WO2005028646A1 - 効率的なdna逆位反復構造の調製方法 - Google Patents

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Taku Demura
Hiroo Fukuda
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Riken
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Definitions

  • the present invention relates to the technical field of RNA interference that can be used as a means for analyzing gene function and can be used for preparing a mutant animal or plant with a modified function.
  • the present invention provides a method for efficiently preparing a chimeric gene having an inverted repeat structure of a DNA fragment of a bright target gene used for RNA interference, and a cassette construct therefor.
  • Non-Patent Document 1 Antisense methods (Non-Patent Document 1) and sense methods (Non-Patent Document 2) have been known as control methods after gene transcription. However, both the antisense and sense methods did not provide sufficient gene regulation efficiency in transformants.
  • RNAi double-stranded RNA
  • siRNA a short dsRNA generated by degradation of dsRNA by Dicer, does not cause apoptosis and can be regulated post-transcriptionally.
  • some genes in C. elegans encode hairpin RNAs and regulate other genes.
  • small RNAs folded into a hairpin structure are used to identify specific genes. Research whether it can inhibit function was. As a result, it was found that short hairpin RNA (shRNA) can regulate gene expression to the same extent as siRNA.
  • Patent Document 3 In order to reduce post-transcriptional gene expression, a further effective method of suppressing post-transcriptional expression is to use a chimeric gene in which the DNA fragment of the target gene takes an inverted repeat structure (reverse repeat structure).
  • Patent Document 3 is known.
  • a chimeric gene having an inverted repeat structure of this target gene DNA fragment is stably introduced into a living body, and a sequence-specific method for degrading endogenous endogenous RNA triggered by dsRNA produced in the living body (RNA Interference) has been widely used as an effective analysis method of gene function.
  • Patent Document 1 In addition, techniques using homologous gene recombination for insertion of a target gene DNA fragment have been reported (Patent Document 1, Non-patent Document 4).
  • Patent Document 1 U.S. Patent Publication 20030049835
  • Non-Patent Document 3 Natl. Acad. Sci. USA Vol. 83 5372-5376 (cited in Non-Patent Document 3)
  • Non-patent document 2 Plant Cell Vol. 2 p. 291 (cited in Non-patent document 3)
  • Patent document 3 The Plant Journal Vol. 33, ⁇ ⁇ 793-800
  • Patent Document 4 Plant J., 27, 581-590, 2001 Disclosure of the Invention
  • the target sequence can be arbitrarily placed mainly at two positions on a plasmid vector in the sense direction and the antisense direction. Or, the antisense direction and the sense direction need to be separately introduced.
  • the insertion of the target sequence is carried out by a DNA cleavage reaction with a restriction enzyme and a binding reaction with a ligase, and the target sequence is inserted into the sense and antisense directions or exactly in the antisense and sense directions.
  • the target sequence In order to be inserted, there must be independent restriction enzyme recognition sequences at each of the two target sequence insertion sites on the vector, and the target sequence must also have a restriction enzyme recognition sequence corresponding to the target sequence insertion site. No. Therefore, depending on the base sequence of the target sequence, it may be difficult to produce a chimeric gene having an inverted repeat structure of the target sequence by uniform processing, which is not suitable for comprehensive gene function analysis .
  • a homologous recombination reaction In order to produce a chimeric gene having an inverted repeat structure using a target sequence to which the recognition sequence of the homologous recombinase has been added, a homologous recombination reaction must be individually performed for each target sequence. It must be made.
  • a cassette construct which is a DNA construct in which an arbitrary base sequence (adapter sequence) with an arbitrary spacer sequence interposed and a base sequence (inverted adapter sequence) repeated in the inverted position of the adapter sequence
  • a plasmid vector incorporating the cassette construct is prepared.
  • a DNA fragment (target sequence) of the target gene is bound to one or both ends of the cassette construct, or the outside of one end of the cassette construct on the plasmid vector. Insert the target sequence into Further, the cassette construct to which the target sequence is bound is type II, and PCR is performed using one type of primer corresponding to any of the terminal portions of the target sequence, or the target sequence is inserted.
  • a primer corresponding to the base sequence of the plasmid vector further outside the target sequence insertion site above, and an adapter sequence or inverted adapter sequence opposite to the target sequence insertion site Perform PCR using primers (primer B) corresponding to the base sequence containing part of the spacer sequence.
  • primers primers (primer B) corresponding to the base sequence containing part of the spacer sequence.
  • the adapter sequence and the inverted adapter one sequence part temporarily anneal in the same molecule to form a binding structure, or After annealing with each other, the subsequent extension reaction and PCR yield a double-stranded PCR product of a chimeric gene whose target sequence takes an inverted repeat structure.
  • a DNA construct in which an arbitrary base sequence (adapter sequence) and a base sequence (inverted adapter sequence) repeated in an inverted position of the adapter sequence are arranged with an arbitrary spacer sequence interposed therebetween. If a cassette construct or a plasmid vector incorporating the cassette construct is prepared, the same method can be used efficiently in the same manner without depending on the base sequence of the target gene. A chimeric gene having an inverted repeat structure of the target sequence as shown can be efficiently prepared.
  • Fig. 1 is a schematic diagram of the inverted repeat structure of the target sequence created by the present invention.
  • Fig. 2 is a procedure for preparing a cassette construct.
  • Figure 3 shows the procedure for preparing the cassette construct, part 2
  • Figure 4 shows the procedure for preparing a plasmid vector for constructing an inverted repeat of the target sequence incorporating the cassette construct.
  • Figure 5 shows the procedure for preparing a chimeric gene having an inverted repeat structure of the target sequence.
  • Figure 6 is an illustration of cassette construct 1 for facilitating target sequence binding.
  • Figure 7 shows the schematic diagram of cassette construct 2 for facilitating target sequence binding.
  • Figure 8 is an illustration of the cassette construct 3 for facilitating target sequence binding.
  • Figure 9 is an illustration of cassette construct 4 for facilitating target sequence binding.
  • Figure 10 is an illustration of cassette construct 5 for facilitating target sequence binding.
  • Figure 11 is an illustration of the cassette construct 6 for facilitating target sequence binding.
  • Figure 12 shows an example of modification of a plasmid vector for creating an inverted repeat structure of a target sequence incorporating a cassette construct.
  • Figure 13 shows the method for preparing pGEMA and pGEMAS.
  • Figure 14 shows the method for preparing pRNAi.
  • Figure 15 shows the insertion of target sequence Z8755 into pRNAi.
  • Fig. 16 shows the preparation of a chimeric gene having an inverted repeat structure of target sequence Z8755.
  • an arbitrary sequence spacer sequence or intervening sequence
  • another arbitrary base sequence adapter sequence
  • a base sequence reverse sequence
  • a DNA construct cassette construct
  • the spacer sequence must be a base sequence that is not related to the target sequence and the adapter sequence (does not bind complementarily to the target sequence or the adapter sequence in vitro and in vivo).
  • any sequence that does not hybridize complementary to the target sequence adapter sequence during asymmetric PCR performed in the amplification of a chimeric gene can be used as a spacer sequence.
  • the spacer sequence is designed to be easily amplified in Escherichia coli so that inverted repeats in the same molecule can easily associate with each other in single-stranded DNA or single-stranded RNA.
  • the base length is 10 nucleotides or more and 10000 nucleotides or less, more preferably 50 nucleotides or more and 2000 nucleotides or less.
  • specific examples of the spacer sequences that can be used include partial fragments of the structural gene of green fluorescent protein (GFP) of jellyfish or dalcuronidase (GUS) of Escherichia coli.
  • Intron sequences such as the Arabidopsis thaliana fatty acid desaturase (FAD2) gene and the intron of the Drosophila ABC transporter gene (to be removed by splicing in living organisms such as Drosophila).
  • the adapter sequence and inverted adapter sequence are not related to the target sequence, spacer sequence, or the base sequence of the plasmid vector used. It does not bind complementarily to the target sequence, spacer sequence, or the base sequence of the plasmid vector used in the body).
  • a sequence capable of associating an adapter sequence with an inverted adapter sequence under ordinary PCR annealing conditions is used. Specifically, it is usually 18-28 nucleotides in length and has a GC content of 50-60. Design so that / o , Tm value is 55 ⁇ 80 ° C. More specifically, one sequence of the loan linker by Ko et al. Can be used as an adapter sequence, and its complementary sequence can be used as a reverse adapter sequence.
  • the inverted adapter sequence can be used even if it is not a complete inverted sequence of one adapter. It is necessary to be able to hybridize complementarily with the target adapter sequence during asymmetric PCR performed in the amplification of the chimeric gene.
  • the above-mentioned cassette construct can be prepared by well-known means.
  • a spacer sequence having blunt ends at both ends is prepared.
  • a linker sequence having a non-adhesive protruding end and a blunt end called a lawn linker, can be bound to both ends as an adapter sequence and an inverted adapter sequence.
  • LL-Sse8387I, LL-Sse8387 IA (5'-GAGATATTACC TGCAGGTACTC-3 ') and LL-Sse8387IB (5'-GAG TACCTGCAGGTAATAT-3')
  • LL-Sa1I, LL-Sa1IA (5'-one ATTG AC GT CG ACTTAT CC AGG—3 ') and LL-Sa1IB (5, one CCTGGATAGTCGACGTC-3 ')
  • Ko MSH et al., Nucleic Acids Res., 18, p4293-4294, 1990).
  • LL-Sse8387 I A, B or LL—Sall A, B is phosphorylated and annealed.
  • the annealed LL-Sse8387I or LL-Sa1I is ligated to a spacer sequence having blunt ends.
  • the cassette construct thus prepared can be amplified by a PCR method using, for example, LL-Sse83871 or LL-Sa1IA as a primer.
  • plasmids can be prepared by well-known means.
  • a cassette construct can be constructed on a DNA vector, and the cassette construct can be excised by a restriction enzyme reaction or amplified by PCR.
  • an adapter is inserted at both ends of a spacer sequence on a plasmid vector into which a spacer sequence is inserted.
  • the sequence and the inverted adapter sequence can be inserted sequentially by well-known means, namely, a restriction enzyme reaction and a ligation reaction.
  • FIG. 3A an adapter is inserted at both ends of a spacer sequence on a plasmid vector into which a spacer sequence is inserted.
  • the sequence and the inverted adapter sequence can be inserted sequentially by well-known means, namely, a restriction enzyme reaction and a ligation reaction.
  • an oligonucleotide consisting of an oligonucleotide in which an adapter sequence and an inverted adapter sequence are continuous and a recognition sequence for an arbitrary restriction enzyme is provided in the center thereof, and a complementary strand thereof.
  • the inverted repeat adapter sequence obtained by annealing them is inserted into an arbitrary plasmid vector, and then a spacer sequence is inserted into the center of the inverted repeat adapter sequence using any of the above-mentioned restriction enzymes. can do.
  • an adapter sequence, a plasmid vector, and a restriction enzyme having no recognition site in the spacer sequence can be used.
  • both ends of the insertion spacer sequence and the attached end are used.
  • the above plasmid vector is preferably a plasmid vector for TA cloning, more specifically, a plasmid vector for TA cloning, provided that one nucleotide adenine (A) is added to the 3 ′ end of the above oligonucleotide.
  • T Easy Vector Promega or the like can be used.
  • a plasmid vector for preparing an inverted repeat structure of a target sequence into which a cassette construct has been incorporated can be prepared by a known method. For example, by providing a restriction enzyme recognition site capable of inserting a target sequence on one of the plasmid vectors adjacent to the cassette constructs of the plasmid vectors 3A and 3B shown in FIG. It can be used as a plasmid vector for preparing an inverted repeat structure of a target sequence into which a cassette construct has been incorporated.
  • a restriction enzyme recognition site that generates a blunt end on the plasmid vector close to the cassette construct is added.
  • Target sequence A plasmid vector for preparing an inverted repeat structure of a target sequence into which a DNA can be easily inserted can be designed.
  • a plasmid vector into which a cassette construct has been incorporated can be used to construct a pool of chimeric genes in which various types of gene DNA fragments based on cDNAs of any animal or plant, preferably homogenized cDNAs take an inverted repeat structure. Can be used for preparation.
  • Target sequence is selected according to [Patent Document 1] can do.
  • the target sequence a DNA fragment of a target gene whose phenotypic expression is to be suppressed can be used.
  • the length of the target sequence is from 10 nucleotides to a nucleotide length sufficient to suppress phenotypic expression of the target gene, preferably at least 19 nucleotides, at least 21 nucleotides, at least 25 nucleotides, At least about 500 nucleotides in length, at least about 100 nucleotides in length, at least about 150 nucleotides in length, at least about 200 nucleotides in length or at least about 500 nucleotides in length, and possibly about 100 nucleotides in length Long target sequences can be used.
  • the target sequence is linked to either or both ends of the cassette construct.
  • a target sequence which is blunt at both ends and not phosphorylated can be preferably used as the target sequence.
  • Such a target sequence can be obtained by performing PCR using a set of dephosphorylated primers at the 5 'end and a thermostable DNA polymerase that does not add (dA) to the 3' end, or After performing PCR using a thermostable polymerase, remove the (dA) overhang at the 3 'end by well-known means and further dephosphorylate the PCR product, or set a primer with a phosphorylated 5' end. It can be prepared by performing PCR using a thermostable DNA polymerase that does not add (dA) to the 3 ′ end and then dephosphorylating the 5 ′ end of the PCR product.
  • the target sequence is inserted outside the adapter sequence or the inverted adapter sequence of the plasmid vector for preparing an inverted repeat structure of the target sequence into which the cassette construct has been incorporated.
  • a restriction enzyme having a recognition sequence only outside one of the cassette constructors on the plasmid vector a target gene into which a DNA fragment of the target gene is inserted outside one of the cassette constructs Insert the DNA fragment of More preferably, the target gene is inserted immediately outside one of the cassette constructs.
  • the plasmid vector can be cleaved with the restriction enzyme and ligated to a target sequence having a blunt end.
  • the plasmid vector and the target sequence may be treated with the same restriction enzyme and ligated at the cohesive ends.
  • cassette construct pretreatment for binding of target sequence to one or both ends of cassette construct
  • one or both ends of the cassette construct can be modified as a pretreatment.
  • the cassette construct 1 for facilitating binding to target sequence 1 (hereinafter abbreviated as CC1) is obtained by phosphorylating both 5 'ends. It is designed to allow the binding of a target sequence whose both ends have been dephosphorylated. This can be easily prepared by using a type of thermostable DNA polymerase that does not add (dA) to the 3 'end, for example, K0D-Plus- (T0Y0B0).
  • the target sequence-binding facilitating cassette construct 2 (CC2) shown in Fig. 7 phosphorylates only one end so that the target sequence whose both ends are dephosphorylated is bound to only one of the cassette constructs. It is designed to.
  • the cassette construct (CC3) for facilitating the binding of the target sequence in FIG. 8 is obtained by adding (dT) to both ends of the cassette construct and adding (dA) to both 3 ′ ends of the cassette construct. ) Is designed so that the target sequence dephosphorylated at both ends amplified by a normal thermostable DNA polymerase is added.
  • the cassette construct for facilitating the binding of the target sequence (CC4) in Fig. 9 can be added to the 3 'end of one of the cassette constructs by subjecting only one 3' end to (dT) and phosphorylation. Only, it is designed so that the target sequence whose both ends have been dephosphorylated and amplified with a normal thermostable DNA polymerase that adds (dA) to the 3 'end will bind.
  • the cassette construct (CC5) for facilitating the binding of the target sequence in Fig. 10 was obtained by adding toposomerase I (Invitrogen) and phosphorylating only one of the 3 'ends, so that only one of the cassette constructs was used. Designed for easy binding of the target sequence.
  • the cassette construct (CC6) for facilitating the binding of the target sequence in Fig. 11 can be converted to one of the force-set constructs by adding (dT) and topoisomerase I and phosphorylating only the 3 'end. Only, it is designed so that the target sequence dephosphorylated at both ends amplified by a normal thermostable DNA polymerase that adds (dA) to the 3 'end binds.
  • the plasmid vector for preparing the inverted repeat structure is cleaved with a restriction enzyme or the like.
  • the end thereof can be subjected to a treatment for facilitating the insertion of the target sequence.
  • blunt ends are cleaved as in pRNAi / blant in Fig. 12, and (dT) is added to the 3 'end of the cleaved end as in pRNAiT in Fig. 12.
  • the topoisomerase I can be added to the 3 'end of the cleaved end like pRNAiTP, and (dT) and topoisomerase I can be added to the 3' end of the cleaved end like pRNAiTTP in Fig. 12. .
  • a DNA product in which the target sequence is bound to one or both ends of the cassette construct is designated as ⁇ , and the target sequence is particularly preferably used by any gene amplification method.
  • a PCR method using only a primer (Primer I or II) specific to one of the ends a chimeric gene can be prepared in which the target sequence takes an inverted repeat structure across the cassette construct. Specifically, production of a single-stranded DNA structure by heat denaturation, and PCR using Primer I or II may be performed.
  • different linkers or primers
  • a primer set for the linker can be used.
  • an asymmetric PCR method allows the target sequence to be reversed across the cassette construct.
  • a chimeric gene having a position repeat structure can be prepared.
  • the primers include (1) a plasmid vector portion on the opposite side of the inserted target sequence from the cassette construct, and (2) either the adapter sequence or the inverted adapter sequence, A set of oligonucleotides designed to include the distant sequence and a portion of the adjacent spacer sequence is used.
  • the primer of the above (1) can be used more preferably 5 times or more, or 10 times or more, or about 100 times or more than the primer of (2).
  • the primer may contain an arbitrary sequence of several bases on the 5 ′ side so that integration into various vectors is easy after amplification of the chimeric gene.
  • a single-stranded PCR product in which a target sequence, an adapter sequence, a spacer sequence, and an inverted adapter sequence are sequentially linked is excessively amplified.
  • the adapter sequence and the inverted adapter sequence contained in this single-stranded PCR product are temporarily annealed in the same molecule to form a throwing structure, or they are annealed to each other between the two molecules.
  • the resulting extension reaction and PCR amplification using only the above primer (1) yield a double-stranded PCR product of a chimeric gene whose target sequence has an inverted repeat structure.
  • a chimeric gene whose target sequence has an inverted repeat structure can be obtained as a double-stranded PCR product without performing asymmetric PCR.
  • normal PCR symmetric PCR
  • the single-stranded PCR product extended from the primer (1) that is, the target sequence, adapter sequence, spacer sequence, and inverted adapter sequence are
  • the adapter sequence and the inverted adapter sequence contained in the single-stranded PCR product are identical.
  • the amplified product containing the inverted repeat structure of the above target sequence can be incorporated into an appropriate expression vector.
  • the integrated expression vector can be introduced into a host cell, for example, a plant cell.
  • a chimeric gene shown in FIG. 1 is produced according to the following steps (1)-(3). did.
  • An oligonucleotide having an inverted repeat structure which has a base sequence into which a spacer sequence can be inserted in the center, is synthesized with an inverted repeat adapter sequence, that is, a continuous sequence of an arbitrary adapter and its inverted adapter sequence.
  • an oligonucleotide (5 ′) that has a recognition sequence C C CGGG of the restriction enzyme Smal in the center and has A at the 3 ′ end
  • pGEM_T Easy Vector Promega
  • Fig. 13A TA cloning vector pGEM_T Easy Vector
  • Fig. 13C pGEMA
  • a spacer sequence was inserted in the center of the cloned inverted repeat sequence (FIGS. 13D to 13F).
  • the center of the inverted repeat sequence of pGEMA was cut with the restriction enzyme Smal (Fig. 13D) to obtain a spacer sequence.
  • a DNA fragment containing the intron sequence of the Arabidopsis thaliana FAD2 gene (Fig. 13E, SEQ ID NO: 4) was amplified by PCR and inserted with T4 DNA ligase to produce pGEMAS (Fig. 13F).
  • the region containing the deviso was excised with EcoRI, a restriction enzyme with recognition sequences on both sides of the oligonucleotide cloning site on the pGEM-T Easy Vector, and cleaved with EcoRI from pBluescript II KS Plus Middector (Stratagene).
  • the site was ligated using T4 DNA ligase to create pRNAi, which has a recognition sequence for the restriction enzyme EcoRV outside the adapter sequence side of the cassette construct (Fig. 14). Subsequently, the nucleotide sequence of pRNAi was confirmed by well-known means.
  • the target sequence was inserted outside one of the cassette constructs on pRNAi.
  • pGEM-T Easy Vector Invitrogen Corp.
  • Hyakunichiso ⁇ receptor type protein kinase gene cDNA Z8755, DDBJ Accession No. AU293996 , T. Demura Other: PNAS, 9 9, 15 ⁇ 94 - 15799 ) was inserted outside the adapter sequence.
  • the primer (primer A) and part of the spacer based on the base sequence of the vector immediately outside the target sequence insertion site and the DNA insertion site PCR was performed using a primer (primer B) based on the nucleotide sequence containing the inverted repeat structure on the opposite side.
  • primer A in excess of primer B, a double-stranded PCR product in which the target sequence took an inverted repeat structure across the cassette construct was produced.
  • primer A was used as the base sequence (CCCCTCGAGG TCGACGGTATCGATAAGCTTGAT) immediately outside the EcoRV recognition site of pBluescript II KS restriction enzyme and pENTR / D T0P0 vector (Invitrogen Oligonucleotide RNAiF (CACCCCTCGAGGTCGACGGTAT CGATAAGCTTGAT) containing a sequence (CA) with a sequence (CA) for cloning at a final concentration of 0.6 ⁇ mol / 1 was inverted as the primer B with the 3 'end of the spacer (CACCC). Oligonucleotide synthesized based on the complementary sequence of the adapter sequence (GGGTGA GTACCTGCAGGTAATATCT)
  • the reaction conditions were as follows: Plasmid (pRNAi-Z8755) in which about 2 ng of the target sequence (partial sequence of Z8755) was inserted into 50 ⁇ l of the reaction solution, 1 ⁇ l of heat-resistant DNA polymerase (KOD-Plus-) , 5Myu1 of 10X carbonochloridate Ffa, 2 ⁇ 1 in 25 mM MgSO 4, 5 ⁇ 1 of 2 mM dNTPs (or T0Y0B0 companies), 10Myumyu of 3 ⁇ 1
  • PCR was performed at 94 ° C for 15 seconds and at 68 ° C for 3 minutes and 30 seconds for 50 cycles.
  • the PCR product amplified by the PCR in the above (3) was subcloned into plasmid vectors by a well-known method, and it was confirmed by determination of the base sequence that the target sequence had an inverted repeat structure.
  • the pENTR / D T0P0 vector (Invitrogen) was used as the plasmid vector, and the nucleotide sequence was determined by the cycle sequence method.
  • This invention can be used in the technical field which produces a transformant, a knockout animal, and a plant by RNAi technology.
  • SEQ ID NO: 1 is a concatenation of an adapter sequence and its inverted sequence.
  • SEQ ID NOs: 2 and 3 are primers.
  • SEQ ID NO: 4 is a DNA sequence containing an intron sequence of Arabidopsis thaliana FAD2 gene.
  • SEQ ID NO: 5 is a partial DNA sequence of zinnia zealand cDNA (Z8755).

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Description

効率的な DNA逆位反復構造の調製方法 技術分野
本発明は、 遺伝子機能解析手段として用いられ、 また機能改変した変異体動植 物の作成に用いることができる RNA干渉の技術分野に関する。
さらに、 本発明は、 RNA干渉に用い明る標的遺伝子 DNA断片の逆位反復構造をもつ キメラ遺伝子を効率的に調製する方法及びそのためのカセットコンストラクトを 提供する。 書 背景技術
遺伝子の転写後の制御方法としては、 従来から、 アンチセンス法 （非特許文献 1 ) 及びセンス法 (非特許文献 2 ) が知られている。 しかしながら、 アンチセン ス、 及びセンス法両者とも、 形質転換体中での遺伝子制御の効率が十分なもので はな力つた。
近年になり、 まず、 線虫 （Caenorhabditis elegans) で、 二本鎖 RNA (dsRNA) が、 遺伝子の転写後発現の低下に、 アンチセンス RNA、 及びセンス RNAのいずれよ りも効果的であることが見出された。 この現象は、 RNAiと呼ばれている。 RNAiは、 RNase III核酸分解酵素フアミリーの一種である Dicerと名付けられた酵素が dsRNAを small interfering RNA又は siRNAと呼ばれる小さな断片に分解するとこ ろから始まるといわれている。
ところで、 哺乳類では、 ごく微量の dsRNAでも細胞内に導入すると、 インター フエロンが生成し、 アポトーシスを引き起こすといわれ、 そのため、 アポトーシ スを引き起こさない手法が研究された。 dsRNAの Dicerによる分解により生じる短 い dsRNAである siRNAは、 アポトーシスを引き起こさず、 転写後制御ができること が発見された。 さらに、 線虫の幾つかの遺伝子がヘアピン構造の RNAをコードし ており、 他の遺伝子を制御しているとの知見から、 siRNAに代わるものとして、 ヘアピン構造に折り畳んだ小さな RNAで特定遺伝子の機能を阻害できるか研究さ れた。 その結果、 short hairpin RNA (shRNA)は、 siRNAと同程度に遺伝子の発現 を制御できることが見出された。
転写後の遺伝子発現の低下には、 さらに、 効率的に転写後発現を抑制する方法 として、 標的遺伝子の DNA断片が逆位反復構造 （逆向きの繰り返し構造） をとる キメラ遺伝子を用いる方法 （非特許文献 3 ) が知られている。
この標的遺伝子 DNA断片の逆位反復構造をもつキメラ遺伝子を生体内に安定的 に導入し、 それによつて生体内で産生される dsRNAを引き金とする配列特異的な 内性 RNAの分解方法 （RNA干渉） は、 遺伝子機能の有効な解析手法として、 その利 用が広がっている。
また、 標的遺伝子 DNA断片の挿入に相同的遺伝子組換を応用した技術が報告さ れている （特許文献 1， 非特許文献 4 ) 。
特許文献 1 米国特許公開 20030049835号
非特許文献 1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 83 5372-5376 (非特許文献 3 中引用文献）
非特許文献 2 Plant Cell Vol. 2 p. 291 (非特許文献 3中引用文献） 特許文献 3 The Plant Journal Vol. 33， ρ· 793 - 800
特許文献 4 Plant J.， 27, 581 - 590, 2001 発明の開示
ところで、 従来の標的遺伝子 DNA断片 （標的配列） の逆位反復構造をもつキメ ラ遺伝子の作製技術では、 任意の、 主にはプラスミ ドベクター上の 2箇所に標的 配列をセンス方向とアンチセンス方向、 あるいは、 アンチセンス方向とセンス方 向に、 個別に揷入する必要がある。
一般的に、 この標的配列の挿入は制限酵素による DNAの切断反応とリガーゼに よる結合反応によって行われるが、 標的配列をセンス方向とアンチセンス方向あ るいはアンチセンス方向とセンス方向に正確に揷入するためには、 ベクター上の 2箇所の標的配列挿入部位にそれぞれ独立した制限酵素認識配列が存在し、 標的 配列にも標的配列挿入部位に対応する制限酵素認識配列が存在しなければならな い。 そのため、 標的配列の塩基配列によっては画一的な処理での標的配列の逆位反 復構造をもつキメラ遺伝子の作製が困難な場合があり、 網羅的な遺伝子機能の解 析には適していない。
また、 標的配列の揷入に相同的遺伝子組換を応用した技術が報告されている (Wesley et al. , Plant J.， 27， 581- 590， 2001 ;米国特許公開 20030049835) 。 この 技術では、 標的配列の両端に一対の相同的遺伝子組換酵素の認識配列を付与する 必要があり、 標的配列の両末端の塩基配列に特異的なオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として用いる PCRを行う力 \ ベクター上の一対の相同的遺伝子組換酵素認 識配列の間に標的配列を揷入しなければならない。 そして、 この相同的遺伝子組 換酵素の認識配列が付与された標的配列を用いて逆位反復構造をもつキメラ遺伝 子を作製するためには、 標的配列ごとに個別に相同的遺伝子組換え反応を行わな ければならない。
はじめに、 任意のスぺーサー配列を挟んで任意の塩基配列 （アダプター配列） 及び当該アダプター配列の逆位に反復した塩基配列 （逆位アダプター配列） が配 置した DNA構築物であるカセットコンス トラク ト、 又は当該カセットコンス トラ ク トを組み込んだプラスミ ドベクターを作製する。 次に、 カセットコンス トラク トの何れか一方又は両方の末端に標的遺伝子の DNA断片 （標的配列） を結合させ る、 又は当該プラスミ ドベクター上のカセットコンス トラク トの何れか一方の末 端の外側に標的配列を揷入する。 さらに、 標的配列を結合した当該カセットコン ストラタ トを鎳型とし、 標的配列の何れかの末端部分に対応する一種類のプライ マーを用いて PCRを行う、 又は、 標的配列が揷入された当該プラスミ ドベクター を铸型として、 上の標的配列揷入部位のさらに外側のプラスミ ドベクターの塩基 配列に対応するプライマー （プライマー A) および標的配列挿入部位とは逆側の ァダプター配列または逆位アダプター配列とスぺーサ一配列の一部を含む塩基配 列に対応するプライマー （プライマー B) を用いて PCRを行う。 この PCRの際に生 成される一本鎖の PCR産物の一部でアダプター配列と逆位アダプタ一配列の部分 が一時的に同一分子内でアニーリングし投げ縛構造をとるか、 2分子間で相互に アニーリングし、 さらに、 引き続いて起こる伸長反応と PCRにより、 標的配列が 逆位反復構造をとるキメラ遺伝子が二本鎖の PCR産物として得られる。 （図 1〜5 参照）
本発明によれば、 はじめに、 任意のスぺーサー配列を挟んで任意の塩基配列 (アダプター配列） 及ぴ当該アダプター配列の逆位に反復した塩基配列 （逆位ァ ダプター配列） が配置した DNA構築物であるカセットコンス トラク ト、 又は当該 カセッ トコンス トラタ トを組み込んだプラスミ ドベクターを調製しておけば、 標 的遺伝子の塩基配列に依存することなく、 効率的に、 同一の手法で、 図 1に示す ような標的配列の逆位反復構造をもつキメラ遺伝子を効率的に調製することがで きる。
今後、 RNAi法により、 種々の遺伝子を大量にノックアウトする場合には、 同一 手法で、 簡便に標的配列の逆位反復構造をもつキメラ遺伝子を作成できることが 必須であるところ、 本件発明は、 これを可能とする、 極めて有意義な発明である。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003-330569号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明によって作り出される標的配列の逆位反復構造の模式図 図 2は、 カセットコンス トラク トの調製手順その 1
図 3は、 カセッ トコンス トラク トの調製手順その 2
図 4は、 カセットコンス トラク トを組み込んだ標的配列の逆位反復構造作成用 プラスミ ドベクタ一の調製手順
図 5は、 標的配列の逆位反復構造を有するキメラ遺伝子の調製手順
図 6は、 標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 1の説明図
図 7は、 標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 2の説明図
図 8は、 標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 3の説明図
図 9は、 標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 4の説明図
図 1 0は、 標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 5の説明図
図 1 1は、 標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 6の説明図
図 1 2は、 カセットコンス トラク トを組み込んだ標的配列の逆位反復構造作成 用プラスミ ドベクタ一の修飾例 図 1 3は、 pGEMA 及ぴ pGEMASの調製法
図 1 4は、 pRNAiの調製法
図 1 5は、 標的配列 Z8755の pRNAiへの挿入
図 1 6は、 標的配列 Z8755の逆位反復構造を有するキメラ遺伝子の調製 発明を実施するための最良の形態
1 . カセットコンストラク ト
まず、 本発明は、 任意の配列 （スぺーサー配列、 又は介在配列） を挟んでこれ とは別の任意の塩基配列 （アダプター配列） 及び当該アダプター配列の逆位に反 復した塩基配列 （逆位アダプター配列） が配置した DNA構築物 （カセットコンス トラタ ト） を包含する。 （図 2〜3参照）
1 - 1 . スぺーサー配列 （介在配列）
スぺーサー配列は、 標的配列とアダプター配列とは関連しない （試験管内及ぴ 生体内で標的配列又はアダプター配列と相補的に結合しない） 塩基配列でなけれ ばならない。 例えば、 キメラ遺伝子の増幅で行う非対称 PCRの際に標的配列ゃァ ダプター配列と相補的にハイブリダィズしない任意の配列をスぺーサ配列として 用いることができる。 スぺーサー配列は （一本鎖 DNAまたは一本鎖 RNAの状態で同 一分子内の逆位に反復したアダプター配列同士が容易に相補的に会合するように、 また、 大腸菌内で容易に増幅するように） 好適には 10ヌクレオチド以上の 10000 ヌクレオチド以下、 さらに好適には、 50ヌクレオチド以上、 2000ヌクレオチド以 下の塩基長である。 スぺーサー配列として用いることができるものとしては、 具 体的には、 ォワンクラゲの緑色蛍光タンパク質 （GFP) や大腸菌の ダルクロニ ダーゼ （GUS) の構造遺伝子の部分断片、 さらに好適には、 （植物やショウジョ ゥバエなどの生体内でスプライシングにより取り除かれるように） イントロン配 列、 具体的には、 シロイヌナズナの脂肪酸不飽和化酵素 （FAD2) 遺伝子やショウ ジョゥバエの ABCトランスポーター遺伝子のイントロンを挙げることができる。
1 - 2 . アダプター配列
アダプター配列および逆位アダプター配列は、 標的配列、 スぺーサー配列、 さ らには用いるプラスミ ドベクターの塩基配列とは関連しない （試験管内おょぴ生 体内で、 標的配列、 スぺーサー配列、 さらには用いるプラスミ ドベクターの塩基 配列と相補的に結合しない） 塩基配列である。 好適には、 通常の PCRのァニーリ ング条件でアダプター配列と逆位アダプタ一配列が会合できる配列を用いる。 具 体的には、 通常 18〜28ヌクレオチド長で、 G C含量が 50〜60。/o、 Tm値が 55〜 80°Cになるように設計する。 さらに具体的には、 Koらによるローン ' リンカ一の 一方の配列をアダプター配列とし、 その相補配列を逆アダプター配列として用い ることができる。 ( o, M. S. Η.ら、 Nucleic Acids Res.， 18， p4293-4294, 1990) なお、 逆位アダプター配列は、 アダプタ一配列の完全な逆位配列でなくとも用 いることは可能であるが、 キメラ遺伝子の増幅で行う非対称 PCRの際に標的ァダ プター配列と相補的にハイブリダィズできることが必要である。
2— 1. カセットコンス トラク トの調製
上記カセットコンストラク トは、 周知の手段で、 調製することができる。 好適 には、 まず、 図 2に示されるように、 両端に平滑末端を有するスぺーサー配列を 調製する。 さらに、 その両端にアダプター配列および逆位アダプター配列として、 ローン · リンカーと呼ばれる非接着性の突出末端と平滑末端を持ったリンカー配 列を結合することができる。 ローン ' リンカ一としては、 例えば、 LL— S s e 838 7 I として、 LL一 S s e 8387 I A ( 5 ' 一 GAGATATTACC TGCAGGTACTC-3' ) 及び L L— S s e 8387 I B (5 ' 一 GAG TACCTGCAGGTAATAT- 3 ' ) 、 あるいは、 LL一 S a 1 Iとして、 L L- S a 1 I A (5 ' 一 ATTG AC GT C G AC T AT C C AGG— 3 ' ) 及び LL一 S a 1 I B (5， 一 C C T G G A T A G T C G A C G T C— 3 ' ) を 用いることができる （Ko，M.S.H.ら， Nucleic Acids Res. , 18, p4293-4294, 1990) 。 LL-S s e 8387 I A, B、 あるいは、 LL— S a l l A, Bをリン酸化し、 アニーリングさせる。 このアニーリングした L L一 S s e 8387 I、 あるいは、 LL一 S a 1 Iを平滑末端末端を有するスぺーサー配列に結合させる。 このよう に調製されたカセットコンス トラク トは PCR法により、 例えば、 LL—S s e 8 38 7 1、 あるいは、 LL— S a 1 I Aをプライマーとして増幅することができ る。
上記カセットコンス トラタ トの別な調製方法として、 周知の手段で、 プラスミ ドベクター上にカセットコンス トラタ トを構築し、 カセットコンス トラタ ト部分 を制限酵素反応などによって切り出すか、 P C R法によって増幅する方法を採用 することができる。 プラスミ ドベクター上にカセットコンス トラタ トを構築する 方法としては、 例えば、 図 3 Aに示されるように、 スぺーサー配列を挿入したプ ラスミ ドベクター上のスぺーサ一配列の両端にァダプタ一配列と逆位ァダプター 配列を、 周知の手段、 すなわち制限酵素反応とライゲーシヨン反応で順次挿入す ることができる。 或いは、 図 3 Bに示されるように、 アダプター配列と逆位ァダ プター配列が連続し、 その中央部に任意の制限酵素の認識配列が設けられたオリ ゴヌクレオチド及びその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドを調製し、 これらを ァニーリングさせた逆位反復アダプター配列を任意のプラスミ ドベクターに組み 込み、 その後に、 上記任意の制限酵素を用いて逆位反復アダプター配列の中央部 にスぺーサー配列を挿入することができる。 上記制限酵素としては、 アダプター 配列、 プラスミ ドベクター、 スぺーサー配列には認識部位が存在しない制限酵素 を用いることができるが、 好適には、 揷入するスぺーサー配列の両末端と付着末 端となる制限酵素を用いることができる。 上記プラスミ ドベクターとしては、 上 記オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端に 1ヌクレオチドのアデニン（A)を付加してお けば、 好適には、 T Aクローニング用のプラスミ ドベクター、 具体的には、 pGEM-T Easy Vector (Promega社） などを用いることができる。
2 - 2 . カセットコンストラク トが組み込まれた標的配列の逆位反復構造調製用 プラスミ ドベクターの調製
カセットコンス トラク トが組み込まれた標的配列の逆位反復構造調製用プラス ミ ドベクターは、 周知の手段で調製することができる。 例えば、 図 3に示された プラスミ ドベクター 3 A及びプラスミ ドベクター 3 Bのカセットコンストラク トに 近接したプラスミ ドベクタ一上に標的配列を揷入できる制限酵素認識部位を設け ておくことにより、 これらをカセットコンストラクトが組み込まれた標的配列の 逆位反復構造調製用プラスミ ドベクターとして用いることができる。 或いは、 図 4で示したように 2— 1で調製したカセットコンストラタ トを任意のプラスミ ド ベクターに組み込むときにカセットコンス トラタ トに近接したプラスミ ドベクタ 一上に平滑末端を生じる制限酵素認識部位を設けておくこと等により、 標的配列 を簡単に挿入できる標的配列の逆位反復構造調製用プラスミ ドベクターを設計す ることができる。
また、 カセットコンス トラク トを組み込んだプラスミ ドベクターは、 任意の動 植物の cDNA、 好適には均一化した cDNAを基にした多種類の遺伝子 DNA断片が逆位 反復構造をとるキメラ遺伝子のプールの調製に用いることができる。
2 - 3 . 標的配列のカセットコンス トラク トへの結合及ぴカセットコンス トラタ トが組み込まれた標的配列の逆位反復構造調製用プラスミ ドベクターへの挿入 標的配列は、 [特許文献 1 ]に従い選択することができる。 例えば、 標的配列は、 表現型の発現を抑制しょうとする標的となる遺伝子の DNA断片を用いることがで きる。 標的配列の長さは 1 0ヌクレオチド長から標的遺伝子の表現型発現が抑制 されるのに十分なヌクレオチド長、 好適には、 最低 1 9ヌクレオチド長、 最低 2 1ヌクレオチド長、 最低 2 5ヌクレオチド長、 最低約 5 0ヌクレオチド長、 最低 約 1 0 0ヌクレオチド長、 最低約 1 5 0ヌクレオチド長、 最低約 2 0 0ヌクレオ チド長又は最低約 5 0 0ヌクレオチド長で、 可能ならば約 1 0 0 0ヌクレオチド 長の標的配列を用いることができる。
標的配列は、 カセットコンス トラタ トの何れか一方又は両方の末端に結合され る。 このとき、 好適には、 標的配列として両末端が平滑でリン酸化されていない ものを用いることができる。 このような標的配列は、 5 ' 末端が脱リン酸化され たプライマーのセッ 卜と 3， 末端に（dA)を付加しないタイプの耐熱性 DNAポリメラ ーゼを用いた PCRを行う、 或いは、 通常の耐熱性ポリメラーゼを用いて PCRを行つ た後 3' 末端の（dA)突出を周知の手段で除去し、 更に PCR産物を脱リン酸化する、 或いは、 5 ' 末端がリン酸化されたプライマーのセットと 3 ' 末端に（dA)を付加し ないタイプの耐熱性 DNAポリメラーゼを用いて PCRを行った後 PCR産物の 5' 末端を 脱リン酸化することで、 調製することができる。
標的配列は、 カセットコンス トラタトが組み込まれた標的配列の逆位反復構造 調製用プラスミ ドベクターのアダプター配列又は逆位アダプター配列の外側に揷 入される。 好適には、 プラスミ ドベクター上のカセットコンス トラタ の一方の 外側にのみ認識配列が存在する制限酵素を用いて、 カセットコンス トラク トの一 方の外側に、 標的遺伝子の DNA断片を挿入する標的遺伝子の DNA断片を挿入する。 さらに好適には、 カセットコンス トラタ トのいずれか一方の直近の外側に標的遺 伝子を挿入する。 例えば、 平滑末端を形成する制限酵素の認識配列がアダプター 配列の外側に存在する場合は、 当該制限酵素で、 プラスミ ドベクターを切断し、 平滑末端を有する標的配列とリガーゼで結合させることができる。 もちろん、 ァ ダプター配列の外側に他の制限酵素認識配列が存在する場合、 プラスミ ドベクタ 一と標的配列を同じ制限酵素で処理して、 付着末端同士で結合させればよい。
2 - 4 . カセットコンストラク トの修飾 (カセッ トコンス トラク トの一方又は両 方の末端への標的配列の結合のための前処理）
標的配列のカセットコンス トラタ トへの結合を容易にするため、 また、 標的配 列を結合したカセットコンス トラク トを铸型とした PCRによる標的配列の逆位反 復構造の作製を容易するために、 カセットコンス トラタトの一方又は両方の末端 に前処理として修飾を施すことができる。
このような標的配列結合容易化カセットコンストラク トとしては、 次のものが 図 6に示す標的配列結合容易化カセットコンストラク ト 1 (以下 CC 1と略） は、 両 5 ' 末端をリン酸化することによって、 両末端が脱リン酸化された標的配列の 結合が可能になるよう設計されている。 これは 3 ' 末端に（dA)を付加しないタイ プの耐熱性 DNAポリメラーゼ、 例えば K0D- Plus- (T0Y0B0社） を用いれば、 容易に 調製できる。 図 7に示す標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト 2 (CC2) は一方の末端のみをリン酸化することでカセッ トコンス トラク トの一方にしか両 末端が脱リン酸化された標的配列が結合しないように設計したものである。
また、 図 8中の標的配列結合容易化カセットコンストラク ト （CC3) は、 CC1の 両 3， 末端に（dT)を付加することによって、 カセットコンストラクトの両 3 '末端 に、 3 ' 末端に（dA)を付加する通常の耐熱性 DNAポリメラーゼで増幅した両末端が 脱リン酸化された標的配列が結合するように設計されている。
図 9中の標的配列結合容易化カセットコンストラク ト （CC4) は、 一方の 3' 末 端のみに（dT)の付カ卩とリン酸化を施すことによって、 カセットコンストラク トの 一方の 3 '末端にのみ、 3 ' 末端に（dA)を付加する通常の耐熱性 DNAポリメラーゼ で増幅した両末端が脱リン酸化された標的配列が結合するように設計されている。 図 1 0中の標的配列結合容易化カセットコンストラク ト （CC5) は、 一方の 3 ' 末端のみにトポィソメラーゼ I (Invitrogen社） の付加とリン酸化を施すことに よって、 カセットコンス トラク トの一方にのみ標的配列が容易に結合するように 設計されている。
図 1 1中の標的配列結合容易化カセットコンス トラク ト （CC6) は、 一方の 3 ' 末端のみに（dT)と トポイソメラーゼ Iの付加とリン酸化を施すことによって、 力 セットコンス トラク トの一方にのみ、 3' 末端に（dA)を付加する通常の耐熱性 DNA ポリメラーゼで増幅した両末端が脱リン酸化された標的配列が結合するように設 計されている。
2 - 5 . カセットコンス トラク トが組み込まれた標的配列の逆位反復構造調製用 プラスミ ドベクターの修飾
カセットコンストラタ トが組み込まれた標的配列の逆位反復構造調製用プラス ミ ドベクターへの標的配列の挿入を容易にするために、 逆位反復構造調製用ブラ スミ ドベクターを制限酵素等で開裂し、 その末端に、 標的配列の揷入を容易化す る処理を施すことができる。 具体的には、 図 1 2中の pRNAi/blantのように開裂 末端を平滑化する、 図 1 2中の pRNAiTのように開裂末端の 3 ' 末端に（dT)を付加 する、 図 1 2中の pRNAiTPのように開裂末端の 3' 末端にトポイソメラーゼ Iを付 加する、 図 1 2中の pRNAiTTPのように開裂末端の 3 ' 末端に（dT)と トポイソメラ ーゼ Iを付加する、 ことができる。
3 . キメラ遺伝子の増幅
図 6〜 1 1に示すように標的配列がカセットコンス トラタ トの何れか一方又は 両方の末端に結合した DNA生成物を鎵型として、 任意の遺伝子増幅法により、 特 に好適には、 標的配列の一方の末端に特異的なプライマー （Primer Iまたは II) のみを用いた PCR法により、 標的配列がカセットコンス トラク トを挟んで逆位反 復構造をとるキメラ遺伝子を調製することができる。 具体的には、 熱変性による 一本鎖 DNA構造物の生成、 Primer I又は IIを用いた PCR、 を行えばよい。 また、 こ れら図 6〜 1 1では標的配列に特異的なプライマーを用いた PCRの例を示したが、 周知の手段で cDNAゃゲノム DNAの DNA断片の両端に相互に異なるリンカー （又はァ ダブター） を結合させることができ、 この場合、 標的配列に特異的なプライマー の代わりにリンカ一 (又はアダプター) 部分のプライマーセットを使うことがで きる。
また、 標的配列がカセットコンス トラタ トのどちらかの外側の一方に挿入され たプラスミ ドベクターを鎳型として用いて、 任意の遺伝子増幅法により、 特に好 適には、 非対称 PCR法 （一方のプライマーを他方のプライマーに対して過剰に使 用して行う P C R、 標準技術集 「核酸の増幅及び検出」 4一 1一 2— 6 非対称 的増幅） により、 標的配列がカセッ トコンス トラク トを挟んで逆位反復構造をと るキメラ遺伝子を調製することができる。 プライマーとしては、 （1 ) 挿入した 標的配列に対し当該カセットコンストラク トとは反対側のプラスミ ドベクター部 分、 及び （2 ) アダプター配列又は逆位アダプター配列のいずれか一方であって 当該標的配列から遠い方の配列およびそれに隣接するスぺーサ一配列の一部を含 むように設計されたオリゴヌクレオチド、 のセットを用いる。 非対称 PCR法を用 いる場合には、 上記 （1 ) のプライマーを （2 ) のプライマーよりも、 好適には 5倍以上、 あるいは 1 0倍以上、 あるいは約 1 0 0倍以上使用することができる。 なお、 キメラ遺伝子の増幅後に種々のベクターへの組み込みが容易になるよう に、 プライマーの 5 ' 側には数塩基の任意の配列を含んでいてもよい。
上記の非対称 PCRを行うことにより、 標的配列、 アダプター配列、 スぺーサー 配列、 逆位アダプター配列が順次連結した一本鎖の PCR産物が過剰に増幅される。 この一本鎖の PCR産物に含まれるアダプター配列と逆位アダプター配列の部分が 一時的に同一分子内でアニーリングし投げ緙構造をとるか、 2分子間で相互にァ ニーリングし、 さらに、 引き続いて起こる伸長反応と上記プライマー （1 ) のみ による PCR増幅により、 標的配列が逆位反復構造をとるキメラ遺伝子が二本鎖の PCR産物として得られる。
また、 非対称 PCRを行わずに標的配列が逆位反復構造をとるキメラ遺伝子が二 本鎖の PCR産物を得ることができる。 例えば、 通常の PCR (対称 PCR) を行い、 そ の後、 上記プライマー （1 ) から伸長した一本鎖の PCR産物、 すなわち、 標的配 列、 アダプター配列、 スぺーサー配列、 逆位アダプター配列が順次連結した一本 鎖の PCR産物のみを回収して、 上記プライマー （1 ) のみによる PCRを行うと、 こ の一本鎖の PCR産物に含まれるアダプター配列と逆位アダプター配列の部分が一 時的に同一分子内でアニーリングし投げ絹構造をとるか、 2分子間で相互にァニ 一リングし、 さらに、 引き続いて起こる伸長反応と上記プライマー (1) のみに よる PCR増幅により、 標的配列が逆位反復構造をとるキメラ遺伝子が二本鎖の PCR 産物として得られる。
4. 発現べクタ一^ "の組み込み ·形質転換体の作成
上記の標的配列の逆位反復構造を含む増幅物は、 適宜の発現ベクターに組み込 むことができる。
組み込まれた発現ベクターは、 宿主細胞、 例えば、 植物細胞に導入することが できる。
以下に実施例により具体的に説明する。
ただし、 本発明、 本実施例により限定されるものではない。
[実施例]
実施例 1
本発明による、 標的遺伝子の DNA断片 （標的配列） の逆位反復構造をもつキメ ラ遺伝子作製の一実施例として、 図 1に示すキメラ遺伝子を以下の工程（ 1 )一 (3)の通り作製した。
(1) pRNAiの作製
中央にスぺーサー配列を揷入できる塩基配列を有し、 逆位反復構造をもつオリ ゴヌクレオチドを逆位反復アダプター配列、 すなわち、 連続した任意のアダプタ 一配列とその逆位アダプター配列を合成する。 ここでは、 中央に制限酵素 Smalの 認識配列 C C CGGGを有し、 3' 末端に Aを付与したオリゴヌクレオチド （5'
CCTGCAGGTAATATCTCA— 3 ' ) を合成し、 このオリゴヌクレオ チドをアニーリング後 (図 1 3B) 、 プラスミ ドベクターにクローニングした。 ここでは、 アニーリングにより両 3' 末端に（A)突出ができるため、 これを市販の
TAクローニングベクター pGEM_T Easy Vector (Promega社） （図 1 3 A) にクロー ニングし、 pGEMAを作製した （図 1 3C) 。 さらに、 クローニングした逆位反復配 列の中央にスぺーサー配列を揷入した （図 1 3D〜F) 。 ここでは、 制限酵素 Smal により pGEMAの逆位繰返し配列の中央を切断し （図 13D) 、 スぺーサー配列とし てシロイヌナズナ FAD2遺伝子のィントロン配列を含む DNA断片 （図 1 3 E、 配列番 号 4) を PCRにより増幅後、 T4 DNAリガーゼにより挿入し、 pGEMASを作製した (図 1 3 F) 続いて、 カセッ トコンス トラタ トを含む領域を pGEM- T Easy Vector上のオリゴヌクレオチドのクローニングサイ トの両側に認識配列が存在す る制限酵素 EcoRIで切 り 出し、 pBluescript II KSプラス ミ ドベク ター (Stratagene社）の EcoRI開裂部位に T4 DNA ligaseを用いて揷入連結し、 カセット コンス トラタ トのアダプタ一配列側の外側に制限酵素 EcoRVの認識配列が存在す る pRNAiを作製した （図 14) 。 続いて、 周知の手段で pRNAiの塩基配列を確認し た。
(2) 標的遺伝子 DNA断片 （標的配列） の pRNAiへの揷入
pRNAi上のカセットコンス トラタ トの一方の外側に標的配列を挿入した。 ここ では、 pGEM-T Easy Vector (Invitrogen社) にクローニングされたヒャクニチソ ゥのレセプター型プロテインキナーゼ遺伝子の cDNA (Z8755, DDBJ Accession No. AU293996, T. Demura他： PNAS， 99, 15ァ94 - 15799) の一部をアダプター配列の外 側に挿入した。 まず、 ベクター上のクローニングサイ トの外側の配列に対応する プライマーのセッ ト、 Forward primer (TGTAAAACGACGGCCAG T) および Reverse primer (CAG -AAACAijCTAT -ACC) 、 ¾r用レヽ て PCRにより Z8755の cDNAを含む DNA断片を増幅し、 制限酵素 Afalを用いて平滑末 端をもつ部分 DNA断片を調製した （配列番号 5) 。 これを pRNAiの制限酵素 EcoRV 開裂部位に T4 DNA ligaseを用いて挿入連結した （図 1 5) 。
(3) 標的配列の逆位反復構造をもつキメラ遺伝子の作製
標的配列を挿入したプラスミ ドを铸型として、 標的配列挿入部位のすぐ外側の ベクターの塩基配列をもとにしたプライマー （プライマー A) 及ぴスぺーサ一の 一部と DNA揷入部位とは逆側の逆位反復構造を含む塩基配列をもとにしたプライ マー （プライマー B) を用いて PCRを行った。 この際、 プライマー Aをプライマー B に比べて過剰に用いることで、 標的配列がカセットコンス トラク トを挟んで逆位 反復構造をとる二本鎖の PCR産物がつく られた。 この現象は、 PCRの際に生成され る一本鎖の PCR産物の一部でアダプター配列と逆位アダプター配列の部分が一時 的に同一分子内でアニーリングし投げ縟構造をとるか、 2分子間で相互にァニー リングし、 さらに、 引き続いて起こる伸長反応と PCRにより引き起こされると考 えられる。 ここでは、 図 1 6に示したように、 プライマー Aとして、 pBluescript II KSの制限酵素 EcoRV認識部位の直近の外側の塩基配列 （CCCCTCGAGG TCGACGGTATCGATAAGCTTGAT) とその 5' 末端に pENTR/D T0P0 vector (Invitrogen社） にクローニングするための配列 （CA) を付カロし たオリゴヌクレオチド RNAiF (CACCCCTCGAGGTCGACGGTAT CGATAAGCTTGAT) を 0.6 μ mol/1の最終濃度で、 プライマー Bとして スぺーサ一の 3' 末端 （CACCC) と逆位アダプター配列の塩基配列 （GGGTGA GTACCTGCAGGTAATATCT) の相補鎖をもとに合成したオリゴヌ
C C CGGGTG) を 0.06μηιο1/1の最終濃度で用いた。 また、 反応条件は、 反 応液 50 μΐ中に、 約 2ngの標的配列 （Z8755の部分配列） を挿入したプラスミ ド (pRNAi- Z8755) 、 1 μ 1の耐熱性 DNAポリメラーゼ （KOD- Plus- ) 、 5μ1の 10Xノく ッファー、 2^ 1の 25mM MgS04、 5^1の 2mM dNTP (以上 T0Y0B0社） 、 3μ1の 10μΜ
RNAiF, 3/ 1の 1 μ M RNAiRが含まれ、 94°Cで 2分の熱変性のあと、 94°C15秒、と 68°C3分 30秒を 50サイクノレの PCRとした。
(4) 標的配列の逆位反復構造をもつキメラ遺伝子のサブクローニング
上記 （3) の PCRによって増幅された PCR産物を、 周知の手段で、 プラスミ ドべ クタ一にサブクローニングして、 標的配列が逆位反復構造をとっていることを塩 基配列の決定により確認した。 ここでは、 プラスミ ドベクターとして pENTR/D T0P0 vector (Invitrogen社） を用い、 塩基配列の決定はサイクルシーケンス法 を用いた。 産業上の利用可能性
本発明は、 RNAi技術により形質転換体、 ノックアウト動物、 植物を作出する技 術分野において用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 1は、 アダプター配列及びその逆位配列の連結物である。 配列番号 2 及び 3は、 プライマーである。 配列番号 4は、 シロイヌナズナ FAD2遺伝子のイン トロン配列を含む DNA配列である。 配列番号 5は、 ヒャクニチソゥ cDNA (Z8755) の部分 DNA配列である。

Claims

請求の範囲
I. アダプター配列、 スぺ一サー配列、 及ぴアダプター配列の逆位配列から なる標的配列の逆位反復配列調製用カセッ トコンス トラク ト。
2. スぺーサー配列が、 イントロン配列である請求項 1記載のカセッ トコン ストラタ ト。
3. 一方又は両方の末端に標的配列の結合のための前処理がなされた請求項 ：!〜 2いずれか 1項記載のカセットコンストラタ ト。
4. 一方又は両方の末端に標的配列が結合してなる請求項 1〜 3の何れか一 項に記載のカセットコンス トラタ ト。
5. 請求項 4に記載のカセットコンス トラク トを錶型として、 標的配列のど ちらか一方の末端の配列に由来する単一のプライマーを用いた PCRを行い、 標的 配列の逆位反復構造を含む増幅産物を調製する方法。
6. 請求項 4記載のカセットコンス トラク トを铸型として、 PCRにより標 的配列の逆位反復構造を調製する方法。
7. 請求項 4記載のカセットコンス トラク トを組み込んだプラスミ ド。
8. 請求項 7記載のプラスミ ドを錶型に、 PCRを行い、 標的配列の逆位反 復構造を調製する方法。
9. PCRが非対称 P C Rである請求項 8記載の標的配列の逆位反復構造を 調製する方法。
10. P CRで用いるプライマーの一方の 3 ' 末端がスぺーサ一部分を含む 請求項 8又は 9記載の方法。
I I. 請求項 5, 6， 8、 9又は 1 0いずれか 1項記載の方法で調製された 標的配列の逆位反復構造を含む発現ベクター。
1 2. 請求項 1 1記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
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