WO2005083448A1 - 生体高分子のマイクロアレイ用基板、ハイブリダイゼーション装置、およびハイブリダイゼーション方法 - Google Patents

生体高分子のマイクロアレイ用基板、ハイブリダイゼーション装置、およびハイブリダイゼーション方法 Download PDF

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Takeo Tanaami
Hideo Tashiro
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Yokogawa Electric Corporation
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    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a substrate for microarrays of biopolymers such as DNA and RNA, a hybridization device using the substrate, and a high-speed hybridization device using the device. About the method.
  • biopolymer microarrays for example, DNA chips and DNA microarrays
  • a method for immobilizing DNA for example, there is a method in which a thiol is bonded to single-stranded DNA, and the single-stranded DNA that is thiolated is immobilized on, for example, a metal substrate.
  • the target DNA which is a subject, is allowed to act on the immobilized probe DNA, and the presence or absence of hybridization between them is detected.
  • the presence or absence of the hybridization is determined, for example, by using a fluorescence method, and can be detected by measuring the fluorescence from the spot of the fluorescence-labeled target DNA hybridized to the probe DNA.
  • a spotting type DNA microarray is prepared by placing a droplet containing probe DNA on a substrate and drying the droplet (see Non-Patent Document 1).
  • This has the advantage that it can be produced at low cost, but has the disadvantage that the uniformity of the DNA immobilized on the substrate is not guaranteed. That is, there is a disadvantage that the size and shape of the DNA detection spot portion vary.
  • Gridding refers to an operation of inputting the number of vertical and horizontal spots on the array, the spot interval, and the size of the spot diameter, and surrounding the spot with a circle (see Non-Patent Document 1).
  • the stamp shape and position of the spot are stable, it takes a very long time to perform the gridding operation at the time of fluorescence analysis, and accurate analysis becomes difficult.
  • hybridization of the probe DNA immobilized on the substrate with the target DNA usually requires ten and several hours.
  • large amounts of sample are required for hybridization. Therefore, enormous time, cost and labor are required for hybridization time and preparation of a large amount of sample. In particular, when analyzing low-expressing genes, an extremely large number of samples are required.
  • Non-patent document 1 "A manual for DNA microarrays that always produces data, from basic principles, chip making technology to bioinformatics", 1st edition, Yodosha, December 1, 2002, P. 19-21, 35, 106 -108
  • the present invention provides a method for applying an AC or DC voltage to a planar electrode to generate an electric field, thereby speeding up biopolymers and hybridization by dielectrophoresis or electrophoresis. Hybridization of biological macromolecules with molecules readable by laser etc.
  • a substrate for hybridization a hybridization device for biopolymers, and a hybridization method.
  • the present invention provides the following.
  • a pair of two conductive paths connected to a DC or AC power supply are installed on this board, and the electric field distribution between the two conductive paths in a part of the conductive path pattern is localized.
  • a biomolecule microarray characterized in that a probe molecule for detecting a biopolymer is fixed on a conductive path in the vicinity thereof or near the vicinity thereof. substrate.
  • a pair of two conductive paths connected to a DC or AC power supply are installed on this board, and the electric field distribution between the two conductive paths in a part of the conductive path pattern is localized.
  • a biomolecule detection probe molecule fixed at a position facing the vicinity of the conductive path of the proximity portion or the vicinity of the proximity portion on the opposing substrate disposed opposite to the substrate so as to be stronger than the substrate.
  • an AC or DC voltage is applied between the conductive paths to generate an electric field having a locally strengthened distribution between the closely arranged conductive paths.
  • Biopolymer can be easily concentrated by dielectrophoresis or electrophoresis
  • a biopolymer microarray substrate characterized in that there are two or more adjacent portions of the conductive path.
  • an electrode for detecting the presence or absence of the hybridization is provided.
  • Biopolymer hybridization apparatus characterized by the following:
  • an AC or DC voltage is applied between the conductive paths from the power supply to generate an electric field having a distribution that is locally strengthened between the conductive paths arranged close to each other.
  • a biopolymer can be concentrated by conducting dielectrophoresis or electrophoresis in a conductive path arrangement portion, and a hybridization device capable of achieving high-speed elimination of hybridization can be easily realized. it can.
  • a cover substrate made of a transparent material is provided opposite to the substrate surface on which the conductive path is provided, and the fluorescent marker hybridized through the cover substrate.
  • a biomolecule hybridization device characterized in that it is configured to observe the fluorescence of a biomolecule attached thereto.
  • An AC voltage or a DC voltage output from the power supply is applied between the conductive paths to generate an electric field, and the sample biopolymer target which naturally diffuses into the solution is subjected to dielectrophoresis.
  • the hybridization can be easily performed at high speed.
  • planar electrodes An AC or DC voltage is applied between two adjacent conductive paths (hereinafter referred to as planar electrodes) provided on the substrate to generate an electric field near the planar electrodes.
  • planar electrodes two adjacent conductive paths
  • a biopolymer microarray substrate capable of concentrating a biopolymer in the vicinity of a planar electrode, a hybridization device using the microarray substrate, and a method for high-speed hybridization Can be easily realized.
  • the cover substrate disposed opposite to the substrate surface on which the plane electrode surface is provided is formed of a transparent material.
  • the substrate of the present invention simply attaches a planar electrode to a conventional substrate, and can easily produce a low-cost biopolymer microarray (such as a DNA chip) with a low manufacturing cost.
  • the flat electrode pattern is made of metal and has a high reflectance, gridding can be easily performed by measuring a reflected image.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of an embodiment showing a part of a biopolymer hybridization apparatus according to the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing the shape of a planar electrode.
  • FIG. 3 is a view showing an example of a spot of a biopolymer.
  • FIG. 4 is a diagram showing another example of a spot of a biopolymer.
  • FIG. 5 is a view showing another example of installation of the plane electrode and the probe DNA.
  • FIG. 6 is a view showing still another example of installation of a plane electrode and probe DNA.
  • FIG. 7 is a view showing still another example of installation of a planar electrode and probe DNA.
  • FIG. 8 is a view showing still another example of installation of a plane electrode and probe DNA.
  • FIG. 1 is a block diagram of an embodiment showing a part of a biopolymer hybridization apparatus according to the present invention, and also includes an objective lens provided in a reader for reading a fluorescent label of a hybridized biopolymer. Shown.
  • DNA will be described as an example of a biopolymer.
  • reference numeral 1 denotes a biopolymer hybridization device
  • reference numeral 20 denotes an objective lens of a reading device.
  • the biopolymer hybridization apparatus 1 is composed of a substrate 2, planar electrodes 3 and 4, which are two-pole conductive paths arranged particularly close to a conductive path mounted on the upper surface of the substrate 2, and a transparent material. An electric field is applied between the cover substrate 5 formed by Power supply 10 is provided.
  • the probe DNA 6 is immobilized on the upper surfaces of the planar electrodes 3 and 4, and the space between the substrate 2 and the cover substrate 5 is filled with a solution 8 containing the sample target DNA 7.
  • the substrate 2 and the cover substrate 5 are formed in a closed container surrounded by side walls (not shown), and have a structure in which the solution 8 does not flow out.
  • the planar electrodes 3 and 4 and the probe DNA 6 pertaining to one site such planar electrodes are arranged at a predetermined interval for a plurality of sites on one DNA chip or DNA microarray. You.
  • the planar electrodes 3 and 4 are arranged on the substrate 2 at positions close to each other so that the two electrodes do not contact each other.
  • the shape is, for example, as shown in (a)-(c) of FIG.
  • FIG. 2 (a) shows a planar electrode composed of a circular electrode and a circular electrode surrounding the circular electrode.
  • the circular electrode 3 and the circular electrode 4 are each a lead wire.
  • the power supply 10 is connected via 3a and 4a.
  • FIG. 2B shows comb-shaped planar electrodes nested in each other, and the electrodes 3 and 4 are connected to a power supply 10 via lead wires 3a and 4a, respectively.
  • FIG. 2 (c) shows spirally formed electrodes, and electrodes 3 and 4 are respectively
  • the planar electrode having such a shape can be produced by a force attached to the surface of the substrate 2, for example, as follows.
  • a slide glass whose surface is polished is used as the substrate 2.
  • Gold is deposited on the glass surface by vacuum deposition.
  • the slide glass is irradiated with ultraviolet light through a photomask by an ultraviolet exposure apparatus. After the irradiation, development is performed to form an electrode-shaped resist pattern on the gold surface as shown in FIG.
  • Gold on the surface other than the resist pattern is etched by a gold etchant.
  • a glass substrate having an electrode-shaped gold pattern as in a photomask can be manufactured.
  • the lead wire can be similarly manufactured by patterning.
  • the probe DNA6 is stamped and immobilized on the electrode surface in advance.
  • the probe DNA is spotted on the circular portion of the electrode 3 and fixed on the circular electrode.
  • Empty space between board 2 and cover board 5 After a solution 8 containing a fluorescently labeled sample target DNA 7 is filled in between, an AC voltage is applied between the flat electrodes 3 and 4 from a power supply 10. As a result, the electric field density between the electrodes 3 and 4 increases, and the negatively charged sample target DNA 7 naturally diffused into the solution 8 is attracted to the vicinity of the electrodes 3 and 4 by dielectrophoresis and concentrated.
  • the sample target DNA is washed away together with the solution 8, and the probe DNA is hybridized with the sample target DNA 7 and the force is applied to the probe bar through the transparent window. Irradiates light (for example, laser light).
  • the fluorescent light that has also emitted fluorescent labeling enters the objective lens 20 through the cover substrate 5 and is read by the reader.
  • the sample target DNA 7 hybridized to the probe DNA can be measured.
  • a scanning confocal microscope, a scanless multibeam reader, or the like can be used for reading the fluorescently labeled DNA.
  • the voltage applied to the electrodes 3 and 4 may be AC or DC.
  • an AC voltage is applied as in the above-described embodiment, at a low frequency, a solution containing the sample target DNA 7 is liable to generate bubbles and the like due to electrolysis. Therefore, it is preferable to use a high-frequency AC.
  • the power supply 10 uses an AC power supply or a DC power supply depending on whether the applied voltage is AC or DC. Alternatively, select either AC voltage or DC voltage by setting Use a power supply that can output.
  • a plurality of the proximity electrode units shown in FIG. 2 can be arranged in an array on the substrate. This allows a large number of DNAs to be analyzed simultaneously.
  • spots of a plurality of types of biopolymers may be separated and spotted on one proximity electrode portion.
  • the spot may be located near the surface electrode. Even in this case, the hybridization is accelerated because the target DNA 7 exists at a high concentration near the electrode.
  • the planar electrodes 3 and 4 and the probe DNA 6 may be provided on the side of the transparent cover substrate 5 for reading fluorescence.
  • the probe DNA 6 is immobilized on a transparent flat electrode.
  • the probe DNA 6 may be provided near the flat electrode.
  • the flat electrode need not be transparent.
  • the arrangement may be as shown in FIG. 7 or FIG.
  • a substrate 2 having a structure in which a columnar or quadrangular prism-shaped convex protrusion 2a having a flat upper surface is formed on a flat plate is used as the substrate 2.
  • the plane electrode and the probe DNA are arranged on the opposing surfaces. That is, in FIG. 7, the planar electrodes 3 and 4 are attached to the upper surface of the convex protrusion 2a, and the probe DNA 6 is fixed to the lower surface of the transparent cover substrate 5.
  • the planar electrodes 3 and 4 are mounted on the lower surface of the transparent cover substrate 5, and the probe DNA 6 is mounted on the upper surface of the convex protrusion 2a.
  • the gap a in this case that is, the gap a between the cover substrate 5 and the planar electrodes 3 and 4 in FIG. 7, and the gap a between the planar electrodes 3 and 4 and the upper surface of the convex protrusion 2a in FIG.
  • the gap a is preferably narrow.
  • a force that may cause electrolysis from a conductive wire other than the proximity portion is covered with a non-conductive film. Insulate it from the solution by the structure of.
  • the detection may be carried out by using an intercalator-type reagent between the two strands after hybridization, instead of using a target DNA or the like that has been fluorescently labeled in advance, and detecting by a fluorescence signal or a current value. . Further, absorption or phosphorescence that is not fluorescent may be used. In the case of current detection, a dedicated electrode for detection and a detection circuit may be separately provided separately from the conductive path for hybridization.
  • hybridization it is possible to perform hybridization at a very high speed in ordinary gene expression analysis. Hybridization can be performed at high speed without preparing a large amount of sample.

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Abstract

　平面電極に交流または直流の電圧を印加して電界を発生させることにより誘電泳動または電気泳動により生体高分子のハイブリダイゼーションを高速化すると共に、ハイブリダイズした生体高分子をレーザなどにより読取り可能とした生体高分子のハイブリダイゼーション用基板、生体高分子のハイブリダイゼーション装置およびハイブリダイゼーション方法を提供する。

Description

明 細 書
生体高分子のマイクロアレイ用基板、ハイブリダィゼーシヨン装置、および ハイブリダィゼーシヨン方法
技術分野
[0001] 本発明は、 DNAや RNAなどの生体高分子のマイクロアレイ用基板、この基板を用 V、たハイブリダィゼーシヨン装置、およびこの装置を用いてハイブリダィゼーシヨンを 高速ィ匕する方法に関する。
背景技術
[0002] 従来より、遺伝子診断、病原菌の特定、一塩基多型の検出などにおいては、被検 体である核酸 (ターゲット核酸)を検出する目的で、プローブ核酸とターゲット核酸と のハイブリダィゼーシヨンが広く利用されている。近年、多数のプローブ核酸を基板 に固定した DNAチップや DNAマイクロアレイが実用されるようになり、ハイブリダィゼ ーシヨンはターゲット核酸の検出に使用されている。
[0003] 生体高分子マイクロアレイ（例えば DNAチップや DNAマイクロアレイ）の作製にお V、ては、基板に多数のプローブ DNAをそれぞれスポットとして整列させ固定ィ匕する 必要がある。 DNAの固定ィ匕方法としては、例えば、チオールを一本鎖 DNAに接合 させ、チオールィ匕した一本鎖 DNAを例えば金属基板に固定ィ匕する方法がある。 固定化されたプローブ DNAに、被検体であるターゲット DNAを作用させ、これらの 間のハイブリダィゼーシヨンの有無を検出する。ハイブリダィゼーシヨンの有無は、例 えば蛍光法を用いることにより行われ、プローブ DNAにハイブリダィズした蛍光標識 済ターゲット DNAのスポットからの蛍光を測定することにより検出することができる。
[0004] スポッティング型の DNAマイクロアレイは、プローブ DNAを含む液滴を基板上に 載せ、これを乾燥させることによって作製される（非特許文献 1参照)。そのため、安価 に作製できるという利点がある反面、基板上に固定される DNAの均一さが保証され ないという欠点がある。すなわち、 DNA検出スポット部の寸法や形状がばらつくという 欠点がある。
[0005] さらに、スポッティング型の DNAマイクロアレイの場合、 DNA検出スポット部の周囲 に付着した固相ィ匕剤の存在により、ターゲット DNAが非特異的に基板上に吸着し、 ノイズの上昇を引き起こし、 SZN比を低下させるという問題もあった (非特許文献 1参 照)。
[0006] 蛍光測定時においては、蛍光部分を特定するグリッディングという操作が行われる 。グリッディングは、アレイ上のスポットの縦横の数やスポット間隔、スポットの直径の 大きさを入力し、スポットを円で囲む操作をいう（非特許文献 1参照)。しかし、スポット のスタンプ形状および位置が安定して 、な 、と、蛍光解析時のグリッディング操作に 非常に時間が力かる上、正確な解析が困難となる。
[0007] また、グリッディングは、スポットの位置がずれて 、るとスポットを正確に囲むことがで きない。そのため、グリッディングを行うソフトウェアには、 自動で位置を補正する機能 が付いている。し力しながらすべての操作が自動になっているわけではなぐ手動で スポットの開始点の設定を行ったり、 目？見によってすべてのスポットのグリッドを確認し 補正する必要がある。この操作は非常に煩雑であり、 DNAスポットの数が数千以上 になると非常に時間が力かる作業となり、解析スピードを遅らせる要因となっている。
[0008] 一方、基板上に固定化されたプローブ DNAと、試料であるターゲット DN Aをハイ ブリダィゼーシヨンさせるには、通常、十数時間を要する。さらにハイブリダィゼーショ ンには多量の試料が必要とされる。そのため、ハイブリダィゼーシヨン時間および多 量の試料の調製に、莫大な時間と費用、労力が必要とされている。特に、低発現遺 伝子の解析を行う場合、極めて多くの試料が必要となる。
非特許文献 1 :「必ずデータが出る DNAマイクロアレイ実践マニュアル 基本原理、 チップ作成技術からバイオインフォマティクスまで」、第 1版、羊土社、 2002年 12月 1 日、 P. 19—21、 35、 106-108
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の目的は、このような点を解決するものである。本発明は、平面電極に交流 または直流の電圧を印加して電界を発生させることにより誘電泳動または電気泳動 により生体高分子のノ、イブリダィゼーシヨンを高速ィ匕すると共に、ハイブリダィズした 生体高分子をレーザなどにより読取り可能とした生体高分子のハイブリダィゼーショ ン用基板、生体高分子のハイブリダィゼーシヨン装置、およびハイブリダィゼーシヨン 方法を提供する。
課題を解決するための手段
[0010] このような課題を達成するために、本発明は下記のものを提供する。
(1)生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される 1対の 2本の導電路が設置され、 その導電路のパターンの一部において 2本の導電路をその導電路間の電界分布が 局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、その近接部の導電路上またはそ の近接部の近傍に生体高分子検出用のプローブ分子を固定ィ匕したことを特徴とする 生体高分子のマイクロアレイ用基板。
[0011] (2)生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される 1対の 2本の導電路が設置され、 その導電路のパターンの一部において 2本の導電路をその導電路間の電界分布が 局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、前記基板に対向して配置された 対向基板における前記近接部の導電路またはその近接部の近傍に対向した位置に 生体高分子検出用プローブ分子を固定ィヒしたことを特徴とする生体高分子のマイク ロアレイ用基板。
[0012] このような構成によれば、導電路間に交流または直流電圧を印加して、近接配置さ れた導電路間に局所的に強くなる分布の電界を発生させることにより、その導電路配 置部に生体高分子を誘電泳動または電気泳動させて容易に濃縮させることができる
[0013] (3)導電路の近接部が、 2箇所以上であることを特徴とする生体高分子のマイクロ アレイ用基板。
(4)前記基板が、ガラスまたはプラスチックまたはセラミックが用いられ、前記導電路 をエッチングまたは印刷によりガラス基板上に形成したものである（1)または（2)に記 載の生体高分子のマイクロアレイ用基板。
[0014] (5)前記導電路が、前記プローブ分子を固定ィ匕した領域以外では溶液と絶縁され て 、ることを特徴とする（1)一（4)の 、ずれか一つに記載の生体高分子のマイクロア レイ用基板。
(6)前記導電路とは別に、ハイブリダィゼーシヨン後にハイブリダィゼーシヨンの有 無を検出するための電極を持つことを特徴とする（1)一 (5)の何れか一つに記載の 生体高分子のマイクロアレイ用基板。
[0015] (7) (1)一（6)のいずれか一つに記載の生体高分子マイクロアレイ用基板と、 前記基板上に設置された 2本の導電路に交流電圧または直流電圧を印加するた めの電源を有し、
この電源から電圧を前記導電路に印加して電界を発生させ、この電界に沿って前 記基板上の溶液中に含まれる試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳 動させ得るように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダィゼーシヨン装置
[0016] このような構成によれば、電源より導電路間に交流または直流電圧を印加して、近 接配置された導電路間に局所的に強くなる分布の電界を発生させることにより、その 導電路配置部に生体高分子を誘電泳動または電気泳動させて濃縮させることができ 、ノ、イブリダィゼーシヨンの高速ィ匕を図り得るハイブリダィゼーシヨン装置を容易に実 現することができる。
[0017] (8) (7)に記載の装置であって、前記導電路が設置された基板面に対向して透明 材料で形成されたカバー基板を設け、このカバー基板を通してハイブリダィズした蛍 光標識付き生体高分子の蛍光を観測できるように構成したことを特徴とする生体高 分子のハイブリダィゼーシヨン装置。
(9) (7)に記載の装置であって、前記導電路が透明材料で形成されたカバー基 板上に形成され、このカバー基板の裏面からハイブリダィズした蛍光標識付き生体高 分子の蛍光を観測できるように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダィ ゼーシヨン装置。
[0018] (10) (7)—（9)の何れか一つに記載の生体高分子のハイブリダィゼーシヨンを行 う方法であって、
前記導電路間に前記電源から出力された交流電圧または直流電圧を印加して電 界を発生させ、溶液中に自然拡散して!/ヽる試料生体高分子ターゲットを誘電泳動ま たは電気泳動により導電路近傍に濃縮させてハイブリダィゼーシヨンを行うようにする ことを特徴とする生体高分子のハイブリダィゼーシヨン方法。
この方法によれば、ハイブリダィゼーシヨンを容易に高速ィ匕できる。
[0019] (11)前記試料生体高分子ターゲットが、ハイブリダィゼーシヨン後に蛍光信号また は電流値により検出することを特徴とする（10)に記載の生体高分子のハイブリダィ ゼーシヨン方法。
発明の効果
[0020] 以上説明したように、本発明によれば次のような効果がある。
(1)基板上に設けた互いに近接した 2極の導電路 (以下この導電路部分を平面電極 と称する）間に、交流または直流電圧を印加して平面電極近傍に電界を発生させ、こ れにより、平面電極近傍に生体高分子を濃縮することのできる生体高分子のマイクロ アレイ用基板、およびこのマイクロアレイ基板を用いたハイブリダィゼーシヨン装置、 ならびにハイブリダィゼーシヨンを高速ィ匕する方法を、それぞれ容易に実現すること ができる。
[0021] (2)また、このようなノ、イブリダィゼーシヨン装置では、平面電極面を設けた基板面に 対向して配置されるカバー基板が透明な材料で形成されており、カバー基板を通し て、ハイブリダィズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を従来のレーザ等による読 取装置で容易に読取ることができ、従来の読取装置がそのまま利用できるという利点 がある。
[0022] (3)本発明の基板は従来の基板に平面電極を取り付けるだけであり、製造コストの低 Vヽ生体高分子マイクロアレイ (DNAチップなど）を容易に作製できる。
[0023] (4)この平面電極のパターンは、金属で、反射率が高!、ため、反射像を測定すること により容易にグリッディングが可能となる。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]本発明に係る生体高分子ハイブリダィゼーシヨン装置の一部を示す実施例構 成図である。
[図 2]平面電極の形状を示す図である。
[図 3]生体高分子のスポット例を示す図である。 [図 4]生体高分子の他のスポット例を示す図である。
[図 5]平面電極とプローブ DNAの他の設置例を示す図である。
[図 6]平面電極とプローブ DNAの更に他の設置例を示す図である。
[図 7]平面電極とプローブ DNAの更に他の設置例を示す図である。
[図 8]平面電極とプローブ DNAの更に他の設置例を示す図である。
符号の説明
[0025] 1 生体高分子のハイブリダィゼーシヨン装置
2 基板
3, 3 , 3 , 3 平面電極
1 2 3
4, 4 , 4 , 4 平面電極
1 2 3
3a, 4a リード線
5 カバー基板
6 プローブ DNA
6 , 6 , 6 , 6 生体高分子のスポット
1 2 3 4
7 試料ターゲット DNA
8 溶液
10 電源
20 読取装置の対物レンズ
発明を実施するための最良の形態
[0026] 以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。
図 1は本発明に係る生体高分子ハイブリダィゼーシヨン装置の一部を示す実施例 構成図であり、ハイブリダィズした生体高分子の蛍光標識を読取るための読取装置 に設けられた対物レンズも併せて示してある。
なお、実施例では、生体高分子として DNAを例にとって説明する。
[0027] 図 1にお 、て、 1は生体高分子ハイブリダィゼーシヨン装置、 20は読取装置の対物 レンズである。生体高分子ハイブリダィゼーシヨン装置 1は、基板 2と、基板 2上面に 取付けられた導電路部の特に近接配置された 2極の導電路部である平面電極 3, 4と 、透明な材料で形成されたカバー基板 5と、平面電極 3, 4の間に電界を印加するた めの電源 10を備える。
[0028] 平面電極 3, 4の上面にはプローブ DNA6が固定化され、基板 2とカバー基板 5に 挟まれた空間には試料ターゲット DNA7を含む溶液 8が満たされる。なお、基板 2と カバー基板 5とは側壁（図示せず）に囲まれて密閉状の容器に形成され、溶液 8が流 出しない構造となっている。また、図では 1つのサイトに係る平面電極 3, 4とプローブ DNA6を示してあるが、 1つの DNAチップや DNAマイクロアレイにはこのような平面 電極が複数サイト分所定の間隔で配置されて!、る。
[0029] 平面電極 3, 4は、基板 2上でその 2極が互いに接触しないように近接した位置に配 置されており、その形状は例えば図 2の（a)—（c)に示すようなものが使用可能である 図 2の（a)は、円形状の電極とそれを取り巻く円環状の電極からなる平面電極であり 、その円形状の電極 3と円環状の電極 4はそれぞれリード線 3a, 4aを介して電源 1 0に接続される。また、図 2の (b)は互いに入れ子状に配置された櫛の歯状の平面電 極であり、各電極 3 , 4はそれぞれリード線 3a, 4aを介して電源 10に接続される。ま
2 2
た、図 2の（c)は互いに渦巻き状に形成された電極であり、各電極 3 , 4はそれぞれ
3 3
リード線 3a, 4aを介して電源 10に接続される。
[0030] このような形の平面電極は、基板 2表面に取付けられる力 例えば次のようにして作 製することもできる。基板 2として表面研磨したスライドガラスを用いる。そのガラス表 面に真空蒸着により金を蒸着する。その上にレジストを塗布してベーキングした後、 紫外線露光装置により、フォトマスクを通して上記スライドガラスに紫外光を照射する 。照射後、現像を行い、図 2に示すような電極形状のレジストパターンを金表面上に 形成する。
[0031] レジストパターン以外の表面の金は金エツチャントによりエッチングする。このように して、フォトマスク通りの電極形状の金パターンを有するガラス基板を作製することが できる。なお、リード線もパターンィ匕して同様に作製できる。
[0032] このような構成における動作を次に説明する。予めプローブ DNA6を電極面上にス タンプし固定化しておく。例えば、図 2 (a)では、電極 3の円形部分にプローブ DNA をスポットし、この円形電極上に固定ィ匕しておく。基板 2とカバー基板 5に挟まれた空 間に蛍光標識した試料ターゲット DNA7を含む溶液 8を満たした後、電源 10より平 面電極 3 , 4の間に交流電圧を印加する。これにより電極 3 , 4間の電界密度が高 まり、溶液 8中に自然拡散している負電荷を有する試料ターゲット DNA7は誘電泳動 によって電極部 3 , 4近傍に引き寄せられ濃縮する。
[0033] これにより、電極部に固定化されたプローブ DNA6と、試料ターゲット DNA7とのハ イブリダィズを促進させることができる。このような交流電圧による促進効果について は、例えば、第 26回日本分子生物学会年会
神戸国際展示場において平成 15年 12月 10日— 13日に発表された「次世代 DNA マイクロアレイシステムの開発 MESA型アレイにおけるハイブリッド形成の増進効果 」（発表者:葛西耕平、畠山哲、島村貴之、近藤恭光、田代朋子、田代英夫)より明ら かである。
[0034] ノ、イブリダィゼーシヨン後、ハイブリダィズしな!/、試料ターゲット DNAは溶液 8と共に 洗い流し、プローブ DNAとハイブリダィズした試料ターゲット DNA7に、透明窓の力 バー基板 5を通して読取装置側から励起光 (例えばレーザ光)を照射する。蛍光標識 力も発光した蛍光はカバー基板 5を通して対物レンズ 20に入り、読取装置で読取ら れる。このようにしてプローブ DNAにハイブリダィズした試料ターゲット DNA7を計測 することができる。
なお、蛍光標識 DNAの読取には、スキャン型の共焦点顕微鏡、スキャンレス型の マルチビーム式の読取装置などを用いることができる。
[0035] なお、電極 3, 4に印加する電圧は、交流でも直流でもよい。上記実施例のように交 流電圧を印加する場合は、低周波数では試料ターゲット DNA7を含む溶液が電気 分解により気泡等が発生しやす!/、ため高周波の交流を用いるのが好ま 、。
[0036] 一方、直流電圧を印加する場合は、高電圧をかけると、試料ターゲット DNA7を含 む溶液が高電圧により電気分解し、気泡等が発生しやすい懸念があるため、低電圧 を使用するのが好まし 、。負に帯電して 、る試料ターゲット DNA7は正極側の電極 の方に集まってくる。
なお、電源 10は、印加する電圧が交流か直流かに応じて、交流電源または直流電 源を用いる。あるいは、設定により交流電圧または直流電圧のいずれかを選択的に 出力できる電源を用いてもょ 、。
[0037] なお、本発明は、上記実施例に限定されることなぐその本質力 逸脱しない範囲 で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、図 2にある近接電極部は基板上に複数アレイ状に設置することができる。 これによつて多数の DNAの解析を同時に行うことができる。
[0038] また、図 3に示すように、 1つの近接電極部に複数種類の生体高分子のスポットをそ れぞれ分離してスポットしてもよ 、。
また、図 4に示すように、プローブ DNA6 , 6 , 6 , - --6は平面電極上ではなぐ平
5 6 7 n
面電極の近傍にスポットしてもよい。この場合でも、電極の近傍にはターゲット DNA7 が高濃度で存在しているためハイブリダィゼーシヨンは加速される。
[0039] また、図 5に示すように、蛍光を読取るための透明なカバー基板 5側に平面電極 3, 4とプローブ DNA6を設置してもよい。この場合、プローブ DNA6は透明な平面電極 に固定化される。
また、図 6に示すように、平面電極の近傍にプローブ DNA6を設置してもよい。この 場合は、平面電極は透明でなくてもよい。
[0040] また、図 7あるいは図 8に示すような配置としてもよい。いずれの図においても、基板 2としては、平板上に、上面が平坦な円柱状または四角柱状の凸型突起部 2aを持つ 構造の基板 2を用いる。そして、平面電極とプローブ DNAを対向する面に配置する 。すなわち、図 7では、凸型突起部 2aの上面に平面電極 3, 4が取付けられ、プロ一 ブ DNA6が透明なカバー基板 5の下面に固定化されている。図 8では、平面電極 3, 4が透明なカバー基板 5の下面に取付けられ、プローブ DNA6が凸型突起部 2aの 上面に取付けられている。
[0041] この場合のギャップ a、すなわち、図 7におけるカバー基板 5と平面電極 3, 4の間の ギャップ aと、図 8における平面電極 3, 4と凸型突起部 2aの上面との間のギャップ aは 狭い方が望ましい。
[0042] また、近接部以外の導線からも電気分解が生じる可能性がある力 これに対しては 、生体高分子を固定化した領域以外 (固定部位以外)を非導電性の膜で覆うなどの 構造により溶液と絶縁すればょ 、。 [0043] また、検出は、予め蛍光標識したターゲット DNAなどを使用する以外に、ハイプリ ダイゼーシヨン後にインターカレータ型の試薬を二本鎖の間に挿入し、蛍光信号や 電流値で検出する方法でもよい。また、蛍光ではなぐ吸収やりん光でもよい。 また、電流検出の場合、ハイブリダィゼーシヨン用の導電路とは別に、検出用の専 用電極と検出回路を別途設置してもよ ヽ。
産業上の利用可能性
[0044] 本発明によれば、通常の遺伝子発現解析にお!ヽては極めて高速にハイブリダィゼ ーシヨンを行わせることが可能であり、低発現遺伝子の解析を行う場合にあっては、 従来必要とされたほどの多量の試料を調製せずとも、高速にハイブリダィゼーシヨン を行わせることが可能になる。

Claims

請求の範囲
[1] 生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される 1対の 2本の導電路が設置され、 その導電路のパターンの一部において 2本の導電路をその導電路間の電界分布が 局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、その近接部の導電路上またはそ の近接部の近傍に生体高分子検出用のプローブ分子を固定ィ匕したことを特徴とする 生体高分子のマイクロアレイ用基板。
[2] 生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される 1対の 2本の導電路が設置され、 その導電路のパターンの一部において 2本の導電路をその導電路間の電界分布が 局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、前記基板に対向して配置された 対向基板における前記近接部の導電路またはその近接部の近傍に対向した位置に 生体高分子検出用プローブ分子を固定ィヒしたことを特徴とする生体高分子のマイク ロアレイ用基板。
[3] 前記近接部は 2箇所以上であることを特徴とする請求項 1または 2に記載の生体高 分子のマイクロアレイ用基板。
[4] 前記基板はガラスまたはプラスチックまたはセラミックであり、前記 2本の導電路をェ ツチングまたは印刷により基板上に形成したことを特徴とする請求項 1ないし 3のいず れかに記載の生体高分子のマイクロアレイ用基板。
[5] 前記導電路は、前記プローブ分子を固定化した領域以外では溶液と絶縁されてい ることを特徴とする請求項 1な 、し 4の 、ずれかに記載の生体高分子のマイクロアレイ 用基板。
[6] 前記導電路とは別に、ハイブリダィゼーシヨン後にハイブリダィゼーシヨンの有無を 検出するための電極を持つことを特徴とする請求項 1ないし 5のいずれかに記載の生 体高分子のマイクロアレイ用基板。
[7] 請求項 1ないし 6のいずれかに記載の生体高分子マイクロアレイ用基板と、
前記基板上に設置された 2本の導電路に交流電圧または直流電圧を印加するた めの電源を有し、 この電源から電圧を前記導電路に印加して電界を発生させ、この電界に沿って前 記基板上の溶液中に含まれる試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳 動させ得るように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダィゼーシヨン装置
[8] 請求項 7に記載の装置であって、
前記導電路が設置された基板面に対向して透明材料で形成されたカバー基板を 設け、このカバー基板を通してハイブリダィズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を 観測できるように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダィゼーシヨン装置
[9] 請求項 7に記載の装置であって、
前記導電路は透明材料で形成されたカバー基板上に形成され、このカバー基板の 裏面からハイブリダィズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を観測できるように構成 したことを特徴とする生体高分子のノ、イブリダィゼーシヨン装置。
[10] 請求項 7な 、し 9の 、ずれかに記載の装置を用いて生体高分子のハイブリダィゼー シヨンを行う方法であって、
前記導電路間に前記電源から出力された交流電圧または直流電圧を印加して電 界を発生させ、溶液中に自然拡散して!/ヽる試料生体高分子ターゲットを誘電泳動ま たは電気泳動により導電路近傍に濃縮させてハイブリダィゼーシヨンを行うようにする ことを特徴とする生体高分子のハイブリダィゼーシヨン方法。
[11] 前記試料生体高分子ターゲットは、ハイブリダィゼーシヨン後に蛍光信号または電 流値により検出することを特徴とする請求項 10に記載の生体高分子のハイブリダィ ゼーシヨン方法。
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