WO2005041649A1 - トランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents

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WO2005041649A1
WO2005041649A1 PCT/JP2004/016373 JP2004016373W WO2005041649A1 WO 2005041649 A1 WO2005041649 A1 WO 2005041649A1 JP 2004016373 W JP2004016373 W JP 2004016373W WO 2005041649 A1 WO2005041649 A1 WO 2005041649A1
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human mammal
synuclein
transgenic non
human
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PCT/JP2004/016373
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Makoto Yoshimoto
Masaki Wakamatsu
Aiko Ishii
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Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a transgenic non-human mammal into which 0; -synuclein gene has been introduced. More specifically, the present invention relates to a transgene comprising expressing a synuclein gene in the brain, wherein the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra of the brain is significantly reduced as compared to a wild-type animal. It relates to non-human mammals and their use. Background art
  • Parkinson's disease is one of the neurodegenerative diseases found in adults and the elderly. Motor function is generally impaired in Parkinson's disease, and lesions include degeneration and disappearance of dopaminergic neurons in the substantia nigra.
  • the selective decrease in dopamine levels in the basal ganglia of the mesencephalon due to this lesion can be suppressed by orally administering L-dopa, a dopamine precursor, which improves symptoms. Therefore, L-dopa and dopamine receptor agonist have been used as therapeutic agents for Parkinson's disease.
  • administration of dopamine precursors is only a symptomatic treatment, and the symptoms gradually progress, and the efficacy of these drugs also weakens, and patients often die eventually.
  • Lewy bodies are specific inclusions that appear intracellularly in residual neurons in the substantia nigra, locus coeruleus, vagus nucleus, and the like. Furthermore, dementia with Lewy bodies (DLB) is known as a disease in which Lewy bodies also appear in the cerebral cortex in addition to brain stem lesions.
  • DLB dementia with Lewy bodies
  • Parkinson's diseases are sporadic, rare families have an autosomal dominant inheritance.
  • Linkage analysis of familial Parkinson's disease The ⁇ -synuclein gene on the fourth long arm of the chromosome has been identified as a gene, and a missense mutation ( ⁇ 53 ⁇ or ⁇ 30 ⁇ ) has been confirmed (Polymeropoulos ⁇ , et al., Science 1997 Jun 27: 276 (5321): 2045-7) And Kruger R, et al., Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synucleinin Parinson's disease. Nat Genet. 1998 Feb; 18 (2): 106-8).
  • transgenic animals overexpressing wild-type or mutant forms of a-synuclein protein have been reported so far (International Publication WO 01/07974). And international publication WO98 / 59050), and transgenic animals in which the amount of dopamine in the brain is significantly decreased immediately after birth have not yet been reported.
  • degeneration and disappearance of dopamine-producing neurons in the midbrain's substantia nigra are observed, especially degeneration and disappearance of dopamine-producing neurons in the substantia nigra, a pathological feature of Parkinson's disease, There are no reports of transgenic animals with no change in the tegmental area. Disclosure of the invention
  • the present inventors diligently studied to solve the above problem, and as a transgene, the Ala residue which is the 53rd amino acid residue in the amino acid sequence of the wild-type human ⁇ -synuclein gene was replaced with a Thr residue.
  • a transgenic mouse was prepared using a mutant gene in which the C-terminal of the amino acid sequence was deleted. Further, the present invention The present inventors analyzed the amount of dopamine in the brain, the expression level of tyrosine hydroxylase, and the amount of spontaneous locomotor activity in the transgenic mouse thus produced, and confirmed that the mouse was highly useful as a model animal for Parkinson's disease. The present invention has been completed based on these findings.
  • the ⁇ -synuclein gene has been introduced, the gene is expressed in brain neurons, and the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra of the brain is significantly reduced as compared to wild-type animals.
  • a transgenic non-human mammal or part thereof characterized in that:
  • the ⁇ -synuclein gene is a mutant in which the Ala residue, the 53rd amino acid residue in the amino acid sequence of the wild-type human ⁇ -synuclein gene, is substituted with a Thr residue.
  • the transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (3), wherein the ⁇ -synuclein gene is a gene in which the C-terminal of the amino acid sequence of the wild-type ⁇ -synuclein gene has been deleted; Or part of it.
  • Recombinant D ⁇ ⁇ has been introduced, which incorporates the ⁇ -synuclein gene under the control of a promoter capable of expressing the gene in dopaminergic neurons.
  • transgenic non-human mammal according to any one of (1) to (4) or a part thereof.
  • the transgenic non-human mammal or the transgenic non-human mammal according to any of (1) to (5), wherein the promoter capable of expressing the ⁇ -synuclein gene in dopaminergic neurons is a tyrosine hydroxylase promoter; Part of that.
  • a method for screening a substance having a dopamine-like action comprising using the non-human mammal or a part thereof according to any one of (1) to (11).
  • a therapeutic or preventive agent for Parkinson's disease comprising as an active ingredient the substance obtained by the screening method according to (12) or (13).
  • FIG. 1 shows selection of transgenic mice expressing mutant human synuclein by PCR.
  • the individual who can detect both the 279 bp band and the 591 bp band is the desired transgenic mouse
  • Figure 2 shows the results of gene expression analysis.
  • A Copy of the gene integrated into the chromosome Analysis by one number of Southern hybridizations
  • B Analysis of gene expression in the brain by Northern hybridization
  • C Analysis of mutant human monosynuclein protein by Western blotting
  • FIG. 3 shows the results of quantification of the amount of tyrosine hydroxylase protein in the striatum by Western blotting.
  • Figure 4 shows the result of a right-handed reflection
  • Figure 5 shows the measurement results of spontaneous locomotor activity.
  • FIG. 6 shows the results of quantification of the amount of monoamine in the midbrain of an individual at the age of 8 weeks and 1 year after birth.
  • D A Dopamine, HVA: Homovanillic acid, 5—HT: Serotonin
  • FIG. 7 shows the results of quantification of the amount of monoamine in the striatum of an individual 8 weeks old and 1 year old.
  • D A dopamine
  • HVA homobaeric acid
  • 5-HT serotonin
  • FIG. 8 shows the results of quantification of the amount of monoamine in the whole brain of a 5 day old individual.
  • D A Dopamine
  • HVA Homovanillic acid
  • 5-HT Serotonin
  • FIG. 9 shows the results of quantification of the amount of monoamine in the whole brain of a 10-day-old individual.
  • D A Dopamine, HVA: Homovanillic acid, 5-HT: Serotonin
  • FIG. 10 shows immunohistological staining of the brain of an 8-week-old individual using LB509.
  • FIG. 11 shows the results of quantification of tyrosine hydroxylase-positive neurons in the midbrain region of an 8-week-old individual.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention has the ⁇ -synuclein gene introduced therein, expresses the gene in brain neurons, and has a wild-type dopamine-producing neuron number in the substantia nigra of the brain. It is characterized by a significant decrease compared to animals.
  • the transgenic non-human mammal of the invention comprises: It has one or more of the following features.
  • the amount of dopamine in the brain decreased significantly at a young age compared to wild-type animals.
  • the amount of brain dopamine is reduced to 85% or less, more preferably 70% or less, and still more preferably 60% or less, as compared with a wild-type animal.
  • the expression level of tyrosine hydroxylase is reduced to 80% or less, preferably 70% or less, more preferably 60% or less, as compared with a wild-type animal.
  • the locomotor activity is reduced to 60% or less, preferably 50% or less, as compared with the wild-type animal.
  • the amount of dopamine in the brain can be measured, for example, by preparing a dopamine-containing sample from brain tissue and analyzing it by HPLC.
  • the number of dopamine-producing neurons in the substantia nigra can be determined by measuring the number of tyrosine hydroxylase-positive cells.
  • the expression level of tyrosine hydroxylase can be measured by Northern blot, RT-PCR or immunohistological staining.
  • the motor function and spontaneous locomotion can be measured by the methods described in Examples 10 and 11 of the present specification or by a method analogous thereto.
  • ⁇ -synuclein gene as used herein is a known gene.
  • CK-synuclein gene any of mammalian ⁇ -synuclein genes such as human, and mutant genes having the same function as these genes can be used.
  • the amino acid sequence of the human ⁇ -synuclein gene is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • a mutant gene of one synuclein gene can also be used.
  • a mutant gene refers to a gene in which the DN ⁇ ⁇ sequence of the ⁇ -synuclein gene has a mutation (for example, a mutation), and specifically, a portion of the nucleotide sequence in the gene.
  • a gene that has been deleted, a gene in which a part of the nucleotide sequence of the gene has been replaced by another nucleotide sequence, a gene in which another nucleotide sequence has been inserted into a part of the gene, and the like can be used.
  • the number of bases to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is generally about 1 to 50, preferably about 1 to 15, and more preferably about 1 to 6.
  • Such deletion, substitution or addition of the base sequence may cause deletion, substitution or addition of preferably about 1 to 5 amino acids, more preferably about 1 or 2 amino acids in the amino acid sequence of ⁇ -synuclein. become.
  • mutant genes it is preferable to use those encoding polypeptides having a function equivalent to that of wild-type ⁇ -synuclein.
  • shi-synuclein gene has the broadest meaning and encompasses not only the wild-type ⁇ -synuclein gene but also all the mutant genes as described above.
  • the ⁇ -synuclein gene used in the present invention includes a mutation in which the alanine residue at amino acid number 30 in the amino acid sequence of the wild-type human ⁇ -synuclein gene (SEQ ID NO: 16 in the sequence listing) has been substituted with another amino acid. It is preferably a variant ⁇ -synuclein gene in which the amino acid residue corresponding to the alanine residue of amino acid number 53 is substituted with another amino acid and has a mutation.
  • the DNA of such a mutant a-synuclein gene may be, for example, a DNA encoding a known human ⁇ -synuclein gene, the amino acid number 30 of the ⁇ -synuclein protein, or amino acids It can be obtained by PCR using a missense mutation-introduced primer in which the base of the ⁇ -synuclein gene encoding the alanine residue of No. 53 has been substituted to encode another amino acid.
  • a mutation in which the amino acid residue corresponding to the alanine residue at amino acid number 30 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is substituted with a proline residue, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 A mutation in which an amino acid residue corresponding to the alanine residue of amino acid number 53 is substituted with a threonine residue is preferable, and the latter mutation is particularly preferable.
  • the C-terminus of the amino acid sequence (1 to 20 amino acid residues at the C-terminus, preferably 5 to 15 amino acid residues at the C-terminus, for example, the C-terminus It is preferable to use a gene in which the terminal 10 amino acid residues are deleted.
  • the method for producing the transgenic non-human mammal of the present invention is not particularly limited.
  • the transgenic non-human mammal can be produced by introducing an expression vector having an ⁇ -synuclein gene incorporated under the control of a promoter into a fertilized egg or the like. it can.
  • a method for producing a transgenic non-human mammal which expresses the histine crane gene by introducing the gene, particularly in nerve cells of the brain will be described.
  • transgene used for producing a transgenic non-human mammal it is preferable to use a recombinant gene in which the above-described ⁇ -synuclein gene is linked downstream of a suitable mammalian promoter. Downstream of the ⁇ -synuclein gene, a polymerase signal can be ligated, if desired.
  • the type of mammalian promoter used for the construction of the transgene is not particularly limited, but it is preferable to use a promoter capable of expressing the synuclein gene in nerve cells (particularly preferably, dopaminergic neurons).
  • a promoter capable of expressing the synuclein gene in nerve cells particularly preferably, dopaminergic neurons.
  • Specific examples of promoters that can drive the expression of the ⁇ _synuclein gene in dopaminergic neurons include a tyrosine hydroxylase promoter and the like.
  • gene promoters derived from viruses eg, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc.
  • various mammals eg, human, porcupine, dog, cat, guinea pig, hamster, Use promoters derived from rats, mice, etc.
  • birds eg, chickens
  • a terminator required for expression of the ⁇ -synuclein gene may be linked to the recombinant gene used in the present invention.
  • the terminator is used as a sequence for terminating transcription of a target messenger RNA (so-called poly ⁇ ) in transgenic animals, and the sequence of each gene derived from viruses, various mammals or birds is used. Can be used. Specifically, SV 40 terminator of Simian virus or the like is used.
  • a splicing signal of a known gene and an enhancer region can be ligated in order to further express the ⁇ -synuclein gene.
  • ⁇ -synuclein gene integrated into the transgene When the ⁇ -synuclein gene integrated into the transgene is expressed in a cell such as a fertilized egg, ⁇ -synuclein is produced in the cell.
  • Toransuji Enikku non-human mammal expressing ⁇ - synuclein by introduction of Shinukurein gene shed for example, the non-human mammal embryo alpha - Shinukurei down introducing genes, the fertilized egg pseudopregnant female non-human mammal And the non-human mammal into which the ⁇ -synuclein gene has been introduced is delivered from the non-human mammal.
  • Non-human mammals include, for example, rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits, etc., as well as chickens, dogs, cats, goats, higgies, horses, pigs, monkeys, etc. Although rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, and egrets are preferred from the viewpoints of simplicity of production, breeding, and use, mice are most preferred.
  • the germinal cells and the germ cells or somatic cells may be in the stage of embryo development (preferably single cells or fertilized egg cells) in the non-human mammal or earlier in the animal.
  • stage of embryo development preferably single cells or fertilized egg cells
  • the recombinant gene containing an exogenous ⁇ -synuclein gene Created is as described above.
  • the ⁇ -synuclein gene is introduced at the fertilized egg cell stage in such a manner that it is maintained in all of the germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the ⁇ -synuclein gene in the germinal cells of the produced animal after the gene transfer means that the progeny of the produced animal have the ⁇ -synuclein gene in all of its germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the gene carry the ⁇ -synuclein gene in all of its germinal and somatic cells.
  • the transgenic animal of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the gene-bearing animal after confirming that the gene is stably maintained by crossing.
  • a homozygous animal having a transgene on both homologous chromosomes and mating the male and female animals it is possible to breed and passage so that all offspring have the gene in excess.
  • the expression of the a-synuclein gene can be observed at the individual, organ, tissue and cell levels. It is also possible to measure the expression level by an enzyme immunoassay using ⁇ -synuclein antibody.
  • transgenic non-human mammal After constructing a transgene containing a cDNA encoding the ⁇ -synuclein gene downstream of the promoter, microinjecting the transgene into the male pronucleus of a mouse fertilized egg, and culturing the obtained egg cell
  • a transgenic mouse can be produced by transplanting the animal into the oviduct of a pseudopregnant female mouse, breeding the recipient animal, and selecting a pup mouse having the above-mentioned cDNA from the pup mouse born.
  • the fertilized egg of the mouse for example, 1 2 9 Z sv, C 5 7 BL / 6, BALB / c s C 3 H, SJL ⁇ W t any if those obtained by crossing mice derived from such Can be used.
  • the appropriate number of transgenes to be injected is 100 to 300 molecules per fertilized egg.
  • the selection of the pup mouse having the cDNA is based on the tail of the mouse. Can be performed by a dot hybridization method using the o; -synuclein gene into which the DNA has been extracted and introduced, or a PCR method using specific primers.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention is characterized by overexpressing ⁇ -synuclein, and is a model that can be used in a screening test for a therapeutic or preventive agent for Parkinson's disease, It is also useful in research fields such as elucidation of the mechanism of development of Parkinson's disease.
  • transgenic non-human mammal of the present invention includes, in addition to cells, intracellular organelles, and tissue organs of the non-human mammal, a head, fingers, hands, feet, and abdomen And tails, all of which are also within the scope of the present invention.
  • the method for screening a substance having a dopamine-like action according to the present invention can be performed using the transgenic non-human mammal of the present invention that overexpresses ⁇ -synuclein. That is, a test substance is administered to the transgenic non-human mammal (eg, transgenic mouse) of the present invention, and the physiological data and exercise ability of the transgenic non-human mammal are evaluated and examined. By doing so, the therapeutic and preventive effects of the test substance on Parkinson's disease can be evaluated.
  • the transgenic non-human mammal eg, transgenic mouse
  • test substance is administered to the transgenic non-human mammal of the present invention, and the expression state of ⁇ -synuclein after administration and the kinetics in vivo are analyzed. It is also possible to evaluate the therapeutic and preventive effects of the drug.
  • transgenic non-human mammal of the present invention it is possible to evaluate the therapeutic effect and the preventive effect of Parkinson's disease, and the transgenic non-human mammal of the present invention can be used for Parkinson's disease.
  • transgenic non-human mammal of the present invention it is possible to determine the recovery of the disease state and the severity thereof, and to examine a method for treating this disease.
  • the overexpression of CK-synuclein and the progress of the above-mentioned disease can be analyzed to determine the onset and progress of the disease.
  • the mechanism can be elucidated.
  • test substance used in the screening method of the present invention examples include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. These compounds may be novel compounds or known compounds. Libraries containing a large number of molecules, such as peptide libraries and compound libraries, can also be used as test substances.
  • test substance for example, oral administration, intravenous injection and the like are used.
  • the dose of the test substance can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test substance, and the like.
  • the substance obtained by using the screening method of the present invention is a substance selected from the above-described test substances and has a preventive / therapeutic effect on Parkinson's disease. It can be used as a medicine such as a prophylactic agent. Furthermore, compounds derived from the substances obtained by the above screening can also be used as pharmaceuticals.
  • the substance obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the substance may be a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid or an organic acid) or a base (eg, an alkali metal) And the like, and particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • the salt examples include a salt with an inorganic acid (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or an organic acid (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • Substances obtained by the screening method can be used, for example, as tablets, forcepsels, elixirs, microforces, etc., sugar-coated as required, orally, or water or other pharmaceutically acceptable drugs. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with an acceptable solution, or an injection such as a suspension.
  • a pharmaceutical preparation can be produced by mixing the substance with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like.
  • Additives that can be incorporated into tablets, tablets, and the like include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, Swelling agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to a conventional method such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • a scavenger such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 TM, HCO-50) You can also.
  • a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol may be used in combination.
  • the above-mentioned therapeutic and / or prophylactic agent for Parkinson's disease includes, for example, a buffer (for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, Shiridani benzalkonium, pro-hydrochloric acid).
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, Shiridani benzalkonium, pro-hydrochloric acid
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity. It can be administered to animals.
  • the dose of the substance varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound in an adult, is used in an amount of about 0.1 to 10 Omg per day. , Preferably about 1.0 to 50 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the target of administration, target disease, etc.
  • the compound when administered to an adult in the form of an injection, the compound may be administered once a day. About 0.01 to 100 mg, preferably about 0.1 to 50 mg is administered by intravenous injection.
  • Human ⁇ -synuclein gene was amplified by PCR using human brain-derived cDNA (manufactured by Clontech) as type I and an oligonucleotide having sequence-1 and an oligonucleotide having sequence 12 as primers.
  • a kit (TaKaRaLAPCCRkitVer.2) manufactured by Takara Bio Inc. was used, and a PCR thermal cycler MP manufactured by Takara Bio Inc. was used.
  • reaction was carried out at 94 ° C for 30 seconds, cooled to 60 ° C, held at 60 for 1 minute, and further held at 72 ° C for 3 minutes. This was repeated 30 times to amplify the target sequence.
  • the amplified DNA fragment was fractionated by agarose gel electrophoresis (gel concentration: 1%), and a pan (1.24 kb) containing a human; -synuclein gene was cut out according to a conventional method. Extraction and purification of the DNA fragment from the agarose gel was performed using GENE CLEANII Kit (Bio101). This purified DNA fragment was incorporated into a base sequence determination vector, pT7BlueT-Vecutor (manufactured by Novagene) by the following method. The ligation solution was reacted at 16 ° C. for 1.5 hours using a kit (TaKaRaDNALigationitKitVer.2) manufactured by Takara Bio Inc.
  • the c- transformant transformed with Escherichia coli ⁇ 12 strain DH5 was plated on an LB agar medium containing 50 ⁇ g Zm1 of ampicillin (Amp).
  • the cells were cultured in C. Inoculate the colony into 10 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ g Zm1 Amp, incubate at 37 ° C overnight, collect the cells by centrifugation, and then use the QI Aprep S in Plasmid Miniprep.
  • the recombinant DNA was purified using pKit (manufactured by Qiagen), and the entire nucleotide sequence was determined according to a conventional method.
  • PT7NACP140 was type III, and the 53rd alanine (codon: GCA) was converted to threonine (codon: ACA) using the TaKaRa LA PCR invitro Mu tagenesis Kit (Takara Bio Inc.). Point mutations were introduced to change them.
  • the reaction was carried out at 94 ° C for 30 seconds, cooled to 60 ° C, kept at 60 ° C for 2 minutes, and further kept at 72 ° C for 3 minutes. This was repeated 25 times to amplify the target sequence.
  • Sequence 1 3 (SEQ ID NO: 3) Sequence 1 4 C AGCCACTGTTGCCACACCATGC (SEQ ID NO: 4) Sequence 1 5
  • Sequence-1 6 GCATGGTGTGGCAACAGTGGCTG (SEQ ID NO: 6) Equivalent amounts of the PCR product obtained using SEQ ID NOS: 13 and 14 and the PCR product obtained using SEQ ID NOs: 5 and 16 were mixed and heated at 94 ° C for 10 minutes. Cooled to 37 ° C over a minute and kept at 37 ° C for 15 minutes. Using this reaction solution as type III, a PCR reaction was performed to amplify the DNA into which the target point mutation had been introduced. Reaction composition liquid
  • the reaction was carried out at 94 ° C for 30 seconds, cooled to 60 ° C, kept at 60 ° C for 2 minutes, and further kept at 72 ° C for 3 minutes. This was repeated 25 times to amplify the target sequence.
  • the amplified DNA fragment was purified using the same method as described in Example 1, and was incorporated into pT7B1eT-Vector (manufactured by Novagen).
  • the recombinant DNA thus constructed was named pT7NACP14Om.
  • the entire nucleotide sequence of the region containing the human a-synuclein gene was determined according to a conventional method, and it was confirmed that the desired point mutation was introduced into the gene.
  • PCR was performed on the region from the initiation codon of the human a-synuclein protein to the codon at residue 130. Amplified by The oligonucleotide of SEQ ID NO: 17 was designed such that a stop codon immediately follows the codon at residue 130. Pfu DNA polymerase (straight) (Tageen) was used to prevent the introduction of new mutations during DNA amplification. Reaction composition liquid
  • the obtained DNA fragment was incorporated into pCRB1unt (Invitrogen) using the same method as described in Example 1.
  • the recombinant DNA thus constructed was named pCRNACP13Om.
  • the entire nucleotide sequence of the region containing the mutant human a-synuclein gene was determined according to a conventional method, and it was confirmed that the desired sequence was obtained.
  • Example 3 Preparation of DNA fragment for microinjection
  • CRNAC P13Om is cut with PstI and SpeI, fractionated by agarose gel electrophoresis (gel concentration 1%), and a band (417 bp) containing the mutant human ⁇ -synuclein gene is obtained according to a conventional method. I cut it out. Extraction and purification of DNA fragments from agarose gel is performed using GENEC LEANII Kit (Bio101). I got it. Furthermore, both ends of the DNA fragment were blunted according to a conventional method. Next, an expression vector having a rat tyrosin hydroxylase gene promoter, pTHZ—9 kb (Iwawa ki, T. eta 1.
  • a recombinant DNII was prepared from.
  • the recombinant DNA thus constructed was named pRTHNACP130m.
  • Example 4 Preparation of mutant human synuclein 'transgenic mouse Thawed frozen pronuclear stage egg (purchased from Nippon Chillslipper) of 1 strain 6C3F using the method recommended by Nippon Chillslipper did. That is, a cryotube (12 mm in diameter, 40 mm in length, manufactured by Nalge Nunc Ltd.) containing the pre-freezing stage eggs was taken out of liquid nitrogen and allowed to stand at room temperature (23 ° C) for 1 minute. The mouse embryo heated to 37 ° C was supplemented with 0.25M sucrose solution (Diatron) 9001 and the frozen mass was quickly thawed by pipetting.
  • a cryotube (12 mm in diameter, 40 mm in length, manufactured by Nalge Nunc Ltd.) containing the pre-freezing stage eggs was taken out of liquid nitrogen and allowed to stand at room temperature (23 ° C) for 1 minute.
  • the mouse embryo heated to 37 ° C was supplemented with 0.25M sucrose solution (Diatron)
  • Penicillin G potassium Meiji (Meiji Seika Co., Ltd.) 0.0075
  • Albumin fraction V powder (manufactured by Sigma) 0.3 Microinjection device (Inverted microscope TE300 with Nomarski differential interferometer (manufactured by Nikon), micromanipulator MMO-204 (manufactured by Narishige), microinjector IM-50AZB (Narishige) and a microsyringe (with Hamilton) attached) to the male pronucleus of pronuclear stage eggs in accordance with a conventional method using 2 p 1 (2000 copies) of the DNA solution prepared in Example 3. Injected.
  • the microcapillary for holding fertilized eggs and the microcapillary for DNA injection consist of a borosilicate glass tube (manufactured by Sutter Corporation) with a length of 10 cm, a diameter of 1.
  • embryos that had developed at the 2-cell stage were transferred to recipient mice (ICR strain, female, 8-week-old (purchased from Japan SLC)) using standard methods, and vasectomized male mice (10-week-old, Japan SLC) of the same strain. (Purchased from the same plant) and pseudopregnant) and transplanted to the tubal ulcer. After transplantation 193, cesarean section of the recipient mouse was performed, and the offspring mouse derived from the transplanted embryo was extracted. The pups are reared in Foster-Imaza-I (female ICR strain one day after delivery (12 weeks old, purchased from Japan SLC)) until weaning, and the pups are weaned 28 days after cesarean section and founder The mouse was used.
  • Foster-Imaza-I female ICR strain one day after delivery (12 weeks old, purchased from Japan SLC)
  • Example 5 Selection of mutant human ⁇ -synuclein transgenic mouse
  • the tail of about 5 mm of the tail of a weaned offspring mouse was anesthetized under getyl ether anesthesia, and the individual was identified by an ear punch method.
  • DNA extraction buffer 100 mM NaCl, 5 OmM Tris—HC1 (pH 7.5), 20 mM EDTA, 1% SDS
  • proteinase K (2 OmgZm 1: Takara Bio Inc.
  • the collected tail was immersed and shaken at 55 ° C. for 10 minutes. 1 ⁇ l of this melt was diluted 100-fold with sterile distilled water to obtain a sample DN ⁇ .
  • Oligonucleotides of sequence 18 and sequence 9 having a partial sequence of the introduced DNA, and sequence 10 and sequence 11 having a partial sequence of Rapsyn which is an acetylcholine receptor protein as an internal standard were used as a primer for PCR.
  • Ta Ka Ra LA Taq TM manufactured by Takara Bio Inc.
  • Gene Amp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems Japan was used.
  • the reaction was carried out at 94 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute, and further at 72 ° C for 2 minutes. After repeating this 5 times, the reaction was repeated 28 times at 94 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 1 minute, to amplify the target sequence.
  • the amplified DNA was electrophoresed on a 2% TAE agarose (Sakem ME Agarose; manufactured by Takara Bay) gel at 100 V for 40 minutes according to a conventional method.
  • Example 6 Breeding of mutant human ⁇ -synuclein transgenic mice The transgene mice obtained in Example 4 were analyzed by the method described in Example 5 to obtain transgene-positive individuals. did. C57B 6ZJ strain M. (purchased from Clea Japan) to produce F1 generation. Further backcrossing to the C57B6 / J line was repeated to produce N2-N6 generations.
  • a digoxigen-labeled probe specific to the mutant human ⁇ -synuclein gene was prepared by the following method. First, PCR was carried out using the pRTHNACP13Om prepared in Example 3 as a ⁇ type, using as primers the oligonucleotide sequence 12 and the sequence 13 having a sequence complementary to a part of the mutant human a-synuclein gene. went. For the reaction, Amp1 iTaqGold (manufactured by Roche Diagnostics) was used, and TaKaRa PCR thermal cycler MP manufactured by Takara Bayo was used.
  • Sequence 12 GTGGCTGCTGCTGAGAAAAC (SEQ ID NO: 12)
  • Sequence 13 GTGGGGCTCCTTCTTCATTC (SEQ ID NO: 13) Reaction composition
  • pRTHNACP 130m (10 p / n 1) 1 ⁇ 1 10 XPCR buffer (Rochex) 25 ⁇ 1 Gene Amp dNTP Mi x 5 ⁇ 1 (Roche Diagnostics)
  • the solution was diluted 1 00 fold the PC R reaction solution with sterile distilled water 1 IX 1 Mg C 1 2 containing PCR buffer 1 0-fold concentration 5 mu 1
  • the reaction was carried out at 95 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute, and further at 72 ° C for 2 minutes. After repeating this 10 times, the reaction at 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute was repeated 35 times.
  • the target sequence was amplified, and digoxigenin was labeled by incorporating DIG-dUTP into the PCR product.
  • tail tissue-derived DNA was prepared by the following method. Place the tail tissue (5 mm) in a 2 ml Eppendorf tube, add 400 ⁇ l of Buffer ATL (Qiagen) and 20 ⁇ l of Proteinase ⁇ Solution (Qiagen), and mix at 55 ° C. ⁇ Immerse and shake.
  • the obtained melt was centrifuged at 15000 ⁇ g for 10 minutes at room temperature (23 ° C.) to separate into a supernatant and a precipitate. 300 ⁇ l of the supernatant was collected, DNA was purified using an automatic nucleic acid separation device ⁇ -200 (manufactured by Kurabo), and the DNA concentration was quantified using a spectrophotometer DU-640 (manufactured by Beckman). . 10 ⁇ g of tail tissue-derived DNA was treated with EcoRI, fractionated by 1.2% agarose gel electrophoresis according to a conventional method, and transferred to a nylon membrane plus charge (manufactured by Roche Diagnostics). 42.
  • a mutant human ⁇ -synuclein gene-specific probe (heated at 100 ° C for 10 minutes and immediately cooled on ice) is diluted in 2 Om 1 DIG Easy Hyb (Final concentration 50 ng Zm 1) and exchanged for DIG Easy Hyb in the hybrid bag. After immersion and shaking at 42 ° C for 12 hours, the membrane was washed with 2 XSSC (0.1% 303). 42 ° (: treated for 10 minutes, treated with 0.1 XSSC (0.1% SDS) at 65 ° C for 40 minutes.
  • Detection of digoxigenin-labeled probe specifically bound to membrane IG washing and block buffer set were performed. That is, the membrane is immersed in a blocking solution (Roche Diagnostics) diluted two-fold with a maleic acid buffer (Roche Diagnostics) and incubated at room temperature (23 ° C) for 2 hours. Shake. Next, an alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin Fab fragment (Roche's Diagnostics) was diluted 10,000 times with this solution, and the membrane was immersed and shaken for 30 minutes.
  • the membrane is further washed with a washing buffer (Roche Diagnostics) for 40 minutes, and CDP-Star (Roche Diagnostics) is then washed with a detection buffer (Roche Diagnostics). After 100-fold dilution, the membrane was reacted. Signal detection was performed using a Rumi-Measure F1 workstation (Roche Diagnostics).
  • the transgenic mouse (1702 line) fertilized eggs (labeled for identification: TH / synl 30ml 702) were prepared under the accession number FERM P-19546 in October 2003. Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (1-1 Tsukuba, Higashi 1-chome, 1-Chuo No. 6 Ibaraki, Japan) on September 2, 2004, on September 16, 2004. Transferred to the International Deposit under the accession number FERM BP-10131.
  • mice derived from this cell express a variant of the human synautalein gene in dopaminergic neurons.
  • a fertilized egg of the transgenic mouse (line 2402) prepared (labeling for identification: THZsyn13OmTg24) 0 2) is the accession number F ERM P—19773 33, dated March 12, 2004, by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (Japan) Deposited at 1-1, Higashi 1-chome, Chuo No. 6), Tsukuba City, Ibaraki Prefecture.On September 16th, 2004 (Heisei 16), deposited on international deposit as accession number F ERM BP—101 3 2 Has been transferred. Mice derived from this cell express mutant human a-synuclein genes in dopaminergic neurons.
  • Example 8 Northern hybridization analysis
  • Mouse brain tissue was collected, placed in a cryotube (diameter 12 mm, length 40 mm, manufactured by Nargenunc) and immediately frozen with liquid nitrogen.
  • the frozen brain tissue was stored at 180 ° C in a deep freezer (made of Sanyo earth) until RNA was extracted.
  • Tota 1 RNA was extracted using ISOGEN (Nippon Gene). That is, the frozen brain tissue was beaten with a hammer while immersed in liquid nitrogen and crushed. The crushed pieces were weighed lO Omg and placed in a 2 ml Eppendorf tube. The mixture was supplemented with IS OGEN lm 1 and disrupted for 20 seconds using a homogenizer (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • the tube was allowed to stand at room temperature (23 ° C.) for 5 minutes, and then the form 001 was added thereto and stirred vigorously for 2 minutes. After allowing the tube to stand for 3 minutes, the mixture was centrifuged at 12,000 X g for 15 minutes at 4 ° C to collect 600 ⁇ l of the supernatant. To this, isopropanol 500 ⁇ 1 was added, and the mixture was allowed to stand for 10 minutes. The mixture was centrifuged at 12000 X g for 10 minutes at 4 ° C, and the precipitate was washed with 70% ethanol. The washed precipitate was dissolved in 300 ⁇ l of water treated with getyl pyrocarbonate, and the RNA concentration was quantified using a spectrophotometer DU-640 (manufactured by Beckman).
  • the mixture was centrifuged at 15000 ⁇ g for 3 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed.
  • the precipitate was suspended in Washing Buffer (10 mM Tris—HC 1 H 7.5, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.1% SDS) 5001.
  • the mixture was centrifuged at 15000 ⁇ g for 3 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed.
  • the precipitate was suspended in 200 ⁇ 1 water treated with getyl pyrocarbonate, heated at 65 ° C for 5 minutes, and rapidly cooled on ice for 3 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 15000 X g for 3 minutes at 4 ° C, and the poly (A) + RNA in the supernatant was recovered.
  • poly (A) + RNA was fractionated by 1.0% denaturing agarose gel electrophoresis according to a conventional method, and transferred to a nylon membrane plus charge (Roche 'Diagnostics').
  • the transgene mRNA was detected in the same manner as in Example 7. After detection, the probe was removed by heating the membrane with 0.5% 303 at 100 for 10 minutes.
  • hybridization was carried out using the same membrane as a probe and a digoxigenin-labeled i3-actin cDNA fragment as a probe. The conditions for hybridization are the same as those described above.
  • the digoxigenin-labeled j3-actin cDNA fragment was prepared in the same manner as described above, using cDNA derived from mouse brain as type III, and using sequence 114 and sequence 15 as primers.
  • SEQ one 14 TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG (SEQ ID NO: 14) sequence one 15: TTTGATGTCACGCACCATTTCC (SEQ ID NO: 15)
  • Northern hybridization results the mutant human o; - synuclein gene specific exogenous human ⁇ by the probe - synuclein gene not only Expression of the endogenous mouse ⁇ -synuclein gene was also detected.
  • the former mRNA was detected as a band of about 1.0 kb, and the latter mRNA was detected as a band of about 1.6 kb.
  • the expression levels of the human ⁇ -synuclein gene differed greatly between the lines, indicating that the transgene copy number and the copy number of the transgene estimated by Southern hybridization were high. Strongly correlated. That is, the expression level was highest in the 1702 line, which was estimated to have the highest inserted copy number (about 30 copies) (Fig. 2B). Similarly, the expression level of 2402 line was high (Fig. 2B).
  • Example 9 Western blotting analysis
  • TBS buffer 20 times the volume of TBS buffer (20 mM Tris—HCI (pH 8.0), 150 mM NaCl, proteaseinh ibitor Competlet Mini) (Roche Diagnostics) , 1% phosphatasei nh ibitorcocktail I (Sigma) was added, and the mixture was crushed with a homogenizer (Hitachi, Ltd.). Further, ultrasonic blasting (manufactured by Taitec) was performed, and the obtained melt was centrifuged at 2,500 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant was recovered and further centrifuged at 4 ° C. for 1 hour at 4 ° C. The protein concentration of the supernatant was measured using bicuculilicacid (BCA) proteinassay (Pierce).
  • BCA bicuculilicacid
  • eta 1.Acta Neuropathol (Ber 1) 99, 14—20 (2000)) was used.
  • NACP-5 was diluted 5000 times with TBS containing 0.5% skim milk before use.
  • an anti-tyrosine hydroxylase polyclonal antibody (manufactured by Novus Biologica 1s) was similarly used, diluted 400-fold.
  • Secondary antibody is HRP-labeled antibody A heron IgG (manufactured by Amersham) was similarly diluted 1000-fold and used.
  • Detection was performed by exposing to Hyperfilm ECL (manufactured by Amersham) using ECL westernblottingdetection reagents (manufactured by Amersham) as a substrate, and measuring the band using ImageMaster ID Elute.
  • human mutant-synuclein protein lacking 10 C-terminal residues was detected as a band of about 18 kDa on the lower molecular weight side than the endogenous mouse type 1 synuclein protein (molecular weight of about 19 kDa on electrophoresis). . Therefore, it was possible to compare and quantify the expression levels of exogenous and endogenous ⁇ -synuclein proteins using the same membrane.
  • human ⁇ -synuclein protein is expressed about 3 times in the striatum and about 2 times in the mesencephalic region as compared to endogenous a-synuclein protein This was confirmed (Fig. 2C).
  • the human ⁇ -synuclein protein was expressed at a higher expression level than the endogenous ⁇ -synuclein protein in the 2402 line (FIG. 2C).
  • Tyrosine hydroxylase protein was detected as a band with a molecular weight of about 56 kDa. In the 1702 line, where the expression level of ⁇ -synuclein is highest, tyrosine hydroxylase protein levels are significantly reduced in the striatum at the age of 8 weeks and 1 year to 40% and 60% in wild-type mice, respectively. (Figure 3).
  • Example 10 Forward reflection test
  • One-day exercise was measured using an infrared-sensitive momentum analyzer (AB-System, manufactured by Neuroscience) in male mice 8 weeks of age and 1 year of age.
  • the light-dark cycle was 12 hours light (7 am to 7 pm) and 12 hours dark (7 pm to 7 am).
  • the subjects were placed in small polycarbonate transparent cages (LXWXH-23 x 17 x 12 cm) with bedding and acclimated well.
  • the amount of exercise from 11 am to 11 am the next day was measured every hour for 24 hours. Exercise was expressed as a 24-hour cumulative count.
  • Statistical analysis performed a significant difference test with Student'st-test.
  • the cerebral substantia nigra and the striatum were extracted from the brains of 8-week-old and 1-year-old mice of the 702 line, and the whole brain was extracted from the 5-day-old and 10-day-old mice, and the liquid was collected, respectively. Frozen with nitrogen. After Kona ⁇ frozen tissue with flour ⁇ , a pargyline of 0. 2 M perchloric acid (100 mu M of Echirenjiamin tetraacetate disodium and 10 mu Micromax of 0. 5 ml to tissue 10 Omg by measuring the weight ) And homogenized using a mini cordless grinder (Beltech Enterprise).
  • the amount of monoamine was measured by high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions.
  • monoamines, 7 types (dopamine; DA, homovanillic acid; HVA, 3,4-dihydroxyfuracetic acid; DOPAC, L-13-methoxytyramine; 3-MT, norepinephrine; NE, serotonin; 5-HT, 5-hi)
  • 5-HIAA droxyindole acetic acid
  • a standard mixture of 7 types was prepared with a final concentration of 10 nL. The sample was stored at 4 ° C protected from light until use to avoid decomposition.
  • Electrochemical detector S 1 -1/2005
  • a mobile phase for measurement was prepared, and the column was equilibrated with the mobile phase until the measured value of the electrochemical detector became stable. After confirming the stability of the measured values, the prepared 7-specimen mixture was further diluted 200-fold with 0.02M acetic acid (containing 20 OmM disodium ethylenediaminetetraacetate), and 500 pg Zl O i L solution (prepared before use) ) was prepared and 10 ⁇ L was injected into the HPLC. It is known that peaks are detected in the order of norepinephrine, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid, dopamine, 5-hydroxyindoleacetic acid, homovanillic acid, L-3-methoxytyramine, and serotonin.
  • the sample extracted from the brain homogenate was measured. The measurement was performed by automatically injecting 10 L per sample every 25 minutes using an auto sampler. The sample was kept at 4 ° C in a thermostat until measurement. The amount of monoamine was calculated by proportional calculation of the peak area of the sample with respect to the peak area of each standard SOOpgZlOjuL, and was converted to lmg of tissue (5 ⁇ of sample).
  • Tissue lamine monoamine (pg) sample peak area ⁇ standard peak area X 500 (pg) ⁇ 2
  • the amount of dopamine in the substantia nigra was decreased at both the 8-week-old and 1-year-olds compared to the wild type (FIG. 6). In particular, it was significantly reduced in 8-week-old mice, and was about 60% of that of wild type. Similarly, homopanilic acid, a degradation product of dopamine, was significantly reduced in transgenic mice at 8 weeks of age. However, serotonin levels had not changed. Next, dopamine levels in the striatum were significantly reduced at both the 8-week-old and the 1-year-old, especially at 8-week-old, to about 50% of the wild-type (Fig. 7).
  • a scalpel was used to cut out the coronal plane from Bredama with the forebrain 2 mm and Predama 0 mm from Bredama. This was defined as the striatum.
  • a 2.5 mm posterior and 0 mm lambda coronal plane was cut from Bredamama and used as the midbrain. Thereafter, the sections were embedded in paraffin according to a conventional method, and sliced at a thickness of 3 ⁇ m to prepare sections.
  • Egret anti-tyrosine hydroxylase antibody (Funakoshi, VN-3109-00) or 12,000 diluted mouse anti-human ⁇ _synuclein monoclonal antibody, LB509 (Cosmo Bio Inc.) , ZYM18021 5) was used as a primary antibody and diluted to a final concentration of 10 ⁇ g Zm1.
  • Biotinylated anti-mouse IgG (Funakoshi, 41-0510-00) or biotinylated anti-mouse IgG (41-0520-00, Funakoshi) was used as the secondary antibody.
  • Immunohistochemical staining was performed using an automated immunostaining system (Ventana Japan) and following the method recommended by Ventana. Cell nuclei were simultaneously stained using Meyer's Hematoxylin (Wako, 131-09665).
  • LB509-positive cells ie, neurons expressing human a-synuclein
  • these LB509-positive neurons were simultaneously positive for tyrosine hydroxylase, confirming that the introduced gene was expressed in the desired neurons at the desired site (FIG. 10).
  • Example 14 Quantification of the number of tyrosine hydroxylase-positive cells
  • Semi-continuous sections of the midbrain of transgenic mice of 1702 lines were prepared as follows. First, one section was cut at a thickness of 3 microns, and then nine sections were removed. By repeating this process, one 3 micron section can be theoretically obtained for a 30 micron thick brain tissue. All the sections of the midbrain region thus obtained were subjected to immunohistological staining using an anti-tyrosine hydroxylase antibody in the same manner as described in Example 13. By observing these sections with an optical microscope, sections from 2.8 mm to 3.8 mm behind Bredama were selected. The left ventral tegmental area and the substantia nigra area of the section fit into the field of view.
  • the image data was captured into a computer using a Photograb-2500 (manufactured by Fuji Film). Next, the number of tyrosine hydroxylase-positive nerve cells was counted by printing the image data and counting only those nerve cells whose cell nuclei could be confirmed. The tyrosine hydroxylase-positive region was quantified by analyzing the image data using IPLab software (manufactured by Scanalytics). The tyrosine hydroxylase-positive area in the image is selected for this purpose! 1 Set the total area and the substantia nigra area by setting the parameter to 98 It was measured.
  • the ⁇ -synuclein gene provided by the present invention is overexpressed in neurons of the brain, and the number of dopamine-producing neurons in the substantia nigra of the brain is significantly reduced as compared to wild-type animals.
  • the transgenic non-human mammal described above is useful as a Parkinson's disease model animal for elucidating the pathogenesis of Parkinson's disease and for screening for Parkinson's disease preventive and therapeutic agents.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention has the advantage that it does not need to be kept for a long period of time because brain dopamine levels are significantly reduced at the age of 8 weeks after birth.

Abstract

　本発明の目的は、α−シヌクレイン遺伝子が導入されたパーキンソン病モデル動物を提供することである。本発明によれば、α−シヌクレイン遺伝子が導入されており、脳の神経細胞で該遺伝子を発現し、かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有意に減少していることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその一部が提供される。

Description

明細書
トランスジエニック非ヒ ト哺乳動物 技術分野
本発明は、 0；—シヌクレイン遺伝子が導入されている トランスジエニック非ヒ ト哺乳動物に関する。 より詳細には、 本発明は、 ーシヌクレイン遺伝子を脳で 発現し、 かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較し て有意に減少していることを特徴とするトランスジエニック非ヒト哺乳動物、 並 びにその利用に関する。 背景技術
パーキンソン病は成人 ·高齢者にみられる神経変性疾患の一つである。 パーキ ンソン病では一般に運動機能の障害が見られ、 病変としては、 中脳黒質のドーパ ミン産生神経細胞の変性 ·消失が認められる。 この病変による中脳一基底核系に おける選択的なドーパミン量の低下は、 ドーパミン前駆体である Lドーパを経口 投与することにより抑制することができ、 これにより症状の改善がみられる。 従 つて、 パーキンソン病の治療薬としては、 Lドーパおよびドーパミン受容体ァゴ 二ストが使用されている。 しかしながら、 ドーパミン前駆体の投与は対症療法に 過ぎず、 症状は次第に進行し、 これらの薬効も衰弱するため、 患者はやがて死に 到ることが多い。
また、パーキンソン病の病理学的所見の一つとして、レビー小体の出現がある。 レビー小体は、黒質、青斑核、迷走神経核などにおける残存ニューロンにおいて、 細胞内に出現する特異的封入体である。 さらに、 脳幹病変に加え、 大脳皮質にも レビー小体が出現する疾患として、 レビー小体を伴う痴呆症 （D L B ) が知られ ている。
パーキンソン病の多くは、 孤発例であるが、 稀に常染色体優性遺伝をとる家系 が存在する。 家族性パーキンソン病家系の連鎖解析から、 パーキンソン病の原因 遺伝子として染色体第 4番長腕上の α—シヌクレイン遺伝子が同定され、 ミス センス変異（Α53Τ、又は Α30Ρ)が確認されている（Polymeropoulos ΜΗ,他、 Science 1997 Jun 27 : 276 (5321) : 2045 - 7；及び、 Kruger R，他、 Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synucleinin Par inson s disease. Nat Genet. 1998 Feb ; 18 (2) : 106-8) 。 その後、 抗 α—シヌクレイン抗体を用いた生化学的検討や 免疫組織学的検討によつて孤発例のパーキンソン病ゃ DLBのレビー小体は、 α― シヌクレイン タンパク質が蓄積してできることが明らかになりノ、。一キンソン病 の原因としての α—シヌクレイン タンパク質蓄積の重要性が明らかとなってき た。
これまでに、 パーキンソン病のモデルマウスとして、 a—シヌクレインタンパ ク質の野生型又は変異型を過剰発現するトランスジュニック動物が報告されてい る力 S (国際公報 WO O 1 / 6 0 7 9 4号公報、 国際公報 WO 9 8 / 5 9 0 5 0号 公報など） 、 生後直ぐに脳内ドーパミン量が有意に減少しているトランスジェニ ック動物については未だ報告されていない。 また、 中脳 '黒質のドーパミン産生 神経細胞の変性 ·消失が認められる、 特にパーキンソン病の病理学的特徴である 黒質緻密部のドーパミン産生神経細胞に変性 ·消失が認められるが、 腹側被蓋野 部分には変化が認められないトランスジエニック動物についての報告はない。 発明の開示
本発明は、 α—シヌクレイン遺伝子が導入されたパーキンソン病モデル動物を 提供することを解決すべき課題とした。 本発明はさらに、 上記モデル動物を用い てドーパミン様作用を有する物質をスクリ一ユングする方法を提供することを解 決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、 導入遺伝子として、 野生 型ヒト α—シヌクレイン遺伝子のアミノ酸配列において 5 3番目のアミノ酸残基 である Ala残基が Thr残基に置換され、 かつ該アミノ酸配列の C末端を欠損させ た変異体遺伝子を使用してトランスジエニックマウスを作製した。 さらに本発明 者らは、 作製したトランスジエニックマウスにおける脳内ドーパミン量、 チロシ ンヒドロキシラーゼ発現量、 及び自発運動量などを解析した結果、 パーキンソン 病のモデル動物として有用性の高いマウスであることを確認した。 本発明はこれ らの知見に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 以下の発明が提供される。
(1) α—シヌクレイン遺伝子が導入されており、 脳の神経細胞で該遺伝子を 発現し、 かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較し て有意に減少していることを特徴とするトランスジエニック非ヒト哺乳動物また はその一部。
(2) α—シヌクレイン遺伝子がヒ ト α—シヌクレイン遺伝子又はその変異体 である、 （1) に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
(3) α—シヌクレイン遺伝子が、 野生型ヒ ト α—シヌクレイン遺伝子のアミ ノ酸配列において 5 3番目のァミノ酸残基である Ala残基が Thr残基に置換して いる変異体である、 （1) 又は （2) に記載のトランスジヱニック非ヒト哺乳動 物またはその一部。
(4) α—シヌクレイン遺伝子が、 野生型 α—シヌクレイン遺伝子のアミノ酸 配列の C末端を欠損させた遺伝子である、 （1) から （3) の何れかに記載のト ランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
(5) α—シヌクレイン遺伝子をドーパミン産生神経細胞で発現させることが できるプロモータ一の制御下に組み込んだ組み換え D Ν Αが導入されてレ、る、
(1) から （4) の何れかに記載のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物またはそ の一部。
(6) α—シヌクレイン遺伝子をドーパミン産生神経細胞で発現させることが できるプロモーターが、チロシンヒドロキシラーゼのプロモーターである、 （1) から（ 5 )の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
(7) 若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して有意に減少している、 (1) から （6) の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはそ の一部。
( 8 ) 若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して 85 %以下まで減少 している、 （1) から （7) の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動 物またはその一部。
(9) チロシンヒドロキシラーゼの発現量が野生型動物と比較して 80%以下 まで減少している、 （1) から （8) の何れかに記載のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物またはその一部。
(10) 自発運動量が野生型動物と比較して 60%以下まで減少している、 (1) から （9) の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはそ の一部。
(11) 非ヒト哺乳動物がマウスである、 （1) から （10) の何れかに記載 のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
(12) (1) から （11) の何れかに記載の非ヒト哺乳動物またはその一部 を用いることを特徴とする、 ドーパミン様作用を有する物質のスクリーユング方 法。
(13) ドーパミン様作用を有する物質がパーキンソン病の治療剤又は予防剤 である、 （12) に記載のスクリーニング方法。
(14) (12) 又は （13) に記載のスクリーニング方法により得られる物 質。
(15) (12) 又は （13) に記載のスクリーニング方法により得られる物 質を有効成分として含有する、 パーキンソン病の治療剤又は予防剤。 図面の簡単な説明
図 1は、 PCR法による変異型ヒト シヌクレインを発現するトランスジェ ニックマウスの選別を示す。 279 b pのバンドと 591 b pのバンドが両方と も検出できる個体が、 所望のトランスジエニックマウスである
図 2は、 遺伝子発現解析の結果を示す。 A：染色体に組込まれた遺伝子のコピ 一数のサザンハイプリダイゼーシヨンによる解析、 B ：脳における遺伝子発現の ノーザンハイブリダィゼーシヨンによる解析、 C ：変異型ヒト 一シヌクレイン 蛋白のウェスタンプロッティングによる解析
図 3は、 線状体におけるチロシンヒドロキシラーゼ蛋白量のウェスタンブロッ ティングによる定量の結果を示す。
図 4は、 正向反射の結果を示す、
図 5は、 自発運動量の測定結果を示す。
図 6は、 生後 8週齢及ぴ 1年齢の個体の中脳のモノアミン量の定量の結果を示 す。 D A： ドーパミン、 HVA :ホモバニリン酸、 5—H T :セロトニン
図 7は、 生後 8週齢及ぴ 1年齢の個体の線状体のモノアミン量の定量の結果を 示す。 D A： ドーパミン、 HVA :ホモバエリン酸、 5— HT :セロトニン 図 8は、 生後 5日齢の個体の全脳のモノアミン量の定量の結果を示す。 D A： ドーパミン、 HVA：ホモバニリン酸、 5 -HT ：セロトニン
図 9は、生後 1 0日齢の個体の全脳のモノァミン量の定量の結果を示す。 D A： ドーパミン、 HVA :ホモバニリン酸、 5—HT :セロトニン
図 1 0は、 生後 8週齢の個体の脳の L B 5 0 9を用いた免疫組織染色を示す。 図 1 1は、 生後 8週齢の個体の中脳領域のチロシンヒドロキシラーゼ陽性神経 細胞の定量の結果を示す。 A：細胞数の実測値、 B ：チロシンヒドロキシラーゼ 陽性領域の画像解析による定量、 薄い部分が黒質緻密部、 濃い部分が腹側被蓋野 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
( 1 ) 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物の特徴
本発明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物は、 α—シヌクレイン遺伝子が導 入されており、 脳の神経細胞で該遺伝子を発現し、 かつ脳の黒質におけるドーパ ミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有意に減少していることを特徴とす る。特に好ましい態様によれば、本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物は、 以下の特徴の何れか 1つ以上を有している。
( 1 ) 若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して有意に減少している。 好ましくは生後 8週齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して 8 5 %以下、 より好ましくは 7 0 %以下、 さらに好ましくは 6 0 %以下まで減少している。
( 2 ) 黒質緻密部のドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して減少して いるが、 腹側被蓋野のドーパミン産生神経細胞数には変化がない。
( 3 ) チロシンヒドロキシラーゼの発現量が野生型動物と比較して 8 0 %以下、 好ましくは 7 0 %以下、 より好ましくは 6 0 %以下まで減少している。
( 4 ) 自発運動量が野生型動物と比較して 6 0 %以下、 好ましくは 5 0 %以下ま で減少している。
本明細書において「若年齢」とは、生後 5日から 1年齢程度の年齢を意味する。 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物において、 脳内ドーパミン量は、 例えば、 脳組織からドーパミン含有試料を調製し、 H P L Cなどにより分析する ことにより測定することができる。 また、 黒質のドーパミン産生神経細胞数は、 チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞数を測定することにより測定することができ る。 また、 チロシンヒドロキシラーゼの発現量は、 ノーザンブロット、 R T— P C R又は免疫組織染色などにより測定することができる。 さらに、 運動機能及ぴ 自発運動量については、 本願明細書の実施例 1 0及び 1 1に記載又はこれに準じ た方法により測定することができる。
本明細書で言う 「α—シヌクレイン遺伝子」 は公知の遺伝子である。 CK—シヌ クレイン遺伝子としては、 ヒ トなどの哺乳動物の α—シヌクレイン遺伝子、 並ぴ に、 これらの遺伝子と同じ機能を有する変異体遺伝子の何れかを使用することが できる。 ヒト α—シヌクレイン遺伝子のァミノ酸配列を配列表の配列番号 1 6に 記載 る。
本発明では、 一シヌクレイン遺伝子の変異体遺伝子を使用することもできる。 変異体遺伝子とは、 α—シヌクレイン遺伝子の D N Α配列に変異 （例えば、 突然 変異など） が生じたものを意味し、 具体的には、 該遺伝子中の塩基配列の一部が 欠損した遺伝子、該遺伝子の塩基配列の一部が他の塩基配列で置換された遺伝子、 該遺伝子の一部に他の塩基配列が揷入された遺伝子などを用いることができる。 欠損、 置換または付加される塩基の数は、 特に限定されないが、 一般的には 1か ら 5 0個程度、 好ましくは 1から 1 5個程度、 より好ましくは 1から 6個程度で ある。 このような塩基配列の欠損、 置換または付加によって、 α—シヌクレイン のァミノ酸配列において、 好ましくは 1ないし 5個程度、 より好ましくは 1また は 2個程度のアミノ酸の欠損、 置換または付加が生ずることになる。 なお、 これ らの変異体遺伝子としては、 野生型の α—シヌクレインと同等の機能を有するポ リぺプチドをコードしているものを使用することが好ましい。本明細書で言う「ひ —シヌクレイン遺伝子」 とは、 野生型の α—シヌクレイン遺伝子のみならず、 上 記したような変異体遺伝子の全てを包含する最も広レ、意味を有する。
本発明で用いる α—シヌクレイン遺伝子としては、 野生型ヒト α—シヌクレイ ン遺伝子のァミノ酸配列 （配列表の配列番号 1 6 ) におけるァミノ酸番号 3 0の ァラニン残基が他のアミノ酸に置換した変異、 及ぴ Ζ又は、 アミノ酸番号 5 3の ァラニン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換し変異を有する、 変 異型の α—シヌクレイン遺伝子であることが好ましい。このような変異型の a— シヌクレイン遺伝子の DNAは、例えば、公知のヒ ト α—シヌクレイン遺伝子をコ ードする DNAを铸型とし、 α—シヌクレイン タンパク質のアミノ酸番号 3 0、及 ぴ Ζ又はアミノ酸番号 5 3のァラニン残基をコードする α—シヌクレイン遺伝 子の塩基を他のアミノ酸をコードするように置換したミスセンス変異導入プライ マーを用いた PCRによって取得することができる。
本発明においては、 配列番号 1 6に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号 3 0の ァラニン残基に相当するアミノ酸残基がプロリン残基に置換する変異、 並びに配 列番号 1 6に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号 5 3のァラニン残基に相当する ァミノ酸残基がスレオニン残基に置換する変異が好ましく、 この中でも後者の変 異が特に好ましい。 さらに本発明では、 上記アミノ酸配列の C末端 （C末端の 1 〜2 0アミノ酸残基、 好ましくは C末端の 5〜1 5アミノ酸残基、 例えば、 C末 端の 1 0アミノ酸残基など） を欠損させた遺伝子を使用することが好ましい。 5 3番目のァミノ酸残基であるァラニン残基がスレオニン残基に置換している変異 体を使用することによりパーキンソン病の病態を再現することが可能になり、 ま た、 C末端を欠損させた遺伝子を使用することにより該遺伝子の発現量を向上さ せることが可能になる。
なお、 PCR、 プライマーの作製、 ゲノム DNAの調製、 クローユング、酵素処理等 の方法は、 当業者に周知の常法により行うことができる。
( 2 ) 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物の作製
本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物の作製方法は特に限定されないが、 例えば、 α—シヌクレイン遺伝子をプロモーターの制御下に組み込んだ発現べク ターを受精卵などに導入することにより作製することができる。 以下、 ひーシヌ クレイン遺伝子の導入により該遺伝子を、 特に脳の神経細胞で発現するトランス ジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法について説明する。
トランスジエニック非ヒト哺乳動物の作製のために用いる導入遺伝子としては、 上記した α—シヌクレイン遺伝子を適当な哺乳動物用プロモーターの下流に連結 した組換え遺伝子を使用することが好ましい。 当該 α—シヌクレイン遺伝子の下 流には、 所望により、 ポリ Αシグナルを連結することができる。
導入遺伝子の構築に用いる哺乳動物用プロモーターの種類は特に制限されない が、 シヌクレイン遺伝子を神経細胞 （特に好ましくは、 ドーパミン産生神経 細胞） において発現させることができるプロモーターを用いることが好ましい。 α _シヌクレイン遺伝子のドーパミン産生神経細胞での発現を駆動できるプロモ 一ターの具体例としては、 チロシンヒドロキシラーゼのプロモーターなどが挙げ られる。 その他、 例えば、 ウィルス （例、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血 病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルスなど） 由来遺伝子プロモーター、 各種 哺乳動物 （例、 ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） および鳥類 （例、 ニヮトリなど） 由来のプロモーターなどを適宜使 用することもできる。
さらに、 本発明で用いる組換え遺伝子には、 α—シヌクレイン遺伝子の発現に 必要なターミネータ一を連結してもよい。 該ターミネータ一は、 トランスジェニ ック動物において、 目的とするメッセンジャー R NAの転写を終結する配列 （い わゆるポリ Α) として使用され、 ウィルス由来、 各種哺乳動物または鳥類由来の 各遺伝子の配列が用いることができる。 具体的には、 シミアンウィルスの S V 4 0ターミネータ一などが用いられる。 その他、 α—シヌクレイン遺伝子をさらに 高発現させる目的で、 既知の遺伝子のスプライシングシグナル、 ェンハンサー領 域を連結することができる。 さらには、 真核生物遺伝子のイントロンの一部をプ 口モーター領域の 5， 上流に、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流に連結することも可能である。
上記導入遺伝子に組み込まれた α—シヌクレイン遺伝子は、 受精卵等の細胞内 で発現すると、 細胞内に α—シヌクレインが産生されるようになる。
ひーシヌクレイン遺伝子の導入により α—シヌクレインを発現する トランスジ エニック非ヒト哺乳動物は、 例えば、 非ヒト哺乳動物の受精卵に α—シヌクレイ ン遺伝子を導入し、 当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、 当該非ヒ ト哺乳動物から α—シヌクレイン遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させ ることにより作製することができる。
非ヒ ト哺乳動物としては、例えば、マウス、 ハムスター、 モルモット、 ラッ ト、 ゥサギ等のげつ歯類の他、 ニヮトリ、 ィヌ、 ネコ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ、 ブタ、 サル等を使用することができるが、 作製、 育成及び使用の簡便さなどの観点から 見て、 マウス、 ハムスター、 モルモッ ト、 ラット、 ゥサギ等のげつ歯類が好まし く、 そのなかでもマウスが最も好ましい。
本発明で用いるトランスジエニック非ヒト哺乳動物は、 胚芽細胞と、 生殖細胞 あるいは体細胞とが、 非ヒト哺乳動物またはこの動物の先袓に胚発生の段階 （好 ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前） において 外来性の α—シヌクレイン遺伝子を含む組み換え遺伝子を導入することによって 作出される。 α—シヌクレイン遺伝子を含む組み換え遺伝子の構築は上記した通 りである。
受精卵細胞段階における α—シヌクレイン遺伝子の導入は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行う。 遺伝子導 入後の作出動物の胚芽細胞において、 α—シヌクレイン遺伝子が存在することは、 作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてに α—シヌクレイン 遺伝子が存在することを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はそ の胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに α—シヌクレイン遺伝子を有する。
本発明のトランスジエニック動物は、 交配により遺伝子を安定に保持すること を確認して、 当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することがで きる。 導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この 雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を過剰に有するように 繁殖継代することができる。 α—シヌクレイン遺伝子の発現部位を同定するため には a—シヌクレイン遺伝子の発現を個体、 臓器、 組織、 細胞の各レベルで観察 することができる。 また、 α—シヌクレインの抗体を用いた酵素免疫検定法によ りその発現の程度を測定することも可能である。
以下、 トランスジエニック非ヒ ト哺乳動物がトランスジエニックマウスの場合 を例に挙げて具体的に説明する。 α—シヌクレイン遺伝子をコードする c D NA をプロモーターの下流に含有する導入遺伝子を構築し、 該導入遺伝子をマウス受 精卵の雄性前核にマイクロインジエタションし、 得られた卵細胞を培養した後、 偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、 その後被移植動物を飼育し、 産まれた仔マ ウスから前記 c D NAを有する仔マウスを選択することにより トランスジェニッ クマウスを作製することができる。 上記マウスの受精卵としては、 例えば、 1 2 9 Z s v、 C 5 7 B L/ 6 , B A L B / c s C 3 H、 S J L^W t等に由来する マウスの交配により得られるものなら任意のものを使用できる。
また、 注入する導入遺伝子の数は受精卵 1個当たり 1 0 0〜3 0 0 0分子が適 当である。 そしてまた、 c D NAを有する仔マウスの選択は、 マウスの尻尾等よ り D NAを抽出し、 導入した o;—シヌクレイン遺伝子をプローブとするドットハ イブリダィゼーシヨン法や、 特異的プライマーを用いた P C R法等により行うこ とができる。
本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物は、 α—シヌクレインを過剰発現 することを特徴とするものであり、 パーキンソン病の治療薬又は予防薬のスクリ 一二ング試験に利用可能なモデルであり、 またパーキンソン病の発生機構の解明 などの研究分野においても有用である。
また、 上記した本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物の一部としては、 非ヒト哺乳動物の細胞、 細胞内小器官、 組織おょぴ臓器のほか、 頭部、 指、 手、 足、 腹部、 尾などが挙げられ、 これらも全て本発明の範囲内に属する。
( 3 ) ドーパミン様作用を有する物質 （例えば、 パーキンソン病の治療剤及び Ζ 又は予防剤など） のスクリーニング
本発明によるドーパミン様作用を有する物質のスクリーニング方法は、 α—シ ヌクレインを過剰発現する本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物を用いて 行うことができる。即ち、本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物（例えば、 トランスジエニックマウスなど） に、 被検物質を投与し、 該トランスジエニック 非ヒト哺乳動物の生理学的データや運動能力などを評価 ·検討することにより、 該被検物質のパーキンソン病に対する治療効果や予防効果を評価することができ る。
あるいはまた、 本発明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与 し、 投与後における α—シヌクレインの発現状態や生体内における動態を分析す ることにより.、 該被検物質のパーキンソン病に対する治療効果や予防効果を評価 することもできる。
すなわち、本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物を利用することにより、 パーキンソン病の治療効果及び予防効果を評価することが可能であり、 本発明の トランスジヱニック非ヒト哺乳動物は、 パーキンソン病の病態評価モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動 物を用いて、 これらの病態回復および重篤程度を判定し、 この疾患の治療方法の 検討を行うことも可能である。
さらにまた、 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物を用いることによつ て、 CK—シヌクレインの過剰発現と、 上記疾病の進行度などを分析することによ り、 該疾患の発症 ·進行のメカニズムを解明することができる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、例えば、ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽 出液、 動物組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であ つてもよいし、 公知の化合物であってもよい。 またペプチドライブラリーや化合 物ライブラリーなど、 多数の分子を含むライブラリーを被験物質として使用する こともできる。
本発明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する方法として は、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられる。また、被験物質の投与量は、 投与方法、 被験物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、 上記した被験物質から 選ばれた物質であり、 パーキンソン病に対して予防 ·治療効果を有するので、 パ 一キンソン病に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用するこ とができる。 さらに、 上記スクリーニングで得られた物質から誘導される化合物 も同様に医薬として用いることができる。 該スクリーニング方法で得られた物質 は塩を形成していてもよく、 該物質の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例 えば、 無機酸、 有機酸） または塩基 （例えば、 アルカリ金属） などとの塩が用い られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） と の塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイ ン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 該スクリーニング方法で得られた物質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した 錠剤、 力プセル剤、 ェリキシル剤、 マイクロ力プセル剤などとして経口的に、 あ るいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁 液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば、 該物質を生理学的に許容される担体、 香味剤、 賦形剤、 ビヒクル、 防 腐剤、 安定剤、 結合剤などと一緒に混和することによって製剤を製造することが できる。錠剤、力プセ/レ剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦开剤、 コーンスターチ, ゼラチン， アルギン酸などのよう な膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖， 乳糖またはサッ カリンのような甘味剤、 ペパーミント， ァカモノ油またはチェリーのような香味 剤などが用いられる。 注射のための無菌組成物は注射用水のようなビヒクル中の 活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出植物油などを、 溶解または懸濁 させるなど常法に従つて処方することができる。 注射用の水性液としては、 例え ば、 生理食塩水， ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビ トール、 D—マンニトール， 塩化ナトリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解 捕助剤、例えば、 アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非ィォン性界面活性剤 （例 えば、 ポリソルベート 8 0™， H C O—5 0 ) などを併用することもできる。 油 性液としては、 例えば、 ゴマ油， 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息 香酸べンジル， ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
また、 上記のパーキンソン病の治療剤及び/又は予防剤には、 例えば、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩ィ匕 ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミ ン， ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール， フ ェノールなど） 、 酸化防止剤などを配合してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物に対して投与することができる。 該物質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はあるが、 例えば、 経口投与する場合、 一般的に成人 においては、一日につき該化合物を約 0. 1〜1 0 Omg、好ましくは約 1. 0〜 5 0m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対 象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で通常成人に投与す る場合、 一日にっき該化合物を約 0. 0 1〜1 0 0mg程度、 好ましくは約 0. 1〜 5 0 m g程度を静脈注射により投与する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されることはない。 実施例
実施例 1 ： ヒト型 α—シヌクレイン遺伝子のクローニング
ヒト脳由来 c DNA (クロンテック社製） を铸型とし、 配列ー1のオリゴヌク レオチドと配列一 2のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、 P CRに よりヒト型 α—シヌクレイン遺伝子を増幅した。 当該反応にはタカラバイオ社製 のキット （T a K a R a LA P CR K i t V e r . 2) を用い、 タカラ パイォ社製の P C Rサーマルサイクラー MPを使用した。
反応組成液
ヒト脳由来 c DNA 1 β
1 0 X P CR緩衝液 ο μ
2. 5mM d NTP 4 μ
1 0 μΜ オリゴヌクレオチド (配列一 1 ) 2 μ
1 0 μ Μ オリゴヌクレオチド (配列一 2) 2 μ
水 3 5 . 5 μ
LA T a qポリメラーゼ 0. 5 μ 1
眚 5 0 μ 反応条件
94 で 2分保持後、 94 °Cで 3 0秒間反応させ、 6 0 °Cまで冷却し、 6 0でで 1分保持し、 更に 7 2 °Cで 3分間保持した。 これを 3 0回繰り返して、 目的配列 を増幅させた。
1) 2)
増幅した DNA断片をァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 1 %) で分画し、 常 法に従ってヒ ト ;—シヌクレイン遺伝子を含むパンド （1. 24 k b) を切り出 した。 ァガロースゲルからの DNA断片の抽出と精製は GENE C L EANII K i t (バイオ 1 0 1社製） を用いて行った。 この精製 DNA断片を以下の方 法により塩基配列決定用ベクター、 p T 7 B l u e T-V e c t o r (ノバジ ェン社製）に組み込んだ。 ライゲーシヨン溶液は、タカラバイオ社製のキット （T a K a R a DNA L i g a t i o n K i t V e r . 2) を用い、 1 6°C で 1. 5時間反応させた。
反応組成液
P CR産物 1 μ 1 (5 0 n g)
T 7 B l u e T一 1 β 1 (1 η g)
水 3 μ 1
ライゲーシヨン溶液 5 μ 1
1 0 μ I
上記反応溶液を用いて常法に従って大腸菌 Κ 1 2株 DH 5の形質転換を行った c 形質転換体をアンピシリン （Amp) 5 0 μ gZm 1を含有する L B寒天培地に プレーティングし、 3 7 °Cでー晚培養した。 コロニーを 5 0 μ gZm 1の Amp を含む L B液体培地 1 0m lに接種して 3 7 °Cで一晩培養し、 遠心分離によって 菌体を集めた後、 Q I Ap r e p S i n P l a s m i d M i n i p r e p K i t (キアゲン社製） で組換え DNAを精製し、 常法に従って全塩基配列 を決定した。 塩基配列は Ge n b a n kに登録されている配列 （a c c e s s i o n番号： L 08 8 50) と同一であった。 このようにして構築した組み換え D NAを p T 7 NAC P 140と命名した。 実施例 2 ：変異型ヒト α—シヌクレイン遺伝子の調製
P T 7NACP 1 40を铸型とし、 T a Ka R a LA PCR i n v i t r o Mu t a g e n e s i s K i t (タカラバイオ社製） を用いて 5 3残 基目のァラニン （コドン： GCA) がスレオニン （コドン： ACA) に変わるよ うに点突然変異を導入した。
反応組成液
Figure imgf000017_0001
1 0 μ M オリゴヌクレオチド （配列一 3または 5 ) 2 μ 1
1 0 μΜ オリゴヌクレオチド （配列一 4または 6 ) 2 μ 1
1 0 X PCR緩衝液 5 μ 1
2. 5mM dNTP 4 μ 1
水 35 5 μ 1
LA T a qポリメラーゼ 0 5 μ 1
50 μ \
反応条件
94 °Cで 2分保持後、 94でで 30秒間反応させ、 60 °Cまで冷却し、 60 °C で 2分保持し、 更に 7 2 °Cで 3分間保持した。 これを 2 5回繰り返して、 目的配 列を増幅させた。
配列一 3 (配列番号 3) 配列一 4 C AGCCACTGTTGCCACACCATGC (配列番号 4) 配列一 5
配列一 6 GCATGGTGTGGCAACAGTGGCTG (配列番号 6 ) 配列一 3と配列一 4を用いて得られた PC R産物と、 配列一 5と配列一 6を用 いて得られた PCR産物を等量混合し、 94°Cで 1 0分間加熱後、 60分間かけ て 3 7 °Cまで冷却し、 3 7 °Cで 1 5分間保持した。 この反応溶液を铸型として P CR反応を実施し、 目的とする点突然変異が導入された DNAを増幅した。 反応組成液
混合液 1 μ
1 0 μΜ オリゴヌクレオチド （配列一 3 ) 2 μ
1 0 μΜ オリゴヌクレオチド （配列一 5) 2 μ
1 0 X PC R緩衝液 5 μ
2. 5mM dNTP 4 μ
水 3 5. 5 μ
LA Τ a qポリメラーゼ 0. 5
総量 5 0 w
反応条件
94 °Cで 2分保持後、 94 °Cで 30秒間反応させ、 60°Cまで冷却し、 60°C で 2分保持し、 更に 72 °Cで 3分間保持した。 これを 25回,操り返して、 目的配 列を増幅させた。
実施例 1に記載したのと同様の方法を用いて増幅した DNA断片を精製し、 p T 7 B 1 e T-V e c t o r (ノバジェン社製） に組み込んだ。 このように して構築した組み換え DNAを pT 7NACP 1 4 Omと命名した。 常法に従つ てヒト a—シヌクレイン遺伝子を含む領域の全塩基配列を決定し、 当該遺伝子内 に所望の点突然変異が導入されたことを確認した。
P T 7NACP 1 4 Omを铸型とし配列一 1のオリゴヌクレオチドと配列一 7 のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、 ヒト a—シヌクレイン蛋白の開 始コドンから 1 30残基目のコドンまでを含む領域を PCRにより増幅した。 配 列一 7のオリゴヌクレオチドは 1 30残基目のコドンの直後に終止コドンが来る ように設計した。 また当該 PCR反応には P f u DNAポリメラーゼ （ストラ タジーン社製） を用い、 DNA増幅中に新たな突然変異が入らないようにした。 反応組成液
P T 7 NAC P 1 4 0m 1 β ( 1 0 n g)
1 0 X P CR緩衝液 5 μ
2. 5mM dNTP μ
1 0 μΜ オリゴヌクレオチド （配列一 1 ) 2 μ
1 0 μ Μ オリゴヌクレオチド （配列一 7 ) 2 μ
水 3 5 5 μ
P f u DNAポリメラーゼ 0 5 μ
5 0 μ
反応条件
9 4 °Cで 2分保持後、 9 4 °Cで 3 0秒間反応させ、 6 0°Cまで冷却し、 6 0°C で 1分保持し、 更に 7 2 で 3分間保持した。 これを 3 0回繰り返して、 目的配 列を増幅させた。 号 7)
得られた DN A断片を実施例 1に記載したのと同様の方法を用いて p CRB 1 u n t (インビトロジェン社製） に組み込んだ。 このようにして構築した組み換 え DNAを p CRNAC P 1 3 Omと命名した。 常法に従って変異型ヒト a—シ ヌクレイン遺伝子を含む領域の全塩基配列を決定し、 所望の配列を有することを 確認した。 実施例 3 ：マイクロインジェクション用 DNA断片の調製
CRNAC P 1 3 Omを P s t Iと S p e Iで切断してァガロースゲル電気 泳動 （ゲル濃度 1 %) で分画し常法に従って変異型ヒト α—シヌクレイン遺伝子 を含むバンド （4 1 7 b p) を切り出した。 ァガロースゲルからの DNA断片の 抽出と精製は、 GENEC LEANII K i t (バイオ 1 0 1社製） を用いて行 つた。 さらに DNA断片の両端を常法に従って平滑化した。 次にラット ·チロシ ンヒドロキシラーゼ遺伝子のプロモーターを有する発現ベクター、 pTHZ— 9 k b (I wawa k i, T. e t a 1. B i o c h em B i o p h y s Re s C ommu n 274, 590— 595 (2000) ) を Xh o Iと H i n d I I Iで切断し、 プロモーターを有する断片を p B S T— N (K o b a y a s h i , K. e t a 1. P r o c Na t l Ac a d S c i USA 89， 1631-1635 (1992) ) に挿入して pRTH— B s tNを調製した。 pRTH— B s tNをEc o R Iで切断し、 両端を常法に 従って平滑化後、 脱リン酸化した。 当該ベクターと上述した変異型ヒト a—シヌ クレイン遺伝子を含む断片を混合して実施例 1に記載したのと同様の方法で結合 して大腸菌 Κ 12株 DH 5の形質転換を行い、 形質転換体から組み換え DN Αを 調製した。 このようにして構築した組み換え DNAを pRTHNACP 130m と命名した。 p RTHNAC P 130mを S a 1 Iで切断した後ァガロースゲル 電気泳動（ゲル濃度 0. 8%)で分画し、常法に従って目的とするバンド （11. 4 k b) を切り出した。 ァガロースゲルからの DN A断片の抽出と精製は、 GE NECLEANII K i t (バイオ 101社製） を用いて行った。 精製した DN A断片をダルべッコ · リン酸緩衝溶液 （インビトロジェン社製） に融解し （終濃 度 12. 6 n g/μ 1 (=2000コピー 2 i) ) , これをマイクロインジ ェクシヨン用 DN A溶液とした。 実施例 4 ：変異型ヒト シヌクレイン ' トランスジエニックマウスの作製 日本チヤ一ルスリパーが推奨する方法を用いて、 Β 6 C 3 F 1系統の凍結前核 期卵 （日本チヤ一ルスリパーより購入） を融解した。 すなわち凍結前核期卵が入 つたクライオチューブ （直径 12mm、 長さ 40mm、 ナルジェヌンク社製） を 液体窒素から取り出し、 室温 （23°C) にて 1分間放置した。 37 °Cに加温した マウス胚 0. 25Mシユークロース液 （ダイアヤトロン社製） 900 1を添カロ し、 ピぺッティングにより素早く凍結塊を融解した。 融解液を直径 35 mmのプ ラスチックシャーレに移し、胚操作用キヤビラリ一を用いて前核期卵を回収した。 前核期卵を PB 1緩衝液で 3回洗浄した後、 マウス胚 mW培地 （三菱化学ャトロ ン社製） で 1時間培養 （37°C、 5%CO2) した。
PB 1緩衝液
組成 g / 100 m 1滅菌蒸留水
N a C 1 0. 8
KC 1 0. 0 2
Figure imgf000021_0001
KH2PO4 0. 0 2
Mg C 1 · 6 H20 0. 0 1
N a 2HP04 0. 1 1 5
ピルビン酸ナトリウム 0. 0 0 36
グノレコース 0. 1
ペニシリン Gカリウム明治 （明治製菓社製） 0. 0075
アルブミンフラクション Vパウダー （シグマ社製） 0. 3 マイクロインジヱクシヨン装置 （ノマルスキー微分干渉装置付き倒立顕微鏡 T E 300 (ニコン社製） にマイクロマニピュレーター MMO— 204 (ナリシゲ 社製） 、 マイクロインジェクター IM— 50AZB (ナリシゲ社製） 、 マイクロ シリンジ （ハミルトン社製） を取り付けたもの） を用いて、 常法に従って前核期 卵の雄性前核へ実施例 3で調製した D N A溶液を 2 p 1 ( 2000コピー） 注入 した。 受精卵保持用マイクロキヤピラリーと DNA注入用マイクロキヤビラリ一 は、長さ 10 cm、直径 1. Omm、 内径 0. 75 mmのホウ珪酸塩ガラス管（サ ッタ一社製） を、 プーラ一 P— 97Z I VF (サッター社製） 及ぴマイクロフォ ージ MF— 900 (ナリシゲ社製） で加工して作製した。 D N A注入操作用スラ イドガラスは、 マイクロカバーグラス （マツナミガラス社製） にスウィンネクス ガスケット 015 (ミリポア社製） を張り付けたものを使用した。 DNA注入後の前核期卵をマウス胚 mW培地 （三菱化学ャトロン社製） で一晩 培養 （37°C、 5%C02) した。 翌朝 2細胞期に発生した胚を常法に従ってレ シピエントマウス （I CR系統、 雌、 8週齢 （日本 SLCより購入） を.同系統の 精管結紮雄マウス （10週齢、 日本 S LCより購入） と交配させ偽妊娠させたも の） の卵管膨大部へ移植した。 移植 193後にレシピエントマウスの帝王切開を 行い、 移植胚に由来する仔マウスを摘出した。 仔マウスは離乳するまでフォスタ 一マザ一（出産 1日後の I CR系統雌マウス （12週齢、 日本 S LCより購入） ） に保育させ、 帝王切開の 28日後に仔マウスを離乳させフアウンダーマウスとし た。 実施例 5 ：変異型ヒト α—シヌクレイン · トランスジエニックマウスの選別 離乳した仔マウスからジェチルエーテル麻酔下で尾の先端約 5 mmを切断後、 耳パンチ法により個体識別した。 D N A抽出緩衝液 ( 100 mM Na C l、 5 OmM T r i s— HC 1 (pH7. 5)、 20 mM EDTA、 1% SDS) 400 μ 1に対しプロテナーゼ K (2 OmgZm 1 ：タカラバイオ社製） を 20 μ 1添加した溶液中において、 採取した尾を 55 °Cで一晚浸漬振盪した。 この融 解液 1 μ 1を滅菌蒸留水で 100倍希釈し試料 DN Αとした。 導入した DN Aの 一部の配列を有する配列一 8と配列一 9、 及び内部標準としてァセチルコリン受 容体蛋白である R a p s y nの一部の配列を有する配列一 10と配列一 1 1のォ リゴヌクレオチドをプライマーとして PC Rを実施した。 当該反応には T a Ka Ra LA Ta q™ (タカラバイオ社製） を用い、 アプライドバイオシステ ムズジャパン社製の G e n e Amp PCR S y s t em 9700を使用 した。
配列— 8： GTGGCTGCTGCTGAGAAAAC (配列番号 8) 配列一 9： GTGGGGCTCCTTCTTCATTC (配列番号 9 )
(配列番号 10) 配列一 1 1 ：
(配列番号 1 1 )
反応組成液
試料 DNA 1 β
1 0 μΜ オリゴヌクレオチド (配列一 8) 1 β
1 0 μ Μ オリゴヌクレオチド (配列一 9) 1
1 0 μ Μ オリゴヌクレオチド (配列一 1 0) 1
1 0 ίΜ オリゴヌクレオチド (配列一 1 1) 1
1 0 X P CR緩衝液 2 . 5 μ
2 5 mM Mg C 1 2 1 . 5 μ
2. 5mM d NTP 2 μ
水 1 3. 7 5 μ
LA T a qポリメラーゼ 0. 2 5 μ
2 5 μ
P CRの反応条件として、 9 4 で 9分保持後、 9 4 °Cで 1分間、 6 0 °Cで 1 分間、 更に 7 2 °Cで 2分間反応させた。 これを 5回繰り返した後、 94°Cで 1分 間、 6 0でで 1分間、 7 2 °Cで 1分間の反応を 2 8回繰り返し、 目的の配列を増 幅した。 増幅した DNAを、 常法に従って 2 %TAEァガロース （S e a k e m ME Ag a r o s e ;タカラバィォ社製） ゲルで 1 0 0 V、 4 0分間電気泳動 した。 ゲルをェチジゥムブロマイド溶液 （アマシャムバイオサイエンス社製） で 染色した後、 紫外光照射し配列一 8と配列一 9で増幅された DNA断片 （2 7 9 b p) 、 及び配列一 1 0と配列一 1 1で増幅された DNA断片 （5 9 1 b p) の 両方を有する個体を T g動物として選別した （図 1) 。 実施例 6 ：変異型ヒ ト α—シヌクレイン · トランスジエニックマウスの繁殖 実施例 4で取得したファゥンダーマゥスを実施例 5に記载した方法で解析する ことにより導入遺伝子陽性の個体を取得した。 当該個体を C 57B 6ZJ系統マ ウス （日本クレアより購入） と交配させ、 F 1世代を産生した。 さらに C 57B 6/ J系統への戻し交配を繰り返して N 2〜N 6世代を産生した。 実施例 7に記 載するサザンハイブリダィゼーシヨン法で F 1世代の遺伝子解析を行い、 染色体 中に組み込まれた遺伝子のコピー数を推定した。 当該解析により染色体の複数箇 所に導入遺伝子が挿入されていることが判明したフアウンダーマウスは、 C 57 B 6 J系統への戻し交配の過程で、 各挿入部位について個別にラインを確立し た。 以上の方法により、 計 9匹のフアウンダーマウスを作製し、 ここから計 12 ラインの変異型ヒトひーシヌクレイン · トランスジエニックマウスを確立した。 実施例 7 ：サザンハイプリダイゼーション解析
以下の方法により変異型ヒト α—シヌクレイン遺伝子に特異的なジゴキシゲュ ン標識プローブを調製した。 まず変異型ヒト a—シヌクレイン遺伝子の一部と相 補的な配列を有するオリゴヌクレオチド配列一 12及ぴ配列一 1 3をプライマー として用い、 実施例 3で調製した pRTHNACP 13 Omを铸型として PCR を行った。 当該反応には Amp 1 i T a q G o 1 d (ロシュ .ダイァグノス ティックス社製） を用い、 タカラバィォ社製の T a Ka R a PCRサーマルサ イクラ一 MPを使用した。
配列— 12 ： GTGGCTGCTGCTGAGAAAAC (配列番号 12) 配列一 13 ： GTGGGGCTCCTTCTTCATTC (配列番号 13 ) 反応組成液
pRTHNACP 130m (10 p / n 1 ) 1 μ 1 10 XPCRバッファ— （ロシュ ックス社製） 2 5 μ 1 Ge n e Amp dNTP Mi x 5 μ 1 (ロシュ ·ダイァグノスティックス社製）
10 μΜ オリゴヌクレオチド （配列一 12) 1 μ 1
10 μ Μ オリゴヌクレオチド （配列一 13) 1 μ 1 滅菌蒸留水 1 7. 75 ^ 1 Am 1 i T a q Go l d 5U/^ 1 0. 2 5 μ 1
(ロシュ .ダイァグノスティックス社製）
総量 _ 25 1 反応条件
94 °Cで 9分保持後、 94 °Cで 1分間、 6 0 °Cで 1分間、 更に 72。Cで 2分間 反応させた。 これを 5回繰り返した後、 94でで1分間、 60でで1分間、 72°C で 1分間の反応を 28回繰り返し、 目的の配列を増幅した。
反応終了後の溶液を 3 μ 1採取し、 常法に従って 1. 2%ァガロースゲル電気 泳動で分画し、 泳動像を確認した。 これにより 2 79 b pの変異型ヒト α—シヌ クレイン遺伝子の一部の配列を有する DN Α断片が特異的に増幅されていること を確認した。 次に PCR D I Gプローブ合成キット （ロシュ ·ダイァグノステ イツタス社製） を用いて、 この DNA断片のジゴキシゲニン標識を行った。 当該 反応には T a K a R a P C Rサーマルサイクラー MPを使用した。
反応組成液
上記 PC R反応溶液を滅菌蒸留水で 1 00倍希釈した溶液 1 IX 1 Mg C 1 2含 PCRバッファー 1 0倍濃度 5 μ 1
(ロシュ 'ダイァグノスティックス社製）
PCR D I G ミックス 1 0倍濃度 5 μ 1
(ロシュ ·ダイァグノスティックス社製）
1 0 μ M オリゴヌクレオチド （配列一 1 2 ) 1 μ 1 1 0 μΜ オリゴヌクレオチド （配列一 1 3 ) 1 μ 1 滅菌蒸留水 36 25 μ 1 エキスパンド H i g h F i d e l i t y 0 75 μ \
(ロシュ ·ダイァグノスティックス社製） 反応条件
95 °Cで 2分保持後、 95でで 1分間、 60 °Cで 1分間、 更に 72 °Cで 2分間 反応させた。 これを 10回繰り返した後、 95°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 7 2°Cで 1分間の反応を 35回繰り返した。 これにより目的の配列を増幅させると ともに、 D I G— dUTPを PCR産物に取り込ませることでジゴキシゲニン標 識を行った。
反応終了後の溶液を 3 μ 1採取し、 常法に従って 1. 2%ァガロースゲル電気 泳動で分画した。 ジゴキシゲニンによる標識のため、 本来のバンドサイズである 279 b ρよりも、 バンドサイズが高分子側にシフトしていることを確認した。 次に尾組織由来 DNAを以下の方法により調製した。 尾組織 （5mm) を 2m 1のエツペンドルフチューブに入れ、 バッファー ATL (キアゲン社製） 400 μ 1とプロテインネース Κソリューション（キアゲン社製） 20 μ 1を添カ卩し、 55 °Cで一晚浸漬振盪した。得られた融解液を 15000X g、 10分、室温（2 3°C) で遠心し、 上清と沈殿に分画した。 上清を 300 μ 1回収し、 核酸自動分 離装置 ΡΤ— 200 (クラボウ社製） を用いて DNAを精製した後、 分光光度計 DU-640 (ベックマン社製） を用いて DNA濃度を定量した。 尾組織由来 D ΝΑ、 10 μ gを E c o R Iで処理し、 常法に従って 1. 2%ァガロースゲル電 気泳動で分画してナイロンメンブレンプラスチャージ （ロシュ ·ダイァグノステ イツタス社製） に転写した。 メンブレンをハイプリ 'パック （コスモ 'バイオ社 製） に入れて D I G Ea s y H y b (ロシュ ·ダイァグノスティックス社製） 20mlを添カ卩し、 42。(：で 30分間浸漬振盪した。 変異型ヒト α—シヌクレイ ン遺伝子特異的プローブ （100°Cで 10分加熱した後、 直ちに氷上で急冷した もの）を 2 Om 1の D I G Ea s y H y bに希釈し（終濃度 50 n g Zm 1 )、 ハイブリ 'バック内の D I G Ea s y H y bと交換した。 これを 42 °Cで 1 2時間浸漬振盪した後、メンプレンを 2 X S S C (0. 1% 303)で42°(：、 10分間処理し、 0. 1 XS SC (0. 1% SDS) で 65°C、 40分間処理 した。 メンプレンと特異的に結合したジゴキシゲニン標識プローブの検出は、 D I G洗浄およぴブロックバッファーセット （ロシュ ·ダイァグノスティックス社 製） を用いて行った。 すなわち、 メンプレンをマレイン酸バッファー （ロシュ ' ダイァグノスティックス社製） で 2倍に希釈したブロッキング溶液 （ロシュ 'ダ ィァグノスティックス社製） に浸し、 室温 （23°C) で 2時間振盪した。 次にァ ルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン F a bフラグメント （ロシュ 'ダイ ァグノスティックス社製） をこの溶液で 10000倍希釈し、 メンプレンを 30 分間浸漬振盪した。 さらにメンブレンを洗浄バッファー （ロシュ 'ダイァグノス ティックス社製） で 40分間洗浄した後、 CDP— S t a r (ロシュ 'ダイァグ ノスティックス社製） を検出バッファー （ロシュ ·ダイァグノスティックス社製） で 100倍希釈して、 メンプレンを反応させた。 シグナルの検出はルミ 'ィメ一 ジャー F 1ワークステーション （ロシュ 'ダイァグノスティックス社製） を使用 した。
サザンハイブリダィゼーション解析の結果、 トランスジエニックマウスでは導 入遺伝子に由来する 346 b pのバンドが検出されたが、 野生型マウスでは検出 されなかっ （図 2A) 。 当該バンドのシグナル強度は各ラインで大きく異なつ ていた。 シグナル強度から各ラインの挿入コピー数を推察したところ、 最も高い コピー数を持つライン （ 1702ライン） は、 約 30コピーの導入遺伝子が挿入 されているものと考えられた。
なお、 作製したトランスジエニックマウス （1702ライン） の受精卵 （識別 のための表示： TH/s yn l 30ml 702) は、 受託番号 FERM P— 1 9546として、 2003年 （平成 15年） 10月 2日付で、 独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番地 1 中央第 6) に寄託され、 2004年 （平成 16年） 9月 16日に、 受託番号 FERM B P— 10131として国際寄託に移管されている。
この細胞に由来するマウスは、 ドーパミン産生神経においてヒト シヌタレ イン遺伝子の変異体を発現する。同様に、作製したトランスジエニックマウス（2 402ライン） の受精卵 （識別のための表示： THZs y n 13 Om T g 24 0 2) は、受託番号 F ERM P— 1 9 7 3 3として、 2 0 04年 （平成 1 6年） 3月 1 2日付で、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日 本国茨城県つくば市東一丁目 1番地 1 中央第 6) に寄託され、 2 00 4年 （平 成 1 6年） 9月 1 6日に、 受託番号 F ERM B P— 1 0 1 3 2として国際寄託 に移管されている。 この細胞に由来するマウスは、 ドーパミン産生神経において ヒト a—シヌクレイン遺伝子の変異体を発現する。 . 実施例 8 ：ノーザンハイブリダイゼーション解析
マウス脳組織を採材し、 クライオチューブ （直径 1 2mm、 長さ 40mm、 ナ ルジェヌンク社製） に入れて速やかに液体窒素で凍結した。 凍結した脳組織は R NAを抽出するまでディープフリーザー （サンヨーネ土製） に入れて一 8 0°Cで保 存した。 （株） 日本ジーンが推奨する方法により、 I SOGEN (日本ジーン社 製） を用いて T o t a 1 RNAの抽出を行った。 すなわち、 凍結した脳組織を 液体窒素に浸しながらハンマーで叩き破碎した。 破砕片を l O Om g量り、 2m 1のエツペンドルフチューブに入れた。 I S OGEN l m 1を添カ卩し、 ホモジェ ナイザー（日立製作所社製）を用いて 2 0秒間破壊した。チューブを室温（2 3°C) で 5分間静置した後、 クロ口ホルム 2 0 0 1を加えて 2分間激しく攪拌した。 チューブを 3分間静置した後、 1 2000 X g、 1 5分、 4°Cで遠心し、 上清 6 0 0 μ Iを回収した。 これにイソプロパノール 5 0 0 β 1を加えて 1 0分間静置 した。 1 2000 X g、 1 0分、 4 °Cで遠心し、 沈殿を 70 %エタノールで洗浄 した。 洗浄した沈殿をジェチルピロカーボネート処理水 3 0 0 μ 1に融解し、 分 光光度計 DU— 6 40 (ベックマン社製） を用いて RNA濃度を定量した。
ロシュ ·ダイァグノスティッタスが推奨する方法により、 オリゴテックス d T 3 0スーパー （ロシュ .ダイァグノスティックス社製） を用いて t o t a l R NAよりポリ （A) +RNAの抽出を行った。 すなわち 2 0 0 μ §の t o t a 1 RNAに E l u t i o n B u f f e r (1 0 mM T r i s—HC l p H 7. 5、 1 mM EDTA、 0. 1 % SD S) を加え全量で 2 00 1とした。 ォ リゴテックス d T 30スーパーを 200 1を加え、 65 °Cで 5分間加熱し、 氷 上で 3分間急冷した。 5M Na C 1を 40 1を加え、 37 °Cで 10分間イン キュベートした。 15000X g、 3分、 4°Cで遠心し、 上清を除去した。 沈殿 を Wa s h i n g Bu f f e r (10 mM T r i s— HC 1 H 7. 5、 1 mM EDTA、 0. .5M Na C l、 0. 1 % SDS) 500 1に懸濁 した。 15000X g、 3分、 4°Cで遠心し、 上清を除去した。 沈殿をジェチル ピロカーボネート処理水 200 ^ 1に懸濁した後、 65 °Cで 5分間加熱し、 氷上 で 3分間急冷した。 15000 X g、 3分、 4°Cで遠心し、 上清中のポリ （A) + RNAを回収した。
5;u gのポリ （A) +RNAを常法に従って 1. 0%変性ァガロースゲル電気 泳動で分画し、 ナイロンメンブレンプラスチャージ （ロシュ 'ダイァグノスティ ックス社製)' に転写した。 実施例 7と同じ方法で導入遺伝子 mRN Aの検出を行 つた。 検出後、 メンブレンを 0. 5% 303で100で、 10分加熱すること によりプローブを除去した。 次に各レーンにアプライしたポリ （A) +RNA量 を補正する目的で同じメンブレンを用いてジゴキシゲニン標識した i3— a c t i nの c DNA断片をプローブとしてハイブリダィゼーションを行った。 ハイブリ ダイゼーシヨンの条件は上述した方法と同一である。 またジゴキシゲニン標識 j3 -a c t i n cDNA断片は、 マウス脳由来 c D N Aを铸型とし、 配列一 14及 ぴ配列一 15をプライマーとして上述したのと同様の方法を用いて作製した。 配列一 14 ： TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG (配列番号 14) 配列一 15 ： TTTGATGTCACGCACCATTTCC (配列番号 15) ノーザンハイブリダイゼーションの結果、 変異型ヒ ト ο;—シヌクレイン遺伝子 特異的プローブにより外来性のヒト α—シヌクレイン遺伝子だけでなく内在性の マウス α—シヌクレイン遺伝子の発現も検出された。 前者の mRNAは約 1. 0 k bのパンドとして検出され、 後者の mRNAは約 1. 6 k bのバンドとして検 出された。 ヒト α—シヌクレイン遺伝子の発現量は各ライン間で大きく異なって おり、 サザンハイプリダイゼーションで推察された導入遺伝子の揷入コピー数と 強く相関していた。 すなわち、 最も挿入コピー数が高い （約 30コピー） と推察 された 1702ラインでは発現量が最も高かった （図 2B) 。 同様に 2402ラ インの発現量も高かった （図 2B) 。 実施例 9 ： ウェスタンブロッテイング解析
マウス脳組織にそれぞれ 20倍量の TB Sバッファー （20mMTr i s— H C I (p H 8. 0) , 150 mM Na C lに p r o t e a s e i nh i b i t o r C omp l e t e M i n i (ロシュ.ダイァグノスティックス社製）， 1% p h o s p h a t a s e i nh i b i t o r c o c k t a i l I (シグマ社製） を溶解したもの） を添加し、 ホモジェナイザー （日立製作所社製) で破壌した。 さらに超音波破壌 （タイテック社製） を行い、 得られた融解液を 2 500回転 3分 4 °Cで遠心した。 上清を回収しさらに 45000回転 1時間 4 °C で遠心した。 その上清について b i c u c u l l i c a c i d (B C A) p r o t e i n a s s a y (ピアス社製） を用いて蛋白濃度を測定した。
これらの蛋白を SDS— p o l y a c r y l am i d e g e l (テフコネ土製） で電気泳動して分画し、 PVDF memb r a n e (アマシャム社製） にセミ ドライ式で 2mAZcm2、 120分の条件で転写した。 変異型ヒトひ一シヌク レイン蛋白の検出には 16%のゲルを用い、 チロシンヒドロキシラーゼ蛋白の検 出には 10%のゲルを用いた。 転写後の P VDF memb r a n eは、 5%ス キムミルクを含む TB S溶液でー晚、 4°Cでブロッキングした。 ヒト型およびマ ウス型 α—シヌクレイン蛋白を検出するために、 一次抗体として α—シヌクレイ ン蛋白特異的抗体である N AC Ρ— 5 (Wa k a b a y a s h i , K. e t a 1. Ac t a Ne u r o p a t h o l (B e r 1 ) 99， 14— 2 0 (2000) ) を使用した。 NACP— 5は 0. 5%スキムミルクを含む T B Sで 5000倍希釈して使用した。チロシンヒドロキシラーゼ蛋白の検出には、 抗チロシンヒ ドロキシラーゼポリクローナル抗体 （No v u s B i o l o g i c a 1 s社製） を同様に 400倍希釈して使用した。 二次抗体は HRP標識抗ゥ サギ I gG (アマシャム社製） を同様に 1000倍希釈して使用した。 検出は、 E C L we s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n r e a g e n t s (アマシャム社製） を基質に用いて Hy p e r f i l m ECL (アマ シャム社製） に感光し、 Ima g eMa s t e r ID E l u t eにてバンド の測定を行った。
C末側 10残基を欠損するヒト変異型 ーシヌクレイン蛋白は、 内在性マウス 型ひ一シヌクレイン蛋白 （電気泳動上の分子量約 19 kD a) より低分子量側に 約 18 kD aのパンドとして検出された。 このため同一メンブレンを用いて外来 性と内在性 α—シヌクレイン蛋白の発現量を比較定量することが可能であつた。 最も遺伝子発現量が高い 1702ラインでは、 内在性 a—シヌクレイン蛋白と比 較して、 線条体部位で約 3倍、 中脳部位で約 2倍のヒ ト α—シヌクレイン蛋白が 発現していることが確認された（図 2C)。同様に、 2402ラインにおいても、 内在性 α—シヌクレイン蛋白と比較して高い発現量でヒ ト α—シヌクレイン蛋白 が発現していることが確認された （図 2C) 。
チロシンヒドロキシラーゼ蛋白は分子量約 56 kD aのバンドとして検出され た。 α—シヌクレインの発現量が最も高い 1 702ラインでは、 生後 8週齢及び 1年齢の線条体において、 チロシンヒドロキシラーゼ蛋白量が野生型マウスのそ れぞれ 40%、 60%まで有意に低下していた （図 3) 。 実施例 10 ：正向反射テスト
生後 3日から 14日齢の仔マウスを対象として、 濾紙上に被験体を仰向けに置 き、正常位に戻るまでの時間を計測した。時間はストップウォッチ（T i me K e e p e r、 セイコー社製） により 0. 1秒の単位まで測定した。 観察限度時間 は 30秒とし、 観察限度時間内に反射が観察されない場合は、 反射潜時 30秒と した。 午後 1時から午後 2時の時間帯に毎日 3試行実施し、 その中央値を粗点と した。 統計解析は Ma n n-Wh i t n e y ' s U検定を用いて行った。
1702ラインにおいて、 生後 12日齢以前の成績に有意な反射潜時の延長が 認められた。 野生型マウスは、 10日齢以降ほとんどの個体が 1秒以内に正向反 射を成立させが、 1 702ラインの Tgマウスでは、 10日齢以降でも 10秒以 上仰向けの状態から起き上がれない個体が観察された （図 4) 。 実施例 1 1 ： 自発運動量の測定
生後 8週齢及ぴ 1年齢の雄マウスを対象として、 1日間の運動量を赤外線感知 型運動量測定装置 （AB— S y s t em、 ニューロサイエンス社製） を用いて測 定した。 明暗周期は明期 12時間 （午前 7時から午後 7時） 、 暗期 12時間 （午 後 7時から午前 7時） とした。 測定前日の午後 7時より被験体を、 床敷を敷いた 小型ポリカーボネート製透明ケージ （LXWXH- 23 X 1 7 X 12 cm) に入 れて、 十分に馴化を行った。 測定日は同一ケージを用いて、 午前 1 1時から翌日 の午前 1 1時までの運動量を 1時間ごとに 24時間測定した。 運動量は 24時間 の累積カウントとして表現した。 統計解析は S t u d e n t ' s t - t e s t で有意差検定を行なった。
1 702ラインにおいて、 1日間の総自発運動量が有意に低下していた。 これ は主として活動期 （暗期） の運動量が低下しているためであった （図 5) 。 実施例 12 ：脳内モノアミン量測定
1 702ラインの生後 8週齢および 1年齢マウスの脳より中脳黒質部およぴ線 条体を、 また 5日齢おょぴ 10日齢のマウスからは全脳を摘出し、 それぞれ液体 窒素で凍結した。 凍結した組織を粉碎機で粉碎した後、 重量を測定して組織 10 Omgに対して 0. 5mlの 0. 2 M過塩素酸 （ 100 μ Mのエチレンジァミン 四酢酸 2ナトリウムと 10 μΜのパージリンを含む） を加え、 ミニコードレスグ ラインダー （ベルテックエンタープライズ社製） を用いてホモジナイズした。 ホ モジナイズ試料を氷中で 30分間静置した後、 0 °C、 2万 X gで 20分間遠心し、 上清を回収した。採取した上清を 1Mの酢酸ナトリゥムにて pH 3付近に調整後、 孔径 0. 22 μπιのマイクロコンフィルター （ミリポア社製） で濾過しモノアミ ン測定用サンプルとした。
モノアミン量は以下の条件で高速液体クロマトグラフィー （HPLC) にて測 定した。 まずモノアミン、 7種 （ドーパミン； DA、 ホモバニリン酸； HVA、 3， 4—ジヒ ドロキシフエュル酢酸； DOPAC、 L一 3—メ トキシチラミン； 3— MT、 ノルェピネフリン； NE、 セロ トニン； 5— HT、 5—ヒ ドロキシィ ンドール酢酸； 5— HIAA) の高濃度標品 （各 lmgZmL) を調製し、 これ らの溶液をすベて混合して 0. 1M酢酸 （lmgZmLのエチレンジァミン四酢 酸 2ナトリウム含有） で希釈し、 最終濃度 10 n Lの 7種混合の標準標品 を作製した。 当該標品は分解を避けるため使用時まで 4 °Cで遮光保存した。
高濃度標品 （lmgZmL)
標品調製には液体クロマトグラフィー用蒸留水 (ナカライテスタ社製) を使用 標品は全てシグマ社より購入
DA 6. 19mg/5mL 0. IN塩酸 （lmg/mL EDTA · 2Na 含有）
HVA 5mg/5mL 0. IN塩酸 （lmg/mL EDTA * 2Na含 有）
DOP AC 5mg/5mL 0. IN塩酸 （lmgZmL EDTA · 2Na 含有）
3 -MT 6. 09mg/5mL 0. 1 N塩酸 （ 1 m g Zm L EDTA - 2 Na含有）
NE 5mg/5mL 0. IN塩酸 （lmgZmL EDTA * 2Na含有） 5— HT 6. 04mg/5mL 0. 1M 酢酸 （lmg/mL EDTA - 2 N a含有）
5— H IAA 5mg/5mL 0. 1M 酢酸 （lmgZmL EDTA · 2 Na含有）
次に標準標品を HP LCにて、 以下に示す条件で分析した 9
HP LC分析条件 カラム： E I COMPAC SC— 50DS 3. OmmX 15 Omm (ェ ィコム社製）
プレカラム：ガードカートリツジ （資生堂社製）
流速： 0. 5mLZ分
作用電極：グラッシ一カーボン
加圧電圧： + 70 OmV
設定温度： 30°C
測定時間： 25分間
測定装置： NANO SPACE S I— 1シリーズ （資生堂社製）
電気化学検出器 （S 1 -1/2005)
ポンプ （S I— 1/2001)
脱気装置 （S I— 1/2009)
データ解析装置 （S_M i c r o Ch r om Ve r s i o n 4. 1) 移動相組成
0. 1M酢酸 ·クェン酸溶液 （pH3. 9) 82%
( 0. 1 M酢酸ナトリゥム溶液： 0. 1 Mクェン酸溶液 = 10 : 7混合液で p H 3. 9)
メタノール （液体クロマトグラフィ一用） 18 %
1一オクタンスルホン酸ナトリウム 190mgZL
エチレンジァミン四酢酸 2ナトリウム 5mgZL
まず測定用移動相を調製し、 電気化学検出器の測定値が安定するまでカラムを 移動相で平衡ィ匕した。 測定値の安定を確認した後、 調製した 7種混合標品を 0. 02M酢酸 （20 OmMエチレンジァミン四酢酸 2ナトリウム含有） で更に 20 0倍希釈し、 500 p gZl O i L液 （用時調製） を調製して HPLCに 10 μ L注入した。 標品はノルェピネフリン、 3， 4ージヒドロキシフエニル酢酸、 ド ーパミン、 5—ヒドロキシインドール酢酸、 ホモバニリン酸、 L— 3—メ トキシ チラミン、 セロトニンの順にピークが検出されることが知られており、 各ピーク 面積およびリテンションタイムにずれが生じないことを確認した。 次に脳ホモジ ネートより抽出した試料の測定を行った。 1検体に付き 10 L、 25分毎にォ ートサンプラーを用いて自動注入し測定した。測定までの間、試料は恒温槽で 4°C に保冷した。 モノアミン量は、 各標品 S O O p gZl Oju Lのピーク面積に対す る試料のピーク面積の比例計算によって算出し、 組織 lmg (試料 5 μ ί分） に 換算した。
算出法：
組織 lmgのモノアミン（p g) =試料ピーク面積 ÷標品ピーク面積 X 500 (p g) ÷2
その結果、 1702ラインのトランスジエニックマウスでは野生型に比べて、 生後 8週齢および 1年齢ともに中脳黒質部のドーパミン量が減少していた（図 6 )。 特に、 8週齢マウスで有意に減少しており野生型の約 60%だった。 同様にドー パミンの分解産物のホモパニリン酸も 8週齢のトランスジエニックマウスで有意 に低下していた。 し力 し、 セロトニン量は変化していなかった。 次に線条体のド ーパミン量は、 8週齢、 1年齢とも有意に減少しており、 特に 8週齢では野生型 の約 50%まで低下していた （図 7) 。 さらに若齢期マウスでも、 成体同様ドー パミン量の有意な減少が確認された （図 8、 9) 。 特に 10日齢マウス （図 9) のドーパミン量は野生型の約 60 %で、 既に生後 10日でドーパミン含量が顕著 に減少している事が確認された。 実施例 13 ：免疫組織染色
分離した 1702ラインのトランスジエニックマウスの脳をマイルドホルム 2 0MN (和光社製） で室温で 1日固定した後、 メスを用いてブレダマから前脳側 2 mmとプレダマ 0 mmで冠状面に切り出し、 これを線条体部とした。 またブレ ダマから後方 2.5mmとラムダ 0mmで冠状面に切り出し、これを中脳とした。 この後、 常法に従いパラフィン包埋し、 厚さ 3ミクロンで薄切して切片を調製し た。抗原賦活化のために切片を脱パラフィンした後 10 mMクェン酸緩衝溶液（ p H6. 0) 中でマイクロウエーブ処理を施し、 0. 5%ブロッキングリエージェ ント Zマレイン酸緩衝溶液（ 100 mMマレイン酸、 150 mM塩化ナトリウム、 pH7. 5) を用いてブロッキング処理した （37°C、 20分） 。 免疫組織染色 には 1/100希釈したゥサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（フナコシ社製、 VN- 3109-00) または 1 2000希釈したマウス抗ヒト型 α_シヌク レインモノクローナル抗体、 LB 509 (コスモバイオ社製、 Z YM18021 5) を一次抗体として用い、 終濃度 10 μ gZm 1になるように希釈した。 ビォ チン化抗ゥサギ I gG (フナコシ社製、 41-0510-00) またはピオチン 化抗マウス I gG (フナコシ社製、 41-0520-00) を二次抗体として用 いた。免疫組織染色は自動免疫染色システム（ベンタナ 'ジャパン社製）を用い、 ベンタナ社推奨の方法に従った。 またマイヤーのへマトキシリン （和光社製、 1 31-09665) を用いて細胞核を同時に染色した。
その結果、 1702ラインのトランスジエニックマウスの中脳に LB 509陽 性細胞すなわちヒト型 a—シヌクレインを発現する神経細胞を多数見出すことが できた。 また、 これら LB 509陽性神経細胞は同時にチロシンヒドロキシラー ゼに陽性であり、 導入した遺伝子が所望の部位の所望の神経細胞で発現している ことを確認できた （図 10) 。 実施例 14 ：チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞数の定量
以下の要領で 1702ラインのトランスジエニックマウスの中脳の半連続的切 片を調製した。 まず厚さ 3ミクロンで切片を 1枚とつた後、 9枚分の切片を取り 除いた。 この作業を繰り返すことにより、 理論的に厚さ 30ミクロンの脳組織に つき 3ミクロンの切片を 1枚得ることができる。 このようにして得られた中脳領 域のすべての切片について、 実施例 13に記載したのと同様の方法で抗チロシン ヒドロキシラーゼ抗体を用いて免疫組織染色を行った。 これらの切片を光学顕微 鏡で観察することによりブレダマ後方 2. 8 mmから 3. 8 mmの範囲の切片を 選び出した。 当該切片の左側腹側被蓋野領域と黒質緻密部領域が視野に収まるよ うに観察し、 Ph o t o g r a b— 2500 (富士フィルム社製） を用いて画像 データをコンピューターに取り込んだ。 次に画像データを印刷し細胞核を確認で きる神経細胞のみを数えることにより、 チロシンヒドロキシラーゼ陽性神経細胞 数を計測した。 また画像データを I PLa bソフト （S c a n a l y t i c s社 製） を用いて解析することによりチロシンヒドロキシラーゼ陽性領域の定量を行 つた。 この目的のために画像中のチロシンヒドロキシラーゼ陽性領域が選択され るよつ!1こ C o l a r s e gme n t a t i o n c omp o n e n t s ¾r R s I n 98— ma xに設定し、 To t a l a r e aと黒質緻密部領域を測 定した。 その結果、 1 702ラインのトランスジエニックマウスの黒質緻密部領 域において、 チロシンヒドロキシラーゼ陽性神経細胞が同週齢、 同性の野生型マ ウスと比べて統計学的に有意に減少していることが確認できた（図 1 1 A、 B)。 産業上の利用可能性
本発明により提供される、 α—シヌクレイン遺伝子を脳の神経細胞で過剰発現 し、 かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較して有 意に減少していることを特徴とするトランジェニック非ヒト哺乳動物は、 パーキ ンソン病モデル動物として、 パーキンソン病の発症機構の解明、 パーキンソン病 の予防剤や治療剤のスクリ一ユングのために有用である。 特に本発明のトランジ エニック非ヒ ト哺乳動物は、 生後 8週齢で脳内ドーパミン量が有意に減少してい るため、 長期間飼育する必要がないという利点を有する。

Claims

請求の範囲
1 . ο;—シヌクレイン遺伝子が導入されており、 脳の神経細胞で該遺伝子を 発現し、 かつ脳の黒質におけるドーパミン産生神経細胞数が野生型動物と比較し て有意に減少していることを特徴とするトランスジエニック非ヒト哺乳動物また はその一部。
2 . α—シヌクレイン遺伝子がヒ ト α—シヌクレイン遺伝子又はその変異体 である、 請求項 1に記載のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物またはその一部。
3 . α—シヌクレイン遺伝子が、 野生型ヒ ト α—シヌクレイン遺伝子のァミ ノ酸配列において 5 3番目のァミノ酸残基である Ala残基が Thr残基に置換して いる変異体である、 請求項 1又は 2に記載のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物 またはその一部。
4 . シヌクレイン遺伝子が、 野生型 α—シヌクレイン遺伝子のアミノ酸 配列の C末端を欠損させた遺伝子である、 請求項 1から 3の何れかに記載のトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
5 . α—シヌクレイン遺伝子をドーパミン産生神経細胞で発現させることが できるプロモーターの制御下に組み込んだ組み換え D Ν Αが導入されている、 請 求項 1から 4の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一 部。
6 . α—シヌクレイン遺伝子をドーパミン産生神経細胞で発現させることが できるプロモーターが、 チロシンヒドロキシラーゼ'のプロモ一ターである、 請求 項 1から 5の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
7 . 若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して有意に減少している、 請求項 1から 6の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその 一部。
8 . 若年齢で脳内ドーパミン量が野生型動物と比較して 8 5 %以下まで減少 している、 請求項 1から 7の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物 またはその一部。
9 . チロシンヒドロキシラーゼの発現量が野生型動物と比較して 8 0 %以下 まで減少している、 請求項 1から 8の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト 哺乳動物またはその一部。
1 0 . 自発運動量が野生型動物と比較して 6 0 %以下まで減少している、 請 求項 1から 9の何れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一 部。
1 1 . 非ヒ ト哺乳動物がマウスである、 請求項 1から 1 0の何れかに記載の トランスジエニック非ヒト哺乳動物またはその一部。
1 2 . 請求項 1カゝら 1 1の何れかに記載の非ヒト哺乳動物またはその一部を 用いることを特徴とする、ドーパミン様作用を有する物質のスクリーニング方法。
1 3 . ドーパミン様作用を有する物質がパーキンソン病の治療剤又は予防剤 である、 請求項 1 2に記載のスクリーニング方法。
1 4 . 請求項 1 2又は 1 3に記載のスクリーニング方法により得られる物質。
1 5 . 請求項 1 2又は 1 3に記載のスクリーニング方法により得られる物質 を有効成分として含有する、 パーキンソン病の治療剤又は予防剤。
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