WO2005052188A1 - Verfahren zur hybridisierung biologischer makromoleküle auf an einer festkörperoberfläche gebundene doppelsträngige nukleinsäureabschnitte - Google Patents

Verfahren zur hybridisierung biologischer makromoleküle auf an einer festkörperoberfläche gebundene doppelsträngige nukleinsäureabschnitte Download PDF

Info

Publication number
WO2005052188A1
WO2005052188A1 PCT/EP2004/013284 EP2004013284W WO2005052188A1 WO 2005052188 A1 WO2005052188 A1 WO 2005052188A1 EP 2004013284 W EP2004013284 W EP 2004013284W WO 2005052188 A1 WO2005052188 A1 WO 2005052188A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
bound
liquid
biological macromolecules
spot
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/013284
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Gauer
Original Assignee
Advalytix Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advalytix Ag filed Critical Advalytix Ag
Publication of WO2005052188A1 publication Critical patent/WO2005052188A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the invention relates to a method for hybridizing biological macromolecules to nucleic acid sections bound to a solid surface, in which a solid surface is provided with at least one spot with first, at least partially double-stranded nucleic acid sections bound to it, and a liquid with biological macromolecules is applied to this solid surface.
  • nucleic acid segments are e.g. B. PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction) products or genomic DNA.
  • PCR is a well-known method for the duplication of specific DNA sequences, as it is e.g. B. is described in US 4,683,195 A and US 4,683,202 A. As a rule, two complementary strands are duplicated.
  • PCR products can be used as “probes” in microarray experiments as follows.
  • Such microarrays comprise a solid surface, for example a chip, of typically a few mm 2 to a few cm 2 Solid surface is usually a variety of individual spots, the distance of such spots z. B. can be a few 10 microns to a few millimeters.
  • the spots are advantageously arranged in the form of a one- or two-dimensional array, which simplifies the automated treatment.
  • microarrays are first produced by e.g. B. PCR products in the form of a one- or two-dimensional array on a solid surface, z. B. mocking similar to an ink jet process or using a contact printing process.
  • the PCR products are generally double-stranded and have a length of approximately 200 to 2000 base pairs.
  • the bond to the solid surface or the crosslinking can, for. B. by UV cross-linking or by baking at high temperature.
  • Typical spot diameters are around 100 ⁇ m and the number of spots per microarray can be up to 100,000.
  • cDNA molecules or other PCR products e.g. B. hybridized cDNA molecules or other PCR products, the sequences of which are at least partially complementary to the spotted PCR products.
  • the cDNA molecules or the other PCR products are applied in solution to the microarray with the spotted PCR products, thus enabling the reaction.
  • the number of probes required for a reaction with the molecules from the There are typically about 10 6 to 10 8 probes per spot with an exemplary diameter of 100 ⁇ m, of which only about 1 per mille to 10 percent is available for binding with molecules in the solution this is due to geometry-related steric hindrance or competitive renaturation ( Reassociation), i.e. the reaction with a complementary probe.
  • Reassociation steric hindrance or competitive renaturation
  • a complementary probe On the other hand, in a gene expression experiment about 10 4 to 10 9 biological macromolecules.
  • B. cDNA molecules within the diffusion radius are present in the solution, so that for strongly expressed genes within the typical diffusion radius of an overnight experiment there are not enough binding sites available and the signal saturates.
  • the object of the present invention is to provide an improved method for hybridizing biological macromolecules to nucleic acid sections bound to a solid surface, in which the number of probes available for binding is increased and the signal-to-noise ratio is improved.
  • the method according to the invention is based on a combination of temperature steps and the mixing or moving of the molecules in the solution.
  • a solid surface which has at least one spot to which first nucleic acid sections are bound, which are at least partially double-stranded.
  • a liquid with biological macromolecules is applied to this solid surface, which is intended to react with the nucleic acid sections bound to the spots.
  • the temperature is e.g. B. with a resistance heater to a value at which any existing bonds between the two strands of the at least partially double-stranded nucleic acid trimmings present at the spots are at least partially released.
  • the temperature is therefore chosen so high that the double strands renatured on the surface of the solid break open.
  • the necessary temperature increase depends on the probes used and can typically be e.g. B. be a few degrees to a few tens of degrees.
  • the liquid is advantageously at rest during this step.
  • a typical reaction time is awaited, during which the macromolecules from the liquid can hybridize with the single strands of the nucleic acid sections at the spots.
  • this Reaction time hybridize molecules from the liquid with the probes bound to the spots, e.g. B. until saturation is reached.
  • the hybridization process of molecules from the liquid on the nucleic acid sections of the spots results in a local depletion in the vicinity of the spots on molecules available for reaction with the nucleic acid sections on the spots.
  • the liquid is set in motion in order to eliminate the local depletion which has arisen in this way.
  • This step according to the invention ensures that the original number of macromolecules available for the reaction is again present in the liquid in the diffusion radius around the individual spots.
  • the step of increasing the temperature can be carried out directly after the application of the liquid with the biological macromolecules to the solid surface in order to release bonds from probes bound to the spots and complementary probes bound to the spots.
  • a typical reaction time between the biological macromolecules and the nucleic acid sections bound to the at least one spot is initially waited for. During this reaction time, molecules from the liquid can hybridize with the nucleic acid sections which are bound to the spots and which are not double-stranded. The resulting local depletion of molecules available for reaction with the nucleic acid sections is eliminated by setting the liquid in motion.
  • This step of the alternative procedure ensures that the original number of macromolecules available for the reaction is again present in the liquid in the diffusion radius around the individual spots.
  • hybridization temperatures are, depending on the nucleic acid sections and buffers used, e.g. B. between 35 ° C and 65 ° C.
  • the movement in the liquid can be achieved by a stirring or shaking process.
  • the application of sound waves, preferably surface sound waves, to the solid surface is particularly advantageous.
  • the impulse transfer of such sound waves or surface acoustic waves to the liquid brings about an effective and precise movement of the liquid on the surface.
  • the use of surface acoustic waves to generate movement in small amounts of liquid is generally described in DE 101 42 789 C1.
  • Interdigital transducers can be easily and inexpensively implemented on a solid surface.
  • the method according to the invention can be carried out on a single spot.
  • a microarray is advantageously used to parallelize the process control, with different nucleic acid segments possibly being bound to different spots of this microarray.
  • the process protocol according to the invention can be run through several times, the number of bonds of the macromolecules from the liquid with the nucleic acid sections to the spots increasing in each cycle.
  • the typical reaction time can advantageously first be waited for in each cycle and only then can the liquid be set in motion.
  • the temperature increase step loosens, at least in part, bonds of sample molecules to probe molecules on the spots that were formed during the previous cycle.
  • This temperature-induced binding solution process leads to a local increase in the concentration of sample molecules in the vicinity of the spot, so that in the subsequent hybridization step a larger number of sample molecules cool is available for binding to probe molecules of the spot. If, according to the advantageous embodiment of the method, the typical reaction time is first waited for after cooling after the cooling and the liquid is only then set in motion again, it is ensured that this local increase in concentration is not canceled out by movement of the liquid during the typical reaction time.
  • the liquid can already be set in motion during or after the increase in temperature in order to provide sufficient macromolecules in the diffusion radius around the spot.
  • the typical reaction times between the macromolecules in the liquid and the nucleic acid sections bound to the spots and the temperatures to be used during the binding solution process can be determined by preliminary experiments or can be estimated from values that are necessary for the hybridization of the materials used or for breaking the bond between them Materials are known.
  • the typical reaction time comprises at least the time that the sample molecules need to move from the diffusion radius to the probes to get on the spots.
  • the method according to the invention can be used particularly advantageously for hybridizing second nucleic acid sections in the liquid to first nucleic acid sections which are bound to the surface of the solid.
  • the first and / or the second nucleic acid sections z.
  • an embodiment of the method according to the invention is described in detail using an example experiment. The example described describes the hybridization of cDNA molecules on PCR products which are bound to the surface of the solid in spots.
  • the number of PCR products on a spot per strand should be 10 8 .
  • the signal is increased by the following procedure. It is also possible to run through the cycle several times.
  • the temperature is raised to a value such that the binding of both the cDNA molecules with the probes bound to the spots and the binding of the Melt at least some of the complementary strands of the bound PCR products with each other again. Depending on the material, this temperature is typically e.g. B. a few degrees to a few tens of degrees higher.
  • the sample liquid is at rest during this step. After the temperature has dropped again to the normal hybridization temperature, the cDNA molecules in the solution can hybridize with the probes, ie single strands of the PCR products bound to the spots.
  • the liquid is e.g. B. by application of surface acoustic waves for z. B. set in motion for an hour to maintain a sufficient number of macromolecules in the liquid within the diffusion radius around the individual spots despite the local depletion of the macromolecules available for the reaction caused by the hybridization.
  • the steps of increasing the temperature, cooling and waiting for a typical reaction time can be carried out cyclically. While with simple execution of the process steps, the liquid can be set in motion already during the temperature increase, the temperature decrease and the waiting of a typical reaction time in order to provide a sufficient number of molecules in the diffusion radius, the cyclical passage through the individual process steps is advantageous first waited the typical reaction time and then set the liquid in motion to provide sufficient macromolecules in the liquid within the diffusion radius around the spots for the next cycle.
  • both the bonds between the cDNA molecules with the PCR products bound to the spots and the binding of the complementary strands of the bound PCR products with one another are at least partially melted again in the temperature raising step.
  • This temperature-induced binding solution process leads to a local increase in the concentration of cDNA molecules above the spot, the number of which has now doubled to 2 ⁇ 10 6 compared to the initial concentration. Competing in the following hybridization step after re-cooling now double the number of cDNA molecules with a constant number of complementary probes of bound PCR products for a specific binding with bound probes compared to the initial concentration. This increases the number of cDNA molecules that will bind. The number of cDNA molecules bound increases with each cycle.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkörperoberfläche gebundene Nukleinsäureabschnitte, bei dem eine Festkörperoberfläche mit zumindest einem Spot mit daran gebundenen ersten, zumindest teilweise doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäureabschnitten bereit­gestellt wird, eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen auf diese Festkör­peroberfläche aufgebracht wird, die Temperatur auf einen Wert erhöht wird, bei dem mögliche Bindungen zwischen den beiden Strängen der an dem wenigstens einen Spot gebundenen, zumindest teilweise doppelsträngig vorliegenden Nuklein­säureabschnitte zumindest zum Teil aufgelöst werden. Nach Absenken der Tempe­ratur wird eine Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen und den an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten abgewartet und die Flüssigkeit in Bewegung versetzt.

Description

Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene doppelsträngige Nukleinsäureabschnitte
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene Nukleinsäureabschnitte, bei dem eine Festkorperoberflache mit zumindest einem Spot mit ersten daran gebundenen, zumindest teilweise doppelstrangig vorliegenden Nukleinsäureabschnitten bereitgestellt wird und eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen auf diese Festkorperoberflache aufgebracht wird.
Derartige Nukleinsäureabschnitte sind z. B. PCR-(Polymerase Chain Reaction, Polymerase Kettenreaktion)-Produkte oder genomische DNA.
Die PCR ist ein bekanntes Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen, wie es z. B. in US 4,683,195 A und US 4,683,202 A beschrieben ist. Es werden hierbei in der Regel zwei komplementäre Stränge vervielfältigt. PCR- Produkte können wie folgt als „Sonden" in Microarray-Experimenten eingesetzt werden. Derartige Microarrays umfassen eine Festkorperoberflache, z. B. einen Chip, von typischerweise einigen mm2 bis einigen cm2 Fläche. Auf der Festkörperoberfläche befindet sich in der Regel eine Vielzahl einzelner Spots, wobei der Abstand solcher Spots z. B. einige 10 μm bis einige Millimeter sein kann. Vorteilhafterweise sind die Spots in der Form eines ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet, wodurch die automatisierte Behandlung vereinfacht wird. Derartige Microarrays und ihre Verwendung speziell für biologische Untersuchungen sind in „DNA Microarrays", herausgegeben von M. Schena, Oxford University Press, N.Y., 2000 (Seiten 130/131) allgemein beschrieben. Eine Vorrichtung, mit der Hybridisierungsprozesse auf einem Microarray untersucht werden können, ist Gegenstand der DE 101 42 789 C1.
Bei bekannten Microarray-Experimenten werden zunächst Microarrays hergestellt, indem man z. B. PCR-Produkte in Form eines ein- bzw. zweidimensionalen Arrays auf eine Festkorperoberflache aufbringt, z. B. ähnlich einem Ink-Jet-Verfahren spottet oder unter Verwendung eines Kontaktdruckverfahrens. Die PCR-Produkte liegen im allgemeinen doppelstrangig vor und haben eine Länge von etwa 200 bis 2000 Basenpaaren. Die Bindung an der Festkorperoberflache bzw. die Quervernetzung kann z. B. durch UV-Cross-Linking oder durch Festbacken bei hoher Temperatur erfolgen. Typische Spotdurchmesser liegen bei etwa 100 μm und die Zahl der Spots pro Microarray kann bis zu 100.000 betragen.
Gegen die so an der Festkorperoberflache gebundenen PCR-Produkte werden andere biologische Makromoleküle, z. B. cDNA-Moleküle oder andere PCR- Produkte hybridisiert, deren Sequenzen zumindest teilweise komplementär zu den gespotteten PCR-Produkten sind. Dazu werden die cDNA-Moleküle bzw. die weiteren PCR-Produkte in Lösung auf das Microarray mit den gespotteten PCR- Produkten aufgebracht und so die Reaktion ermöglicht.
Nach einer typischen Reaktionszeit kann in bekannter Weise untersucht werden, ob bzw. in welchem Maße eine Reaktion der Moleküle in der Lösung mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten stattgefunden hat. Dazu kann z. B. die Fluoreszenz entsprechend präparierter Moleküle untersucht werden. An einem Spot des Microarrays findet folgender Reaktionsablauf statt. Während der Hybridisierungsreaktion kommt es zu einer kompetitiven Bindung zwischen dem jeweils ersten Strang (im folgenden auch „Sonde") der an dem Spot gebundenen Nukleinsäureabschnitte und dem ebenfalls gebundenen Komplementärstrang (im folgenden auch „komplementäre Sonde") einerseits und den biologischen Makromolekülen in der Lösung (im folgenden auch „Probenmoleküle") andererseits. Da lokal in der Regel eine höhere Dichte von Sonden und den ebenfalls gebundenen komplementären Sonden vorliegt als von den Molekülen in der Lösung, ist die Zahl der Sonden, die für eine Reaktion mit den Molekülen aus der Lösung zur Verfügung stehen, eher gering. Typischerweise befinden sich pro Spot eines beispielhaften Durchmessers von 100 μm etwa 106 bis 108 Sonden, von denen aber nur etwa 1 Promille bis 10 Prozent für eine Bindung mit Molekülen in der Lösung zur Verfügung steht. Gründe hierfür sind geometriebedingte sterische Hinderung oder kom- petitive Renaturierung (Reassoziation), also die Reaktion mit einer komplementären Sonde. Andererseits sind in einem Genexpressionsexperiment etwa 104 bis 109 biologische Makromoleküle, also z. B. cDNA-Moleküle innerhalb des Diffusionsradius in der Lösung vorhanden, so daß für stark exprimierte Gene innerhalb des typischen Diffusionsradius eines über-Nacht-Experimentes nicht genügend Bindungsstellen zur Verfügung stehen und das Signal in die Sättigung übergeht.
Zur Lösung dieser Problematik werden heutzutage bereits beim Spotten von PCR- Produkten auf die Festkorperoberflache denaturierende Substanzen (z. B. DMSO, Dimethylsulfoxid) zugegeben, die verhindern sollen, daß die PCR-Produkte, die an den Spots gebunden sind, renaturieren (reassoziieren). Während der Hybridisierungsreaktion selbst können derartige denaturierende Substanzen allerdings nicht in hoher Konzentration präsent sein, da sonst auch eine Bindung einer an einem Spot gebundenen Sonde mit einem komplementären Molekül aus der Lösung nicht möglich wäre. Während der Hybridisierungsreaktion bildet sich also die doppel- strängige Ausführung des an den Spots gebundenen PCR-Produktes teilweise wieder aus, so daß auch bei dieser bekannten Verfahrensführung die oben beschriebene kompetitive Reaktion stattfindet. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene Nukleinsäureabschnitte anzugeben, bei dem die Zahl der Sonden, die für die Bindung zur Verfügung stehen, erhöht ist und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert ist.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Hybridisierung gelöst, das die Merkmale des Anspruches 1 aufweist. Vorteilhafte Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand des Anspruches 11. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Kombination von Temperaturschritten und dem Mischen bzw. Bewegen der Moleküle in der Lösung.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Festkorperoberflache bereitgestellt, die zumindest einen Spot aufweist, an dem erste Nukleinsäureabschnitte gebunden sind, die zumindest teilweise doppelstrangig vorliegen. Auf diese Festkorperoberflache wird eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen aufgebracht, die mit den an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten reagieren sollen. Die Temperatur wird z. B. mit einer Widerstandsheizung auf einen Wert erhöht, bei dem möglicherweise existierende Bindungen zwischen den beiden Strängen der an den Spots zumindest teilweise doppelstrangig vorliegenden Nukleinsäureabeschnit- te wenigstens zum Teil gelöst werden. Die Temperatur wird also so hoch gewählt, daß die auf der Festkorperoberflache renaturierten Doppelstränge aufbrechen. Die notwendige Temperaturerhöhung ist abhängig von den verwendeten Sonden und kann typischerweise z. B. einige wenige Grad bis zu einigen wenigen zehn Grad betragen. Während dieses Schrittes befindet sich die Flüssigkeit vorteilhafterweise in Ruhe. Nach dem Absenken der Temperatur bzw. Abkühlenlassen auf die typische Hybridisierungsprozeßtemperatur wird eine typische Reaktionszeit abgewartet, während der Makromoleküle aus der Flüssigkeit mit den Einzelsträngen der Nukleinsäureabschnitte an den Spots hybridisieren können. Während dieser Reaktionszeit hybridisieren Moleküle aus der Flüssigkeit mit den an den Spots gebundenen Sonden, z. B. bis eine Sättigung erreicht ist. Durch den Hybridisie- rungsprozeß von Molekülen aus der Flüssigkeit an den Nukleinsäureabschnitten der Spots entsteht in der Umgebung der Spots eine lokale Verarmung an zur Reaktion mit den Nukleinsäureabschnitten an den Spots zur Verfügung stehenden Molekülen. Während des Hybridisierungsprozesses und/oder danach wird die Flüssigkeit in Bewegung versetzt, um die so entstandene lokale Verarmung aufzuheben. Durch diesen erfindungsgemäßen Schritt ist gewährleistet, daß im Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum wieder im wesentlichen die ursprüngliche Anzahl von für die Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen in der Flüssigkeit vorliegt.
Der Schritt der Temperaturerhöhung kann direkt nach dem Aufbringen der Flüssigkeit mit den biologischen Makromolekülen auf der Festkorperoberflache durchgeführt werden, um Bindungen von an den Spots gebundenen Sonden und an den Spots gebundenen komplementären Sonden zu lösen. Bei einer alternativen Verfahrensführung wird nach dem Aufbringen der Flüssigkeit mit den biologischen Makromolekülen auf die Festkorperoberflache zunächst eine typische Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen und den an dem zumindest einen Spot gebundenen Nukleinsäureabschnitten abgewartet. Während dieser Reaktionszeit können Moleküle aus der Flüssigkeit mit den an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten, die nicht doppelstrangig vorliegen, hybridisieren. Die dadurch oberhalb der Spots entstehende lokale Verarmung an zur Reaktion mit den Nukleinsäureabschnitten zur Verfügung stehenden Molekülen wird durch Versetzen der Flüssigkeit in Bewegung aufgehoben. Dieser Schritt der alternativen Verfah- rensführung gewährleistet, daß im Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum wieder im wesentlichen die ursprüngliche Anzahl von für die Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen in der Flüssigkeit vorliegt.
Während der Hybridisierungsprozesse befindet sich das System bei einer Temperatur unterhalb derjenigen Temperatur, die zum Aufbrechen der Hybridisierungs- bindungen notwendig ist. Typische Hybridisierungstemperaturen liegen je nach verwendeten Nukleinsäureabschnitten und Puffern z. B. zwischen 35°C und 65°C.
Die Bewegung in der Flüssigkeit kann durch einen Rühr- oder Schüttelprozeß erreicht werden. Besonders vorteilhaft ist die Applikation von Schallwellen, vorzugsweise Oberflächenschallwellen auf der Festkorperoberflache. Der Impulsübertrag derartiger Schallwellen bzw. Oberflächenschallwelien auf die Flüssigkeit bewirkt eine effektive und präzise Bewegung der Flüssigkeit auf der Oberfläche. Die Verwendung von Oberflächenschallwellen zur Erzeugung von Bewegung in kleinen Flüssigkeitsmengen ist allgemein in DE 101 42 789 C1 beschrieben. Vorrichtungen zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen, z. B. Interdigitaltransducer, lassen sich einfach und kostengünstig auf einer Festkorperoberflache realisieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf einem einzelnen Spot durchgeführt werden. Vorteilhafterweise wird zur Parallelisierung der Prozeßführung jedoch ein Microarray eingesetzt, wobei ggf. an unterschiedlichen Spots dieses Microarrays unterschiedliche Nukleinsäureabschnitte gebunden sind.
Das erfindungsgemäße Verfahrensprotokoll kann mehrfach durchlaufen werden, wobei sich bei jedem Zyklus die Zahl der Bindungen der Makromoleküle aus der Flüssigkeit mit den Nukleinsäureabschnitten an den Spots erhöht.
Beim zyklischen Durchführen der Schritte der Temperaturerhöhung, des Absen- kens der Temperatur, des Abwartens einer typischen Reaktionszeit und des Ver- setzens der Flüssigkeit in Bewegung kann vorteilhafterweise in jedem Zyklus zunächst die typische Reaktionszeit abgewartet werden und die Flüssigkeit erst dann in Bewegung versetzt werden. Durch den Temperaturerhöhungsschritt werden Bindungen von Probenmolekülen an Sondenmolekülen auf den Spots zumindest zum Teil wieder gelöst, die während des vorhergehenden Zyklus entstanden sind. Durch diesen temperaturinduzierten Bindungslösungsprozeß kommt es zu einer lokalen Konzentrationserhöhung von Probenmolekülen in der Umgebung des Spots, so daß in dem folgenden Hybridisierungsschritt eine größere Anzahl von Probenmole- külen für eine Bindung an Sondenmoleküle des Spots zur Verfügung steht. Wird gemäß der vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens beim zyklischen Durchführen nach dem Abkühlen zunächst die typische Reaktionszeit abgewartet und die Flüssigkeit erst dann wieder in Bewegung versetzt, so ist gewährleistet, daß während der typischen Reaktionszeit diese lokale Konzentrationserhöhung nicht durch eine Bewegung der Flüssigkeit wieder aufgehoben wird.
Werden die einzelnen Schritte nur jeweils einmal durchgeführt, kann die Flüssigkeit bereits während oder nach der Erhöhung der Temperatur in Bewegung versetzt werden, um ausreichend Makromoleküle im Diffusionsradius um den Spot zur Verfügung zu stellen.
Die typischen Reaktionszeiten zwischen den in der Flüssigkeit vorhandenen Makromolekülen und an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten und die einzusetzenden Temperaturen während des Bindungslösungsprozesses können durch Vorabexperimente bestimmt werden oder aus Werten abgeschätzt werden, die für die Hybridisierung der verwendeten Materialien bzw. für das Aufbrechen der Bindung zwischen diesen Materialien bekannt sind.
Wird während des Schrittes des Abwartens einer typischen Reaktionszeit die Flüssigkeit nicht in Bewegung versetzt, also insbesondere gemäß der geschilderten vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens bei zyklischer Durchführung, so umfaßt die typische Reaktionszeit zumindest diejenige Zeit, die die Probenmoleküle benötigen, um aus dem Diffusionsradius an die Sonden auf den Spots zu gelangen.
Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Hybridisierung von zweiten Nukleinsäureabschnitten in der Flüssigkeit an ersten Nukleinsäureabschnitten, die an der Festkorperoberflache gebunden sind, einsetzen. Dabei können die ersten und/oder die zweiten Nukleinsäureabschnitte z. B. PCR- Produkte, cDNA-, genomische DNA- oder RNA-Moleküle sein. lm folgenden wird anhand eines Beispielexperimentes eine Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Detail geschildert. Das beschriebene Beispiel beschreibt die Hybridisierung von cDNA-Molekülen an PCR-Produkten, die an der Festkorperoberflache in Spots gebunden sind.
Zur Erläuterung wird beispielhaft angenommen, daß die Zahl der PCR-Produkte auf einem Spot je Strang 108 betragen soll. Etwa 1 Prozent, also 106 PCR-Produkte stehen dann typischerweise in einem über-Nacht-Experiment zur Hybridisierung zur Verfügung, da nur diese Zahl einzelsträngig vorliegt.
Auf die derart vorbereitete Festkorperoberflache mit den PCR-Produkten an den Spots wird eine Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten, zu den PCR-Produkten an den Spots zumindest teilweise komplementären Probenmolekülen, z. B. cDNA- Moleküle in einer Menge von z. B. 106 Molekülen in einem Volumen der Dimension eines Diffusionsradius eines typischen über-Nacht-Experimentes (ca. 1 mm) aufgebracht. Insgesamt stehen auf einem Array von ca. 1 cm2 etwa 108 Probenmoleküle für die Bindung zur Verfügung.
Unter den geschilderten Bedingungen wäre das Signal nach einem über-Nacht- Experiment in Sättigung. Weder eine Verlängerung der Hybridisierungszeit noch das Versetzen der Probenlösung in Bewegung führen zu einer Erhöhung des Signales, obwohl nur etwa 1 Prozent der vorhandenen cDNA-Moleküle eine Bindung eingegangen sind. Ein Grund hierfür ist die Konkurrenzreaktion, die aus der Bindung der beiden komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte besteht.
Gemäß einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Signal durch folgende Verfahrensführung erhöht. Dabei ist auch ein mehrmaliges Durchlaufen des Zyklus möglich.
Die Temperatur wird auf einen Wert erhöht, daß die Bindungen sowohl der cDNA- Moleküle mit den an den Spots gebundenen Sonden als auch die Bindung der komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte untereinander zumindest zum Teil wieder aufschmelzen. Je nach Material liegt diese Temperatur typischerweise z. B. einige Grad bis einige zehn Grad höher. Während dieses Schrittes ist die Probenflüssigkeit in Ruhe. Nachdem sich die Temperatur wieder auf die normale Hybridisierungstemperatur abgesenkt hat, können die cDNA-Moleküle in der Lösung mit den Sonden, also Einzelsträngen der an den Spots gebundenen PCR- Produkte hybridisieren. Während oder nach dem Hybridisierungsschritt wird die Flüssigkeit z. B. durch Applikation von Oberflächenschallwellen für z. B. für eine Stunde in Bewegung versetzt, um innerhalb des Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum trotz der durch die Hybridisierung hervorgerufenen lokalen Verarmung an zur Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen eine ausreichende Anzahl von Makromolekülen in der Flüssigkeit aufrecht zu erhalten.
Die Schritte der Erhöhung der Temperatur, der Abkühlung und des Abwartens einer typischen Reaktionszeit können zyklisch durchlaufen werden. Während bei nur einfacher Ausführung der Prozeßschritte die Flüssigkeit bereits während der Temperaturerhöhung, der Temperaturerniedrigung und des Abwartens einer typischen Reaktionszeit in Bewegung versetzt werden kann, um eine ausreichende Anzahl von Molekülen im Diffusionsradius zur Verfügung zu stellen, wird beim zyklischen Durchlaufen der einzelnen Prozeßschritte vorteilhafterweise zunächst die typische Reaktionszeit gewartet und dann die Flüssigkeit in Bewegung versetzt, um für den nächsten Zyklus ausreichend Makromoleküle in der Flüssigkeit innerhalb des Diffusionsradius um die Spots zur Verfügung zu stellen.
Bei mehrfachem Durchlaufen des Zyklus werden bei dem Temperaturerhöhungsschritt sowohl die Bindungen zwischen den cDNA-Molekülen mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten als auch die Bindung der komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte untereinander zumindest zum Teil wieder aufgeschmolzen. Durch diesen temperaturinduzierten Bindungslösungsprozeß kommt es zu einer lokalen Konzentrationserhöhung von cDNA-Molekülen oberhalb des Spots, deren Zahl sich nun mit 2 x 106 gegenüber der Ausgangskonzentration verdoppelt hat. Bei dem folgenden Hybridisierungsschritt nach Wiederabkühlung konkurriert jetzt die doppelte Zahl von cDNA-Molekülen mit einer konstanten Anzahl komplementärer Sonden von gebundenen PCR-Produkten um eine spezifische Bindung mit gebundenen Sonden im Vergleich zur Ausgangskonzentration. Dadurch wird die Zahl der cDNA-Moleküle, die eine Bindung eingehen wird, erhöht. Bei jedem Zyklus erhöht sich daher die Zahl der gebundenen cDNA-Moleküle.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene Nukleinsäureabschnitte mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen einer Festkorperoberflache mit zumindest einem Spot mit ersten daran gebundenen, teilweise doppelstrangig vorliegenden Nukleinsäureabschnitten, b) Aufbringen einer Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen auf die Festkorperoberflache, c) Erhöhen der Temperatur auf einen Wert, bei dem mögliche Bindungen zwischen den beiden Strängen der an dem wenigstens einen Spot gebundenen, zumindest teilweise doppelstrangig vorliegenden Nukleinsäureabschnitte zumindest zum Teil aufgelöst werden, d) Absenken der Temperatur bzw. Abkühlen lassen, e) Abwarten einer typischen Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen und den an dem zumindest einen Spot gebundenen Nukleinsäureabschnitten, und f) Versetzen der Flüssigkeit in Bewegung.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem zwischen den Schritten b) und c) eine typische Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen und den an den zumindest einen Spot gebundenen Nukleinsäureabschnitten abgewartet wird und während oder nach dem Abwarten der typischen Reaktionszeit die Flüssigkeit in Bewegung versetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Flüssigkeit mit Hilfe des Impulsübertrages von Schallwellen in Bewegung versetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem während Schritt f) die Flüssigkeit mit Hilfe des Impulsübertrages von Schallwellen in Bewegung versetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, bei dem der Impulsübertrag von Oberflächenschallwellen verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der Schritt f) bereits während des Schrittes c), des Schrittes d) und/oder des Schrittes e) begonnen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem eine Vielzahl von Spots eingesetzt wird, die vorzugsweise in Form eines ein- bzw. zweidimensionalen Arrays angeordnet sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Schritte c) bis f) ein- oder mehrfach wiederholt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem vor der Wiederholung des Schrittes c) auch der Schritt des Anspruches 2 wiederholt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, bei dem bei der ein- oder mehrfachen Wiederholung der Schritt f) erst nach dem Schritt e) begonnen wird.
11. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Hybridisierung von zweiten Nukleinsäureabschnitten an ersten Nukleinsäureabschnitten, die an der Festkörperoberfäche gebunden sind.
12. Verwendung nach Anspruch 11 , bei der die ersten und/oder die zweiten Nukleinsäureabschnitte PCR-Produkte, cDNA-, genomische DNA- oder RNA- Moleküle sind.
PCT/EP2004/013284 2003-11-28 2004-11-23 Verfahren zur hybridisierung biologischer makromoleküle auf an einer festkörperoberfläche gebundene doppelsträngige nukleinsäureabschnitte WO2005052188A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10355593.5 2003-11-28
DE2003155593 DE10355593B4 (de) 2003-11-28 2003-11-28 Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkörperoberfläche gebundene PCR-Produkte

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005052188A1 true WO2005052188A1 (de) 2005-06-09

Family

ID=34625334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/013284 WO2005052188A1 (de) 2003-11-28 2004-11-23 Verfahren zur hybridisierung biologischer makromoleküle auf an einer festkörperoberfläche gebundene doppelsträngige nukleinsäureabschnitte

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10355593B4 (de)
WO (1) WO2005052188A1 (de)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168948B1 (en) * 1995-06-29 2001-01-02 Affymetrix, Inc. Miniaturized genetic analysis systems and methods
DE10142788A1 (de) * 2001-08-31 2003-03-27 Advalytix Ag Vorrichtung und Verfahren zur Erzeugung dünner Flüssigkeitsfilme

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066802A1 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Genetag Technology, Inc. SYSTEMS AND METHODS TO QUANTIFY AND AMPLIFY BOTH SIGNALING AND PROBES FOR cDNA CHIPS AND GENES EXPRESSION MICROARRAYS
US6642046B1 (en) * 1999-12-09 2003-11-04 Motorola, Inc. Method and apparatus for performing biological reactions on a substrate surface
US20020090614A1 (en) * 2001-01-09 2002-07-11 Jia Zhang Direct measurement method for gene expression using single chain antisense array
JPWO2003027673A1 (ja) * 2001-07-31 2005-01-13 オリンパス株式会社 遺伝子検査装置およびそれを用いた標的核酸検出方法
US20030087292A1 (en) * 2001-10-04 2003-05-08 Shiping Chen Methods and systems for promoting interactions between probes and target molecules in fluid in microarrays

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168948B1 (en) * 1995-06-29 2001-01-02 Affymetrix, Inc. Miniaturized genetic analysis systems and methods
DE10142788A1 (de) * 2001-08-31 2003-03-27 Advalytix Ag Vorrichtung und Verfahren zur Erzeugung dünner Flüssigkeitsfilme

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEGDE P ET AL: "A CONCISE GUIDE TO CDNA MICROARRAY ANALYSIS", BIOTECHNIQUES, EATON PUBLISHING, NATICK, US, vol. 29, no. 3, September 2000 (2000-09-01), pages 548 - 550,552, XP001145439, ISSN: 0736-6205 *
TOEGL ANDREAS ET AL: "Enhancing results of microarray hybridizations through microagitation.", JOURNAL OF BIOMOLECULAR TECHNIQUES : JBT. SEP 2003, vol. 14, no. 3, September 2003 (2003-09-01), pages 197 - 204, XP002323099, ISSN: 1524-0215 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE10355593B4 (de) 2005-12-01
DE10355593A1 (de) 2005-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112005000293T5 (de) Gendetektions-Feldeffektvorrichtung und Verfahren zum Analysieren einer Genpolymorphie damit
DE102004036285A1 (de) Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
WO2002082053A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur manipulation kleiner flüssigkeitsmengen und/oder darin enthaltener teilchen
EP1409722B1 (de) Verfahren zur analyse von makromolekülen
EP1436609A2 (de) Mikrofluidisches extraktionsverfahren
DE10259819B4 (de) Verfahren zur PCR-Amplifikation und Detektion von Nucleotidsequenzen
DE10136008B4 (de) Verfahren zur Analyse von Makromolekülen und Verfahren zur Herstellung einer Analysevorrichtung
DE10355593B4 (de) Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkörperoberfläche gebundene PCR-Produkte
WO2019081259A1 (de) Reaktionsträger für eine mikrofluidische vorrichtung und verfahren zur bestimmung einer nukleotidsequenz
EP2022559A2 (de) Nukleinsäurenbibliothek oder protein- oder peptibibliothek
EP1327004A2 (de) Verfahren zum nachweis mindestens einer nukleinsäuresequenz
EP2331260B1 (de) Vorrichtung zum temperieren eines rotationssymmetrischen behältnisses
DE102005029810B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, Verwendung des Verfahrens und Testbesteck
DE60011178T2 (de) Amplifikation und Detektion von Yersina enterocolitica
DE102007051578B3 (de) Verfahren zur parallelen Amplifikation von wenigstens zwei verschiedenen Nukleinsäureabschnitten
DE102004043870B4 (de) Verfahren zur Erweiterung des dynamischen Erfassungsbereich bei Mikroarrays
WO2002004111A2 (de) Polymer-chip
EP1649045B1 (de) Einbau von hapten-gruppen bei der herstellung von trägern für die analytbestimmung
WO2002057013A2 (de) Analysechip mit mehreren funktionalen ebenen für elektrofokussiertes spotten
DE10307801A1 (de) Analyseverfahren und -device zur Untersuchung von spezifischen Bindungsereignissen
DE10003763A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen in gentechnisch veränderten Organismen
EP1706505A2 (de) Verfahren zum validieren und/oder kalibrieren eines systems zur durchführung von hybridisierungsexperimenten, mikroarray und kit hierfür
WO2002044405A2 (de) Verfahren und kit zum direkten nachweis von nukleotidsequenzen, aminosäuresequenzen oder antigenen
EP2217364A2 (de) Flexibles extraktionsverfahren für die herstellung sequenzspezifischer molekülbibliotheken
WO2008080531A2 (de) Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung einer flüssigkeitsprobe

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase