JP4397934B2

JP4397934B2 - インスリン感作薬での処置に対する反応者を識別する方法

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Inventors: ワーグナー，ジヨン・エイ; シエーラー，フイリツプ・エー; パジバニ，ウタパル・ビー
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Description

脂肪細胞は、全身の遊離脂肪酸レベルの調節により、および集合的にアディポカインとして知られている脂肪細胞特異的または脂肪細胞高含有蛋白質の分泌により、全身の代謝に影響を及ぼし得る。最近の出版物では、エネルギーの恒常性および代謝における脂肪細胞分泌分子の重要性が強調されている（１−３）。アディポカイン、例えば、レプチン、レジスチン、アディポネクチン（Ａｃｒｐ３０、ＡｄｉｐｏＱ、ａＰＭ１およびＧＢＰ２８としても知られている）、アディプシン、インターロイキン−６、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、およびさらに多くのものが、全身性インスリン作用、炭水化物および脂質代謝に影響を及ぼすことが、明らかになった（４）。これらのアディポカインには、相乗作用を有するものもあるが、レジスチンおよびアディポネクチンのように、競合作用を有するものもあり、薬理学的用量のレジスチンは、糖新生に対するインスリンの抑制効果を不活性化し（５）、これに対してアディポネクチンは、インスリン感受性を増大させ、その結果、肝臓の糖放出の抑制強化を導く（６）。さらに、ヒトアディポネクチン遺伝子系統は、染色体３（３ｑ２７）上にあり、肥満−メタボリック症候群に関連した表現型についての最近のゲノムワイドスキャンにより、染色体３のこの領域は、新規糖尿病感受性座位であることが判明した（（７）に総説されている）。これ以来、幾つかのグループが、アディポネクチン遺伝子内の遺伝的変異は、血清中蛋白質レベルの変化を導き、一般に蛋白質にインスリン抵抗性の素因を与えるという仮説を立て、証拠を提供してきた。血清アディポネクチン減少は、肥満の特徴と現在では考えられており、一般にインスリン感受性指数低下と相関関係がある（８、９）。幾つかの研究は、血清アディポネクチンレベルの低下は、インスリン感受性低下の一つの要因であり、単なる結果ではないことを示唆している。遺伝子データおよび薬理学的データは、インスリン感受性に対する蛋白質の直接的影響を支持している（２、１０、１１）。

治療ターゲットとしてのアディポネクチンの潜在的な重要性は、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）としても知られている抗糖尿病、インスリン感作薬での処置に反応してこのアディポカインが劇的にアップレギュレーションされることにより強調される（１２−１４）。ＴＺＤは、遺伝性または後天性インスリン抵抗性の多数の動物モデルにおいて活性であり、これは、これらの薬物が、基礎をなす原因にかかわらず、インスリン感受性を改善することを示唆している（１５）。臨床試験により、２型糖尿病患者におけるＴＺＤのインスリン感作作用が確認されており、前記患者においてこれらの薬物は、空腹時および食後の両方のグルコースおよびインスリンレベルを低下させる。しかし、ＴＺＤ作用の分子メカニズムは、まだ充分には理解されていない。ＴＺＤは、ＰＰＡＲγ（脂肪細胞において高度に発現されるが、より低レベルでは他の組織においても見出される転写因子）の外在性リガンドとして機能する（１６）。脂肪組織における主ＴＺＤターゲット（ＰＰＡＲγ）の高レベルの発現は、脂肪細胞が、ＴＺＤ作用の少なくとも一部の側面を媒介する上で重大な役割を果たし得ることを示唆している。この仮説は、ＴＺＤ処置に反応して低減された代謝改善を示す「脂肪の少ない」マウスの研究によりさらに支持された（１７）。かなりの脂肪組織が不足しているこの動物モデルにおいて、ＴＺＤ処置は、血清トリグリセリドを有効に低下させたが、インスリン感受性の測定値は影響を受けなかった。マウスおよびヒトにおいて、ＴＺＤ処置が、脂肪細胞からのアディポネクチンの生産および分泌増加を伴う転写アップレギュレーションをもたらすことは、多数の研究により実証されている（２、１２−１４）。興味深いことに、先行の循環アディポネクチンの有意な増加が、ａｂ／ａｂマウスコホートのＴＺＤ処置で達成される血清グルコースおよびトリグリセリドレベルを低下させた（１２）。アディポネクチンのＴＺＤ媒介誘発が、インスリン感受性改善の原因となるのか、または単に状態を示すものなのかに関して、この分野の研究者たちの間ではいまだ議論が続いている。原因的役割には、インスリン感受性の改善とアディポネクチンの誘発の間に不一致が存在するという報告により異議が唱えられた（１３）。大多数の患者は、（程度は様々であるにせよ）ＴＺＤ処置に反応してアディポネクチンの発現および分泌を誘発するが、５０から７０％の患者しか、インスリン感受性の臨床的改善を示さない（（１８）に総説されている）。これは、いずれの特定の個体においてもアディポネクチンの誘発は、インスリン感受性の定量的改善の予測とならず、これと相関関係もないことを示唆している。

アディポネクチンは、少なくとも二つの形で、低分子量（ＬＭＷ）複合体と呼ばれる三量体の二量体（ｔｒｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ）として、および１２から１８のサブユニットから成る高分子量（ＨＭＷ）複合体として、血清中に存在することが、最近、示された（１９）。これらのオリゴマー複合体は、インビトロでも、インビボでも安定であり、沈降速度法またはゲル濾過クロマトグラフィーにより容易に分離することができる。これらは、様々な代謝刺激により差別的に調節される。齧歯動物またはヒトではインスリン処置により血清アディポネクチンレベルが低下する（１３）。マウスでは、これは循環ＨＭＷ複合体の特異的減少の結果であることが、明らかになった（１９）。同様に、経口グルコース負荷は、血清からのＨＭＷの選択的消失をもたらすであろう。ＨＭＷの重要性、および絶対量ではなく、これら二つのオリゴマー形間の比率（ＨＭＷ対ＬＭＷ）の重要性は、インスリン感受性の判定および制御において重要とは考えられていない。

ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンは、構造の一部としてベンジルチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）を含むＰＰＡＲガンマ作動薬である。これらの化合物は、投与を受ける糖尿病患者の５０から７０％においてインスリン抵抗性を低下させ、その結果、これらの患者の２型糖尿病の症状を改善する。インスリン感受性の臨床的改善を示す患者を、処置に対する「反応者」と呼ぶ。インスリン感受性の臨床的改善を示さない患者は、「非反応者」である。

臨床反応およびヘモグロビンＡ１Ｃの改善を基に患者を反応者または非反応者と識別することができるまでに、ＴＺＤまたは他のインスリン感作薬での数ヶ月の処置が必要である。ＴＺＤまたは他のインスリン感作薬での処置に対する非反応者である可能性が高い患者を短期間（例えば、１から４週間）で識別して、代替の処置方式をより早く開始することができると有利であろう。

より短期間で反応者と非反応者を識別する方法を本明細書において開示する。ＴＺＤまたは他のインスリン感作薬での処置に対する反応者は、本明細書において説明する方法に従うことにより、処置開始から４週間以内に容易に識別され、好ましくは２週間以内、さらにいっそう好ましくは１週間以内に識別されるであろう。本方法は、患者の血清または血漿中のアディポネクチン（ＨＭＷおよびＬＭＷをアディポネクチン含む）の量の測定に基づく。

（発明の要約）
インスリン抵抗性のまたは２型糖尿病に関連した１つまたはそれ以上の疾病の治療的処置に対する反応者である患者は、次の方法によって識別することができ、この方法は、
治療的処置開始前に、患者の組織（通常、血漿または血清）中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量を測定する段階；
この治療的処置を開始する段階；ならびに
この治療的処置の開始後に患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンいずれかの量を測定する段階を含む。治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が増加した場合、その患者はその治療的処置に対する反応者であると予測される。

この治療的処置は、１つまたはそれ以上のインスリン感作薬、例えばチアゾリジンジオン（ＴＺＤとも呼ばれる）；ＴＺＤではないＰＰＡＲガンマ作動薬；またはＰＰＡＲガンマ作動薬とは異なるメカニズムにより作用するインスリン感作化合物、の有効量を投与する段階を一般に含む。ＰＰＡＲガンマ作動薬に加えて追加の治療活性を有するＰＰＡＲガンマ作動薬、例えばＰＰＡＲアルファガンマ二重作動薬も、その患者がＰＰＡＲガンマ作動薬での処置に対する反応者であるかどうかを判定するために、ここで用いる方法によって試験することができる。この方法は、選択的ＰＰＡＲガンマモジュレータ（ＳＰＰＡＲＭ）としても知られているＰＰＡＲガンマ部分作動薬、ＰＰＡＲアルファ−ガンマ二重作動薬（選択的ＰＰＡＲアルファ−ガンマ二重選択的モジュレータ）、およびＰＰＡＲｐａｎ−作動薬での処置を受けることとなる患者に適用することもできる。

ＴＺＤ構造を有するＰＰＡＲガンマ作動薬には、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、バラグリタゾン、イサグリタゾン、トログリタゾン、ネトグリタゾン、ＭＣＣ−５５５およびＢＲＬ−４９６５３が挙げられる。他のＰＰＡＲガンマ作動薬（これらの一部は、ＴＺＤ構造を有する）には、ＣＬＸ−０９２１、５−ＢＴＺＤ、ＧＷ−０２０７、ＬＧ−１００６４１、ＬＹ−３００５１２、ＮＮ−２３４４、ＬＹ−８１８、ＧＷ−６７７９５４、ＧＷ−７２８２およびＴ−１３１が挙げられる。好ましいＰＰＡＲガンマ作動薬には、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンが挙げられる。

ＰＰＡＲアルファ／ガンマ二重作動薬は、アルファ作動作用とガンマ作動作用の両方を示し、２型糖尿病の処置と同時に脂質の低減に使用することができる。ＰＰＡＲアルファ／ガンマ作動薬には、ＫＲＰ−２９７（ＭＫ−０７６７）、ムラグリタザル（ＢＭＳ−２９８５８５）、ファルグリタザル、ラガグリタザル、テサグリタザル（ＡＺ−２４２）、ＪＴ−５０１、ＧＷ−２５７０、ＧＩ−２６２５７９、ＣＬＸ−０９４０、ＧＷ−１５３６、ＧＷ１９２９、ＧＷ−２４３３、Ｌ−７９６４４９、ＬＲ−９０、ＳＢ−２１９９９４、ＬＹ−５７８、ＬＹ−４６５５６０８、ＬＳＮ−８６２、ＬＹ−５１０９２９およびＬＹ−９２９が挙げられる。好ましいＰＰＡＲアルファ／ガンマ作動薬には、ＫＲＰ−２９７（ＭＫ−０７６７）、ムラグリタザル（ＢＭＳ−２９８５８５）、ファルグリタザルおよびテサグリタザルが挙げられる。

本明細書に開示する方法は、ＴＺＤまたは非ＴＺＤＰＰＡＲガンマ作動薬が、２型糖尿病またはインスリン抵抗性を処置するために使用することができる別の１つまたは複数の薬物と併用（例えば、固定的併用）または同時使用される場合の、患者がＴＺＤまたは非ＴＺＤガンマ作動薬での処置に対する反応者であるかどうかの判定にも有効であると予想される。こうした他の薬物は、例えば、ビグアニド（例えば、メトホルミン）；スルホニル尿素；スルホニル尿素以外の別の化学分類のインスリン分泌促進物質、例えば、メグリチニド；インスリン（皮下もしくは筋肉内注射用に調合してもよいし、注射の必要を回避するための調合物、例えば経口、口腔内もしくは鼻用調合物であってもよい）；ＤＰ−ＩＶ阻害剤；ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤；ＧＬＰ−１類似体；グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤；グルカゴン受容体拮抗薬；ヒドロキシステロールデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ−１）阻害剤；グルコキナーゼ活性化剤であるか、抗糖尿病化合物の別の類からのものである。本明細書に開示する方法は、ＴＺＤまたは非ＴＺＤＰＰＡＲガンマ作動薬が、２型糖尿病またはインスリン抵抗性にも罹患している肥満患者において肥満を処置するために使用することができる別の１つまたは複数の薬物と併用（例えば、固定的併用）でまたは同時に投与される場合の、患者がＴＺＤまたは非ＴＺＤガンマ作動薬での処置に対する反応者であるかどうかの判定にも有効であると予想される。こうした他の薬剤は、例えば、シブトラミン、オリスタット、フェンテルミン、Ｍｃ４ｒ作動薬、カンナビノイド受容体１（ＣＢ−１）拮抗薬／逆作動薬、β３アドレナリン作動薬であるか、抗肥満化合物の別の類からのものである。本方法は、患者がＴＺＤまたは非ＴＺＤＰＰＡＲ作動薬での処置に対する反応者であるかどうかを、これが、全コレステロールもしくはＬＤＬ−コレステロールを減少させるおよび／またはＨＣＬ−コレステロールを上昇させるために使用される１つまたはそれ以上の薬物、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（ロバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、パラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、リバスタチン、ピタバスタチン、ＺＤ−４５２２、および他のスタチン）；ナイアシン；コレステロール吸収阻害剤（エゼチミブ）；ＣＥＴＰ阻害剤（トルセトラピブ）；ＰＰＡＲアルファ作動薬（フェノフィブレート、ゲムフィルリゾール、クロフィブレート、またはベザフィブレート）；ＡＣＡＴ阻害剤（アバシミブ）；抗酸化物質（プロブコール）；または胆汁酸封鎖剤（コレスチラミン）、と同時にまたは固定的併用で投与される場合に、判定する上でも有効であると予想される。

好ましい分析とは、処置開始前、およびその後、ＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率の変化が、その患者が処置に対して反応するかどうかを反映するために充分長い時間、処置が進行した後、その患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率を測定し、比較することである。この比率は、本明細書ではＳ_Ａと定義し、これは、ＨＭＷ／（ＨＭＷ＋ＬＭＷ）の計算比である。ＨＭＷアディポネクチンの全ＨＭＷ＋ＬＭＷアディポネクチンに対するこの比率の変化は、患者がインスリン感作薬での処置に対して陽性に反応するかどうかの最良の予測因子である。処置が進行した後、治療的処置に対する反応者である可能性が高い患者は、ＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、処置中に増加することになろう。陽性反応を示す可能性が高いこの比率の増加は、例えば、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％および７５％である。これらの増加は、治療開始後４週間以内、好ましくは治療開始後２週間以内、最も好ましくは治療開始後１週間以内に観察されるであろう。

（発明の詳細な説明）
アディポネクチンは、比較的低い分子量（ＬＭＷ）の六量体および高分子量（ＨＭＷ）のより大きな多量体構造として血清中で循環する脂肪細胞特異的分泌蛋白質である。この蛋白質の血清中レベルは、全身のインスリン感受性と相関関係がある。その完全長蛋白質は、インスリン感受性の改善により肝臓の糖新生に影響を及ぼし、アディポネクチンの蛋白質溶解性フラグメントは、筋肉におけるβ酸化を誘発する。絶対量ではなく、これら二つのオリゴマー形間の比率（ＨＭＷ対ＬＭＷ）は、インスリン感受性の判定に重要であることが判明した。新たな指数（Ｓ_Ａ）は、ＨＭＷ／（ＨＭＷ＋ＬＭＷ）と定義する。ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＳ_Ａ値は、全アディポネクチンレベルが同様であるにもかかわらず、野生型同腹子より低い。さらに、Ｓ_Ａは、ＰＰＡＲγ作動薬処置（ＴＺＤ）で増加する。Ｓ_Ａの変化は、ＴＺＤ処置中に達成されるインスリン感受性の改善の予測因子として役立つが、全血清アディポネクチンレベルの変化は、個々のレベルで充分な相関関係がない。

材料および方法
アディポネクチン複合体を分離するための沈降速度法／ゲル濾過クロマトグラフィー − １０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１２５ｍＭＮａＣｌ中の５から２０％スクロース勾配溶液を２ｍＬ薄壁超遠心管（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に段階的に（５％、１０％、１５％、２０％）注入し、一晩、４℃で放置して平衡させた。頂部でのサンプルの成層後（血清の場合、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１２５ｍＭＮａＣｌで希釈した）、ＢｅｃｋｍａｎＴＬ−１００卓上超遠心分離器のＴＬＳ５５ローター内で、４℃で４時間、５５，０００ＲＰＭでこれらの勾配溶液を回転させた。１５０μＬの勾配溶液画分をその勾配溶液の頂部から順次回収し、定量ウエスタンブロット分析により分析した。

免疫ブロット法 − ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蛍光間接撮影法および免疫ブロット法による蛋白質の分離は、以前に記載した（２０）とおり行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ中で一次および二次抗体を希釈した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の説示に従って、強化された化学発光で検出した。定量ウエスタンブロット法については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、蛋白質をＢＡ８３ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に転写した。ニトロセルロース膜をポンソーＳ溶液で染色して、すべてのサンプルの一様で完全な転写を確保し、その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ中でブロックした。超可変領域（ＥＤＤＶＴＴＴＥＥＬＡＰＡＬＶ）を含むペプチドに対して産生させた親和精製ウサギ抗マウスアディポネクチン抗体を使用した。この抗体は、過剰な免疫ペプチドと有効に競合させることができるウエスタンブロット分析により単一のバンドを認識する。ヒト血清サンプルの分析については、ヒト蛋白質の超可変領域（ＤＱＥＴＴＴＱＧＰＧＶ）に向けたウサギ抗ヒトアディポネクチン抗体を利用した。両方の一次抗体を^１２５Ｉ−誘導化二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で視覚化した。ブロットをＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）で分析し、沈降速度法からの画分４から６および９から１１（それぞれ、ＬＭＷおよびＨＭＷアディポネクチン）をＩｍａｇｅｑｕａｎｔＳｏｆｔｗａｒｅで定量した。

インビボ動物試験 − 雄ｄｂ／ｄｂマウスおよび対照マウス（それぞれ、Ｌｅｐｒ^ｄｂ＋／Ｌｅｐｒ^ｄｂ＋およびＬｅｐｒ^ｄｂ＋／＋ｍ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ）をケージ１個あたり５匹で収容し、磨り潰したＰｕｒｉｎａｒｏｄｅｎｔｃｈｏｗ５００１および水に自由に近づけるようにした。これらの動物および餌を３日ごとに計量し、ビヒクル（０．２５％カルボキシメチルセルロース）±１０ｍｇ／ｋｇ−日のロシグリタゾンを１１日間または１０ｍｇ／ｋｇ−日のＰＰＡＲα作動薬（化合物１０（２１））を７日間、飲料により、毎日、服用させた。この試験中、３から４日おきに、尾の出血により得た血液から、血漿アディポネクチン、グルコースおよびトリグリセリドレベルを測定した。インビボアディポネクチン活性試験のために、脂肪抽出に使用した野生型動物（Ｃ５７／Ｂ１６Ｊ）およびアディポネクチンノックアウト動物を同じやり方で維持した。すべての動物実験計画は、ＡｌｂｅｒｔＥｉｎｓｔｅｉｎＡｎｉｍａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を受けた。

ヒト臨床試験プロトコル − 試験Ａ
これは、１４日間のプラシーボおよびロシグリタゾン（１日２回、４ｍｇ）を含む処置での一施設、二重盲検、無作為化、プラシーボ対照、平行群間試験であった。２０人の非糖尿病被験者をこの分析で処置した（ｎ＝１０／群）。アディポネクチン濃度測定のために、１日目の投薬前（ベースライン）と１４日目の最終投薬の２時間後に血漿を採取した。２０人すべての被験者が健康は男性であり、年齢１８歳から４２歳（平均年齢２４歳）、体重６１から１１０ｋｇ（平均体重８９ｋｇ）と多様であった。これらの被験者は、試験完了の１４日前から他のすべての薬物使用を断った。彼らには糖尿病の形跡および家族歴がなく、ベースライン空腹時血漿グルコースは、１１０ｍｇ／ｄＬ未満であり、ベースライン空腹時血漿脂質プロフィール（トリグリセリドおよび全コレステロールを含む）は、検査室の基準範囲内であった。すべての被験者から、説明した上での同意を書面で得、この臨床プロトコルは、ベルギー、アントワープのＣｏｍｍｉｓｓｉｅｖｏｏｒＭｅｄｉｓｃｈｅＥｔｈｉｅｋにより再検討され、承認された。

動物試験および試験Ａの結果
糖尿病マウスは、同等の全血清アディポネクチンレベルにもかかわらず低減したＨＭＷ／全アディポネクチン比を示す。アディポネクチンレベルは、本質的にすべての状況下のヒトにおいてインスリン感受性が低下した状態では有意に低下するが、マウスでは、常にではないが多くの場合、インスリン抵抗性がアディポネクチンのレベル低下を随伴する。これは、ｄｂ／ｄｂおよびｏｂ／ｏｂマウスにおいて見出せるような単一遺伝子障害に特に関連がある。ｄｂ／ｄｂマウスが、痩せたヘテロ接合同腹子と同等の循環アディポネクチンレベルを示すことは、以前に明らかにした（１２）。これらの動物間の相違を、血清中のアディポネクチン複合体の差別的配分を基に（少なくとも一部は）説明することができるかどうか判定するために、本発明者らは、沈降速度法、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより雄ｄｂ／ｄｂおよびｄｂ／＋マウスからの血清を分析した。以前の発見と同様に、痩せた動物と太った動物は、血清中で循環する全アディポネクチンレベルが同等であった。しかし、ｄｂ／ｄｂマウスは、ＨＭＷ形のアディポネクチンのパーセンテージの有意な低下を示した。％ＨＭＷアディポネクチンに関する同様の低下は、ｏｂ／ｏｂマウスを含む多数の他の糖尿病マウスモデルにおいて見ることができる（明らかにされていない。）。

チアゾリジンジオン処置は、マウスおよびヒトにおける循環ＨＭＷ／ＬＭＷアディポネクチン複合体比に影響を及ぼす。ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおいて、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）処置は、１１日の処置過程の中で血清アディポネクチンの誘発を導き、高血糖、高グリセリド血漿およびインスリン抵抗性を改善する（１２）。ＴＺＤ処置が、血清中のアディポネクチンオリゴマーの相対循環濃度に影響を及ぼすかどうかを判定するために、雄ｄｂ／ｄｂマウスのコホートをロシグリタゾンで処置し、沈降速度法によりアディポネクチン複合体を分析した。処置前、アディポネクチンは、主としてアディポネクチンのＬＭＷ（６量体）形で見出され、これは、雄の野生型マウスからの値と一致する。しかし、１１日のロシグリタゾン処置の後、高分子量（ＨＭＷ）形で見出されるアディポネクチンのパーセンテージは、全循環アディポネクチンの約４５％へとほぼ倍増した。プラシーボ処置は、アディポネクチンオリゴマーの配分にいかなる有意な変化ももたらさず（明らかにされていない。）、血清グルコース、トリグリセリドおよびインスリンレベルの低下（それぞれ、４５％、４５％および８０％）に等しく成功したＰＰＡＲα作動薬での７日の治療も、アディポネクチンオリゴマーの配分にいかなる有意な変化ももたらさなかった。これは、複合体の配分におけるこのシフトが、直接的にはＴＺＤ処置の結果であり得るとともに、全身の代謝パラメータ改善の間接的な結果ではないことを示している。

この相対的なＨＭＷアディポネクチン増加を、ＴＺＤでの処置を受けたヒトの被験者においても観察することができるかどうか見るために、ヒトの非糖尿病男性のコホートにおける効果を検査した（「試験Ａ」、（１２））。彼らにロシグリタゾンまたはプラシーボのいずれかでの治療を２週間施し、アディポネクチン複合体を処置前および処置後に二重盲検様式で沈降速度法により分析した。プラシーボで処置した患者では、全循環アディポネクチンレベルに関しても、ＨＭＷまたはＬＭＷアディポネクチン複合体いずれかに関しても、小さな変化しか見られなかった。比較すると、ロシグリタゾンで処置した患者は、全アディポネクチンの有意な増加（プラシーボより約２倍高い）を示した。全アディポネクチンのこの増加は、主として、循環ＨＭＷ形の劇的な増加の結果であった。結果として、ロシグリタゾンで処置した個体では、ＨＭＷ／全アディポネクチン比が、有意に増加され、処置後の値は、約４５から５０％であった。これは、処置前の値２０から２５％のほぼ倍である。

マウスにおいて、６量体（ＬＭＷ）アディポネクチンではなく、ＨＭＷアディポネクチンの静脈内注射は、血清グルコースの減少を導く。適切に折り重ねられ、組立てされた完全長アディポネクチンが、腹腔内注射または静脈内注射のいずれかにより動物に導入したとき、血清グルコースレベルの有意な低下を導くことは、以前に研究により証明されている。ＨＭＷおよびＬＭＷアディポネクチン複合体の差別的生物活性に関するなんらかの証拠があるかどうかを判定するために、精製ＨＭＷ（体重１ｇあたり１または２μｇ）またはＬＭＷ（体重１ｇあたり２μｇ）アディポネクチンを雄の動物に注射した。様々な循環外因性複合体の作用との混同を避けるため、アディポネクチン座の染色体の欠失を有し、そのため一切の外因性循環アディポネクチンが完全に欠如しているマウスにおいてこれらの注射を行った。

データを図１に提示する。週齢１０から１２週の雄アディポネクチンノックアウトマウスに、尾静脈経由で、体重１ｇあたり２μｇのＨＭＷアディポネクチン（ｎ＝６）（黒丸）、２μｇ／ｇのＬＭＷアディポネクチン（ｎ＝６）（白四角）、１μｇ／ｇのＨＭＷアディポネクチン（ｎ＝６）（黒三角）または緩衝液（ｎ＝６）（白丸）を注射した。血清グルコースを、注射後、様々な時点で、血糖計によりアッセイした。出発グルコースレベルは、すべてのコホートについて、任意に１００％に設定し、すべてのコホートにわたり平均１５０±５ｍｇ／ｄＬであった。グルコースの変化を、注射後の時間（時間）に対するベースライン（出発）グルコースの％としてプロットする。緩衝液対照と有意に異なる値は、アスタリスクにより示す（ｐ＜０．０５）。図１のプロットは、ＨＭＷアディポネクチンが、血漿グルコースレベルを用量依存的に低下させ、これに対して精製６量体（ＬＭＷ）アディポネクチンは、緩衝液の注射と比較して血漿グルコースレベルの低下を誘導する能力が不足していたことの例証となる。雄のマウスは、アディポネクチンの約８０％をＬＭＷ形で示す（１２から１５倍モル過剰に相当する）ので、これらの精製複合体に関する溶解度の問題点により、この極めてモル過剰のＬＭＷ複合体を有効に模倣する二つの複合体の混合物の注射はできない。

アディポネクチン複合体分泌を脂肪組織レベルで調節する。ヨウ化アディポネクチン複合体が、血清中で安定であり、分泌後に相互変換しないことは、以前に説明した。これらの観察を、アディポネクチンノックアウトマウスにおいて、非誘導化完全天然アディポネクチン複合体を使用して、最近確認した（データは示さない）。これは、ＴＺＤ処置後のＨＭＷアディポネクチン増加のメカニズムが、二つのオリゴマー形の差別的分泌を通して脂肪細胞により媒介されるという仮説を指示している。雄および雌のマウスからの様々な脂肪組織および血清を沈降速度法により分析して、これらの動物から複合体の配分を判定した。以前に報告したように、雄および雌のマウスは、差別的な血清中アディポネクチンレベルを示す。雄の動物は、血清アディポネクチンの約２５％をＨＭＷ形で示し、一方、雌のマウスは、その倍よりわずかに大きいパーセンテージ（〜５０％ＨＭＷ）を有する。驚くべきことに、雄と雌の両方が、脂肪組織内のＨＭＷアディポネクチンについて同様のパーセンテージを有する。同じマウスの血清中での分配とは著しく対照的に、脂肪組織に付随するアディポネクチンの７０から９０％の間が、ＨＭＷ形である。脂肪組織に付随するアディポネクチンの比率と血清アディポネクチンの比率の間の差異を定量した。これらの差異は、雄のマウスについて特に著しいが、脂肪組織におけるＨＭＷアディポネクチンの有意な増加は、両方の性のマウスにおいて観察される。同様のパターンが、ヒトの血清および脂肪細胞で観察される。

６量体（ＬＭＷ）アディポネクチンではなく、ＨＭＷアディポネクチンの静脈内注射により血清グルコースが用量依存的に減少することを図示する図である。この図は、ＨＭＷアディポネクチン（体重１ｇあたり１または２μｇ）、ＬＭＷアディポネクチン（体重１ｇあたり２μｇ）または緩衝液を注射した雄アディポネクチンノックアウトマウスの血清グルコースの変化を比較するものである。

Claims

インスリン抵抗性患者が、インスリン抵抗性の治療的処置に対する反応者であるかどうかを判定する方法であって、
治療的処置の開始前に患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量を測定する段階；ならびに
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量を１回またはそれ以上測定する段階
を含み、
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、前記方法。
前記治療的処置が、１つまたはそれ以上のインスリン感作薬の有効量の投与を含む、請求項１に記載の方法。
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２５％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも３０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも４０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも５０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記治療的処置開始後にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも７５％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記インスリン感作薬が、ＰＰＡＲ−ガンマ作動薬、ＰＰＡＲ−ガンマ部分作動薬およびＰＰＡＲアルファ−ガンマ二重作動薬から成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
前記インスリン感作薬が、その構造にＴＺＤ基を有する、請求項２に記載の方法。
前記インスリン感作薬が、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ＭＣＣ−５５５、バラグリタゾン、イサグリタゾン、ネトグリタゾン、ＫＲＰ−２９７（ＭＫ−０７６７）、ファルグリタザル、テサグリタザル（ＡＺ−２４２）およびムラグリタザル（ＢＭＳ−２９８５８５）から成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンまたはＬＭＷアディポネクチンの量が、前記治療的処置の開始前に測定され、および前記治療的処置の開始後に１回またはそれ以上測定される、請求項２に記載の方法。
前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンの量が、前記治療的処置の開始前に測定され、および前記治療的処置の開始後に１回またはそれ以上測定され、ならびに、前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項２に記載の方法。
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２５％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１３に記載の方法。
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも３０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１３に記載の方法。
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも４０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１３に記載の方法。
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも５０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１３に記載の方法。
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも７５％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１３に記載の方法。
前記治療的処置の開始後４週間以内に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１３に記載の方法。
前記治療的処置の開始後２週間以内に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１９に記載の方法。
前記治療的処置の開始後１週間以内に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記患者が前記治療的処置に対する反応者であると判定される、請求項１９に記載の方法。
インスリン抵抗性の治療的処置が、インスリン抵抗性に関連した１つまたは複数の疾病を前記１つまたは複数の疾病の処置が必要な患者において改善することに有効であるかどうかを予測する方法であって、
治療的処置の開始前に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンの量を測定する段階；ならびに
前記治療的処置の開始後に前記患者の血漿または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量および全アディポネクチンの量を１回またはそれ以上測定する段階
を含み；
前記治療的処置が、１つまたはそれ以上のインスリン感作薬の有効量の投与を含み；
前記治療的処置開始後４週間以内にＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記治療的処置が前記患者における前記１つまたはそれ以上の疾病の改善に有効であると予測される方法。
インスリン抵抗性の治療的処置が、２型糖尿病、肥満、高血圧および脂質代謝異常から成る群より選択されるインスリン抵抗性に関連した１つまたはそれ以上の疾病を、前記１つまたは複数の疾病が必要な患者において改善することに有効であるかどうかを予測する請求項２２に記載の方法。
インスリン抵抗性の治療的処置が、２型糖尿病患者における高血糖または脂質代謝異常の改善に有効であるかどうかを予測するために用いられる、請求項２２に記載の方法。
インスリン抵抗性の治療的処置が、耐糖能異常または空腹時血漿グルコース上昇を有する非糖尿病患者が２型糖尿病を発現する危険を低下させるのに有効であるかどうかを予測するために用いられる、請求項２２に記載の方法。
インスリン抵抗性の治療的処置が、腹部肥満、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬ、高血圧、および空腹時グルコース上昇から成る群より選択されるメタボリック症候群の３つまたはそれ以上の症状の改善に有効であるかどうかを予測するために用いられる、請求項２２に記載の方法。
前記治療的処置開始後４週間以内に前記患者の血症または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２０％増加した場合、前記治療的処置が、前記患者において有効であると予測される、請求項２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
前記治療的処置開始後４週間以内に前記患者の血症または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも２５％増加した場合、前記治療的処置が、前記患者において有効であると予測される、請求項２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
前記治療的処置開始後４週間以内に前記患者の血症または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも３０％増加した場合、前記治療的処置が、前記患者において有効であると予測される、請求項２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
前記治療的処置開始後４週間以内に前記患者の血症または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも４０％増加した場合、前記治療的処置が、前記患者には有効であると予測される、請求項２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
前記治療的処置開始後４週間以内に前記患者の血症または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも５０％増加した場合、前記治療的処置が、前記患者において有効であると予測される、請求項２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。
前記治療的処置開始後４週間以内に前記患者の血症または血清中のＨＭＷアディポネクチンの量の全アディポネクチンの量に対する比率が、少なくとも７５％増加した場合、前記治療的処置が、前記患者において有効であると予測される、請求項２４、２５または２６のいずれか一項に記載の方法。