換樹脂 に供し、 約 1. 0M N.aClで溶出されてくる画分および約 1. 5M NaClで溶出されてくる 画分をそれぞれ、 SS - CS/DS (1. 0M)および SS-CS/DS (1. 5M) と称する。
これらのサメ皮由来コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖の各 画分の組成分析を、 コンドロイチナ一ゼ ABC、 Bまたは AC - 1にて消化することによ り実施した。 その結果、 いずれの SS- CS/DS画分も主要構成成分は GlcUA j3 1- 3GalNAc (4S) (Aュニット）もしくは]: doUA o _3GalNAc (4S) (iAュニット）ならびに GlcUA β l-3GalNAc (6S) (Cュニット）もしくは IdoUA a l-3GalNAc (6S) (iCュニッ ト）であった。 また、 GlcUA (2S) β l-3GalNAc (6S) (Dユニット）、 IdoUA (2S) ひ 1一 3GalNAc (6S) (iDュニッ ト）、 Gl cUA (2S) β l-3GalNAc (4S) (Bュニッ ト）、 IdoUA (2S) a l-3GalNAc (4S) ( iBユニット）、 Gl cUA 0 l—3GalNAc (4S， 6S) (Eュニッ ト）および IdoUA o; l-3GalNAc (4S， 6S) (iEユニット）の全部または一部の二硫酸化 二糖を含んでいることも明らかになった。 また、 これらの画分のコンドロイチン 硫酸おょぴデルマタン硫酸は、 非常に多様な二糖分子からなっており、 特に GlcUA (2S) -GalNAc (4S)の構造を持つ二糖分子が検出された。 かかる GlcUA (2S) - GalNAc (4S)の構造を持つ二糖分子を含むコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハ' イブリツド鎖は、 本発明において初めて見つけられたものであり、 サメ皮由来の コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎮特有の性質であると考えら れる。
以上のように、 サメ皮由来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッ ド鎖は、 Gl cUA (2S) - GalNAc (4S) ( B ユニッ ト） を必ず含み、 さらに GlcUA -
GalNAc (4S) (A ュニ ッ ト） 、 GlcUA- GalNAc (6S) ( C ュニ ッ ト） 、 GlcUA (2S) -
GalNAc (6S) (D ュニット） 、 GlcUA- GalNAc (4S, 6S) (E ュニット） および硫酸化 されていなレ、GlcUA- GalNAc (0 [ォ一]ユニット）からなる群から選択される少なく とも 1つのユニッ ト （すなわち、 1つ、 2つ、 3つ、 4つもしくは 4つのュニッ ト） 、 ならびに IdoUA ひ 1一 3GalNAc (4S) (iAユニ ッ ト） 、 IdoUA (2S) -GalNAc (4S)
(iB ユニッ ト） 、 IdoUA 1一 3GalNAc (6S) (iCユニッ ト）、 IdoUA (2S) -GalNAc (6S)
(iD ュニット） および IdoUA- GalNAc (4S， 6S) (iE ュニット） からなる群から選 択される少なくとも 1つのユニット （すなわち、 1つ、 2つ、 3つ、 4つもしく は 5つのユニット） を含む。 なお、 コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブ リツド鎖であるので、 Gl cUA (2S) - GalNAc (4S) (B ユニット） 、 GlcUA- GalNAc (4S)
(A ュニッ ト） 、 GlcUA- GalNAc (6S) (C ュニッ ト） 、 Gl cUA (2S) -GalNAc (6S) (D ユニット） 、 GlcUA-GalNAc (4S, 6S) (E ユニット） およぴ硫酸化されていない
GlcUA - GalNAc (0 [ォ一]ュニット）からなるコンドロイチン硫酸ュニット群中の少 なく とも一つと IdoUA a l-3GalNAc (4S) (iAユエッ ト）、 IdoUA (2S) -GalNAc (4S)
(iB ユニッ ト) 、 IdoUA a l-3GalNAc (6S) ( iCユニッ ト）、 I doUA (2S) -GalNAc (6S) (iD ユニット） および IdoUA-GalNAc (4S, 6S) ( iE ユニット） からなるデルマタ ン硫酸ュニット群中の少なくとも一つを必ず同時に含んでいる。
また、 ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド 鎖の組成分析の結果、 主要構成成分は GlcUA iS 1- 3GalNAc (4S， 6S) (Eユニット）も しく は IdoUA a l-3GalNAc (4S, 6S) (iEユニッ ト）、 ならびに GlcUA β 1一 3GalNAc (4S) (Aユニット）もしくは IdoUA o: 3GalNAc (4S) (iAユニット）であった, また、 Gl cUA /n—3GalNAc (0 [ォ一]ユニット）、 GlcUA ;3 l—3GalNAc (6S) (Cュ-ッ ト )、 IdoUA a l-3GalNAc (6S) (iCュニット）、 GlcUA (2S) β 1— 3GalNAc (4S， 6S) (Tュ ニット）ぉょぴ1 1^ (23) " 1-36&1 (；（43，65) ( iTュニット）の全部または一部も 含まれていた。 すなわち、 ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸/デルマタン 硫酸ハイプリ ッ ド鎖は、 Gl cUA β l-3GalNAc (4S) (Aュニッ ト ） 、 GlcUA β 1 - 3GalNAc (6S) (Cユニット）、 GlcUA j8卜 3GalNAc (4S， 6S) (Eユニット）、 Gl cUA (2S) β l-3GalNAc (4S, 6S) (Tュニット）および硫酸化されていない GlcUA- GalNAc (0 [ォ 一]ュニット）からなる群から選択される少なくとも 1つのュニット （すなわち、 1つ、 2つ、 3つ、 4つもしくは 5つのユニッ ト） 、 ならびに IdoUA α 1 - 3GalNAc (4S) .(iAユニ ッ ト） 、 IdoUAひ 1一 3GalNAc (6S) (iCユニ ッ ト） 、 IdoUAひ 1一 3GalNAc (4S, 6S) (iEユニット）および IdoUA (2S) ひ 1 - 3GalNAc (4S, 6S) ( iTュニッ ト） 力 らなる群から選択される少なくとも 1つのユニット （すなわち、 1つ、 2 つ、 3つもしくは 4つのユニット） を含む。
以上より、 サメおよぴヌタウナギを含む硬骨魚類を除く魚類由来のコンドロイ チン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖は、 GlcUA- GalNAc (4S) (A ュニット） .
GlcUA (2S) -GalNAc (4S) ( B ユニ ッ ト） 、 GlcUA— GalNAc (6S) ( C ユニ ッ ト） 、
GlcUA (2S) -GalNAc (6S) (D ユニッ ト ) 、 GlcUA- GalNAc (4S, 6S) (E ユニッ ト ) 、
GlcUA (2S) β l-3GalNAc (4S, 6S) (Tュニット）およぴ硫酸化されていない GlcUA -
GalNAc (0 [ォ一]ュニット）からなる群から選択される少なくとも 1つのュニット, ならびに IdoUA α ΐ - 3GalNAc (4S) ( iAユニット）、 IdoUA (2S) -GalNAc (4S) (iB ュニ ット） 、 IdoUA a l—3GalNAc (6S) (iCユニット）、 IdoUA (2S) -GalNAc (6S) (iD ュニ ッ ト） 、 IdoUA-GalNAc (4S, 6S) ( iE ユニ ッ ト） および IdoUA (2S) a 1-
3GalNAc (4S, 6S) (iTュニット）からなる群から選択される少なくとも 1つのュニ ットを含む。
本発明のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖は種々の増殖因 子 （繊維芽細胞増殖因子（FGF) -2、 FGF- 10、 FGF- 18、 へパリン結合性上皮細胞増 殖因子（HB- EGF)、 ミツドカイン（MK)、 プレイオト口ピン（PTN)、 脳由来神経栄養 因子（BDNF)および神経膠細胞由来神経栄養因子（GDNF) ) と高い親和性をもって結 合した。
さらに、 本発明のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖は、 神 経突起伸長促進作用および抗凝血作用を示す。 .
かかる特性より、 サメ皮由来、 ヌタウナギ脊索由来等の硬骨魚類以外の魚類由 来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖は、 神経変性疾患、 神 経系発達の促進に対する治療または予防薬として有用である。 さらにまた、 抗凝 血剤として有用である。
したがって、 本発明は、 上記のサメ皮由来、 ヌタウナギ脊索由来の画分に含ま れるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖等の硬骨魚類以外の魚 類由来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖からなるグリコサ ミノグリカンを含む、 増殖因子 （FGF- 2、 FGF- 10、 FGF- 18、 HB- EGF、 MK、 PTN、 BDNFおよび GDNF) 結合剤、 神経突起伸長促進剤、 および抗凝血剤をも包含する。 これらの剤の製造方法は当業者であれば、 容易に想到し得る。 例えば、 サメ皮か ら上述の通りコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖を含むダリコ サミノダリカンを完全にまたは部分的に精製し、 得られた画分を必要に応じて、 これを適切な担体および/または溶媒と混合するとよい。
上記ダリコサミノダリカンは医薬組成物として利用され得る。
特に、 上記グリコサミノダリカンの神経突起伸長促進作用により、 該グリコサ ミノグリカンは神経変性疾患の予防または治療用の医薬組成物となり得る。 神経 変性疾患は、 神経細胞の神経突起の変性 ·脱落を伴うため、 該グリコサミノダリ カンは、 これを予防し得るか、 または新規神経突起の伸長を促進し得るために疾 患による症状の進行もしくは症状の軽減をもたらし得る。
これらの製剤または医薬組成物は、 上記グリコサミノダリカンを、 最終的に 1
〜20 /_f g/ml、 好ましくは：！〜 10 g/ml、 より好ましくは：！〜 5 /i g/mlの濃度で、 作用させることが好ましい。
例えば、 上記コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリ コサミノダリカンまたはそれを含む画分を、 神経突起伸長促進剤として適用する 場合は、 サメ皮から上述の通りコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッ ド鎖を含むグリコサミノグリカンを完全にまたは部分的に精製して得られた画分 を、 これが神経突起の伸長を促進する必要のある対象とする個体の神経細胞と接 触することが可能な方法で投与することができる。 投与方法は適切な方法を当業 者が選択することができるが、 突起伸長が望ましい神経細胞またはその細胞の周 辺に送達し得るように、 局所投与するとよい。 送達される際の濃度が、 1〜10 μ g/ml、 より好ましくは l〜5 /z g/ml、 さらに好ましくは 2 μ g/ml程度になるよう、 投与することが好ましい。 また、 ヌタウナギ脊索由来コンドロイチン硫酸/デル マタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン等の他の硬骨魚類以外の 魚類の場合も同様である。
例えば、 上記ダリコサミノダリカンまたはそれを含む画分を、 増殖因子結合剤 として適用する場合、 目的に応じて適切な量 （対象とする増殖因子に応じて異な る） の上記グリコサミノダリカンまたはそれを含む画分を増殖因子と混合し、 接 触させるとよレ、。
さらにまた、 上記グリコサミノダリカンまたはそれを含む画分を、 抗凝血剤と して適用する場合、 目的に応じて適切な量の上記ダリコサミノダリカンまたはそ れを含む画分を増殖因子と混合し、 接触させるとよい。
上記グリコサミノダリカンを、 0. l / g以上、 好ましくは 1〜10 μ β/ηι1の濃度で 血液と混合し、 接触させることにより、 抗凝血活性が発揮される。
これらの適用の対象となるのは任意の哺乳動物であってよい。
本発明の硬骨魚類以外の魚類由来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイ プリッド鎖画分の分離方法およびその特性解析について、 以下の実施例にサメ皮 およびヌタウナギ脊索を例として詳述するが、 本発明は実施例の記載に限定され るわけではない。
実施例 1 サメ皮からのコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖画 分の分離 <方法〉
ダリコサミノグリカンの単離
ヨシキリザメ Prionace glaucaの皮膚 （乾燥重量 85g) を、 アセトン抽出によつ て 3回脱脂し、 完全に風乾した。 水に懸濁後、 タンパク質分解酵素を失活させる ために 30分間、 沸騰水中に保持した。
懸濁液に、 ホウ酸塩 - NaOHバッファーと塩化カルシウムを、 それぞれ 0. と 10 の終濃度となるように加え、 24時間の間 60°Cでプロテアーゼ （ァクチナ一 ゼ：サンプルの 2重量％) で消化した。 そして 24時間および 48時間後に、 新たに ァクチナーゼ （サンプルの 1重量0 /0) を加え消化後、 50%のトリクロ口酢酸を 5%終 濃度になるように加えて遠心分離し、 タンパク質を沈殿させ、 5%のトリクロ口酢 酸で再懸濁して再度遠心分離により、 それぞれの上清を回収した。
上清中の過剰なトリクロ口酢酸はジェチルエーテル抽出によって除去し、 4倍 容量の 5%酢酸ナトリゥム含有 80%エタノールを加えてー晚 4°Cに放置して、 ダリコ サミノグリカンを沈殿させ、 さらに遠心によって回収し乾燥させた。
グリコサミノグリカンの精製
上記のグリコサミノグリカン含有沈殿物を、 0. 02Mの Na2S04で可溶化し、 10% (w/v) 塩化セチルピリジニゥム （CPC) /0. 02MNa2SC ^を添加して室温でー晚放置 した。 得られた綿状沈降物は、 100 : 15 (v/v) 2M NaCl/エタノール溶液で再溶解 させて、 3倍容量の 99. 5%のエタノールを加え再度沈殿させた。 上記のステップを 3度繰り返して、 最後に水中で沈殿させて乾燥させた。 同様の CPC沈殿工程を、 臨 界電解質濃度を 0. 5Mの NaClに保ちつつ実施し、 ヒアルロン酸を除去して、 グリコ サミノダリカンを濃縮した。
ヒアルロニダーゼ消化
上記で得られた CPC沈殿物を 0. 15M NaCl含有 0. 02M酢酸バッファー （PH 6) に溶 解し、 60°Cで振盪しなが 50TRU (turbidity reducing units)のス トレプトマイセ ス属ヒアル口ニダーゼで 5時間消化した。 50TRUのヒアル口ニダーゼを更に添加し- 12時間消化させた。 セルロースアセテート膜電気泳動法によって、 ヒアルロン酸 の消化を確認した後に、 タンパク質を除去するために消化物を TCAで処理し、 ェ タノールを 64%になるように添加してダリコサミノグリカンを沈殿させた。 亜硝酸処理
ヒアルロニダーゼ消化後得られた沈殿物は、 同量の 0. 5mmol e硫酸と 0. 5mmole亜 硝酸バリゥムとを混合して得られる亜硝酸で 40分間室温静置して処理した。 新た に調製した亜硝酸のァリコートを再び添加し、 更に 40分間静置した。 処理したサ ンプルを、 0· 5Mの Na2C03で中和して、 セフアデックス G-50カラム （1x56cm) で脱 塩した （溶出剤 ·· 0. 2Mの重炭酸アンモ-ゥム、 流速 0. 6ml/分） 。 溶出は 210nmで モニターし、 溶出画分を回収して、 凍結乾燥しては水で戻す作業を繰り返した。
C18およぴ陰ィオン交換力ラムによるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブ リッド鎖の精製
脱塩したグリコサミノダリカンを、 Sep-Pak C18カートリッジカラムに通して 水で溶出した後、 100%のメタノ一ルで溶出した。 ここで溶出された遊離のぺプチ ド不含コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリ ッ ド鎖は、 SS- CS/DS (Native) と称した。 この標品は糖鎖に共有結合したペプチドをわずかに含む (0. 6〜1. 2重量％程度) 。
SS-CS/DS (Nat ive) は、 陰イオン交換体カートリッジに通して、 0. 15、 0. 5、 1. 0、 1. 5または 2. 0M NaCl含有 300mMリン酸塩緩衝液にてステップワイズに溶出後. PD-10力ラムを用い 50mMピリジン酢酸塩バッファー （pH 5. 0；溶出剤） で脱塩し た。
ぐ結果 > '
精製の結果、 NaClを含む 1. 0と 1. 5Mのバッファーで溶出された画分に、 それぞれ 20%および 80%のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖が含まれ ており、 SS - CS/DS (1. 0M)と SS - CS/DS (1. 5M)と称した。 精製の収率を表 1に示す。 表 1 SS-CS/DSの収率
SS-CS/DSの収率
Figure imgf000018_0002
実施例 2 二糖組成分析
<方法 >
酵素消化
二糖組成分析は、 コンドロイチナーゼ ABC、 Bまたは AC- 1の消化物を分析するこ とにより行なった。
1；^^または3. 6 /^の55-。5/05の3標品 （Native、 1· 0Μ、 1. 5Μ) を、 lOmlUのコン ドロイチナーゼ ABC、 5mIUのコンドロイチナーゼ AC- 1、 または 2mIUのコンドロイ チナーゼ Bのいずれかで消化し、 各々の消化物を既報 （Kinoshita, A. , Sugahara, K (1999) Anal. Biochem. 269， 367-378) に従って 2 -ァミノべンズアミ ド （2AB) で標識した （過剰な 2ABは水：クロ口ホルム 1 ： 1 (v/v) 混合物で除去した） 。
2ABで標識した二糖は、 16mMの
Figure imgf000018_0001
1で希釈し、 陰イオン交換 HPLC (16mMおよび 530mMの Na^PO^の溶媒を使用した PA-03シリカカラム）によって 分析した。
また、 1. 6 8の53-。3/03の3標品 （Native, 1. 0M、 1. 5M) を lOmlU コンドロイ チナーゼ ABC (10 i lの総容積） で消化し、 その 3分の 1ずつを lOmlUのコンドロ 4- またはコンドロ 6 -スルファターゼ消化に供し、 この消化物を 2AB標識して HPLCに て上記と同様に分析した。
Superdex Peptide カラムの SS-DSコンドロイチナーゼ消化物のゲルろ過分析 SS-CS/DS (Native) (ΐ.Ομ§) を、 コンドロイチナーゼ AC- 1または Bで消化し コンドロイチナーゼ AC- 1の後にはコンドロイチナーゼ Βで、 またはコンドロイ チナーゼ Bの後にはコンドロイチナーゼ AC-Iで消化した。 全ての消化物を 2ABで標 識し、 1-プロパノール含有 0.2M重炭酸アンモ-ゥムにて溶解し、 Superdex Peptideカラムを使い、 蛍光検出にて分析した （流速 0.4 ml/分） 。
<結果 >
コンドロイチナーゼ ABC消化による組成分析
SS - CS/DSの 3標品 （Native、 l.OM, 1.5M) を酵素消化し、 分析した結果を表 2 に示す。
SS-CS/DS (Native) 、 SS-CS/DS (l.OM) および SS-CS/DS (1.5M) の 3標品全て は、 様々な比率で AHexUAal - 3GalNAc (ADi— OS) 、 Δ HexUAひ 1— 3GalNAc (6S)
(ADi-6S) 、 AHexUAa l-3GalNAc (4S) (ADi~4S) 、 ADi - diS ADi— diSBお よび Δ D i - diSEを含有していることが明らかとなった。
SS - CS/DSの 3標品 (Native, 1.0M、 1.5M) の主要構成成分は Δ Di- 4Sと Δ Di - 6S であり、 SS-CS/DS (Native) 、 SS-CS/DS (l.OM) および SS - CS/DS (1.5M) におけ る ADi - 4Sと Δϋί - 6Sの全二糖に対する比率は、 それぞれ、 48.9%と 21.3°/。、 43.5% と 21.3%、 55.0%および 16.6%であった （表 2 ) 。 Δ Di- 0Sの比率は SS - CS/DS (1.0M) 力 23.8%であり、 SS - CS/DS (Native) (10.5%) および SS- CS/DS (1.5M) (5.8%) と比較して高かった。 対照的に、 SS- CS/DS (1.5M) は、 二硫酸化二糖 (ADi - diSD、 ADi - diSDおよぴ ADi - diSc) の比率が 22.6%であり、 SS - CS/DS
(Native) (19.3%) および SS-CS/DS (1.0M) (11.4%) に比べて高かった。
以上より、 SS- CS/DS (Native) は、 異なった硫酸化度をもった多種多様な
CS/DS鎖を含んでいることが分かった。
今までに単離された、 サメ軟骨、 イカ軟骨、 ホヤ、 ゥ二とヌタウナギを含む海 洋生物由来のコンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸のほとんどは、 「E」 ュニッ ト、 「 iE」 ユニッ ト、 「 D」 ユニッ ト、 「 iD」 ユニッ トまたは 「 iB J
(IdoUA(2S)-GalNAc (4S)) ュニットのニ硫酸化二糖が大部分を占める高硫酸化物 であつ itが (sulfate to disaccharide moler ratio (S/Unit) =1.2~1.9) 、 本 発明の SS - CS/DSの 3標品 (Native, 1. 0M、 1. 5M) は、 S/Unitが 0. 87〜1. 17と低レ、 にもかかわらず （表2) 、 かなりの量の複数の二硫酸化二糖ユニットを含み、 し かも硫酸化されていない二糖ユニット （0 [ォ一]ユニット） をも含むという点で ユニークである。
コンドロイ.チナーゼ B消化による組成分析
コンドロイチナーゼ Bの消化により、 SS-CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) からは A Di - 4Sと A Di- diSBが生成された （表 2) 。 コンドロイチナーゼ Bの消化に より得られる二糖の総量は、 コンドロイチナーゼ ABC消化によって得られる二糖 の総量の 2%程度に過ぎなかった。
コンドロイチナーゼ B処理により A Di- 4Sと A Di - diSBがわずかしか遊離してこ なかったことは、 それらの由来するユニットのほとんどが、 IdoUA- GalNAc (4S)
(iAユニット） または IdoUA (2S) -GalNAc (4S) (iBユニット） としてではなく、 むしろ GlcUA- GalNAc (4S) (Aユニット） または GlcUA (2S) -GalNAc (4S) (Bュニッ ト） として存在することを示唆する。 また、 大多数の iAユニットまたは iBュニッ トがクラスターを形成しておらず、 それ故、 コンドロイチナーゼ B消化に抵抗性 を有していると考えられる。
コンドロイチナーゼ Bでは A Di- 6Sは遊離してこなかった。 コンドロイチナーゼ AC - 1消化後にはある程度検出されたことから、 その全 6-0硫酸化ュニッ トが GlcUA-GalNAc (6S) (Cユニット） として存在する力、 または、 IdoUA - GalNAc (6S) (iCユニット） として存在することを示唆する。 これらは、 酵素に対して抵抗性 を有するか、 または抵抗性のある配列に含まれている可能性がある。
コンドロイチナーゼ AC- 1消化による組成分析
SS - CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) のコンドロイチナーゼ AC- 1による消 化では、 二硫酸化二糖がほとんど検出されず、 SS-CS/DS標品中の二糖全量の 10% に過ぎない程度の、 A Di - 0S、 A Di - 6Sと A Di-4Sを含む非硫酸化およびモノ硫酸 化二糖が検出された （表 2 ) 。 この結果は、 4-0硫酸化ユニットと 6 - 0硫酸化ュニ ットとの少なくとも一部が、 「A」 および 「CJ ユニットとして存在することを示 唆する。
コンドロイチナーゼ AC- 1と B消化物のゲル濾過分析 IdoUA含有ュニットと GlcUA含有ュニットとの分布を調べるために、 SS-CS/DS (Native) (ΐ. 0 μ §) を、 コンドロイチナーゼ AC- 1または Βで消化し、 各々の消 化物を Superdex Peptideカラムでのゲル濾過クロマトグラフィによって分析した, 6、 8、 および 10糖のオリゴ糖は両消化物で観察された。 このことは、 多糖鎖中に GlcUA含有ュニットと IdoUA含有ュニットとが混在し、 CS/DS複合型構造が形成さ れていることを示唆する （図 2、 Aと B) 。
コンドロイチナーゼ AC- 1またはコンドロイチナーゼ Bの消化物を、 それぞれ他 方のコンドロイチナーゼで消化すると、 4およぴ 6糖に相当する消化抵抗性断片の 他は、 主に二糖が生成された。 これは、 隣接する IdoUA含有二糖ユニットまたは GlcUA含有二糖ユニットを有するオリゴ糖が存在することを示唆した （図 2C) 。
10糖またはこれより大きなオリゴ糖は、 コンドロイチナーゼ B消化物 （図 2B) よりコンドロイチナーゼ AC-I消化物 （図 2A) の方が少なかった。 これは、 IdoUA より GlcUAが幾分高比率であることを支持する結果であった。
いずれかのコンドロイチナーゼ消化により得られた二糖 （図 2、 Aおよび B中 5、 6、 7) は、 恐らく GlcUA含有ユニット （10°/。） と IdoUA含有ユニット (2%) から成 る隣接する配列の存在を意味する。 陰イオン交換クロマトグラフィーによると、 コンドロイチナーゼ AC- 1消化物の二硫酸化二糖に相当する画分は、 それぞれ主要 成分として A Di-diSEが、 少量成分として A Di - diSBが存在することを示す。 一方 コンドロイチナーゼ B消化物の二硫酸化二糖は、 主要成分として A Di- diSBが、 少 量成分として A Di - diSEが存在することを示す。 陰イオン交換 HPLC (図 1C) によ つて SS- CS/DS (Native)の二硫酸化二糖がコンドロイチナーゼ AC-I消化物で検出さ れなかったのは、 他の二糖に比べてほとんど検出不可能な量しか存在しないため であろうが （表 2) 、 Superdex Peptideカラムで最初に分画した後、 陰イオン交 換カラムで分画すると、 SS - CS/DS (Native)の二硫酸化二糖が検出された。 これら の結果は、 SS- CS/DS標品中の A Di- ≤6と A Di- diSEが、 GlcUA含有二糖ユニット と IdoUA含有二糖ュニッ ト、 すなわち GlcUA (2S) /IdoUA (2S) -GalNAc (4S) と GlcUA/IdoUA - GalNAc (4S，6S)に由来することを示す。 本実験により、 GlcUAを含有 する 「B」 ユニット （GlcUA(2S) - GalNAc (4S) ) が初めて検出された。 表 2に示すこ れらのュニットの値は非常に少ないが、 これらは切断可能なュニットのみであつ て、 他に Bユニットが高頻度で含まれていること可能性は高い。 この Bユニットが SS - CS/DSの機能に関与している可能性がある。
対照的に、 A Di- diSDが、 コンドロイチナーゼ AC-Iまたは Bの消化物で検出され なかった （図 1Bおよび (：、 表 2) 。 これは、 以前に報告されている （Yoshida, K. b (1993) Dermatan sulfate Proteoglycans Chemistry, Biology and Chemical Pathology (Scott, J. E.， Ed. ) pp 55-80， Portland Press ) よ う に 、 D [GlcUA (2S) -GalNAc (6S) ]または、 iD [IdoUA (2S) -GalNAc (6S) ]ュ-ットを含有す る配列がコンドロイチナーゼ AC- 1または Bに対して非消化性であることを示す。
「DJ および Zまたは 「iD」 ユニットはかなりの比率 （3%) で存在し、 コンドロ イチナーゼ AC-Πは効率的に CSオリゴ糖から Dュニットを解離させるにもかかわら ず （Nadanaka, S.ら （1998) J. Biol. Chem.， 273， 33728 - 33734) 、 コンドロ イチナーゼ AC - II消化でも検出されなかった。 これは、 コンドロイチナーゼ ABCに より生成した ADi- diSDが iDュニットに由来し、 それがコンドロイチナーゼ ABCに は感受性を有するがコンドロイチナーゼ Bには感受性を有していないという可能 性がある。 しかしながら、 iDユニットおよび Dユニットが実際 SS- CS/DSの 3標品で それぞれどのくらレ、の割合で存在するのかは明らかではなレ、。 表 2
SS - CS/DS標品の 2糖組成
Figure imgf000023_0001
実施例 3 分子量決定
ぐ方法 >
Superdex 200カラム （10 X 300mm) のゲル濾過でコンドロイチン硫酸/デルマタ ン硫酸ハイブリッド鎖の分子サイズを測定した。 SS-CS/DSの 3標品 （Native、 1. OM, 1. 5M) (40 μ g) をカラムにロードし、 0. 3ml/分の流速で 0. 2Mの酢酸アン モニゥムで溶出した。 3分間の溶出分を 1画分に回収し、 蒸発乾燥して、 100 1水 で溶解した。 測定は既報に従った （Chandrasekhar, S. , et al ( 1987) Anal Biochem. 161， 103-108) 。
<結果 >
SS- CS/DSの分子をゲルろ過カラムクロマトグラフィ一にて調べたところ、 SS - CS/DS (Native)、 SS- CS/DS (1. 0M)と SS - CS/DS (1· 5M)のいずれの標品も、 その平均 分子量は 70kDaであった （図3) 。
この分子量は、 ヌタウナギ脊索 （18kDa) 、 ブタの皮膚 （l9kDa) 、 ゥナギ皮膚
(HkDa) 、 内皮細胞 （30kDa) 、 ブタ脳 （40kDa) 由来のそれぞれの CS/DSと比較 して非常に大きかった。 サメ軟骨からのコンドロイチン硫酸 C鎖の分子量は、 か なり大きい （43〜70kDa) ので、 本発明の SS- CS/DSの分子量はサメに特徴的であ る可能性がある。
実施例 4 種々の増殖因子による SS- CS/DS標品 （1. 0M、 1. 5M) の相互作用分析 <方法>
SS - CS/DS標品 (1. 0Mヽ 1. 5M) と種々の増殖因子 (FGF - 1、 FGF - 2、 FGF- 10、 FGF - 16、 HB_EGF、 PTN、 MK) との相互作用分析は、 既報に従って、 Interaction Analysis System (IAsys ; Affinity sensors社、 ケンブリッジ、 英国)を使用して 実施した （Deepa, S. S.， et. al. ( 2002 ) J. Biol. Chera. 277, 43707- 43716) 。
親和性パラメータである解離定数 kd、 結合定数 kaを FASTfitソフトウエア (Affinity sensors社、 ケンブリッジ、 英国） を使って求め、 解離平衡定数 （ =解離定数 k /結合定数 ka) を算出して評価した。
ぐ結果 >
過剰量 （1, 500〜3， 500倍量） の各々の増殖因子を灌流して接触させることによ り試験した結果、 いずれの SS- CS/DS標品 （1· 0Μ、 1. 5M) も、 FGF- 1以外の全ての 増殖因子と高い相互作用応答を示したが、 その応答は、 増殖因子によって異なつ ていた。 結合程度も、 SS- CS/DS標品 （1. 0M、 1. 5M ) によ り異なり 、 SS - CS/DS (1. 5M)の方が SS- CS/DS (1. 0M) より高い応答性を誘発した (図 4) 。
試験した種々の増殖因子の中で、 FGF- 18は 5. Ofmolの固定化 SS - CS/DS (1. 5M)に 対して最も高い応答 （180arc seconds ) を示し、 これは増殖因子 1. 2ng (43fraol) に匹敵した。 このことは、 SS - CS/DS鎖 1つが、 平均 8. 6分子の FGF- 18 に結合したことを示す。 同様に、 SS- CS/DS (1. 5M)への各増殖因子の結合最大量を 計算し、 全ての増殖因子に対する結合能を評価し、 既報の CS- H (ヌタウナギ由来 のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖） およびへパリン （Hep) の結合能と比較して表 3にまとめた。 表 3 各種増殖因子と SS- CS/DS (1. 5M)標品の結合能
Figure imgf000025_0002
以上の結果は、 SS- CS/DS鎖が CS-H鎖より、 多くの Hep結合性増殖因子に結合す ることを示した。 Hepと比較しても、 SS - CS/DS (1. 5M)は、 大部分の増殖因子に対 して 1多糖鎖につき、 より多くの増殖因子と結合した。
同じ長さのグリコサミノダリカン鎖に結合する増殖因子の数として、 その結合 能を表した場合も SS- CS/DS (1. 5M)の方が、 CS-Hより数倍結合能が高かった （表 3 右欄） 。 Hepと比較すると数倍低いにもかかわらず、 SS - CS/DS (1. 5M)の硫酸化度
(S/Unit = 1. 17) 力 ¾epの硫酸化度 （S/Uni t = 2. 55) より低いことを考慮する と配列特異性が高いことを示していると考えられる。
結合親和性を決定するために、 様々な濃度の増殖因子を、 固定化 SS -
CS/DS (1. 5M)標品と相互作用させた。 図 5—：！〜 5— 3に、 FGF- 2 (A) 、 FGF - 10
(B) 、 FGF-18 (C) 、 HB-EGF (D) 、 MK (E) 、 PTN (F) でのセンサーグラムを示 した。 全ての増殖因子は、 増殖因子の典型的な結合するパターンを示した。
IAsysシステムで得られた により、 全ての増殖因子は、 SS- CS/DS (1. 5M)と高 親和性であることが明らかとなった （表 4) 。 FGF - 18
Figure imgf000025_0001
と ΗΒ - EGF (¾
= 4. 5ηΜ) が最も高い親和性を示し、 ΡΤΝ ¾= 7. 6ηΜ) と FGF - 10 (Kj= 8. 6nM) が 次いで高い親和性を示した。
PTNと DS ' (ブタ皮膚由来： IdoUAだけを含む） との相互作用はすでに報告され ており、 51nMの が IAsysシステム （Vacherot, Fら （1999) J. Biol . Chera. 274,
7741-7747) で得られているが、 SS- CS/DS (1. 5M)の は 7. 6nMであった （表 4) 。 表 4
Figure imgf000026_0001
この相違は使用される SS-CS/DS標品の構造上の相違によるかも知れず、 ΡΤΝの 結合に対する SS - CS/DSのハイプリッド構造の重要性が示唆され、 ブタ胚脳由来の CS/DS鎖についての最近の知見と一致する （Bao， Xら （2004) J. Biol. Chem. 79， 9765-9776) 。
面白いことに、 種々の増殖因子に対する SS - CS/DS (1. 5M)によって示された親和 性は、 FGF- 2と HB- EGFを除いて、 Hepの増殖因子への親和性より高かった （表 4) 。 これらの増殖因子への SS- CS/DSの高結合能、 親和性および特異性は、 CS/DSハイ プリッド構造の重要性を示唆するものである。
<方法〉
実施例 5 BDNFと GDNFと SS - CS/DS (1. 5M) の相互作用
SS-CS/DS (1. 5M) と BDNFと GDNFの相互作用の分析は、 BIAcore J system (BIAcore AB社、 ウプサラ、 スウェーデン） を用いて行なった。 ビォチン標識さ れた SS- CS/DS (1. 5M)をストレプトアビジンでコートしたセンサ 'チップ上に固定 し、 BDNFと GDNFをそれぞれ種々の濃度で、 センサ .チップ上に流した （高流速
(60 / 1/分） ） 。 結合相 2分'間、 解離相3分間とした。 力イネティックパラメータ k。、 kdおよび Kdは、 BIA evaluation 3. 1ソフトウェアを使用して算出した。
<結果 >
過剰量の BDNFと GDNFで試験した結果、 SS- CS/DS (1. 5M) では GDNFへの結合の方 が BDNFへの結合より高かった （図 6A) 。
SS- CS/DS (1. 5M)の GDNFへの結合反応が CS- H (コントロール） に比べて 1. 5〜2. 2 倍程度であったにもかかわらず、 BDNFまたは GDNFへの SS-CS/DS (1. 5M)の結合能は、 CS - Hに比べて顕著に高かった （それぞれ 7· 9と 19. 0倍） 。 結果を表 5に示す。
表 5
Figure imgf000027_0001
実施例 6 精製 SS- CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) の神経突起成長促進作 用の検討
ぐ方法 >
既述 （Hikino, Mら （2003) J. Biol. Chem. 278, 43744-43754, Fassiner, A ら （1994) J. Cell Biol. 126， 783-799) の通り実施した。 カバーガラスを 37°C で 2時間、 1. 5 μ g/mlポリ DL-オルニチン (P- 0RN) 600 1でコートし、 2 / gの SS- CS/DSの 3標品 (Native, 1. 0M、 1. 5M) またはこれと等量のコンドロイチナーゼ ABC, AC-： [または Bで消化した SS- CS/DS消化物を各ゥヱルに入れ、 ー晚 37°Cでイン キュベートした。 イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸 Eをポジティブコントロー ルとした。
El6マウス胚から単離した海馬-ユーロンを 10， 000細胞/ mm2の密度で該カバー ガラス上に分散させ、 イーグル最小必須培地中にて C025%下で 37° (：、 24時間培養 した。 その後、 細胞を固定化してニューロフィラメント （NF) と微小管関連タン パク質 （MAP2) に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行なった。
各々のカバーガラスの免疫染色された細胞を顕微鏡下でカウントした。 無作為 に選択した細胞の最も長い神経突起の長さと神経突起の数は、 画像分析ソフトゥ エア (MacSCOPE; 三谷商事 (株）、 福井、 日本） を使用して測定した。
<結果 >
神経突起伸長促進活性を、 伸長した最長の神経突起の長さで示すと、 SS- CS/DS の3標品 （Native, 1· 0Μ、 1. 5Μ) で神経突起伸長促進が認められ、 いずれも CS - Ε より上回っていた （図 7— 1 A) 。
また、 神経突起伸長促進活性は、 SS-CS/DS (Native) , SS - CS/DS (1· 5M)、 次いで SS-CS/DS (1. 0M)の順で高かった。
SS- CS/DS (Native)をコートしたカバーガラス上で培養した-ユーロンは、 コン トロールとした P - 0RNコートのみのカバーガラス上で培養した細胞 （図 7— 2 E) に比べて、 神経突起が伸長している様子が観察された （図 7— 2 D) 。
また、 SS- CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) 上で培養した細胞では、 1細胞 あたり平均 3本以上の神経突起があった （図 7— 1 C) 。
SS-CS/DS (Native)の構造と神経突起伸長促進活性の関係を調べるために、 コン ドロイチナーゼ ABC、 AC-Iまたは Bで消化物について神経突起伸長促進活性を評価 した。 その結果全ての消化物で、 神経突起伸長促進活性が消失した （図 7— 1 B) 。 従って、 CS様構造と DS様構造が共に活性に関与していると考えられる。 実施例 7 抗ファクタ一 Ila活性測定
<方法〉
抗ファクター Ila活性は、 1〜10 // β/ηι1の SS - CS/DSの 3標品 （Native、 1. 0M、 1. 5M) を含む 227mM NaCl含有 50mM Tris - HC1バッファー 100 μ 1 (ρΗ 8. 3) と、 正 常ヒト血漿 60 ^ 1とヒトトロンビン （1. 2 ΝΙΗ単位/ ml) 40 z lとを、 1分間 25°Cで インキュベートすることによって測定した （Sakai， Sら （2003) Carbohydr. Res. 338, 263 - 269) 。 トロンビンのアミ ドリティック （araidolytic) 活性は、 1. 9 mol/ml chromozym TH を 100 1を添加後、 100秒間 405nmで、 吸光度の変化 を測定することにより決定した。 吸光度の変化率は、 残存トロンビン活性と比例 していた。 ブタの皮膚由来のへパリンおよびデルマタン硫酸をポジティブコント ローゾレとした。
<結果〉
SS- CS/DSの 3標品 （Native, 1. 0M、 1. 5M) で、 ポジティブコントロールと同等 のトロンビン活性阻害を示した。 SS-CS/DS (Native)は、 他の 2つの SS- CS/DS (1. 0M 1. 5M)よりわずかに高い抗ファクター Ila活性を示した （図 8 ) 。
実施例 8 ヌタウナギ脊索からのコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリ ッド鎖画分の分離
<方法〉
ヌタゥナャ (hagfish) Eptatretus burgeriの脊索 (notochord) をアセトンで 処理し、 懸濁液にプロナーゼを添加し消化した。 20%のトリクロ口酢酸を加えて 遠心分離し、 タンパク質を沈殿させ、 上清を回収した。 2倍量の 2. 5%酢酸カルシ ゥム含有のエタノールを加えてダリコサミノダリカンを沈殿させた。 ダリコサミ ノグリカン混合物は Dowex 1- C1—カラムを通して、 NaCl溶液にてステップワイズ に溶出し、 2· 0M画分について Shively and Cornadの方法に従いへパラン硫酸を除 去した。 亜硝酸処理後、 0. 5Mの Na2C03で中和して、 セフアデックス G- 50カラム (1x56cm) で脱塩した。 脱塩したグリコサミノダリカン画分から遊離のペプチド を除去するために、 Sep- Pak C18カートリッジカラムに通して、 水で溶出した。 <結果 >
精製の結果、 2. 0M NaClで溶出された画分にコンドロイチン硫酸/デルマタン硫 酸ハイブリ ッ ド鎖 （CS/DS鎖） が含まれていた。 ヌタ ウナギ （hagfish ) Eptatretus burgeriの脊索 (notochord) からこのように単離した CS/DS鎖を、 こ こでは HN - CS/DSと呼ぶことにする。
実施例 9 分子量決定
ぐ方法 >
Superdex 200カラム （10 X 300mm) のゲル濾過でコンドロイチン硫酸/デルマタ ン硫酸ハイプリッド CS/DS鎖の分子サイズを測定した。 HN- CS/DSをカラムにロー ドし、 0. 3ml/分の流速で 0. 2Mの酢酸アンモニゥムで溶出した。 3分間の溶出分を 1 画分に回収し、 蒸発乾燥して、 100 1水で溶解した。 測定は既報
(Chandrasekhar, S. , et al (1987) Anal Biochera. 161, 103-108) に従った。 <結果 >
HN - CS/DSの分子をゲルろ過カラムクロマトグラフィ一にて調べたところ、 HN - CS/DSの平均分子量は 18kDaでブタの皮膚由来デルマタン硫酸 （19kDa) やゥナギ 皮膚由来デルマタン硫酸 （14kDa) に近いものであった。
実施例 1 0 二糖組成分析
<方法〉
酵素消化
二糖組成分析は、 コンドロイチナーゼ ABC、 Bまたは AC - 1の消化物を分析するこ とにより行なった。
0. 5 gの HN- CS/DSを、 lOmlUのコンドロイチナーゼ ABC、 5mIUのコンドロイチナ ーゼ AC- 1、 または lmlUのコンドロイチナーゼ Bのいずれかで消化し、 各々の消化 物を既報 (Kinoshita, A. , Sugahara, K (1999) Anal. Biochera. 269, 367-378) に従って 2-ァミノべンズアミ ド （2AB) で標識した （過剰な 2ABは水：クロ口ホル ム 1 ： 1 (v/v) 混合物で除去した） 。
2ABで標識した二糖は、 l6mMの Na¾P04 400 1で希釈し、 陰イオン交換 HPLC (l6mMおよび 5:30mMの Na¾P04の溶媒を使用した PA- 03シリカカラム）によって 分析した。
Superdex Peptide カラムを用いた HN - CS/DSのコンドロイチナーゼ消ィヒ物のゲノレ ろ過分析
HN - CS/DSを、 コンドロイチナーゼ ABC、 AC- 1あるいは Bで消化した。
それぞれの消化物を 2ABで標識し、 7°/。 1-プロパノール含有 0. 2M重炭酸アンモ ニゥムにて溶解し、 Superdex Peptideカラムを使い、 蛍光検出にて分析した （流 速 0. 4 ml/分） 。
<結果〉
蘭- CS/DSの主要構成成分は、 A HexUAひ 1- 3GalNAc (4S， 6S) ( Δ Di- diSE)、 Δ HexUAひ 1— 3GalNAc(4S) ( ADi- 4S)であった。 また、 AHexUA α 1 - 3GalNAc (6S) Di— 6S)、 Δ HexUA a l-3GalNAc ( Δ Di—OS) 、 Δ HexUA(2S) a l-3GalNAc (4S， (ADi-triS) も含まれていた （表 6 ) 。 表 6
Figure imgf000031_0001
実施例 1 1 種々の増殖因子との相互作用分析
ぐ方法 >
HN- CS/DSと種々の増殖因子 （FGF- 2、 FGF- 10、 FGF- 16、 FGF- 18、 PTN、 MK、 HB - EGF、 VEGF) との相互作用分析は、 BIAcore system (BIAcore社、 Uppsala、 Sweden) を用いて行なった。 力イネティックパラメータ ka、 kdおよぴ は、 BIA evaluation 3· 1ソフトウェアを使用して算出した。
<結果 >
結合親和性を決定するために、 様々な濃度の増殖因子を、 固定化した HN- CS/DS と相互作用させた。 図 9 - 1力、ら図 9 -4に、 HN- CS/DSの FGF - 2 (A) 、 FGF- 10 (Β) (図 9— 1 ) 、 FGF-16 (C) 、 FGF— 18 (D) (図 9— 2) 、 ΜΚ (Ε) 、 PTN (F) (図 9-3) 、 HB- EGF(G)、 VEGF(H) (図 9-4) でのセンサーグラムを示した。 調べた全ての増殖因子は、 増殖因子の典型的な結合パターンを示した。
調べた全ての増殖因子は、 HN- CS/DSと高親和性であることが明らかとなつた (表 7) 。 特に FGF - 18 (Kd = 0.2nM) 、 FGF- 10 (Kd = 0.4nM) と PTN (Kd = 0.17n ) で高い親和性を示した。 表 7
Figure imgf000032_0001
実施例 1 2 神経栄養因子と HN- CS/DSの相互作用
ぐ方法〉
ΗΝ - CS/DSと BDNFと GDNFの相互作用の分析は、 BIAcore J system (BIAcore社、 Uppsala, Sweden) を用いて行なった。 ビォチン標識された顕- CS/DSをストレプ トァビジンでコートしたセンサ ·チップ上に固定し、 BDNFと GDNFをそれぞれ種々 の濃度で、 センサ ·チップ上に流した （高流速 （60 1/分） ） 。 結合相 2分間、 解離相 3分間と した。 力イネティ ックパラメータ ka、 kdおよび Kdは、 BIA evaluation 3· 1ソフトウェアを使用して算出した （表 8 ) 。
ぐ結果 >
表 8
Figure imgf000032_0002
HN - CS/DSをセンサ .チップ上に固定し、 BDNFと GDNFをそれぞれ種々の濃度で センサ ·チップ上に流した際のセンサーグラムを図 1 0に示す。
HN- CS/DSの GDNFへのァフィ二ティーはへパラン硫酸 （HS) と GDNFとのァフィ二 ティーに比べて 10倍程度高く、 BDNFへのァフィ二ティーは 360倍と顕著に高かつ た。 これらの高い結合親和性はコンドロイチン硫酸、 デルマタン硫酸あるいは
CS/DSハイプリッド鎖構造が結合に重要ことを示唆している。
この神経栄養因子との高い結合親和性は初めて報告されたもので、 HSに比べて 効率的な結合を示していることから、 HSとは異なる結合様式で働き、 神経栄養因 子の活性を調節していると推測される。
実施例 1 3 神経突起成長促進作用の検討
<方法〉
既述 （Hikino, Mら （2003) J. Biol. Chem. 278, 43744-43754, Fassiner, A ら （1994) J. Cell Biol. 126， 783-799) の通り実施した。 カバーガラスを 37°C で 2時間、 1. 5 z g/mlポリ DL-オル二チン （P - 0RN) 600 1でコートし、 0. 7 μ gの HN - CS/DSまたはコンドロイチナーゼ ABC、 AC- 1または Bで消化したこれと等量の消 化物を各ゥエルに入れ、 ー晚 37°Cでインキュベートした。 イカ軟骨由来の CS- Eを ポジテイブコント口一ノレとした。
E16マウス胚から単離した海馬ニュ一ロンを 10, 000細胞/ mm2の密度で該カバー ガラス上に分散させ、 イーグル最小必須培地中にて C025%下で 37°C、 24時間培養 した。 その後、 細胞を固定化して-ユーロフィラメント （NF) と微小管関連タン パク質 （MAP2) に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行なった。
各々のカバーガラスの免疫染色された細胞を顕微鏡下でカウントした。 無作為 に選択した細胞の最も長い神経突起の長さと神経突起の数は、 画像分析ソフトゥ エア (Mac SCOPE; Mitani Corp.、 東京、 日本） を使用して測定した。
<結果〉
神経突起伸長促進活性を、 伸長した最長の神経突起の長さで示すと、 コント口 ールに比べ神経突起伸長促進が認められた （図 1 1一 2 C) 。
HN- CS/DSをコートした力パーガラス上で培養したニューロンは、 コントローノレ とした P- 0RNのみをコートしたカバーガラス上で培養した細胞 （図 1 1— 1 B) に 比べて、 神経突起が伸長している様子が観察された （図 1 1一 1 A) 。
HN-CS/DSの構造と神経突起伸長促進活性の関係を調べるために、 コンドロイチ ナーゼ ABC、 AC- 1または Bで処理した消化物について神経突起伸長促進活性を評価 した。 その結果コンドロイチナーゼ ABC消化物で、 神経突起伸長促進活性が消失 した。 一方、 コンドロイチナーゼ AC-Iまたは Bによる分解でも、 コンドロイチナ ーゼ ABCで消化したときよりは活性低下の程度は低かったが、 はっきりと活性の 低下が認められた （図 1 1— 2 C) 。 このことは、 グルクロン酸を含む CS様の構 造とィズロン酸を含む DS様の構造からなる CS/DSハイプリッド構造が神経突起伸 長促進活性に関与していることを示している。 産業上の利用可能性
本発明により、 種々の増殖因子に結合し、 神経突起伸長促進作用および抗凝血 作用を示す、 新規コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖およびそ れを含む画分が提供され、 さらに、 それを含んだ神経性治療用組成物を提供され る。 また、 本発明のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖はサメ 皮、 ヌタウナギ等の硬骨魚類を除く魚類由来であり、 魚類の有用な用途が本発明 により見出された。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取り 込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の 範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは 当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形および変更を も包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1 . GlcUA (2S) -GalNAc (4S) (B ユニット） の二糖を含むコンドロイチン硫酸/デ ルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
2 . GlcUA(2S) -GalNAc (4S) (B ユニット） を含み、 さらに、 GlcUA - GalNAc (4S) (A ユニット） 、 GlcUA— GalNAc (6S) (C ユニッ ト） 、 GlcUA (2S)—GalNAc (6S) (D ュ ニッ ト） 、 GlcUA- GalNAc (4S， 6S) (E ュニッ ト） および硫酸化されていない GlcUA- GalNAc (0 [ォ一]ュニット）からなる群から選択される少なくとも 1つのュ ニット、 ならびに IdoUA a 1- 3GalNAc (4S) (iAユニット）、 I doUA (2S) -GalNAc (4S)
(iB ユニット） 、 IdoUA a l— 3GalNAc (6S) (iCユニット）、 IdoUA (2S) - GalNAc (6S) (iDュニット） および IdoUA - GalNAc (4S， 6S) (iE ュニット） からなる群から選 択される少なくとも 1つのュニットを含む、 請求項 1に記載のコンドロイチン硫 酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
3 . 平均分子量が 65〜75kDaである、 請求項 1または 2に記載のコンドロイチン 硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド鎖。
4 . 二糖 1分子当たりの硫酸化度が 0. 70以上 1. 2未満の範囲内である、 請求項 1 〜 3のいずれか 1項に記載のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイプリッド 鎖。
5 . サメ皮由来である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のコンドロイチン硫 酸/デルマタン硫酸ハイブリッド鎖。
6 . 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸 ハイブリッド鎖を含む、 グリコサミノダリカン。
7 . 請求項 6記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 増殖因子結合 剤。
8 . 請求項 6記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 神経突起伸長 促進剤。
9 . 請求項 6記載のグリコサミノグリカンを活性成分として含む、 抗凝血剤。
1 0 . 請求項 6記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 医薬組成物。
1 1 . 請求項 6記載のグリコサミノダリカンを活性成分として含む、 神経変性疾 患を予防または治療するための医薬組成物。
1 2. 増殖因子結合剤、 神経突起伸長促進剤、 抗凝血剤または神経変性疾患治療 用組成物を製造するための請求項 6記載のダリコサミノダリカンの使用。
1 3. 硬骨魚類を除く魚類由来であるコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸ハイ ブリッド鎖を含むグリコサミノダリカン。
1 4. GlcUA-GalNAc(4S) (Aユニット) 、 GlcUA(2S)- GalNAc (4S) (B ユニット） GlcUA-GalNAc (6S) (C ュ-ッ ト） 、 GlcUA(2S)— GalNAc (6S) (D ュニッ ト） 、 GlcUA - GalNAc (4S， 6S) (E ユニット） 、 GlcUA(2S) β l-3GalNAc (4S, 6S) (Tュニッ ト）および硫酸化されていない Gl cUA-GalNAc (0 [ォー ]ユニット）からなる群から選 択される少なくとも 1つのユニット、 ならびに IdoUAal - 3GalNAc(4S) (iAュニッ ト）、 IdoUA(2S) -GalNAc (4S) (iB ユニッ ト） 、 IdoUAひ 1— 3GalNAc (6S) (iCュニッ ト）、 IdoUA(2S) -GalNAc (6S) (iD ユニッ ト） 、 IdoUA - GalNAc (4S， 6S) (iE ュニ ット） および IdoUA (2S) a l~3GalNAc (4S, 6S) (iTュニット）からなる群から選択さ れる少なくとも 1つのュュットを含む、 請求項 1 3に記載のコンドロイチン硫酸 /デルマタン硫酸ハイブリッド鎖を含むグリコサミノグリカン。
1 5. 請求項 1 3または 1 4に記載のダリコサミノダリカンを活性成分として含 む、 増殖因子結合剤。
1 6. 請求項 1 3または 1 4に記載のダリコサミノグリカンを活性成分として含 む、 神経突起伸長促進剤。
1 . 請求項 1 3または 1 4に記載のダリコサミノダリカンを活性成分として含 む、 神経変性疾患治療用組成物。
1 8. 請求項 1 3または 1 4に記載のダリコサミノダリカンを活性成分として含 む、 医薬組成物。
1 9. 請求項 1 3または 1 4に記載のダリコサミノダリカンを活性成分として含 む、 神経変性疾患を予防または治療するための医薬組成物。 ならびに
2 0. 増殖因子結合剤、 神経突起伸長促進剤、 または神経変性疾患治療用組成物 を製造するための請求項 1 3または 1 4に記載のグリコサミノダリカンの使用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007016099A (ja) * 2005-07-06 2007-01-25 Japan Science & Technology Agency プレイオトロフィン結合性および非結合性のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸オリゴ糖
JP2007224286A (ja) * 2006-01-25 2007-09-06 Tottori Univ 生体組織からの多糖類の取得方法
JP2007291322A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Maruha Corp 新規多糖およびオリゴ糖
US8481711B2 (en) 2010-07-06 2013-07-09 Hidenori Kamanishi Neurite outgrowth agent
JP2020173228A (ja) * 2019-04-12 2020-10-22 株式会社島津製作所 グリコサミノグリカンの分析方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101633701B (zh) * 2008-07-23 2011-10-05 上海景峰制药有限公司 一种透明质酸的纯化方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0930979A (ja) * 1995-07-24 1997-02-04 Seikagaku Kogyo Co Ltd 神経疾患の治療剤

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0930979A (ja) * 1995-07-24 1997-02-04 Seikagaku Kogyo Co Ltd 神経疾患の治療剤

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIYAMA F. ET AL.: "Anticoagulant Activity of Dermatan Polysulfates", TOHOKU JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 136, no. 4, 1982, pages 359 - 365, XP002993447 *
HIKINO M. ET AL.: "Oversulfated Dermatan Sulfate Exhibits Neurite Outgrowth-promoting Activity toward Embryonic Mouse Hippocampal Neurons: IMPLICATIONS OF DERMATAN SULFATE IN NEURITOGENESIS IN THE BRAIN", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 278, no. 44, 2003, pages 43744 - 43754, XP002993445 *
HIKINO M. ET AL: "TARYUSANKA DERMATAN RYUSAN WA SHINKEI TOKKI SHINCHO SOKUSHIN KASSEI O YUSURU.", SEIKAGAKU, vol. 74, no. 8, 25 August 2002 (2002-08-25), pages 734, XP002993446 *
KOSHIISHI I. ET AL.: "Analysis of chondroitin sulfate/dermatan sulfate chains in rat peritoneal resident macrophages", BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 16, no. 3, 1993, pages 307 - 308, XP000856226 *
NANDINI C.D. ET AL.: "Novel 70-kDa Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate Hybrid Chains with a Unique Heterogenous Sulfation Pattern from Shark Skin, Which Exhibit Neuritogenic Activity and Binding Activities for Growth Factors and Neurotrophic Factors", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 280, no. 6, 2005, pages 4058 - 4069, XP002993442 *
NANDINI C.D. ET AL.: "Structural and Functional Characterization of Oversulfated Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate Hybrid Chains from the Notochord of Hagfish: NEURITOGENIC AND BINDING ACTIVITIES FOR GROWTH FACTORS AND NEUROTROPHIC FACTORS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 279, no. 49, 2004, pages 50799 - 50809, XP002993443 *
SUGAHARA K. ET AL.: "Structure and Function of Oversulfated Chondroitin Sulfate Variants: Unique Sulfation Patterns and Neuroregulatory Activities", TRENDS IN GLYCOSCIENCE AND GLYCOTECHNOLOGY, vol. 12, no. 67, 2000, pages 321 - 349, XP002993444 *
ZANETTA J.P. ET AL.: "Evidence for a Lectin Activity for Human Interleukin 3 and Modeling of Its Carbohydrate Recognition Domain", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 41, 2002, pages 38764 - 38771, XP002993448 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007016099A (ja) * 2005-07-06 2007-01-25 Japan Science & Technology Agency プレイオトロフィン結合性および非結合性のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸オリゴ糖
JP2007224286A (ja) * 2006-01-25 2007-09-06 Tottori Univ 生体組織からの多糖類の取得方法
JP2007291322A (ja) * 2006-03-31 2007-11-08 Maruha Corp 新規多糖およびオリゴ糖
US8481711B2 (en) 2010-07-06 2013-07-09 Hidenori Kamanishi Neurite outgrowth agent
JP2020173228A (ja) * 2019-04-12 2020-10-22 株式会社島津製作所 グリコサミノグリカンの分析方法
JP7185232B2 (ja) 2019-04-12 2022-12-07 株式会社島津製作所 グリコサミノグリカンの分析方法

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