WO2005038457A1

WO2005038457A1 - 多量体アディポネクチンの分別測定方法

Info

Publication number: WO2005038457A1
Application number: PCT/JP2004/015260
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Ebinuma; Hirokazu Yago; Yuka Akimoto; Osamu Miyazaki; Takashi Kadowaki; Toshimasa Yamauchi; Kazuo Hara
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd; Todai TLO Ltd
Current assignee: Todai TLO Ltd; Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2006-04-15
Also published as: AU2004282754B9; KR20060132571A; JP4677545B2; US8039223B2; EP2071333A2; MXPA06004235A; EP1681566A4; ATE439590T1; US20070042424A1; CA2542824C; JPWO2005038457A1; EP2071333B1; ATE554385T1; DE602004022575D1; EP2071333A3; ES2383259T3; EP1681566A1; US20090291461A1; CN1867828B; AU2004282754A1

Abstract

　生体試料中で種々の多量体を形成して存在しているアディポネクチンを分別して免疫学的に測定する方法の提供、さらに、分別測定することによりアディポネクチンの総量測定のみでは得られない情報を得、疾病とアディポネクチンの関係をより正確に評価する方法を提供する。　測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び／又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法。

Description

明細書

多量体アディポネクチンの分別測定方法

技術分野

[0001] 本発明は、生体試料中に含まれる種々の多量体アディポネクチンを分別して免疫学的に測定する方法に関する。

背景技術

[0002] アディポネクチンは、脂肪細胞カゝら特異的に分泌されるインスリン感受性ホルモンであり、血中に比較的高濃度（5— 10 gZmL)存在している。アディポネクチンの生理的な作用については、本発明者らにより、アディポネクチンの量的な減少力肥満による 2型糖尿病や脂肪萎縮性糖尿病における糖'脂質代謝異常を弓 Iき起こす原因の一つであることが報告され (非特許文献 1)、医学的な利用については、糖代謝異常の診断、特にインスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体の治療効果のモニタリングへの利用（特許文献 1)、肝星細胞の活性化及び増殖の抑制、細胞外マトリックス産生の抑制などの作用を利用した肝繊維化抑制剤 (特許文献 2)が提案されている。

[0003] アディポネクチンは、構造上 Clq (Complement lq)ファミリーに属し、 Clqフアミリーの特徴であるコラーゲン様ドメインを有していることから、 3量体を基本とした多量体を形成して存在してヽることが報告されてヽる（非特許文献 2、 3)。

[0004] アディポネクチンの構造上の相違と生理的作用、活性等との関係に関しては、 Tsa oらが、 NF— κ Bの活性ィ匕作用について、 3量体を超える多量体アディポネクチンにのみ活性が認められ、 3量体やコラーゲン様ドメインが欠落したグロブラー (globular ：球状)ドメインには、活性ィ匕作用が認められな力つたことを報告している。また、 Utp alらは、インスリンやグルコース投与により、高分子画分アディポネクチンのみが有意に低下することや、血糖降下作用は、コラーゲン様ドメインのシスティンをセリンに変換したアディポネクチンや還元処理したアディポネクチンで強く、還元未処理及び gl obular アディポネクチンではほとんど示さな力つたことを報告している（非特許文献 4)。 [0005] し力しながら、これらの報告で検討に使用されたアディポネクチンは、大腸菌等における遺伝子組換えにより発現されたものであり、生体内で分泌されたアディポネクチンの挙動や作用を正確に反映していない可能性が考えられる。また、血中アディポネクチン濃度には性差があることが知られており、女性は男性と比較して有意に高値化して!/、る（非特許文献 5)ことが報告される一方、マウス血清での成績ではあるが、特に高分子画分アディポネクチンの含量が高いことも報告されている（非特許文献 4)。

[0006] このように、アディポネクチンの構造上の相違と生理的作用や、疾病とアディポネクチンとの関係について、アディポネクチンの総量のみの測定によっては得ることができなヽ情報があるため、生体試料中に存在する種々のアディポネクチン多量体を分別して測定することができる方法が要望されていた。

[0007] アディポネクチンを測定する方法としては、測定用の試料を予めドデシル硫酸ナトリゥム (SDS)存在下に煮沸処理した後、免疫学的に測定をする方法が開示 (特許文献 3)されている。この方法は立体構造上隠れている、抗体の認識部位を前記処理により露出させて免疫学的にアディポネクチンの総量を測定しょうとする方法であり、種々の多量体を分別して測定することはできな、。

[0008] また、測定試料中のアディポネクチンを、 SDS変性処理や熱変性処理を行わずに測定する方法 (特許文献 2では天然型の測定と称してヽる）が開示されてヽる (特許文献 2)力分別測定に関する記載はなぐ利用できるものではない。

特許文献 1 :国際公開 WO 03Z016906公報

特許文献 2：特開 2002-363094公報

特許文献 3：特開 2000 - 304748公報

非特許文献 l :Yamauchi T. , et al. , Nat Med. , 7, 941—946, 200 非特許文献 2 : Nakano Y. , et al. , J. Biochem. , 120, 803-812, 1 996

非特許文献 3 :Tsao T-S. , et al. , J. Biol. Chem. , 277, 29359—2 9362, 2002 非特許文献 4:Utpal B. , et al. , J. Biol. Chem. , 278, 9073—908 5, 2003

非特許文献 5 :Yamamoto Y. , et al. , Clin. Sci. , 103, 137—142, 2002

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明は、生体試料中で種々の多量体を形成して存在して、るアディポネクチンを分別して測定する方法を提供することを目的とし、さらに、分別測定することによりアディポネクチンの総量測定のみでは得られな、情報を得、アディポネクチンの生理的作用や、疾病とアディポネクチンとの関係をより正確に評価する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究したところ、血液中のアディポネクチンは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより見積もられる分子量から、 150kDa以上 2 OOkDa以下（主として 160kDa付近）（以下、 LMW— Adと表記する。）、 200kDa超 4 OOkDa未満（主として 260kDa付近）（以下、 MMW— Adと表記する。）及び 400kDa 以上 800kDa以下（主として 450kDa付近）（以下、 HMW— Adと表記する。）で区別できる 3種が存在することを確認し、さらに検討を続けたところ、人血液中から 4種の多量体アディポネクチンの分別精製標品を得ることに成功した。これら 4種は、非変性系のポリアクリルアミド（2-15%)による電気泳動（以降、「PAGE (2— 15%)」のように表記することがある）にて分離可能であり、移動度の大きい側から順に、 ULMW -Ad, LMW— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Adと表記して区別した。これら 4種のうち LMW— Ad、 MMW— Ad、 HMW— Adは前記血清中の 3種のアディポネクチンにそれぞれ対応していた。そして LMW— Adが、 3量体アディポネクチンにアルブミンがジスルフイド結合したものであること、及び、少なくともアディポネクチンに対する抗体とアルブミンに対する抗体を組合わせて使用することで、 LMW— Adを分別測定できることを見出し、又、分子内架橋後の SDS—ポリアクリルアミド（2—15%)による電気泳動（以降、方法にっ、て「SDS— PAGE」と表記することがある）での分子量算出から、 ULMW— Adが、アディポネクチンの 3量体であることを解明し、 MMW— Adは 6 一 9量体程度、 HMW— Adは MMW— Adの 2倍以上の会合体を形成して!/、ることを推測するに至った。

[0011] さらにこれらの知見に基づき、アディポネクチンが含まれる試料に適当なプロテア一ゼを作用させることによって、 HMW— Ad以外のアディポネクチンを消化しうることを見出し、プロテアーゼによる消化処理の後、残った HMW— Adを、抗アディポネクチン抗体を用いて分別測定できることを見出した。

[0012] さらに、試料中の MMW— Ad量を、 ULMW— Ad及び LMW— Adをプロテアーゼ処理し、残存する HMW— Ad量及び MMW— Ad量の合計量を算出し、該合計量からさらに HMW— Ad量を差し引くことで、算出できること、試料中の ULMW— Ad量を、 U LMW— Ad及び LMW— Adをプロテアーゼ処理し、残存する HMW— Ad量及び MM W— Ad量の合計量を算出し、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及び LMW— Ad量を差し引くことで、算出できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

[0013] すなわち、本発明は、多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法を提供するものである。

さらに本発明は、人血中由来多量体アディポネクチンが下記の 4種であり、その内の 1種又は 2種を、プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中のアディポネクチンの測定方法を提供するものである。

(1) ULMW— Ad：人血清又は人血漿力精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（2-15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される 4種のバンドのうち、最も移動度が大きぐさらに、分子内架橋後の SDS— PAGEによる分子量が lOOkDa付近にあるアディポネクチン。

(2) LMW-Ad：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（2-15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される 4種のバンドのうち、 ULMW— Adの次に移動度が大きぐさらに、分子内架橋後の SDS—PAGEによる分子量が 150kDa付近にあり、さらにアルブミンがジスルフイド結合して、るアディポネクチン。

(3) MMW-Ad：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（2-15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される 4種のバンドのうち、 LMW— Adの次に移動度が大きぐさらに、分子内架橋後の SDS— PAGEによる分子量が 250kDa付近にあるアディポネクチン。

(4) HMW-Ad：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（2-15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される 4種のバンドのうち、最も移動度が小さぐさらに、分子内架橋後の SDS— PA GEによる分子量が少なくとも 300kDa以上であるアディポネクチン。

[0014] また本発明は、上記の 4種のアディポネクチンのうちの 1種又は 2種を、プロテア一ゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定し、その結果を基に、疾病又は病態に関する情報を得ることを特徴とする、疾病又は病態の評価方法を提供するものである。

発明の効果

[0015] 本発明によれば、 ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Adを分別して測定できることから、アディポネクチンの生理的作用や、疾病又は病態、特に 2型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患、肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果をより正確に評価することができる。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]実施例 1における多量体アディポネクチンのゲルろ過クロマトグラムである。

[図 2]実施例 1において、 LMW— Ad、 MMW-Ad, HMW— Adをそれぞれ PAGE ( 2— 15%)し、 CBB蛋白染色した、泳動像の図である。

[図 3]実施例 2において、 LMW— Ad、 MMW-Ad, HMW— Adをそれぞれ SDS— P AGE (2-15%) U CBB蛋白染色した、泳動像の図である。

[図 4]実施例 5において、ヒト血清中のアディポネクチンを、ウェスタンブロッテイング法により解析した図である。

[図 5]実施例 6にお、て、 LMW— Ad (アルブミン結合型アディポネクチン）を免疫測定法により測定した結果を示す図である。

[図 6]実施例 3において、ヒト由来 ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW— Ad、 HMW— Adの精製品をそれぞれ PAGE (2— 15%)し、 CBB蛋白染色した、泳動像の図である。

[図 7]実施例 4において、ヒト由来 ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW— Ad、 HMW— Adの精製品をそれぞれ非還元条件で SDS— PAGE (2-15%)し、 CBB蛋白染色した、泳動像の図である。

[図 8]実施例 4において、ヒト由来 ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW— Ad、 HMW— Adの精製品をそれぞれ分子内架橋後、 SDS-PAGE (2-15%) Uウェスタンプロッティング法により解析した図である。

[図 9]実施例 7にお、て、 LMW— Ad (アルブミン結合型アディポネクチン）を免疫測定法により測定した結果を示す図である。

[図 10]実施例 13におけるプロティナーゼ Kの多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。

[図 11]実施例 13におけるプロテアーゼ A「ァマノ」の多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明において使用できる生体試料としては、多量体アディポネクチンを含有するものであれば、すべて対象となり、ヒト、サル、ャギ、ヒッジ、ゥサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳類の動物力得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などが挙げられる。これらのうち、アディポネクチンの生理的作用や、疾病又は病態の正確な評価のための試料としては、血液 (血清、血漿)が好適である。試料の採取方法は、分別測定するという目的を考慮し、試料中に存在するアディポネクチンに影響を与えな、方法であれば使用可能である。例えば、ヒト血液を試料とする場合、評価の目的により、空腹時採血、薬物投与後採血など適宜選択することが好まし、。

[0018] LMW— Adを分別して免疫測定するための方法について説明する。 LMW— Adを認識する抗体により LMW— Adを捕捉、検出する方法である。 [0019] LMW— Adを認識する抗体により LMW— Adを捕捉、検出する方法に使用される抗体は、 LMW— Adが 3量体アディポネクチンとアルブミンとの複合体であることから、当該複合体を認識して捕捉'検出し得るものであれば、特に制限を受けることなく使用できる。このような抗体の好適な例として、アディポネクチンを認識する抗体とアルブミンを認識する抗体の組み合わせ、あるいは、アディポネクチンとアルブミンとの複合体を特異的に認識する抗体が挙げられる。アディポネクチン、アルブミン、アディポネクチンとアルブミンとの複合体をそれぞれ認識するポリクローナル抗体及びモノクロ一ナル抗体は、公知の手法によって適当な動物に免疫して得ることができる。これらの抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗ヒトアディポネクチン抗体としては、 Goat a human Acrp30 antibody (コスモバイオ社、 GT社)、 rabbit a hu adiponectin— PoAb (コスモノィォ社、 chemicon社)、 h u Acrp30— MoAb (藤沢薬品工業社、 BD社）、 Mouse a hu Adiponectin Mo Ab (コスモバイオ社、 chemicon社）、抗ヒト ACRP30モノクローナル抗体 (AX773、 AX741、 Ne, Na、和光純薬工業社)などが挙げられる。抗ヒトアルブミン抗体としては、 Goat a Albumin, human antibody (コスモバイオ社、 BET、 ACD、 BMD)、 Mouse a Albumin, human antibody (コスモバイオ社、 NBT、 ZYM、 MED)、 R abbit Albumin, human antibody (コスモノィォ社、 CL、 ACM)、 Goat Alb umin, human antibody (フナコシ社、 ANT)などが挙げられる。

[0020] 本発明の具体的な免疫学的測定方法としては、 ELISA (酵素免疫測定法)、 CLEI A (化学発光酵素免疫測定法）、 RIA (ラジオィムノアツセィ）、 LTIA (ラテックス免疫比濁法)などの公知の方法を使用することができる。 ELISAの場合、例えば、アディポネクチンを認識する抗体を結合させた不溶性担体とアルブミンを認識する抗体を酵素標識抗体として組み合せる方法、アディポネクチンとアルブミンの複合体を認識する抗体を結合させた不溶性担体によりアディポネクチンとアルブミンの複合体を捕捉し、アディポネクチンを認識する抗体ある、はアルブミンを認識する抗体を酵素標識抗体として組み合せる方法が挙げられる。測定工程に従ってさらに説明する。アディポネクチンを認識する抗体を結合させた不溶性担体と、アディポネクチンとアルブミンの複合体を含む試料を接触、混合させ、前記不溶性担体にアディポネクチンとァルブミンの複合体を捕捉する。次いで、酵素標識したアルブミンを認識する抗体を接触、混合することにより、不溶性担体アディポネクチンとアルブミンの複合体酵素標識抗体の三元複合体が形成される。この後、標識抗体中の酵素と適当な該酵素の基質を反応させ、その結果生じる反応生成物に由来する吸光度変化を光学的に測定することでアディポネクチンとアルブミンの複合体を定性的または定量的に測定する。 LTIAの場合、アディポネクチンとアルブミンの複合体に特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体とアディポネクチンとアルブミンの複合体とを混合することによりアディポネクチンとアルブミンの複合体を介した不溶性担体の架橋 (凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンとアルブミンの複合体を定性的または定量的に測定することができる。 LTIAは、アディポネクチンとァルブミンの複合体を簡便、迅速かつ正確に測定するには好適である。

[0021] 本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用されェ業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。 ELISAにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン等の 9 6穴のマイクロプレート、 LTIAにおいてはポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい

[0022] 上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持 (感作)方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。

[0023] 抗体を担持させた抗体不溶性担体及び Z又は酵素標識抗体とアディポネクチンとアルブミンの複合体との反応は、抗原抗体反応が起こりえる条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、アディポネクチンとアルブミンの複合体との抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、 pHを制御するためのリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝成分、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩ィ匕ナトリウムなど、安定化剤としてのゥシ血清アルブミン (BSA)、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、酵素の阻害剤等の添加剤を適宜溶解させても良い。

[0024] ELISAにおける酵素標識抗体は、公知の方法によって調製することができる。例えば、石川らの方法 (マレイミド法：「酵素免疫測定法第 3版医学書院」）等に従い、抗体をそのまま、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解して F (ab' )又は Fab'とした後、酵素で標識することができる。標識に使用する酵素として

2

はペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 j8— D—ガラタトシダーゼ、ダルコ一スォキシダーゼなどが挙げられる。さらに、酵素活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸ィ匕水素を用い、発色剤として o フエ-レンジァミン、 3, 3' , 5, 5'—テトラメチルベンチジン、 2, 2，一アジノジー（3 ェチルベンズチアゾリンスルホン酸）アンモ-ゥム塩等を用いることができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質としてトロフエ-ルフォスフェート等を、酵素に j8— D ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質として j8— D ガラクトピラノシド等を、酵素にグルコースォキシダーゼを用いる場合は、ペルォキシダーゼの共存下で、グルコースォキシダーゼの基質として j8 D グルコース、発色剤として酵素がペルォキシダーゼである場合に使用した発色剤等を用いることができる。

[0025] ELISAにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素がペルォキシダーゼ、基質が過酸化水素、発色剤が o フエ二レンジァミンの場合、酵素反応生成物固有の波長、 492 nmにおける吸光度として 96穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である

[0026] LTIAにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度程度と測定試料の濁度程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法 (凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法 (凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法 (凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。

[0027] HMW— Adを分別して免疫測定するための方法について説明する。アディポネクチンが含まれる試料に適当なプロテアーゼを作用させ、 HMW— Ad以外のアディポネクチンを消化し、プロテアーゼによる消化処理の後、残った HMW— Adを、抗アディポネクチン抗体を用いて測定する。 HMW— Adを分別測定するのに使用されるプロテアーゼとしては、 HMW— Adを消化せず、それ以外のアディポネクチンを消化するものであればいずれも制限することなく使用することができる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、トリチラチゥム（Tritirachium)属由来のプロティナ一ゼ1^、ァスペルギルス属、バチルス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用される。ァスペルギルス属由来のプロテアーゼの巿販品の例として、プロテアーゼ P「ァマノ」、プロテアーゼ A「ァマノ」、ゥマミザィム (V、ずれもアマノエンザィム社)、スミチーム MP、スミチーム FP (新日本化学工業社）などが挙げられ、バチルス属由来のプロテアーゼの巿販品の例としては、プロテア一ゼ N「ァマノ」（アマノエンザィム社）、プロチン PC (大和化成社)などが挙げられる。これらのプロテアーゼは遺伝子組換え技術により得られたものであっても差し支えない

。またィ匕学修飾を施されていてもよい。プロテアーゼ処理の条件は、用いるプロテアーゼによって異なる力リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、 4一 60°Cで 5分一 24時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、プロテア一ゼの比活性、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね 0. 01— lOOuZmLあるいは 0. 0 1一 lOOmgZmLの範囲で使用される。

[0028] 生体試料をこれらのプロテアーゼで処理し、残存する HMW— Adを測定するための抗体としてはアディポネクチンを認識する抗体を使用することができる。抗アディポネクチンポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、公知の手法によって適当な動物に免疫し得ることができるが、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗ヒトアディポネクチン抗体は、 Goat a human Acrp30 antib ody (コスモバイオ社、 GT社）、 rabbit a hu adiponectin— PoAb (コスモバイオ社、 chemicon社）、 hu Acrp30 - MoAb (藤沢薬品工業社、 BD社）、 Mouse a hu A diponectin MoAb (コスモバイオ社、 chemicon社）、抗ヒト ACRP30モノクローナル抗体 (AX773、 AX741、 Ne, Na、和光純薬工業社）などが挙げられる。また、巿販のアディポネクチン総量を測定するキットも使用することが出来、例えば、「ヒトアディポネクチン ELISAキット」（大塚製薬社)等が挙げられる。さら〖こ、生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加えてァディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法 (特願 2003— 354715を優先権主張してなされた国際出願)も利用できる。

[0029] MMW— Adを分別して免疫測定するための方法について説明する。 MMW-Ad は、 ULMW— Ad及び LMW— Adを特異的に消化するプロテアーゼを作用させ、消化されずに残存する MMW— Ad及び HMW— Adの総量を求め、その総量から HM W— Ad量を差し引くことで算出することが可能である。この方法で使用されるプロテアーゼとしては、 ULMW— Ad及び LMW— Adのみを特異的に消化できるものであればいずれも制限することなく使用することができる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、バチルス属、ァスペルギルス属、スタフイロコッカス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用され、例えば、プロテアーゼ S「ァマノ」、プロテアーゼ A「ァマノ」（いずれもアマノエンザィム社）、スミチーム FP、スミチーム LP50D (新日本化学工業社）、プロテアーゼ V8 (生化学工業社)などの市販されているものも利用できる。これらのプロテアーゼは、遺伝子組換え技術により得られたものでもよい。またィ匕学修飾を施したものでもよい。残存する MM W— Ad及び HMW— Adの総量は、市販のアディポネクチン総量を測定するキット等を使用することで求められる。差し引く HMW— Ad含量は、上記に挙げた方法により測定できる。

[0030] 生体試料のプロテアーゼ処理方法は、用いるプロテアーゼによって異なる力リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、 4一 60°Cで 5分一 24時間行うことが好ましい。プロテァーゼの使用濃度は、プロテア一ゼの比活性、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね 0. 01— lOOuZmLあるいは 0. 01— lOOmgZmLの範囲で使用される。免疫測定法は、前述した LMW— Adを分別測定する方法についての記載を参考に、 ELISAや LTIAが実施できる。

[0031] さらにまた、 ULMW— Ad、 LMW— Ad及び MMW— Adの総量を、 HMW— Adの分別測定方法の項において述べたプロテアーゼを用いて、変換物の総量として算出し、この量から、先に述べた ULMW— Ad、 LMW— Adを特異的に消化できるプロテアーゼを作用させ、変換物の総量として算出される量を差し引くことで、 MMW— Adの量を算出することも可能である。免疫測定法は、前述した LMW— Adあるいは HMW Adを分別測定する方法にっ、ての記載を参考に、 ELISAや LTIAが実施できる。

[0032] ULMW— Adを分別して免疫測定するための方法について説明する。 ULMW— A dは、アディポネクチン総量から、前記で測定した LMW— Ad、 MMW— Ad及び HM W— Adの合計量を差し引くことにより算出できる。具体例としは、 ULMW— Ad及び L MW— Adを特異的に消化するプロテアーゼを作用させ、消化されずに残存する MM W— Ad及び HMW— Adの合計量を求め、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及び LMW— Ad量を差し引くことで算出することが可能である。

[0033] 本発明によれば、ヒト血液中に存在する 4種のヒトアディポネクチンが各々分別して測定できる。その結果、 2型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患、肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果が評価可能となる。評価の方法としては、 ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Adのうちの 1種以上の量の変動あるいは ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW— Ad、 HMW— Ad 及びアディポネクチン総量のうち少なくとも 2つの量の比を基準値を設けて観察する方法、同一個体における経時的な変動を観察する方法が挙げられる。さらに特定の疾病や病態において公知の他の指標（例えば、 2型糖尿病におけるインスリン、動脈硬化性疾患における HDLコレステロールなど）と ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MMW Ad及び HMW— Adのうちの 1種以上の量、あるいは ULMW— Ad、 LMW— Ad、 M MW— Ad、 HMW— Ad及びアディポネクチン総量のうち少なくとも 2つの量の比を関連付けることにより評価を行う方法も挙げることができる。

実施例

[0034] 次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

[0035] く試薬及び材料〉

実施例及び参考例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。

a.抗体結合榭脂用洗浄液： 0. 5M NaCl を含む 0. 1M NaHCO— NaOH (p

3

H8. 3)。

b.抗体結合榭脂用溶出液: 0. 1M Glycine— HCl (pH2. 5)。

c.抗体結合榭脂用中和液： 2M Tris— HCl(pH8. 0)。

d. ELISA用プレート： 96穴マイクロプレート（NUNC社)。

e. ELISA用抗体感作溶液: PBS (pH7. 4)。

f. ELISA用緩衝液： 1% ゥシ血清アルブミン、 0. 1% Tween 20 を含む PBS (pH7. 4)。

g. Vector ABC kit (Mouse)：フナコシ社、 Cat No. PK— 6102。

h. DAB基質キット（ウェスタンブロティング発色基質）：フナコシ社、 Cat No. SK— 4100。

i.抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体 (hu Acrp30— MoAb)：藤沢薬品ェ業社、 BD Transduction Laboratories社、商品コード A12820。

j.ャギ抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体（Goat a human Acrp30 anti body)：コスモノくィォ社、 GT社、 Cat No. 421065。

k.ャギ抗マウス IgG HRP標識抗体：コスモバイオ社、 capple社。

1. ELISA用洗浄液： 0. 05% Tween20 を含む PBS

m. ELISA用緩衝液 2 : 1% BSA, 0. 05% Tween20を含む PBS。

n.ャギ抗ヒトアルブミンポリクローナル HRP標識抗体 (HRP— Gt抗 HSA抗体）： P

ARIS社。

o . HRP-Avidin： PIERCE社。

[0036] 参考例 1. 大腸菌リコンビナントマウスグロブラーアディポネクチン (rMgAd)の調製

マウスアディポネクチンの遺伝子配列（NCBI accession # U37222)のグロブラードメイン配列（ 104—247残基相当）を 6 X Hisタグを含む pQE30ベクターの Bam HI、 Hindlllに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナントマウスグロブラーアディポネクチン (rMgAd)を発現した大腸菌力もの rMgAdの精製は、以下の操作により行った。すなわち、大腸菌の可溶画分を Ni— NTAァガロース（QIAGEN社）に 4°C、 16時間添加して rMgAdを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、ァディポネクチンを含む画分を回収し、 3日間 PBS (pH7. 4)で透析を行なった。得られた rMgAdの蛋白質濃度は、 Bio— Rad DC protein assay kit を用いて求めた。

[0037] 参考例 2. 抗 rMgAd抗体の作製

参考例 1で調製した rMgAdの 50 μ gを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、 2匹のゥサギに 2週間おきに 6回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体 (igG)の精製は、 Protein A榭脂を用いて常法により行なった (抗 rMgAd 抗体)。

[0038] 参考例 3. ヒト血中由来多量体アディポネクチン (mAd)の精製

参考例 2で作製した抗 rMgAd抗体 500mgを CNBr~activated Sepharose 4B (Amersham Bioscience社) 50mLに結合させ抗体結合 Sepharose 4 B榭脂を作製した。ヒト血清 2. 5Lを抗 rMgAd抗体結合 Sepharose 4B樹脂に添カロし、抗体結合榭脂用洗浄液で十分量洗浄した後、抗体結合榭脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン画分 (mAd)を溶出し、溶出画分に抗体結合榭脂用中和液を 1Z1 0量添カ卩して中和した。さらに、中和した溶出画分を、 Protein A榭脂に添カ卩し、 Pr otein A榭脂への非吸着画分を精製 mAdとして回収し、「ヒトアディポネクチン ELIS Aキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。

[0039] 参考例 4. 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の作製

参考例 3で得た精製 mAd 20 μ gを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、 2匹のマウスに 2週間おきに 3又は 4回免疫を行った後、さらに細胞融合 3日前に再投与した。免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、 P3U1ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、 ELISA法により mAdとの反応性の高ぃゥエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体 (IgG)の精製は、 Protein A榭脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号; 64401— 64411で識別される 11の抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。

[0040] 実施例 1 ヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別精製（1)

参考例 3で得た精製 mAdを、 20mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)にて透析して脱塩した後、これを Gelatin— Cellulofine (生化学工業社)カラムに吸着させ、 0、 100、 20 0、 300及び 500mMの NaClをそれぞれ含む 20mMジン酸緩衝液（pH7. 0)にて、段階的に溶出させた。得られた各 NaCl濃度の溶出画分中には、分子量の異なるァディポネクチンが混在していた。得られた各溶出画分を濃縮し、それぞれの溶出画分【こつ、て Sephacryl S— 300 (分画分子量； 10一 1500kDa、平均粒子径 47 m 、 Amersham Bioscience社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーをさらに実施した。溶離液には、 150mMの NaClを含む 20mM リン酸緩衝液 (pH7. 0)を使用した。 Sephacryl S— 300カラムの分子量較正は Gel filtration calibration Kit (A mersham Bioscience社）を用いて行った。各クロマトグラフィーにおけるアディポネクチンの検出は、「ヒトアディポネクチン ELISAキット」（大塚製薬社）により行った。

[0041] ゲルろ過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図 1に示した。得られた溶出フラクションを、 150kDa以上 200kDa以下（主として 160kDa付近;)、 200kDa超 400kDa未満（主として 260kDa付近）、 400kDa以上 800kDa以下（主として 450kDa付近）の 3画分に区別して収集し、多量体アディポネクチン分別精製品とした。なお、各多量体アディポネクチン分別精製品は、 150kDa以上 200kDa以下（主として 160kDa付近）のものを LMW Ad、 200kDa超 400kDa未満（主として 260kDa付近）のものを MMW Ad、 400kDa以上 800kDa以下（主として 450kDa付近）のものを HMW— Adと呼ぶこととした。

[0042] 前工程で得られた 3種の多量体アディポネクチン分別精製品、 LMW— Ad、 MMW

Ad及び HMW— Adそれぞれを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ポリアクリルアミド濃度 2-15%) (以下、 PAGE (2-15%)のように表記する）にて分離し、 CBB (クマシ一ブリリアントブルー）による蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図 2に示した。

[0043] LMW— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Adのいずれについても主たる染色バンド以外のバンドが認められた力主たる染色バンドに対して検出の程度は僅かであり、分別、精製が達成されていることが確認された。なお、前述したとおりアディポネクチンは、 3量体を基本として多量体を形成しているため、 LMW— Ad、 MMW— Ad、 HM

W— Adの!、ずれにつ、ても、 PAGEで見積もられる分子量とゲルろ過での分子量は必ずしも一致していない。

[0044] 実施例 2 ヒト血中由来の多量体アディポネクチン（LMW— Ad、 MMW— Ad、 HMW

Ad)の構造解析

1) SDS— PAGEによる解析

実施例 1で得られた多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件で SDS— P

AGE (2-15%)にて分離し、 CBB蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図 3に示した。

[0045] LMW Ad、 MMW Ad、 HMW Adとも〖こ 60kDa付近〖こ、明確な染色バンドが認められた。当該染色バンドは、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、 2量体のアディポネクチンと推定された。 LMW Adについては、前記 60kDa 以外に、 90kDa付近に、未同定の明確な染色バンドが認められた。

[0046] 2) SDS— PAGE (2— 15%)で 90kDa付近に泳動される未同定アディポネクチンの分析

前記 1)で検出された 90kDa付近の未同定染色バンドのゲルを切り出し、エレクト口エリユーター Model422 (バイオラッド社)を用いて蛋白を抽出した。抽出された蛋白を 2—メルカプトエタノールを含む処理液により煮沸、還元処理し、再度 SDS— PAGE (2-15%)にて分離後、 PVDF膜へ転写し、 CBB蛋白染色を行なったところ、 60kD a付近と 30kDa付近に 2本の染色バンドが確認された。

[0047] 前記 60kDa付近及び 30kDaのバンド中の蛋白それぞれについて、 N末端アミノ酸配列を分析したところ、 60kDa付近のバンド中の蛋白の N末端アミノ酸配列は、ヒトァルブミンの N末端アミノ酸配列と一致した。一方、 30kDa付近のバンド中の蛋白の N 末端アミノ酸配列は、アディポネクチンのアミノ酸配列の 19番目力もの配列と一致した。

[0048] 以上の事実より、 LMW— Adを SDS— PAGE (2—15%)した際に検出される 90kDa 付近の蛋白は、アルブミン 1分子とアディポネクチン 1分子がジスルフイド結合したへテロダイマーであることが判明した。従って、 LMW— Ad画分のアディポネクチンの構造は、 3量体アディポネクチンとアルブミンがジスルフイド結合した構造を有して、ることが判明した。

[0049] 実施例 3 ヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別精製（2)

参考例 3の方法に準じて、再度調製された精製 mAdを、 20mM リン酸緩衝液 (p H7. 0)にて透析して脱塩した後、これを Gelatin— Cellulofine (生化学工業社)カラムに吸着させ、 0、 100、 200及び 500mMの NaClをそれぞれ含む 20mM リン酸緩衝液 (PH7. 0)にて、段階的に溶出させた。得られた lOOmM NaCl溶出画分には、 ULMW— Ad、 LMW— Ad及び MMW— Adが混在し、 200mM NaCl溶出画分には、 MMW— Ad及び HMW— Adが混在したが、 500mM NaCl画分は、 HMW— Adのみであったことから、 500mM NaCl溶出画分を、 HMW— Ad分別精製品とした。次に、上記参考例 3の方法に準じて、 Goat a human ALB antibody結合 Se pharose4B榭脂を作製後、 lOOmM NaCl溶出画分を添加し、非吸着画分及び吸着画分を得た。非吸着画分には、 ULMW - Ad及び MMW - Adが混在していたが、吸着画分には LMW— Adのみであったことから、これを LMW— Ad分別精製品とした。さらに、非吸着画分を濃縮し、 Sephacryl S— 300 (分画分子量； 10— 1500kDa 、平均粒子径 47 μ m、 Amersham Bioscience社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー〖こより、 ULMW— Ad及び MMW— Adを分離した。得られたそれぞれの画分を、 ULMW— Ad分別精製標品及び MMW— Ad分別精製品とした。

実施例 1の分別精製で得られた情報を基に、さらに分別精製条件を改良した結果、この方法では、 LMW— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Adの 3種以外に、もう 1種（U LMW— Adとした)新たに分離された。

[0050] 前工程で得られた 4種の多量体アディポネクチン分別精製品、 ULMW— Ad、 LM W— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Adそれぞれを、非変性条件下、 PAGE (2— 15% )にて分離し、 CBB蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図 6に示した。 [0051] 実施例 4 ヒト血中由来の多量体アディポネクチン（ULMW— Ad、 LMW— Ad、 MM W— Ad、 HMW-Ad)の構造解析

1) SDS— PAGEによる解析

実施例 3で得られた各多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件で SDS -PAGE (2-15%)にて分離し、 CBB蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図 7 に示した。

[0052] ULMW-Ad, LMW—Ad、 MMW—Ad、 HMW—Adともに 60kDa付近に、明確な染色バンドが認められた。当該染色バンドは、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、 2量体のアディポネクチンと推定された。 LMW— Adについては、前記 60kDa以外に、 90kDa付近に、未同定の明確な染色バンドが認められた。又、 ULMW— Adについては、 2量体以外に 1量体の染色バンドが認められたことから、 3量体と推測された。尚、図 7の泳動像から、 LMW— Adの染色バンドが 2本確認される力共にアルブミンが結合したアディポネクチンであることを確認して、る。

[0053] 2)分子内架橋による分子量の推定

実施例 3で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH8. 0)にて、 5— ΙΟ /z gZmL程度に希釈し、別に架橋剤である Bis (sulfosuc cinimidyl) suberate (商品名 BS³： PIERCE社製）を 20mgZmLとなるように精製水で希釈した液と、等量混合後、室温にて 30分間放置した。さらに、 lOOmMトリス塩酸緩衝液 (PH8. 0)を混合液に等量添加し、室温で 15分間放置した。これらの各処理液を非還元条件で SDS— PAGE (2— 15%)にて分離し、セミドライブロッテイングにより PVDF膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を 5% スキムミルク及び 0. 1% NaNを含む PBSでブロッキング後、 0. 1% Tween 20を含む PB

3

Sで洗浄し、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（hu Acrp30— MoAb) 1 μ _& ZmLを室温で 1時間反応させた。 0. 1% Tween 20を含む PBSで十分に洗浄した後、 Vector ABC kit (Mouse) 及び DAB基質キットを用いて発色させた。

[0054] その結果を図 8に示した。分子量マーカーより分子量較正した結果、 ULMW— Ad は、約 lOOkDa付近に染色バンドが認められ、報告されているアディポネクチンの構造及び分子量から、 3量体であることが確認された。 LMW— Adは、約 150kDa付近に染色バンドが認められ、上記で得られたアルブミンが結合した 3量体であることが、分子量からも確認された。 MMW— Adは、 250kDa付近に染色バンドが認められ、 6 又は 9量体を形成しているものと推測された。 HMW— Adは、非常に高分子位置に染色バンドが確認され、かなり分子量が大きぐ少なくとも、 300kDa以上はあるものと推測され、 12量体又は 18量体程度と推定されるが、正確な形態は不明である。

[0055] 実施例 5 ヒト血清中のアディポネクチンのウェスタンブロッテイング解析

健常者 8名の血清 0. 分を、 PAGE (2— 15%)にて分離し、セミドライブロッテイングにより PVDF膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を 5%スキムミルク及び 0. l %NaNを含む PBS液（pH7. 4)でブロッキング後、 0. l %Tween20

3

を含む PBS液（pH7. 4)で洗浄し、抗アディポネクチンモノクローナル抗体（hu A crp30— MoAb ;藤沢薬品工業社、 BD Transduction Laboratories社） 1 gZ mLを室温で 1時間反応させた。 0. l %Tween20を含む PBS液 (pH7. 4)で十分に洗浄した後、 Vector ABC kit (Mouse) 及び DAB基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。

[0056] 実施例 1で調製した LMW— Ad、 MMW— Ad及び HMW— Ad画分と同 Cf立置にメインバンドとして発色を認めたことから、この 3種のアディポネクチンが血中に存在する主なものであることが判明した（図 4)。

又、 ULMW— Adについては、存在量が少ない為か不明である力ほとんど染色バンドが認められなかった（図 4)。

[0057] 実施例 6 アルブミン結合型アディポネクチンの測定（1)

ELISA用プレートにャギ抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体（Goat a huma n Acrp30 antibody)を ELISA用抗体感作溶液で 1 μ gZmLに希釈した後、感作した。 ELISA用緩衝液でブロッキング後、実施例 1で調製した LMW— Adを ELIS A用緩衝液で 1、0. 1、0. 01 /z gZmL (Ad含量として）の濃度に希釈し室温で 1時間反応させた。 ELISA用緩衝液でプレートを洗浄後、 ELISA用緩衝液で 1Z2000 倍希釈した抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体 (特開 2001— 337092)液を室温で 1時間反応させた後、 ELISA用緩衝液でプレートを洗浄、 ELISA用緩衝液で 1Z1 000倍希釈したャギ抗マウス（Goat α mouse) IgG HRP標識抗体液を室温で 1 時間反応させた。 ELISA用緩衝液でプレートを洗浄後、 TMB (テトラメチルベンチジン）と過酸ィ匕水素の基質を用いた HRPの酵素反応により発色させ、 2N硫酸を添加して反応を停止させた後、 450nmの吸収を測定した。測定結果を図 5に示す。

[0058] 濃度依存的な吸光度の増加が観察され、サンドイッチ免疫測定法が成立したことより、 LMW— Adは、アディポネクチンにアルブミンが結合したもの（アルブミン結合型ァディポネクチン)であることがわ力つた。また、本実施例の方法により LMW— Adを分別測定できることもわ力つた。

[0059] 実施例 7 アルブミン結合型アディポネクチンの測定（2)

(1)希釈直線性

ELISA用プレートに、 ELISA用抗体感作溶液で 5 /z gZmLに希釈した抗アディポネクチンモノクローナル抗体（64402)を、感作した。次に、 20%ャギ血清を含む ELI SA用緩衝液でブロッキング後、実施例 3で調製した LMW— Ad精製品を ELISA用緩衝液で 0— 20ngZmL (Ad含量として）の濃度範囲に希釈し、に希釈し室温で 1時間反応させた。 ELISA用洗浄液でプレートを洗浄後、 ELISA用緩衝液で 1000倍希釈した HRP標識ャギ抗ヒトアルブミン (HRP— Gt抗 HSA)抗体液を室温で 1時間反応させた後、 ELISA用洗浄液でプレートを洗浄し、 OPD発色液（2mgZmL ォルトフヱ-レンジァミン塩酸塩、 0. 02% 過酸化水素を含む、 250mMクェン酸緩衝液、 pH5. 0)により発色させ、停止液（1. 5N 硫酸、 ImM EDTA— 2Na)を添カロして反応を停止させた後、 492nmの吸収を測定した。測定結果を図 9に示す。

[0060] 濃度依存的な吸光度の増加が観察され、サンドイッチ免疫測定法が成立したことより、 LMW— Adは、アディポネクチンにアルブミンが結合したもの（アルブミン結合型ァディポネクチン)であることが再度確認された。

[0061] (2)添加回収試験

人血清を、 ELISA用緩衝液 2で 100— 800倍希釈したものに、実施例 3で調製した LMW— Ad精製品を 0— 50ngZmLの濃度範囲で添カ卩し、前記（1)と同様の ELI S A系にて測定後、添加量と実測値からの回収率を求めた。その結果を表 1に示す。

[0062] [表 1]

[0063] いずれの場合も、良好な回収率が得られ、本実施例の方法により LMW— Adを分別測定できることもわ力つた。

[0064] 実施例 8 プロテアーゼ処理（1)

50mMリン酸緩衝液 (pH8. 0)に、参考例 3で得た精製 mAd及び各種巿販プロテァーゼを添カ卩し、 37°Cで 60分間加温した。その処理液を PAGE (2—15%)にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分への作用を、 CBB蛋白染色像にて比較した (表 2)。

[0065] 処理条件 1一 2に使用のプロテアーゼ処理では、 LMW— Ad画分は消失するが、 M MW— Ad及び HMW— Adは残存することが確認された。さらに、明確な変換物は確認されなかった。一方、処理条件 3— 4に使用のプロテアーゼ処理では、 LMW-Ad は消失し、 MMW— Ad画分及び HMW— Adは残存することが確認され、さらに、低分子量領域に LMW— Ad由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。さらに、処理条件 5— 6に使用のプロテアーゼ処理では、 LMW— Ad及び MMW Ad画分は消失し、 HMW— Adは残存することが確認され、さらに、低分子量領域に LMW— Ad由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。これら変換物の PAGE (2—15%)での染色バンドの検出位置は、用いるプロテアーゼにより、若干異なる場合があるものの、 30— 42kDaの範囲で検出された。この結果より、処理条件 1及び 2での処理により、 MMW - Ad及び HMW - Adの総量、処理条件 3及び 4 での処理により、 LMW— Adのみ又は MMW— Ad及び HMW— Adの総量、処理条件 5及び 6での処理により、 HMW— Adのみ又は MMW— Ad及び HMW— Adの総量を測定可能となることがわ力つた

[0066] [表 2]

(-） =消失（+) =不変又は変換物の生成を示す。

[0067] 実施例 9 プロテアーゼ処理（2)

50mM リン酸緩衝液 (pH8. 0)に、実施例 3で解析された精製 mAd及び各種巿販プロテアーゼを lmgZmLとなるように添カ卩し、 37°Cで 30分間加温した。その処理液を PAGE (2— 15%)にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分へのプロテアーゼの作用を、 CBB蛋白染色像にて比較した (表 3)。

[0068] 処理条件 7— 9に使用のプロテアーゼ処理では、 ULMW— Ad及び LMW— Ad画分は消失する力 MMW— Ad及び HMW— Adは残存することが確認された。さらに、低分子量領域に ULMW— Ad及び LMW— Ad由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。さらに、処理条件 10— 12に使用のプロテアーゼ処理では、 ULMW— Ad及び LMW— Ad及び MMW— Ad画分は消失し、 HMW— Adは残存することが確認され、さら〖こ、低分子量領域に ULMW— Ad、 LMW— Ad及び MMW— Ad由来の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。これら変換物の PA GE (2— 15%)での染色バンドの検出位置は、用いるプロテアーゼにより、若干異なる場合があるものの、 30— 40kDa付近で検出された。この結果より、処理条件 7— 9 で使用のプロテアーゼを用いることにより、残存する MMW— Ad及び HMW— Adの総量若しくは、新たに生成する Ad変換生成物を測定することにより、 ULMW— Ad及び LMW— Adの総量の分別測定が可能となることがわかった。又、処理条件 10— 12 で使用のプロテアーゼを用いることにより、残存する HMW— Ad量、若しくは ULMW -Ad, LMW— Ad及び MMW— Adの総量も分別測定が可能である。

[0069] [表 3] 処理条件 7 8 9 1 0 1 1 1 2

テア Ηζ' スミチムフ lテアフ⁰ α フ P

テアスミチム FP フ ¾テ仃セ

ΑΙ マノ」 L P50D P 」 Nf マ多重 _体ァィポ HIVI Ad ++ ++ ++ ++ ++ ++

++ ++ ++

LMW-Ad

ULMW-Ad

変換物 +++ +++

(+) =減少 (++) =不変（+++) =増加又は変換物の生成を示す。

(-) =消失又は変換物の未生成を示す。

[0070] 実施例 10 HMW— Adの測定用のプロテアーゼ処理

参考例 3で得られた、抗体結合榭脂非吸着画分 (以下、「Ad除去血漿」という）に、実施例 3で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で 10 gZ mL程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、 50mM トリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)に、プロティナーゼ Kを 5— 10u/mLとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料 10 Lに前処理用酵素液 90 Lを加え、 37°Cで 10 30分間反応させた後、 lOOmM クェン酸緩衝液 (pH3. 0 2% SDS含有）を 4 00 μ Lカ卩え、酵素反応 (前処理)を停止させた。この反応液 20 μ Lに、 ELISA用緩衝液 2を 1. OmL添カ卩して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用 ELISA系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。

[0071] 実施例 11 MMW— Ad及び HMW— Ad合計量測定用のプロテアーゼ処理

実施例 10と同様に、 Ad除去血漿に、実施例 3で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で 10 gZmL程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、 50 mM トリス塩酸緩衝液 (pH8. 0)に、プロテアーゼ A「ァマノ」を 0 . 6-1. OmgZmLとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料 10 Lに前処理用酵素液 90 Lを加え、 37°Cで 10— 30分間反応させた後、 10 OmM クェン酸緩衝液 (pH3. 0 2% SDS含有）を 400 L加え、酵素反応（前処理）を停止させた。この反応液 20 しに、 ELISA用緩衝液 2を 1. OmL添カ卩して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用 ELISA系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。

[0072] 実施例 12 アディポネクチン総量測定用試料の調製生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加え、アディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法 (特願 2003— 3547 15を優先権主張してなされた国際出願)から、酸と界面活性剤で前処理する方法を使用した。すなわち、人血漿又は人血清 10 しに、 lOOmM クェン酸緩衝液 (pH3 . 0、 2%SDS含有）を 490 /z L加え十分に攪拌し、当該混液 Lに、 ELISA用緩衝液 2を 1. OmL添カ卩して希釈し、前処理済み試料として。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用 ELISA系にて、アディポネクチン総量を算出した。

[0073] 実施例 13 アディポネクチン測定用 ELISA系

ELISA用プレートに PBSで 5 μ gZmLに希釈した抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体 (64405)を感作した。次に、 ELISA用緩衝液 2でブロッキング後、実施例 10又は 11で調製された各前処理済み試料を添加し、室温で 1時間反応させた。 E LISA用洗浄液でプレートを洗浄後、 ELISA用緩衝液 2で 2000倍希釈した Biotin 標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（64404)を室温で 1時間反応させた後、さらに、 ELISA用緩衝液 2で 2000倍希釈した HRP— Avidinを添カ卩し、室温で 3 0分間反応させた。 ELISA用洗浄液でプレートを洗浄し、 OPD発色液（2mgZmL オルトフヱ-レンジァミン塩酸塩、 0. 02%過酸化水素を含む、 250mMクェン酸緩衝液、 pH5. 0)により発色させ、停止液（1. 5N硫酸、 ImM EDTA— 2Na)を添カロして反応を停止させた後、 492nmの吸収を測定した。前処理用酵素液 90 Lと 100 mM クェン酸緩衝液 (pH3. 0、 2% SDS含有) 400 Lの混液に検討用試料 10 μ Lをカ卩えたものを標準試料として同様に ELISA測定を行い、得られた発色値を 10 0%として、実施例 10及び 11の各検討試料の発色値を％換算した。換算された％発色値を各条件毎に平均し、実施例 10の試料について図 10、実施例 11の試料について図 11に示した。

[0074] 図 10の結果から、プロティナーゼ Kによるプロテアーゼ処理により、血漿中の HM W— Ad以外の多量体 Adが消化され、 HMW— Adが特異的に測定できることが判明した。又、図 11の結果から、プロテアーゼ A「ァマノ」によるプロテアーゼ処理により、血漿中の MMW— Ad及び HMW— Ad以外の多量体 Adが消化され、 MMW— Ad及び HMW— Adの合計量が特異的に測定できることが判明した。 MMW— Adの濃度については、 MMW— Ad及び HMW— Adの合計量から、 HMW— Adの濃度を差し引くことで、算出することが可能である。

[0075] 以上の事実より、実施例 12の前処理を行ったのち試料中のアディポネクチン総量を測定し、実施例 6又は 7の方法で求められる LMW - Ad濃度及び実施例 11及び 1 3の方法で求められる MMW— Ad及び HMW— Adの合計量を、アディポネクチン総量力差し引くことにより、 ULMW— Ad濃度も算出することが可能であることも分かる。これらのことから、人血中に存在する 4種の多量体 Adの総量及び分別測定は、可能となった。

[0076] 実施例 14 動脈硬化性疾患との関係

インスリン治療を行っていない 2型糖尿病患者 298名中、冠動脈造影検査 (CAG) により器質的病変を認めた 90名を冠動脈疾患 (CAD)群、残りの 208名を非冠動脈疾患 (NCAD)群に分け、前記実施例で挙げた方法を用いて、患者血漿中の総アディポネクチン (T. Ad)含量測定及び各多量体アディポネクチンの分別測定を実施した。即ち、 T. Ad含量は実施例 12及び 13の方法、 HMW-Ad含量は実施例 10及び 13の方法、 MMW— Ad含量は実施例 11及び 13の方法で MMW— Ad及び HM W— Ad合計量を算出し、さらに HMW— Ad含量を差し引くことで求めた。 ULMW— A d及び LMW - Adの合計量は、 T. Ad含量から MMW - Ad及び HMW - Ad合計量を差し引くことによって求めた。求められたそれぞれの値で、 CAD群及び NCAD群間の有意差検定を、 t検定を用いて行った。

[0077] その結果を表 4に示す。 T. Ad含量では、 CAD群と NCAD群間で、有意差は認められなかった力 HMW— Ad含量では、有意差を認め（pく 0. 05)。さらに、 T. Ad含量に対する HMW— Ad含量比（％)でも、明確な有意差を認めた (p< 0. 0001)。この結果から、 T. Ad含量よりも、 HMW— Ad含量や特にその T. Ad含量に占める割合（％)が、 CADを正確に反映することが示された。

[0078] [表 4] CAD NCAD

平均値標準偏差平均値標準偏差 P値

血漿中 T.Ad含量（ g/mL) 9.64 6.73 9.92 6.15 0.726 血漿中 HMW- Ad含量（ g/mL) 3.00 2.70 3.76 3.11 0.046 血漿中 MMW-Ad含量（ U g/mL) 4.32 3.06 4.02 2.41 0.374 血漿中 ULMW及び LMW_Ad含量の和（ g/mL) 2.34 1.92 2.18 1.60 0.463 血槳中 H MW-Ad/T.Ad ( % ) 27.0 10.2 34.2 10.9 く 0.0001 血槳中 MMW- Ad/T.Ad (o/o) 43.6 1 1.5 42.0 1 1.8 0.260

[0079] 実施例 15 メタボリックシンドロームとの関係

実施例 14で挙げた 298名について、総アディポネクチン量 (T. Ad)及び T. Ad量に占める HMW— Ad量の割合、すなわち HMW— AdZT. Ad X 100% (HMW— R) を基に、次に示す基準で、 4群に分類した。まず、 T. Adの平均値及び HMW—尺の平均値をそれぞれ算出した結果、それぞれ 9. 8 /z gZmL及び 32%であった。次に T. Ad値及び HMW— R値がともに平均値未満の患者を A群、 T. Ad値が平均値未満で、 HMW— R値が平均値以上である患者を B群、 T. Ad値が平均値以上で、 HM W— R値が平均値未満である患者を C群及び T. Ad値及び HMW— Ad値がともに平均値以上である患者を D群に分類した。さらに、各群内において、米国の Adult Tr eatment Panel ΠΙ (ΑΤΡΠΙ)によって提唱されているメタボリックシンドロームの診断基準 (JAMA, 285 : 2486, 2001)に照らし合わせ、 5項目のリスクファクターの内、 2項目以上基準値を超える患者と 2項目未満の患者の 2グループに分けた (本来、 ΑΤΡΙΠの診断基準では、 3項目以上基準値を超える場合をメタボリックシンドロームとしているが、今回はより厳しい条件とした)。その結果を、表 5に示す。

[0080] 「メタボリックシンドローム診断基準項目数と T. Ad値及び HMW— R値には統計学的に有意な関係がある」ことがクラスカル'ヮーリス検定の結果、判明した (P値 =0. 0 01)。さらに、 HMW— R値が平均値以下である A群及び C群において、メタボリックシンドローム診断基準項目数が 2項目以上である患者割合が多、ことが判明した。この結果は、 T. Ad値に比較して、 HMW— R値の方力メタボリックシンドロームとの関係を表す上でより好適な指標となることを示している。即ち、 HMW-R値を測定し、メタボリックシンドロームの指標として用いる事力メタボリックシンドロームの予知や予防にとって有効であることを、今回初めて見出した。

[0081] [表 5] 2項目未満 2項目以上

A群 44 92

B群 29 21

C群 6 13

D群 50 43

(人）

以上の結果から、総アディポネクチン含量を指標としただけでは、疾病や病態の評価が出来ない場合においても、多量体 Adの特定の画分を測定することや総アディポネクチン含量に占める特定の画分の割合を見ることによって、疾病の予知や予防、病態の把握が可能となることが判った。

Claims

請求の範囲

[1] 測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中の多量体アディポネクチンの分別測定方法。

[2] プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別する方法が、分別して測定する対象以外のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させ、残存する測定対象のアディポネクチンを免疫学的に測定することを特徴とする、請求項 1に記載の測定方法。

[3] プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別する方法が、分別して測定する対象のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させ、その消化産物を免疫学的に測定することを特徴とする、請求項 1に記載の測定方法。

[4] 多量体アディポネクチン力人血中由来である、請求項 1一 3のいずれ力 1項に記載の測定方法。

[5] 人血中由来多量体アディポネクチンが下記の 4種であり、その内の 1種又は 2種を、プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、請求項 1一 4のいずれ力 1項に記載の分別測定方法。

(1) ULMW-Ad：人血清又は人血漿力精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル（2-15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される 4種のバンドのうち、最も移動度が大きぐさらに、分子内架橋後の SDS— PAGEによる分子量が lOOkDa付近にあるアディポネクチン。

(4) HMW-Ad：人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下

、ポリアクリルアミドゲル（2-15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される 4種のバンドのうち、最も移動度が小さぐさらに、分子内架橋後の SDS— PA

GEによる分子量が少なくとも 300kDa以上であるアディポネクチン。

[6] 抗体が、抗アルブミン抗体及び Z又は抗アディポネクチン抗体である、請求項 1一

5の、ずれか 1項に記載の測定方法。

[7] 分別して測定する対象力 ULMW Ad及び Z又は LMW Adである、請求項 5又は 6に記載の測定方法。

[8] 分別して測定する対象力 MMW— Ad、 HMW-Ad,又は該 2種の組合わせである、請求項 5又は 6に記載の測定方法。

[9] 分別して測定する対象が HMW— Adであって、分別して測定するための手段力 H

MW— Ad以外の 3種のアディポネクチンにプロテアーゼを作用させることである、請求項 5、 6又は 8に記載の測定方法。

[10] HMW— Adの測定に先立って、 HMW— Ad以外の 3種のアディポネクチンにプロテァーゼを作用させる、請求項 5、 6、 8又は 9に記載の測定方法。

[11] 分別して測定する対象が MMW— Adであって、分別して測定する手段が、 ULMW

Ad及び LMW— Adをプロテアーゼ処理し、残存する HMW— Ad量及び MMW— A d量の合計量を算出し、該合計量からさらに HMW— Ad量を差し引くことで算出する

、請求項 5、 6又は 8に記載の測定方法。

[12] 分別して測定する対象が LMW— Adであって、分別して測定する手段が、抗アルブミン抗体及び抗アディポネクチン抗体を組合わせる、請求項 5— 7のヽずれか 1項に記載の測定方法。

[13] 分別して測定する対象が ULMW— Adであって、分別して測定する手段が、 ULM W— Ad及び LMW— Adをプロテアーゼ処理し、残存する HMW— Ad量及び MMW— Ad量の合計量を算出し、別に測定したアディポネクチン総量から、該合計量及び L MW— Ad量を差し引くことで算出する、請求項 5— 7のいずれ力 1項に記載の測定方法。

[14] 人血中由来多量体アディポネクチンが下記の 4種であり、その内の 1種又は 2種を、プロテアーゼ及び Z又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定し、その結果を基に、疾病又は病態に関する情報を得ることを特徴とする、疾病又は病態の評価方法。

[15] ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW— Ad及び HMW— Adのうちの 1種以上の量の変動により評価を行うものである、請求項 14に記載の評価方法。

[16] ULMW-Ad, LMW-Ad, MMW-Ad, HMW— Ad及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも 2つの量の比を求めて評価を行うものである、請求項 14に記載の評価方法。

[17] 他の指標と ULMW— Ad、 LMW-Ad, MMW— Ad及び HMW— Adのうちの 1種以上の量、あるいは ULMW— Ad、 LMW-Ad, MMW-Ad, HMW— Ad及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも 2つの量の比を関連付けることにより評価を行うものである、請求項 14に記載の評価方法。

[18] 疾病又は病態が、 2型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患又は肥満症、メタボリックシンドロームである、請求項 14に記載の評価方法。

[19] 2型糖尿病、動脈硬化性疾患、腎疾患、肝疾患又は肥満症、メタボリックシンドロームの発症、診断、進展、予知及び治療効果を評価する、請求項 14に記載の評価方法。