WO2005100561A1 - 翻訳制御ポリヌクレオチド - Google Patents

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WO2005100561A1
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seq
polynucleotide
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translation control
translation
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PCT/JP2005/006970
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French (fr)
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Tetsuro Okuno
Hiroyuki Mizumoto
Takao Ido
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Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Definitions

  • the present invention relates to a translational control polynucleotide that regulates translational activity depending on temperature, a recombinant vector comprising the polynucleotide, a transformant comprising the recombinant vector, and a method of protein synthesis, It relates to an in vitro translation kit and a protein synthesizer.
  • an expression vector containing a base sequence encoding a target protein is introduced into a host cell which is a living cell, and the host cell is transformed.
  • Methods for expressing proteins can be mentioned.
  • the promoter of a gene containing a base sequence encoding the target protein is improved, and the concentration of the component of the culture medium for culturing the host cell is adjusted.
  • Methods such as methods for controlling mRNA transcription activity (see, for example, Patent Document 1) and methods for promoting protein translation using a specific RNA sequence (see, for example, Patent Document 2). It has been
  • cell-free protein synthesis has been studied as a method for performing protein synthesis carried out in a host cell in vitro, and improvements for practical use have been made.
  • the method for cell-free protein synthesis for example, an extract containing ribosome, tRNA synthetase, translation initiation factor, etc. is prepared from E. coli, wheat germ, etc.
  • the above-mentioned cell-free protein synthesis does not require any steps such as transformation of host cells or cell disruption, and it is difficult to synthesize proteins compared to a system using host cells. There are advantages such as few kinds of toxic substances.
  • these proteins When synthesizing a target protein of eukaryotic origin, these proteins have activity within the range of general host cell culture temperature, so that the host cells can be expressed by expressing them in the host cell. It is desirable to carry out the synthesis under low temperature conditions, since it may inhibit the growth of the protein, and as a result, a sufficient amount of protein may not be obtained. Also in cell-free protein synthesis, similarly, a target protein having a synthesized activity may adversely affect factors and proteins involved in translation.
  • RNAN red 'clover''necrotic' mosaic 'virus
  • RCNMV Red Clover Necrotic Mosaic Virus
  • RNA virus gene
  • the present inventors found that luc mRNA having ⁇ UTR and ⁇ -UTR in RNA1 of the Canadian strain, which can not replicate at 25 ° C, is cap-independent at 25 ° C but to a lesser extent than 17 ° C. The results showing sexual translation activity were obtained. This translational activity suggests that a sufficient amount of viral protein is translated even at 25 ° C., which is about 10 times higher than that of the normal mRNA with cap and poly (A), Ru. It is clear from this that translation of the viral protein of RNA1 does not show the same temperature dependence as "replication".
  • RNAN of RCNMV the process of 4 above
  • the temperature sensitivity of “replication” of RNA 1 is 2) above. It is thought that they are involved in the process of recognition of the genomic RNA of the protein (in particular, ⁇ -UTR), or the process of synthesis of negative-strand RNA from the genomic RNA described above.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-320495
  • Patent Document 2 Patent No. 2814433
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-338597
  • Non-Japanese Literature 1 Hiroyuki izumoto, Yasufumi Hikichi, and Tetsuro Okuno, Viology 293 (2002), p320-327
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the prior art and to achieve the following objects. That is, the present invention is not restricted by the species of the host cell used for live cell line protein synthesis or the species of the extract from the cell free protein, and enhances mRNA translation activity and controls the temperature. It is an object of the present invention to provide a translation control polynucleotide which is capable of enhancing translational activity particularly at low temperature (less than 20 ° C.).
  • a thread change vector comprising the translation control polynucleotide, the translation control polynucleotide, a transformant into which! / ⁇ of the recombinant vector has been introduced, a method of protein synthesis using the translation control polynucleotide,
  • An object of the present invention is to provide an in vitro translation kit and a protein synthesizer.
  • the red clover necrotic mosaic virus (Red Clover) showed temperature dependency upon replication of genomic RNA.
  • the RNA1 power of Necrotic Mosaic Virus, RCNMV) In its non-translated region, it has been found that it has a region that enhances translational activity, particularly translational activity under temperature conditions of less than 20 ° C., leading to the completion of the present invention.
  • the present invention is based on the above findings by the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is,
  • the translational activity of the mRNA after incorporation is such that translational activity X under a temperature condition of less than 20 ° C. and translational activity Y under a temperature condition of 20 ° C. or more satisfy the relationship of XZY ⁇ 1.
  • a translational control polynucleotide characterized in that
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7 (2) RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7, (3) Sequence The RNA sequence shown in No. 7 and a polynucleotide hybridizing under stringent conditions, and (4) at least one of the partial arrays of the polynucleotides of any one of (1) to (3) above. And incorporated into the 3 rules of the mRNA encoding the amino acid sequence,
  • the translational activity of the mRNA is enhanced compared to before incorporation, and
  • the translational activity of the mRNA after incorporation is such that translational activity X under a temperature condition of less than 20 ° C. and translational activity Y under a temperature condition of 20 ° C. or more satisfy the relationship of XZY ⁇ 1.
  • a translational control polynucleotide characterized in that
  • ⁇ 3> The translation regulatory polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the translational activity at 17 ° C. is controlled to be higher than that at 25 ° C.
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 39 (2) the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 39, a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, and (3 ) The translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, comprising at least one of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 39 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions. is there.
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) in the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1, a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, and (3) The translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, including at least one of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions. is there.
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 3 (2) in the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 3, a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, and (3) The translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, which contains at least one of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide hybridizing under stringent conditions. is there.
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 13 (2) RNA shown in SEQ ID NO: 13 A polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added in the sequence, and (3) a polynucleotide which hybridizes with the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 13 under stringent conditions It is a translation control polynucleotide according to any one of the above ⁇ 1> and ⁇ 3> including at least one of them.
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 (2) The RNA sequence shown in SEQ ID NO: 5, a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, and (3) A translation control polynucleotide according to any one of 2> and 3> of the above, including at least one of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a polynucleotide hybridizing under stringent conditions; is there.
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions one or more bases are deleted, substituted, Or a polynucleotide added, (3) RNA sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions, and (4) any one of the above (1) to (3).
  • ⁇ 11> The translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, which is a sequence derived from RNA 1 of Red clover 'necrotic' mosaic virus (RCNMV).
  • RNNMV Red clover 'necrotic' mosaic virus
  • the translational activity of the base sequence is enhanced compared to before incorporation, and
  • the translational activity of the base sequence after incorporation is such that translational activity X under a temperature condition of less than 20 ° C. and translational activity Y under a temperature condition of 20 ° C. or more satisfy the relationship of XZYZ1.
  • a translational control polynucleotide characterized in that
  • the translational activity of the base sequence is enhanced compared to before incorporation, and
  • the translational activity of the base sequence after incorporation is such that translational activity X under a temperature condition of less than 20 ° C. and translational activity Y under a temperature condition of 20 ° C. or more satisfy the relationship of XZYZ1.
  • a translational control polynucleotide characterized in that
  • ⁇ 14> A translation control polynucleotide according to ⁇ 12> to ⁇ 13>, wherein the translation activity at 17 ° C. is controlled to be higher than that at 25 ° C.
  • ⁇ 16> (1) In the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2, (2) in the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2, a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, and ( 3) The translation control polynucleotide according to any one of the above ⁇ 12> to ⁇ 14>, which contains at least one of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions. is there.
  • ⁇ 17> (1) A DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, (2) A polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added in the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, 3) The translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 14>, which contains at least one of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions. .
  • a DNA sequence shown in SEQ ID NO: 14 (2) A polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added in the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 14, and (3) A translation control polynucleotide according to any one of the above 12> and 14> comprising at least one of a DNA sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions. is there.
  • ⁇ 22> The translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 21>, which is a cDNA for a sequence derived from RNA 1 of Red clover 'necrotic' mosaic virus (RCNMV) is there.
  • RNNMV Red clover 'necrotic' mosaic virus
  • ⁇ 23> The translation regulatory polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 22>, wherein the translational regulation is controlled so as to maximize translational activity under a temperature condition of 17 ° C. or less.
  • ⁇ 25> A recombinant vector comprising the translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to 24>.
  • ⁇ 26> The translation regulatory polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>, and / or the recombinant vector according to any of ⁇ 25>. Transformants.
  • ⁇ 27> The transformant according to ⁇ 26>, which is selected from animal cells, plant cells, fungi and yeasts.
  • ⁇ 28> A method for protein synthesis, characterized by using the translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>.
  • ⁇ 29> A method for protein synthesis comprising using the recombinant vector according to ⁇ 25>.
  • ⁇ 31> The protein synthesis method according to ⁇ 30>, which is carried out using a wheat germ extract.
  • An in vitro translation kit comprising at least the translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>.
  • a protein synthesizer comprising at least a synthetic means for synthesizing an amino acid using the translation control polynucleotide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>.
  • Fig. 1 is a structural diagram showing RNA1 of an Australian strain of RCNMV, and a secondary structure (stem-loop structure) formed by ⁇ TE-DR1 region which is a translation control polynucleotide of the present invention. It is the schematic diagram which showed.
  • Fig. 2 is a structural diagram showing RNA1 of a Canadian strain of RCNMV, showing a secondary structure (stem-loop structure) formed by ⁇ TE-DR1 region which is a translation control polynucleotide of the present invention. It is a schematic diagram.
  • FIG. 3 is a structural diagram of each mRNA whose translational activity was evaluated in Example 1.
  • the broken line shows the portion into which a deletion was introduced, and the thin line shows the sequence portion of pUCl18.
  • FIG. 4 is a schematic view showing a mutation introduced into each stem-loop structure in the 3 'TE-DR1 region in Example 2, Example 3, Example 6, and Example 7.
  • FIG. 5 shows a recombinant vector (R15,-XbS) containing a translational control polynucleotide (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16) using tobacco cultured cell protoplasts as host cells in Example 6.
  • a recombinant vector in which a mutation has been introduced into the region constituting the stem loop Indicates the results of protein synthesis using one (3'TE-DRlZLml, 3'TE-DR1 / Lm2, 3'TE-DR1 / Lm3, 3'TE-DRlZLm4, 3'TE-DR1 / Lm5) I am a patient.
  • FIG. 6 shows a recombinant vector (R1-5 'XbS) containing a translational control polynucleotide (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16) using cowpea protoplast as a host cell in Example 6.
  • a recombinant vector (3, TE -DRl / Lml, 3'TE-DR1 / Lm2, 3'TE-DR1 / Lm3, 3'TE-DRl / Lm 4, 3) in which a mutation has been introduced into the region constituting the stem loop.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of protein synthesis using 'TE-DR1 / Lm5)
  • FIG. 7 is a graph showing the results of protein synthesis in a cell-free protein synthesis system using extracts of cultured tobacco cells (BY2) in Example 7.
  • FIG. 8 shows that in Example 8, the recombinant vector (R1-5'-XbS) containing the translation control polynucleotide of the present invention derived from RCNMV and the non-translation of sunhemp mosaic virus (SHMV) It is a graph which shows the result of having compared the translation activity of the recombinant vector (SH-luc-SH) containing a region.
  • FIG. 9 shows that in Example 9, protein synthesis using an in vitro translation kit containing a recombinant vector containing the translation control polynucleotide of the present invention and other recombinant vectors in vitro
  • FIG. 16 is a graph showing the result of comparison with protein synthesis using a system translation kit.
  • the translational control polynucleotide of the present invention is a translational control polynucleotide of the present invention.
  • A The mRNA encoding the amino acid sequence is incorporated into the rule of mRNA, and the translational activity of the mRNA is enhanced compared to that before incorporation, and the translation activity of the mRNA after incorporation is 20 °.
  • a polynucleotide (RN ⁇ ) that controls translational activity X under a temperature condition of less than C and translational activity Y under a temperature condition of 20 ° C. or more to satisfy the relationship of X / Y ⁇ 1, and
  • translational activity of the base sequence is enhanced, and the translational activity of the base sequence after incorporation is compared with the translational activity X under temperature conditions of less than 20 ° C. and temperature conditions of 20 ° C. or more.
  • Translational activity in Y is a polynucleotide (DNA) that controls to satisfy the relationship of X / Y ⁇ 1.
  • the translation activity can be represented by the amount of synthesis of the target amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as "protein") encoded by the mRNA, and "enhancing translation activity” means the amount of protein synthesis P Represents that the relation P> Q is satisfied with respect to the synthetic amount Q before the translation control polynucleotide is incorporated.
  • protein target amino acid sequence
  • enhancing translation activity means the amount of protein synthesis P Represents that the relation P> Q is satisfied with respect to the synthetic amount Q before the translation control polynucleotide is incorporated.
  • a method of quantifying the synthesized amount for example, a method of measuring the concentration of the target protein thus recovered using a spectrophotometer, a radioisotope is incorporated to synthesize the protein of the target, and the emission of the protein is emitted.
  • a method of measuring the activity a method of synthesizing a luminescent protein for the purpose of evaluating the activity, and a method of measuring the luminescence amount of the luminescent protein.
  • RNA Translation control polynucleotide
  • RNA translation control polynucleotide (RNA) of the above (A)
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 15 (2) RNA sequence shown in SEQ ID NO: 15, polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, (3 ) At least a portion of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions, and (4) any one of the polynucleotide sequences of (1) to (3) above. And a translation control polynucleotide containing any one of
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7 (2) in the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7, a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added, (3 And / or (4) a partial sequence of any one of the polynucleotides of (1) to (3) above, and the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions; And translation control polynucleotides.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions is a polynucleotide that has been identified (eg, the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 15 in (I) above) and 90 % Or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more.
  • a polynucleotide which causes hybridization only when it is present is about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C., than the melting temperature (Tm) of complete hybridization. It refers to a polynucleotide in which hybridization occurs at a low temperature.
  • the stringent conditions include, for example, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Alaboratory
  • a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added is a polynucleotide (for example, a sequence number in the case of (I) described above).
  • 15 refers to a polynucleotide having a mutation such as deletion, substitution or addition of 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10 bases in the RNA sequence shown in 15).
  • the means for deletion, substitution or addition of the bases can be selected appropriately from known methods without particular limitation.
  • the translation regulatory polynucleotide of (A) includes the translation regulatory polynucleotide of (B) which is a cDNA of the translation regulatory polynucleotide of (A).
  • it may be an RNA sequence transcribed along with the base sequence and present in the rule of the mRNA.
  • translational activity at 17 ° C. of mRNA is preferably controlled to be higher than translational activity at 25 ° C. It is more preferable that the control be performed so as to maximize translational activity at 17 ° C.
  • the translational control polynucleotide is less likely to be synthesized under high temperature (for example, 25 ° C. or higher) conditions, or low in yield (for example, 17 ° C. or less)! /, It is suitably used for protein synthesis.
  • Examples of the translation control polynucleotide of (A) include
  • a translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 13 which is a partial sequence of the translation control polynucleotide of (I) above,
  • a translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 5 which is a partial sequence of the translation control polynucleotide of (II), and
  • these translation control polynucleotides may be single or may be composed of a plurality of combinations.
  • the polynucleotide into which the translation control polynucleotide of (A) above is incorporated can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation. However, according to the 5 rules of the mRNA encoding the amino acid sequence,
  • RNA sequence shown in SEQ ID NO: 17, (2) Polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added in RNA sequence shown in SEQ ID NO: 17, (3) SEQ ID NO: At least one of the RNA sequence shown in FIG. 17 and a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions, and (4) a partial sequence of any one of the polynucleotides of (1) to (3) above are incorporated.
  • the mRNA (polynucleotide) into which the translation control polynucleotide of (A) is incorporated it may have at least one of a poly A structure at the 3 'end and a Cap structure at the ⁇ end. It is not necessary to have all of them. When incorporated into a polynucleotide having a 3, terminal poly A structure and a ⁇ terminal Cap structure, the translational activity of the mRNA can be further enhanced.
  • the amino acid sequence encoded by the polynucleotide into which the translation control polynucleotide of (A) is incorporated may be appropriately selected according to the purpose without particular limitation, and may be any of protein and polypeptide chain. Although it may be present, it is preferably a protein. Further, as the above-mentioned protein, a protein having a small expression amount under low temperature conditions, a protein unstable under high temperature conditions, and the like are suitably mentioned.
  • region of mRNA (polynucleotide) into which the translation control polynucleotide of (A) is incorporated there are no particular restrictions on the three rules of the region encoding the amino acid sequence, depending on the purpose. Although it can be selected as appropriate, it is preferably a non-translated region
  • the translation control polynucleotide of (A) is a sequence derived from RNA 1 of Red clover 'necotic' mosaic virus (RCNMV). It is preferable that the sequence is a sequence derived from RNA1 of the Australian strain shown in SEQ ID NO: 19 or a sequence derived from RNA1 of the Canadian strain shown in SEQ ID NO: 11.
  • RNAl of the Australian strain is shown in FIG. 1
  • RNA1 of the Canadian strain is shown in FIG. 1
  • RNA1 of the RCNMV Australian strain shown in Fig. 1 the translation control polynucleotide of (A) is expressed by the three noncoding regions (hereinafter referred to as "3 '-UTR"). There is an RNA sequence derived from
  • the ⁇ UTR of the Australian strain corresponds to the translation control polynucleotide of (I) represented by SEQ ID NO: 15.
  • the 3595th force that forms five stem-loop structures is also a 3732th base sequence (hereinafter sometimes represented as “3′TE-DR1”) is the above (I) represented by SEQ ID NO: 13 It corresponds to a translation control polynucleotide.
  • Nucleotide is an RNA sequence derived from the 3 'UTR.
  • the ⁇ UTR of the Canadian strain corresponds to the translation control polynucleotide of (I) represented by SEQ ID NO: 7.
  • 3'TE-DR1 which is the 3595th force et al. 3732th nucleotide sequence forming five stem-loop structures, corresponds to the translation control polynucleotide of (I) shown in SEQ ID NO: 5 above. .
  • SL1, SL4 and SL5 have a common base sequence, and the base sequence forming the stem-loop structure shown by SL1 is SEQ ID NO: 39.
  • the base sequence corresponding to the translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 4, which forms the stem loop structure shown by SL4, corresponds to the translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 1, and the base sequence forming the stem loop structure shown by SL5 is It corresponds to the translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 3.
  • the stem-loop structure is a secondary structure of a hairpin formed by the presence of a complementary sequence in the sequence forming the stem-loop structure to cause a corresponding bond to form a complementary bond (hydrogen bond). is there.
  • the translation control polynucleotide of the present invention includes any of the three terminal poly A structure and the ⁇ terminal Cap structure by including the base sequence forming the stem-loop structure.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 17 may be incorporated into the 5 rules of mRNA encoding the amino acid sequence
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 9 is also preferably a sequence derived from RNA1 of the RCNM V! /.
  • RNA sequence shown in said SEQ ID NO: 17 is a sequence derived from ⁇ UTR of RNA 1 of said RCNMV Australia strain, and the RNA shown in said SEQ ID NO: 9 The sequence is a sequence derived from ⁇ UTR of RNA1 of the RCNMV Canadian strain.
  • RNA1 is extracted from virus particles of RCNMV, and the RNA1 is The cDNA of the present invention is prepared by reverse transcription reaction, then amplified, and the transcripts of the cDNA are mixed with RNA 2 to select those showing infectivity.
  • (III) (1) a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 16; (2) a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 16; a polynucleotide in which one or more bases are deleted, substituted or added; (3) sequence No. 16 and at least one of the partial sequences of the polynucleotides of any of the polynucleotides of (1) to (3) from (1) to (3) above, and (4) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions.
  • a translation control polynucleotide comprising
  • the translation control polynucleotide of (B) above is a cDNA of the translation control polynucleotide of (A) above, and is incorporated into the three rules of the polynucleotide having a base sequence encoding any amino acid sequence.
  • those which express the translation control polynucleotide of (A) on the ⁇ side of mRNA which is transcribed together with the base sequence can be mentioned.
  • An embodiment of the translational control of the translation control polynucleotide is, for example, an embodiment in which the translational activity at 17 ° C. of the base sequence is controlled to be higher than the translational activity at 25 ° C. It is more preferable that the mode is such that the translational activity at 17 ° C. is maximized.
  • the above-mentioned translation control polynucleotide is less likely to be synthesized under high temperature (for example, 25 ° C. or higher) conditions or low temperature (for example, 17 ° C. or less)! /, It is suitably used for protein synthesis.
  • Examples of the translation control polynucleotide of (B) include
  • a translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 14 which is a partial sequence of the translation control polynucleotide of (III) above,
  • the translation control polynucleotides of SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 which are sequences common to the translation control polynucleotides of (I) and (II) above are preferably mentioned. Furthermore, polynucleotides in which one or more bases of these translation control polynucleotides are deleted, substituted or added, and translation control polys that hybridize under hybridization conditions with these translation control polynucleotides. Nucleotides can be mentioned. In addition, these translation control polynucleotides may be single or may be composed of a plurality of combinations.
  • tcttccgaca acgacgtgcg cacaaccaca cagaggtttt ccctctcgac ggcgggttac 60 ccgaaggtga agcccgccg atttctagcg acctattaat acgctaggta cctgtttcc 120 agggtccgat gccggttc 138
  • the polynucleotide into which the translation control polynucleotide of (B) is incorporated can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation. However, according to the 5 rules of the base sequence encoding the amino acid sequence,
  • the amino acid sequence encoded by the polynucleotide into which the translation control polynucleotide of (B) is incorporated may be appropriately selected according to the purpose without particular limitation, and it may be selected from either a protein or a polypeptide chain. Although it may be present, it is preferably a protein. Preferred examples of the protein include proteins having a small expression level under low temperature conditions and proteins unstable under high temperature conditions.
  • the region of the polynucleotide into which the translation control polynucleotide of (B) is incorporated is not particularly limited as long as it has three rules of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, and may be appropriately selected according to the purpose. Force that can be done It is preferable that it is a non-translational region.
  • the translation control polynucleotide of (B) be a cDNA of a sequence derived from RNAl of Red clover 'Nekotic' mosaic (RCNMV).
  • RNNMV Red clover 'Nekotic' mosaic
  • RNA1 of the RCNMV Australian strain shown in FIG. 1 corresponds to the translation control polynucleotide of (III) set forth in SEQ ID NO: 16.
  • the cDNA of 3'TE-DR1 which is the 3596th force that forms the five stem-loop structure, and the 3732nd base sequence, corresponds to the translation control polynucleotide of (III) represented by SEQ ID NO: 14. .
  • the cDNA of 3'-UTR corresponds to the translation control polynucleotide of (IV) shown in SEQ ID NO: 8.
  • the cDNA of 3'TE-DR1 which is the 3595th force et al. 3732th nucleotide sequence forming five stem-loop structures, is the translation control polynucleotide of (IV) shown in SEQ ID NO: 6 above. Equivalent to.
  • TE-DR1, SL1, SL4 and SL5 have a common base sequence
  • the cDNA of the base sequence forming the stem loop structure shown in SL1 is the above-mentioned sequence
  • the translation control polynucleotide of No. 40 corresponds to the translation control polynucleotide of No. 40
  • the cDNA of the nucleotide sequence forming the stem loop structure corresponds to the translation control polynucleotide of SEQ ID NO: 2
  • the cDNA of the nucleotide sequence forming the stem loop structure shown in SL5 is the translation regulatory poly of SEQ ID NO: 4 It corresponds to a nucleotide.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 18 may be incorporated into the 5 rules of the base sequence encoding the amino acid sequence.
  • the DNA sequence and the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 10 are also cDNAs of the RNA 1 derived sequences of said RC NMV! /.
  • the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 18 is a cDNA of a sequence derived from ⁇ UTR of RNA1 of the RCNMV Australia strain
  • the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 10 is the RCNMV Canadian strain. It is a cDNA of the sequence derived from the 5'-UTR of RNA1.
  • RNA1 is extracted from virus particles of RCNMV, and the RNA1 is isolated.
  • cDNAs are prepared by reverse transcription reaction, then amplified, and the cDNA transcripts are mixed with RNA2 to select those showing infectivity.
  • the recombinant vector of the present invention can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation, as long as it is a vector containing at least the translation control polynucleotide.
  • a recombinant vector for protein expression comprising the translation control polynucleotide and a base sequence encoding a target amino acid sequence (protein), and a recombinant vector for amplifying the translation control polynucleotide Is included.
  • the translation control polynucleotide is inserted into three non-translational regions of the region encoding the target amino acid sequence.
  • the polynucleotide shown in any one of SEQ ID NOs: 9, 10, 17 and 18 may be inserted into the 5 non-coding region of the region encoding the amino acid sequence of interest; Sequences that enhance activity may be inserted.
  • a vector (Lybricon) used to prepare the above-mentioned recombinant vector there is no particular limitation as long as replication is possible in the main cell, and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include plasmid vectors, virus vectors, cosmids, butterflies, and agrobacterial worms.
  • bacterial plasmids eg, pBR322, pKC30, pCFM536 etc.
  • phage DNA eg, lambda phage etc.
  • yeast plasmids eg, pG-1 etc.
  • baculovirus as a vector for mammalian cells
  • examples include vaccinia virus, viral DNA such as adenovirus, and SV40 and its derivatives.
  • the vector may include, for example, an origin of replication, a selection marker, a promoter, an enhancer, a transcription termination sequence (terminator 1), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like.
  • the vector preferably contains a force having a polylinker having various restriction sites therein, or a single restriction site.
  • Specific restriction sites in the vector can be cleaved by a particular restriction endonuclease, and the translational control polynucleotide can be inserted at the cleaved site.
  • the plasmid vector in particular limitation can force s appropriately selected depending on the Nag purpose, for example, pBR322, pBR325, pAT153, pUC8 , pUC18, pUC19, pSP RLUC and the like.
  • commercially available products include, for example, pQE70, pQE60, pQE-9 (manufactured by Qiagen), pBluescript II KS, ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (manufactured by Pharmacia), pET-11a (Manufactured by Novagen), pXTl, pSG5 (manufactured by Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL SV40 (manufactured by Pharmacia), and the like.
  • virus vector examples include retrovirus, adenovirus, Herpes virus, Sendai virus and the like.
  • the pacterio phage can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation, and examples thereof include T4 phage, T5 phage, T7 phage, ⁇ phage, M13 and the like.
  • the recombinant vector is introduced into a target cell and used.
  • the translation control polynucleotide and a base sequence encoding an amino acid of interest For example, a recombinant vector for protein expression containing the gene is suitably used for the preparation of the transformant of the present invention described later.
  • the method for using the recombinant vector can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation.
  • the target cell is infected with the replacement vector comprising a viral vector and introduced into the cell.
  • Methods, methods of infecting cells of interest with the above-mentioned recombinant vector, which is Pacteryophage phage, and introducing them into the bacteria, and methods of introducing the above-mentioned recombinant vector consisting of a plasmid vector into the cells of interest Be
  • any cells containing any of the translation control polynucleotide of the present invention and the replacement vector of the present invention can be appropriately selected according to the purpose without restriction.
  • those which are at least viable and capable of synthesizing a protein at least under temperature conditions at which the translational activity of the translation control polynucleotide is maximized are preferred.
  • the method is appropriately selected from known methods without particular limitation according to the purpose.
  • the polyethylene glycol method PEG method
  • the electrophoresis method the particle gun method
  • the microinjection method the ribosome method
  • the agrobacterial method and the like can be mentioned.
  • the transformant may be a single cell or a plurality of cellular tissues, organs, or individuals.
  • Examples of the cells include animal cells, plant cells, fungi, and yeasts.
  • the above animal cells can be appropriately selected according to the particular purpose without limitation, and for example, embryonic stem cells such as fertilized eggs, ES cells, EG cells, and EC cells, embryonic cancer cells, hematopoietic stems, etc. Cells, cancerous and immortalized cancer cell lines, cell lines of each organ and the like can be mentioned.
  • the animal cells also include cells of transgenic animals into which the translation regulatory polynucleotide has been introduced and transformed.
  • the origin of the animal cells can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation.
  • animals such as mammals, reptiles, birds, amphibians, fish, insects and the like can be mentioned.
  • the method for introducing the translation control polynucleotide or the recombinant vector into the animal cell can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation.
  • they may be administered by injection or the like into the muscle, subcutaneous, or intraperitoneal of an individual animal.
  • the plant cells can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation, and for example, organs of cultivated plants (eg, leaves, petals, stems, roots, rhizomes, seeds, etc.), tissues (eg, , Epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundles, etc.) sections, protoplasts, etc.
  • organs of cultivated plants eg, leaves, petals, stems, roots, rhizomes, seeds, etc.
  • tissues eg, , Epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundles, etc.
  • protoplasts etc.
  • the plant cells also include cells of plants transformed by introducing the translation control polynucleotide from the time of development.
  • the origin of the plant cells can be appropriately selected depending on the purpose without particular limitation, and examples include plants such as seed plants, ferns, mosses and algae.
  • the method for introducing the translation control polynucleotide or the recombinant vector into the plant cell can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation.
  • binary vector method of agarose bacteria, particles examples include the bombardment method, the polyethylene glycol method, and the electoral deposition method.
  • cells into which the translation control polynucleotide or the recombinant vector has been introduced can be subjected to cell culture, tissue culture, and organ culture, and plant hormones can be used using a known plant tissue culture method. Etc. can be administered and regenerated into plants.
  • the translation control polynucleotide of the present invention is introduced into the 3 'non-coding region of the base sequence encoding a protein having an action to increase the yield, a protein that enhances resistance to environmental stress such as cold, etc.
  • a protein having an action to increase the yield a protein that enhances resistance to environmental stress such as cold, etc.
  • filamentous fungi such as Trichophvtm rubrum, Micro sporum cams, Alternaria alternata. Alter naria ⁇ anax ⁇ Bipolaris brizae etc .: Staphylococcus aureus ⁇ Street ococcus pyogenes. Enterococcus faecalis. Bucillus anthracis. Batcillus sub tilis. Clostridium tetania Listeria monocytogenes. Pseudomonas a eruginosa. Escherichia coli Heamophilis influenzae.
  • Neisseria gonorrh oeae Mycobacterium tuberculosis, Corvnebacterium glutamicum, Stre ptomvces antibioticus Salmonella typhi. Edwardsiella tarda Citrobact er freundii. Vibrio Klebsiella pneumoniae. Shigella dvsenteriae. Yersinia pestis Treponema pallidum Leptospira interroganse, Campylobacter jejuni Lactobacillus latis etc. bacteria and the like are recovered. parahaemolvticus, Morganella morganii, Seratia marces cens.
  • Fungi that can grow at low temperatures include, for example, microorganisms of the genus Vibrio (Vibrio marinas etc.), microorganisms of the genus Pseudomonas (such as
  • Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas spnngae ⁇ . Rhodococcus fe microbe. immobilis etc.), Arthrobacter sp. microorganism (Arthrobacter SE, TAD 20 etc.), Cytophaga sp. micro cattle (such as CvtoDhaga KUC-1 strain), Moraxella microorganism (MoE glk)
  • the above-mentioned yeast can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation.
  • the method for confirming that the transformant has been obtained can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation.
  • a drug resistance gene or the like may be incorporated as a marker, and the recombination may be performed.
  • the cells into which the vector has been introduced may be cultured in a drug-containing medium, and the grown cells may be selected.
  • the drug resistance gene and the like can be appropriately selected according to the purpose without particular limitations.
  • an ampicillin resistance gene a tetracycline resistance gene, Resistance genes, aureobasidin A resistance gene, chloramphenicol resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, phleomycin resistance gene, thorostrepton resistance gene and the like.
  • the transformant has expressed the target amino acid sequence (polypeptide, protein)
  • it can be appropriately selected according to the purpose of releasing restriction, for example, fluorescent protein, for example Methods, enzyme activity assays, immunohistochemistry and the like.
  • fluorescent protein method include a method in which a fluorescent protein gene is incorporated into the recombinant vector, cells into which the recombinant vector has been introduced are cultured, and then ultraviolet light is irradiated to measure the fluorescence of the protein.
  • the enzyme activity measurement method for example, a gene of an enzyme protein is incorporated into the recombinant vector and cultured in a culture solution in which color is developed by an enzyme reaction, and then the color development of the culture solution is measured with a spectrophotometer.
  • the method of quantifying an enzyme activity is mentioned.
  • proteins other than the enzyme protein hydrogen peroxide and the like are generated to form a chromogenic substance such as a quinone body, and the method may be quantified by measuring it with a spectrophotometer.
  • the histochemistry method for example, Western blot method, ELISA method and the like can be mentioned.
  • the method for protein synthesis of the present invention can be appropriately selected according to the purpose without limitation, as long as the method uses the translation control polynucleotide and the recombinant vector, for example, a method using a host cell, And methods carried out in cell-free protein synthesis systems (hereinafter sometimes referred to as "in vitro systems").
  • the protein synthesis method is preferably performed at less than 20 ° C., and more preferably at 17 ° C. or less.
  • the method using the host cell can be appropriately selected from known methods without particular limitation, and, for example, a base sequence encoding a target protein, and the above-mentioned set containing the translation control polynucleotide A host cell into which a replacement vector has been introduced (eg, the transformant) is grown to grow, and the host cell is cultured under a temperature condition of less than 20 ° C. By doing, the method of expressing the said protein of interest is mentioned.
  • the host cell may be appropriately selected depending on the purpose without particular limitation, as long as it is a cell capable of synthesizing a protein (for example, eukaryotic cell, E. coli etc.), but the temperature is less than 20 ° C. It is preferably a cell that performs protein synthesis.
  • the above protein of interest can be recovered from the culture medium when it is secreted outside the host cell, and when it is present in the host cell, it is obtained by disrupting or dissolving the host cell. It can be recovered from the extract.
  • the collected protein of interest can be prepared by ammonium sulfate precipitation, ethanol precipitation, acid extraction, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, or the like with respect to the medium or the extract. It can be purified by known methods such as gel filtration chromatography, HPLC, electrophoresis, chromatofocusing and the like.
  • a protein is synthesized without introducing a base sequence encoding a protein of interest and the recombinant vector containing the translation control polynucleotide into a host cell.
  • the method is a method of extracellularly synthesizing a protein by adding the recombinant vector, an amino acid, an energy source, various ions, a buffer solution and the like to a cell extract containing ribosomes and the like. .
  • mRNA may be used as a template, and a method of synthesizing only a protein on ribosomes based on the information of the mRNA may be used. And a translation method.
  • the reaction solution used for the above-mentioned cell-free protein synthesis system can be appropriately selected according to the type of the target protein and the like.
  • the cell extract includes, for example, cell extracts such as E. coli, plant seed germ (eg, wheat germ, wheat germ, rice germ, corn germ, etc.), and rabbit reticulocytes etc., among them.
  • Wheat germ extract is preferred, as extracts of cells able to grow under temperature conditions of less than 20 ° C. are preferred.
  • the method for preparing the cell extract may be appropriately selected according to the purpose without particular limitation. For example, a process for removing a translation inhibitor, a nucleolytic enzyme, etc., an activity of a translation inhibitor, etc. It is preferable to carry out the process of suppressing
  • amino acids examples include amino acids that constitute proteins.
  • the energy source includes, for example, either ATP or GTP.
  • various ions include acetates such as potassium acetate, magnesium acetate and ammonium acetate, glutamates and the like.
  • Examples of the buffer include Hepes-KOH, Tris-OAC, and the like.
  • Examples of the ATP regeneration system include a combination of phosphoenol pilpate and pyruvate kinase, or a combination of creatine phosphate (creatine phosphate) and creatine kinase.
  • nucleolytic enzyme inhibitor examples include ribonuclease inhibitor, nuclease inhibitor and the like.
  • Examples of the reducing agent include dithiothreitol and the like.
  • Examples of the antibacterial agent include sodium azide, ampicillin and the like.
  • Examples of the RNA polymerase include SP6 RNA polymerase, T7 RNA polymerase, and the like.
  • any known method without particular limitation can be appropriately selected, and for example, the reaction solution is mixed in one reaction vessel
  • Method and method using a reaction vessel in which a reaction part for synthesizing a protein and a supply part for supplying a substance necessary for protein synthesis are divided by a semipermeable membrane or the like dialysis method
  • reaction part and supply instead of separating the part with a semipermeable membrane, the liquid to be supplied is mixed with a substance with a high specific gravity such as glycerol, and the specific gravity of the reaction liquid is increased to be supplied.
  • the specific gravity is small! /
  • the method of overlaying the reaction solution (overlayer method), etc. may be mentioned.
  • the target protein synthesized by the cell-free protein synthesis system can be purified from the reaction solution by known protein purification methods such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography and the like. It is isolated and purified by combining as appropriate.
  • the in vitro translation kit of the present invention comprises at least the translation control polynucleotide of the present invention, and is suitably used in the aforementioned protein synthesis method.
  • the in vitro translation kit includes at least the recombinant vector for incorporating the translation control polynucleotide, and incorporating a base sequence encoding a target protein, and further, a cell extract, It contains an ATP regeneration system reagent, and optionally contains all or part of reagents necessary for the cell-free protein synthesis system.
  • the in vitro translation kit of the present invention may further contain a reaction vessel.
  • the configuration of a known in vitro translation kit can be adopted, and, for example, JP-A 2003-102495, Current Opinion Biotechnology 9: 534-548 (1998), J. Biotechnology 41: 81-90 (1995), etc. can be referred to.
  • the cell extract to be used in the in vitro translation kit can be appropriately selected according to particular limitations, for example, E. coli, plant seed germ (eg, wheat germ, wheat germ) Cell extracts of germ, rice germ, corn germ, etc., plant-derived cultured cells (eg, cultured tapaco cells), etc. Wheat germ extract is preferred, as extracts of possible cells are preferred.
  • plant seed germ eg, wheat germ, wheat germ
  • plant-derived cultured cells eg, cultured tapaco cells
  • Wheat germ extract is preferred, as extracts of possible cells are preferred.
  • the protein synthesis apparatus of the present invention comprises at least a synthetic means for synthesizing an amino acid using the above-mentioned translational control polynucleotide, and is suitably used for the above-mentioned protein synthesis method.
  • the protein synthesis apparatus of the present invention have a temperature control means.
  • the temperature control means preferably controls protein synthesis to be performed at less than 20 ° C., and more preferably at 17 ° C. or less.
  • the temperature control means can be appropriately selected from known devices and the like according to the purpose of being not particularly limited, and, for example, even if it is a protein module integrated with the protein synthesis device, It may be a thermostat, a CO incubator, or the like externally attached to the protein synthesizer.
  • Examples of the synthesis means used in the protein synthesis method using the host cell include, for example, a bioreactor and the like.
  • Examples of the synthesis means used for the cell-free protein synthesis include a supply means for supplying the cell extract, the recombinant vector, an amino acid, an energy source, various ions, a buffer solution, etc .; And a container for carrying out a protein synthesis reaction, and a discharge means for discharging the product.
  • the container may be divided into a reaction tank and a supply tank with a semipermeable membrane or the like.
  • the cell extract can be appropriately selected depending on the purpose of being particularly restricted but, for example, wheat germ extract, E. coli extract, tobacco culture cell extract and the like are preferred. Among them, wheat germ is preferred. Extracts are more preferred.
  • a preferred example of the protein synthesizer is, as a specific example, a reaction temperature gradient thermostat equipped with the reaction vessel, or a container divided by a semipermeable membrane, and the supply vessel and the reaction vessel are formed. And devices capable of performing transcription and translation continuously.
  • the protein synthesis method using the protein synthesizer for example, using the in vitro translation kit, can continuously supply the substrate and energy necessary for the reaction through the semipermeable membrane, and the cell extract Protein synthesis can be performed up to 24 hours using.
  • high level transcription is performed by T7 RNA polymerase, and then translation is performed using components (tRNA, ribosomes, enzymes, factors, etc.) in the cell extract.
  • the supply tank contains ions, nucleotides serving as an energy source and a substrate, and amino acids, and these substances are supplied to the reaction tank through a semipermeable membrane. Similarly, by convection from the reaction vessel to the supply vessel, the inhibitory low molecules formed by the reaction in the reaction vessel are effectively diluted.
  • the translation control polynucleotide of the present invention is not restricted by the species of the organism from which the extract is used for host cells or cell-free proteins, and is capable of enhancing mRNA translation activity and capable of temperature control. In order to enhance translational activity, particularly at low temperatures (less than 20 ° C.), it is suitably used for synthesis of unstable proteins under high temperature conditions, and synthesis of proteins with low yield under low temperature conditions. In addition, since a plant body as a transformant with the translation control polynucleotide is suitable for cold region agriculture and the like, the translation control polynucleotide is suitably used for breed improvement for cold region agriculture.
  • RNA1 was extracted from RCNMV Australia strain by a known method.
  • the full-length cDNA of RNA1 was synthesized by the following method, the translational control polynucleotide was cut out, and incorporated into a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding luciferase, to prepare a recombinant vector.
  • RNA1 (30 ⁇ g), 1 U of poly (A) polymerase (Takara Bio Inc.), 40 mM Tris-monohydrochloric acid (pH 8.0), 10 mM MgCl, 250 mM NaCl, 2.5 mM M
  • the cDNA obtained by the reverse transcription reaction was amplified by PCR.
  • the PCR reaction is performed using an Ex tag polymerase (Takara Bio Inc.) and an lOpmol adapter (SEQ ID NO: 22: 5'-CGACTCGAGTCGACATCGA-3 ') as a primer, / Rlint5' (SEQ ID NO: 23: 5'-TGAGCAGATAAACGCCAATC) -3) 1 cycle at 94 ° C for 4 minutes, then 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 50 ° C, 2 minutes at 72 ° C, then 2 cycles at 94 ° C 1 cycle at 55 ° C, 1 cycle at 72 ° C, 1 cycle at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C, 1 cycle at 55 ° C, 10 cycles at 72 ° C. .
  • the cDNA was recovered, and electrophoresis was performed using a 1% low melting point agarose gel (manufactured by FMC Bioproducts) to confirm its length.
  • the length of the cDNA was found to be 1.9 kb.
  • the recovered cDNA is cleaved with restriction enzyme Xhol, and then using DNA Regission Kit Ver. 1 (Takara Baio Co., Ltd.) at the corresponding site of pBluescriptll (KS) (Stratagyen). This was subjected to auto sequencing (manufactured by Applied Norsystems) to determine the sequence of the ⁇ terminal of RNA1.
  • RNA1 The reverse transcription reaction of RNA1 was carried out using RNA1 (1 g), Superscript II (manufactured by Invitrogen), and 20 pmol of 3'RZCl (SEQ ID NO: 24: 5'-TACCCCGGGGTACCCTAGCGGTTAC-3 as primers). The reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 60 minutes, 51 ° C. for 30 minutes, and 67 ° C. for 15 minutes.
  • the PCR reaction was performed using Ex tag polymerase (Takara Bio Inc.), 2 pmol of poly (T) -adapter as a primer, 24 pmol of adapter, and 24 pmol of SZRlint 3 '(SEQ ID NO: 25: 5'-TTGCG TGGCAATGCAAACCG-3 ' )
  • Ex tag polymerase Takara Bio Inc.
  • 2 pmol of poly (T) -adapter as a primer
  • 24 pmol of adapter and 24 pmol of SZRlint 3 '(SEQ ID NO: 25: 5'-TTGCG TGGCAATGCAAACCG-3 ' )
  • SZRlint 3 ' SZRlint 3 '(SEQ ID NO: 25: 5'-TTGCG TGGCAATGCAAACCG-3 ' )
  • One cycle is performed for 30 cycles of 94 ° C for 45 seconds, 58 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 3 minutes
  • the obtained DNA was recovered, and the length was confirmed by electrophoresis using a 1% low melting point agarose gel (manufactured by FMC Bioproducts Co., Ltd.).
  • the obtained cDNA was digested with restriction enzyme Xhol, and ligated to the corresponding site of pBluescript (KS) (manufactured by Stratagene) using DNA ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takarajyo Co., Ltd.).
  • RNA1 The cDNA containing the ⁇ end of RNA1 obtained as described above was applied to Autosequencer (manufactured by Applied Nanosystems) to determine the sequence of the 5 end of RNA1.
  • RNA1 The primer prepared on the basis of the nucleotide sequence of RNA1 determined in (1) above, T7Canl5 '(SEQ ID NO: 26: 5'-GCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGA ACAAACGTTTTTACCGG- 3 and RCNMV separated using the above-mentioned ⁇ RZCl Reverse transcription was performed on RNA1 of each of the Australian strain and Canadian strain to obtain cDNA.
  • the cDNA of the Australian strain was amplified by PCR.
  • the PCR reaction is performed using Ex tag polymerase (Takara Bio Inc.) for one cycle of 94 ° C. for 4 minutes, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 5 minutes, and 94 ° C. for 1 minute. Twenty-eight cycles of 1 minute at 60 ° C. and 4 minutes at 72 ° C. were performed, and one cycle of 1 minute at 94 ° C., 1 minute at 60 ° C., and 10 minutes at 72 ° C. was performed.
  • Ex tag polymerase Takara Bio Inc.
  • the cDNA amplified by PCR was recovered, and electrophoresis was performed using a 1% agarose gel (manufactured by FMC NOProducer Co., Ltd.). The length was confirmed to be 4. O kb. After cleaving this cDNA with restriction enzymes Sacl and Smal, it was ligated into the corresponding region of pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a cDNA clone.
  • RNA1 obtained by the transcription reaction of (1) was mixed with RNA2 in an equal amount and inoculated into C. quinoa, and cDNA derived from the transcript showing infectivity was selected.
  • RNA1 pRCl
  • SP6 RNA polymerase manufactured by Fermentus
  • A poly (A) tail added by in vitro transcription.
  • the recombinant vector was prepared according to the following method using a plasmid (pSP64-RLUC) having a Renilla Luc gene capable of producing an isolated mRNA transcript.
  • the SEQ ID NO: (nt) 1 to 131 in the cDNA fragment of RNA1 of the Australian strain of RCNMV is the primer 5 'RS 1T7 (SEQ ID NO: 27: 5'-GCGAGCTCTAATACGAC TCACTATAGACAAACGTTTTACCGGTTTG-3 '), — (SEQ ID NO: 28: 5 '-AAAACCCATGGACTGGTACGAAAAGTAG-3') (the underlined portion indicates a restriction enzyme region), and pRCl IG force was also amplified by PCR.
  • the SEQ ID NO: (nt) in the cDNA fragment of RNA1 of the Australian strain of RCNMV is the primer AC5'UTRZNco + (SEQ ID NO: 29: 5'-CGTACCAG TCC ATGGGTTTTATAAATC-3 ') and 3'R / Cl (sequence) Number 30:
  • the newly synthesized DNA was amplified using the ⁇ RS1T7 primer and the 3RZC1 primer.
  • the amplified 3.9 kb cDNA was treated with restriction enzymes Sacl and Smal, and ligated to the corresponding region of pUCl 18 (Takara Baio Co., Ltd.) to obtain plasmid pURClZNco.
  • the plasmid pURClZNco was digested with the restriction enzyme NcolZSphl, and subjected to end-tapping with T4 DNA polymerase.
  • the resulting small DNA fragments were recovered by electrophoresis on 1% low melting point agarose gel (manufactured by FMC Bioproducts).
  • the recovered small DNA fragment is treated with T4 DNA polymerase and pSP digested with restriction enzymes Xbal and Hpal.
  • the vector was introduced into -Luc + (Promega) to prepare a recombinant vector (pRl-5'-NS) containing the full length RNA1.
  • a DNA fragment obtained by cleaving pURClZNco with Sac1ZNcoI was inserted into the NdelZNcoI region of pRl-XbS to prepare a recombinant vector (pRl-5'-XbS) containing the 5'-UTR and 3'-UTR of RNA1.
  • the recombinant vector comprises the translation control polynucleotide (SEQ ID NO: 14) of the present invention.
  • the plasmid ⁇ 3'-8 carrying the 60-nt poly A region was cleaved with Hindlll / Accl, and a DNA fragment prepared by cleaving pL UCpA30 with Hindlll ZSacI was inserted, and a vector for comparison with poly A (pLUCA30) was produced.
  • the plasmid pLUCpA30 was prepared by recombining the Renilla Luc gene of pSP64-RLUC with the firefly Luc gene.
  • the nucleotide sequences of each of the obtained recombinant vectors were analyzed using ABI310 automatic sequencer.
  • Each of the above recombinant vectors was linearized, and a transcription reaction was performed.
  • RNA1 The recombinant vector (pRl-5, -NS) containing the full length of RNA1 and the recombinant vector (pRl-5'-XbS) containing 51 UTR and 3'-UTR of RNA1 were digested with Smal. After linearization, transcription was performed using T7 RNA polymerase to prepare Rl-5'-NS and R1 5'-XbS.
  • RNA1 The recombinant vector (pRl-Xbs) containing the 3-UTR of RNA1 is cleaved with Smal and linearized, and then transcribed using SP6 RNA polymerase (manufactured by Fermentas) to prepare R1-Xbs. did.
  • the pA60 was cleaved with EcoRI to form a linear chain, followed by transcription using the T7 RNA polymerase to prepare A40.
  • a cap structure analog (m 7 GpppG) manufactured by New England Noorabs Co., Ltd. is used, and mRNA having a Cap structure at the 5 'end and V ⁇ mRNA having a Cap structure are described below. Were prepared respectively.
  • the mRNA having a Cap structure is 1 ⁇ T7 RNA polymerase buffer, 10 mM DTT, ImM ATP, ImM UTP, ImM CTP, 0.2 mM GTP, 2 mM RNA cap
  • a transcription solution containing structure analog (m 7 GpppG), 60 ng z L lineari zed DNA, and lOUZl O T 7 RNA polymerase was used for transcription reaction at 37 ° C for 2 hours, and then RQI RNase- free DNase (Promega)
  • the DNA of each plasmid was prepared by digestion under the reaction conditions of 37 ° C. for 30 minutes.
  • the aforementioned mRNA having no Cap structure is linearized with 1 X T7 RNA polymerase buffer, 10 mM DTT, ImM ATP, ImM UTP, ImM CTP, ImM GTP, and 60 ngZ L.
  • RNA polymerase buffer 10 mM DTT, ImM ATP, ImM UTP, ImM CTP, ImM GTP, and 60 ngZ L.
  • transcription reaction is performed at 37 ° C for 2 hours, and then using RQI RNase-free DNase (manufactured by PUGA Mega Corp.) for 30 minutes at 37 ° C.
  • the DNA of each plasmid was prepared by digestion under the reaction conditions of
  • each reaction solution is saturated with distilled water, and the reaction solution is added to an ImL syringe (manufactured by Terumo Co., Ltd.) packed with a Amersham Sephadex G-50 fine carrier, and the reaction is carried out at 1200 ⁇ g for 5 minutes. And centrifuged using a swing rotor.
  • reaction solution is passed through a column, ethanol precipitated, dissolved in distilled water, and the concentration is A.
  • the back epidermis of the first leaf of cowpea (Vigna unguiculata cv. California Blackeye) cultured for 10 to 16 days is peeled off with tweezers, and the enzyme solution (0.5 M man-tol, 5 mM CaCl, 1% (WZV) cellulase Onozuka R- 10 (Yakult Co., Ltd.), 0. 05%
  • the peeled surface was floated down on (W / V) macerozyme R-10 (manufactured by Yakult Co., Ltd.), and shaken at 40 rpm at 25 ° C. for 4 hours to obtain a protoplast.
  • the protoplasts were filtered through 4 layers of gauze and collected by centrifugation (50 ⁇ g, room temperature, 3 minutes), and then washed three times with 0.5 M man-torol and 5 mM CaCl,
  • the number of cells was counted by a counter.
  • Each of the above recombinant vectors (R1-5'-NS, R1-5'-XbS, Rl-XbS, and pA60) is attached to the wall of the plastic tube, and 200 ⁇ L of PEG solution (40% WZV polyethylene glycol, Pour into protoplasts with 3 mM CaCl, pH 5.5) for 20 seconds
  • the protoplast (transformant) was prepared using culture solution (0.2 mM KH PO, ImM KNO).
  • each recombinant vector only pA60 has the force Cap structure.
  • the structure of each recombinant vector is as shown in FIG.
  • the translation control poly of the present invention represented by SEQ ID NO: 39 (SEQ ID NO: 40 as cDNA) and SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2 as cDNA), which is a sequence forming a stem loop structure in RNA1 of RCNMV.
  • Recombinant vectors p3'TE-DR1 / Lml and p3'TE-DR1 / Lm4 in which mutations were introduced into nucleotide sequences by the following method were prepared.
  • Primer Luc + 3'FW (SEQ ID NO: 33: 5 'T GTGGACGAAGTACGCAAAGGTCTTGG-3') using pRl-5 'XbS as a template, and SL4-: LmlZ-(SEQ ID NO 34: 5'-GAGGAAAAGCCTTCTCAGCGGCGGGTTAC-3 ') And SL4-Lml / + (SEQ ID NO: 35: 5 '-GAGGCTTTTCCTCTGTGTGGT) Using TGCG 3 ') and the combination of: Luc + 3' RV (SEQ ID NO: 36: 5 '-GCAGCGGAACGGACCGAG CGCAGCGAGTCAG-3'), 45 seconds at 94 ° C, 45 seconds at 55 ° C, 72 ° PCR was performed with the conditions of 30 cycles of 1 minute in C, and confirmed that the two fragments of interest are amplified, of, l i u L a Puraima Luc + 3'FW and Luc + 3
  • the PCR reaction was carried out 30 cycles of 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 55 ° C., and 1 minute at 72 ° C.
  • PCR-amplified DNA was digested with restriction enzymes SacII and Smal, it was ligated to the corresponding region of pRl-5'-XbS.
  • the obtained cDNA was applied to autosequencer (manufactured by Applied Biosystems) to confirm that the mutation was inserted.
  • the sequences after insertion of the mutations are shown in each frame of FIG.
  • the recombinant vector into which the mutation shown in Lm4 has been introduced is represented as p3, TE-DRlZLm4, and the recombinant vector into which the mutation shown in Lml has been introduced is referred to as p3 'TE-DRlZLml.
  • the pRl-5'-XbS, the p3'TE-DRlZLm4, the p3'TE-DRlZLml and the PA60 are linearized in the same manner as in Example 1, and transcription is carried out to obtain each of the ⁇ terminal.
  • mRNAs were introduced into protoplasts in the same manner as in Example 1, and luciferase activity (LUC activity) was measured in the same manner as in Example 1.
  • LOC activity luciferase activity
  • 3 ⁇ 41 5'-1 ⁇ is a recombinant vector comprising a translation control polynucleotide represented by SEQ ID NO: 15 (cDNA as SEQ ID NO: 16) and ⁇ UTR of RNA1.
  • ⁇ TE-DRlZLm4 has a base substitution in the region of the translation control polynucleotide of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 (cDNA SEQ ID NO: 2) in the above “R1-5'-XbS”.
  • “3′TE-DRlZLmlJ is the one in which a base substitution has been performed on the region of the translation control polynucleotide of the present invention represented by SEQ ID NO: 39 (SEQ ID NO: 40 as cDNA) in the above“ R1-5′-XbS ”. is there.
  • the SL1 region capable of forming a stem loop, and the SL4 region force translational activity, especially translational activity in a low temperature region. It was found to be an important polynucleotide for enhancing action.
  • a mutation is introduced into the sequence of the translation control polynucleotide of the present invention represented by SEQ ID NO: 3 (cDNA as SEQ ID NO: 4) in RNA1 of the RCNMV, which is a sequence forming a stem loop structure.
  • a recombinant vector P 3'TE-DR1 / Lm5 was prepared.
  • the primers Luc + 3'FW and SL5- A combination of Lml /-(SEQ ID NO: 37: 5 '-CGTGCGGTGTTCCACACACAGAGGTTTTCCC 3) and a thread combination of the above Luc + 3, RV, and SL5-Lml Z + (SEQ ID NO: 38: 5,-GT GTGGAACACCGCACGTCGTTGTCGGAAG 3') A mutation was inserted into SL5 in the same manner as in Example 2 except for the above.
  • luciferase activity (LUC activity) was measured in the same manner as in Example 1.
  • the activity at 25 ° C. of protoplasts into which pA60 (with Cap structure) was introduced was defined as 1, and the relative value was determined. The results are shown in Table 2.
  • 3 ⁇ 41 5'-1 ⁇ is a recombinant vector comprising a translation control polynucleotide represented by SEQ ID NO: 15 (cDNA as SEQ ID NO: 16) and ⁇ UTR of RNA1.
  • ⁇ TE—DRlZLm4 is a sequence of SEQ ID NO: 1 (as cDNA) in the above “R1-5′-XbS”.
  • the region of the translation control polynucleotide of the present invention shown in column number 2) is subjected to base substitution,
  • “3′TE-DRlZLmlJ is the one in which a base substitution has been performed on the region of the translation control polynucleotide of the present invention represented by SEQ ID NO: 39 (SEQ ID NO: 40 as cDNA) in the above“ R1-5′-XbS ”. Yes,
  • “3′TE-DRlZLm5” is a base substitution in the region of the translation control polynucleotide of the present invention represented by SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 4 as cDNA) in the “R1-5′-XbS”. It is
  • the stem loop formable SL5 region like the SL1 region and SL4 region, translational activity, particularly low temperature It has been found that it is an important polynucleotide for its action to enhance translational activity in the region.
  • WGE wheat germ extract
  • RRL rabbit reticulocyte extract
  • the pA60 (having a Cap structure) prepared as in Example 1 was used as a control for comparison with the recombinant vector.
  • RNAs are purified by treating the pA60 and the R1-5'-XbS with an lmL syringe column packed with Sephadex G-50 fine carrier (manufactured by Amersham), 2 The concentration was adjusted to 5 ng Zw L.
  • the 25 L of the reaction solution containing the RRL is the RRL 17.5, an ImM amino acid mixture ( ⁇ mino Acid Mixture) (Promega Corp.) 0.5 ⁇ l, and 40 U / ⁇ 1 lunasin ribonuclease inhibitor (Rnasin) It was prepared to contain 0.5 L of Ribonuclease Inhibitor (Promega) and 6.5 L of distilled water.
  • the reaction was carried out for 2 hours under the conditions of 10 ° C, 17 ° C, 25 ° C and 32 ° C.
  • WGE represents a wheat germ extract
  • RRL represents a rabbit reticulocyte extract
  • the translation control polynucleotide of the present invention has translational activity in the cell-free protein synthesis system, regardless of whether it is an animal cell-derived extract or a plant cell-derived extract. It was found to be enhanced and to enhance translational activity at low temperatures.
  • BY2 culture cells Cultured cells derived from tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright. Yellow-2) (hereinafter referred to as "BY2 culture cells") were treated with medium (30 g / L sucrose, 0.2 g / L KH PO) every 7 days.
  • L. Murashige 'Stag medium mixed salt (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 0.1 g / L myo-inositol, 0.001 g / L Vitamin B 1 hydrochloride, 0.2 X 10- 3 g / L 2.4-dichlorophenoxyacetic acid, pH5. 8) It was obtained by subculturing 1.5 mL of the BY2 cell solution in 10 OmL in a sterile condition, shaking culture at 25 ° C. in dark conditions, and subculturing.
  • the culture solution of the BY2 culture cells is divided into two 50 mL screw tubes, the BY2 culture cells are allowed to fall spontaneously, and the supernatant of the culture solution is removed with a syringe.
  • 4M Man-Tor solution 0.4 M Man-Tor, 20 mM MgCl ⁇ 6%
  • Enzyme solution (1.0% cellulase Onozu RS, 0.1% 1% pectolyase Y-23, 0.4M man-tor ⁇ 5.5) is added to the washed 2nd culture cells 5 times the amount of the cell precipitate Then, it was transferred to a 200 mL Erlenmeyer flask, which was wrapped in aluminum foil and then incubated at 30 ° C. for 3 hours. During incubation, cells were gently stirred with a pipette every 15 minutes. After incubation, the condition of the cells was checked with a microscope, and protoplasts were transferred to a glass centrifuge tube with an enzyme solution and centrifuged at 50 ⁇ g for 3 minutes. .
  • the supernatant was removed with an aspirator, and the protoplast was suspended by adding 0.4 M man-torque solution to about half of the centrifuge tube and further centrifuged at 50 ⁇ g for 3 minutes. After repeating this washing operation 5 times, the precipitated protoplast was suspended in 0.4 M man-tor solution and transferred to a 50 mL screw tube. After centrifuging again at 50 ⁇ g for 3 minutes, the Man-Tor solution was sufficiently removed with an aspirator to obtain protoplasts of the BY2 cultured cells.
  • a recombinant vector (p3, TE-DRl ZLm2, and p3 ') mutated by the following method TE-DRlZLm3) was prepared.
  • Each recombinant vector (p3'TE-DR1 / Lm4, p3'TE-DR1 / Lml, p3'TE-DRlZ) prepared as in Examples 2 and 3 with mutations introduced in the stem-loop structure region Lm5), the p3, TE-DRlZLm2, the p3, TE-DRlZLml, and the pRl-5'-XbS prepared in the same manner as in Example 1 and pA60, which are then transcribed after linearization. To create mRNAs that do not have a Cap structure at the ⁇ end.
  • the resulting mRNAs were respectively introduced into cowpea protoplasts prepared in the same manner as in Example 1 and in tobacco cultured cells (BY2) protoplasts prepared in the same manner as in Example 5, and cultured at 17 ° C. for 16 hours. Thereafter, the luciferase activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • Figure 5 shows the results for tobacco cultured cell (BY2) protoplasts. The results are shown in Figure 6 respectively.
  • the stem loop formable SL5 region is similar to the SL1 region and SL4 region.
  • the polynucleotide is an important polynucleotide in the action of enhancing translational activity in a low temperature range.
  • Example 4 The synthesis was performed in the same manner as in Example 4 except that a tobacco cultured cell (BY2) extract prepared by the following method was used as the cell extract constituting the in vitro translation system kit.
  • BY2 tobacco cultured cell
  • the pA60 (having a Cap structure) prepared in the same manner as in Example 1 was used as a control for comparison with the recombinant vector.
  • the results of the above R1-5 and XbS are shown in FIG.
  • the LUC activity was measured.
  • the translational activity of pA60 (with a Cap structure) was highest at 25 ° C. and 30 ° C. (not shown).
  • the translation control polynucleotide of the present invention was found to enhance the translational activity at low temperature even in a cell-free protein synthesis system.
  • Example 1 in the same manner as the recombinant vector was prepared from RNA1 of RCNMV, from the San Hemp mosaic virus (hereinafter referred to as “SHMV”), the 3′-UTR region, 5, — UTR region cDNAs were prepared and used to produce recombinant vectors in the same manner as in Example 1.
  • SHMV San Hemp mosaic virus
  • the recombinant vector (SH-luc-SH) containing SHMV's 3, -UTR and 5,-UTR, the recombinant vector (pRl-5 'X bS) containing the RCNMV UTR and UTR, and the pA60 After linearizing them in the same manner as in Example 1, respectively, transcription was performed to prepare mRNA having a Cap structure at each 5 'end.
  • the obtained mRNA was introduced into cowpea protoplasts in the same manner as in Example 1 and cultured under temperature conditions of 10 ° C., 17 ° C., 25 ° C. and 32 ° C. for 6 hours to measure luciferase activity. The results are shown in Figure 8.
  • a recombinant vector containing the translation control polynucleotide of the present invention derived from RNAN of RCNMV was prepared from SHMV which has a tobamovirus ⁇ UT R known to enhance translational activity. It has been found that the translational activity is enhanced more than the recombinant vector, particularly in the low temperature range.
  • the cell extract constituting the in vitro translation system kit, and PR OTEIOS (Wakenyaku Co., Ltd.) are used as the other components, and pE U3- ⁇ is used as a control for comparison with the recombinant vector. What was prepared using was used. These vectors were linearized and then transcribed to produce mRNAs that do not have a Cap structure at each ⁇ end. Using the resulting mRNA, protein synthesis was carried out at temperatures of 17 ° C. and 26 ° C., and the luciferase activity was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • the translation control polynucleotide of the present invention is not restricted by the species of the host cell used for live cell line protein synthesis or the species of the extract from the cell free protein, and enhances the translational activity of mRNA.
  • a recombinant vector containing the translational control polynucleotide, any of the translational control polynucleotide and the recombinant vector is introduced.
  • the transformant, the protein synthesis method using the translation control polynucleotide, the in vitro translation kit, and the protein synthesizer are capable of synthesizing a protein unstable in a high temperature range (eg, 20 ° C. or higher), It is suitably used for the synthesis of tough proteins for which a sufficient synthesis amount can not be obtained by conventional methods in a low temperature range (for example, less than 20 ° C.) Door is Ru can.
  • the above-mentioned translation control polynucleotide is used to improve crop varieties suitable for cold region agriculture etc. Specifically, the northern limit of producible crops such as agricultural crops is transferred further to the north to produce crops in cold regions. It can be used suitably for breed improvement that can bring about a revolution in agriculture, such as enabling greenhouse farming such as house cultivation and enabling double cropping of cereals such as rice.

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Abstract

　本発明は、生細胞系タンパク質合成に用いる宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（２０°C未満）における翻訳活性を高める翻訳制御ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。このため、（Ａ）アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの３´側に組み込まれ、組み込まれる前に比べて、該ｍＲＮＡの翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記ｍＲＮＡの翻訳活性を、２０°C未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０°C以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ＲＮＡ）、及び（Ｂ）アミノ酸配列をコードする塩基配列の３´側に組み込まれ、組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、２０°C未満の温度条件下における翻訳活性Ｘと、２０°C以上の温度条件下における翻訳活性Ｙとが、Ｘ／Ｙ≧１の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を提供する。前記（Ａ）の翻訳制御ポリヌクレオチドは、配列番号１５又は７に示されるポリヌクレオチドであり、前記（Ｂ）の翻訳制御ポリヌクレオチドは、配列番号１２又は１３に示されるポリヌクレオチドである。

Description

翻訳制御ポリヌクレオチド
技術分野
[0001] 本発明は、温度に依存して翻訳活性を制御する翻訳制御ポリヌクレオチド、該ポリ ヌクレオチドを含む組換えベクター、及び該組換えベクターを含む形質転換体、並び に、タンパク質合成方法、 in vitro系翻訳キット、タンパク質合成装置に関する。 背景技術
[0002] 従来より、遺伝子組換え技術を用いた有用タンパク質の合成や、植物の品種改良 等が広く行われている。
遺伝子組換え技術におけるタンパク質の合成方法としては、例えば、生細胞である 宿主細胞に、 目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む発現ベクター等を導入 し、前記宿主細胞を形質転換させ、前記目的のタンパク質を発現させる方法等が挙 げられる。
前記宿主細胞に前記目的のタンパク質を効率よく生産させるために、例えば、前記 目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子のプロモーターを改良し、さら に宿主細胞を培養する培地の成分の濃度を調整することにより mRNAの転写活性 を制御する方法 (例えば、特許文献 1参照）や、特定の RNA配列を利用してタンパク 質の翻訳を促進させる方法 (例えば、特許文献 2参照)等の手法がとられてきた。
[0003] 一方、近年では、宿主細胞内で行われるタンパク質合成を、生体外で行わせる方 法として、無細胞系タンパク質合成が研究され、実用化に向けた改良が行われてい る。前記無細胞系タンパク質合成の方法としては、例えば、大腸菌やコムギ胚芽等か ら、リボソーム、 tRNA合成酵素、翻訳開始因子等を含む抽出物を調製し、該抽出物 に铸型となる RNAやエネルギー源をカ卩え、試験管内でタンパク質合成を行わせる方 法が挙げられ、効率よくタンパク質を合成する方法が提案されている（例えば、特許 文献 3参照)。
前記無細胞系タンパク質合成は、宿主細胞の形質転換や、細胞の破砕等の工程 が不要であることに加え、宿主細胞を用いた系に比べ、合成させることが困難なタン ノ ク質の種類が少な 、等の利点がある。
[0004] これらのタンパク質合成方法において、活性のあるタンパク質を効率よく大量に得 ることは容易ではなぐ改良技術が求められている。そのための手法として、例えば、 温度制御が挙げられる。タンパク質合成を温度により制御する方法は、特別な試薬 などが不要であり、環境の影響を直接受けるような屋外で生育する動植物にも応用 可能であることから、極めて有効である。
[0005] 真核生物由来の目的タンパク質を合成する場合、これらのタンパク質は、一般的な 宿主細胞の培養温度の範囲内に活性を有するため、宿主細胞内で発現させることに より、該宿主細胞の生育を阻害し、その結果、十分な量のタンパク質が得られないこ とがあるため、低温条件下で合成を行うことが望まれる。無細胞系タンパク質合成に おいても、同様に、合成された活性を有する目的タンパク質が、翻訳に関与する因子 やタンパク質に悪影響を与えることがある。
また、大腸菌を使用した場合、一般的な培養温度である 37°Cよりも低い温度で培 養を行うと、活性型タンパク質の発現量が増加することが知られており、さらに、この 他にも、好適生育温度範囲が 20°C未満の動植物由来のタンパク質を合成する場合 にも、低温条件下で行うことにより、効率よく活性のあるタンパク質が合成できると考え られる。このように、タンパク質合成における温度制御としては、例えば、低温条件下 において合成を促進させる技術が有効であると考えられる。
[0006] 低温条件下でタンパク質合成を行う方法として、例えば、低温でタンパク質を発現 させるベクターや、プロモーター配列等が提案されている力 宿主細胞や、無細胞系 タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、 mRNAの翻訳活 性を温度制御可能な因子は未だ満足なものは提供されていないのが現状である。
[0007] ところで、本発明の発明者らは、レッド'クローバ一'ネクロティック 'モザイク'ウィル ス（Red Clover Necrotic Mosaic Virus、以下「RCNMV」と略称することがあ る）の遺伝子の複製に、温度依存性があることを見出し、発表している（非特許文献 1 参照）。具体的には、 RCNMVの遺伝子である RNA1を植物プロトプラストに接種し た場合、 RCNMVのオーストラリア株 RNA1は、 17°C及び 25°Cのいずれでも自己複 製できるのに対し、 RCNMVのカナダ株の RNA1は、 17°Cで自己複製できる力 25 °Cでは自己複製できないことを見出したのである。
本発明者らは、 RCNMVの遺伝子の「複製」に温度依存性があることを見出し、発 表したが、前記非特許文献 1において、 RCNMVの遺伝子の「翻訳」の温度依存性 については開示していない。一般に、遺伝子の「複製」と「翻訳」とは、以下に示す通 り、まったく異なるものである。
RNAウィルスの遺伝子（ゲノム RNA)の「複製」過程は、
1)細胞に侵入したゲノム RNAからのウィルス RNA複製酵素タンパク質の翻訳、
2)ウィルス RNA複製酵素タンパク質のゲノム RNA (特に^ UTR)の認識、
3)ゲノム RNAからのマイナス鎖 RNA (ゲノム RNAに相補的配列を持つ RNA)の 合成、
4)マイナス鎖 RNAを铸型としたゲノム RNAの合成
という、 4つに大別され、これらの中でいずれかの過程が進行しない場合には、ウィル スの遺伝子である RNAは「複製」されな!/、。
本発明者らは、 25°Cで複製できな 、前記カナダ株の RNA1における^ UTR及 び^—UTRを有する luc mRNAが、 17°Cよりは程度は劣るものの 25°Cでもキヤッ プ非依存性の翻訳活性を示す結果を得た。この翻訳活性は、キャップ及びポリ (A)を 有する通常の mRNAの翻訳活性に比べても約 10倍も高ぐ 25°Cでも十分な量のゥ ィルスタンパク質が翻訳されることを示唆して 、る。このことから RNA1のウィルスタン ノ ク質の翻訳が、「複製」と同様の温度依存性を示すものではないことは明らかであ る。
また、 RCNMVの RNA1の合成活性（上記 4)の過程）は、 17°Cよりも 25°Cの方が 高いことから、 RNA1の「複製」の温度感受性は、上記 2)ウィルス RNA複製酵素タン パク質のゲノム RNA (特に^ -UTR)の認識の過程、又は上記 3)ゲノム RNAから のマイナス鎖 RNAの合成の過程、の 、ずれか〖こ関与するものと考えられる。
一般的に、翻訳の過程は、 mRNAにリボソームが結合し、 tRNAにより誘導された アミノ酸が連結されてペプチド乃至タンパク質が合成される過程力もなり、これらは「 複製」の過程と異なるものである。また、該翻訳におけるメカニズム、必要とされる因 子や物質も、前記「複製」とは異なるのものである。 [0009] 特許文献 1：特開 2002— 320495号公報
特許文献 2：特許第 2814433号公報
特許文献 3：特開 2002— 338597号公報
非特干文献 1 : Hiroyuki izumoto, Yasufumi Hikichi, and Tetsuro Okuno, Viology 293(2002), p320-327
発明の開示
[0010] 本発明は従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とす る。即ち、本発明は、生細胞系タンパク質合成に用いる宿主細胞や、無細胞系タン ノ ク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、 mRNAの翻訳活性を 高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（20°C未満）における翻訳活性を高める 翻訳制御ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、該翻訳制御ポリヌクレオチドを含む糸且換えベクター、前記翻訳制御ポリヌクレ ォチド及び該組換えベクターの!/ヽずれかが導入された形質転換体、前記翻訳制御 ポリヌクレオチドを用いたタンパク質合成方法、 in vitro系翻訳キット、並びにタンパ ク質合成装置を提供することを目的とする。
[0011] 前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ゲノム RNAの複 製にぉ 、て温度依存性を示したレッド ·クローバー ·ネクロティック ·モザイク ·ウィルス ( Red Clover Necrotic Mosaic Virus、 RCNMV)の RNA1力 その非翻訳領 域に、翻訳活性を高め、特に、 20°C未満の温度条件下における翻訳活性を高める 領域を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0012] 本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するた めの手段としては、以下の通りである。即ち、
< 1 > (1)配列番号 15に示される RN A配列、 (2)配列番号 15に示される RNA 配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオ チド、（3)配列番号 15に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダ ィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の!、ずれかのポリヌクレオチドの 部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする mRNAの 3 則に 組み込まれ、 組み込まれる前に比べて、該 mRNAの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記 mRNAの翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における翻 訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係を 満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 15)
uugguucuuu uaaguguagc cuccacccga guugcaagag gggaacacgc agucucgccg 60 acccuguugg caaacaguaa aauugcaaaa aauagagugc uaggaguagu ucccguaccc 120 gcgggagcaa gacccuacua caguagacga accggcaucg gacccuggga aacagguacc 180 uagcguauua auaggucgcu agaaaucggg cgggcuucac cuucggguaa cccgccgucg 240 agagggaaaa ccucugugug guugugcgca cgucguuguc ggaagacucu cacuguugua 300 guuauuuccu uuuucuuuua gguaggagca cuugcucaga gggcgcauac cucugguaaa 360 acaaaauugg ccccugagag uagaaaacuc agguuaauaa aacaggagaa uauuuaccua 420 gucguauaac ggcuagguac ccc 443
< 2> (1)配列番号 7に示される RNA配列、（2)配列番号 7に示される RNA配列 において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3)配列番号 7に示される RNA配列と、ストリンジ ントな条件下でハイブリダィズす るポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配 列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする mRNAの 3 則に組み込 まれ、
組み込まれる前に比べて、該 mRNAの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記 mRNAの翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における翻 訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係を 満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 7)
uugguuaauu gguuagcgca gccuccaucc gaguugcaag agaggaagac gcagucucgc 60 cgacccuguu ggcaaacagu aaaauugcaa aaaauagagu guuaggagua guucccauac 120 ccuuggggac aagaaccuau uauggagaaa cgaacuggca ucggacccug ggaaacaggc 180 aucuagcgua uuaauagguc gcuagaagac gggcaggcuu caccacuagg uaaccugccg 240 ccgagaggga aaaccucugu gugguugugc gcacgucguu gucggaagaa guucaccaua 300 guaguuauuu ccuuuucuuu uagguagaag cacuugcucc agagggcgca uaccucuggu 360 uaaacaaaau uguccccuga gaguagaaaa cucagguuaa uaaaacagga gaauauuuac 420 cuaguuguau aacggcuagg uacccc 446
< 3 > 17°Cにおける翻訳活性が、 25°Cにおける翻訳活性よりも高くなるように制 御する前記 < 1 >から < 2 >の 、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
< 4 > ( 1)配列番号 39に示される RN A配列、（2)配列番号 39に示される RNA 配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオ チド、及び（3)配列番号 39に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記く 1 >から < 3 >の いずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 39)
ccugggaaac agg 1ύ
< 5 > ( 1)配列番号 1に示される RNA配列、（2)配列番号 1に示される RNA配列 において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 及び（3)配列番号 1に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチド、の少なくとも 、ずれかを含む前記く 1 >から < 3 >の!、ずれ かに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 1)
agagggaaaa ccucu 15
< 6 > ( 1)配列番号 3に示される RNA配列、（2)配列番号 3に示される RNA配列 において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 及び（3)配列番号 3に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチド、の少なくとも 、ずれかを含む前記く 1 >から < 3 >の!、ずれ かに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 3)
gugugguugu gcgcac 16
< 7 > ( 1)配列番号 13に示される RNA配列、（2)配列番号 13に示される RNA 配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオ チド、及び（3)配列番号 13に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記く 1 >及び < 3 > のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 13)
gaaccggcau cggacccugg gaaacaggua ccuagcguau uaauaggucg cuagaaaucg 60 ggcgggcuuc accuucgggu aacccgccgu cgagagggaa aaccucugug ugguugugcg 120 cacgucguug ucggaaga 138
< 8 > (1)配列番号 5に示される RNA配列、（2)配列番号 5に示される RNA配列 において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 及び（3)配列番号 5に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチド、の少なくとも 、ずれかを含む前記く 2 >及びく 3 >の!、ずれ かに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 5)
gaacuggcau cggacccugg gaaacaggca ucuagcguau uaauaggucg cuagaagacg 60 ggcaggcuuc accacuaggu aaccugccgc cgagagggaa aaccucugug ugguugugcg 120 cacgucguug ucggaag 137
< 9 > アミノ酸配列をコードする mRNAの 5 則に（ 1)配列番号 17に示される RN A配列、（2)配列番号 17に示される RNA配列において、 1若しくは複数の塩基が欠 失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 17に示される RNA配 列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1 )から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくとも 、ずれかが組み込 まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記 < 1 >から < 8 >のいずれかに記載の翻 訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 17)
gacaaacguu uuaccgguuu guaaauagga gcacacaagc ucgcuagucg cccccuucgu 60 aucggggauc uagagauuaa acgguauacc ugucauuuua aauuucuacu uuucguacca 120 guc 123 < 10> アミノ酸配列をコードする mRNAの 5 則に（1)配列番号 9に示される RN A配列、（2)配列番号 9に示される RNA配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失 、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 9に示される RNA配列と 、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)か ら（3)のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組み込まれ たポリヌクレオチドに組み込まれる前記 < 1 >から < 8 >のいずれかに記載の翻訳制 御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 9)
gaacaaacgu uuuaccgguu uguaaauugg aauucucgaa uucgccaguc gccuucuucg 60 uaucaaggau cuggaauuug aacgguaucu uuaucauuuu aauuucuacu uuucguacca 120 guc 123
< 11 > レッドクローバー'ネクロティック 'モザイクウィルス（Red clover necroti c mosaic virus :RCNMV)の RNA1由来の配列である前記 < 1 >からく 10>の いずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
< 12> (1)配列番号 16に示される DNA配列、（2)配列番号 16に示される DNA 配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオ チド、（3)配列番号 16に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダ ィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の!、ずれかのポリヌクレオチドの 部分配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の 3 則 に組み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における 翻訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係 を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 16)
ggggtaccta gccgttatac gactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggccaattt tgttttacca gaggtatgcg ccctctgagc aagtgctcct 120 acctaaaaga aaaaggaaat aactacaaca gtgagagtct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcgacggc gggttacccg aaggtgaagc ccgcccgatt 240 tctagcgacc tattaatacg ctaggtacct gtttcccagg gtccgatgcc ggttcgtcta 300 ctgtagtagg gtcttgctcc cgcgggtacg ggaactactc ctagcactct attttttgca 360 attttactgt ttgccaacag ggtcggcgag actgcgtgtt cccctcttgc aactcgggtg 420 gaggctacac ttaaaagaac caa 443
< 13 > (1)配列番号 8に示される DNA配列、（2)配列番号 8に示される DNA配 列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチ ド、（3)配列番号 8に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズ するポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分 配列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の 3 則に組 み込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における 翻訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係 を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 8)
ggggtaccta gccgttatac aactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggacaattt tgtttaacca gaggtatgcg ccctctggag caagtgcttc 120 tacctaaaag aaaaggaaat aactactatg gtgaacttct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcggcggc aggttaccta gtggtgaagc ctgcccgtct 240 tctagcgacc tattaatacg ctagatgcct gtttcccagg gtccgatgcc agttcgtttc 300 tccataatag gttcttgtcc ccaagggtat gggaactact cctaacactc tattttttgc 360 aattttactg tttgccaaca gggtcggcga gactgcgtct tcctctcttg caactcggat 420 ggaggctgcg ctaaccaatt aaccaa 446
く 14〉 17°Cにおける翻訳活性が、 25°Cにおける翻訳活性よりも高くなるように制 御する前記 < 12〉から < 13〉に記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
< 15 > (1)配列番号 40に示される DNA配列、（2)配列番号 40に示される DNA 配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオ チド、及び（3)配列番号 40に示される DNA配列と、ストリンジヱントな条件下でノヽィ ブリダィズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記く 12 >からく 14 >の 、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 40)
cctgtttccc agg 1ύ
< 16 > ( 1)配列番号 2に示される DNA配列、（2)配列番号 2に示される DNA配 列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチ ド、及び（3)配列番号 2に示される DNA配列と、ストリンジ ントな条件下でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記 < 12 >から < 14 >の いずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 2)
agaggttttc cctct 15
< 17 > ( 1)配列番号 4に示される DNA配列、 (2)配列番号 4に示される DNA配 列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチ ド、及び（3)配列番号 4に示される DNA配列と、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリ ダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記 < 12 >から < 14 >の いずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 4)
gtgcgcacaa ccacac ID
< 18 > ( 1)配列番号 14に示される DNA配列、（2)配列番号 14に示される DNA 配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオ チド、及び（3)配列番号 14に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、ィ ブリダィズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記く 12 >及びく 14 >の 、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 14)
tcttccgaca acgacgtgcg cacaaccaca cagaggtttt ccctctcgac ggcgggttac 60 ccgaaggtga agcccgcccg atttctagcg acctattaat acgctaggta cctgtttccc 120 agggtccgat gccggttc 138 < 19 > (1)配列番号 6に示される DNA配列、（2)配列番号 6に示される DNA配 列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチ ド、及び（3)配列番号 6に示される DNA配列と、ストリンジ ントな条件下でノ、イブリ ダイズするポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む前記 < 13 >及びく 14>の いずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 6)
cttccgacaa cgacgtgcgc acaaccacac agaggttttc cctctcggcg gcaggttacc 60 tagtggtgaa gcctgcccgt cttctagcga cctattaata cgctagatgc ctgtttccca 120 gggtccgatg ccagttc 137
< 20> アミノ酸配列をコードする塩基配列の 5 則に（1)配列番号 18に示される DNA配列、（2)配列番号 18に示される DNA配列において、 1若しくは複数の塩基 が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 18に示される DN A配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前 記（1)から（3)のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組 み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記 < 12>から< 19 >のいずれか〖こ記 載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 18)
gactggtacg aaaagtagaa atttaaaatg acaggtatac cgtttaatct ctagatcccc 60 gatacgaagg gggcgactag cgagcttgtg tgctcctatt tacaaaccgg taaaacgttt 120 gtc 123
< 21 > アミノ酸配列をコードする塩基配列の 5 則に（1)配列番号 10に示される DNA配列、（2)配列番号 10に示される DNA配列において、 1若しくは複数の塩基 が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 10に示される DN A配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前 記（1)から（3)のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくともいずれかが組 み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれる前記 < 12>から< 19 >のいずれか〖こ記 載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
(配列番号 10) gactggtacg aaaagtagaa attaaaatga taaagatacc gttcaaattc cagatccttg 60 atacgaagaa ggcgactggc gaattcgaga attccaattt acaaaccggt aaaacgtttg 120 ttc 123
<22> レッドクローバー'ネクロティック 'モザイクウィルス（Red clover necroti c mosaic virus:RCNMV)の RNA1由来の配列に対する cDNAである前記 < 1 2>からく 21 >のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
[0014] <23> 17°C以下の温度条件下において翻訳活性が最大となるように翻訳制御 する前記 <1>からく 22>の 、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドである。
< 24 > アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの非翻訳領域 に組み込まれる前記 <1>から <23>の 、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチ ドである。
[0015] <25> 前記 <1>からく 24>のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを 含むことを特徴とする組換えベクターである。
[0016] <26> 前記 <1>からく 24>のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド、 及び前記 < 25 >のいずれかに記載の組換えベクターの少なくともいずれかを含むこ とを特徴とする形質転換体である。
<27> 動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母から選択される前記く 26>に記 載の形質転換体である。
[0017] <28> 前記 <1>からく 24>のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを 用いることを特徴とするタンパク質合成方法である。
<29> 前記く 25 >に記載の組換えベクターを用いることを特徴とするタンパク質 合成方法である。
<30> 無細胞タンパク質合成系で行われる前記く 28 >からく 29 >の!ヽずれか に記載のタンパク質合成方法である。
く 31 > コムギ胚芽抽出物を用いて行われる前記く 30 >に記載のタンパク質合 成方法である。
< 32 > 真核生物の細胞を用いて行われる前記く 28 >力らく 29 >の!、ずれかに 記載のタンパク質合成方法である。 く 33 > 大腸菌を用いて行われる前記く 28 >からく 29 >の!、ずれかに記載のタ ンパク質合成方法である。
< 34> 17°C以下の温度条件下で行われる前記 < 28 >力ら< 33 >のいずれ力 に記載のタンパク質合成方法である。
[0018] < 35 > 前記 < 1 >から < 24>のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを 少なくとも含むことを特徴とする in vitro系翻訳キットである。
< 36 > コムギ胚芽抽出物を含む前記 < 35 >に記載の in vitro系翻訳キット。
[0019] < 37> 前記 < 1 >から < 24>のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを 用い、アミノ酸を合成させる合成手段を少なくとも有することを特徴とするタンパク質 合成装置である。
く 38 > 合成手段がコムギ胚芽抽出物を使用する前記く 37 >に記載のタンパク 質合成装置である。
< 39 > 温度制御手段を有する前記 < 37 >から < 38 >の 、ずれかに記載のタン パク質合成装置である。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]図 1は、 RCNMVのオーストラリア株の RNA1を示す構造図であり、本発明の翻 訳制御ポリヌクレオチドである^ TE— DR1領域が形成する 2次構造 (ステムループ 構造)を示した模式図である。
[図 2]図 2は、 RCNMVのカナダ株の RNA1を示す構造図であり、本発明の翻訳制 御ポリヌクレオチドである^ TE— DR1領域が形成する 2次構造 (ステムループ構造） を示した模式図である。
[図 3]図 3は、実施例 1で翻訳活性を評価した各 mRNAの構造図であり、破線は欠失 を導入した部分、細線は pUCl 18の配列部分を示す。
[図 4]図 4は、実施例 2、実施例 3、実施例 6、及び実施例 7において、 3'TE-DR1 領域中の各ステムループ構造に導入した変異を表す模式図である。
[図 5]図 5は、実施例 6において、宿主細胞としてタバコ培養細胞プロトプラストを用い 、翻訳制御ポリヌクレオチド (配列番号 15、配列番号 16)を含む組換えベクター (R1 5,— XbS)、及び、ステムループを構成する領域に変異を導入した組換えべクタ 一（3'TE— DRlZLml、 3'TE-DR1/Lm2, 3'TE-DR1/Lm3, 3'TE— D RlZLm4、 3'TE-DR1/Lm5)を用いてタンパク質合成を行った結果を示すダラ フである。
[図 6]図 6は、実施例 6において、宿主細胞としてササゲプロトプラストを用い、翻訳制 御ポリヌクレオチド (配列番号 15、配列番号 16)を含む組換えベクター (R1— 5' X bS)、及び、ステムループを構成する領域に変異を導入した組換えベクター（3,TE -DRl/Lml, 3'TE-DR1/Lm2, 3'TE-DR1/Lm3, 3'TE-DRl/Lm 4、 3'TE-DR1/Lm5)を用いてタンパク質合成を行った結果を示すグラフである
[図 7]図 7は、実施例 7において、タバコ培養細胞 (BY2)抽出物を使用した無細胞タ ンパク合成系でタンパク質合成を行った結果を示すグラフである。
[図 8]図 8は、実施例 8において、 RCNMV由来の本発明の翻訳制御ポリヌクレオチ ドを含む組換えベクター（R1— 5' -XbS)と、サンへンプモザイクウィルス (SHMV) の非翻訳領域を含む組換えベクター（SH— luc— SH)の翻訳活性を比較した結果 を示すグラフである。
[図 9]図 9は、実施例 9において、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えべ クタ一を含む in vitro系翻訳キットを用いたタンパク質合成と、他の組換えベクター を含む in vitro系翻訳キットを用いたタンパク質合成とを比較した結果を示すグラフ である。
発明を実施するための最良の形態
(翻訳制御ポリヌクレオチド）
本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、
(A)アミノ酸配列をコードする mRNAの 3 則に組み込まれ、組み込まれる前に比 ベて、該 mRN Aの翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記 mRNAの翻訳活 性を、 20°C未満の温度条件下における翻訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下にお ける翻訳活性 Yとが、 X/Y≥ 1の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド (RN Α)、及び
(Β)アミノ酸配列をコードする塩基配列の 3 則に組み込まれ、組み込まれる前に比 ベて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、組み込まれた後の前記塩基配列の翻 訳活性を、 20°C未満の温度条件下における翻訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下 における翻訳活性 Yとが、 X/Y≥ 1の関係を満たすように制御するポリヌクレオチド（ DNA)である。
[0022] 前記翻訳活性は、前記 mRNAがコードする目的のアミノ酸配列（以下、「タンパク質 」ということがある）の合成量で表すことができ、「翻訳活性を高める」とは、タンパク質 合成量 Pが、該翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれる前の合成量 Qに対し、 P> Qの関係を満たすことを表す。
前記合成量の定量方法としては、例えば、回収した前記目的のタンパク質濃度を 分光高度計を用いて測定する方法、放射線同位元素をとりこませて前記目的のタン パク質を合成させて、該タンパク質の放射活性を測定する方法、更に、活性を評価 する目的で発光タンパク質を合成させて、該発光タンパク質の発光量を測定する方 法等が挙げられる。
[0023] (A)翻訳制御ポリヌクレオチド (RNA)—
前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチド (RNA)としては、
(I) (1)配列番号 15に示される RNA配列、（2)配列番号 15に示される RNA配列に おいて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 ( 3)配列番号 15に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズす るポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配 列、の少なくとも 、ずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドと、
(II) (1)配列番号 7に示される RNA配列、（2)配列番号 7に示される RNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 7に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリ ヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、 の少なくともいずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドとが挙げられる。
[0024] 本発明にお 、て、ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドとは、 特定されたポリヌクレオチド (例えば、前記 (I)においては、配列番号 15に示される R NA配列）と 90%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 97%以上の相同性が存 在するときにのみ、ハイブリダィゼーシヨンが起こるポリヌクレオチドを意味し、完全ノヽ イブリツドの融解温度 (Tm)より約 5°C〜約 30°C、好ましくは約 10°C〜約 25°C低い温 度でハイブリダィゼーシヨンが起こるポリヌクレオチドをいう。
なお、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、 J. Sambrookら， Molecular Cloning, ALaboratory
Mannuai, second Edition, Cold Spring Haroor Laboratory Press (198 9) ,特【こ 11.45節' Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Prob es"に記載された条件を適用することができる。
[0025] また、本発明にお 、て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポ リヌクレオチドとは、特定されたポリヌクレオチド (例えば、前記 (I)においては、配列 番号 15に示される RNA配列）に、 1〜30個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜 10個の塩基の欠失、置換、若しくは付加といった変異を有するポリヌクレオチドをいう 。前記塩基の欠失、置換、若しくは付加の手段としては、特に制限はなぐ公知の方 法力 適宜選択することができる。
[0026] (配列番号 15)
uugguucuuu uaaguguagc cuccacccga guugcaagag gggaacacgc agucucgccg 60 acccuguugg caaacaguaa aauugcaaaa aauagagugc uaggaguagu ucccguaccc 120 gcgggagcaa gacccuacua caguagacga accggcaucg gacccuggga aacagguacc 180 uagcguauua auaggucgcu agaaaucggg cgggcuucac cuucggguaa cccgccgucg 240 agagggaaaa ccucugugug guugugcgca cgucguuguc ggaagacucu cacuguugua 300 guuauuuccu uuuucuuuua gguaggagca cuugcucaga gggcgcauac cucugguaaa 360 acaaaauugg ccccugagag uagaaaacuc agguuaauaa aacaggagaa uauuuaccua 420 gucguauaac ggcuagguac ccc 443
(配列番号 7)
uugguuaauu gguuagcgca gccuccaucc gaguugcaag agaggaagac gcagucucgc 60 cgacccuguu ggcaaacagu aaaauugcaa aaaauagagu guuaggagua guucccauac 120 ccuuggggac aagaaccuau uauggagaaa cgaacuggca ucggacccug ggaaacaggc 180 aucuagcgua uuaauagguc gcuagaagac gggcaggcuu caccacuagg uaaccugccg 240 ccgagaggga aaaccucugu gugguugugc gcacgucguu gucggaagaa guucaccaua 300 guaguuauuu ccuuuucuuu uagguagaag cacuugcucc agagggcgca uaccucuggu 360 uaaacaaaau uguccccuga gaguagaaaa cucagguuaa uaaaacagga gaauauuuac 420 cuaguuguau aacggcuagg uacccc 446
[0028] ここで、前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、該 (A)の翻訳制御ポリヌクレ ォチドの cDNAである前記（B)の翻訳制御ポリヌクレオチド力 任意のアミノ酸配列を コードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの前記塩基配列の 3 則に組み込まれ た結果、前記塩基配列とともに転写されて mRNAの 3 則に存在する RNA配列であ つてもよい。
[0029] 前記翻訳制御ポリヌクレオチドの翻訳制御の態様としては、例えば、前記 mRNAの 17°Cにおける翻訳活性力 25°Cにおける翻訳活性よりも高くなるように制御する態 様であることが好ましぐ 17°Cにおける翻訳活性が最大となるように制御する態様で あることがより好ましい。この結果、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、高温 (例えば、 2 5°C以上)条件下で不安定なタンパク質の合成や、低温 (例えば、 17°C以下)条件下 で産生量が少な!/、タンパク質の合成に好適に使用される。
[0030] 前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、例えば、
前記 (I)の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号 13の翻訳制御ポリ ヌクレ才チド、
前記 (II)の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号 5の翻訳制御ポリ ヌクレオチド、並びに、
前記 (I)及び (II)の翻訳制御ポリヌクレオチドに共通な配列である配列番号 39、配 列番号 1、及び配列番号 3の翻訳制御ポリヌクレオチド、などが好適に挙げられる。 さらに、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドの 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若 しくは付加されたポリヌクレオチド、及びこれらの翻訳制御ポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズする翻訳制御ポリヌクレオチドが挙げられる。
また、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドは単独であってもよぐ複数の組合せから なるものであってもよい。
[0031] (配列番号 13) gaaccggcau cggacccugg gaaacaggua ccuagcguau uaauaggucg cuagaaaucg 60 ggcgggcuuc accuucgggu aacccgccgu cgagagggaa aaccucugug ugguugugcg 120 cacgucguug ucggaaga 138
[0032] (配列番号 5)
gaacuggcau cggacccugg gaaacaggca ucuagcguau uaauaggucg cuagaagacg 60 ggcaggcuuc accacuaggu aaccugccgc cgagagggaa aaccucugug ugguugugcg 120 cacgucguug ucggaag 137
[0033] (配列番号 39)
ccugggaaac agg 13
[0034] (配列番号 1)
agagggaaaa ccucu 15
[0035] (配列番号 3)
gugugguugu gcgcac 16
[0036] 前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドとしては、特 に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができるが、アミノ酸配列をコードする mRNAの 5 則に、
(1)配列番号 17に示される RNA配列、 (2)配列番号 17に示される RNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 17に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポ リヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、 の少なくとも 、ずれかが組み込まれたポリヌクレオチド、及び
(1)配列番号 9に示される RNA配列、 (2)配列番号 9に示される RNA配列にぉ 、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配 列番号 9に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌ クレオチド、及び (4)前記（1)から（3)のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の 少なくとも 、ずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれることが好ま U、。
[0037] (配列番号 17)
gacaaacguu uuaccgguuu guaaauagga gcacacaagc ucgcuagucg cccccuucgu 60 aucggggauc uagagauuaa acgguauacc ugucauuuua aauuucuacu uuucguacca 120 guc 123
[0038] (配列番号 9)
gaacaaacgu uuuaccgguu uguaaauugg aauucucgaa uucgccaguc gccuucuucg 60 uaucaaggau cuggaauuug aacgguaucu uuaucauuuu aauuucuacu uuucguacca 120 guc 123
[0039] また、前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれる mRNA (ポリヌクレオチ ド）としては、 3'末端のポリ A構造、及び^末端の Cap構造の少なくともいずれかを有 していてもよぐいずれも有していなくてもよい。 3,末端のポリ A構造、及び^末端の Cap構造を有するポリヌクレオチドに組み込まれた場合には、該 mRNAの翻訳活性 をより高めることができる。
[0040] 前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドがコードする アミノ酸配列としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、タン パク質、ポリペプチド鎖のいずれであってもよいが、タンパク質であることが好ましい。 また、前記タンパク質としては、低温条件下で発現量が少ないタンパク質や、高温 条件下で不安定なタンパク質等が好適に挙げられる。
[0041] また、前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれる mRNA (ポリヌクレオチ ド）の領域としては、前記アミノ酸配列をコードする領域の 3 則であれば、特に制限 はなぐ 目的に応じて適宜選択することができるが、非翻訳領域であることが好ましい
[0042] 前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、レッドクローバー'ネクロティック 'モ ザイクウイノレス（Red clover necrotic mosaic virus :RCNMV)の RNA1由来 の配列であることが好ましぐ具体的には、配列番号 19に示すオーストラリア株の RN A1由来の配列、及び、配列番号 11に示すカナダ株の RNA1由来の配列のいずれ かであることが好ましい。
[0043] (配列番号 19)
gacaaacguu uuaccgguuu guaaauagga gcacacaagc ucgcuagucg cccccuucgu 60 aucggggauc uagagauuaa acgguauacc ugucauuuua aauuucuacu uuucguacca 120 gucauggguu uuauaaaucu uucgcuuuuu gauguggaua aauuaauggu gugggugagu 180 aaauucaauc caggcaaaau ccugucugca aucugcaacu uggguauaga cuguuggaau 240 cgcuuucgca agugguucuu uggucucaac uuugaugcac auaugugggc gguggaugcc 300 uucauuccac ucaugccaca uuacacggag cagauggaac guguagucga cgacuucugc 360 agcgaaaccc cagaauccaa auuagaagac ugucuggaac uggacaccuc aguaaaugaa 420 uucuucgaug aagaggugua caagaaggau gaggaaggcg ugaugaaacu ccaaaggagc 480 gcugccagga aacacauuaa acgugugcgc ccaggcauga ugcaagcggc cauuaaggcu 540 guagaaacga ggaucagaaa ucgccauacc aucuuuggag augacauggg aaagguagac 600 gaagcugcag uuagagcaac ugccagugac auauguggug aguucaagau caacgaacac 660 cacaccaaug cauuggugua ugccgcagca uaccuugcca ugacaccaga ccagaggucu 720 aucgacagcg ucaagcucgc cuacaauccu aagagucaag ccagaaggac uuugguuuca 780 gccauucgug agaacaaggc uguugccggg uucaaauccc uugaggauuu uuaggcggcc 840 cacucagcuu uccgguugaa gaugccccau auccuauuuu aggcaucccg gaaaucaggg 900 uagcugagaa gcgggccagu agagucauga aaaguaagag agucguaggg uuaccugcug 960 uuagugcagg uuugaagguu ugcguccauc aaaccucccu acauaauaug auaguuaguc 1020 ucgaacgcag gguuuuucgu gugaagaacu cugcaggaga guuaguagua ccucccaaac 1080 cuauccaaaa ugcauuugac uccauuuccu auuuccguga agaaugguug aggaaauugu 1140 cucacaaggg ucaaauucuc aaguccucuu uggcggaugu uguggcgugu uacucuucug 1200 aaaagaggaa guuauaccaa aaagcagcag acuccuuaga gaagaaaccu gugcaaugga 1260 gagacuccaa gguacaagca uucaucaaag uugaaaagcu ugagugugac accaaggauc 1320 ccguaccucg uacgauucaa ccucgaucca agagguacaa ccuagcaaua ggccaguauc 1380 ucagauuaaa ugaaaagaag auguuggauu ccauagacga cguuuucaaa gagaagacug 1440 ucuuaucagg uuuggacaac agggcucaag ggagagccau cgcccacaag uggcguaaau 1500 accagaaccc aauagggauc gggcuggaug caucgagauu cgaucaacau ugcagcgucg 1560 augcccucaa auucgagcaa acuuucuaua aagcgugcuu uccuggggau caacaguugg 1620 aaacauuauu gaaauggcaa uuauccaaua cuggaucggc uuuguuacca acuggagaac 1680 ugguuagaua ucguaccaaa gggugucgca ugagcggcga uauaaacaca ggccuuggga 1740 acaaaauucu caugugcagc augguacacg cauucuugaa agagacggga gugcgagcuu 1800 cguuggccaa caauggugac gauugugucc ucuucuguga gaagggagau uaugagcaga 1860 uaaaccgcaa ucuugagcaa ugguuccugu gcagggguuu cgaaaugacc gucgaaaaac 1920 cugucgaugu acucgagaag guggcguuuu gucguaguca accgguuugc auugccacgc 1980 aaugggcuau gguaaggcaa uugggaaguu ugucgagaga cugcuuuuca acacaggauu 2040 gguuaaaccc aaagacauuc aaagaugcaa ugaaugcgcu aggucaaugu aacgggauca 2100 ucaaugaugg aguuccaaua cauauggcac aagcaaaacu aaugcauaga aucgguggaa 2160 accguaaguu caaucuagau gcgcuucaua aacaaaugga guacagcugg agagaucguc 2220 ucgguaagag aacgaaucuu uuguggagug agguagagga ugcuacaaga uugucguacu 2280 uuagagcauu cggaauagaa ccuuacauuc aaagaauagu ggaggaguac uucucacagg 2340 uggaaaucac uugugagggg cgaucaacaa acguauuacc uacacacuac ucuagaaucc 2400 acaaagaucu aaucaaagcc cgauaaaaug ucuucaaaag cucccaagaa auccaaacaa 2460 cggucccagc ccaggaaccg gaccccaaau accaguguaa agacuguagc cauccccuuu 2520 gccaagacgc aaauaaucaa gacugugaau ccuccaccga aaccagcaag agguauauug 2580 cauacccagu uaguuaugag ugugguugga ucaguucaaa ugcguacaaa uaauggcaaa 2640 uccaaccaaa gguucagauu aaacccuagc aauccugcuc uuuuccccac ucuagcauau 2700 gaagcugcaa auuaugacau guaucgcuua aagaagcuga cacuccguua cgucccacuc 2760 guuaccgugc aaaauuccgg gcgaguugca augaucuggg aucccgacuc gcaagacucg 2820 gccccacaau ccagacagga gauaucagcc uauucccgau cagucucgac ugccguguac 2880 gagaaaugcu cguugacgau uccggcggau aaucaauggc gcuucguugc agauaacacc 2940 acaguggaca gaaagcucgu cgauuuuggc cagcuuuugu ucguuacaca cucugguagu 3000 gauggaauag aaacagggga cauauucuua gauugugaag ucgaguucaa aggaccccaa 3060 ccaaccgcaa gcaucguaca gaaaacugua auugaucucg gugggacacu cacuucuuuc 3120 gaagggccau cuuaucugau gccuccggau gccuuuauua ccaguucuag uuucggccug 3180 uuuguugacg ucgcagggac cuaucugcuu acacuagugg ugacuuguuc gaccacuggu 3240 agcgucacag uaggaggaaa uucaacucug guuggcgacg guagggcggc auacgguagu 3300 agcaauuaca uugcuucuau aguauucacu aguucgggug uguuaucgac caccccuagu 3360 gugcaguuuu cagguuccuc uggaguauca cgcgugcaaa ugaacaucug cagauguaaa 3420 caggggaaca cuuucauacu ugguuaauug guucuuuuaa guguagccuc cacccgaguu 3480 gcaagagggg aacacgcagu cucgccgacc cuguuggcaa acaguaaaau ugcaaaaaau 3540 agagugcuag gaguaguucc cguacccgcg ggagcaagac ccuacuacag uagacgaacc 3600 ggcaucggac ccugggaaac agguaccuag cguauuaaua ggucgcuaga aaucgggcgg 3660 gcuucaccuu cggguaaccc gccgucgaga gggaaaaccu cugugugguu gugcgcacgu 3720 cguugucgga agacucucac uguuguaguu auuuccuuuu ucuuuuaggu aggagcacuu 3780 gcucagaggg cgcauaccuc ugguaaaaca aaauuggccc cugagaguag aaaacucagg 3840 uuaauaaaac aggagaauau uuaccuaguc guauaacggc uagguacccc 3890 (配列番号 11)
gaacaaacgu uuuaccgguu uguaaauugg aauucucgaa uucgccaguc gccuucuucg 60 uaucaaggau cuggaauuug aacgguaucu uuaucauuuu aauuucuacu uuucguacca 120 gucauggguu uugucaacuu uucgcuuuuu gauguggaca aauugauggu augggugagc 180 aaauucaauc caggcaagau auuguccgcu auuugcaacu uggguauaga cugcuggaac 240 cguuuucgca aaugguacuu cggucucaac uuugaugcac auaugugggc ugucgaugcc 300 uuuaugccac ucaugccaca uuacacggag cagauggaac gcguagucgg cgaccucugc 360 agcgaaaccc uagaauccaa auuagaagac ugucuggaau uggacacuuc cgucaaccag 420 uauuuugacg aagaagugua caaagaggau gacaagggcg ugaugaaacu ccaaaggagu 480 gcugccagga agcacauuaa acgugugcga ccagguauga ugacagcagc cauaaaagcu 540 guugagacga ggaucagaaa ccgccaugcc auuuucggag auaacauggg auugauagac 600 gaagcugcag uuagagcaac ugccagugau aucuguggag aguucaaaau aaaugaacac 660 cacacgagga cauugguaua caccgcagca uaucuuucca ugacaccuga ccagaagucc 720 cuagacagug ucaagcucgc cuauaaucca aagagucaag ccagaaggac uuuagugaca 780 gccguucgug agaacaaagc uguugcuggg uucaaauccc uugaggauuu uuaggcgguc 840 cacucagcuu uccgguugaa gaugccccau auccuauuuu aggcaucccg gaaaucaggg 900 uagcugagaa gcgggccagu agagucauga gaaguaagag agucguaggu uuaccugcug 960 uuagugcggg ucuaaagguu ugcguccauc aaaccucccu acauaauaug auaguuaguc 1020 ucgaacgcag aguguuccgu guaaagaacg cugcgggaga guuaguagug ccucccaaac 1080 caauccaaaa ugcauuugac uccauuuccu acuuccgcga agagugguug aggaaauugu 1140 cucauaaggg ucaagugcuc aaauccucca uagaugacgu uguugcuugc uauucuucug 1200 aaaagaggaa auuguaucaa aaagcggcug acucucugga gaagaaaccu guccaaugga 1260 gagauuccaa ggugcaagca uucaucaagg uagaaaaacu ugaaugugac acuaaggauc 1320 ccgugccccg cacgauucaa ccucgaucca agagauauaa ucuuugcaua ggacaauauc 1380 ucagguugaa ugaaaagaag auguuggauu ccauagacga ugucuucaaa gagaagaccg 1440 ucuugucagg uuuggauaac agggcucaag ggagagccau cgcccacaag uggcgcaaau 1500 accagaaccc cauagggauc gggcuagaug cgaguagauu cgaucagcau uguagcgugg 1560 augcccucaa auuugaacac accuuuuaua aagcguguuu uccuggggau caacaguugg 1620 aacaacuauu gaaauggcaa uuauccaaca cuggaucggc ccuauuacca acuggagaac 1680 ugguuagaua ccguaccaaa gggugucgca ugagcggcga uauaaacaca ggccuuggga 1740 acaagauucu caugugcagc augguacacg cauuccugaa agaggcggga gugcgggcuu 1800 cguuagccaa uaauggugac gauugugucc uuuucuguga gaagggagac uaugaugaga 1860 uaaaccgcaa ucuugagcaa ugguuccugu gcagggguuu cgaaaugacc gucgaaaaac 1920 cugucgaugu acucgagaag guggcguucu gucguaguca accaguuugc auugccacgc 1980 aaugggcuau gguaaggcaa uugggaaguu ugucuagaga cuguuuuuca acacaggauu 2040 gguuaaaccc aaagacauuc aaagaugcaa ugaacgcguu ggggcaaugu aacggaauca 2100 ucaaugaugg aguuccaaua cauauggcuc aggcgaaauu aaugcauaaa aucgguggaa 2160 accggaaguu caaucuagau gcacuccaca agcaaaugga guacaguugg agagaucguc 2220 ucgguaaaag aacgaaucuu uuguggagug agguagagga ugcuacgaga uugucauacu 2280 uuaaagcauu cggcauagaa ccuuacauuc agaaaauagu ggaggaguac uucucacaag 2340 uggaaaucac uugugagggg cgaucaacaa acguauuacc ugcacacuau ucuagaaucc 2400 acaaagauuu aaucaaaucc cgauaguaug ucuucgaaag cucccaagaa auccaaauca 2460 cggucccagc ccaggaaccg gaucccaaac accaguauca aaacuguagc caucccauuu 2520 gccaagacgc aaaucaucaa gaccgugaac ccuccacaaa ggccagcuaa agcuuuaaug 2580 cacacccagc ugguacuaag uguuguugga acgacucaac ugcgugugaa caacggcaag 2640 uccauucaga gguucagauu gaacccaagu aacccagcuc uauuccccac cauagccuau 2700 gaagccgcaa auuaugacau guaucgucug aagaaaauga cacuccguua ugucccgauc 2760 gugaccgugc aaaauuccgg acgcguauca augguuuggg augccgacuc ucgggauucg 2820 gcuccccaau cacgacagga gacaucugcu uauucucgau cugucucgac ugccguguac 2880 gagaaaugcu cguugacgau uccggcugau aaucaauggc gauucauagc ugacaacaca 2940 gccguugaua gaaaacugau cgacuuuggc caguuguugu uugucaccca cuccgggagu 3000 gagggaguag aaauugguga uguguucuuc gagugugaag uagaauuuaa aggaccccaa 3060 cccaccgcaa cagucaucca gaagggugua gcugacguug gcggggcacu cuccucagaa 3120 ggaccgucuu acuuaauguc cucggacuua gucgucaccc cgucggguuu cgguaugaac 3180 uuggauguag cagggacuua ucugcuaacg uggugguug cagcaacugc uagcggaaac 3240 aucacaguag ccggcaauuc aacauuggug ggugaggcaa gggcagcaua cagcagcggc 3300 aacuacaucg ccacucuggu auuuacuagu accggcgucu ugucggcgac accuaguaua 3360 caguuuacag gauccuccgg aguuacacgg guucaauuga accucgccag auguaaaccg 3420 gcgaauaccu acgucacugg uuaguugguu aauugguuag cgcagccucc auccgaguug 3480 caagagagga agacgcaguc ucgccgaccc uguuggcaaa caguaaaauu gcaaaaaaua 3540 gaguguuagg aguaguuccc auacccuugg ggacaagaac cuauuaugga gaaacgaacu 3600 ggcaucggac ccugggaaac aggcaucuag cguauuaaua ggucgcuaga agacgggcag 3660 gcuucaccac uagguaaccu gccgccgaga gggaaaaccu cugugugguu gugcgcacgu 3720 cguugucgga agaaguucac cauaguaguu auuuccuuuu cuuuuaggua gaagcacuug 3780 cuccagaggg cgcauaccuc ugguuaaaca aaauuguccc cugagaguag aaaacucagg 3840 uuaauaaaac aggagaauau uuaccuaguu guauaacggc uagguacccc 3890
[0045] 前記オーストラリア株の RNAlの構造を図 1に、前記カナダ株の RNA1の構造を図 2に示す。
[0046] 図 1に示す前記 RCNMVオーストラリア株の RNA1にお!/、て、前記 (A)の翻訳制 御ポリヌクレオチドは、 3 則の非翻訳領域 (以下、「3'— UTR」と表すことがある）に 由来する RNA配列である。
前記オーストラリア株の^ UTRは、前記配列番号 15で示される前記 (I)の翻訳 制御ポリヌクレオチドに相当する。
図 1中、 5つのステムループ構造を形成する 3595番目力も 3732番目の塩基配列（ 以下、「3'TE— DR1」と表すことがある）は、前記配列番号 13で示される前記 (I)の 翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
[0047] 図 2に示す前記 RCNMVカナダ株の RNA1にお!/、て、前記（A)の翻訳制御ポリヌ クレオチドは、 3' UTRに由来する RNA配列である。
前記カナダ株の^ UTRは、前記配列番号 7で示される前記 (I)の翻訳制御ポリ ヌクレオチドに相当する。
図 2中、 5つのステムループ構造を形成する 3595番目力ら 3732番目の塩基配列 である 3'TE— DR1は、前記配列番号 5で示されるの前記 (I)の翻訳制御ポリヌクレ ォチドに相当する。
[0048] 前記オーストラリア株及び前記カナダ株の 3'TE— DR1中、 SL1、 SL4、及び SL5 は共通の塩基配列であり、 SL1で示されるステムループ構造を形成する塩基配列は 、前記配列番号 39の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当し、 SL4で示されるステムルー プ構造を形成する塩基配列は、前記配列番号 1の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当 し、 SL5で示されるステムループ構造を形成する塩基配列は、前記配列番号 3の翻 訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
前記ステムループ構造は、該ステムループ構造を形成する配列中に相補的な配列 が存在することにより、対応する塩基が相補的結合 (水素結合)を生じて形成される ヘアピン形の 2次構造である。
[0049] ここで、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドにお 、て、前記ステムループ構造を形 成する塩基配列を含むことにより、 3,末端のポリ A構造、及び^末端の Cap構造の いずれかが存在しないポリヌクレオチド、又は、 3,末端のポリ A構造、及び^末端の Cap構造の 、ずれも存在しな 、ポリヌクレオチドのアミノ酸配列を翻訳が可能である ことについては、本発明者らの知見であり、文献の内容を参照することができる（ Hiroyuki Mizumoto, Masahiro Tatsuta, Masanori Kaido, Kazuyuki Mise, and Tetsuro Okuno, JOURNAL OF VIOLOGY (2003), pl2113— pl2121)。
[0050] また、前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドにお!、 て、アミノ酸配列をコードする mRNAの 5 則に組み込まれることがある前記配列番号 17に示される RNA配列、及び前記配列番号 9に示される RNA配列も、前記 RCNM Vの RNA1由来の配列であることが好まし！/、。
具体的には、前記配列番号 17に示される RNA配列は、前記 RCNMVオーストラリ ァ株の RNA1の^ UTRに由来する配列であり、前記配列番号 9に示される RNA 配列は、前記 RCNMVカナダ株の RNA1の^ UTRに由来する配列である。
[0051] 前記 RCNMVの RNA1から、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを調製する方法として は、特に制限はなぐ公知の方法力も適宜選択することができ、例えば、 RCNMVの ウィルス粒子から RNA1を抽出し、該 RNA1の cDNAを逆転写反応により調製した 後、これを増幅し、該 cDNAの転写産物のうち、 RNA2とともに混合して感染性を示 すものを選択する方法等が挙げられる。
[0052] (B)の翻訳制御ポリヌクレオチド（DNA)—
前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチド (DNA)としては、
(III) (1)配列番号 16に示される DNA配列、（2)配列番号 16に示される DNA配列 において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3)配列番号 16に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズす るポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配 列、の少なくとも 、ずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドと、
(IV) (1)配列番号 8に示される DNA配列、（2)配列番号 8に示される DNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 8に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポ リヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、 の少なくともいずれかを含む翻訳制御ポリヌクレオチドとが挙げられる。
[0053] (配列番号 16)
ggggtaccta gccgttatac gactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggccaattt tgttttacca gaggtatgcg ccctctgagc aagtgctcct 120 acctaaaaga aaaaggaaat aactacaaca gtgagagtct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcgacggc gggttacccg aaggtgaagc ccgcccgatt 240 tctagcgacc tattaatacg ctaggtacct gtttcccagg gtccgatgcc ggttcgtcta 300 ctgtagtagg gtcttgctcc cgcgggtacg ggaactactc ctagcactct attttttgca 360 attttactgt ttgccaacag ggtcggcgag actgcgtgtt cccctcttgc aactcgggtg 420 gaggctacac ttaaaagaac caa 443
[0054] (配列番号 8) ggggtaccta gccgttatac aactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggacaattt tgtttaacca gaggtatgcg ccctctggag caagtgcttc 120 tacctaaaag aaaaggaaat aactactatg gtgaacttct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcggcggc aggttaccta gtggtgaagc ctgcccgtct 240 tctagcgacc tattaatacg ctagatgcct gtttcccagg gtccgatgcc agttcgtttc 300 tccataatag gttcttgtcc ccaagggtat gggaactact cctaacactc tattttttgc 360 aattttactg tttgccaaca gggtcggcga gactgcgtct tcctctcttg caactcggat 420 ggaggctgcg ctaaccaatt aaccaa 446
[0055] ここで、前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、前記 (A)の翻訳制御ポリヌク レオチドの cDNAであり、任意のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌク レオチドの 3 則に組み込まれた結果、前記塩基配列とともに転写されて mRNAの^ 側に前記 (A)の翻訳制御ポリヌクレオチドを発現するものが挙げられる。
[0056] 前記翻訳制御ポリヌクレオチドの翻訳制御の態様としては、例えば、前記塩基配列 の 17°Cにおける翻訳活性が、 25°Cにおける翻訳活性よりも高くなるように制御する 態様であることが好ましぐ 17°Cにおける翻訳活性が最大となるように制御する態様 であることがより好ましい。この結果、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、高温 (例えば 、 25°C以上)条件下で不安定なタンパク質の合成や、低温 (例えば、 17°C以下)条 件下で産生量が少な!/、タンパク質の合成に好適に使用される。
[0057] 前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、例えば、
前記 (III)の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号 14の翻訳制御ポ リヌクレ才チド、
前記 (IV)の翻訳制御ポリヌクレオチドの部分配列である配列番号 6の翻訳制御ポリ ヌクレオチド、並びに、
前記 (I)及び (II)の翻訳制御ポリヌクレオチドに共通な配列である配列番号 40、配 列番号 2、及び配列番号 4の翻訳制御ポリヌクレオチド、などが好適に挙げられる。 さらに、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドの 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若 しくは付加されたポリヌクレオチド、及びこれらの翻訳制御ポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズする翻訳制御ポリヌクレオチドが挙げられる。 また、これらの翻訳制御ポリヌクレオチドは単独であってもよぐ複数の組合せから なるものであってもよい。
[0058] (配列番号 14)
tcttccgaca acgacgtgcg cacaaccaca cagaggtttt ccctctcgac ggcgggttac 60 ccgaaggtga agcccgcccg atttctagcg acctattaat acgctaggta cctgtttccc 120 agggtccgat gccggttc 138
[0059] (配列番号 6)
cttccgacaa cgacgtgcgc acaaccacac agaggttttc cctctcggcg gcaggttacc 60 tagtggtgaa gcctgcccgt cttctagcga cctattaata cgctagatgc ctgtttccca 120 gggtccgatg ccagttc 1ό ι
[0060] (配列番号 40)
cctgtttccc agg 13
[0061] (配列番号 2)
agaggttttc cctct 15
[0062] (配列番号 4)
gtgcgcacaa ccacac 16
[0063] 前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドとしては、特に 制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができるが、アミノ酸配列をコードする塩 基配列の 5 則に、
( 1)配列番号 18に示される DNA配列、（2)配列番号 18に示される DNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 18に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする ポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配 列、の少なくともいずれかが組み込まれたポリヌクレオチド、及び
( 1)配列番号 10に示される DNA配列、 (2)配列番号 10に示される DNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 10に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする ポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配 列、の少なくとも 、ずれかが組み込まれたポリヌクレオチドに組み込まれることが好ま しい。
[0064] (配列番号 18)
gactggtacg aaaagtagaa atttaaaatg acaggtatac cgtttaatct ctagatcccc 60 gatacgaagg gggcgactag cgagcttgtg tgctcctatt tacaaaccgg taaaacgttt 120 gtc 123
[0065] (配列番号 10)
gactggtacg aaaagtagaa attaaaatga taaagatacc gttcaaattc cagatccttg 60 atacgaagaa ggcgactggc gaattcgaga attccaattt acaaaccggt aaaacgtttg 120 ttc 123
[0066] 前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドがコードする アミノ酸配列としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、タン パク質、ポリペプチド鎖のいずれであってもよいが、タンパク質であることが好ましい。 前記タンパク質としては、低温条件下で発現量が少ないタンパク質や、高温条件下 で不安定なタンパク質等が好適に挙げられる。
[0067] また、前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドの領域 としては、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列の 3 則であれば、特に制限はなく 、 目的に応じて適宜選択することができる力 非翻訳領域であることが好ましい。
[0068] 前記（B)の翻訳制御ポリヌクレオチドとしては、レッドクローバー'ネクロティック 'モ ザイクウイノレス（Red clover necrotic mosaic virus :RCNMV)の RNAl由来 の配列の cDNAであることが好ましぐ具体的には、配列番号 20に示すオーストラリ ァ株の RNA1の cDNA、及び、配列番号 12に示すカナダ株の RNA1の cDNAのい ずれかに由来する配列であることが好ま 、。
[0069] (配列番号 20)
ggggtaccta gccgttatac gactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggccaattt tgttttacca gaggtatgcg ccctctgagc aagtgctcct 120 acctaaaaga aaaaggaaat aactacaaca gtgagagtct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcgacggc gggttacccg aaggtgaagc ccgcccgatt 240 tctagcgacc tattaatacg ctaggtacct gtttcccagg gtccgatgcc ggttcgtcta 300 ctgtagtagg gtcttgctcc cgcgggtacg ggaactactc ctagcactct attttttgca 360 attttactgt ttgccaacag ggtcggcgag actgcgtgtt cccctcttgc aactcgggtg 420 gaggctacac ttaaaagaac caattaacca agtatgaaag tgttcccctg tttacatctg 480 cagatgttca tttgcacgcg tgatactcca gaggaacctg aaaactgcac actaggggtg 540 gtcgataaca cacccgaact agtgaatact atagaagcaa tgtaattgct actaccgtat 600 gccgccctac cgtcgccaac cagagttgaa tttcctccta ctgtgacgct accagtggtc 660 gaacaagtca ccactagtgt aagcagatag gtccctgcga cgtcaacaaa caggccgaaa 720 ctagaactgg taataaaggc atccggaggc atcagataag atggcccttc gaaagaagtg 780 agtgtcccac cgagatcaat tacagttttc tgtacgatgc ttgcggttgg ttggggtcct 840 ttgaactcga cttcacaatc taagaatatg tcccctgttt ctattccatc actaccagag 900 tgtgtaacga acaaaagctg gccaaaatcg acgagctttc tgtccactgt ggtgttatct 960 gcaacgaagc gccattgatt atccgccgga atcgtcaacg agcatttctc gtacacggca 1020 gtcgagactg atcgggaata ggctgatatc tcctgtctgg attgtggggc cgagtcttgc 1080 gagtcgggat cccagatcat tgcaactcgc ccggaatttt gcacggtaac gagtgggacg 1140 taacggagtg tcagcttctt taagcgatac atgtcataat ttgcagcttc atatgctaga 1200 gtggggaaaa gagcaggatt gctagggttt aatctgaacc tttggttgga tttgccatta 1260 tttgtacgca tttgaactga tccaaccaca ctcataacta actgggtatg caatatacct 1320 cttgctggtt tcggtggagg attcacagtc ttgattattt gcgtcttggc aaaggggatg 1380 gctacagtct ttacactggt atttggggtc cggttcctgg gctgggaccg ttgtttggat 1440 ttcttgggag cttttgaaga cattttatcg ggctttgatt agatctttgt ggattctaga 1500 gtagtgtgta ggtaatacgt ttgttgatcg cccctcacaa gtgatttcca cctgtgagaa 1560 gtactcctcc actattcttt gaatgtaagg ttctattccg aatgctctaa agtacgacaa 1620 tcttgtagca tcctctacct cactccacaa aagattcgtt ctcttaccga gacgatctct 1680 ccagctgtac tccatttgtt tatgaagcgc atctagattg aacttacggt ttccaccgat 1740 tctatgcatt agttttgctt gtgccatatg tattggaact ccatcattga tgatcccgtt 1800 acattgacct agcgcattca ttgcatcttt gaatgtcttt gggtttaacc aatcctgtgt 1860 tgaaaagcag tctctcgaca aacttcccaa ttgccttacc atagcccatt gcgtggcaat 1920 //:/ O 06900sooI>d I9s0sS00AV
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gcccacatat gtgcatcaaa gttgagacca aagaaccact tgcgaaagcg attccaacag 3660 tctataccca agttgcagat tgcagacagg attttgcctg gattgaattt actcacccac 3720 accattaatt tatccacatc aaaaagcgaa agatttataa aacccatgac tggtacgaaa 3780 agtagaaatt taaaatgaca ggtataccgt ttaatctcta gatccccgat acgaaggggg 3840 cgactagcga gcttgtgtgc tcctatttac aaaccggtaa aacgtttgtc 3890 (配列番号 12)
ggggtaccta gccgttatac aactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggacaattt tgtttaacca gaggtatgcg ccctctggag caagtgcttc 120 tacctaaaag aaaaggaaat aactactatg gtgaacttct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcggcggc aggttaccta gtggtgaagc ctgcccgtct 240 tctagcgacc tattaatacg ctagatgcct gtttcccagg gtccgatgcc agttcgtttc 300 tccataatag gttcttgtcc ccaagggtat gggaactact cctaacactc tattttttgc 360 aattttactg tttgccaaca gggtcggcga gactgcgtct tcctctcttg caactcggat 420 ggaggctgcg ctaaccaatt aaccaactaa ccagtgacgt aggtattcgc cggtttacat 480 ctggcgaggt tcaattgaac ccgtgtaact ccggaggatc ctgtaaactg tatactaggt 540 gtcgccgaca agacgccggt actagtaaat accagagtgg cgatgtagtt gccgctgctg 600 tatgctgccc ttgcctcacc caccaatgtt gaattgccgg ctactgtgat gtttccgcta 660 gcagttgctg caaccaccaa cgttagcaga taagtccctg ctacatccaa gttcataccg 720 aaacccgacg gggtgacgac taagtccgag gacattaagt aagacggtcc ttctgaggag 780 agtgccccgc caacgtcagc tacacccttc tggatgactg ttgcggtggg ttggggtcct 840 ttaaattcta cttcacactc gaagaacaca tcaccaattt ctactccctc actcccggag 900 tgggtgacaa acaacaactg gccaaagtcg atcagttttc tatcaacggc tgtgttgtca 960 gctatgaatc gccattgatt atcagccgga atcgtcaacg agcatttctc gtacacggca 1020 gtcgagacag atcgagaata agcagatgtc tcctgtcgtg attggggagc cgaatcccga 1080 gagtcggcat cccaaaccat tgatacgcgt ccggaatttt gcacggtcac gatcgggaca 丄丄 40 taacggagtg tcattttctt cagacgatac atgtcataat ttgcggcttc ataggctatg 1200 gtggggaata gagctgggtt acttgggttc aatctgaacc tctgaatgga cttgccgttg 1260 ttcacacgca gttgagtcgt tccaacaaca cttagtacca gctgggtgtg cattaaagct 1320 ttagctggcc tttgtggagg gttcacggtc ttgatgattt gcgtcttggc aaatgggatg 1380 gctacagttt tgatactggt gtttgggatc cggttcctgg gctgggaccg tgatttggat 1440 ttcttgggag ctttcgaaga catactatcg ggatttgatt aaatctttgt ggattctaga 1500 atagtgtgca ggtaatacgt ttgttgatcg cccctcacaa gtgatttcca cttgtgagaa 1560 gtactcctcc actattttct gaatgtaagg ttctatgccg aatgctttaa agtatgacaa 1620 tctcgtagca tcctctacct cactccacaa aagattcgtt cttttaccga gacgatctct 1680 ccaactgtac tccatttgct tgtggagtgc atctagattg aacttccggt ttccaccgat 1740 tttatgcatt aatttcgcct gagccatatg tattggaact ccatcattga tgattccgtt 1800 acattgcccc aacgcgttca ttgcatcttt gaatgtcttt gggtttaacc aatcctgtgt 1860 tgaaaaacag tctctagaca aacttcccaa ttgccttacc atagcccatt gcgtggcaat 1920 gcaaactggt tgactacgac agaacgccac cttctcgagt acatcgacag gtttttcgac 1980 ggtcatttcg aaacccctgc acaggaacca ttgctcaaga ttgcggttta tctcatcata 2040 gtctcccttc tcacagaaaa ggacacaatc gtcaccatta ttggctaacg aagcccgcac 2100 tcccgcctct ttcaggaatg cgtgtaccat gctgcacatg agaatcttgt tcccaaggcc 2160 tgtgtttata tcgccgctca tgcgacaccc tttggtacgg tatctaacca gttctccagt 2220 tggtaatagg gccgatccag tgttggataa ttgccatttc aatagttgtt ccaactgttg 2280 atccccagga aaacacgctt tataaaaggt gtgttcaaat ttgagggcat ccacgctaca 2340 atgctgatcg aatctactcg catctagccc gatccctatg gggttctggt atttgcgcca 2400 cttgtgggcg atggctctcc cttgagccct gttatccaaa cctgacaaga cggtcttctc 2460 tttgaagaca tcgtctatgg aatccaacat cttcttttca ttcaacctga gatattgtcc 2520 tatgcaaaga ttatatctct tggatcgagg ttgaatcgtg cggggcacgg gatccttagt 2580 gtcacattca agtttttcta ccttgatgaa tgcttgcacc ttggaatctc tccattggac 2640 aggtttcttc tccagagagt cagccgcttt ttgatacaat ttcctctttt cagaagaata 2700 gcaagcaaca acgtcatcta tggaggattt gagcacttga cccttatgag acaatttcct 2760 caaccactct tcgcggaagt aggaaatgga gtcaaatgca ttttggattg gtttgggagg 2820 cactactaac tctcccgcag cgttctttac acggaacact ctgcgttcga gactaactat 2880 catattatgt agggaggttt gatggacgca aacctttaga cccgcactaa cagcaggtaa 2940 acctacgact ctcttacttc tcatgactct actggcccgc ttctcagcta ccctgatttc 3000 cgggatgcct aaaataggat atggggcatc ttcaaccgga aagctgagtg gaccgcctaa 3060 aaa cctcaa gggatttgaa cccagcaaca gctttgttct cacgaacggc tgtcactaaa 3120 gtccttctgg cttgactctt tggattatag gcgagcttga cactgtctag ggacttctgg 3180 tcaggtgtca tggaaagata tgctgcggtg tataccaatg tcctcgtgtg gtgttcattt 3240 attttgaact ctccacagat atcactggca gttgctctaa ctgcagcttc gtctatcaat 3300 cccatgttat ctccgaaaat ggcatggcgg tttctgatcc tcgtctcaac agcttttatg 3360 gctgctgtca tcatacctgg tcgcacacgt ttaatgtgct tcctggcagc actcctttgg 3420 agtttcatca cgcccttgtc atcctctttg 1 tacacttctt cgtcaaaata ctggttgacg 3480 gaagtgtcca attccagaca gtcttctaat ttggattcta gggtttcgct gcagaggtcg 3540 ccgactacgc gttccatctg ctccgtgtaa tgtggcatga gtggcataaa ggcatcgaca 3600 gcccacatat gtgcatcaaa gttgagaccg aagtaccatt tgcgaaaacg gttccagcag 3660 tctataccca agttgcaaat agcggacaat atcttgcctg gattgaattt gctcacccat 3720 accatcaatt tgtccacatc aaaaagcgaa aagttgacaa aacccatgac tggtacgaaa 3780 agtagaaatt aaaatgataa agataccgtt caaattccag atccttgata cgaagaaggc 3840 gactggcgaa ttcgagaatt ccaatttaca aaccggtaaa acgtttgttc 3890
[0071] 図 1に示す前記 RCNMVオーストラリア株の RNA1において、 3'— UTRの cDNA は、前記配列番号 16で示される前記 (III)の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。 図 1中、 5つのステムループ構造を形成する 3596番目力 3732番目の塩基配列 である 3'TE— DR1の cDNAは、前記配列番号 14で示される前記（III)の翻訳制御 ポリヌクレオチドに相当する。
[0072] 図 2に示す前記 RCNMVカナダ株の RNA1にお!/、て、 3'—UTRの cDNAは、前 記配列番号 8で示される前記 (IV)の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
図 2中、 5つのステムループ構造を形成する 3595番目力ら 3732番目の塩基配列 である 3'TE— DR1の cDNAは、前記配列番号 6で示されるの前記（IV)の翻訳制御 ポリヌクレオチドに相当する。
[0073] 前記オーストラリア株及び前記カナダ株の 3,TE— DR1中、 SL1、 SL4、及び SL5 は共通の塩基配列であり、 SL1で示されるステムループ構造を形成する塩基配列の cDNAは、前記配列番号 40の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当し、 SL4で示される ステムループ構造を形成する塩基配列の cDNAは、前記配列番号 2の翻訳制御ポリ ヌクレオチドに相当し、 SL5で示されるステムループ構造を形成する塩基配列の cD NAは、前記配列番号 4の翻訳制御ポリヌクレオチドに相当する。
[0074] また、前記 (B)の翻訳制御ポリヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチドにお!/、 て、アミノ酸配列をコードする塩基配列の 5 則に組み込まれることがある前記配列番 号 18に示される DNA配列、及び前記配列番号 10に示される DNA配列も前記 RC NMVの RNA1由来配列の cDNAであることが好まし!/、。
具体的には、前記配列番号 18に示される DNA配列は、前記 RCNMVオーストラリ ァ株の RNA1の^ UTRに由来する配列の cDNAであり、前記配列番号 10に示さ れる DNA配列は、前記 RCNMVカナダ株の RNA1の 5'— UTRに由来する配列の cDNAである。
[0075] 前記 RCNMVの RNA1から、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを調製する方法として は、特に制限はなぐ公知の方法力も適宜選択することができ、例えば、 RCNMVの ウィルス粒子から RNA1を抽出し、該 RNA1の cDNAを逆転写反応により調製した 後、これを増幅し、該 cDNAの転写産物が、 RNA2とともに混合して感染性を示すも のを選択する方法等が挙げられる。
[0076] (組換えベクター）
本発明の組換えベクターとしては、少なくとも前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む ベクターであれば、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができる。
前記組換えベクターとしては、前記翻訳制御ポリヌクレオチドと目的のアミノ酸配列 (タンパク質)をコードする塩基配列とを含むタンパク質発現用組換えベクターの他、 前記翻訳制御ポリヌクレオチドを増幅させるための組換えベクターが含まれる。
前記タンパク質発現用組換えベクターとしては、 目的のアミノ酸配列をコードする領 域の 3 則の非翻訳領域に、前記翻訳制御ポリヌクレオチドが挿入されてなることが好 ましい。また、 目的のアミノ酸配列をコードする領域の 5 則の非翻訳領域には、前記 配列番号 9、 10、 17、及び 18のいずれかに示されるポリヌクレオチドが挿入されてい てもよく、その他の翻訳活性を高める配列が挿入されて 、てもよ 、。
[0077] 前記組換えベクターを調製するために使用されるベクター（レブリコン）としては、宿 主細胞において複製可能である限り、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択する ことができ、例えば、プラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミド、バタテリオファー ジ、及びァグロバタテリゥムなどが挙げられ、具体的には、細菌プラスミド (例えば、 pB R322、 pKC30、 pCFM536等）、ファージ DNA (例えば、ラムダファージ等）、酵母 プラスミド (例えば、 pG— 1等）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウィルス、 ワクシニアウィルス、アデノウイルス等のウィルス DNA、 SV40とその誘導体などが挙 げられる。
また、前記ベクターとしては、例えば、複製開始点、選択マーカー、プロモーター、 ェンハンサー、転写終結配列（ターミネータ一）、リボソーム結合部位、ポリアデニル 化シグナル等を含んで 、てもよ 、。
また、前記ベクターは、種々の制限部位をその内部にもつポリリンカ一を含んでい る力、又は単一の制限部位を含んでいることが好ましい。前記ベクター中の特定の制 限部位を、特定の制限エンドヌクレアーゼによって切断し、その切断した部位に前記 翻訳制御ポリヌクレオチドを挿入することができる。
[0078] 前記プラスミドベクターとしては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択すること 力 sでき、例えば、 pBR322、 pBR325、 pAT153、 pUC8、 pUC18、 pUC19、 pSP RLUC等が挙げられる。また、商業的に入手可能なものとしては、例えば、 pQE7 0、 pQE60、 pQE— 9 (Qiagen社製）、 pBluescript II KS、 ptrc99a、 pKK223 - 3、 pDR540、 pRIT2T (Pharmacia社製）、 pET— 11a (Novagen社製）、 pXTl 、 pSG5 (Stratagene社製）、 pSVK3、 pBPV、 pMSG、 pSVL SV40 (Pharmaci a社製)等が挙げられる。
[0079] 前記ウィルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルぺスゥ ィルス、センダイウィルス等が挙げられる。
前記パクテリオファージとしては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択すること ができ、例えば、 T4ファージ、 T5ファージ、 T7ファージ、 λファージ、 M13等が挙げ られる。
[0080] 前記組換えベクターとしては、 目的の細胞に導入されて使用される。前記組換えべ クタ一のうち、前記翻訳制御ポリヌクレオチドと目的のアミノ酸をコードする塩基配列と を含むタンパク質発現用組換えベクターは、例えば、後述する本発明の形質転換体 の調製に好適に使用される。
前記組換えベクターの使用方法としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択 することができ、例えば、ウィルスベクターからなる前記糸且換えベクターを目的の細胞 に感染させ、該細胞内に導入する方法、パクテリオファージカ なる前記組換えべク ターを目的の細胞に感染させ、該細菌内に導入する方法、及びプラスミドベクターか らなる前記組換えベクターを目的の細胞に導入する方法などが挙げられる。
[0081] (形質転換体）
本発明の形質転換体としては、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド、及び本発明の 糸且換えベクターのいずれかを含む細胞であれば、特に制限はなぐ 目的に応じて適 宜選択することができるが、例えば、前記翻訳制御ポリヌクレオチドの翻訳活性が最 大となる温度条件下において、少なくとも生存可能であり、タンパク質を合成可能な 細胞力もなるものが好まし 、。
[0082] 前記形質転換体を調製する方法としては、細胞等に、前記翻訳制御ポリヌクレオチ ド及び前記組換えベクターが導入される限り、特に制限はなぐ公知の方法から目的 に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール法 (PEG法）、エレ タトロポレーシヨン法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、リボソーム法、 及びァグロバタテリゥム法などが挙げられる。
[0083] 前記形質転換体としては、単一の細胞であってもよぐ複数の細胞力 なる組織、 器官、又は個体であってもよい。
前記細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母などが挙げられ る。
[0084] 前記動物細胞としては、特に制限なぐ 目的に応じて適宜選択することができ、例え ば、受精卵、 ES細胞、 EG細胞、 EC細胞等の胚性幹細胞、胚性癌細胞、造血幹細 胞、癌化し、不死化した癌細胞株、各臓器の細胞株などが挙げられる。なお、前記動 物細胞には、発生時力 前記翻訳制御ポリヌクレオチドが導入されて形質転換され たトランスジエニック動物の細胞も含まれる。
前記動物細胞の由来としては、特に制限なぐ 目的に応じて適宜選択することがで き、例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、昆虫類等の動物が挙げられる。
[0085] 前記動物細胞への前記翻訳制御ポリヌクレオチド、又は前記組換えベクターの導 入方法としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リ ポソーム法、マイクロインジェクション法、及びインビト口において前記糸且換えベクター を、前記動物細胞 (又は組織）に直接接触させることにより投与する方法などが挙げ られる。また、動物個体の筋肉内、皮下、腹腔内等へ、注射等により投与してもよい。
[0086] 前記植物細胞としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、 例えば、栽培植物の器官 (例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、種子等)、組織 (例えば、 表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)由来の切片、プロトプラストなどが挙げられる。 なお、前記植物細胞には、発生時から前記翻訳制御ポリヌクレオチドが導入されて 形質転換された植物体の細胞も含まれる。
前記植物細胞の由来としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することが でき、例えば、種子植物、シダ類、蘚苔類、藻類等の植物が挙げられる。
[0087] 前記植物細胞への前記翻訳制御ポリヌクレオチド又は前記組換えベクターの導入 方法としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ァグ ロバクテリゥムのバイナリーベクター法、パーティクルボンバードメント法、ポリエチレン グリコール法、エレクト口ポレーシヨン法などが挙げられる。
[0088] また、前記翻訳制御ポリヌクレオチド又は前記組換えベクターが導入された細胞は 、細胞培養、組織培養、及び器官培養に供することができ、さらに、公知の植物組織 培養法を用い、植物ホルモン等を投与し、植物体に再生させることができる。
具体的には、収穫量増加作用のあるタンパク質、寒さ等の環境ストレスに対する耐 性を高めるタンパク質等をコードする塩基配列の 3'側非翻訳領域に、本発明の翻訳 制御ポリヌクレオチドを導入してなる組換えベクターを、イネ、ムギ、トウモロコシ、ジャ ガイモ等の植物に導入することによって、耐寒性に優れ、収穫量の多い植物を作出 することができる。
[0089] 前記菌類としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、例えば ゝ Trichophvtm rubrum、 Micro sporum cams, Alternaria alternata. Alter naria ^anax^ Bipolaris brizae等の糸状菌： Staphylococcus aureus^ Street ococcus pyogenes. Enterococcus faecalis. Bucillus anthracis. Batcillus sub tilis. Clostridium tetania Listeria monocytogenes. Pseudomonas a eruginosa. Escherichia coli Heamophilis influenzae. Neisseria gonorrh oeae, Mycobacterium tuberculosis, Corvnebacterium glutamicum, Stre ptomvces antibioticus Salmonella typhi. Edwardsiella tarda Citrobact er freundii. Vibrio parahaemolvticus, Morganella morganii, Seratia ma rcescens. Klebsiella pneumoniae. Shigella dvsenteriae. Yersinia pestis Treponema pallidum Leptospira interroganse, Campylobactor jejuni Lactobacillus latis等の細菌等が举げられる
これらの中でも低温で増殖可能な菌類が好まし 低温で増殖可能な菌類として は、例えば、 Vibrio属微生物 (Vibrio marinas等)、 Pseudomonas属微生物（
Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas svnngae^) . Rhodococcusfe微牛.物 ( Rnodococcus ervthropolis等)、 Shewanelia属微生物 (Shewanella vioiacea^) Pseudoalteromonas属微生物 (Pseudoalteromonas haloplanktis等)、 Sphingomonas属 微生物 (Sphingomonas paucimobilis等)、 Psychrobacter属微生物 (Psvchrobacter immobilis等)、 Arthrobacter属微生物 (Arthrobacter SE, TAD20株等）、 Cytophaga 属微牛.物（CvtoDhaga KUC-1株等）、 Moraxella属微生物（MoE glk
TAE123株等）等が挙げられる。
[0090] 前記酵母としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ、例えば
Candida albicans. C. giabrada. . tropicalis C. parapsilosis C. st ellatoidea. Cryptococcus neoformans. Saccharomvces cerevisi&e等が挙 げられる。
[0091] 前記形質転換体が得られたことを確認する方法としては、特に制限はなぐ 目的に 応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性遺伝子等をマーカーとして組み込 み、該組換えベクターを導入した細胞を薬剤含有培地で培養し、増殖した細胞を選 抜する方法等が挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子等としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択すること ができ、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、デストマイシ ン耐性遺伝子、オーレォバシジン A耐性遺伝子、クロラムフエ二コール耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、及 びチォストレプトン耐性遺伝子等が挙げられる。
[0092] また、前記形質転換体が目的のアミノ酸配列（ポリペプチド、タンパク質)を発現した ことを確認する方法としては、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができ 、例えば、蛍光タンパク法、酵素活性測定法、免疫組織化学法等が挙げられる。 前記蛍光タンパク法としては、例えば、前記組換えベクター中に、蛍光タンパク質 遺伝子を組み込み、該組換えベクターを導入した細胞を培養した後、紫外線を照射 して前記タンパクによる蛍光を測定する方法が挙げられる。
前記酵素活性測定法としては、例えば、前記組換えベクター中に、酵素タンパク質 の遺伝子を組み込み、酵素反応により発色する培養液中で培養した後、該培養液の 発色を分光光度計により測定し、酵素活性を定量する方法が挙げられる。酵素タン パク質以外のタンパク質につ 、ては、過酸化水素等を発生させてキノン体等発色物 質を形成させ、それを分光光度計にて測定することにより定量する方法も挙げられる 前記免疫組織化学法としては、例えば、ウェスタンプロット法、 ELISA法等が挙げ られる。
[0093] (タンパク質合成方法）
本発明のタンパク質合成方法は、前記翻訳制御ポリヌクレオチド、及び前記組換え ベクターを用いる方法であれば、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することが でき、例えば、宿主細胞を用いた方法、及び無細胞タンパク質合成系で行われる方 法（以下、「in vitro系」ということがある）などが挙げられる。
また、前記タンパク質合成方法は、 20°C未満で行われることが好ましぐ 17°C以下 で行われることがより好まし 、。
[0094] 前記宿主細胞を用いた方法としては、特に制限はなぐ公知の方法から適宜選択 することができ、例えば、 目的のタンパク質をコードする塩基配列、及び前記翻訳制 御ポリヌクレオチドを含む前記組換えベクターが導入された宿主細胞 (例えば、前記 形質転換体)を成長乃至増殖させ、 20°C未満の温度条件下で前記宿主細胞を培養 することにより、前記目的のタンパク質を発現させる方法が挙げられる。
[0095] 前記宿主細胞としては、タンパク質を合成可能な細胞 (例えば、真核細胞、大腸菌 など)であれば、特に制限はなぐ 目的に応じて適宜選択することができるが、 20°C 未満でタンパク質合成を行う細胞であることが好ましい。
[0096] 前記目的のタンパク質は、宿主細胞外に分泌される場合には、培地から回収するこ とができ、宿主細胞内に存在する場合には、該宿主細胞を破砕又は溶解して得た抽 出液から回収することができる。
回収された前記目的のタンパク質は、前記培地又は前記抽出液に対し、硫酸アン モ -ゥム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互 作用クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー 、 HPLC、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの公知の方法により精製することが できる。
[0097] 無細胞タンパク質合成系
前記無細胞タンパク質合成系で行われる前記タンパク質合成方法としては、 目的 のタンパク質をコードする塩基配列、及び前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む前記 組換えベクターを、宿主細胞に導入することなくタンパク質を合成させる方法であり、 具体的には、リボソーム等を含む細胞抽出物に、前記組換えベクター、アミノ酸、ェ ネルギ一源、各種イオン、緩衝液等を加え、細胞外でタンパク質合成を行う方法であ る。
前記無細胞タンパク質合成系としては、 mRNAを铸型として、該 mRNAの情報に 基づきリボゾーム上でタンパク質を合成する翻訳のみ力もなる方法であってもよぐ D NAを铸型として mRNAを合成する転写及び翻訳カゝらなる方法であってもよい。
[0098] 前記無細胞タンパク質合成系に用いられる反応液としては、 目的のタンパク質の種 類等に応じて適宜選択することができるが、例えば、細胞抽出液、铸型となるポリヌク レオチド (例えば、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド及び目的のタンパク質をコード した塩基配列を含む組換えベクター）、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液 、 ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、 tRNA、還元剤、ポリエチレングリコール、葉 酸塩、抗菌剤、また铸型として DNAを用いる場合、 RNA合成の基質、及び RNAポ リメラーゼ等を含むものが挙げられる。
[0099] 前記細胞抽出液としては、例えば、大腸菌、植物種子胚芽 (例えば、コムギ胚芽、 ォォムギ胚芽、イネ胚芽、コーン胚芽等）、ゥサギ網状赤血球等の細胞抽出物が挙 げられる力 これらの中でも 20°C未満の温度条件下で増殖可能な細胞の抽出物が 好ましぐコムギ胚芽抽出物が好ましい。
前記細胞抽出液の調製方法としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択す ることができるが、例えば、翻訳阻害因子、核酸分解酵素等を除去する処理、翻訳阻 害因子の活性ィ匕を抑制する処理を行うことが好ましい。
[0100] 前記アミノ酸としては、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸が挙げられる。
前記エネルギー源としては、例えば、 ATP、及び GTPのいずれかが挙げられる。 各種イオンとしては、例えば、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモ-ゥム等 の酢酸塩、グルタミン酸塩等が挙げられる。
前記緩衝液としては、例えば、 Hepes— KOH、 Tris— OAC等が挙げられる。 前記 ATP再生系としては、例えば、ホスホェノールピルペートとピルビン酸キナー ゼの組合せ、またはクレアチンリン酸（クレアチンホスフェート）とクレアチンキナーゼ の組合せが挙げられる。
前記核酸分解酵素阻害剤としては、例えば、リボヌクレアーゼインヒビターや、ヌク レアーゼインヒビタ一等が挙げられる。
前記還元剤としては、例えば、ジチオスレィトール等が挙げられる。
前記抗菌剤としては、例えば、アジィ匕ナトリウム、アンピシリン等が挙げられる。 前記 RNAポリメラーゼとしては、例えば、 SP6RNAポリメラーゼ、及び T7RNAポリ メラーゼ等が挙げられる。
[0101] 前記前記無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成方法としては、特に 制限はなぐ公知の方法力も適宜選択することができ、例えば、前記反応液を一の反 応容器中に混合して行う方法、及び、タンパク質を合成する反応部と、タンパク質合 成に必要な物質を供給する供給部とを、半透膜等により分割した反応容器を使用す る方法 (透析法)、反応部と供給部を半透膜で区切る代わりに、供給する液にグリセリ ン等の比重の大きい物質を混合し、反応液に対する比重を大きくし供給し、その上に 比重の小さ!/、反応液を重層する方法 (重層法)等が挙げられる。
[0102] 前記無細胞タンパク質合成系により合成された目的のタンパク質は、前記反応液か らゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、逆相力 ラムクロマトグラフィー等の公知のタンパク質精製法を適宜組合せることにより、単離 精製される。
[0103] (in vitro系翻訳キット）
本発明の in vitro系翻訳キットは、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを少なくとも 含んでなり、前記タンパク質合成方法に好適に使用される。
前記 in vitro系翻訳キットとしては、具体的には、前記翻訳制御ポリヌクレオチドが 組込まれ、 目的タンパク質をコードする塩基配列を組込むための前記組換えべクタ 一を少なくとも含み、さらに、細胞抽出液、 ATP再生系試薬を含み、必要に応じて、 前記無細胞タンパク合成系にに必要な試薬類の全部または一部を含む。
本発明の in vitro系翻訳キットは、さら〖こ、反応用容器を含んでいてもよい。
[0104] 前記 in vitro翻訳キットの具体的な構成としては、公知の in vitro系翻訳キットの 構成を採用することができ、例えば、特開 2003— 102495号公報、 Current Opinion Biotechnology 9: 534-548 (1998) 、 J. Biotechnology 41: 81-90 (1995)、などの文献を参照することができる。
[0105] 前記 in vitro系翻訳キットに使用される細胞抽出液としては、特に制限はなぐ 目 的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌、植物種子胚芽 (例えば、コム ギ胚芽、ォォムギ胚芽、イネ胚芽、コーン胚芽等）、植物由来培養細胞 (例えば、タパ コ培養細胞等）、ゥサギ網状赤血球等の細胞抽出物が挙げられるが、これらの中でも 20°C未満の温度条件下で増殖可能な細胞の抽出物が好ましぐコムギ胚芽抽出物 が好ましい。
[0106] (タンパク質合成装置）
本発明のタンパク質合成装置は、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを用い、アミノ酸を 合成させる合成手段を少なくとも有してなり、前記タンパク質合成方法に好適に使用 される。
また、本発明のタンパク質合成装置としては、温度制御手段を有することが好ましく 、該温度制御手段により、タンパク質合成を 20°C未満で行うように制御することが好 ましぐ 17°C以下で行うように制御することがより好ましい。
前記温度制御手段としては、特に制限はなぐ目的に応じて公知の装置等の中か ら適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質合成装置と一体に構成されたサ 一モモジュールであってもよぐ前記タンパク質合成装置に外付けされる恒温槽、 C oインキュベーターなどであってもよい。
2
[0107] 前記宿主細胞を用いたタンパク質合成方法に使用される前記合成手段としては、 例えば、ノ ィオリアクター等が挙げられる。
[0108] 前記無細胞系タンパク質合成に使用される前記合成手段としては、例えば、前記 細胞抽出物、前記組換えベクター、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液等 を供給する供給手段と、目的のタンパク質の合成反応を行うための容器と、及び生成 物を排出する排出手段とを備えるものなどが挙げられる。前記容器は、半透膜等で、 反応槽と供給槽に仕切られて 、てもよ 、。
前記細胞抽出物としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ るが、例えば、コムギ胚芽抽出物、大腸菌抽出物、タバコ培養細胞抽出物等が好まし ぐこれらの中でもコムギ胚芽抽出物がより好ましい。
[0109] 前記タンパク質合成装置の好ま 、具体例としては、例えば、前記反応槽を備えた 反応温度勾配恒温器や、前記容器を半透膜で仕切り、前記供給槽と前記反応槽と が形成され、転写と翻訳とを連続的に行うことができるようにした装置などが挙げられ る。該タンパク質合成装置を用い、例えば、前記 in vitro翻訳キットを用いたタンパ ク質合成方法としては、反応に必要な基質とエネルギーとを半透膜を介して連続的 に供給でき、前記細胞抽出物を用いて、タンパク質合成を最長 24時間まで行うこと ができる。前記反応槽においては、 T7RNA ポリメラーゼによって高レベルの転写 が行われ、その後、前記細胞抽出物中の成分 (tRNA、リボソーム、酵素、因子等)を 用いて翻訳が行われる。前記供給槽には、イオン、エネルギー源や基質となるヌクレ ォチド、アミノ酸が含まれており、半透膜を介してこれらの物質を前記反応槽に供給 する。同様に前記反応槽から前記供給槽へ対流させることにより、前記反応槽中の 反応によって形成された阻害要因となる低分子が効果的に希釈される。 [0110] 本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、宿主細胞や、無細胞系タンパク質に用いる 抽出物の由来生物の種による制限を受けず、 mRNAの翻訳活性を高め、かつ、温 度制御可能であり、特に低温（20°C未満）における翻訳活性を高めるため、高温条 件下で不安定なタンパク質の合成や、低温条件下で産生量が少な 、タンパク質の合 成に好適に使用される。また、前記翻訳制御ポリヌクレオチドによる形質転換体として の植物体は、寒冷地農業等に好適であるため、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、寒 冷地農業用の品種改良に好適に使用される。
実施例
[0111] 以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも のではない。
[0112] (実施例 1)
<翻訳制御ポリヌクレオチド、及び組換えベクターの調製 >
RCNMVオーストラリア株から、公知の方法により、 RNA1を抽出した。 下記の方法により、該 RNA1の全長 cDNAを合成し、該 cDNA力 翻訳制御ポリヌ クレオチドを切り出し、ルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド に組み込み、組換えベクターを調製した。
[0113] <RNA1の配列解析 >
3'RACE法による ^末端塩基配列の決定
RNA1 (30 μ g)に対し、 1Uのポリ（A)ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）、 40 mMのトリス一塩酸（pH8. 0)、 10mMの MgCl、 250mMの NaCl、 2. 5mMの M
2 2
nCl、 250 μ M( ATP, 50ng/ μ LOBSA,及び ImMの DTTを用い、 37。Cで 30
2
分間で反応を行い、前記 RNA1の^末端にポリ Aを付加した。次いでフエノール Zク ロロホルム抽出を 2回行い、クロ口ホルム抽出を 1回行った後、エタノール沈澱を行い 、 3'末端にポリ Aが付加された RNA1を回収した。
[0114] 次!、で、スーパースクリプト（Superscript) II (インビトロジェン（invitrogen)社製）と 、プライマーとして 20pmolのポリ（T)アダプター（配列番号 21： 5'— CGACTCGA GTCGACATCGAT T T T T T TTTT - 3')とを用いて RNAの逆転写反 応を行った。この逆転写反応は、 42°Cで 60分間、 51°Cで 30分間、 67°Cで 15分間 の条件で行った。
前記逆転写反応により得られた cDNAを、 PCR反応により増幅した。前記 PCR反 応は、 Ex タグ ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）と、プライマーとして lOpmol のアダプター（配列番号 22： 5' -CGACTCGAGTCGACATCGA- 3')と、 / Rlint5' (配列番号 23： 5' -TGAGCAGATAAACCGCAATC- 3')とを用い、 94°Cで 4分間を 1サイクル、次に 94°Cで 1分間、 50°Cで 1分間、 72°Cで 1分間を 2サ イタル、続いて 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 1分間を 27サイクル、さらに 94 °Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 10分間を 1サイクルの条件で行った。
前記 cDNAを回収し、 1%低融点ァガロースゲル (FMC バイオプロダクツ社製）を 用いて電気泳動を行って長さを確認したところ、前記 cDNAの長さは 1. 9kbであるこ とがわかった。
[0115] 回収した前記 cDNAを、制限酵素 Xholで切断後、 pBlueScriptll (KS) (ストラタジ ーン社製)の対応するサイトに DNA ライゲ―シヨン キット Ver. 1 (タカラバィォ株 式会社製)を用いてライゲーシヨンし、これをオートシークェンサ一（アプライド ノィォ システムズ社製）に供し、前記 RNA1の^末端の配列を決定した。
[0116] 5'RACE法を用いた^末端塩基配列の決定
前記 RNA1 (1 g)と、スーパースクリプト II (インビトロジェン社製）と、プライマーと して 20pmolの 3'RZCl (配列番号 24 : 5' - TACCCGGGGTACCTAGCCGTT ATAC— 3Ίとを用い、前記 RNA1の逆転写反応を行った。該逆転写反応は、 42 °Cで 60分間、 51°Cで 30分間、 67°Cで 15分間の条件で行った。
前記逆転写反応の反応液から、 SUPREC— 02 (タカラバイオ株式会社製)を用い 、余分な dNTPとプライマーとを除去した。前記反応液中のアデニル残基の重合反 応は、ターミナル デォキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ (タカラノィォ株式会 社製)を用いて 37°Cで 30分間行 、、さらに 65°Cで 3分間不活ィ匕処理を行った。 得られた前記反応液 5 Lを PCR反応に供した。前記 PCR反応は、 Ex タグ ポリ メラーゼ (タカラバイオ株式会社製）、プライマーとして 2pmolのポリ (T)—アダプター 、 24pmolのアダプター、及び 24pmolの SZRlint3' (配列番号 25： 5'—TTGCG TGGCAATGCAAACCG— 3')を用い、 95°Cで 5分間、 42°Cで 2分間、 72°Cで 4 分間を 1サイクル行い、 94°Cで 45秒間、 58°Cで 45秒間、 72°Cで 3分間を 30サイク ル行い、 94°Cで 45秒間、 58°Cで 45秒間、 72°Cで 10分間を 1サイクル行った。
[0117] さらに前記 PCRの反応液 1 μ Lをセカンド PCRに供した。このセカンド PCRは、 20ρ molのアダプター及びプライマー（SZRlint3 を用い、 94°Cで 4分間を 1サイクル 行い、 94°Cで 30秒間、 58°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間を 30サイクル行った。
得られた DNAを回収し、 1%低融点ァガロースゲル（FMC バイオプロダクツ社製 )を用いて電気泳動により長さを確認したところ、 1. 9kbであった。
得られた cDNAを制限酵素 Xholで切断後、 pBlueScript (KS) (ストラタジーン社 製)の対応するサイトに、 DNA ライゲーシヨン キット Ver. 1 (タカラバィォ株式会 社製)を用いてライゲーシヨンした。
以上により得られた RNA1の^末端を含む cDNAを、オートシークェンサ一（ァプ ライド ノィォシステムズ社製）に供し、 RNA1の 5末端の配列を決定した。
[0118] く cDNAクローンの作製 >
上記（ 1)にお 、て決定した前記 RNA1の塩基配列に基づ 、て調製したプライマー 、 T7Canl5' (配列番号 26： 5' -GCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGA ACAAACGTTTTACCGG— 3 と、前記 ^RZClとを用い、分離した RCNMV オーストラリア株、及びカナダ株それぞれの RNA1について逆転写反応を行い、 cD NAを得た。
[0119] 得られた cDNAのうち、オーストラリア株の cDNAを PCR反応により増幅した。
前記 PCR反応は、 Ex タグ ポリメラーゼ (タカラバイオ株式会製)を用い、 94°Cで 4分間、 50°Cで 1分間、 72°Cで 5分間を 1サイクル行い、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分 間、 72°Cで 4分間を 28サイクル行い、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 10分 間を 1サイクル行った。
PCRにより増幅した前記 cDNAを回収し、 1%ァガロースゲル（FMC ノィォプロ ダクッ社製)を用いて電気泳動を行い、長さを確認したところ、 4. Okbであった。この cDNAを、制限酵素 Saclと Smalとで切断後、 pUC118 (タカラバィォ株式会社製） の対応する領域にライゲーシヨンし、 cDNAクローンを得た。
[0120] 前記 cDNAクローンを Smalでリニアライズした後、 in vitro転写反応を行った。こ の転写反応により得られた RNA1の転写産物を、 RNA2と等量混合して C. quinoa に接種し、感染性を示した転写産物の由来である cDNAを選抜した。
[0121] く組換えベクターの作製 >
前記 RCNMVのオーストラリア株の RNA1 (pRCl | G)の cDNA、 SP6RNAポリメ ラーゼ（フェルメンタス社製）、及び in vitro転写によってポリ（A) テールの付カロさ
30
れた mRNA転写物を作ることができる Renilla Luc遺伝子をもつプラスミド（pSP64 — RLUC)を用いて、下記の方法により、前記組換えベクターを調製した。
[0122] 前記 RCNMVのオーストラリア株の RNA1の cDNA断片における配列番号（nt) 1 〜 131は、プライマー 5'RS 1T7 (配列番号 27： 5'- GCGAGCTCTAATACGAC TCACTATAGACAAACGTTTTACCGGTTTG-3' )と、 AC5'UTR/Nco— (配列番号 28： 5' - AAAACCCATGGACTGGTACGAAAAGTAG- 3')とを 使用し (下線部は、制限酵素領域を示す)、 pRCl I G力も PCRで増幅した。
前記 RCNMVのオーストラリア株の RNA1の cDNA断片における配列番号（nt)： 113〜3890は、プライマー AC5'UTRZNco+ (配列番号 29： 5'-CGTACCAG TCC ATGGGTTTTATAAATC-3 ' )と、 3'R/Cl (配列番号 30： 5'-TACCCG GGGTACCTAGCCGTTATAC- 3 とを用いて、 pRCl | Gから PCRで増幅した これらの cDNA断片を混合し、変性し、冷却して得られた混合物は、 PCRの铸型と して用い、 PCRを行い、 DNAを合成した。
[0123] 新たに合成された DNAは、前記^ RS1T7プライマー、及び前記 3RZC1プライ マーを使って増幅した。増幅された 3. 9kbの cDNAは、制限酵素 Saclと Smalとで 処理し、、 pUCl 18 (タカラバィォ株式会社)の一致した領域にライゲーシヨンさせて 、プラスミド pURClZNcoを得た。
[0124] < <RNA1全長を含む組換えベクター（pRl— 5'— NS) > >
前記プラスミド pURClZNcoを制限酵素 NcolZSphlを用いて切断し、 T4DNA ポリメラーゼによる末端平活ィ匕を行った。得られた DNA小断片を、 1%低融点ァガロ ースゲル (FMC バイオプロダクツ社製）にて電気泳動して回収した。回収した DNA 小断片を T4DNAポリメラーゼで処理し、制限酵素 Xbalと Hpalとで切断された pSP -Luc+ (プロメガ社製）に導入し、 RNA1全長を含む組換えベクター（pRl— 5'— NS)を作製した。
[0125] <く RNA1の 3'— UTRを含む組換えベクター（pRl— XbS) > >
RCNMVのオーストラリア株の RNA1の cDNA断片の配列番号（nt)： 3446〜38 90を、プライマー Ausl— 3'/Xba (配列番号 31： 5' -GCTCTAGATTGGTTC TTTTAAGTGTAGCC - 3' )と、 M4 (配列番号 32： 5' -GTTTTCCCAGTCA CGAC 3Ίとを用い（下線部は制限酵素領域を示す）、 pURC 1 ZNco力 増幅し 、増幅した cDNA断片（0. 5kb)を Xbal/Sphlで切断し、 pSP— Luc +の Xbal/H pal領域に導入し、 RNA1の^ UTRを含む組換えベクター（pRl—XbS)を作製 した。該糸且換えベクターは、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド (配列番号 14)を含 む。
[0126] < <RNA1の 5'— UTRと 3'— UTRとを含む組換えベクター（pRl— 5'— XbS) >
>
pRl— XbSの NdelZNcoI領域に、 pURClZNcoを SaclZNcoIで切断した DN A断片を挿入し、 RNA1の 5'— UTRと 3'—UTRとを含む組換えベクター（pRl - 5 '—XbS)を作製した。該組換えベクターは、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド (配 列番号 14)を含む。
[0127] < <比較用ベクターの調製 > >
60- ntのポリ A領域を持っているプラスミド ρ3'— 8を、 Hindlll/Acclで切断し、 pL UCpA30を HindlllZSacIで切断した DNA断片を挿入し、ポリ Aを有する比較用べ クタ一（pLUCA30)を作製した。
なお、プラスミド pLUCpA30は、 pSP64— RLUCの Renilla Luc遺伝子をホタル Luc遺伝子と組み換えることで作製した。
なお、得られた各組換えベクターの塩基配列は、 ABI310自動シークェンサ一を用 いて解析した。
[0128] 前記各組換えベクターを直鎖状にし、転写反応を行った。
前記 RNA1の全長を含む組換えベクター（pRl— 5,— NS)、及び前記 RNA1の 5 一 UTRと 3'—UTRとを含む組換えベクター（pRl— 5'—XbS)は、 Smalで切断し 、直鎖状にした後、 T7RNAポリメラーゼを用いて転写を行い、 Rl - 5' -NS,及び R1 5'—XbSを調製した。
前記 RNA1の 3,— UTRを含む組換えベクター（pRl—Xbs)は、 Smalで切断し、 直鎖にした後、 SP6RNAポリメラーゼ (フェルメンタス社製）を用いて転写を行い、 R1 —Xbsを調製した。
また、前記 pA60は、 EcoRIで切断して、直鎖にした後、前記 T7RNAポリメラーゼ を用いて転写を行い、 A40を調製した。
それぞれの構造図を、図 3に示した。
[0129] 前記転写反応において、ニュー イングランド ノィオラブズ社製のキャップ構造ァ ナログ (m7GpppG)を用い、 5'末端に Cap構造を持つ mRNAと、 Cap構造を持たな Vヽ mRNAとを以下の方法によりそれぞれ作製した。
[0130] Cap構造を持つ前記 mRNAは、 1 X T7RNAポリメラーゼバッファーと、 10mMの DTTと、 ImMの ATPと、 ImMの UTPと、 ImMの CTPと、 0. 2mMの GTPと、 2m Mの RNA キャップ ストラクチャー アナログ（m7GpppG)と、 60ngZ Lの lineali zed DNAと、 lOUZlO Lの T7RNAポリメラーゼとを含む反応液を用い、 37°Cで 2時間転写反応を行った後、 RQIRNase— freeDNase (プロメガ社製）を用い、 37 °Cで 30分の反応条件で前記各プラスミドの DNAを分解して調製した。
[0131] Cap構造を持たない前記 mRNAは、 1 X T7RNAポリメラーゼバッファーと、 10m Mの DTTと、 ImMの ATPと、 ImMの UTPと、 ImMの CTPと、 ImMの GTPと、 60 ngZ Lのリニアライズド DNAと、 IOUZ IO /Z Lの T7RNAポリメラーゼとを含む 反応液を用い、 37°Cで 2時間転写反応を行った後、 RQIRNase— freeDNase (プ 口メガ社製)を用い、 37°Cで 30分の反応条件で前記各プラスミドの DNAを分解して 調製した。
[0132] その後、前記各反応液を蒸留水で飽和させた後、アマシャム社製 Sephadex G— 50 fine 担体を充填した ImLシリンジ (株式会社テルモ製）に添カ卩し、 1200 X gで 5分間、スイングローターを用いて遠心分離した。
前記反応液をカラムを通過させた後エタノール沈澱し、蒸留水に溶解し、濃度を A
2 で測定し、さらに電気泳動で行うことにより転写産物を確認した。 [0133] <形質転換体の調製 >
プロトプラストの調製
10〜16日間培養したササゲ (Vigna unguiculata cv. California Blackeye) の第 1葉の裏表皮をピンセットで剥ぎ取り、酵素液（0. 5Mのマン-トール、 5mMの CaCl、 1% (WZV)のセルラーゼ オノズカ R- 10 (株式会社ヤクルト製）、 0. 05%
2
(W/V)のマセロザィム R— 10 (株式会社ヤクルト製)を含む）上に、剥ぎ取った面 を下にして浮かべ、 25°Cで 4時間、 40rpmで振とうし、プロトプラストを得た。
該プロトプラストを 4層のガーゼでろ過し、遠心分離（50 X g、室温、 3分間）により回 収した後、 0. 5Mのマン-トール及び 5mMの CaClによる洗浄を 3回繰り返し、へマ
2
トメ一ターで、細胞数をカウントした。
前記プロトプラストを 4mLのプラスチックチューブに 3. O X 105個ずつ分注し、遠心 分離した後、上清を除去した。
[0134] 一組換えベクターの導入
前記各組換えベクター（R1— 5'— NS、 R1— 5'— XbS、 Rl— XbS、及び pA60) を前記プラスチックチューブの壁面に付け、 200 μ Lの PEG溶液（40%WZVポリエ チレングリコール、 3mMCaCl、 pH5. 5)でプロトプラストに向けて流し込み、 20秒
2
間穏やかに混ぜた。その後、直ちに 0. 5Mマン-トール及び 5mMの CaClを 2mL
2 加え、穏やかに混ぜ、氷中に 15分間静置した。この間、 5分間ごとにプロトプラストを 穏やかに攪拌した。得られたプロトプラスト (形質転換体)は、遠心分離 (50 X g、室温 、 3分間）で集めた後、 0. 5%マン-トール及び 5mMの CaClで 2回洗浄した。
2
[0135] <タンパク質合成 >
前記プロトプラスト（形質転換体）を、培養液（0. 2mMの KH PO、 ImMの KNO
2 4 3
、 ImMの MgSO、 10mMの CaCl、 1 μ Μの ΚΙ、 0. 01 μ Μの CuSO、 0. 5Μの
4 2 4
マン-トール、 0. 02% (WZV)のクロラムフエ-コール、 pH6. 5) lmL中にカロえ、 1 . 5mLエツペンチューブに移し、弱光下（lOOOlux以下）で温度勾配恒温器（日本医 科機器製作所製、 TG— 100— ADCT)を用い、 17°Cと 25°Cとで、それぞれ 6時間 口 ^しプ 。
培養液 20 μ Lをルシフェラーゼ定量システム (スタンダードタイプ）（プロメガ社製)を 利用し、ルシフェラーゼ活性 (LUC活性)を測定した。 pA60を導入したプロトプラスト の 25°Cにおける活性を 1とし、相対値を求めた。結果を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000054_0001
各組換えベクター中、 pA60のみ力 Cap構造を有する。各組換えベクターの構造 は図 3に示すとおりである。
[0137] 表 1の結果から、前記 RCNMVの RNA1由来の配列を含まない pA60に比べて、 本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド (配列番号 15、配列番号 16)を含む前記 R1— 5' XbS、及び Rl— XbSは、導入したプロトプラストにおけるタンパク質翻訳活性を高 めることがわ力つた。また、 25°Cの翻訳活性よりも 17°Cにおける翻訳活性を高めるこ とから、低温域における翻訳活性を高めることがわ力つた。
なお、前記 RCNMVの RNA1全長を含む R1— 5'— NSでは、翻訳活性を高める 作用は弱力つた。
[0138] (実施例 2)
前記 RCNMVの RNA1中、ステムループ構造を形成する配列であり、前記配列番 号 39 (cDNAとして配列番号 40)、及び前記配列番号 1 (cDNAとして配列番号 2) で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの配列中に、下記の方法により変異を 導入した組換えベクター（p3'TE— DR1/Lml、及び p3'TE— DR1/Lm4)を調 製した。
[0139] —p3'TE— DRlZLm4の調製
前記 pRl— 5' XbSを铸型として、プライマー Luc + 3'FW (配列番号 33： 5' T GTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGG— 3')と、 SL4—： LmlZ— ( 配列番号 34： 5' -GAGGAAAAGCCTCTCGACGGCGGGTTAC- 3')の組 合せと、 SL4-Lml/+ (配列番号 35 : 5'— GAGGCTTTTCCTCTGTGTGGT TGCG 3' )と、: Luc + 3'RV (配列番号 36： 5'— GCAGCCGAACGACCGAG CGCAGCGAGTCAG— 3')の組合わせとを用いて、 94°Cで 45秒、 55°Cで 45秒 間、 72°Cで 1分間を 30サイクルの条件で PCRを行い、目的の 2つの断片が増幅して いるのを確認し、 のうち、 l iu LをプラィマーLuc + 3'FWとLuc + 3'RVを用 いたリコンビナント PCR反応に供した。 PCR反応は、 94°Cで 45秒間、 55°Cで 45秒 間、 72°Cで 1分間を 30サイクル行った。 PCRで増幅した DNAを制限酵素 SacIIと、 S malとで切断後、 pRl— 5'— XbSの対応する領域にライゲーシヨンした。得られた c DNAは、オートシークェンサ一（アプライド バイオシステムズ社製）に供し、変異が 挿入されたことを確認した。
[0140] —p3'TE— DRlZLmlの調製
前記 pRl— 5'— XbSを铸型として、プライマーに、前記 Luc + 3'FW、及び SL1— Lml/- (配列番号 41： 5' -GGTACCTGGGAAACAGGGTCCGATGCCG G— 3,の組合せと、前記 Luc + 3,RV、及び SL1— LmlZ+ (配列番号 42 : 5,— G TTTCCCAGGTACCTAGCGTATTAATAGG - 3' )の組合せとを用いた以外 は、上記 p3'TE— DRlZLm4と同様にして変異を SL1に挿入した。
[0141] 変異が挿入された後の配列を、図 4の各枠中に示す。図 4中、 Lm4に示す変異が 導入された組換えベクターを、 p3,TE— DRlZLm4と表し、 Lmlに示す変異が導 入された組換えベクターを、 p3'TE— DRlZLmlと表す。
[0142] 前記 pRl— 5'— XbS、前記 p3'TE— DRlZLm4、前記 p3'TE— DRlZLml及 び前記 PA60を、実施例 1と同様にして直鎖にした後、転写を行い、それぞれ^末端 に Cap構造を持つ mRNAと、 Cap構造を持たな!、mRNAとを作製した。
[0143] 得られた各 mRNAを実施例 1と同様にしてプロトプラストへ導入し、実施例 1と同様 にしてルシフェラーゼ活性 (LUC活性)を測定した。 pA60 (Cap構造あり）を導入した プロトプラストの 25°Cにおける活性を 1とし、相対値を求めた。結果を表 2に示す。
[0144] [表 2] LUC活性
10 C 1 7°C 25°C 32°C
pA60 0. 04 0. 03 0. 04 0. 03
Cap 3' TE-DR1 /Lm4 3. 22 2. 00 0. 1 5 0. 08
なし 3' TE-DR1 /Lml 0. 03 0. 03 0. 02 0. 02
R1 -5'-XbS 4. 64 8. 04 3. 59 0. 73
pA60 0. 67 1 . 1 6 1 . 00 0. 73
Cap 3' TE-DR1 /Lm4 3. 62 9. 73 8. 90 3. 1 6
あり 3' TE-DR1 /Lml 3. 1 9 7. 36 6. 80 2. 26
R1 -5 XbS 6. 1 9 1 3. 21 10. 77 2. 75 なお、表 2中、
¾1 5'— 1^」は、実施例 1と同様、配列番号 15 (cDNAとして配列番号 16)で 示される翻訳制御ポリヌクレオチドと、前記 RNA1の^ UTRとを含む組換えべクタ 一であり、
「^TE— DRlZLm4」は、前記「R1— 5'— XbS」中、配列番号 1 (cDNAとして配 列番号 2)で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行つ たものであり、
「3'TE— DRlZLmlJは、前記「R1— 5'— XbS」中、配列番号 39 (cDNAとして 配列番号 40)で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を 行ったものである。
[0145] 表 2の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド (配列番号 15、配列番号 16) において、ステムループ形成可能な SL1領域、及び SL4領域力 翻訳活性、特に低 温域における翻訳活性を高める作用にお 、て重要なポリヌクレオチドであることがわ かった。
[0146] (実施例 3)
前記 RCNMVの RNA1中、ステムループ構造を形成する配列であり、前記配列番 号 3 (cDNAとして配列番号 4)で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの配列 中に、下記の方法により変異を導入した組換えベクター (P3'TE— DR1/Lm5)を 調製した。
[0147] 前記 pRl— 5'—XbSを铸型として、プライマーに、前記 Luc + 3'FW、及び SL5— Lml/—（配列番号 37： 5' -CGTGCGGTGTTCCACACAGAGGTTTTCCC 3,の組合せと、前記 Luc + 3,RV、及び SL5— LmlZ+ (配列番号 38 : 5,— GT GTGGAACACCGCACGTCGTTGTCGGAAG 3')の糸且合せとを用 ヽた以外 は、実施例 2と同様にして変異を SL5に挿入した。
変異が挿入された後の配列を、図 4の各枠中に示す。図 4中、 Lm5に示す変異が 導入された組換えベクターを、 p3'TE— DRlZLm5と表す。
[0148] 前記 pRl— 5,— XbS、前記 p3,TE— DRlZLm4、前記 p3,TE— DRlZLml、 前記 p3'TE— DRlZLm5、及び前記 pA60を、実施例 1と同様にして直鎖にした後 、転写を行い、それぞれ ^末端に Cap構造を持つ mRNAと、 Cap構造を持たない m RNAとを作製した。
[0149] 得られた各 mRNAを実施例 1と同様にしてプロトプラストへ導入し、実施例 1と同様 にしてルシフェラーゼ活性 (LUC活性)を測定した。 pA60 (Cap構造あり）を導入した プロトプラストの 25°Cにおける活性を 1とし、相対値を求めた。結果を表 2に示す。
[0150] [表 3]
Figure imgf000057_0001
なお、表 2中、
¾1 5'— 1^」は、実施例 1と同様、配列番号 15 (cDNAとして配列番号 16)で 示される翻訳制御ポリヌクレオチドと、前記 RNA1の^ UTRとを含む組換えべクタ 一であり、
「^TE— DRlZLm4」は、前記「R1— 5'— XbS」中、配列番号 1 (cDNAとして配 列番号 2)で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行つ たものであり、
「3'TE— DRlZLmlJは、前記「R1— 5'— XbS」中、配列番号 39 (cDNAとして 配列番号 40)で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を 行ったものであり、
「3'TE— DRlZLm5」は、前記「R1— 5'— XbS」中、配列番号 3 (cDNAとして配 列番号 4)で示される本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドの領域に、塩基置換を行つ たものである。
[0151] 表 3の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド (配列番号 15、配列番号 16) において、ステムループ形成可能な SL5領域は、 SL1領域、及び SL4領域と同様、 翻訳活性、特に低温域における翻訳活性を高める作用にお 、て重要なポリヌクレオ チドであることがわかった。
[0152] (実施例 4)
<無細胞タンパク質合成系 >
前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして、実施例 1と同様にして 調製した R1— 5' -XbS (Cap構造なし）を含む前記 In vitro翻訳系のキットを用い 、無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行った。
前記 in vitro翻訳系のキットを構成する前記細胞抽出物としては、コムギ胚芽抽出 物（Wheat Germ Extract、以下「WGE」と略す。）（プロメガ社製)及び、ゥサギ網 状赤血球抽出物（Rabbit Reticulocyte Lysate System、以下「： RRL」と略す。 ) (プロメガ社製)を用いた。
なお、前記組換えベクターの比較対照としては、実施例 1と同様にして調製した前 記 pA60 (Cap構造あり）を用いた。
[0153] 前記 pA60、及び前記 R1— 5'— XbSに対して、 Sephadex G— 50 fine担体 (ァ マシャム社製)を充填した lmLシリンジカラムで処理することにより、これらの RNAを 精製し， 2. 5ngZw Lの濃度に調製した。
前記 WGEのを含む反応液 25 μ Lは、前記 WGE12. 5 μ Lと、 ImMアミノ酸混合 液（Amino Acid Mixture) (プロメガ社製 )2 Lと、 1M酢酸カリウム 3. 25 Lと、 40U/ /Z Lルナシンリボヌクレアーゼインヒビター（Rnasin Ribonuclease Inhibit or) (プロメガ社製) 0. 5 μ Lと、蒸留水 6. 75 μ Lとを含むように調製した。
前記 RRLを含む反応液 25 Lは，前記 RRL17. 5 しと、 ImMアミノ酸混合液 (Α mino Acid Mixture) (プロメガ社製) 0. 5 μ Lと、 40U/ μ 1ルナシンリボヌクレア ーゼインヒビター（Rnasin Ribonuclease Inhibitor) (プロメガ社製) 0. 5 Lと、蒸 留水 6. 5 Lとを含むように調製した。
[0154] 1 μ の前記1^1 5'— 1^、及び前記 ρΑ60を、それぞれ前記反応液 5 L中に 添加し、温度勾配恒温器（日本医科機器製作所製、 TG— 100— ADCT)を用いて、
10°C、 17°C、 25°C、 32°Cの条件により 2時間反応させた。
反応後、前記ルシフェラーゼ定量システム (スタンダードタイプ）（プロメガ社製)を用 い、実施例 1と同様にして定量した。結果を表 4に示す。
[0155] [表 4]
Figure imgf000059_0001
表 4中、「WGE」は、コムギ胚芽抽出物を表し、「RRL」は、ゥサギの網状赤血球抽 出物を表す。
[0156] 表 4の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、無細胞タンパク合成系に おいて、動物細胞由来の抽出物、植物細胞由来の抽出物いずれを用いた場合でも 、翻訳活性を高め、また、低温において翻訳活性を高めることが明らかになった。
[0157] (実施例 5)
<タバコ培養細胞 (BY2)プロトプラストにおけるタンパク質合成 >
実施例 1と同様にして調製した前記 R1— 5'— XbS、前記 R1— XbS、及び pA60を 用い、それぞれ Cap構造を付カ卩した mRNA、 Cap構造を付カ卩しない mRN Aを調製 し、これらを、下記の方法により調製したタバコ培養細胞 (BY2)のプロトプラストに、 実施例 1と同様にして導入し、得られた形質転換体を 17°Cで 6時間培養し、実施例 1 と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を表 5に示す。
[0158] タバコ培養細胞 (BY2)プロトプラストの調製
タバコ (Nicotiana tabacum L.cv.Bright.Yellow— 2)由来培養細胞（以下、「BY2培 養細胞」と表す）は、 7日ごとに、培養液 (30g/L スクロース、 0.2g/L KH PO
2 4、 4.6g/
L ムラシゲ 'スターグ培地用混合塩類（日本製薬社製)、 0.1g/L myo-イノシトール、 0.001g/L ビタミン B1塩酸塩、 0.2 X 10— 3g/L 2.4-ジクロロフエノキシ酢酸、 pH5.8) 10 OmLに、 1. 5mLの BY2細胞液を無菌状態で植え継ぎ、 25°C、暗黒条件で振盪培 養して継代培養して得た。
植え継ぎ 3日目に、前記 BY2培養細胞の培養液を、 50mLのスクリューチューブ 2 本に分注し、前記 BY2培養細胞を自然落下させ、前記培養液の上澄みをァスピレ 一ターで取り除き、 0. 4Mマン-トール液 (0. 4Mマン-トール、 20mM MgCl ·6Η
2 2
0)で 2回洗浄した。洗浄した前記 ΒΥ2培養細胞に、酵素液（1. 0%セルラーゼオノズ 力 RS、0. 1%ぺクトリアーゼ Y—23、 0. 4M マン-トール ρΗ5.5)を細胞沈殿量の 5 倍量加え、 200mL三角フラスコに移し、これをアルミホイルで包み、 30°Cで 3時間ィ ンキュペートした。インキュベート中は、 15分ごとにピペットで静かに細胞を撹拌した インキュベート後、細胞の状態を顕微鏡で確認し、プロトプラストを酵素液と共にォ 一トクレーブしたガラス遠沈管に移し 50 X gで 3分間遠心した。上澄みをァスピレータ 一で取り除き、 0. 4Mマン-トール液を遠沈管の半分程度まで加えてプロトプラストを 懸濁し、さらに 50 X gで 3分間遠心した。この洗浄作業を 5回繰り返した後、沈殿した プロトプラストを 0. 4Mマン-トール液に懸濁し、 50mLスクリューチューブに移した。 再び 50 X gで 3分間遠心した後、ァスピレーターでマン-トール液を充分取り除き、 前記 BY2培養細胞のプロトプラストを得た。
[0159] [表 5]
1 7°C LUC活性
Capあり Capなし
R1 - 5' -Xbs 70.27 4.67
1 -Xbs 27.09 0.1 1
PA60 2.99 0 [0160] 表 5の結果から、タバコ培養細胞（BY2)のプロトプラストにおいて、前記 RCNMV RNA1の 5'— UTRを有する前記 R1— 5'— XbSと、 5'— UTRを持たない前記 R1 XbSとを比較すると、 5,—170^を有する前記!^1 5,— 1^カ 著しく高い翻訳 制御効果を示すことがわかった。このことから、前記 RCNMV RNA1の 5,—UTR 力 3'—UTRの翻訳制御効果をより高めることがわ力つた。
[0161] (実施例 6)
前記 RCNMVの RNA1中、ステムループ構造を形成する配列のうち、図 1に示す S L2、及び SL3〖こ、下記の方法により変異を導入した組換えベクター（p3,TE— DRl ZLm2、及び p3'TE— DRlZLm3)を調製した。
[0162] 前記 pRl— 5'—XbSを铸型として、プライマーに、前記 Luc + 3'FW、及び SL2— Lml/- (配列番号 43： 5' -GCGACCATAAAATACGCTAGGTACCTG- 3 の組合せと、前記 Luc + 3'RV、及び SL2— LmlZ+ (配列番号 44 : 5'— CGT ATTTTATGGTCGCTAGAAATCGGGC - 3' )の組合せとを用いた以外は、実 施例 2と同様にして変異を SL2に挿入し、 p3'TE— DRlZLm2を調製した。
また、前記 pRl— 5'— XbSを铸型として、プライマーに、前記 Luc + 3'FW、及び SL3-Lm3/- (配列番号 45： 5' -GGTTACCGCTTGGTGAAGCCCGCCC G の組合せと、前記 Luc + 3'RV、及び SL3— Lm3Z+ (配列番号 46 : 5^— CTTCACCAAGCGGTAACCCGCCGTCGAG- 3')の組合せとを用いた以外 は、実施例 2と同様にして変異を SL3に挿入し、 p3'TE— DR1/Lm3を調製した。
[0163] 実施例 2及び 3と同様にして調製した、ステムループ構造領域に変異を導入した各 組換えベクター（p3'TE— DR1/Lm4、 p3'TE— DR1/Lml、 p3'TE— DRlZ Lm5)、前記 p3,TE— DRlZLm2、前記 p3,TE— DRlZLml、並びに実施例 1と 同様にして調製した前記 pRl— 5'— XbS、及び pA60を用い、これらを直鎖状にし た後、転写を行い、それぞれ^末端に Cap構造を持たない mRNAを作製した。 得られた各 mRNAを、実施例 1と同様にして調製したササゲプロトプラストと、実施 例 5と同様にして調製したタバコ培養細胞 (BY2)プロトプラストにそれぞれ導入し、 1 7°Cで 16時間培養した後、実施例 1と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。 タバコ培養細胞（BY2)プロトプラストにおける結果を図 5に、ササゲプロトプラストに おける結果を図 6にそれぞれ示す。
[0164] 図 5及び図 6の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチド（配列番号 15、配列 番号 16)において、ステムループ形成可能な SL5領域は、 SL1領域、及び SL4領域 と同様、翻訳活性、特に低温域における翻訳活性を高める作用において重要なポリ ヌクレオチドであることがわかった。
[0165] (実施例 7)
<無細胞タンパク質合成系 >
前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして、実施例 1と同様にして 調製した R1— 5' -XbS (Cap構造なし）を含む前記 In vitro翻訳系のキットを用い 、無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行った。
前記 In vitro翻訳系のキットを構成する前記細胞抽出物として、下記の方法により 調製したタバコ培養細胞 (BY2)抽出物を用いた以外は、実施例 4と同様にして合成 を行った。なお、前記組換えベクターの比較対照としては、実施例 1と同様にして調 製した前記 pA60 (Cap構造あり）を用いた。前記 R1— 5,—XbSの結果を、図 7に示 す。
[0166] < < BY2抽出物の調製方法 > >
実施例 5と同様にして調製した BY2プロトプラストを用い、重量の 5倍量の 30% (vo lZvol)パーコール (Amersham社製)液を該 BY2プロトプラストに加え懸濁した。
得られた懸濁液を、オートクレーブを行った遠心管に 6mL入れ、この下に 40% (vo lZvol)パーコール液 7mLを重層し、さらにその下に 2mLの 70% (volZvol)バーコ 一ル液を重層した。なお、全てのパーコール液には 0. 7Mマン-トール、 20mM MgCl 及び 5mM Pipes- KOH(pH7.4)が含まれている。
2
パーコール液を重層した前記懸濁液を、 25°C、 10, 000 X gで 65分間遠心した。 この時アクセルとブレーキは最小にした。遠心後、 40% (volZvol)と 70% (volZvol )のパーコール液の境界に存在する脱液胞化したプロトプラストのフラクションを、先 端を切った p 1000チップで、 25mLの 0. 4Mマン-トール液が入ったスクリューチュ ーブに回収した。
これを、さらに 50 X gで 3分間遠心して、ァスピレーターで上澄みを除去し、 0. 4M マン-トール液で 2回洗浄した後、マン-トール液を充分取り除いてスクリューチュー ブの重さを差し引いて重量を測定し、その重量の 4倍量の TRバッファー (30mM Hepes- KOH,pH7.4、 lOOmM 酢酸カリウム、 2mM DTT, 500 μ g/mL ベントナイ ト、 1 tablet per 10ml Complete Mini protease mixture(Roche Diagnostics社製 )を加えて脱液胞化プロトプラストを得た。該脱液胞化プロトプラストを、オートクレープ を行ったダウンスホモジェナイザー (tight社製)を用い、氷上で 50回破砕し、得られた 破砕液を、氷上に立てておいたエツペンドルフチューブに移し、 4°C、 500 X gで 10 分間遠心した。得られた破砕液の上澄みを、無細胞タンパク合成系の細胞抽出物と して使用し、タンパク質合成を行った。
[0167] LUC活性を測定したところ、 pA60 (Cap構造あり）の翻訳活性は、 25°C及び 30°C における活性が最も高力つた（図示せず)。
図 7の結果から、本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、無細胞タンパク質合成系 においても、低温における翻訳活性を高めることがわ力 た。
[0168] (実施例 8)
実施例 1にお 、て、 RCNMVの RNA1から組換えベクターを調製したのと同様の 方法で、サンへンプモザイクウィルス（以下、「SHMV」と表す）から、 3'— UTR領域 と、 5,— UTR領域の cDNAを調製し、これらを用いて、実施例 1と同様にして組換え ベクターを作製した。
前記 SHMVの 3,—UTR及び 5,— UTRを含む組換えベクター（SH— luc— SH) と、前記 RCNMVの UTR及び UTRを含む組換えベクター（pRl— 5' X bS)と、前記 pA60とを、それぞれ実施例 1と同様にして直鎖にした後、転写を行い、 それぞれ 5'末端に Cap構造を持つ mRNAを作製した。得られた mRNAを、実施例 1と同様にしてササゲプロトプラストに導入し、 10°C、 17°C、 25°C、 32°Cの温度条件 下で 6時間培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図 8に示す。
[0169] 図 8の結果から、 RCNMVの RNA1由来の本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドを含 む組換えベクターは、翻訳活性を高めることが知られているトバモウイルスの^ UT Rを有する SHMVから調製した組換えベクターよりも、翻訳活性を高め、特に低温域 における翻訳活性を高めることがわ力つた。 [0170] (実施例 9)
前記翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして、実施例 1と同様にして 調製した R1— 5' -XbS (Cap構造なし）を含む前記 In vitro翻訳系のキットを用い 、無細胞タンパク質合成系でタンパク質合成を行った。
前記 In vitro翻訳系キットを構成する前記細胞抽出物、及び他の成分として、 PR OTEIOS (和研薬 (株)製)を使用し、前記組換えベクターの比較対照としては、 pE U3— ΝΠを用いて調製したものを使用した。これらのベクターを、直鎖にした後、転 写を行い、それぞれ ^末端に Cap構造を持たない mRNAを作製した。得られた mR NAを用い、 17°C、及び 26°Cの温度条件下でタンパク質合成を行い、実施例 1と同 様にしてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図 9に示す。
[0171] 本発明の翻訳制御ポリヌクレオチドは、生細胞系タンパク質合成に用いる宿主細胞 や、無細胞系タンパク質に用いる抽出物の由来生物の種による制限を受けず、 mR NAの翻訳活性を高め、かつ、温度制御可能であり、特に低温（20°C未満）における 翻訳活性を高めるため、該翻訳制御ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記翻 訳制御ポリヌクレオチド及び該組換えベクターのいずれかが導入された形質転換体 、前記翻訳制御ポリヌクレオチドを用いたタンパク質合成方法、 in vitro系翻訳キット 、並びにタンパク質合成装置は、高い温度領域 (例えば、 20°C以上）において不安 定なタンパク質の合成や、低い温度領域 (例えば、 20°C未満）において従来の方法 では十分な合成量が得られな力つたタンパク質の合成に好適に使用することができ る。
[0172] また、前記翻訳制御ポリヌクレオチドは、寒冷地農業等に好適な農作物の品種改 良、具体的には、農作物等の生産可能な北限をより北方に移し、寒冷地での農作物 生産を可能とし、ハウス栽培等の温室栽培を不要とし、稲等の穀類の二期作等を可 能とする等、農業に革命をもたらし得る品種改良に好適に使用することができる。

Claims

請求の範囲
(1)配列番号 15に示される RNA配列、 (2)配列番号 15に示される RNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 15に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポ リヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、 の少なくとも 、ずれかを含み、アミノ酸配列をコードする mRNAの 3 則に組み込まれ 組み込まれる前に比べて、該 mRNAの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記 mRNAの翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における翻 訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係を 満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 15)
uugguucuuu uaaguguagc cuccacccga guugcaagag gggaacacgc agucucgccg 60 acccuguugg caaacaguaa aauugcaaaa aauagagugc uaggaguagu ucccguaccc 120 gcgggagcaa gacccuacua caguagacga accggcaucg gacccuggga aacagguacc 180 uagcguauua auaggucgcu agaaaucggg cgggcuucac cuucggguaa cccgccgucg 240 agagggaaaa ccucugugug guugugcgca cgucguuguc ggaagacucu cacuguugua 300 guuauuuccu uuuucuuuua gguaggagca cuugcucaga gggcgcauac cucugguaaa 360 acaaaauugg ccccugagag uagaaaacuc agguuaauaa aacaggagaa uauuuaccua 420 gucguauaac ggcuagguac ccc 443
(1)配列番号 7に示される RNA配列、 (2)配列番号 7に示される RNA配列にお！/、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配 列番号 7に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌ クレオチド、及び (4)前記（1)から（3)のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の 少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする mRNAの 3 則に組み込まれ、 組み込まれる前に比べて、該 mRNAの翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記 mRNAの翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における翻 訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係を 満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 7)
uugguuaauu gguuagcgca gccuccaucc gaguugcaag agaggaagac gcagucucgc 60 cgacccuguu ggcaaacagu aaaauugcaa aaaauagagu guuaggagua guucccauac 120 ccuuggggac aagaaccuau uauggagaaa cgaacuggca ucggacccug ggaaacaggc 180 aucuagcgua uuaauagguc gcuagaagac gggcaggcuu caccacuagg uaaccugccg 240 ccgagaggga aaaccucugu gugguugugc gcacgucguu gucggaagaa guucaccaua 300 guaguuauuu ccuuuucuuu uagguagaag cacuugcucc agagggcgca uaccucuggu 360 uaaacaaaau uguccccuga gaguagaaaa cucagguuaa uaaaacagga gaauauuuac 420 cuaguuguau aacggcuagg uacccc 446
17°Cにおける翻訳活性が、 25°Cにおける翻訳活性よりも高くなるように制御する請 求項 1から 2のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(1)配列番号 39に示される RNA配列、 (2)配列番号 39に示される RNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及 び（3)配列番号 39に示される RNA配列と、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズ するポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 1から 3のいずれかに記載 の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 39)
ccugggaaac agg 1ό
(1)配列番号 1に示される RNA配列、（2)配列番号 1に示される RNA配列にぉ 、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（ 3)配列番号 1に示される RNA配列と、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする ポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 1から 3のいずれかに記載の翻 訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 1)
agagggaaaa ccucu 15
(1)配列番号 3に示される RNA配列、 (2)配列番号 3に示される RNA配列にぉ 、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（ 3)配列番号 3に示される RNA配列と、ストリンジ ントな条件下でハイブリダィズする ポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 1から 3のいずれかに記載の翻 訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 3)
gugugguugu gcgcac 16
(1)配列番号 13に示される RNA配列、 (2)配列番号 13に示される RNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及 び（3)配列番号 13に示される RNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ するポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 1及び 3のいずれかに記載 の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 13)
gaaccggcau cggacccugg gaaacaggua ccuagcguau uaauaggucg cuagaaaucg 60 ggcgggcuuc accuucgggu aacccgccgu cgagagggaa aaccucugug ugguugugcg 120 cacgucguug ucggaaga 138
(1)配列番号 5に示される RNA配列、 (2)配列番号 5に示される RNA配列にぉ 、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（ 3)配列番号 5に示される RNA配列と、ストリンジ ントな条件下でハイブリダィズする ポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 2及び 3のいずれかに記載の翻 訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 5)
gaacuggcau cggacccugg gaaacaggca ucuagcguau uaauaggucg cuagaagacg 60 ggcaggcuuc accacuaggu aaccugccgc cgagagggaa aaccucugug ugguugugcg 120 cacgucguug ucggaag 137
アミノ酸配列をコードする mRNAの 5 則に（1)配列番号 17に示される RNA配列、 (2)配列番号 17に示される RNA配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換 、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 17に示される RNA配列と、スト リンジ ントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から (3) の!、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくとも 、ずれかが組み込まれたポリ ヌクレオチドに組み込まれる請求項 1から 8のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレ ォチド。
(配列番号 17)
gacaaacguu uuaccgguuu guaaauagga gcacacaagc ucgcuagucg cccccuucgu 60 aucggggauc uagagauuaa acgguauacc ugucauuuua aauuucuacu uuucguacca 120 guc 123
アミノ酸配列をコードする mRNAの 5 則に（1)配列番号 9に示される RNA配列、 ( 2)配列番号 9に示される RNA配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 9に示される RNA配列と、ストリン ジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の Vヽずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくとも 、ずれかが組み込まれたポリヌ クレオチドに組み込まれる請求項 1から 8のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオ チド。
(配列番号 9)
gaacaaacgu uuuaccgguu uguaaauugg aauucucgaa uucgccaguc gccuucuucg 60 uaucaaggau cuggaauuug aacgguaucu uuaucauuuu aauuucuacu uuucguacca 120 guc 123
レッドクローノ ー 'ネクロティック 'モザイクウイノレス (Red clover necrotic mosai c virus :RCNMV)の RNA1由来の配列である請求項 1から 10の!ヽずれかに記載 の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(1)配列番号 16に示される DNA配列、（2)配列番号 16に示される DNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 (3) 配列番号 16に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする ポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配 列、の少なくともいずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の 3 則に組み 込まれ、
組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における 翻訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係 を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 16)
ggggtaccta gccgttatac gactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggccaattt tgttttacca gaggtatgcg ccctctgagc aagtgctcct 120 acctaaaaga aaaaggaaat aactacaaca gtgagagtct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcgacggc gggttacccg aaggtgaagc ccgcccgatt 240 tctagcgacc tattaatacg ctaggtacct gtttcccagg gtccgatgcc ggttcgtcta 300 ctgtagtagg gtcttgctcc cgcgggtacg ggaactactc ctagcactct attttttgca 360 attttactgt ttgccaacag ggtcggcgag actgcgtgtt cccctcttgc aactcgggtg 420 gaggctacac ttaaaagaac caa 443
(1)配列番号 8に示される DNA配列、（2)配列番号 8に示される DNA配列にぉ 、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配 列番号 8に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌ クレオチド、及び (4)前記（1)から（3)のいずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の 少なくとも 、ずれかを含み、アミノ酸配列をコードする塩基配列の 3 則に組み込まれ 組み込まれる前に比べて、該塩基配列の翻訳活性を高め、かつ、
組み込まれた後の前記塩基配列の翻訳活性を、 20°C未満の温度条件下における 翻訳活性 Xと、 20°C以上の温度条件下における翻訳活性 Yとが、 XZY≥1の関係 を満たすように制御することを特徴とする翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 8)
ggggtaccta gccgttatac aactaggtaa atattctcct gttttattaa cctgagtttt 60 ctactctcag gggacaattt tgtttaacca gaggtatgcg ccctctggag caagtgcttc 120 tacctaaaag aaaaggaaat aactactatg gtgaacttct tccgacaacg acgtgcgcac 180 aaccacacag aggttttccc tctcggcggc aggttaccta gtggtgaagc ctgcccgtct 240 tctagcgacc tattaatacg ctagatgcct gtttcccagg gtccgatgcc agttcgtttc 300 tccataatag gttcttgtcc ccaagggtat gggaactact cctaacactc tattttttgc 360 aattttactg tttgccaaca gggtcggcga gactgcgtct tcctctcttg caactcggat 420 ggaggctgcg ctaaccaatt aaccaa 446
[14] 17°Cにおける翻訳活性が、 25°Cにおける翻訳活性よりも高くなるように制御する請 求項 12から 13に記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
[15] (1)配列番号 40に示される DNA配列、（2)配列番号 40に示される DNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及 び（3)配列番号 40に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ するポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 12から 14のいずれかに記 載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 40)
cctgtttccc agg 13
[16] (1)配列番号 2に示される DNA配列、（2)配列番号 2に示される DNA配列におい て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（ 3)配列番号 2に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする ポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 12から 14のいずれかに記載の 翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 2)
agaggttttc cctct 15
[17] (1)配列番号 4に示される DNA配列、（2)配列番号 4に示される DNA配列におい て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（ 3)配列番号 4に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする ポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 12から 14のいずれかに記載の 翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 4)
gtgcgcacaa ccacac 16
[18] (1)配列番号 14に示される DNA配列、（2)配列番号 14に示される DNA配列にお いて、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及 び（3)配列番号 14に示される DNA配列と、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズ するポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 12及び 14のいずれかに記 載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 14)
tcttccgaca acgacgtgcg cacaaccaca cagaggtttt ccctctcgac ggcgggttac 60 ccgaaggtga agcccgcccg atttctagcg acctattaat acgctaggta cctgtttccc 120 agggtccgat gccggttc 138
(1)配列番号 6に示される DNA配列、（2)配列番号 6に示される DNA配列にぉ 、 て、 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、及び（ 3)配列番号 6に示される DNA配列と、ストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする ポリヌクレオチド、の少なくともいずれかを含む請求項 13及び 14のいずれかに記載 の翻訳制御ポリヌクレオチド。
(配列番号 6)
cttccgacaa cgacgtgcgc acaaccacac agaggttttc cctctcggcg gcaggttacc 60 tagtggtgaa gcctgcccgt cttctagcga cctattaata cgctagatgc ctgtttccca 120 gggtccgatg ccagttc Ιύ ΐ
アミノ酸配列をコードする塩基配列の 5 則に（1)配列番号 18に示される DNA配列 、 （2)配列番号 18に示される DNA配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置 換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、 （3)配列番号 18に示される DNA配列と、ス トリンジェントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（ 3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくとも 、ずれかが組み込まれた ポリヌクレオチドに組み込まれる請求項 12から 19のいずれかに記載の翻訳制御ポリ ヌクレオチド。
(配列番号 18)
gactggtacg aaaagtagaa atttaaaatg acaggtatac cgtttaatct ctagatcccc 60 gatacgaagg gggcgactag cgagcttgtg tgctcctatt tacaaaccgg taaaacgttt 120 gtc 123
アミノ酸配列をコードする塩基配列の 5 則に（1)配列番号 10に示される DNA配列 、（2)配列番号 10に示される DNA配列において、 1若しくは複数の塩基が欠失、置 換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、（3)配列番号 10に示される DNA配列と、ス トリンジェントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド、及び (4)前記（1)から（ 3)の 、ずれかのポリヌクレオチドの部分配列、の少なくとも 、ずれかが組み込まれた ポリヌクレオチドに組み込まれる請求項 12から 19のいずれかに記載の翻訳制御ポリ ヌクレオチド。
(配列番号 10)
gactggtacg aaaagtagaa attaaaatga taaagatacc gttcaaattc cagatccttg 60 atacgaagaa ggcgactggc gaattcgaga attccaattt acaaaccggt aaaacgtttg 120 ttc 123
[22] レッドクローノ一'ネクロティック 'モザイクウイノレス (Red clover necrotic mosai c virus： RCNMV)の RNA1由来の配列に対する cDNAである請求項 12から 21 の!、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
[23] 17°C以下の温度条件下において翻訳活性が最大となるように翻訳制御する請求 項 1から 22のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
[24] アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの非翻訳領域に組み込 まれる請求項 1から 23のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド。
[25] 請求項 1から 24の 、ずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを含むことを特徴と する組換えベクター。
[26] 請求項 1から 24のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチド、及び請求項 25に 記載の組換えベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする形質転換体。
[27] 動物細胞、植物細胞、菌類、及び酵母から選択される請求項 26に記載の形質転 換体。
[28] 請求項 1から 24のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用いることを特徴 とするタンパク質合成方法。
[29] 請求項 25に記載の組換えベクターを用いることを特徴とするタンパク質合成方法。
[30] 無細胞タンパク質合成系で行われる請求項 28から 29の 、ずれかに記載のタンパ ク質合成方法。
[31] コムギ胚芽抽出物を用いて行われる請求項 30に記載のタンパク質合成方法。 [32] 真核生物の細胞を用いて行われる請求項 28から 29の 、ずれかに記載のタンパク 質合成方法。
[33] 大腸菌を用いて行われる請求項 28から 29の ヽずれかに記載のタンパク質合成方 法。
[34] 17°C以下の温度条件下で行われる請求項 28から 33のいずれかに記載のタンパク 質合成方法。
[35] 請求項 1から 24のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを少なくとも含むこと を特徴とする in vitro系翻訳キット。
[36] コムギ胚芽抽出物を含む請求項 35に記載の in vitro系翻訳キット。
[37] 請求項 1から 24のいずれかに記載の翻訳制御ポリヌクレオチドを用い、アミノ酸を 合成させる合成手段を少なくとも有することを特徴とするタンパク質合成装置。
[38] 合成手段がコムギ胚芽抽出物を使用する請求項 37に記載のタンパク質合成装置
[39] 温度制御手段を有する請求項 37から 38の 、ずれかに記載のタンパク質合成装置
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