A141S- und G399S-Mutation im Omi/HtrA2-Protein bei Morbus Parkinson
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Morbus Parkinson bei einem menschlichen Lebewesen; in diesem Verfahren verwendete Nukleinsauremolekule sowie deren Verwendungen zum Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls kodierend für humanes Omi/HtrA2-Protein bzw. zur Amplifizierung des menschlichen Omi/HtrA2-Gens; die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein gegenüber dem Wildtyp genetisch verändertes Omi/HtrA2-Protein oder Abschnitte hiervon kodiert, und/oder eines solchen Proteins bzw. Abschnitten hiervon zur Diagnose
von Morbus Parkinson und/oder einer Veranlagung hierfür; ein Nukleinsauremolekul, das für ein humanes Omi/HtrA2-Protein kodiert, das an Aminosäureposition 141 und/oder 399 eine gegenüber dem Wildtyp genetische Veränderung aufweist, sowie für entsprechende Abschnitte hiervon; einen Wirt, vorzugsweise einen transgenen nicht-menschlichen Säuger, in den ein solches Nukleinsauremolekul eingebracht wurde; ein (Poly)peptid, das von einem solchen Nukleinsauremolekul kodiert wird; ein Verfahren zum Auffinden von an gegenüber dem Wildtyp genetisch veränderten Omi/HtrA2-Protein bindenden Substanzen; eine mittels dieses Verfahrens aufgefundene Substanz sowie eine vorzugsweise pharmazeutische Zusammensetzung, die eine solche Substanz aufweist. Darüber hinaus betrifft diese Erfindung ein Kit, das zumindest eines der vorstehend genannten Nukleinsauremolekule aufweist.
Verfahren der vorstehend genannten Art sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Bei der Parkinson' sehen Krankheit oder auch Morbus Parkinson handelt es sich um die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung beim Menschen und um die zweithäufigste neurologische Erkrankung von Menschen im fortgeschrittenen Alter. Bei den über Achtzigjährigen sind 4 % betroffen, allein in Deutschland gibt es etwa 250.000 Parkinson-Patienten.
Kardinalsymptome von Morbus Parkinson sind Tremor, Rigor und Akinese, d.h. Zittern, das in Ruhe maximal ausgeprägt ist, Bewegungsverlangsamung und -armut, Schwierigkeiten bei der Initiierung von Bewegungen, kleinschrittiger Gang bei vornüber gebeugtem Oberkörper, erloschene Haltungsreflexe mit Fallnei-
gung, maskenartiger Gesichtsausdruck, leise, monotone und stotternde Sprache. Bei etwa 50 % der Patienten entwickelt sich eine Demenz .
Die Parkinson' sehe Krankheit geht ferner mit einer Degeneration der Dopamin bildenden Zellen in der Substantia nigra pars com- paeta einher, vermutlich über einen apoptotischen Zelluntergang, was zu einer funktioneilen Dysbalance nachgeschalteter Kerne führt. Da Dopamin die Aktivität von Nervenzellen in verschiedenen Hirnarealen hemmt, führt der Dopa inverlust zu einer Überstimulierung dieser Hirnregionen.
Die tiologie der Parkinson' sehen Erkrankung ist weitgehend unbekannt. Dabei werden Umweltfaktoren, wie bspw. Pestizide, als auf den Beginn dieser Krankheit Einfluss nehmende Faktoren diskutiert.
Andererseits spielen genetische Faktoren eine signifikante Rolle für eine Erkrankung an der Parkinson' sehen Krankheit. Diese Erkenntnisse basieren auf Zwillingsstudien (vgl. hierzu Piccini et al. (1999), The role of inheritance in sporadic Parkinson 's disease: evidence from a longitudinal study of dopa inergic funetion in twins . Ann .Neurol . , 45, 577-582), der Identifizierung von großen von der Parkinson' sehen Krankheit betroffenen Familien (vgl. hierzu bspw. Nicholl et al. (2002), Two large British kindreds with familial Parkinson 's disease: a clinico-pathological and genetic study. Brain , 125, 44-57), und dem erhöhten Risiko bei Verwandten von sogenannten Index- Patienten, an der Parkinson'sehen Krankheit zu erkranken (vgl. hierzu Elbaz et al. (1999), Familial aggregation of Parkinson 's
disease: a population-based case-control study in Europe. EUROPARKINSON Study Group. Neurology, 52, 1876-1882).
Bislang konnten zehn Genloci identifiziert werden, die mit der Parkinson 'sehen Krankheit in Verbindung stehen. Ein Überblick hierüber findet sich in Krüger et al. (2002), Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes?, TRENDS in Molecular Medecine, Vol. 8 No. 5, 236-240. Ferner konnten vier Gene identifiziert werden, α-Synuclein , Synphilin-1 , Parkin und UCH-Ll , die in autosomal-dominant oder autosomal-rezessiv vererbtem Morbus Parkinson in mutierter Form vorliegen. Sämtliche Genprodukte dieser Gene sind Mitglieder des Proteaso -Protein- Degeneration-Abbauweges. Während Mutationen in den -Synuclein- , Synphilin-1 -, und in den UCH-Ll-Genen äußerst selten sind, finden sich in nahezu der Hälfte der Fälle von autosomal-rezessiven Formen des so genannten Frühform-Morbus- Parkinson (AR-EOPD) Mutationen im Parkin-Gen; vgl. hierzu Lucking et al. (2000), Association between early-onset Parkinson's disease and mutations in the parkin gene. French Parkinson's Disease Genetics Study Group. N.Engl .J.Med. , 342, 1560- 1567.
Vor kurzem konnten zwei Genloci, die mit AR-EOPD korrelieren, PARK6 und PARK7, dem menschlichen Chromosom lp35-36 zugeordnet werden. Während der zugrunde liegende Gendefekt von PARK6 bislang noch nicht identifiziert werden konnte, gelang Bonifati et al. die Identifizierung einer homozygoten L166P-Substitution und einer Deletion in zwei nicht verwandten Familien in dem DJ- 1-Gen als einen Auslöser der PARK7-assoziierten Parkinson' sehen Erkrankung; vgl. Bonifati et al. (2003), Mutations in the DJ-1
gene associated with autosomal recessive early-onset parkinson- is . Science , 299, 256-259.
In der bislang unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 103 48 904.5 wird darüber hinaus eine weitere neue mit AR-EOPD in Zusammenhang stehende Mutation in dem DJ-1 - Gen beschrieben, durch die im DJ-1-Protein an Aminosäureposition 64 ein Glutaminsäuremolekül gegen ein Asparaginsäuremolekül ausgetauscht wird.
Die Diagnose der Erkrankung an Morbus Parkinson bzw. an AR-EOPD wird bislang im Wesentlichen an Hand der beobachteten Kardinalsymptome gestellt, was mit entsprechenden Unsicherheiten und Risiken von Fehldiagnosen behaftet ist. Eine solche Diagnose kann nur post mortem durch den neuropathologischen Nachweis der charakteristischen so genannten Lewy-Körperchen, bei denen es sich um abnorme Proteinablagerungen im Gehirn handelt, gesichert werden. Eine Veranlagung für eine entsprechende Erkrankung kann deshalb bislang gar nicht oder nur mit sehr großem Unsieherheitsfaktor diagnostiziert werden. Im Stand der Technik fehlt darum die Basis für eine entsprechend zielgerichtet präventive Behandlung von betroffenen Personen, sowohl medikamentös als auch ggf. psychotherapeutisch.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die vorstehend genannten Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden. Insbesondere soll ein solches Verfahren bereitgestellt werden, mittels dem bei betroffenen Personen eine molekularbiologische Differenzialdiagnose einer Erkrankung an bzw. Veranlagung für Morbus Parkinson möglich ist, das bspw. eingebettet werden kann in den zusätzlichen Nachweis von
genetischen Veränderungen, die im Stand der Technik bereits als mit Morbus Parkinson korrelierend beschrieben wurden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Diagnose von Morbus Parkinson bei einem menschlichen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe des Lebewesens; (b) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein eines Nukleinsäuremoleküls und/oder eines (Poly)peptides, und (c) Korrelation eines positiven Befundes mit einer Erkrankung an Morbus Parkinson und/oder mit einer Veranlagung für eine Erkrankung an Morbus Parkinson, wobei in Schritt (b) die biologische Probe auf das Vorhandensein eines solchen Nukleinsäuremoleküls hin untersucht wird, das für ein gegenüber dem Wildtyp genetisch verändertes Omi/HtrA2-Protein oder für Abschnitte hiervon kodiert. Vorzugsweise wird die biologische Probe auf das Vorhandensein eines solchen Nukleinsäuremoleküls hin untersucht, das für ein humanes Omi/HtrA2-Protein kodiert, das an Aminosäureposition 141 und/oder 399 eine gegenüber dem Wildtyp genetische Veränderung aufweist, sowie für entsprechende Abschnitte hiervon.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Die Erfinder konnten überraschenderweise erstmals zeigen, dass eine genetische Veränderung in dem Omi/HtrA2-Protein, vorzugsweise einer solchen an Aminosäureposition 141 bzw. 399, mit Morbus Parkinson korreliert. Diese Erkenntnis ist um so überraschender, da das Omi/HtrA2-Gen bzw. das hiervon kodierte Protein bisher nicht mit Morbus Parkinson in Zusammenhang gebracht wurde. Bei dem Omi/HtrA2-Protein handelt es sich um eine Serin-
Protease, die erstmals im Jahre 2000 beschrieben wurde; vgl. Faccio et al. (2000), Characterization of a novel human serine protease that has extensive homology to bacterial heat shock endoprotease HtrA and is regulated by kidney ischemia, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 No. 4, Seiten 2581- 2588; Grey et al. (2000), Characterization of human HtrA2, a novel serine protease involved in the mammalian cellular stress response, European Journal of Biochemistry Vol. 267, Seiten 5699-5710. Die Sequenz des humanen Omi /HtrA2-Gens kann der NCBI-Datenbank entnommen werden: NM_013247.3 oder NM_145074.1 (jeweils mRNA) ; AC005041.2 (genomische Sequenz, BAC); AF141305.1 oder AF020760.2 (jeweils cDNA) .
Das Omi/HtrA2-Protein ist ein Mitglied der HtrA-Protease- Chaperon-Familie und im Intermembranraum der Mitochondrien lokalisiert. Omi/HtrA2 wird mit stressinduziertem Zelltod (A- poptose) in Verbindung gebracht, wobei gezeigt werden konnte, dass die Serinproteaseaktivität des Omi/HtrA2-Proteins für die Vermittlung des Caspase unabhängigen Zelltods verantwortlich ist; vgl. Cilenti et al. (2003), Characterization of a novel and specific inhibitor for the pro-apoptotic protease Omi/HtrA2, Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, Seiten 11489-11494. Darüber hinaus ist das Omi/HtrA2-Protein über die Interaktion mit der Ubiquitin-E3-Ligase XIAP eng mit dem Ubi- quitin vermittelten Proteinabbauweg verbunden; vgl. bspw. Suzuki et al. (2001), A serine protease, HtrA2, is released from the mitochondria and interacts with XIAP, inducing cell death, Molecular Cell , Vol. 8, Seiten 613-621.
Jones et al. (2003), Loss of Omi mitochondrial protease activi- ty causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice, Na-
ture, Vol. 425, Seiten 721-727, beschreiben die erste im Omi/HtrA2-Gen aufgefundene Mutation, durch die im Protein an Aminosäureposition 276 ein Serinmolekül gegen ein Cysteinmole- kül ausgetauscht wird. Die dort beschriebene Mutation wurde in einer mit mnd2 bezeichneten und seit 1990 bekannten Mausmutante identifiziert, die neuromuskuläre Störungen und itochondriale Defekte zeigt. Die dortigen Autoren konnten in Versuchen an embryonalen Mausfibroblasten, die entsprechend mutiertes Omi/HtrA2-Protein exprimierten, eine erhöhte Anfälligkeit dieser Zellen gegenüber Stress induzierter Apoptose aufzeigen. Eine mögliche Bedeutung des Omi/HtrA2-Proteins bzw. der dort beschriebenen genetischen Veränderung bei Morbus Parkinson wird von den dortigen Autoren nicht erkannt. Mehr noch, die dortigen Autoren haben in weiteren Studien zwei von Morbus Parkinson betroffene Familien auf eine entsprechende Mutation im Omi/HtrA2-Gen hin untersucht, konnten eine solche jedoch nicht auffinden; vgl. Jones et al. a.a.O., insbesondere Seite 726, linke Spalte, zweiter Absatz.
Bei der von den Erfindern erkannten Lehre handelt es sich deshalb um eine Abkehr von der im Stand der Technik bislang vertretenen Auffassung, in der ein Zusammenhang des Ctai/iϊtrA2-Gens mit dem Krankheitsbild des Morbus Parkinson nicht nur nicht erkannt, sondern sogar verneint wird.
Die Erfinder hingegen konnten bei 29 Morbus-Parkinson-Patienten eine genetische Veränderung im O i lEt rA2-Gen nachweisen, nicht jedoch bei über 600 gesunden Kontrollpersonen. Parallel dazu wurde von den Erfindern mittels etablierter Toxizitätstests die pathophysiologische Relevanz der aufgefundenen genetischen Veränderungen erkannt.
Ferner konnten die Erfinder aufzeigen, dass die genetische Veränderung zu einer Schädigung der Mitochondrienfunktion führt.
Der Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls in einer menschlichen Probe, das für ein genetisch verändertes menschliches Omi/HtrA2-Protein kodiert, lässt demnach gemäß der Erfindung die Diagnose einer Veranlagung für oder einer bereits erfolgten Erkrankung an Morbus Parkinson zu. Mehr noch, nachdem erstmals die Bedeutung des Omi /HtrA2-Gens für eine Erkrankung an Mobus Parkinson erkannt wurde, kann nun gezielt nach weiteren pathologisch relevanten genetischen Veränderungen in diesem Gen gescreent werden.
Eine solche erfindungsgemäß zu untersuchende biologische Probe kann jegliches biologisches Material sein, das repräsentative Nukleinsäuren und/oder Proteine des entsprechenden menschlichen Lebewesens enthält, bspw. eine Blut-, Gewebe-, Speichel-, Haaroder sonstige Probe .
Die Untersuchung der biologischen Probe in Schritt (b) erfolgt mittels im Stand der Technik allgemein bekannter Verfahren, bspw. mittels eines Mutationsscreenings, bei denen z.B. PCR- gestützte Verfahren und Heteroduplexanalysen wie bspw. die denaturierende Hochdruckflüssigkeitschromatografie (dHPLC) oder auch Hybridisierungstechniken Anwendung finden.
Wie die Erfinder erkannt haben, reicht für eine erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein von Nukleinsäure- olekülen aus, die für solche Omi/HtrA2-Proteinabsσhnitte ko-
dieren, die die genetische Veränderung und vorzugsweise einen im Gesamtprotein an Position 141 bzw. 399 befindlichen entsprechenden Aminosäurerest aufweisen. Wie die Erfinder herausfinden konnten, ist nämlich gerade eine genetische Veränderung an dieser Position im Omi/HtrA2-Gesamtprotein für das Auftreten von Morbus Parkinson von entscheidender Bedeutung.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn das nachzuweisende Nukleinsauremolekul für ein menschliches Omi/HtrA2-Protein kodiert, das an der Aminosäureposition 141 bzw. 399 einen Aminosäureaustausch, weiter vorzugsweise einen solchen aufweist, durch den ein Alaninmolekül gegen ein Serin- molekül bzw. ein Glycinmolekül gegen ein Serinmolekül ausgetauscht ist.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein eines solchen Nukleinsäuremoleküls hat dabei den Vorteil, dass hiermit eine für die Korrelation mit Morbus Parkinson äußerst bedeutsame und aussagekräftige genetische Veränderung bzw. Mutation erfasst wird. Die Erfinder konnten in diesem Zusammenhang überraschenderweise zeigen, dass 29 an Morbus Parkinson erkrankte Patienten zumindest eine dieser genannten Aminosäureaustauschmutationen tragen, wohingegen gesunde Kontrollpersonen keinerlei genetische Veränderungen an Position 399 bzw. signifikant seltener an Position 141 aufwiesen. Diese aufgefundenen genetischen Veränderungen gehen auf Nukleotid- bzw. Basenaustausche an den Positionen 421 bzw. 1195 des offenen Leserasters (ORF) des menschlichen Ctai/iϊtrÄ2-Gens zurück, bei denen gegenüber dem Wildtyp ein Desoxyguanosinmo- nophosphat (dGMP) bzw. Guanin (G) gegen Desoxythymidinmo- nophosphat (dTMP) bzw. Thymin (T) oder ein dGMP bzw. G gegen
ein Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP) bzw. Adenin (A) ausgetauscht wurde.
Der Nachweis eines solchen vorstehend definierten Nukleinsäuremoleküls mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht deshalb die zuverlässige Diagnose einer Veranlagung für oder einer Erkrankung an Morbus Parkinson.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn das nachzuweisende Nukleinsauremolekul ein solches ist, das unter stringenten Bedingungen an das zuvor beschriebene Nukleinsauremolekul bindet. Dabei sind unter stringenten Bedingungen solche dem Fachmann bekannte Bedingungen zu verstehen, unter denen nur perfekt basengepaarte Nukleinsäurestränge gebildet werden und stabil bleiben.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bspw. auch der komplementäre nicht kodierende Strang des menschlichen Qmi/.fftrA2-Gens zur Diagnose von Morbus Parkinson herangezogen wird, wodurch die Sensitivität des Verfahrens zusätzlich erhöht wird.
In diesem Zusammenhang ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren weiter bevorzugt, wenn das nachzuweisende Nukleinsauremolekul ein solches ist, das unter stringenten Bedingungen wiederum an das hier vorstehend genannte Nukleinsauremolekul bindet.
Der Vorteil dieser Maßnahme besteht darin, dass auch solche Nukleinsauremolekule zur Detektion herangezogen werden, die sich von dem ORF des Omi/HtrA2-Gens ableiten, wie bspw. reife oder unreife mRNA, sowie Abbauprodukte hiervon, die jedoch noch die charakteristische (n) genetische (n) Veränderung(en) tragen
und deshalb an das Nukleinsauremolekul binden, das zu dem für das veränderte Omi /HtrA2-Gen kodierende Nukleinsauremolekul komplementär ist. Durch diese Maßnahme wird die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter erhöht.
Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Nukleinsauremolekul kodierend für ein humanes Omi/HtrA2-Protein, das an Aminosäureposition 141 und/oder 399 eine gegenüber dem Wildtyp genetische Veränderung, vorzugsweise einen Aminosäureaustausch, weiter vorzugsweise einen solchen aufweist, durch den an Position 141 ein Alaninmolekül gegen ein Serinmolekül und/oder an Position 399 ein Glycinmolekül gegen ein Serinmolekül ausgetauscht ist, sowie solche Nukleinsauremolekule, die für entsprechende Abschnitte hiervon kodieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein erläutertes Nukleinsauremolekul, das unter stringenten Bedingungen an das hier vorstehend beschriebene Nukleinsauremolekul bindet, sowie ein solches ebenfalls bereits erläutertes Nukleinsauremolekul, das unter stringenten Bedingungen wiederum an dieses bindet.
Auf Grund des erstmals von den Erfindern erkannten Zusammenhangs einer genetischen Veränderung im Omi/HtrA2-Gen ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsauremolekule zur Diagnose von Morbus Parkinson und/oder einer Veranlagung hierfür.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Wirt, vorzugsweise einen transgenen nicht-menschlichen Säuger, weiter vorzugsweise eine transgene Maus, eine transgene Ratte, ein trans- genes Schaf, eine transgene Ziege oder eine transgene Kuh, in den zumindest ein Nukleinsauremolekul, das für ein gegenüber dem Wildtyp genetisch verändertes Omi/HtrA2-Protein kodiert, vorzugsweise eines der vorstehend beschriebenen Nukleinsauremolekule, eingebracht wurde.
Die von verschiedenen Arbeitsgruppen beschriebene Schlüsselrolle des Omi/HtrA2-Proteins in der Caspase unabhängigen Apoptose und in der Ubiquitin abhängigen Proteindegradation sowie der von den Erfindern erstmals erkannte Zusammenhang zwischen Omi/HtrA2 und Morbus Parkinson sprechen für eine Schlüsselrolle dieses Gens bzw. des dadurch kodierten Proteins in der molekularen Pathogenese bei Morbus Parkinson. So werden nämlich auch bei Morbus Parkinson neurodegenerative Prozesse beobachtet, die zumeist nicht den klassischen Kriterien des Caspase vermittelten apoptotischen oder nekrotischen Zelltods entsprechen. Ferner wird bei Morbus Parkinson ebenfalls eine Störung der Proteindegradation beschrieben, die sich in der Bildung sog. Lewy- Körperchen im Gehirn von betroffenen Patienten zeigt. Die für diese Phänomene verantwortlichen Mechanismen waren bislang trotz intensiver Forschung unbekannt. Durch das Auffinden von krankheitsverursachenden Mutationen im Omi/HtrA2-Gen bei Morbus Parkinson durch die Erfinder werden erstmals bekannte Pathoge- nesewege der gestörten Proteindegradation mit apoptotischen Prozessen verbunden. Die Erfinder konnten ferner in weiteren Experimenten eine Ubiquitinierung des Omi/HtrA2-Proteins sowie letzteres in charakteristischen Lewy-Körperchen im Gehirn von betroffenen Patienten nachweisen.
Mittels des erfindungsgemäßen transgenen Säugers wird deshalb ein Modellsystem bereitgestellt, mit dem die molekulare Pathologie von Morbus Parkinson umfassender als im Stand der Technik repliziert und analysiert werden kann. Selbstverständlich stellt ein solcher transgener Wirt auch ein hervorragendes System zum Auffinden und Testen von gegen Morbus Parkinson wirksamen Substanzen dar. Die für die Herstellung eines transgenen Säugers, wie bspw. einer Omi/HtrA2-Knock-out-Maus, erforderlichen Verfahrensschritte sind im Stand der Technik umfassend beschrieben; vgl. hierzu bspw. Thomas Rülicke (2001) Transgene, Transgenese, transgene Tiere: Methoden der nichthomologen DNA-Rekombination, Karger-Verlag.
Die Erfinder haben darüber hinaus erkannt, dass nach einer Modifizierung des vorstehend beschriebenen neuen Verfahrens ebenfalls eine Diagnose von Morbus Parkinson möglich ist, wenn nämlich in der biologischen Probe ein (Poly)peptidmolekül nachgewiesen wird, das sich von einem gegenüber dem Wildtyp genetisch veränderten Omi/HtrA2-Protein ableitet. Vorzugsweise wird die biologische Probe auf das Vorhandensein eines (Poly)pep- tidmoleküls hin untersucht, das von einem der zuvor beschriebenen Nukleinsauremolekule kodiert wird. Das wie erläutert genetisch veränderte Omi/HtrA2-Protein ist das Translationsprodukt des entsprechend genetisch veränderten Nukleinsäuremoleküls und lässt deshalb ebenfalls direkte Rückschlüsse auf eine Veranlagung für bzw. Erkrankung an Morbus Parkinson zu.
Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt deshalb in Schritt (b) die Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein eines (Poly)peptides, das sich von einem gegenüber dem Wildtyp genetis.ch veränderten Omi/HtrA2-Protein
ableitet, vorzugsweise auf das Vorhandensein eines solchen (Poly)peptides, das von einem der zuvor beschriebenen Nukleinsauremolekule kodiert wird.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bei einer Detektion eines solchen (Poly)peptides eine noch gefestigtere Diagnose von Morbus Parkinson möglich wird, bspw. auch dann möglich ist, wenn das für das Peptid kodierende Nukleinsauremolekul in der biologischen Probe, z.B. auf Grund von Nukleaseaktivitäten, nicht oder nicht mehr nachweisbar ist.
Der Nachweis des (Poly)peptides mit der genetischen Veränderung, vorzugsweise an der Aminosäureposition 141 bzw. 399, in der biologischen Probe erfolgt hierbei mittels im Stand der Technik bekannter Proteinreinigungs- und/oder ggf. Sequenzierverfahren. Ein Überblick über derartige Verfahren findet sich bspw. in Lottspeich F. (Herausgeber) et al. (1998), „Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag.
Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein solches (Poly) peptid, das von einem der zuvor beschriebenen Nukleinsauremolekule kodiert wird.
Es versteht sich, dass mit einem solchen (Poly)peptid auch solche Peptide erfasst sind, die Fragmente, Varianten und Isoformen des genetisch veränderten Omi/HtrA2-Proteins darstellen, und die die im Gesamtprotein an Position 141 bzw. 399 vorhandene oben erläuterte genetische Veränderung aufweisen.
Ein solches (Poly) eptid schafft die Grundlage für die Entwicklung von pharmakologisch wirksamen Substanzen, wie bspw. Inhi-
bitoren oder Aktivatoren des entsprechend genetisch veränderten Omi/HtrA2-Proteins. Gleiches gilt für die für ein solches Poly(peptid) kodierenden Nukleinsäuren, über die bspw. pharmakologisch interessante inhibierende RNAi(RNA interference)- bzw. siRNA(silencing RNA) -Moleküle oder andere Antisense-Moleküle konstruiert werden können. Mittels der kodierenden Nukleinsauremolekule kann bspw. auch das genetisch veränderte Omi/HtrA2- Protein in großen Mengen hergestellt, dessen dreidimensionale Struktur aufgeklärt und darüber mittels in siliσo-Screenings pharmakologisch wirksame Substanzen entwickelt werden.
Bei dem eingangs beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn im Schritt (b) die Untersuchung auf das Vorhandensein des interessierenden Nukleinsäuremoleküls mittels PCR-Technologie erfolgt.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass dadurch ein äußerst sensitives, etabliertes und weitgehend automatisierbares Verfahren Anwendung findet, über das hochspezifisch das genetisch veränderte Nukleinsäurematerial angereichert werden kann, welches dann anschließend mittels weiterer Standardverfahren wie Elektrophorese-/Heteroduplexverfahren oder direkter Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Als PCR-Primer wird vorzugsweise ein Nukleinsauremolekul verwendet, das eine der Sequenzen aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 17.
Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass mittels der Verwendung des vorstehend bezeichneten Nukleinsäuremoleküls mit einer der gelisteten Nukleotidsequenzen eine hochspezifi-
sehe und selektive Amplifizierung des gesamten Omi / Ht r A2 -Gens gelingt und deshalb im gesamten offenen Leseraster auf genetische Veränderungen gescreent werden kann. Wie gezeigt werden konnte, gelingt mit einem PCR-Primer, der die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, als Vorwärtsprimer und mit einem PCR- Primer, der die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, als Rückwartsprimer, die Amplifizierung des Exons 1 des humanen Omi / Ht r A2 -Gens . Entsprechend gelingt mit PCR-Primern mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 2 ebenfalls die Amplifi- zierung des Exons 1, mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 die Amplifizierung des Exons 2, mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7 die Amplifizierung des Exons 3, mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9 die Amplifizierung des Exons 4, mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 11 die Amplifizierung des Exons 5, mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13 die Amplifizierung des Exons 6, mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15 die Amplifizierung des Exons 7, und mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17 die Amplifizierung des Exons 8 des Omi / Ht r A2 -Gens .
An Hand der Amplifizierungsprodukte kann dann eine ggf. vorhandene genetische Veränderung mittels üblicher Mutationsscree- ningverfahren bzw. Hybridisierungsverfahren einfach nachgewiesen werden.
Selbstverständlich gelingt eine solche Amplifizierung auch mit solchen PCR-Primern, die neben einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 17 5'- und/oder 3'-wärts weitere Nukleotide aufweisen, die ggf. mit dem Gegenstrang hybridisieren, oder die kleinere Sequenzvariationen aufweisen, welche jedoch die Spezi- fität der Primer nicht wesentlich verändern. Derartige Nuklein-
säuremoleküle sind von der erfindungsgemäßen Verwendung als PCR-Primerpaar ebenfalls umfasst.
Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch die entsprechende erfindungsgemäße Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls als PCR-Primer, das unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsauremolekul bindet, das eine der Sequenzen aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 17.
Auch ein unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsauremolekul mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 17 bindendes Nukleinsauremolekul ermöglicht die hochspezifische und selektive Amplifizierung eines Abschnittes des Omi/HtrA2- ggf . genetisch veränderten Omi /HtrA2-Gens, wobei hier jedoch eine Hybridisierung mit dem entsprechend komplementären Strang erfolgt, die Amplifikate jedoch weitgehend identisch sind.
Auf Grund der unerwarteten Eigenschaften und besonderen Eignung der vorstehend beschriebenen neuen Nukleinsauremolekule ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch deren Verwendung zur Amplifizierung des menschlichen Omi /HtrA2-Gens .
Bei dem vorstehend erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die PCR-Amplifikate mittels denaturierender Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (dHPLC) oder anderer Hete- roduplexverfahren analysiert werden.
Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, das mit hoher Sensi- tivität Sequenzvariationen in PCR-Amplifikaten im Vergleich zur Wildtypsequenz selektieren kann. Der Nachweis beruht auf einem
Heteroduplex, der sich nach artifizieller De- und Renaturierung immer dann bildet, wenn neben dem Wildtyp-Ctai/2TtrA2-Allel die in Rede stehende Sequenzvariation auf dem zweiten Allel vorliegt. Deshalb wird zum Nachweis von homozygoter Omi/HtrA2- Mutation vor der artifiziellen Denaturierung durch Erhitzung und langsame Abkühlung zusätzlich „Wildtyp-Material" zugemischt. Im Rahmen der vorausgehenden PCR entsteht dabei mit hoher Zuverlässigkeit eine Heteroduplex aus einem Strang des Wildtyp-Oini /Ht rA2-Alleis und einem Strang des genetisch veränderten 0.7ii/HtrA2-Allels. Diese Hybride weisen auf der dHPLC- Saule gegenüber einer Homoduplex ein verändertes Retentionsver- halten auf, das mit einer Wahrscheinlichkeit von über 95 % nachgewiesen werden kann.
Die Analysezeit für ein Fragment liegt bei etwa vier bis fünf Minuten, so dass die dHPLC ein sehr kostengünstiges und zeiteffektives Screeningverfahren, bspw. vor einer zusätzlichen Sequenzierung der Amplifikate, darstellt. Informationen zu diesem Verfahren finden sich bspw. in McCallum, C. M. et al., (2000), Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology, 18, 455-457.
Alternativ hierzu kann die genetische Veränderung mittels der als Pyrosequencing (siehe hierzu: www.pyrosequencing.com; der Inhalt der Homepage ist durch Bezugnahme Gegenstand der vorliegenden Beschreibung) bezeichneten schnellen Direktsequenzie- rungsmethode gescreent werden. Auch lässt sich erfindungsgemäß die etablierte Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)- Analyse anwenden. Ferner geeignet ist die Einzelstrang- konformations(SSCP) -Analyse, die jedoch bezüglich des Detek- tionsgrades weniger sensitiv und zeitaufwendiger ist. Denkbar
ist ferner die Durchführung der direkten Sequenzierung. Diese Methode ist hoch sensitiv, jedoch verhältnismäßig kosten- und zeitaufwendig .
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn die Untersuchung auf das Vorhandensein des Nukleinsäuremoleküls in Schritt (b) mittels Hybridisierungstechnologie erfolgt, wobei vorzugsweise als Hybridisierungssonde eine Nukleinsauremolekul verwendet wird, das eine der Sequenzen aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 18 bis SEQ ID Nr. 21 gemäß beiliegendem Sequenzprotokoll.
Nach einer erfindungsgemäßen Variante wird als Hybridisierungssonde ein Nukleinsauremolekul verwendet, das unter stringenten Bedingungen an ein vorstehend bezeichnetes Nukleinsauremolekul bindet .
Die Erfinder konnten bei ihren Arbeiten Nukleinsauremolekule entwickeln, über die bei Verwendung als Hybridisierungssonde hochspezifisch ein Austausch von Desoxyguanosinmonophosphat (dGMP) bzw. Guanin (G) gegen Desoxythymidinphosphat (dTMP) bzw. Thymin (T) an Position 421 des offenen Leserasters des Omi /HtrA2 -Gens nachgewiesen werden kann, nämlich Nukleinsauremolekule, die die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 aufweisen. Selbstverständlich ist dieser Nachweis auch mit komplementären Nukleinsäuremolekülen möglich, die an den entsprechenden Gegensinnstrang des Omi /Ht rA2-Gens hybridisieren.
Dabei ist ein Nukleinsauremolekul mit der Sequenz SEQ ID Nr. 18 in der Lage, hochspezifisch an den Sinnstrang des Exons 1 des
Omi /HtrA2-Gens zu hybridisieren, während ein Nukleinsauremolekul mit einer Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 19 hochspezifisch an den Gegensinnstrang des Exons 1 des Omi /HtrA2-Gens hybridisieren kann.
Wie die Erfinder weiter zeigen konnten, eignet sich ein Nukleinsauremolekul, das die Sequenz SEQ ID Nr. 20 oder SEQ ID Nr. 21 aufweist, als Hybridisierungssonde, mit der ein Austausch von Desoxyguanosinmonophosphat (dGMP) bzw. Guanin (G) gegen Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP) bzw. Adenin (A) an Position 1195 des offenen Leserasters des Omi /HtrA2~Gens nachgewiesen werden kann. Gleiches gilt für entsprechend komplementäre Nukleinsauremolekule .
Das Nukleinsauremolekul mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 20 bindet hochspezifisch an den Sinnstrang des Exons 7, das Nukleinsauremolekul mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 21 hochspezifisch an den Gegensinnstrang des Exons 7 des Omi/HtrA2- Gens.
Aufgrund der besonderen Eignung, beispielsweise als PCR-Primer oder Hybridisierungssonde, ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Nukleinsauremolekul, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 21 gemäß beiliegendem Sequenzprotokoll, sowie ein Nukleinsauremolekul, das unter stringenten Bedingungen an vorstehendes Nukleinsauremolekul bindet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Kit, das zumindest eines der vorstehend gelisteten Nukleinsauremolekule aufweist.
In einem solchen Kit können neben den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, d.h. PCR-Primern oder Hybridisierungsson- den, sämtliche für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Reagenzien, Chemikalien und Puffersubstanzen sowie eine ausführliche Beschreibung des durchzuführenden erfindungsgemäßen oder eines anderen Verfahrens enthalten sein. Dies hat den besonderen Vorteil, dass dadurch ein fehlerfreies Arbeiten, insbesondere von Großlabors mit angelerntem Personal sichergestellt wird, d.h. Handhabungsfehler bspw. beim Ansetzen der Puffer, bei der Durchführung des Verfahrens etc., weitgehend vermieden werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Auffinden von an gegenüber dem Wildtyp genetisch verändertem humanem Omi/HtrA2-Protein bindenden Substanzen, das folgende Schritte aufweist (a) Inkontaktbringen eines Peptides, das sich von dem genetisch veränderten Omi/HtrA2-Protein ableitet, mit einer Testsubstanz unter Bedingungen, die die Bindung der Testsubstanz an das Peptid ermöglicht, und (b) Feststellung, ob eine Bindung der TestSubstanz an das Peptid stattgefunden hat, wobei die genetische Veränderung ein Aminosäureaustausch an Aminosäureposition 141 und/oder an Aminosäureposition 399 des Omi/HtrA2-Proteins ist, durch den ein Alaninmolekül gegen ein Serinmolekül bzw. ein Glycinmolekül gegen ein Serinmolekül ausgetauscht ist.
Die neu aufgefundene Korrelation von an Aminosäureposition 141 bzw. 399 genetisch verändertem Omi/HtrA2-Protein mit dem klinischen Erscheinungsbild des Morbus Parkinson macht das so veränderte Protein zu einem potenziellen Target für einen gezielten pharmakologischen Eingriff mittels selektiv zielgerichteter
Substanzen. Das vorstehend beschriebene neue Verfahren schafft nun erstmals die Möglichkeit, derartige Substanzen aufzufinden, die zielgerichtet an das veränderte Omi/HtrA2-Protein binden und deshalb hohes therapeutisches Potenzial aufweisen und Nebenwirkungen weitgehend vermeiden.
Dabei haben die Erfinder erkannt, dass zum Auffinden von derartigen Substanzen die Bereitstellung eines solchen Peptides ausreicht, das sich von dem genetisch veränderten Omi/HtrA2- Protein ableitet, aber nach wie vor die genetisch veränderte Aminosäureposition 141 bzw. 399 aufweist. Dadurch wird das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich vereinfacht.
Die zu testende Substanz kann in jeglicher denkbaren chemischen, biochemischen oder biologischen Form vorliegen, d.h. als ein Molekül, wie eine chemisch definierte Verbindung, ein Peptid, Protein, Antikörper, Aptamer oder als ein Ion oder Atom.
Nach diesem neuen Verfahren wird festgestellt, ob die Testsubstanz an das Peptid bindet, d.h. ob ein Zustand vorherrscht, in dem die zu testende Substanz sich zumindest in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem Peptid befindet und deshalb möglicherweise die Aktivität dieses Peptides beeinflussen kann.
Schritt (b) erfolgt mittels im Stand der Technik etablierter molekularbiologischer und biochemischer Methoden, bspw. affinitäts- chromatografischer oder elektrophoretischer Techniken.
Bedingungen, die die Bindung der Testsubstanz an das Peptid ermöglichen, sind im Bereich der Protein- oder Enzymbiochemie
hinreichend bekannt; diese Bedingungen werden bspw. durch die Verwendung von üblichen physiologischen oder biologischen Puffersystemen geschaffen, wie bspw. Tris-, Hepes-, oder PBS- basierenden Puffern, bspw. unter Zusatz von verschiedenen Salzen in geeigneten Konzentrationen, sowie anderen üblichen Agenzien.
Auf Grund der äußerst bedeutsamen pharmakologischen Eigenschaften einer solchen aufgefundenen Substanz für eine Behandlung von Morbus Parkinson ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch eine mittels dieses vorstehend beschriebenen Verfahrens aufgefundene Substanz, sowie eine diese Substanz enthaltende, vorzugsweise pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie ggf. weitere Hilfsstoffe enthält. Geeignete pharmazeutische Träger und Hilfsstoffe sind im Stand der Technik bekannt; vgl. Kibbe, A.H., (2000), „Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Auflage, American Phar- maceutical Association and Pharmaceutical Press.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen und den Figuren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun an Hand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen erläutert, in denen
Fig. 1 die mittels dHPLC aufgefundene Exon 1-Mutation ( G421T → A141S) zeigt;
Fig. 2 die Bestätigung der Exon 1-Mutation mittels direkter Sequenzierung zeigt;
Fig. 3 die Bestätigung der Exon 1-Mutation mittels direkter Pyrosequenzings zeigt;
Fig. 4 die mittels dHPLC aufgefundene Exon 7-Mutation ( G1195A → G399S) zeigt;
Fig. 5 die Bestätigung der Exon 7-Mutation mittels direkter Sequenzierung zeigt;
Fig. 6 die Bestätigung der Exon 7-Mutation mittels RFLP- Analyse zeigt;
Fig. 7 das Ergebnis des Zytotoxizitätstests unter Verwendung von Staurosporin zeigt,
Fig. 8 das Ergebnis des Zytotoxizitätstests unter Verwendung von MGI32 zeigt, und
Fig. 9 das Ergebnis eines Mitochondrienfunktionstests unter Verwendung von Staurosporin zeigt.
Beispiel 1 : Mutationsanalyse des Omi/fftrA2-Gens
411 bzw. 514 an Morbus Parkinson erkrankte Patienten sowie über 300 gesunden Kontrollpersonen wurden biologische Proben entnommen und aus diesen gemäß Standardverfahren die DNA isoliert. Die DNA wurde mittels PCR amplifiziert . Die hierbei verwendeten PCR-Primer sind in nachstehender Tabelle I gelistet:
Tabelle I
Mit den Amplifikaten wurde ein Mutationsscreening durchgeführt. Das Mutationsscreening wurde mittels der dHPLC-Mutations- detektionsSysteme der Firma Transgenomic (WAVE) durchgeführt. Die dHPLC nutzt das unterschiedliche Schmelzverhalten von Homo- und Heteroduplex-DNA. Hierbei wird doppelsträngige DNA mittels TEAA (Triethylammoniumacetat) an eine HPLC-Säule gebunden und durch einen ansteigenden Acetonitrilgradienten von der Säule abgelöst. Die DNA-Konzentration des Acetonitrilpuffers wird nach der Säule von einem Laser detektiert. Kommen in einem doppelsträngigen DNA-Strang heterozygote Basenaustausche auf einem Strang bei gegenüberliegenden Basen vor, kommt es durch
die Instabilität an dieser Stelle zu einer verfrühten Ablösung von der HPLC-Säule, was sich in einer Verschiebung des Detekti- onspeaks auf dem WAVE-System auswirkt. Durch Unterschiede des AblösungsZeitpunktes der DNA können die Mutationen detektiert werden .
Die eingesetzte DNA liegt als PCR-Ampli ikat von Patienten bzw. gesunden Kontrollpersonen vor, wobei jedes Exon einzeln ampli- fiziert wird. Um mögliche Mutationen eines Exons als Heteroduplex zu detektieren, wird das PCR-Produkt vor dem Einsatz auf dem WAVE-Gerät denaturiert und unter langsamer Abkühling wieder renaturiert. Dabei können sich Wildtyp- und mutierte DNA- Stränge aneinander lagern und Heteroduplizes ausbilden. Da sich homozygote Mutationen dabei nicht detektieren lassen, wurde unter Berücksichtigung der relativen Seltenheit von Parkinson- Mutationen DNAs von jeweils zwei Patienten miteinander gepoolt und dann mittels der dHPLC gemessen. Da somit auffällige Detek- tionspeaks immer das Ergebnis zweier Patientenproben sind, wurden die jeweiligen Patientenproben nochmals mit Referenz- DNAs (bezogen von dem „Centre d'etudes des polymorphismes hu- maines" (CEPH), Paris, Frankreich) gemessen. Die hier noch auffälligen Proben wurden direkt auf einem Beckmann-Kapillar- sequenzer sequenziert.
Die optimierten dHPLC-Bedingungen für die entwickelten PCR- Primerpaare sind in nachfolgender Tabelle II zusammengefasst:
Tabelle II
* Puffer B = 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA), 25 % Acetonitril
Mittels dieser Methode konnten zwei Mutationen im Omi /HtrA2-Gen identifiziert werden. Bei der ersten Mutation handelt es sich um eine Nukleotidaustauschmutation im Exon 1 des Gens, bei der an Position 421 des offenen Leserasters ein dGMP gegen ein dTMP ausgetauscht wurde (vgl. Fig. 1), was auf Proteinebene an Position 141 zu einem Austausch eines Alanins gegen ein Serin führt. Diese Mutation wurde bei 25 von insgesamt 414 Morbus- Parkinson-Patienten und ausschließlich in heterozygotem Zustand gefunden.
Ferner konnte eine zweite Mutation im Omi/HtrA2-Gen aufgefunden werden, bei der an Position 1195 des offenen Leserasters im Exon 7 ein dGMP gegen ein dAMP ausgetauscht wurde (vgl. hierzu Fig. 4), was auf Proteinebene in einem Austausch von Glycin gegen Serin -an Position 399 resultiert. Diese Mutation wurde
bei 4 von insgesamt 514 Morbus-Parkinson-Patienten und ebenfalls ausschließlich in heterozygotem Zustand gefunden.
Das Vorhandensein der Mutation im Exon 1 wurde mittels direkter Sequenzierung verifiziert (vgl. Fig. 2). Ferner konnte das Vorliegen dieser Mutation über Pyrosequencing bestätigt werden (vgl. Fig. 3); hierbei kamen biotinylierte Varianten der in Tabelle I gelisteten PCR-Primer zum Einsatz .
Die Nukleotidaustauschmutation' im Exon 7 wurde ebenfalls mittels direkter Sequenzierung (vgl. Fig. 5) und ferner mittels Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP) -Analyse nach Mval-Verdau bestätigt. Bei der Wildtypsequenz entstehen nach Restriktion des Amplifikats von Exon 7 (163 Basenpaare) mit Mval drei Fragmente: 113 bp, 44 bp und 6 bp. Durch den Basenaustausch von G zu A in Position 1195 der kodierenden Sequenz geht eine zuvor bestehende Restriktionsschnittstelle für das Enzym verloren (vgl. Fig. 6).
Um die Relevanz der beiden aufgefundenen Mutationen im Hinblick auf Morbus Parkinson zu bestimmen, wurden Chromosomen von gesunden alterskorrelierenden Kontrollpersonen auf beide Mutationen hin mittels der zuvor genannten Verfahren gescreent. Bei dieser Vorgehensweise konnte bei 740 Chromosomen gesunder Kontrollpersonen keinerlei Exon 7-Mutation nachgewiesen werden. Bei 662 Chromosomen gesunder Kontrollpersonen konnte lediglich in 10 Fällen die Exon 1-Mutation gefunden werden (p=0,05).
Das Vorliegen einer der beiden aufgefundenen Mutationen korre- liert demnach mit einer Erkrankung an bzw. Veranlagung für
Morbus Parkinson. Beide Mutationen sind deshalb wertvolle diagnostische Marker für Morbus Parkinson.
Beispiel 2: Zytotoxizitätstests mit Zellen, die genetisch verändertes Omi/HtrA2-Protein exprimieren
Um die pathogenetische Relevanz der beiden im Ctai/lϊtrA2-Gen aufgefundenen Mutationen zu analysieren, wurde mittels eines Zytotoxizitätstests untersucht, ob Zellen, die entsprechend genetisch verändertes Omi/HtrA2-Protein exprimieren, sensitiver gegenüber Zytotoxinen sind, d.h. bei entsprechender Exposition vermehrt in die Apoptose eintreten.
Dieser Test wurde mit Hilfe des Cytotoxicity Detection Kits (LDH) der Firma Röche durchgeführt. Als Maß für die Apoptose dient hierbei die nach Kontakt mit den Toxinen von den apoptotischen Zellen aus dem Cytosol in das umgebende Medium freigesetzte Laktatdehydrogenase (LDH) . Diese wiederum wird über die Umsetzung eines Tetrazoliumsalzes zu Formazan bestimmt, die sich durch einen Farbumschlag von gelb (Tetrazoliumsalz) zu rot (Formazan) mittels eines ELISA-Readers bei einer Wellenlänge von 490 n messen lässt. Als Referenzabgleich wird die Absorption bei 650 nm gemessen.
Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden je 70.000 HEK293-Zellen (Zellen, die Wildtyp Omi/HtrA2-Protein oder entsprechend imitiertes Omi/HtrA2-Protein stabil exprimieren; hergestellt gemäß Standardverfahren, wie z.B. beschrieben in Sambrook und Russell (2001), Molecular cloning - a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, dessen Inhalt durch Bezugnahme in die Beschreibung einbezogen ist) in einer 24-Well-
Platte ausgesät. Die Zellen wurden für 24 Stunden unter normalen Kulturbedingungen in DMEM (Invitrogen) , 10 % inaktiviertem fötalem Kälberserum (Invitrogen), 1 % Penicillin/Strepto ycin (Invitrogen) inkubiert. Anschließend wird das Kulturmedium abgenommen und gegen LDH-Assay-Medium (DMEM) , 1 % inaktiviertes fötales Kälberserum, Penicillin/Streptomycin ersetzt, welches als Zytotoxin entweder 0,5 μM Staurosporin oder 3,0 μM MG132 oder als Negativkontrolle Lösungsmittel enthielt. Der Test wurde dabei als Dreifachtest (jeweils für vergiftete Zelllinien und Kontrollen) durchgeführt. Als Hintergrundwert für den ELISA-Reader wurde das entsprechende Medium in ein leeres Well überführt und mit den Zellen inkubiert.
Bei Verwendung von MG132 erfolgte eine 24stündige Inkubation, bei Verwendung von Staurosporin erfolgte eine 6stündige Inkubation. Nach diesen Inkubationszeiten wurden 150 μl je Well abgenommen und zentrifugiert . Der Zentrifugationsschritt diente zur Sedimentation abgelöster Zellen, die durch spätere Apoptose die reale LDH-Konzentration hätten verändern können. Nach der Zentrifugation wurden 100 μl des Uberstandes in eine 96-Well- Platte überführt. Die verbliebenen 50 μl wurden resuspendiert und in die entsprechenden Wells der 24-Well-Platte zurückgegeben.
Um die Gesamtmenge an LDH zu detektieren, welche im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellen pro Well steht, wurden dann pro Well 50 μl einer 10%igen Triton X-100-Lösung zupipettiert, um die noch lebenden Zellen zu lysieren. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten wurden dann wiederum 100 μl des abzentrifugier- ten Überstandes in die 96-Well-Platte pipettiert. In jedes zu
messende Well der 96-Well-Platte gab man dann 100 μl LDH-Assay- Medium und inkubierte bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 1 N HC1 (Sigma) gestoppt und mittels des ELISA-Readers gemessen. Der LDH-Wert ergibt sich dann aus dem Quotienten der Absorption des ersten und zweiten Überstandes eines Wells und kann somit als Wert für den Anteil zugrunde gegangener Zellen verwendet werden. Der Mittelwert aus drei gleich behandelten Wells ergibt den Anteil abgestorbener Zellen für eine Messung mit Standardabweichung.
Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in den Figuren 7 und 8 dargestellt. Dabei zeigt sich, dass die HEK293-Zellen, die die Exon 7-, d.h. die G1195A-Mutation (G399S) exprimierten, mehr als fünfmal sensitiver gegenüber Staurosporin als die Wildtyp-HEK293-Zellen waren; Fig. 7, vgl. erste Säule mit fünfter Säule von links .
Des weiteren zeigt sich, dass die HEK293-Zellen, die die Exon 1-, d.h. G42IT-Mutation (A141S) exprimierten, ungefähr 1,4 Mal sensitiver gegenüber MGI32 als Wildtyp-HEK293-Zellen waren; Fig. 8, vgl. erste Säule mit dritter Säule von links.
Beispiel 3: Funktionstest an Mitochondrien aus Zellen, die genetisch verändertes Omi/HtrA2-Protein exprimieren
Aufgrund der beobachteten morphologischen Veränderungen der Mitochondrien in Zellen mit Überexpression von mutiertem Omi/HtrA2 wurde die Mitochondrien-Funktion in diesen Zellen untersucht.
Als Marker für die mitochondriale Homöostase wurde in SH-SY5Y- Zellen, die Wildtyp oder mutiertes (S141 or S399) Omi/HtrA2 stabil exprimierten, das mitochondriale Membranpotential mittels JC-1 durch FACS-Analyse (Durchflusszytometer) gemessen.
JC-1 ist ein grün fluoreszierender Farbstoff, der zur Messung des mitochondriellen Membranpotentials eingesetzt werden kann. Er besitzt die Eigenschaft durch zelluläre Membranen zu diffundieren und liegt dabei als Monomer vor, welches unter Anregung eines 488 nm-Lasers grün fluoresziert. In intakten Mitochondrien kommt es durch das mitochondrielle Membranpotential zu einer Akkumulation des Farbstoffes wodurch sich JC-1 Aggregate bilden. Die Aggregate emitieren nun in einer rot fluoreszierenden Wellenlänge das Anregungslicht zurück und sind damit sowohl im Mikroskop als auch im Durchflusszytometer von den grün fluoreszierenden Monomeren deutlich zu unterscheiden. Somit kann man mit JC-1 das mitochondrielle Membranpotential von Mitochondrien sehr gut messen und auch Aussagen über den frühen Apoptosebeginn von Zellen machen, da das Membranpotential zu einem sehr frühen Zeitpunkt in der Apoptose zusammenbricht.
Als Modell für zellulären Stress wurde Staurosporin verwendet, um einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials zu provozieren.
Der JC-1 Assay wurde nach der Beschreibung des Farbstoffes von Molecular Probes angepasst. Hierzu wurden Zellen 24 Stunden vor dem Vergiften in 6-well Platten ausgesät (HEK293: 700.000 Zellen/well, SH-SY 5Y: 1.000.000 Zellen/well) und für 24 Stunden adhärent anwachsen gelassen. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit den entsprechenden Giften in ihrem normalem Zellkulturmedi-
um weiterkultiviert und nach verschiedenen Inkubationszeiten für die Analyse weiterverwendet.
Die Zellen wurden dann mit Trypsin aus der Zellkulturschale abgelöst, abzentrifugiert (1.200 rpm, 4 Minuten) und einmal in PBS gewaschen. Nach dem Waschen erneut zentrifugiert und dann in 500 μl einer 5μg/ml konzentrierten JC-1/PBS-Lösung resuspendiert. Die Zellen wurden dann für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Auf die Inkubation mit dem JC-1 folgten drei Waschschritte mit PBS, worauf sofort die Analyse im Durchflusszytometer folgte .
Um die Zellpopulation zwischen grüner und roter Fluoreszenz abzugrenzen und die Einstellung im Durchflusszytometer zu machen, wurden Zellen ohne JC-1, mit JC-1 und mit CCCP behandelte Zellen mit JC-1 verwendet. CCCP ist eine Protonophore , welche das mitochondrielle Membranpotential reversibel aufhebt. Durch Behandlung mit CCCP, konnte nach der Färbung also nur die grüne Fluoreszenz der JC-1 Monomere angeregt werden. Nach der Einstellung des Assays im Durchflusszytometer wurden die Proben dann gemessen und ausgewertet.
Das Ergebnis dieses Experimentes ist in Fig. 9 dargestellt. Hier wurden die verschiedenen Zellen für 4 Stunden mit 0.5 μM Staurosporin behandelt.
Auf der y-Achse ist die Abnahme des Membranpotentials in Prozent angegeben (ΔΨm [loss in percent]). Auf der x-Achse ist im linken Ansatz das Ergebnis der Messungen an Wildtyp-Zellen (Omi/HtrA2 wt) , im mittleren Ansatz an Zellen mit der Exon 1-
Mutation (Omi/HtrA2 S141), und im rechten Ansatz an Zellen mit der Exon 7-Mutation (Omi/HtrA2 S399) dargestellt.
Der jeweils linke helle Balken zeigt das Ergebnis der Messungen an unbehandelten bzw. mit Dimethylsufoxid behandelten Zellen (Control (DMSO)), der jeweils rechte dunkle Balken zeigt das Ergebnis der Messungen an mit 0.5 μM Staurosporin behandelten Zellen (Staurosporine 0.5 μM) .
Dabei zeigte die Analyse der JC-1 Fluoreszenz, dass es in Zellen die die S141- und S399-Mutationen im Omi/HtrA2-Protein aufwiesen nach der Behandlung mit Staurosporin im Vergleich zu Wildtyp-Zellen zu einer deutlichen Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials kommt.
Die aufgefundenen Mutationen im Omi/HtrA2-Protein führen also zu einer Schädigung der Mitochondrienfunktion.
Bei den beiden neu aufgefundenen Mutationen im humanen Omi /HtrA2-Gen handelt es sich folglich um sich erheblich auf die Integrität der Zellen auswirkende genetische Veränderungen. Die Inkubation solcher genetisch veränderter Zellen mit Zytoto- xinen führt zu einem vermehrten Eintritt dieser in die Apoptose. Von den Erfindern wurden damit erstmals solche mit Morbus Parkinson in Zusammenhang stehende genetische Veränderungen aufgefunden, die sowohl in die gestörte Proteindegradation - das Omi/HtrA2-Protein ist Bestandteil pathognomonischer Proteinaggregate, sog. Lewy-Körper, was die Erfinder durch eigene Experimente bestätigen konnten - als auch, wie die vorstehend diskutierten Daten zeigen, in die Regulation der Apoptose in- volviert sind.
Durch die Bereitstellung der erfinderischen Lehre wird deshalb nicht nur ein diagnostisches Werkzeug zum Auffinden einer Erkrankung an bzw. Veranlagung für Morbus Parkinson bereitgestellt, sondern auch die Basis für die Entwicklung eines Modellsystems geschaffen, mittels dessen bspw. neue therapeutisch wirksame Antiparkinsonsubstanzen aufgefunden oder die oleku- larpathologischen Grundlagen der Morbus-Parkinson-Erkrankung besser verstanden werden können.