WO2005077406A1 - Inhibiteurs ded proteases pour le traitement de pathologies digestives - Google Patents

Inhibiteurs ded proteases pour le traitement de pathologies digestives Download PDF

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Definitions

  • the present application relates to compositions and methods for the treatment of intestinal pathologies. It also relates to compositions and methods for regulating the paracellular permeability of the intestinal epithelium.
  • the compositions and methods of the invention are based in particular on the use of protease inhibitors modulating the opening of tight junctions of the intestinal epithelium.
  • the invention can be used for the preventive or curative treatment of various pathologies, such as functional digestive disorders (TFD), more particularly functional intestinal disorders (TFI), and in particular irritable bowel syndrome (SU also called “Irritable”). Bowel Syndrome ", IBS), hyperalgesia and other abdominal pain, etc., in mammals, especially humans.
  • the intestinal epithelium is the center of very important exchanges between the external environment and the organism. These exchanges can take place either through the cells of the epithelium, or through parallel networks.
  • the transport of water or electrolytes, or the absorption of small molecules (molecular weight generally less than about 1000 Da) at the level of the gastric, intestinal or colic mucosa is carried out by transcellular route, through epithelial cells or enterocytes.
  • the absorption of large molecules and the passage of antigens, toxins or immune cells takes place mainly by the paracellular route, at the level of "tight junctions", which are arranged between the epithelial cells.
  • JS epithelial tight junctions
  • TJ The epithelial tight junctions
  • JS epithelial tight junctions
  • These structures provide and control the paracellular transepithelial transport, from the outside to the submucosa, of macromolecules various (allergens, irritants, toxins, microorganisms).
  • These structures also allow the migration of immune cells (eg, immunocytes) to the outside (digestive tract).
  • Tight junctions are flexible structures made up of a complex assembly of transmembrane proteins (occludins, claudins) and cytoplasmic proteins (zona ocludens proteins ZO-1, ZO-2, ZO-3, proteins AF7, cinguline or 7H6, etc. ), which are associated with elements of the cytoskeleton (myosin, actin filaments, etc.).
  • TFD digestive functional disorders
  • abdominal pain without elimination disorder can be caused by food allergies or intolerances or manifest as part of celiac disease for example.
  • Functional intestinal disorders affect 15 to 20% of the population and result in dyspeptic and / or intestinal symptoms for which no organic cause has so far been identified and which require specific treatment.
  • the common characteristic of functional digestive disorders meeting ROME criteria is abdominal pain, present in the postprandial period, whether localized in the upper part (dyspepsia) or in the lower part of the abdomen.
  • One particular disorder that affects the lower abdomen is Irritable Bowel Syndrome (SU).
  • SU Irritable Bowel Syndrome
  • This digestive micro-inflammatory state promotes the sensitization of the endings of the primary afferent neurons and this sensitization could lead to a secondary facilitation of the transmission, to the brain, messages of a nociceptive nature.
  • Functional imaging studies indeed indicate characteristic changes in the areas of cortical projection of these nerve messages in subjects with TFD.
  • Such a process of sensitizing the intestine to pain can be induced by factors such as stress, pathogens, allergens, enzymes of the trypsin or tryptase type for example, bile salts, xenobiotics, chemical molecules of glycerol type, TNBS or taurocholate for example and / or sequelae resulting from an infection or from a surgical operation.
  • the present invention results from the demonstration of the activation, by bacterial proteases released in the colonic lumen, of PAR receptors (proteinase-activated receptors), located on the membranes of epithelial cells, which modulate the opening of tight junctions , this opening can lead to a state of hyperalgesia.
  • PAR receptors proteinase-activated receptors
  • the bacterial origin of the above-mentioned proteases has been demonstrated by the fact that a 10-day oral treatment with a cocktail of antibiotics destroying the flora reduces the permeability of tight junctions, this being restored by the intracolic perfusion of 'a supernatant of normal colonic content.
  • the inventors have also demonstrated that a cocktail of protease inhibitors infused into the colonic lumen reduces the colonic paracellular permeability and the visceral sensitivity to distension.
  • the present invention stems from the development of new therapeutic strategies for the treatment of intestinal pathologies, based on a modulation of the para-cellular permeability of the intestinal epithelium using protease inhibitors.
  • the present invention provides a therapeutic approach to intestinal pathologies based on the use of protease inhibitors for controlling the opening of tight junctions of the intestinal epithelium.
  • protease inhibitors make it possible to modulate the tension of the cytoskeleton of the intestinal epithelial cells or to directly regulate, preferably decrease, or even block, the opening of the tight junctions of the intestinal epithelium.
  • This approach therefore makes it possible to control the opening and closing of the tight junctions of the intestinal epithelium, without necessarily resorting to de novo protein synthesis and / or to significant protein and / or structural degradations in the epithelium.
  • This strategy makes it possible to regulate the permeability of the intestinal epithelium in a specific, fine and reactive manner, and thus to act on the transfer of allergens, pathogens and / or chemical molecules to the cells of immunity. This strategy is particularly suitable for obtaining a rapid and controllable biological effect over time (reversible).
  • results presented below show that a substance capable of loosening the tight epithelial junctions (peptides activating the PAR-2 receptor such as the peptide SLIGRL) triggers delayed hyperalgesia, hypersensitivity to distension and an increase in colonic permeability.
  • results presented in the examples also show that the suppression of this increase in paracellular permeability by a protease inhibitor or a mixture (cocktail) of protease inhibitors suppresses or reduces this hyperalgesia characteristic of TFD and in particular SU.
  • a first object of the invention therefore lies more particularly in the use of at least one protease inhibitor, for the preparation of a medicament intended for the preventive or curative treatment of functional digestive disorders.
  • the invention also relates to such a use for the preparation of a medicament intended for the preventive or curative treatment of hyperalgesia occurring in the context of intestinal pathologies.
  • the protease inhibitor is preferably an inhibitor of intracolic proteases.
  • Another object of the invention lies in a method of preventive or curative treatment of intestinal pathologies characterized by a state of hyperalgesia, comprising the administration to a subject of an effective amount of at least one protease inhibitor.
  • Protease inhibitors appear to work by controlling the opening of tight junctions in the intestinal epithelium. These inhibitors are in particular inhibitors which modulate the tension of the cytoskeleton of intestinal epithelial cells or inhibitors which decrease, or even block, the opening of tight junctions of the intestinal epithelium.
  • the invention thus relies on the use of protease inhibitors modulating the tension and the state of contraction of the cytoskeleton of the cells of the intestinal epithelium or preventing an excessive opening of the tight junctions which results in hyperalgesia or hypersensitivity distension of the intestine.
  • the proteins making up the tight junctions are associated with the cytoskeleton of the cells they connect. It is proposed in the context of the invention that the voltage of the cytoskeleton or the opening of tight junctions can be modulated in subjects suffering from intestinal diseases or disorders to act in a non-destructive and transient manner on the permeability of their intestinal epithelium. Thus, the contraction of the cytoskeleton must favor the opening of tight junctions, while a relaxation of the cytoskeleton (or an inhibition of the contraction) must favor the closing of the junctions. It is also possible to directly modulate tight junctions, in particular on the proteins constituting them, by reducing or blocking their opening.
  • protease inhibitors which modulate the contraction of the cytoskeleton of intestinal epithelial cells (or in particular human) or which control the opening of tight junctions of the intestinal epithelium (in particular human).
  • protease inhibitors are used which inhibit or activate or promote the contraction of the cytoskeleton of intestinal epithelial cells.
  • a protease inhibitor is considered to modulate the tension of the cytoskeleton when it modulates the opening of tight junctions.
  • An inhibitory effect on the contraction or tension of the actin and / or myosin filaments need not be complete or total, but it is enough that it reduces the contraction or the tension of the cytoskeleton sufficiently to reduce the opening of the tight junctions.
  • the reduction in the opening of tight junctions preferably corresponds to a minimum reduction of approximately 25%, advantageously of approximately 30%, even more preferably of approximately 50% of the paracellular permeability of the intestinal epithelium.
  • Paracellular permeability can be measured using a marker such as 51 Cr-EDTA which, after passing through the blood, is measured in the urine for 24 hours (cf.: example 1).
  • the protease inhibitors used are preferably the inhibitors acting on serine proteases and / or metalloproteases. Such inhibitors are particularly active in reducing the action of bacterial proteases on colonic permeability.
  • protease inhibitors used are advantageously molecules, which can be in isolated form or in the form of a cocktail, combination, biological extracts, etc. These molecules can be synthetic, semi-synthetic or biological, in particular of animal, viral, plant or bacterial origin.
  • protease inhibitors of selective or non-selective inhibitors of serine proteases [serpin and its derivatives, Aprotinin, N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK), dichloroisocoumarin, nexin-1, AEBSF-HC1, Antipain, benzamidine, Leupeptine, TLCK, Ovomucoid, phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), PEFABLOC® and soy extracts] and metalloproteases (Amastatin, Arphamenine, Bestatin, Diprotin A, Phosphoramidon) as well as non-specific molecules used as antivirals (amprenavir, indinavir, lopinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir and atazanavir).
  • serine proteases serine proteases
  • Protease inhibitors can be used alone or in combination and / or in combination with other active agents, such as, for example, other active substances used in the treatment of irritable bowel syndrome.
  • Protease inhibitors are thus optionally used in combination and / or in combination with compounds which decrease or block the opening of tight junctions of the intestinal epithelium, in particular by modulating the tension of the cytoskeleton, or which increase the opening of them.
  • the activity of these compounds can be direct or indirect, that is to say directed at the very constituents of the cytoskeleton or at regulators of its tension.
  • the compounds acting directly on the tension of the cytoskeleton are preferred.
  • or ⁇ . also prefers compounds exhibiting selective activity on cytoskeletal tension, that is to say typically compounds which do not directly affect the structure of the proteins constituting the tight junctions.
  • the protease inhibitor according to the invention preferably does not directly affect the structure of the proteins constituting the tight junctions.
  • the term “compound” must be taken in a broad sense, that is to say as designating any agent, substance, composition, condition, treatment or process making it possible to modulate the opening tight junctions of the intestinal epithelium. It is advantageously an agent (eg, a molecule) or a combination or association of agents. Examples of such compounds are indicated in international patent application No. WO 03/077893. These include inhibitors of myosin light chain kinase (MLC3).
  • MLC3 myosin light chain kinase
  • a particular example of selective inhibitors of MLCK is the compound ML-7 ⁇ 1- (5-iodonaphthalene-1-sulfonyl) -1H-hex ⁇ ahydro-1,4-diazepine ⁇ (Makishima M. et al. FEBS Lett. 1991; 287: 175).
  • Other examples of such inhibitors are in particular the compound ML-9 (Wilson DP. Et al. T Biol Chem. 2001; 13: 165) or other non-selective: Wortmannin (Warashina A. Xife Sci 2000; 13: 2587 -93), H-7 (Piao Zf et al.
  • KT 7692 Warashina A. Life Sci 2000; 13: 2587-93.
  • Other targets acting on the tension of the cytoskeleton of compounds which can be used in combination with protease inhibitors are in particular myosin binding proteins, such as for example cingulin, or junction molecules, such as cadherin-E, catenin- ⁇ or desmosomes. Modulating the activity or expression of these proteins makes it possible to regulate the tension of the cytoskeleton, within the framework of the present invention.
  • Protease inhibitors can also be used in combination with compounds that inhibit protein synthesis or other molecules that link proteins in the cytoskeleton to proteins in tight junctions.
  • mitogen-activated kinase inhibitors MAPKK
  • kinase MEK1 or kinase-PI3 such as the compounds PD098,059 ⁇ 2- (Amino -3-methoxyphenyl) - 4H-l-benzo ⁇ yran-4-one ⁇ (Alessi et al. J. Biol. Chem. 1995; 270, 27589) or LY294002 ⁇ 2- (4-Morpholinyl) -8-phenyl-l ( 4H) -benzopyran-4-one ⁇ (Vlahos et al. J. Biol. Chem 1994; 269: 5241).
  • MAPKK mitogen-activated kinase inhibitors
  • HGF hepatic growth factor
  • EGF endothelial growth factor
  • IGF-1 or gamma interferon growth factors
  • proteins acting on receptors located at the apical pole of epithelial cells can act indirectly on the cytoskeleton.
  • Other active agents are, for example, anti-cholinergic compounds, prokinetics, anti-diarrheal agents, modifiers of digestive motility, etc. These different agents can be used in therapeutic combination, and administered in separate, combined, time-spread or concomitant form.
  • Another object of the invention thus resides in a product, a cocktail or a pharmaceutical combination comprising at least one protease inhibitor and at least one other active agent selected from anti-cholinergic compounds, prokinetic substances, anti-diarrheal substances, laxatives or modifiers of motor skills, viscerosensitivity (or digestive sensitivity), for combined use, separate or spaced over time.
  • the present invention can be used for the treatment or management of pathologies or disorders of the digestive system characterized by a state of hyperalgesia, in particular functional intestinal disorders, chronic inflammatory bowel disease (IBD), intolerances food (allergies, packaging, etc.) characterized by chronic visceral pain.
  • IBD chronic inflammatory bowel disease
  • irritable bowel syndrome whatever its form (constipation, diarrhea or a combination of the two), but also chronic visceral pain not falling within in the context of SU, such as functional abdominal pain without faecal elimination disorder (F APS: Functional Abdominal Pain) and pain related to food intolerance and celiac disease.
  • F APS Functional Abdominal Pain
  • the compositions and methods of the invention make it possible to reduce the suffering of the subjects, to attenuate the symptoms or the cause of these disorders.
  • the present invention surprisingly demonstrates that the suppression of the increase in paracellular permeability associated with the activation of PAR receptors (for example the PAR-2 receptor) prevents the appearance of visceral hyperalgia.
  • a particular object of the invention resides in the use of a protease inhibitor as defined above for the preparation of a medicament intended to control, in particular to reduce, the paracellular permeability of the intestinal epithelium in subjects suffering from intestinal diseases characterized by a state of hyperalgesia, in particular chronic inflammatory diseases characterized by an accumulation, in the submucosal layer, of immunocytes (for example mast cells and / or enterochromaffin cells), by sensitivity increased parietal mechanoreceptors and possibly by infiltration of colon bacteria into the submucosal layer, for example hyperalgesia and in particular irritable bowel syndrome.
  • intestinal diseases characterized by a state of hyperalgesia
  • chronic inflammatory diseases characterized by an accumulation, in the submucosal layer, of immunocytes (for example mast cells and / or enterochromaffin cells), by sensitivity increased parietal mechanoreceptors and possibly by infiltration of colon bacteria into the submucosal layer, for
  • Another particular object of the invention resides in the use of a protease inhibitor as defined above for the preparation of a medicament intended to reduce the sensitization to allergens, pathogens and / or chemical molecules in affected subjects.
  • a protease inhibitor as defined above for the preparation of a medicament intended to reduce the sensitization to allergens, pathogens and / or chemical molecules in affected subjects.
  • sensitive to functional intestinal diseases in particular intestinal affections characterized by an accumulation, in the submucosal layer, of immunocytes, in particular for example mast cells and / or enterochromaffin cells, by an increased sensitivity of the parietal mechanoreceptors and possibly by a infiltration of colon bacteria into the submucosal layer, for example hyperalgesia and in particular irritable bowel syndrome.
  • Another particular object of the invention resides in the use of a protease inhibitor as defined above for the preparation of a medicament intended to reduce the transepithelial migration of immunocytes and the accumulation of immunocytes in the submucosal layer of subjects suffering from a functional intestinal pathology, in particular an intestinal affection inducing visceral hyperalgesia, for example irritable bowel syndrome, characterized by an accumulation, in the submucosal layer of immunoc ⁇ ytes, in particular mast cells and / or enterochromaffin cells, by an increased sensitivity of the parietal mechanoreceptors and possibly by an infiltration of bacteria from the colon into the submucosal layer.
  • the invention also relates to methods of treatment of the conditions indicated above, comprising the administration to a subject suffering from an intestinal pathology or sensitive to intestinal pathologies, of a protease inhibitor or treatment as defined above. before.
  • a protease inhibitor or treatment as defined above.
  • the inhibitor of proteases where the treatment is administered in a dose effective to reduce the paracellular permeability of the intestinal epithelium and / or to reduce pain sensitivity and / or to reduce transepithelial migration of allergens, toxins, irritants or microorganisms and thus the accumulation of immunocytes in the submucosal layer of the intestine.
  • the protease inhibitor can be administered by different routes and in different forms.
  • the protease inhibitor can be in liquid or solid form, typically in the form of a tablet, capsule, capsule, ampoule or oral solution, solution for injection, etc.
  • Packaging in capsules or capsules releasing its content by microbial digestion in the colon is particularly preferred, when possible.
  • other forms of administration are possible, such as injections (intraperitoneal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intra-arterial, etc.), pastes, gels, etc.
  • compositions comprising at least one protease inhibitor and a pharmaceutically acceptable excipient, said composition being preferably formulated for administration by oral or rectal route.
  • the composition is in the form of a suppository, or in the form of a capsule or capsule releasing its content by microbial digestion in the colon.
  • Figure 1 Influence of increasing doses of a PAR-2 receptor activating peptide (SLIGRL) on the absorption of a macromolecule ( 51 Cr-EDTA) evaluated by the percentage found in the urine collected for 24 hours in rats.
  • SLIGRL PAR-2 receptor activating peptide
  • Example 1 Reduction of rectal hyperalgesia using a tight junction blocker.
  • the intestinal epithelium has epithelial cell binding structures that provide controlled passage of immunocytes into the submucosal layer of the intestine.
  • This example shows that certain molecules known for their effect of increasing paracellular permeability at the intestinal level such as SLIGRL promote the accumulation of immunocytes in the intestinal submucosa (mast cells, enterochromaffin cells) and that this effect can be prevented. (eg, inhibited, reduced) by intracolic treatment involving a tight junction blocker.
  • SLIGRL PAR-2 activating peptide
  • Example 2 Colonic paracellular permeability in mice. Influence of different inhibitors of bacterial proteases.
  • Example 3 Modifications of the colonic paracellular permeability in mice caused by the intraluminal perfusion of trypsin and of supernatant of colonic content and after treatment with a cocktail of antibiotics.
  • EXAMPLE 4 Reduction of the rectal sensitivity to distension by the intracolic perfusion of a cocktail of protease inhibitors in the rat.
  • 3 batches of 8 male Wistar rats 250-300 g were subjected to a protocol of rectal distension of increasing volumes (0.4 ml) from 0 to 1.6 ml carried out using an embolectomy probe (FORGATY®).
  • the animals were previously equipped with electrodes implanted in the striated muscles of the abdomen allowing the electromyographic recording of abdominal cramps recognized as a criterion of pain.
  • the animals received, by intracolic route, a 12 hour infusion of the cocktail of protease inhibitors (Roche ref.: 1 873 580) (2 cachets - 0.5ml / h) or its solvent NaCl 0.9 %.
  • the animals are subjected to the rectal distension protocol.
  • the infusion of protease inhibitors causes a significant decrease in the abdominal response for the distension volumes of 0.8, 1.2 and 1.6 ml (Fig. 4) thus showing that the proteases released by the microflora in the colonic lumen participate in the determination of the basal state of rectocolic sensitivity to distension (Fig. 4).

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Abstract

La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies intestinales. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'inhibiteurs de protéases modulant l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que les troubles fonctionnels digestifs (TFD) en particulier les troubles fonctionnels intestinaux (TFI) entraînant une hyperalgésie et notamment le syndrome de l'intestin irritable (SII), chez les mammifères, notamment les humains.

Description

INHIBITEURS DE PROTEASES POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES DIGESTIVES
La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies intestinales. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'inhibiteurs de protéases modulant l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que les troubles fonctionnels digestifs (TFD), plus particulièrement les troubles fonctionnels intestinaux (TFI), et notamment le syndrome de l'intestin irritable (SU encore appelé « Irritable Bowel Syndrome », IBS), les hyperalgésies et autres douleurs abdominales, etc., chez les mammifères, notamment les humains.
L'épithélium intestinal est le centre d'échanges très importants entre le milieu extérieur et l'organisme. Ces échanges peuvent s'effectuer soit à travers les cellules de l'épithélium, soit par des réseaux parallèles. Ainsi, le transport d'eau ou d'électrolytes, ou encore l'absorption de petites molécules (poids moléculaire généralement inférieur à 1000 Da environ) au niveau de la muqueuse gastrique, intestinale ou colique, s'effectue par voie transcellulaire, à travers les cellules épithéliales ou entérocytes. Par contre, l'absorption de grosses molécules et le passage d'antigènes, de toxines ou de cellules immunitaires se fait principalement par voie paracellulaire, au niveau de «jonctions serrées », qui sont disposées entre les cellules épithéliales.
Les jonctions serrées (« JS ») épithéliales (ou « tight junction », « TJ ») sont des structures de liaison entre les cellules bordant les épithéliums muqueux (tube digestif, poumons). Ces structures assurent et contrôlent le transport trans- epithélial paracellulaire, de l'extérieur vers la sous-muqueuse, de macromolécules variées (allergènes, irritants, toxines, microorganismes). Ces structures permettent également la migration de cellules immunitaires (e.g., immunocytes) vers l'extérieur (tube digestif). Les jonctions serrées sont des structures souples constituées d'un assemblage complexe de protéines transmembranaires (occludines, claudines) et de protéines cytoplasmiques (protéines zona ocludens ZO-1, ZO-2, ZO-3, protéines AF7, cinguline ou 7H6, etc.), qui sont associées à des éléments du cytosquelette (filaments de myosine, d'actine, etc.).
Parmi les troubles fonctionnels digestifs (TFD), on distingue les douleurs abdominales sans trouble de l'élimination et les troubles fonctionnels intestinaux. Les douleurs abdominales sans trouble de l'élimination peuvent être provoquées par des allergies ou des intolérances alimentaires ou se manifester dans le cadre de la maladie cœliaque par exemple. Les troubles fonctionnels intestinaux affectent 15 à 20% de la population et se traduisent par des symptômes dyspeptiques et/ou intestinaux pour lesquels aucune cause organique n'a jusqu'ici été identifiée et qui nécessitent un traitement spécifique. La caractéristique commune des troubles fonctionnels digestifs répondant aux critères de ROME est la douleur abdominale, présente en période postprandiale, qu'elle soit localisée en partie haute (dyspepsie) ou en partie basse de l'abdomen. Un trouble particulier qui affecte la partie basse de l'abdomen est le Syndrome de l'Intestin Irritable (SU). La douleur des troubles fonctionnels intestinaux est le plus souvent soulagée par la défécation. La physiopathologie des troubles fonctionnels digestifs (TFD) est mal connue mais les récentes investigations cliniques montrent l'existence chez ces patients d'un abaissement du seuil de perception douloureuse à la distension (hyperalgésie viscérale) traduisant un état d'hypersensibilité digestive. Celui-ci semble relever en premier lieu d'une sensibilisation de mécanorécepteurs pariétaux par des médiateurs pro-inflammatoires. En effet l'existence de modifications de structure ou de densité de certaines cellules du système immunitaire au niveau de la sous- muqueuse en particulier du colon plaide en faveur d'une altération de l'équilibre immunitaire avec la microflore résidente. Une densité accrue de mastocytes ou de cellules entérochromaffines a été détectée dans des biopsies iléales et coliques chez des sujets atteints de SU. Cet état micro-inflammatoire digestif favorise la sensibilisation des terminaisons des neurones afférents primaires et cette sensibilisation pourrait conduire à une facilitation secondaire de la transmission, vers le cerveau, des messages à caractère nociceptif. Les études d'imagerie fonctionnelle indiquent en effet des modifications caractéristiques des aires de projection corticale de ces messages nerveux chez les sujets atteints de TFD. Un tel processus de sensibilisation de l'intestin à la douleur peut être induit par des facteurs tels que le stress, des pathogènes, des allergènes, des enzymes de type trypsine ou tryptase par exemple, des sels biliaires, des xénobiotiques, des molécules chimiques de type glycérol, TNBS ou taurocholate par exemple et/ou des séquelles résultant d'une infection ou d'une opération chirurgicale. Toutefois, les mécanismes par lesquels ces facteurs sont capables d'initier le phénomène de sensibilisation ne sont pas clairement documentés in vivo. Lorsque des allergènes, des pathogènes et/ou des molécules chimiques par exemple sont absorbés, ils entrent en contact avec la paroi épithéliale intestinale qui empêche leur introduction dans l'organisme et leur mise en contact avec les cellules de l'immunité. Toutefois, pour qu'une sensibilité se développe, cela implique que certains allergènes, pathogènes et/ou molécule chimique sont capables de traverser cet epithelium pour interagir avec les cellules immunitaires. Les conditions dans lesquelles ce transfert est possible demeurent peu documentées in vivo. Ainsi, bien que certains rapports suggèrent, sur des cultures de cellules in vitro, un rôle des jonctions serrées dans ce processus, aucune démonstration n'a été apportée de l'implication de ces jonctions in vivo dans le développement d'une sensibilisation. De même, si Coremans et al. (Ital J Gastroenterol 1991 (8) S 1 :39-40) suggèrent un lien entre les sels biliaires, perfusés par voie intra-colique, et les douleurs abdominales d'un sujet présentant un intestin irritable, aucun résultat présenté n'établit de corrélation entre les jonctions serrées et un processus de sensibilisation à la douleur de l'épithélium intestinal. Si la malabsorption des sels biliaires n'est observée que chez une faible proportion des sujets présentant un intestin irritable, des altérations de la perméabilité trans-epithéliale sont décrites chez les sujets développant un SU après gastro-entérite (SPILLER et al. Gut 2000 ; 47 : 804-11) mais sans qu'il soit fait mention de modifications de la perméabilité paracellulaire laquelle n'est pas étudiée.
Une corrélation entre le syndrome de l'intestin irritable et la présence accrue de microorganismes au niveau de la sous-muqueuse a été mise en évidence au travers d'études expérimentales (AGA. 1999), de même qu'un lien a pu être constaté entre les maladies inflammatoire chroniques de l'intestin ou les troubles fonctionnels intestinaux et des modifications du degré d'activation immunitaire (inflammation) de la paroi intestinale. Cependant, ces observations préliminaires n'ont pas été confirmées ou n'ont pas donné lieu à de nouvelles approches thérapeutiques.
La présente invention résulte de la mise en évidence de l'activation, par les protéases bactériennes libérées dans la lumière colique, des récepteurs PAR (proteinase-activated receptors), situés sur les membranes des cellules épithéliales, qui modulent l'ouverture des jonctions serrées, cette ouverture pouvant entraîner un état d'hyperalgésie.
L'origine bactérienne des protéases mentionnées ci-dessus a été démontrée par le fait qu'un traitement oral de 10 jours par un cocktail d'antibiotiques détruisant la flore réduit la perméabilité des jonctions serrées, celle-ci étant restaurée par la perfusion intracolique d'un surnageant de contenu colique normal. Les inventeurs ont par ailleurs démontré qu'un cocktail d'inhibiteurs de protéases perfusé dans la lumière colique réduisait la perméabilité paracellulaire colique et la sensibilité viscérale à la distension.
Le rôle in vivo des jonctions serrées de l'épithélium intestinal dans le processus de sensibilisation à la douleur a par ailleurs été mis en évidence dans la demande de brevet WO 03/077893. L'"ouverture" des jonctions serrées de l'épithélium du colon par différentes molécules ou par le stress entraîne une hyperalgésie spontanée ou une hypersensibilité à la distension (état caractéristique de l'IBS). Les résultats obtenus dans le cadre de cette invention ont établi pour la première fois et de façon surprenante que l'ouverture des jonctions serrées provoque un état d'hyperalgésie retardé durable.
La présente invention découle de la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de pathologies intestinales, basées sur une modulation de la perméabilité para-cellulaire de l'épithélium intestinal à l'aide d'inhibiteurs de protéases. En particulier, la présente invention propose une approche thérapeutique des pathologies intestinales basée sur l'emploi d'inhibiteurs de protéases permettant de contrôler l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal. Ainsi, ces inhibiteurs de protéases permettent de moduler la tension du cytosquelette des cellules épithéliales intestinales ou de réguler directement, de préférence diminuer, voire bloquer, l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal. Cette approche permet donc de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium. Cette stratégie permet de réguler la perméabilité de l'épithélium intestinal de manière spécifique, fine et réactive, et ainsi d'agir sur le transfert d' allergènes, de pathogènes et/ou de molécules chimiques vers les cellules de l'immunité. Cette stratégie est particulièrement adaptée à l'obtention d'un effet biologique rapide et contrôlable dans le temps (réversible).
A cet égard, les résultats présentés ci-dessous montrent qu'une substance susceptible de relâcher les jonctions serrées épithéliales (peptides activateurs du récepteur PAR-2 tels que le peptide SLIGRL) déclenche une hyperalgésie retard, une hypersensibilité à la distension et une augmentation de la perméabilité colique. Les résultats présentés dans les exemples montrent également que la suppression de cette augmentation de la perméabilité paracellulaire par un inhibiteur de protéases ou un mélange (cocktail) d'inhibiteurs de protéases supprime ou réduit cette hyperalgésie caractéristique des TFD et en particulier des SU.
Un premier objet de l'invention réside donc plus particulièrement dans l'utilisation d'au moins un inhibiteur de protéases, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif des troubles fonctionnels digestifs. L'invention concerne également une telle utilisation pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de l'hyperalgésie survenant dans le cadre de pathologies intestinales. L'inhibiteur de protéase est de préférence un inhibiteur de protéases intracoliques.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de traitement préventif ou curatif de pathologies intestinales caractérisées par un état d'hyperalgésie, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de protéases.
Les inhibiteurs de protéases semblent agir en contrôlant l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal. Ces inhibiteurs sont en particulier des inhibiteurs qui modulent la tension du cytosquelette de cellules épithéliales intestinales ou des inhibiteurs qui diminuent, voire bloquent, l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal.
L'invention repose ainsi sur l'utilisation d'inhibiteurs de protéases modulant la tension et l'état de contraction du cytosquelette des cellules de l'épithélium intestinal ou empêchant une ouverture trop importante des jonctions serrées qui aboutit à une hyperalgésie ou à une hypersensibilité à la distension de l'intestin.
Les protéines composant les jonctions serrées sont associées au cytosquelette des cellules qu'elles relient. Il est proposé dans le cadre de l'invention que la tension du cytosquelette ou l'ouverture des jonctions serrées puisse être modulée chez des sujets atteints de maladies ou désordres intestinaux pour agir de manière non destructrice et transitoire sur la perméabilité de leur epithelium intestinal. Ainsi, la contraction du cytosquelette doit favoriser l'ouverture des jonctions serrées, tandis qu'un relâchement du cytosquelette (ou qu'une inhibition de la contraction) doit favoriser la fermeture des jonctions. Il est possible également de moduler directement les jonctions serrées, en particulier sur les protéines les constituant, en diminuant ou en bloquant leur ouverture.
On utilise donc préférentiellement dans le cadre de l'invention des inhibiteurs de protéases qui modulent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales intestinales (notamment humaines) ou qui contrôlent l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal (notamment humain). Selon la condition à traiter, on utilise des inhibiteurs de protéases qui inhibent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales intestinales, ou qui activent ou favorisent celle-ci
Un inhibiteur de protéase est considéré comme modulant la tension du cytosquelette lorsqu'il module l'ouverture des jonctions serrées. Un effet inhibiteur de la contraction ou de la tension des filaments d'actine et/ou de myosine ne doit pas nécessairement être complet ou total, mais il suffit qu'il diminue la contraction ou la tension du cytosquelette suffisamment pour réduire l'ouverture des jonctions serrées.
La réduction de l'ouverture des jonctions serrées correspond préférentiellement à une diminution minimale d'environ 25%, avantageusement d'environ 30%, de façon encore plus préférée d'environ 50% de la pennéabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal. La perméabilité paracellulaire peut être mesurée à l'aide d'un marqueur tel que le 51Cr-EDTA lequel après son passage dans le sang est mesuré dans les urines pendant 24 heures (cf. : exemple 1). Les inhibiteurs de protéases utilisés sont de préférence les inhibiteurs agissant sur les sérine-protéases et/ou les métalloprotéases. De tels inhibiteurs sont particulièrement actifs pour réduire l'action des protéases bactériennes sur la perméabilité colique.
Les inhibiteurs de protéases utilisés sont avantageusement des molécules, qui peuvent être sous forme isolée ou sous forme de cocktail, de combinaison, d'extraits biologiques, etc. Ces molécules peuvent être synthétiques, semi- synthétiques ou biologiques, notamment d'origine animale, virale, végétale ou bactérienne.
On peut notamment citer comme inhibiteurs de protéases, les inhibiteurs sélectifs ou non sélectifs de serine-proteases [serpine et ses dérivés, Aprotinine, N-tosyl-L- phenylalanyl chlorométhyle cétone (TPCK), dichloroisocoumarine, nexin-1, AEBSF-HC1, Antipain, benzamidine, Leupeptine, TLCK, Ovomucoide, fluorure de phénylméthyle sulfonyle (PMSF), PEFABLOC® et les extraits de soja] et de métallo-protéases (Amastatine, Arphamenine, Bestatin, Diprotin A, Phosphoramidon) ainsi que les molécules non-spécifiques utilisées comme antiviraux (amprenavir, indinavir, lopinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir et atazanavir).
Les inhibiteurs de protéases peuvent être utilisés seuls ou en combinaisons et/ou en association avec d'autres agents actifs, comme par exemple d'autres substances actives utilisées dans le traitement du syndrome de l'intestin irritable.
Les inhibiteurs de protéases sont ainsi éventuellement utilisés en combinaison et/ou en association avec des composés qui diminuent ou bloquent l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal, notamment par modulation de la tension du cytosquelette, ou qui augmentent l'ouverture de celles-ci. L'activité de ces composés peut être directe ou indirecte, c'est-à-dire dirigée sur les constituants mêmes du cytosquelette ou sur des régulateurs de sa tension. Bien que non limitatif, on préfère les composés agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette. En outre, or±. préfère également des composés présentant une activité sélective sur la tension do cytosquelette, c'est-à-dire typiquement des composés qui n'affectent pas directement la structure des protéines constitutives des jonctions serrées. De même, l'inhibiteur de protéases selon l'invention, n'affecte de préférence pas directement la structure des protéines constitutives des jonctions serrées.
Différents types de composés peuvent être utilisés en combinaison avec des inhibiteurs de protéases dans le cadre de la présente demande. Ainsi, au sens, de l'invention, le terme « composé » doit être pris dans un sens large, c'est-à-dire comme désignant tout agent, substance, composition, condition, traitement ou procédé permettant de moduler l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium intestinal. Il s'agit avantageusement d'un agent (e.g., d'une molécule) ou d'une combinaison ou association d'agents. Des exemples de tels composés sont indiqués dans la demande de brevet international n° WO 03/077893. Il s'agit notamment d'inhibiteurs de la kinase de la chaîne légère de la myosine (MLC3 ). Un exemple particulier d'inhibiteurs sélectif de MLCK est le composé ML-7 {1- (5-iodonaphtalène-l-sulfonyl)-lH-hexιahydro-l,4-diazepine} (Makishima M. et al. FEBS Lett. 1991; 287:175). D'autres exemples de tels inhibiteurs sont notamment le composé ML-9 (Wilson DP.et al. T Biol Chem. 2001; 13: 165) ou d'autres non sélectifs: Wortmannin (Warashina A. Xife Sci 2000;13: 2587-93), H-7 (Piao Zf et al. Mol Cell Biol Res Commun 2001 4: 307-12) et KT 7692 (Warashina A. Life Sci 2000; 13: 2587-93). D'autres cibles agissant sur la tension du cytosquelette de composés utilisables en combinaison avec des inhibiteurs de protéases sont notamment les protéines de liaison à la myosine, telles que par exemple la cinguline, ou les molécules de jonction, telles que la cadherine-E, la catenine-α ou les desmosomes. La modulation de l' ctivité ou de l'expression de ces protéines permet de réguler la tension du cytosquelette, dans le cadre de la présente invention. On peut également utiliser des inhibiteurs de protéases combinés à des composés inhibiteurs de la synthèse de protéines ou autres molécules assurant la liaison entre les protéines du cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. Il est également possible d'utiliser dans le cadre de l'invention des inhibiteurs de kinases activées par les mitogènes (MAPKK), notamment de la kinase MEK1 ou de la kinase-PI3, tels que les composés PD098,059 {2-(Amino-3-methoxyphenyl)- 4H-l-benzoρyran-4-one}(Alessi et al. J.Biol.Chem.1995; 270, 27589) ou LY294002 {2-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-l(4H)-benzopyran-4-one} (Vlahos et al.J.Biol.Chem 1994;269: 5241). D'autres molécules utilisables pour réguler, de manière indirecte, la tension du cytosquelette, sont des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance hépatique (HGF), le facteur de croissance endothélial (EGF) ou certaines cytokines susceptibles d'être libérées par les immunocytes, telles que les interleukines-1, -4, -13, ou les facteurs tels que IGF-1 ou l'interféron gamma. Une autre approche permettant de réguler de manière indirecte la tension du cytosquelette repose sur l'utilisation du peptide GLP2 (« glucagon-like peptide 2 ») ou de ses dérivés, qui peuvent modifier la perméabilité de l'épithélium intestinal par un effet indirect sur la contraction du cytosquelette. De même, certaines molécules agissant sur des récepteurs situés au pôle apical des cellules épithéliales (ex: récepteurs aux protéinases; PAR-2) peuvent agir indirectement sur le cytosquelette. D'autres agents actifs sont par exemple les composés anti- cholinergiques, les prokinétiques, les anti-diarrhéiques, les modificateurs de la motricité digestive, etc. Ces différents agents peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.
Un autre objet de l'invention réside ainsi dans un produit, un cocktail ou une association pharmaceutique comprenant au moins un inhibiteur de protéases et au moins un autre agent actif sélectionné parmi les composés anti-cholinergiques, les substances prokinétiques, les anti-diarrhéiques, les laxatifs ou les modificateurs de la motricité, de la viscéro-sensibilité (ou de la sensibilité digestive), en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps. La présente invention peut être utilisée pour le traitement ou la prise en charge de pathologies ou désordres du système digestif caractérisés par un état d'hyperalgésie, notamment de troubles fonctionnels intestinaux, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), d'intolérances alimentaires (allergies, conditionnements, etc.) caractérisées par une douleur viscérale chronique. Elle est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif des hyperalgésies et en particulier du syndrome de l'intestin irritable (SU) quelque soit sa forme (constipation, diarrhée ou une combinaison des deux), mais également des douleurs viscérales chroniques n'entrant pas dans le cadre du SU, telles que les douleurs abdominales fonctionnelles sans trouble de l'élimination fécale (F APS : Functional Abdominal Pain) et les douleurs liées aux intolérances alimentaires et à la maladie cœliaque. Elle est utilisable de manière préventive chez des sujets présentant des prédispositions ou une sensibilité à ce type de désordres, ou de manière curative, par exemple lors de crises ou sur des périodes plus longues. Les compositions et méthodes de l'invention permettent de réduire la souffrance des sujets, d'atténuer les symptômes ou la cause de ces désordres.
La présente invention démontre en effet de façon surprenante que la suppression de l'augmentation de la perméabilité paracellulaire associée à l'activation des récepteurs PAR (par exemple le récepteur PAR-2) empêche l'apparition de l'hyperalgie viscérale.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de protéases tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler, notamment à réduire, la perméabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal chez des sujets atteints de maladies intestinales caractérisées par un état d'hyperalgésie, notamment de maladies inflammatoires chroniques caractérisées par une accumulation, dans la couche sous-muqueuse, d'immunocytes (par exemple de mastocytes et/ou de cellules entérochromaffînes), par une sensibilité accrue des mécanorécepteurs pariétaux et éventuellement par une infiltration de bactéries du colon dans la couche sous-muqueuse, par exemple les hyperalgésies et notamment le syndrome de l'intestin irritable.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de protéases tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes, pathogènes et/ou molécules chimiques chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies fonctionneslles intestinales, notamment aux affections intestinales caractérisées par une accumulation, dans la couche sous-muqueuse, d'immunocytes, notamment par exemple de mastocytes et/ou de cellules entérochromaffînes, par une sensibilité accrue des mécanorécepteurs pariétaux et éventuellement par une infiltration de bactéries du colon dans la couche sous-muqueuse, par exemple les hyperalgésies et notamment le syndrome de l'intestin irritable.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d 'un inhibiteur de protéases tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans la couche sous-muqueuse de sujets atteints d'une pathologie fonctionnelle intestinale, notamment d'une affection intestinale induisant une hyperalgésie viscérale, par exemple le syndrome de l'intestin irritable, caractérisée par une accumulation, dans la couche sous-muqueuse d'immunoc^ytes, notamment de mastocytes et/ou de cellules entérochromaffînes, par une sensibilité accrue des mécanorécepteurs pariétaux et éventuellement par une infiltration de bactéries du colon dans la couche sous-muqueuse.
L'invention est également relative à des méthodes de traitement des conditions indiquées ci-dessus, comprenant l'administration à un sujet atteint d'une pathologie intestinale ou sensible aux pathologies intestinales, d' un inhibiteur de protéases ou traitement tel que défini ci-avant. De préférence., l'inhibiteur de protéases ou le traitement est administré dans une dose efficace pour réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal et/ou pour réduire la sensibilité à la douleur et/ou pour réduire la migration transépithéliale d' allergènes, de toxines, d'irritants ou de microorganismes et ainsi l'accumulation d'immunocytes dans la couche sous-muqueuse de l'intestin.
L'inhibiteur de protéases peut être administré par différentes voies et sous différentes formes. Ainsi, l'inhibiteur de protéases peut être sous forme liquide ou solide, typiquement sous forme de comprimé, gélule, capsule, ampoule ou soluté buvable, solution injectable, etc. On préfère des composés formulés sous une forme administrable par voie orale (solutés buvables, comprimés, ampoules, gélule, capsule, sirops, etc.) ou rectale (suppositoire). Le conditionnement en capsule ou gélule libérant son contenu par digestion microbienne dans le colon est particulièrement préféré, lorsque cela est possible. Bien entendu, d'autres formes d'administration sont possibles, comme des injections (intrapéritonéale, intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, etc.), des pâtes, gels, etc.
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un inhibiteur de protéases et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, ladite composition étant formulée préférentiellement pour une administration par voie orale ou rectale. De préférence, la composition se présente sous forme de suppositoire, ou sous forme de capsule ou gélule libérant son contenu par digestion microbienne dans le colon.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Influence de doses croissantes d'un peptide activateur des récepteurs PAR-2 (SLIGRL) sur l'absorption d'une macromolécule (51Cr-EDTA) évaluée par le pourcentage retrouvé au niveau des urines collectées pendant 24h chez le rat.
Figure 2 : Perméabilité paracellulaire colique chez la souris. Influence de différents inhibiteurs de protéases bactériennes (moyenne ± SD ; n=12) : Cocktail d'inhibiteurs de protéase (1/2 cachet) Cystéine protéase inhibiteur ( 1 OOμg/ml)
Serine protéase inhibiteur (100 et 500 μg/ml) Matrice Métallo Protéase inhibiteurs (100 μg/ml)
Figure 3 : Modifications de la perméabilité paracellulaire colique engendrée par la perfusion intraluminale de trypsine et de surnageant de contenu colique chez la souris normale (témoin) et après un traitement de 10 jours par un cocktail d'antibiotiques (Néomycine : 2mk/kg/j + ampicilline : lmg/kg/j) administré par voie orale chez la souris (moyenne ± SD ; n =12).
Figure 4 : Diminution de la sensibilité rectale à la distension par la perfusion intracolique d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases chez le rat (moyenne ± écart- type ; n=8).
Figure 5 : Influence de la perfusion intracolique de trypsine sur la sensibilité rectale à la distension chez le rat (moyenne ± ESM ; n=8).
EXEMPLES
Exemple 1 : Réduction de l'hyperalgésie rectale à l'aide d'un bloqueur des jonctions serrées. L'épithélium intestinal possède des structures de liaison des cellules épithéliales qui assurent un passage contrôlé des immunocytes dans la couche sous-muqueuse de l'intestin. Cet exemple montre que certaines molécules connues pour leur effet d'augmentation de la perméabilité paracellulaire au niveau intestinal tel que le SLIGRL favorisent l'accumulation d'immunocytes dans la sous-muqueuse intestinale (mastocytes, cellules entérochromaffînes) et que cet effet peut être prévenu (e.g., inhibé, réduit) par un traitement intracolique impliquant un bloqueur des jonctions serrées.
Pour réaliser cette étude, six lots de 8 rats mâles Wistar (200-250 g) ont été utilisés. Les animaux ont été munis d'un cathéter intracolique placé à demeure au niveau du côlon proximal (à 3 cm de la jonction caeco-colique). Au cours de ces essais, 4 lots de rats ont été perfusés par voie intracolique durant lOh avec une solution de 51Cr - EDTA (0.5 μc/h). Les animaux étant placés dans des cages individuelles, l'urine totale de 24h a été collectée et la mesure de sa radioactivité a permit d'évaluer la perméabilité de la muqueuse colique au 51Cr -EDTA. Des doses croissantes d'un peptide activateur du PAR-2 (SLIGRL) ont été injectées dans la lumière colique (lots 2, 3 et 4) au temps t = 0 (début de perfusion du 51Cr - EDTA) aux doses de 0,05, 0,2 et 0,5 mg/rat, le lot 1 recevant le solvant. La figure n°l montre l'augmentation dose-dépendante de la perméabilité au 51Cr-EDTA induite par le SLIGRL montrant son effet d'augmentation de la perméabilité paracellulaire.
Exemple 2 : Perméabilité paracellulaire colique chez la souris. Influence de différents inhibiteurs de protéases bactériennes.
Six lots de 10 souris Swiss mâles (25-30 g) ont été utilisés pour cette étude. Les animaux ont été perfusés pendant 5 heures par voie intracolique (250 μl/h ) à l'aide d'un cathéter introduit par voie rectale et fixé à la base de la queue, avec les différentes solutions d'inhibiteurs de protéases et perfusion ajoutée de 51Cr-EDTA de 3 à 5 heures (Fig.2). A t=5heures, les animaux sont abattus et après prélèvement du colon, la radioactivité totale retrouvée dans le corps témoigne de la perméabilité paracellulaire. Celle-ci apparaît significativement réduite après perfusion du cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche ref : 1 873 580, EDTA- fîee), d'un inhibiteur de sérine-protéases (Aprotinin Sigma Al 153) et d'un inhibiteur non-spécifique de matricemétallo-protéases (galardin Sigma : M5939.) (Fig.2)
Exemple 3 : Modifications de la perméabilité paracellulaire colique chez la souris engendrée par la perfusion intraluminale de trypsine et de surnageant de contenu colique et après un traitement par un cocktail d'antibiotiques.
Des lots de 10 souris mâle Swiss (Janvier- France) pesant 25-30g ont été utilisés dans cette expérience. En condition basale, les effets sur la perméabilité paracellulaire colique de la perfusion intracolique de trypsine (50μl, 600U) et de surnageant de contenu colique prélevé sur des souris contrôle perfusées par voie intracolique (250μl/h) pendant 3 heures un jour (Jl) ou 2 jours consécutifs (J2) ont été mesurés. Les mêmes perfusions ont ensuite été réitérées après 12 jours d'un traitement oral par un cocktail d'antibiotiques (néomycine : 2mg/kg/j+ ampicilline : lmg/kg/j). Les résultats montrent 1) que le traitement aux antibiotiques diminue la perméabilité colique, 2) que l'augmentation de la perméabilité induite par la trypsine disparaît après traitement antibiotique induisant probablement une disparition des récepteurs épithéliaux aux protéases et 3) que chez ces animaux, la perfusion de surnageant colique augmente cette perméabilité au deuxième jour (Fig.3).
Exemple 4 : Diminution de la sensibilité rectale à la distension par la perfusion intracolique d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases chez le rat. Dans cette série d'essais, 3 lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont été soumis à un protocole de distension rectale de volumes croissants (0,4 ml) de 0 à 1,6 ml réalisées à l'aide d'une sonde à embolectomie (FORGATY®). Les animaux ont été équipés au préalable d'électrodes implantées dans les muscles striés de l'abdomen permettant l'enregistrement électromyographiques des crampes abdominales reconnues comme un critère de douleur.
Au temps t=0 les animaux ont reçu, par voie intracolique, une perfusion pendant 12 heures du cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche réf. : 1 873 580) (2 cachets - 0.5ml/h) ou de son solvant NaCl 0.9%. A la fin de la perfusion, les animaux sont soumis au protocole de distension rectale. Par rapport au lot témoin, la perfusion d'inhibiteurs de protéases provoque une diminution significative de la réponse abdominale pour les volumes de distension de 0,8, 1,2 et 1,6 ml (Fig. 4) montrant ainsi que les protéases libérées par la microflore dans la lumière colique participent à la détermination de l'état basai de sensibilité rectocolique à la distension (Fig.4).
Exemple 5 : Influence de la perfusion intracolique de trypsine sur la sensibilité rectale à la distension chez le rat
Dans cette série d'essais 2 lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont été soumis à un protocole de distension rectale suivant des étapes croissantes (0,4 ml) de 0 à 1,6 ml réalisées à l'aide d'une sonde à embolectomie (FORGATY®). Les animaux ont été équipés au préalable d'électrodes implantées dans les muscles striés de l'abdomen permettant l'enregistrement électromyographiques des crampes abdominales reconnues comme un critère de douleur. Au temps t=0, les animaux ont reçus, par voie intracolique, la trypsine (400 unités) un activateur spécifique des récepteurs PAR-2, à la dose de 20 unités (lot 1) ou son solvant (lot 2). Au temps t = lOh, après l'administration intracolique de trypsine, les animaux sont soumis au protocole de distension rectale. Par rapport au lot témoin, la trypsine provoque une augmentation significative de la réponse abdominale pour les volumes de distension de 0,8, 1,2 et 1,6 ml (Fig. 5) montrant ainsi qu'une augmentation de concentration intracolique en protéases augmente la sensibilité colique à la distension.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins un inhibiteur de protéases, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif des troubles fonctionnels digestifs (TFD).
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de protéases est un inhibiteur de protéase intracolique.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'inhibiteur est un inhibiteur de sérine-protéases ou un inhibiteur de métalloprotéinases.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur de sérine-protéases est choisi parmi la serpine et ses dérivés, l'Aprotinine, la N-tosyl-
L-phenylalanyl chlorométhyle cétone, la dichloroisocoumarine, la nexin-1, le AEBSF-HC1, l'Antipain, la benzamidine, la Leupeptine, le TLCK, l'Ovomucoide, le fluorure de phénylméthyle sulfonyle , le PEFABLOC® et les extraits de soja.
5. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur de métalloprotéinases est choisi parmi l'Amastatine, l'Arphamenine, la Bestatin, la Diprotin A et le Phosphoramidon.
6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de protéases est choisi parmi l'amprenavir, l'indinavir, le lopinavir, le ritonavir, le saquinavir, le nelfinavir et l'atazanavir.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal chez des sujets atteints de maladies fonctionnelles intestinales caractérisées par un état d'hyperalgésie.
8. Utilisation selon la revendication 7, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithélium intestinal chez des sujets atteints de maladies fonctionnelles intestinales caractérisées par un état d'hyperalgésie.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilité à la douleur chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies fonctionnelles intestinales caractérisées par un état d'hyperalgésie.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif des troubles fonctionnels intestinaux (TFI).
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que les troubles fonctionnels intestinaux sont choisis parmi le syndrome de l'intestin irritable (SU), les douleurs abdominales fonctionnelles sans trouble de l'élimination fécale et les douleurs liées aux intolérances alimentaires.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'inhibiteur est administré par voie orale ou rectale.
13. Utilisation d'au moins un inhibiteur de protéases, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de l'hyperalgésie survenant dans le cadre de pathologies intestinales.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'inhibiteur de protéases est tel que défini à l'une des revendications 2, 3, 4, 5 et 6.
15. Produit pharmaceutique comprenant au moins un inhibiteur de protéases et au moins un autre agent actif sélectionné parmi les composés anti-cholinergiques, les prokinétiques, les anti-diarrhéiques, les laxatifs, les modificateurs de la motricité ou de la viscéro-sensibilité, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
16. Produit selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'inhibiteur de protéase est choisi parmi un inhibiteur de sérine-protéases et un inhibiteur de métallo-protéases.
17. Produit pharmaceutique selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une capsule ou d'une gélule libérant son contenu par digestion microbienne dans le colon.
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