WO2005074988A1 - 神経細胞分化誘導剤 - Google Patents

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WO2005074988A1
WO2005074988A1 PCT/JP2005/002106 JP2005002106W WO2005074988A1 WO 2005074988 A1 WO2005074988 A1 WO 2005074988A1 JP 2005002106 W JP2005002106 W JP 2005002106W WO 2005074988 A1 WO2005074988 A1 WO 2005074988A1
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synoviolin
nucleic acid
seq
gene
decoy nucleic
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PCT/JP2005/002106
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English (en)
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Toshihiro Nakajima
Satoshi Yamasaki
Naoko Yagishita
Daijuro Tonaki
Yukihiro Kato
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Locomogene, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a nerve cell differentiation inducer containing a Synoviolin expression inhibitor.
  • Synoviolin is a protein found as a membrane protein present in synovial cells derived from rheumatic patients (WO02 / 05207). Synoviolin contributes to normal bone formation or limb development, as studies using genetically modified animals have shown that these factors are directly involved in bone and joint development and the development of arthropathy. It is considered to be a protein.
  • Synoviolin is a ubiquitin ligase involved in endoplasmic reticulum-associated proteolysis (ERAD). Recently, it has been revealed that genes responsible for neurodegenerative diseases such as familial Alzheimer's disease and Parkinson's disease are involved in ERAD (Nakagawa T, ZuH, Morishima N, LiE, XuJ, Yankner BA, Yuan J. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature. 2000 Jan 6; 403 (6765): 98-103.).
  • Alzheimer's disease is one of the diseases of great interest in today's aging society. The most important feature is that senile plaques, or fibrous ⁇ -amyloid protein (A / 3) deposits, are observed in the brain.
  • a / 3 fibrous ⁇ -amyloid protein
  • An object of the present invention is to provide a drug useful for treating a neurological disease, particularly Alzheimer's disease or Parkinson's disease, peripheral neuropathy, or spinal cord injury.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that suppressing the expression of synoviolin induces differentiation of nerve cells, leading to the completion of the present invention. 6
  • the present invention is as follows.
  • (1) 1 neuronal cell differentiation inducer comprising the expression inhibitor of Synoviolin.
  • Examples of the Synoviolin expression inhibitor include siRNA or shRNA against a Synoviolin encoding gene (SEQ ID NO: 1 or 2), a decoy nucleic acid that inhibits the Synoviolin gene promoter activity, or a Synoviolin encoding gene (SEQ ID NO: 1 or 2). 2).
  • the siRNA is a partial sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 3) or a partial sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (for example, the sequence shown in SEQ ID NO: 4) Can be targeted.
  • decoy nucleic acid examples include the decoy nucleic acids shown in the following (a) or (b).
  • decoy nucleic acid may be a decoy nucleic acid shown in the following (a) or (b).
  • a decoy nucleic acid comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, and having a function of inhibiting the promoter activity of the synopiolin gene
  • the decoy nucleic acid inhibits synoviolin expression by inhibiting the promoter activity of the synoviolin gene.
  • the antisense oligonucleotide can target a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the agent for inducing neuronal differentiation of the present invention is used for treating nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, peripheral neuropathy or spinal cord injury.
  • FIG. 1 is a diagram showing that neuronal cell differentiation was induced by inhibiting the expression of Synoviolin with siRNA.
  • the present invention aimed to clarify the relationship of Synoviolin to neurodegenerative diseases, and first analyzed the function of Synoviolin in nerve cells. As a result, they found that inhibition of synoviolin expression induces cell differentiation in nerve cells.
  • the differentiation of a nerve cell means either or both that a certain cell undergoes a morphological change into a nerve cell and / or differentiates until it can function as a nerve cell. When certain cells show a neuronal-like morphological change and / or functional change, it is determined that the differentiation of the neuron has been induced.
  • the origin or type of nerve cells is not particularly limited, and may be human-derived cells (human patient-derived cells, healthy human-derived cells), or rat or mouse-derived cells. Examples of cell types include undifferentiated neurons, stem cells, established cells, and the like. Stem cells can be used for the treatment of nervous system diseases (regenerative medicine), etc., by explanting them and explanting them into nerve cells ex vivo. Examples of cell lines include rat PC-12 cells, mouse Neuro2a cells, and human NB-1 cells. Inhibition of Synoviolin expression>
  • RNA interference RNA interference
  • decoy nucleic acid or antisense oligonucleotide can be used.
  • RNAi can be induced by designing and synthesizing siRNA (sniall interfering: NA) for the synoviolin gene and introducing it into cells.
  • siRNA nervel interfering: NA
  • RNAi is a phenomenon in which dsRNA (double-strand RNA) binds specifically and selectively to a target gene, and the expression of the target gene is efficiently inhibited by cleaving the target gene.
  • dsRNA double-strand RNA
  • the siRNA can be designed, for example, as follows.
  • the gene is not particularly limited as long as it encodes synoviolin, and any arbitrary region can be used as a candidate. For example, in the case of humans,
  • GenBank Accession number AB024690 SEQ ID NO: 1
  • NM_028769 SEQ ID NO: 2
  • a sequence starting with AA is selected from the selected region, and the length of the sequence is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the sequence should have a GC content of, for example, 40 to 70%.
  • a DNA containing the following base sequence can be used as a target sequence of the siRNA.
  • Synoviolin siRNAl CGT TCC TGG TAC GCC GTC A (SEQ ID NO: 3)
  • Synoviolin siRNA2 GAAATG GTG ACT GGT GCT A (SEQ ID NO: 4)
  • Synoviolin siRNAl has the 640-658th region of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Synoviolin siRNA2 is a sequence targeting the region from position 1373 to position 1391 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • shRNA is called short hairpin RNA (shoi't hairpin RNA), which has a stem-loop structure because a part of the single strand forms a complementary strand with the other. RNA molecule.
  • shRNAs can be designed so that part of them form a stem-loop structure. For example, if the sequence of a certain region is sequence A and the complementary strand to sequence A is sequence B, it is assumed that these sequences are present in one RNA strand in the order of sequence A, spacer, and sequence B. And design the total length to be 45-60 bases.
  • Sequence A is a sequence of a partial region of the target Synoviolin gene (SEQ ID NO: 1 or 2), and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of sequence A is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • the decoy nucleic acid of the present invention means a short "decoy nucleic acid" containing a binding site of a transcription factor. When this nucleic acid is introduced into cells, the binding of the transcription factor to the nucleic acid competitively inhibits the binding of the transcription factor to the original genomic binding site, and as a result, the expression of the transcription factor is suppressed. It has a function to be performed.
  • a decoy nucleic acid is a nucleic acid or an analog thereof, comprising at least one nucleic acid capable of binding a transcription factor.
  • decoy nucleic acids of the present invention include, for example, a nucleic acid capable of binding to a transcription factor binding to EBS, which is an Ets binding site responsible for constitutive expression in the Synoviolin promoter, and a transcription factor binding site of a promoter, ABS ( A nucleic acid capable of binding to a transcription factor that binds to an AML binding site), a nucleic acid capable of binding to a transcription factor that binds to SBS (Spl binding site) that is a transcription factor binding site of a promoter, an oligonucleotide containing a complement thereof, These mutants, or nucleic acids containing these in the molecule, and the like are included.
  • the decoy nucleic acid can be designed as a single strand or a double strand including its complementary strand based on the sequence of EBS, ABS or SBS.
  • the length is not particularly limited, and is 15 to 60 bases, preferably 20 to 30 bases.
  • a nucleic acid capable of binding to a transcription factor that binds to EBS and / or its complementary strand (SEQ ID NO: 7) can be preferably used as a decoy nucleic acid.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or a nucleic acid modified within the nucleic acid and / or Alternatively, it may contain a pseudonucleic acid. Further, these nucleic acids, mutants thereof, or nucleic acids containing these in a molecule may be single-stranded or double-stranded, and may be circular or linear. A mutant is defined as a nucleotide sequence in which one or several (e.g., 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 2, etc.) bases of the decoy nucleic acid sequence are deleted, substituted, or added. And a nucleic acid having a function of inhibiting the promoter activity of the Synoviolin gene, that is, a function of binding to a transcription factor. It may be a nucleic acid containing one or more of the above base sequences.
  • the decoy nucleic acid used in the present invention can be produced using a chemical synthesis method or a biochemical synthesis method known in the art.
  • a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used.
  • a PCR method or a gene amplification method using a cloning vector can be used.
  • the desired nucleic acid may be produced by cleaving the nucleic acid obtained by these methods using a restriction enzyme or the like and ligating the nucleic acid using a DNA ligase.
  • a method for producing a decoy nucleic acid mutant can also be synthesized using a method known in the art, for example, by site-directed mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis methods are well known in the art, and commercially available kits such as GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (utan-, Mutan-Super Express Km, etc.) (Yukara Bio Inc.) can be used.
  • luciferase atssay For the analysis of the transcription activity of the promoter when a decoy nucleic acid is used, luciferase atssay, gel shift atssay, CAT atssay, etc., which are generally performed, can be employed. Kits for performing these assays are also commercially available (eg, romega dual luciferase assay kit).
  • a firefly luciferase gene is linked as a reporter upstream of the transcription start site of the target gene.
  • the cytomegalovirus (CMV) / 3 galactosidase (/ 3-gal) gene is linked downstream of the promoter as a reporter.
  • the vector may be simultaneously introduced into the cells.
  • the calcium phosphate method or the like can be employed.
  • the cells into which the vector has been introduced are collected after culturing for a predetermined time, and the cells are disrupted by freeze-thawing or the like, and then the luciferase and j8 galactosidase activities are measured using a fixed amount of cell extract.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention refers to a nucleotide having a sequence that is complementary to a base sequence encoding a siioviolin gene.
  • this antisense oligonucleotide forms a hybrid with all or a part of the base sequence encoding the Synoviolin gene, it can inhibit the expression of the Synoviolin gene and efficiently inhibit the synthesis of Synoviolin protein.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention hybridizes with all or a part of the RNA of the synoviolin gene of the present invention or all or a part of the synoviolin-related RNA of the present invention, the synthesis or function of the above RNA is inhibited, or The expression of the Synoviolin gene of the present invention can be regulated and controlled through the interaction with Synoviolin-related RNA.
  • preferred antisense oligonucleotides of the present invention include, for example, the 5′-end hairpin loop, 5′-end 6-basepair repeat, 5′-end untranslated region, translation initiation codon, and protein coding region of the synoviolin gene of the present invention.
  • an antisense oligonucleotide which directs RNA degradation by RNaseH a sequence complementary to the base sequence encoding the synoviolin gene of the present invention including introns is preferable.
  • the antisense oligonucleotide can be designed as a single strand or a double strand containing its complementary strand, or as a DNA: RNA hybrid, based on the above sequence.
  • the length is not particularly limited, and is usually 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases. 2106
  • the antisense oligonucleotides of the present invention may be DNA; NA, or may include modified nucleic acids and / or pseudonucleic acids within the nucleic acids.
  • nucleic acids, mutants thereof, or nucleic acids containing these in a molecule may be single-stranded or double-stranded.
  • a mutant is defined as a nucleotide sequence in which one or several (e.g., 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 2, etc.) bases of the above sequence are deleted, substituted, or added.
  • the synthesis, mutagenesis, modification, and the like of the antisense oligonucleotide used in the present invention can be performed in the same manner as described in the section of the decoy nucleic acid.
  • the inhibitory activity of the antisense oligonucleotide can be examined using a transformant into which the antisense oligonucleotide of the present invention has been introduced, and in vivo and in vitro gene expression systems using the transformant.
  • Pharmaceutical composition of the present invention >
  • shRNA or siRNA, decoy nucleic acid, and antisense oligonucleotide prepared in the present invention are substances that inhibit the expression of synopiolin, and are pharmaceutical compositions aimed at inducing differentiation of nerve cells (gene therapeutic agents for nervous system diseases). Can be used as
  • the pharmaceutical composition of the present invention When used as a gene therapy agent for nervous system diseases, it is applied to the central nervous system and peripheral nerves such as the brain (cerebrum, diencephalon, midbrain, and cerebellum), medulla oblongata, and spinal cord. You.
  • Nervous system diseases include, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, peripheral neuropathy, spinal cord injury and the like.
  • the above nervous system diseases may be used alone or in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used in such a form that shRNA or siRNA, decoy nucleic acid, or antisense oligonucleotide is taken into cells of an affected part or cells of a target tissue.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be oral or parenteral.
  • they can be administered in appropriate dosage forms, such as tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions.
  • parenteral administration examples include a pulmonary dosage form (for example, using a nephrizer), a nasal dosage form, a transdermal dosage form (eg, an ointment, a cream), an injection form, and the like.
  • an injectable form for example, it can be administered directly or indirectly to the diseased site in whole or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection or the like.
  • a method of directly administering the pharmaceutical composition of the present invention by injection and a method of administering a vector into which a nucleic acid has been incorporated can be mentioned.
  • the above vectors include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, a lentivirus vector, and the like. Efficiency can be improved by using these virus vectors. Can be administered well.
  • a commercially available gene transfer kit for example, AdenoExpress: Clontech
  • AdenoExpress Clontech
  • the pharmaceutical composition of the present invention into phospholipid vesicles such as ribosomes and administer the vesicles.
  • the endoplasmic reticulum retaining the pharmaceutical composition of the present invention is introduced into predetermined cells by the lipofection method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, from a vein or an artery. It can also be administered locally to the brain and the like. Phospholipids, cholesterols, nitrogen lipids, and the like are used as lipids for forming the liposome structure.
  • Phospholipids are generally preferable, and phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, and phosphatidyl are generally used.
  • Examples include natural phospholipids such as ethanolamine, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, and lysolecithin, and hydrogenated products thereof according to a standard method.
  • the method for producing the ribosome is not particularly limited as long as the siRNA or shRNA, decoy nucleic acid or antisense oligonucleotide is retained, and a conventional method such as a reverse phase evaporation method (Szoka, F et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 (1980)), ether injection method (Deamer, DW: Ann. ⁇ . ⁇ . Acad. Sci "Vol. 308 250 (1978)), surfactant method (Bnmner, J ⁇ ) ,: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 455 322 (1976)) and the like.
  • a reverse phase evaporation method Szoka, F et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 (1980)
  • ether injection method Deamer, DW: Ann. ⁇ . ⁇ . Acad. Sci "Vol. 308 250 (1978)
  • surfactant method B
  • lipids including phospholipids can be used alone, but two or more lipids can be used in combination.
  • a compound having an atomic group having a positive group such as ethanolamine-choline in the molecule the binding rate of the electrically negative decoy nucleic acid can be increased.
  • additives generally known as ribosome formation additives such as cholesterols, stearylamine, and tocopherol, can also be used.
  • the ribosomes obtained in this manner include membrane fusion promoters such as Sendai virus, inactivated Sendai virus, and Senda virus in order to promote the uptake of the diseased cells or target tissues into the cells.
  • a membrane fusion-promoting protein purified from polyethylene, polyethylene glycol, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated according to a conventional method, and may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such carriers may be additives, such as water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, propyloxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate.
  • Water-soluble dextran carboxymethylsulfuric acid, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin , Stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the above-mentioned additives may be used alone or appropriately in combination according to the dosage form of the therapeutic agent of the present invention.
  • 05 002106 Selected in combination.
  • the purified deco nucleic acid is dissolved in a solvent (eg, physiological saline, buffer, glucose solution, etc.) and
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin and the like can be used. Alternatively, it may be freeze-dried to give a dosage form that dissolves before use.
  • the lyophilization excipient include the following. That is, saccharides such as mannitol, glucose, lactose, corn, wheat, starch derived from other plants, cellulose such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose or carboxymethylcellulose sodium, rubber such as arabia gum and tragacanth gum, Gelatin, collagen, etc.
  • disintegrating or solubilizing agents such as cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof (eg, sodium alginate) can be used.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptoms, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • the administration method is appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
  • the effective dose is the amount of siRNA or shRNA, decoy nucleic acid, or antisense oligonucleotide that reduces the symptoms or condition of the disease.
  • the therapeutic effect and toxicity are determined by standard pharmaceutical procedures in cell culture or laboratory animals, such as ED50 (therapeutically effective dose in 50% of the population) or LD50 (50% of the population). (The dose that is lethal to the contrary).
  • the dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ED50 / LD50.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 1 g / kg of body weight at a time, and preferably from 1 to 10 g / Lg.
  • the above therapeutic agents are not limited to these doses.
  • projecting Azukaryou when administered adenovirus is 10 6 ⁇ 10i 3 or so per day, administered in one week 1-8 week intervals.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these dosages.
  • Neuro2a cells are cells that have the ability to elongate axons by removing serum and adding drugs, and have the potential for differentiation.
  • Neuro2a cells using Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM ) to 10% Fetal Calf Serum (FCS) , culture land supplemented with 1% penicillin / streptomycin, 37 ° (:., Were cultured in 5% C0 2 incubator Nem 'O2A cells were seeded (4 X 104 C ells / 60mm dish), and cultured for 24 hours.
  • DMEM Doulbecco's modified Eagle's Medium
  • FCS Fetal Calf Serum
  • siRNA short interfering RNA
  • Shinopiorin SEQ ID NO: 1 or 2
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the final concentration of siRNA was ⁇ , and Oligofectamine TM Reagent was used at 8 / L.
  • the medium was a serum-free, anti-inert substance medium, and 4 hours after transfection, 10% FCS was added and the culture was continued.
  • the target sequences for producing siRNA are as follows.
  • Synoviolin siRNAl CGT TCC TGG TAG GCC GTC A (SEQ ID NO: 3)
  • Synoviolin siRNA2 GAAATG GTG ACT GGT GCT A (SEQ ID NO: 4)
  • GFP siRNA GGC TAC GTC CAG GAG CGC A (SEQ ID NO: 5)
  • a nerve cell differentiation inducer containing a Synoviolin expression inhibitor may include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, peripheral neuropathy Or Sequence Listing free text that is useful as a therapeutic drug for nervous system diseases such as spinal cord injury
  • SEQ ID NO: 5 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 6 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 synthetic DNA

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Abstract

本発明は、神経疾患、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、末梢神経障害又は脊髄損傷を治療するために有用な薬剤である、シノビオリンの発現阻害物質を含む神経細胞分化誘導剤を提供する。シノビオリンの発現抑制物質としては、例えばシノビオリンをコードする遺伝子（配列番号１又は２）に対するsiRNA若しくはshRNA、シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子と結合してプロモーター活性を阻害するデコイ核酸又はシノビオリンをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明の神経細胞分化誘導剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、末梢神経障害又は脊髄損傷などの神経系疾患を治療するために使用される。

Description

明 細 書 神経細胞分化誘導剤 技術分野
本発明は、 シノビオリンの発現阻害物質を含む神経細胞分化誘導剤に関する。 背景技術
シノビオリンは、 リウマチ患者由来滑膜細胞に存在する膜タンパク質として発 見されたタンパク質である （WO02/05207) 。 遺伝子改変動物を用いた研究によ り、 骨 ·関節の発生および関節症の発症に同因子が直接関与することが明らかと なったことから、 シノビオリンは正常な骨形成又は四肢の発達に貢献するタンパ ク質であると考えられる。
また、 シノビオリン ( Synoviolin) は小胞体関連タンパク質分解 (ERAD)に関 与するュビキチンリガーゼである。 近年、 家族性アルツハイマー病、 パーキンソ ン病等の神経変性疾患の原因遺伝子が ERAD に関与することが明らかにされた (Nakagawa T, Z u H, Morishima N, Li E, Xu J, Yankner BA, Yuan J. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature. 2000 Jan 6； 403(6765)： 98-103.) 。
アルツハイマー病は、 高齢化が進む現代において高い関心が払われている疾患 の一つである。 その最も重要な特徴は、 脳に老人斑、 すなわち繊維状の^ -アミ ロイドタンパク質 （A /3 ) の沈着が観察されることである。
しかし、 シノビォリンの神経変性疾患への関連は、 まだ明らかではない。 発明の開示
本発明は、 神経疾患、 特にアルツハイマー病又はパーキンソン病、 末梢神経障 害、 脊髄損傷を治療するために有用な薬剤を提供することを目的とする。 本発明 者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、 シノビォリンの発現を 抑制すると、 神経細胞が分化誘導されることを見出し、 本発明を完成するに至つ 6 た。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) 1シノビオリンの発現阻害物質を含む神経細胞分化誘導剤。
シノビオリンの発現抑制物質としては、 例えばシノビオリンをコードする遺伝 子 （配列番号 1又は 2 ) に対する siRNA 若しくは shRNA、 シノビオリン遺伝 子のプロモーター活性を阻害するデコイ核酸又はシノビオリンをコードする遺伝 子 （配列番号 1又は 2 ) に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。 siRNA は、 配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列 （例えば配列番号 3 に示す配列） 、 あるいは配列番号 2に示す塩基配列のうち一部の配列 （例えば配 列番号 4に示す配列） を標的とすることができる。
デコイ核酸としては、 例えば、 以下の （a) 又は （b) に示すデコイ核酸が挙 げられる。
(a) 配列番号 6若しくは 7に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 6若しくは 7に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基 が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シノビオリン遺伝子 のプロモー夕一活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
また、 デコイ核酸は、 以下の （a) 又は （b) に示すデコイ核酸でもよい。
(a) 配列番号 6及び 7に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 6及び 7に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠 失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シノピオリン遺伝子 のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
上記デコイ核酸は、 シノビオリン遺伝子のプロモータ一活性を阻害することに よりシノビオリンの発現を阻害するものである。
ァンチセンスォリゴヌクレオチドは、 配列番号 1又は配列番号 2に示す塩基配 列のうち一部の配列を標的とすることができる。
本発明の神経細胞分化誘導剤は、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 末梢神 経障害又は脊髄損傷などの神経系疾患を治療するために使用される。
(2) シノビォリンの発現を抑制することを特徴とする、 神経細胞の分化を誘導す る方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 シノビオリンの発現を siRNAで阻害することにより、 神経細胞分化が 誘導されたことを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 シノビオリンの神経変性疾患への関連を明らかにすることを目的と し、 まず神経細胞におけるシノピオリンの機能解析を行った。 その結果、 シノビ ォリンの発現を阻害すると、 神経細胞におけるによる細胞分化が誘導されること を見出した。
<神経細胞の分化 >
神経細胞の分化とは、 ある種の細胞が神経細胞への形態変化をすること、 及び 神経細胞として機能し得るようになるまで分化することのいずれか又は両者を意 味する。 ある種の細胞が、 神経細胞様の形態変化及び/又は機能変化を示したと きに、 神経細胞の分化が誘導されたと判断する。 神経細胞の由来又は種類等は特 に限定されるものではなく、 ヒト由来の細胞 （ヒト患者由来細胞、 健常人由来細 胞） でも、 ラットやマウス由来の細胞であってもよい。 また、 細胞の種類として は、 例えば未分化神経細胞、 幹細胞、 株化細胞等が挙げられる。 幹細胞は、 ex vivo で神経細胞に分化させてこれを移植することで、 神経系疾患の治療 （再生 医療） などに使用することができる。 株化細胞としては、 例えばラット PC-12 細胞、 マウス Neuro2a細胞、 ヒト NB-1細胞などが挙げられる。 ぐシノビオリンの発現阻害 >
また、 シノビォリンの発現阻害についても、 その手法は特に限定されるもので はなく、 例えば RNA干渉 （RNA interference :RNAi) 、 デコイ核酸又はアンチ センスオリゴヌクレオチドを利用することができる。 1 . RNA干渉
シノビオリン遺伝子に対する siRNA(sniall interfering： NA)を設計及び合成 し、 これを細胞内に導入させることによって、 RNAi を引き起こすことができる。
RNAiとは、 dsRNA(double-strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に 結合し、 当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象 である。 例えば、 dsRNA を細胞内に導入すると、 その RNA と相同配列の遺伝 子の発現が抑制 （ノックダウン） される。
siRNAの設計は、 例えば、 以下の通り行なうことができる。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、 任意の領域を全て候補にすることが可能である。 例えば、 ヒトの場合では、
GenBank Accession number AB024690 (配列番号 1 ) の任意の領域を候補にす ることができ、 マウスの場合では Accession number NM_028769 (配列番号 2 ) の任意の領域を候補にすることができる。
(b) 選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、 その配列の長さは 19〜25 塩基、 好ましくは 19〜21塩基である。 その配列の GC含量は、 例えば 40〜70% となるものを選択するとよい。 具体的には、 配列番号 1又は 2に示される塩基配 列のうち、 以下の塩基配列を含む DNA を siRNAの標的配列として使用するこ とができる。
シノビオリン siRNAl： CGT TCC TGG TAC GCC GTC A (配列番号 3 ) シノビオリン siRNA2： GAAATG GTG ACT GGT GCT A (配列番号 4 ) シノビオリン siRNAl は、 配列番号 1に示される塩基配列のうち 640〜658 番目の領域を標的とした配列である。 また、 シノビオリン siRNA2 は、 配列番 号 2に示される塩基配列のうち 1373〜： 1391番目の領域を標的とした配列である。 siRNAを細胞に導入するには、 in vitroで合成した siRNAをプラスミド DNA に連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNAをァニールする方法などを 採用することができる。
また、 本発明は、 RNAi効果をもたらすために shRNAを使用することもでき る。 shRNA とは、 ショートヘアピン RNA(shoi't hairpin RNA)と呼ばれ、 一本 鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有する RNA分子である。
shRNA は、 その一部がステムループ構造を形成するように設計することがで きる。 例えば、 ある領域の配列を配列 Aとし、 配列 Aに対する相補鎖を配列 B とすると、 配列 A、 スぺーサ一、 配列 B の順になるようにこれらの配列が一本 の RNA鎖に存在するようにし、 全体で 45〜60塩基の長さとなるように設計す る。 配列 A は、 標的となるシノビオリン遺伝子 （配列番号 1又は 2 ) の一部の 領域の配列であり、 標的領域は特に限定されるものではなく、 任意の領域を候補 にすることが可能である。 そして配列 Aの長さは 19〜25塩基、 好ましくは 19 〜21塩基である。
2 . デコイ核酸
本発明のデコイ核酸は、 転写因子の結合部位を含む短い 『おとり核酸』 を意味 する。 この核酸を細胞内に導入すると、 転写因子がこの核酸に結合することによ り、 転写因子の本来のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、 その結果、 その転写因子の発現が抑制されるような機能を有する。 代表的には、 デコイ核酸 は核酸又はその類似体であり、 転写因子に結合しうる核酸を少なくとも一つ含む。 本発明の好ましいデコイ核酸の例は、 例えば、 シノビオリンプロモータ一中の 構成的発現を担う Ets結合部位である EBSに結合する転写因子と結合し得る核 酸、 プロモーターの転写因子結合部位である ABS(AML binding site)に結合す る転写因子と結合し得る核酸、 プロモーターの転写因子結合部位である SBS(Spl binding site)に結合する転写因子と結合し得る核酸、 これらの相補体 を含むオリゴヌクレオチド、 これらの変異体、 又はこれらを分子内に含む核酸な どが挙げられる。 デコイ核酸は、 上記 EBS、 ABS 又は SBS の配列をもとに、 1本鎖、 又はその相補鎖を含む 2本鎖として設計することができる。 長さは特に 限定されるものではなく、 15〜60塩基、 好ましくは 20〜30塩基である。
本発明においては、 例えば EBS に結合する転写因子と結合し得る核酸 （配列 番号 6 ) 及び/又はその相補鎖 （配列番号 7 ) をデコイ核酸として好ましく使用 することができる。
核酸は、 DNAでも RNAでもよく、 またはその核酸内に修飾された核酸及び/ 又は擬核酸を含んでいてもよい。 またこれらの核酸、 その変異体、 又はこれらを 分子内に含む核酸は、 1本鎖又は 2本鎖であってもよく、 また環状でも線状でも よい。 変異体とは、 上記デコイ核酸配列の 1又は数個 （例えば 1 個〜 10 個、 1 個〜 5個又は 1個〜 2個等） の塩基が、 欠失、 置換又は付加された塩基配列から なり、 かつ、 シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能、 すなわち、 転写因子と結合する機能を有する核酸をいう。 上記塩基配列を 1 つ又はそれ以 上含む核酸であってもよい。
本発明で用いられるデコイ核酸は、 当業界で公知の化学合成法又は生化学的合 成法を用いて製造することができる。 例えば、 遺伝子組換え技術として一般的に 用いられる DNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。 また、 鐃型となる塩基配列を単離又は合成した後に、 PCR 法又はクローニングベクタ —を用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。 さらに、 これらの方法により 得られた核酸を、 制限酵素等を用いて切断し、 DNA リガーゼを用いて結合する ことにより所望の核酸を製造してもよい。 さらに、 細胞内でより安定なデコイ核 酸を得るために、 塩基等にアルキル化、 ァシル化等の化学修飾を付加することが できる。 デコイ核酸の変異体の作製方法は、 当業界で公知の方法を用いて、 たと えば、 部位特異的突然変異誘発法等によって合成することもできる。 部位特異的 突然変異誘発法は当分野において周知であり、 市販のキッ ト、 例えば GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製） 、 TaKaRa Site -Directed Mutagenesis System ( utan- 、 Mutan-Super Express Km等 （夕カラバイオ社製） ） を使用することができる。
デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、 一般的に行な われるルシフェラーゼアツセィ、 ゲルシフトアツセィ、 CAT アツセィ等を採用 することができる。 これらのアツセィを行なうためのキットも市販されている (例 ば romega dual luciferase assay kit) 。
例えばルシフェラーゼアツセィの場合は、 目的遺伝子の転写開始点の上流にレ ポーターとしてホタルルシフェラ—ゼ遺伝子を連結する。 また、 アツセィの対象 となる細胞間の導入効率を補正するために、 サイトメガロウィルス （CMV) /3ガ ラクトシダーゼ（/3 -gal)遺伝子をレポーターとしてプロモーターの下流につない だべクタ一を細胞に同時に導入してもよい。 細胞への導入は、 例えばリン酸カル シゥム法等を採用することができる。 ベクターを導入した細胞は所定時間培養し た後に回収し、 凍結—融解等によって細胞を破壊した後、 一定量の細胞抽出液を 用いてルシフェラ一ゼ及び j8ガラクトシダーゼ活性を測定する。
3 . アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、 シオビオリン遺伝子をコード する塩基配列に相補的な配列を有するヌクレオチドをいう。 このアンチセンスォ リゴヌクレオチドが、 シノビオリン遺伝子をコードする塩基配列の全部又は一部 とハイブリッドを形成すると、 シノビオリン遺伝子の発現を阻害し、 シノビオリ ンタンパク質の合成を効率よく阻害することができる。 また、 本発明のアンチセ ンスオリゴヌクレオチドは、 本発明のシノビオリン遺伝子の RNA又は本発明の シノビオリン関連 RNA の全部又は一部とハイブリダィズすると、 上記の RNA の合成又は機能が阻害されるか、 あるいは本発明のシノビオリン関連 RNA との 相互作用を介して本発明のシノビオリン遺伝子の発現が調節 ·制御されうる。 本発明の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、 例えば、 本発明の シノビオリン遺伝子の 5'端ヘアピンループ、 5'端 6-ベースペア · リピート、 5'端 非翻訳領域、 翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 翻訳終止コドン、 3'端非 翻訳領域、 3'端パリンドローム領域、 および 3'端ヘアピンループなどの配列に対 して相補的な配列が挙げられるが、 シノビオリン遺伝子内のいかなる領域も対象 領域として選択しうる。 具体的には、 （ィ） 翻訳阻害を指向したアンチセンスォ リゴヌクレオチドの場合は、 本発明のシノビオリンの N末端部位をコードする部 分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） と相補的な配列が好ま しく、 （口） RNaseHによる RNA分解を指向するアンチセンスオリゴヌクレオ チドの場合は、 イントロンを含む本発明のシノビオリン遺伝子をコードする塩基 配列に相補的な配列が好ましい。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 上記の配 列をもとに、 1本鎖、 又はその相補鎖を含む 2本鎖、 さらには DNA： RNAハイ ブリツドとして設計することができる。 長さは特に限定されるものではなく、 通 常、 10〜40塩基、 好ましくは 15〜30塩基である。 2106 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA でも ； NA でもよく、 またはその核酸内に修飾された核酸及び/又は擬核酸を含んでいてもよい。 また これらの核酸、 その変異体、 又はこれらを分子内に含む核酸は、 1本鎖又は 2本 鎖でもよい。 変異体とは、 上記の配列の 1又は数個 （例えば 1個〜 10個、 1個 〜5個又は 1個〜 2個等） の塩基が、 欠失、 置換又は付加された塩基配列からな り、 かつ、 シノビオリン遺伝子の発現を阻害する機能を有するヌクレオチドをい レ アンチセンスオリゴヌクレオチド自体が、 配列番号 1 又は 2 で表される塩 基配列を有する DNAにハイブリダィズするものであればいずれのものでもよレ^ 上記塩基配列を 1つ又はそれ以上含むヌクレオチドであってもよい。
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成、 変異導入、 修飾 等は、 前記デコイ核酸の項で記載した内容と同様に行うことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害活性は、 本発明のアンチセンスオリゴ ヌクレオチドが導入された形質転換体、 その形質転換体を用いた生体内や生体外 の遺伝子発現系などを用いて調べることができる。 ぐ本発明の医薬組成物 >
本発明において作製された shRNA 又は siRNA、 デコイ核酸及びアンチセン スオリゴヌクレオチドは、 シノピオリンの発現を阻害する物質であり、 神経細胞 の分化誘導を目的とした医薬組成物 （神経系疾患の遺伝子治療剤） として使用す ることができる。
本発明の医薬組成物を神経系疾患の遺伝子治療剤として使用する場合は、 脳 (大脳、 間脳、 中脳、 小脳） 、 延髄、 脊髄などの中枢神経系および末梢神経を対 象として適用される。
神経系疾患としては、 例えばアルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチント ン舞踏病、 末梢神経障害、 脊髄損傷などが挙げられる。
上記神経系疾患は、 単独であっても、 併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物は、 shRNA若しくは siRNA、 デコイ核酸又はアンチセン スオリゴヌクレオチドが患部の細胞内又は目的とする組織の細胞内に取り込まれ るような形態で用いられる。 本発明の医薬組成物の投与形態は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能である。 経口投与の場合は、 適当な剤型、 例えば錠剤、 丸剤、 糖衣剤、 カプセル、 液剤、 ゲル、 シロップ、 スラリー、 懸濁物により投与が可能である。 非経口投与の場合 は、 経肺剤型 （例えばネフライザ一などを用いたもの） 、 経鼻投与剤型、 経皮投 与剤型 （例えば軟膏、 クリーム剤） 、 注射剤型等が挙げられる。 注射剤型の場合 は、 例えば点滴等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全 身又は局部的に直接的又は間接的に患部に投与することができる。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、 本発明の医薬組成 物を注射により直接投与する方法のほか、 核酸が組込まれたベクタ一を投与する 方法が挙げられる。 上記ベクターとしては、 アデノウイルスベクター、 アデノ関 連ウィルスベクター、 ヘルぺスウィルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、 レトロウイルスベクター、 レンチウィルスベクタ一等が挙げられ、 これらのウイ ルスべクタ一を用いることにより効率よく投与することができる。 本発明の医薬 組成物を目的の組織又は器官に導入するために、 市販の遺伝子導入キット （例え ばアデノエクスプレス ：クローンテック社） を用いることもできる。
また、 本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、 その 小胞体を投与することも可能である。 本発明の医薬組成物を保持させた小胞体を リポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。 そして、 得られる細胞を例え ば静脈内、 動脈内等から全身投与する。 脳等に局所投与することもできる。 リポ ゾーム構造を形成するための脂質としては、 リン脂質、 コレステロール類や窒素 脂質等が用いられるが、 一般に、 リン脂質が好適であり、 ホスファチジルコリン、 ホスファチジルセリン、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイノシト ール、 ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジン酸、 カルジォリピン、 スフィンゴミエリン、 卵黄レシチン、 大豆レシチン、 リゾレシチン等の天然リン 脂質、 あるいはこれらを定法に従って水素添加したものが挙げられる。 また、 ジ セチルホスフェート、 ジステアロイルホスファチジルコリン、 ジパルミトイルホ スファチジルコリン、 ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、 ジパル レオステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の合成リン脂質を用いるこ とができる。
リボソームの製造方法は、 siRNA若しくは shRNA、 デコイ核酸又はアンチセ ンスオリゴヌクレオチドが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、 慣用の方法、 例えば、 逆相蒸発法 (Szoka、 F ら、 Biochim. Biophys. Acta、 Vol. 601 559 (1980))、 エーテル注入法 (Deamer、 D.W.: Ann. Ν· Υ. Acad. Sci" Vol.308 250 (1978))、 界面活性剤法 (Bnmner,J ζ,： Biochim. Biophys. Acta, Vol. 455 322 (1976))等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが， 2種以上を併 用することも可能である。 このとき、 エタノールアミンゃコリン等の陽性基をも つ原子団を分子内に有するものを用いることにより、 電気的に陰性のデコイ核酸 の結合率を増加させることもできる。 これらリボソーム形成時の主要リン脂質の 他に一般にリボソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、 ステアリ ルァミン、 ひ一トコフエロール等の添加剤を用いることもできる。 このようにし て得られるリボソームには、 患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込 みを促進するために、 膜融合促進物質、 例えば、 センダイウィルス、 不活化セン ダイウィルス、 センダウィルスから精製された膜融合促進タンパク質、 ポリェチ レンダルコール等を添加することができる。
本発明の医薬組成物は、 常法にしたがって製剤化することができ、 医薬的に許 容されるキヤリァーを含むものであってもよい。 このようなキヤリァ一は添加物 であってもよく、 水、 医薬的に許容される有機溶剤、 コラーゲン、 ポリビニルァ ルコール、 ポリビニルピロリドン、 力ルポキシビ二ルポリマー、 カルポキシメチ ルセルロースナトリウム、 ポリアクリル酸ナトリウム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルポキシメチルス夕一チナトリウム、 ぺクチン、 メチル セルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒 天、 ポリエチレングリコール、 ジグリセリン、 グリセリン、 プロピレングリコ一 ル、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清ァ ルプミン、 マンニトール、 ソルビトール、 ラクト一ス、 医薬添加物として許容さ れる界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、 本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 05 002106 み合わせて選ばれる。 例えば、 注射用製剤として使用する場合、 精製されたデコ ィ核酸を溶剤 (例えば生理食塩水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等）に溶解し、 これに
Tween80、 Tween 20、 ゼラチン、 ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用す ることができる。 あるいは、 使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したも のであってもよい。 凍結乾燥用賦形剤としては、 例えば以下のものが挙げられる。 すなわち、 マンニトール、 ブドウ糖、 ラクトース等の糖類、 トウモロコシ、 コム ギ、 その他の植物由来のデンプン、 メチルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチ ルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリゥム等のセルロース、 ァラ ビアゴム、 卜ラガカントゴム等のゴム、 ゼラチン、 コラーゲン等である。 所望に より、 架橋されたポリビニルピロリドン、 寒天、 アルギン酸又はその塩 （例えば、 アルギン酸ナトリゥム） 等の崩壌剤又は可溶化剤を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤 型によって異なる。 投与方法は、 患者の年齢、 症状により適宜選択する。 有効投 与量は、 疾患の徵候又は状態を軽減する siRNA 若しくは shRNA、 デコイ核酸 又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの量である。 例えば、 デコイ核酸では、 治 療効果及び毒性は、 細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、 例えば ED50 (集団の 50 %において治療的に有効な用量） 、 あるいは LD50 (集団の 50%に対して致死的である用量） によって決定され得る。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、 ED50/LD50 として 表され得る。 本発明の医薬組成物の投与量は、 例えば 1回につき体重 1kg あた り O.l g〜： L00mg、 好ましくは l〜10 gである。 但し、 上記治療剤はこれらの 投与量に制限されるものではない。 例えば、 アデノウイルスを投与する場合の投 与量は、 1 日 1回あたり 106〜10i3個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。 但し、 本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕
siRNAを用いた神経細胞の分化誘導試験 <材料及び方法 >
本実施例は、 マウス神経芽細胞腫由来 Neuro2a 細胞を使用した。 なお、 Neuro2a 細胞は、 血清除去、 薬剤添加により軸索を伸長し、 分化能を有する細 胞である。 Neuro2a細胞は Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)に 10%Fetal Calf Serum (FCS)、 1%ぺニシリン /ストレプトマイシンを添加した培 地を使用し、 37° (：、 5%C02インキュベーターで培養した。 Nem'o2a 細胞を播種 し (4 X 104Cells/60mm dish), 24 時間培養した。 シノピオリンをコードする遺伝 子 （配列番号 1又は 2 ) に対する short interfering RNA (siRNA)2種類、 およ びコントロールとして Green Fluorescent Protein (GFP)遺伝子に対する siRNA を OligofectamineTM Reagent (Invitrogen社）を用いてトランスフエクシヨンし た。
siRNAは終濃度 ΙΟΟηΜとし Oligofectamine™ Reagentは 8 / L使用した。 トランスフエクシヨン時は、 無血清、 無抗性物質の培地とし、 トランスフエクシ ヨンより 4時間後、 10%FCSを加え培養を続けた。
siRNA作製のための標的配列は以下の通りである。
シノビオリン siRNAl： CGT TCC TGG TAG GCC GTC A (配列番号 3) シノビオリン siRNA2： GAAATG GTG ACT GGT GCT A (配列番号 4) GFP siRNA： GGC TAC GTC CAG GAG CGC A (配列番号 5)
<結果 >
トランスフエクシヨンより 2 日後、 シノビオリンに対する両 siRNAを導入し た細胞において、 軸索の伸長等の細胞の形態変化が観察された （図 1 ) 。
シノビオリン siRNAl、 シノビオリン siRNA2 をトランスフエクシヨンした 細胞 (それぞれ図 1パネル (A)、 パネル (B))は、 対照として使用した GFPに対する siRNA (GFP siRNA) (図 1パネル (C))と比較して、 軸索が伸長した細胞が多いこと が観察された。 GFPに対する siRNAでは変化は見られなかった。 産業上の利用可能性
本発明により、 シノビオリンの発現抑制物質を含む神経細胞分化誘導剤が提供 される。 本発明の誘導剤は、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 末梢神経障害 又は脊髄損傷などの神経系疾患治療薬として有用である 配列表フリーテキスト
配列番号 5 ：合成 DNA
配列番号 6 ：合成 DNA
配列番号 7 ：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1 . シノビオリンの発現阻害物質を含む神経細胞分化誘導剤。
2 . シノビォリンの発現阻害物質が、 シノビオリンをコードする遺伝子に対す る siRNA又は shRNAである請求項 1記載の誘導剤。
3 . シノビオリンをコードする遺伝子が、 配列番号 1又は 2に示される塩基配 列を含むものである請求項 2記載の誘導剤。
' 4 . siRNA が、 配列番号 1又は 2に示す塩基配列のうち一部の配列を標的と するものである請求項 2記載の誘導剤。
5 . 一部の配列が、 配列番号 3又は 4に示す塩基配列を有するものである請求 項 4記載の誘導剤。
6 . シノビォリンの発現阻害物質が、 シノビオリン遺伝子のプロモ一ターの転 写因子と結合してプロモーター活性を阻害するデコイ核酸である請求項 1記 載の誘導剤。
7 . デコイ核酸が、 以下の （a) 又は （b) に示すデコイ核酸である請求項 6 記載の誘導剤。
(a) 配列番号 6若しくは 7に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 6若しくは 7に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基 が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シノピオリン遺 伝子のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
8 . デコイ核酸が、 以下の （a) 又は （b) に^すデコイ核酸である請求項 6 記載の誘導剤。 .
(a) 配列番号 6及び 7に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 6及び 7に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠 失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シノピオリン遺伝子 のプロモータ一活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
9 . シノビォリンの発現阻害物質が、 シノピオリンをコードする遺伝子に対す るアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項 1記載の誘導剤。
1 0 . シノビオリンをコードする遺伝子が配列番号 1又は配列番号 2に示され る塩基配列を含むものである請求項 9記載の誘導剤。
. アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号 1又は 2に示す塩基配列の うち一部の配列を標的とするものである請求項 9記載の誘導剤。
. 神経系疾患を治療するための請求項 1〜 1 1のいずれか 1項に記載の誘 導剤。
. 神経系疾患がアルツハイマー病、 パーキンソン病、 末梢神経障害又は脊 髄損傷である請求項 1 2記載の誘導剤。
. シノビォリンの発現を阻害することを特徴とする、 神経細胞の分化を誘 導する方法。
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