JP2020173228A - グリコサミノグリカンの分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】グリコサミノグリカン由来の二糖を安定的に且つ高い再現性で分析することができる方法を提供する。【解決手段】本発明のグリコサミノグリカンの分析方法は、生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程とを備え、前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアミド基が結合された固相担体が充填されたカラム、又は官能基であるアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである。【選択図】図１

Description

本発明は、グリコサミノグリカンの分析方法に関する。

グリコサミノグリカン（以下「ＧＡＧ」と略する）は、ウロン酸又はガラクトースとヘキソサミンからなる二糖を構成単位として、それが繰り返し配列した構造を有する直鎖状の多糖である。二糖の組成によりヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、へパラン硫酸などに分類される。ＧＡＧは、細胞膜、細胞外基質にタンパク質結合型あるいは非結合型として生体内に存在する多糖類として知られ、生化学、生物学、薬学、医学等の分野において注目されている物質である。

例えばＧＡＧの分解代謝に関係する酵素の先天的な障害（活性低下）又は欠損によって起こる疾患の一つにムコ多糖症（mucopolysaccharidoses）がある。ムコ多糖症では、障害を受けている、又は欠損している酵素の種類に応じて特異的なＧＡＧが生体組織中に蓄積する。したがって、血液等の生体試料中に含まれるＧＡＧの種類を分析することにより、ムコ多糖症を診断することができる。

従来、生体試料に含まれるＧＡＧは、分解酵素により二糖に分解した後、液体クロマトグラフィで分離し、吸光度や蛍光強度等の光強度を測定することにより分析する方法が用いられていた。ところが、液体クロマトグラフィでは二糖を十分に分離することができないため、複数種類のＧＡＧを同時に測定することが難しかった。

これに対して、特許文献１および非特許文献１には、液体クロマトグラフィ質量分析法を用いることにより、生体試料に含まれる複数種類のＧＡＧを同時に分析できる方法が開示されている。特許文献１に記載の方法では、液体クロマトグラフィのカラムとして逆相カラム又はハイパーカーブ（Hypercarb（登録商標））カラムが用いられ、非特許文献１の記載の方法では、ハイパーカーブカラムが用いられている。

特開2008-102114号公報

Shunji Tomatsu, et al., "Establishment of Glycosaminoglycan Assays for Mucopolysaccharidoses" Metabolites 2014, 4, 655-679; doi:10.3390/metabo4030655

逆相カラムは液体クロマトグラフィにおいて一般的に使用されるカラムであるものの、ＧＡＧを構成する二糖のような高極性化合物の保持力が弱く、安定的に分離分析することが困難である。一方、ハイパーカーブカラムは多孔性グラファイトカーボンから成る基材が充填されたカラムであり、高極性化合物の保持、分離に優れるという性質を有している。しかし、ハイパーカーブカラム製品ロット間で保持性能、分離性能等のばらつきがあり、ばらつきの大きさによっては分析の再現性が低くなるという問題があった。

本発明が解決しようとする課題は、グリコサミノグリカン由来の二糖を安定的に且つ高い再現性で分析することができる方法を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明の第１の態様は、
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアミド基（カルバモイル基）が結合された固相担体が充填されたカラムである、グリコサミノグリカンの分析方法に関する。

また、上記課題を解決するための成された本発明の第２の態様は、
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィのカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、グリコサミノグリカンの分析方法に関する。

本発明に係るグリコサミノグリカンの分析方法では、生体試料中のグリコサミノグリカンを酵素により分解して複数種類の二糖を生成した後、これら二糖を、液体クロマトグラフィ質量分析法を用いて分離し、分析する。グリコサミノグリカンを構成する二糖は、多数の硫酸基とカルボキシル基を有する、強く負に帯電した高極性化合物である。本発明においては、液体クロマトグラフィ質量分析における液体クロマトグラフィで、高極性化合物と強く結合する官能基であるアミド基又はアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムを用いたため、グリコサミノグリカンを安定的に且つ高い再現性で分析することができる。

５種類の二糖、および１種類の内部標準物質（コンドロシン）のそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析することにより得られたＭＲＭクロマトグラム。 ６種類の二糖、および１種類の内部標準物質（コンドロシン）のそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析することにより得られたＭＲＭクロマトグラム。 血液（全血）試料に含まれるグリコサミノグリカンを液体クロマトグラフィ質量分析装置を用いて分析することにより得られたＭＲＭクロマトグラム。 血液（血清）試料に含まれるグリコサミノグリカンを液体クロマトグラフィ質量分析装置を用いて分析することにより得られたＭＲＭクロマトグラム。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

［実施例１］
まず、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いたＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定により、生体試料に含まれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分析が可能かどうかを検討した。
＜試料の調製＞
以下の表１に示す既知の化合物（定量分析のための内部標準物質（コンドロシン）を含む）の１μmol/L水溶液を調製し、これを試料とした。表１に示す化合物は全て生化学工業株式会社より購入した。

表１中、「ＣＳ」はコンドロイチン硫酸、「ＤＳ」はデルマタン硫酸、「ＨＳ」はヘパラン硫酸、「ＫＳ」はケラタン硫酸の略号である。
また、ΔＤｉ−４Ｓ、Ｄｉ−０ＳはそれぞれＣＳ、ＤＳがコンドロイチナーゼＢで分解（消化）されてできる二糖であり、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓはヘパラン硫酸がヘパリチナーゼにより分解されてできる二糖であり、Ｇａｌ−ＧｌｃＮａｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮａｃ（６Ｓ）はケラタン硫酸がケラタナーゼＩＩで分解されてできる二糖である。

また、液体クロマトグラフィ質量分析に用いた装置名、分析条件は以下の通りである。
＜装置＞
液体クロマトグラフ：超高速液体クロマトグラフNexera X2（株式会社島津製作所製）
質量分析計：超高速トリプル四重極型質量分析計LCMS-8050（株式会社島津製作所製）

＜ＬＣ分析条件＞
カラム ：イナートサステインアミドカラム（株式会社ジーエルサイエンス）
（2.1mmI.D. × 100mmL, 3.0μm）
移動相 ：移動相Ａ 5mmol/Lギ酸アンモニウム−アセトニトリル
移動相Ｂ ギ酸アンモニウム−超純水
グラジエント：Ｂ 濃度５重量％（0-1min）→３０重量％（4min）→９０重量％（5-8min）→５重量％（8.01-13min）
流速 ：0.3mL/min
カラム温度 ：40℃
注入量 ：1μL

＜ＭＳ分析条件＞
イオン化モード ：ESI（negative）
分析モード ：ＭＲＭ
ネブライザーガス流量 ：3.0L/min
ドライングガス流量 ：10.0mL/min
インターフェースガス流量：10.0L/min
インターフェース温度 ：300℃
脱溶媒管（DL）温度 ：250℃
ヒートブロック温度 ：400℃

また、表１に示した二糖のうちΔＤｉＨｓ−６Ｓを除く二糖のプリカーサーイオンとプロダクトイオンのm/z（この組合せをＭＲＭトランジションという）、ＣＥを表２に示す。表２に示す値は二糖の検出感度、同重体との分離を考慮して設定したものである。ただし、ΔＤｉＨｓ−６Ｓとプリカーサーイオンが同じであるΔＤｉ−４Ｓは、質量分析（ＭＳ/ＭＳ）するとΔＤｉＨｓ−６Ｓと同じプロダクトイオン（m/z ３００．１０）が生成されるため、両者をＭＳ分離して検出することができない。また、ΔＤｉ−０Ｓとプリカーサーイオンが同じであるΔＤｉＨＳ−０Ｓは、ＭＳ/ＭＳするとΔＤｉ−０Ｓと同じプロダクトイオン（m/z １７５．１０）が生成されるため、両者をＭＳ分離して検出することができない。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムを図１に示す。図１には、上から順に、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉＨｓ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮａｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮａｃ（６Ｓ）、コンドロシンのそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが示されている。図１の最上段のＭＲＭクロマトグラムに示すように、ΔＤｉ−４Ｓのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとした場合は、ΔＤｉ−４ＳのピークにΔＤｉＨＳ−６Ｓのピークが重なり、両者はＬＣ及びＭＳのいずれにおいても分離できないことが分かる。このことは、ΔＤｉ−４ＳとΔＤｉＨＳ−６Ｓの液体クロマトグラフィにおける溶出時間が同等であることを意味する。

このように液体クロマトグラフィ及び質量分析のいずれにおいても分離できない複数種類の二糖を分析対象成分とする場合は、複数種類の二糖のいずれか一種類の二糖を生成する酵素を生体試料に添加した試料、別の一種類の二糖を生成する酵素を生体試料に添加した試料、さらに別の一種類の二糖を生成する酵素を生体試料に添加した試料等、を順に調製し、それら試料を順に液体クロマトグラフィ質量分析する。これにより、複数種類の二糖をそれぞれ個別に分析することができる。

［実施例２］
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフィにおけるカラムの種類を変更して、実施例１と同じ試料についてＬＣ／ＭＳを用いたＭＲＭ測定を行った。ＬＣ分析条件、ＭＳ分析条件は以下の通りである。

＜ＬＣ分析条件＞
カラム ：カプセルパックイナートアドメカラム（株式会社大阪ソーダ）
（2.0mmI.D. × 150mmL, 3.0μm）
移動相 ：移動相Ａ 0.1%ギ酸−超純水
移動相Ｂ 0.1%ギ酸−アセトニトリル
イソクラティック：Ｂ 濃度 ２重量％
流速 ：0.3mL/min
カラム温度：５０℃
注入量 ：1μL

＜ＭＳ分析条件＞
イオン化モード ：ESI（negative）
分析モード ：ＭＲＭ
ネブライザーガス流量 ：3.0L/min
ドライングガス流量 ：10.0mL/min
ヒーティングガス流量 ：10.0mL/min
インターフェース温度 ：150℃
脱溶媒管（DL）温度 ：150℃
ヒートブロック温度 ：400℃

ＭＲＭ測定の条件（ＭＲＭトランジション及びＣＥ）は実施例１と同じ（表２）である。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムを図２に示す。図２には、上から順に、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉＨｓ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、コンドロシンのそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが示されている。ただし図２に示すように、一番上のＭＲＭクロマトグラムには、ΔＤｉ−４ＳのピークとΔＤｉＨｓ−６Ｓのピークがみられ、上から２番目のＭＲＭクロマトグラムには、ΔＤｉ−０ＳのピークとΔＤｉＨＳ−０Ｓのピークがみられる。また、上から５番目のＭＲＭクロマトグラムには、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）の２つのピークがみられる。

１個のＭＲＭクロマトグラムにおいて２個のピークが存在する二糖は、液体クロマトグラフィ質量分析の際にアノマー分離が起きていたと考えられる。例えば図２の一番上のＭＲＭクロマトグラムには３個のピークがみられ、これらのうち左側のピークと中央のピークの一部はΔＤｉ−４Ｓのピークを、右側のピークと中央のピークの一部はΔＤｉＨＳ−６Ｓのピークを示している。これは、ΔＤｉ−４Ｓ及びΔＤｉＨＳ−６Ｓの両方にアノマー分離が起き、ΔＤｉ−４Ｓのアノマーのうち保持力の強いアノマーの保持時間と、ΔＤｉＨＳ−６Ｓの二つのアノマーのうち保持力の弱いアノマーの保持時間が近接していた結果、両者のピークが合わさった結果、ＭＲＭクロマトグラムに３個のピークが現れたものである。また、図２の上から２番目のＭＲＭクロマトグラムには２個のピークがみられ、これらのうち左側のピークと右側のピークの一部はΔＤｉ−０Ｓのピークを、右側のピークの一部はΔＤｉＨＳ−０Ｓのピークを示している。これは、ΔＤｉ−０Ｓにアノマー分離が起き、保持力の強いアノマーのピークがΔＤｉＨＳ−０Ｓのピークと合わさった結果、ＭＲＭクロマトグラムには２個のピークが現れたものである。

複数種類の二糖のピークが合わさっているピークはそれら二糖の定量に用いることができない。したがって、このような場合は、他の二糖と合わさっていないピークを用いて、二糖の定量が行われる。具体的には、例えば図２の最上段のＭＲＭクロマトグラムでは、ΔＤｉ−４Ｓは、保持時間の短い左側のピークを用いて定量し、ΔＤｉＨＳ−６Ｓは、保持時間の長い左側のピークを用いて定量し、中央のピークはΔＤｉ−４Ｓ及びΔＤｉＨＳ−６Ｓのいずれの定量にも使用しない。

［実施例３］
生体試料として、ＧＡＧ特異的酵素であるコンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼ、ケラタナーゼＩＩの混合液を添加した血液（全血）をろ紙に含ませて乾燥させた乾燥ろ紙血（乾燥血液ろ紙（Dried Blood Spots（ＤＢＳ））試料を用い、該ＤＢＳ試料から抽出した二糖を含む回収物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入してＧＡＧの定量分析を行った。ＬＣ分析条件、ＭＳ分析条件、ＭＲＭの測定条件は実施例２と同じ条件に設定した。この実施例では、１０個のＤＢＳ試料（ＤＢＳ１〜１０）を用意した。ＤＢＳ試料から回収物を得、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入するまでの手順は以下の通りである。

＜二糖の回収及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳへの導入＞
１．各ＤＢＳ試料の血液が含浸している部分をＤＢＳパンチャー（PerkinElmer（登録商標）、株式会社パーキンエルマージャパン）で切り出してディスク（３．３ｍｍ）を得た。
２．ディスクを、100μLの0.1％ＢＳＡを含有する、９６ウェルフィルタープレート（Omega 10K、日本ポール株式会社）の各ウェルに入れた。
３．各ウェルにＧＡＧ特異的酵素（コンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼおよびケラタナーゼII）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
４．得られたＧＡＧの消化物をフィルタープレートでろ過し、得られたろ過液を2500×gで１５分間、遠心分離した後、回収物をＬＣ ／ ＭＳ ／ ＭＳに導入した。

＜分析結果＞
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムを図３に示す。図３には、それぞれ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨｓ−ＮＳ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、コンドロシンのそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが示されている。

表３は、各試料に含まれる二糖の定量結果を示している。定量値は、試料ＤＢＳ４に、表２に記載のコンドロシンの溶液（標準溶液）を１μｍｏｌ/Ｌ添加した試料を分析した結果を使って、１点検量（内部標準法）により算出した。

また、以下の表４は、試料中に含まれるマトリックス（夾雑物）の測定に対する影響を調べたものである。マトリックスの影響は、試料ＤＢＳ４に標準溶液を１μｍｏｌ/Ｌ添加した試料、１μｍｏｌ/Ｌの標準溶液、試料ＤＢＳ４の結果より算出した。

［実施例４］
生体試料として、ＧＡＧ特異的酵素であるコンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼ、ケラタナーゼＩＩの混合液を添加した血液（血清）試料を用い、各血清試料から抽出した二糖を含む回収物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入してＧＡＧの定量分析を行った。ＬＣ分析条件、ＭＳ分析条件、ＭＲＭの測定条件は実施例２と同じ条件に設定した。この実施例では、１０個の血清試料（Ｓｅｒｕｍ２、４、６〜２０）を用意した。血清試料から回収物を得、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入するまでの手順は、以下の通りである。

＜二糖の回収及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳへの導入＞
１．10μLの血清試料と90μLの50mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.0）を９６ウェルフィルタープレート（Omega 10K、日本ポール株式会社）のウェルに入れた。
２．各ウェルにＧＡＧ特異的酵素（コンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼおよびケラタナーゼII）を添加し、さらに60μLの50mMトリス-塩酸緩衝液（pH 7.0）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
３．９６ウェルフィルタープレートを2200×gで１５分間遠心分離した後、回収物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入した。

＜分析結果＞
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムを図４に示す。図３には、それぞれ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨｓ−ＮＳ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、コンドロシンのそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが示されている。

表５は、各試料に含まれる二糖の定量結果を示している。定量値は、血清試料Ｓｅｒｕｍ４に標準溶液を１μｍｏｌ/Ｌ添加した試料を分析した結果を使って、１点検量（内部標準法）により算出した。

また、以下の表６は、マトリックスの影響を調べたものである。マトリックスの影響は、血清試料Ｓｅｒｕｍ４に標準溶液を１μｍｏｌ/Ｌ添加した試料、１μｍｏｌ/Ｌの標準溶液、血清試料Ｓｅｒｕｍ４の結果より算出した。

以上、本発明における実施形態を詳細に説明したが、該実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

本発明の第１態様は、
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアミド基が結合された固相担体が充填されたカラムである、分析方法である。

また、本発明の第２態様は、
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィのカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、分析方法である。

本発明の第１態様、第２態様のグリコサミノグリカンの分析方法では、前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィのカラムを、官能基としてのアミド基、アダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムとした。アミド基及びアダマンチル基はいずれも、グリコサミノグリカンを構成する二糖のような高極性化合物との間の強い相互作用により該高極性化合物を保持する。したがって、グリコサミノグリカンを安定的に且つ高い再現性で分析することができる。

本発明の第１態様及び第２態様のグリコサミノグリカン（以下「ＧＡＧ」と略する）の分析方法における生体試料は、ＧＡＧを含んでおり、且つ、液体クロマトグラフィ質量分析法によりＧＡＧを分離、分析することができればどのようなものでも良く、具体例として血液（全血、血清、血漿）、尿、唾液、及び生体組織が挙げられる。生体試料の採取のし易さ、ＧＡＧの含有量の多さを考慮すると血液が好ましく、特に血漿又は血清が好適である。

本発明のＧＡＧの分析方法で使用されるＧＡＧ特異的酵素としては、ＧＡＧを特異的に分解する酵素であればどのようなものでも用いることができる。ムコ多糖症では、主にケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸が生体組織に蓄積することが知られている。したがって、本発明のＧＡＧの分析方法で得られた結果をムコ多糖症の診断に利用する場合は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヘパラン硫酸をそれぞれ特異的に分解する酵素を用いることが好ましい。また、本発明では、２種類以上の酵素を組み合せて用いることができる。ＧＡＧ特異的酵素の市販品としては、例えばケラタナーゼ、ケラタナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＩＩ、へパリナーゼ、コンドロイチナーゼＢなどが挙げられる。

上述したように本発明の第１態様では、固相担体に官能基としてのアミド基（カルバモイル基）が結合したカラムが、液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられる。このようなカラムの市販品として、例えばイナートサステインアミド（InertSustain（登録商標）Amide）分析カラム（ジーエルサイエンス株式会社）が挙げられる。これはＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Chromatography）系のカラムであり、極性化合物の分析に適している。

また、本発明の第２態様では、固相担体に官能基としてのアダマンチル基が結合したカラムが、液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられる。このようなカラムの市販品として、例えばカプセルパックイナートアドメ（CAPCELL PAK INERT ADME）カラム（株式会社大阪ソーダ）が挙げられる。これは逆相カラムであるが、従来の逆相カラムに比べて固相表面における疎水性と表面極性のバランスが良く、高極性化合物を安定的に分離することができる。

本発明の第１態様及び第２態様のいずれにおいても、カラムのサイズ（内径、長さ）、固相担体のサイズ、移動相の性質（ｐＨ）、移動相の流速、カラム温度等の分析条件によって、カラムに二糖が保持される時間が変化する。したがって、本発明では、カラムに保持された二糖が、質量分析する上で適切な時間（保持時間）でカラムから溶出してくるように、分析条件が適切に設定される。

特に本発明の第１態様及び第２態様のグリコサミノグリカンの分析方法では、液体クロマトグラフィのカラムとして特徴的な官能基が固相担体に結合したカラムを用いており、適切な移動相を選択することにより、グリコサミノグリカンを構成する二糖の当該カラムよる分離性能を高めることができる。

本発明の第３態様は、第１態様のグリコサミノグリカンの分析方法であって、前記第１工程において、前記複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素のうち、前記生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖のうち少なくとも１種の二糖を生成する第１酵素を前記生体試料に添加する工程と、前記複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素のうち、前記第１酵素によって生成される二糖以外のグリコサミノグリカン由来の１又は複数種類の二糖を生成する第２酵素を添加する工程とを備え、
前記第２工程において、前記第１酵素が添加された生体試料と、前記第２酵素が添加された生体試料を、それぞれ液体クロマトグラフィ質量分析するものである。

第３態様のグリコサミノグリカンの分析方法によれば、液体クロマトグラフィの保持時間が同等であり、且つ質量分析によっても分離して検出することができないような二糖を分析することができる。このような二糖の例として、ΔＤｉ−４ＳとΔＤｉＨＳ−６Ｓ、ΔＤｉ−０ＳとΔＤｉＨＳ−０Ｓが挙げられる。

そこで、本発明の第４態様は、第１態様のグリコサミノグリカンの分析方法において、前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−４Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−６Ｓが含まれているか、前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−０Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−０Ｓが含まれているものである。

本発明の第５態様は、前記第２態様のグリコサミノグリカンの分析方法であって、前記第２工程において、１個のＭＲＭトランジションで液体クロマトグラフィ質量分析を行った結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが３個以上のピークを含むとき、溶出時間が最も短いピークか溶出時間が最も長いピークを用いて二糖を定量するものである。
本発明の第５態様では、液体クロマトグラフィ質量分析を行っている間に、グリコサミノグリカン特異的構成によって生成されたグリコサミノグリカンを構成する二糖がアノマー分離した場合でも、該二糖を定量的に分析することができる。

本発明の第１態様又は第２態様のグリコサミノグリカンの分析方法により得られた結果は、生体試料を採取した被検者のムコ多糖症の有無の検査に利用することができる。つまり、本発明の第１態様の別の側面は、
被検者から生体試料を取得する工程と、
前記生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する工程と、
前記分析結果に基づき前記被検者におけるムコ多糖症の有無を検査する工程とを備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアミド基が結合された固相担体が充填されたカラムである、ムコ多糖症の検査方法である。

また、本発明の第２態様の別の側面は、
被検者から生体試料を取得する工程と、
前記生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する工程と、
前記分析結果に基づき前記被検者におけるムコ多糖症の有無を検査する工程とを備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィのカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、ムコ多糖症の検査方法である。

Claims (5)

1. 生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
   液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
   を備え、
   前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアミド基が結合された固相担体が充填されたカラムである、グリコサミノグリカンの分析方法。
2. 前記第１工程において、前記複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素のうち、前記生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖のうち少なくとも１種の二糖を生成する第１酵素を前記生体試料に添加する工程と、前記複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素のうち、前記第１酵素によって生成される二糖以外のグリコサミノグリカン由来の１又は複数種類の二糖を生成する第２酵素を添加する工程とを備え、
   前記第２工程において、前記第１酵素が添加された生体試料と、前記第２酵素が添加された生体試料を、それぞれ液体クロマトグラフィ質量分析する、請求項１に記載のグリコサミノグリカンの分析方法。
3. 前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−４Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−６Ｓが含まれているか、前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−０Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−０Ｓが含まれている、請求項２に記載のグリコサミノグリカンの分析方法。
4. 生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
   液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
   を備え、
   前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィのカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、グリコサミノグリカンの分析方法。
5. 前記第２工程において、１個のＭＲＭトランジションで液体クロマトグラフィ質量分析を行った結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが３個以上のピークを含むとき、溶出時間が最も短いピークか溶出時間が最も長いピークを用いて二糖を定量する、請求項４に記載のグリコサミノグリカンの分析方法。

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