WO2005026390A1 - 蛍光性分子のモノマー蛍光とエキシマー蛍光のスイッチングを利用した分子ビーコンを用いるｄｎａ検出法 - Google Patents

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fluorescent organic
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bases
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Masahiko Inouye
Kazuhisa Fujimoto
Hisao Shimizu
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Japan Science And Technology Agency
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • DNA detection method using molecular beacon using switching between monomer emission and excimer emission of fluorescent molecule
  • the present invention relates to a molecular beacon that can be used for detecting a complementary strand DNA sequence and for detecting an SNP, and a method for detecting a complementary strand DNA sequence and a method for detecting an SNP using the molecular beacon.
  • a conventional molecular beacon is a single-stranded oligonucleotide having a hairpin norape structure in which one end has a fluorescent organic group and the other end has a quenching organic group covalently bonded thereto.
  • the fluorescent organic group and the fluorescent organic group are formed because the sequence is capable of forming the terminal force of the molecular beacon.
  • the quenching organic group is located in the vicinity of the position where fluorescence resonance energy transfer (FRET) is performed. Then, the light emitted from the fluorescent organic group is quenched by the quenching organic group.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the oligonucleotide chain having the test sequence By causing the oligonucleotide chain having the test sequence to coexist with the conventional molecular beacon, a double chain is formed with the loop region of the molecular beacon, and the fluorescent organic group and the quenching organic group cannot be subjected to FRET. It will be located at a distance. As a result, the light emission derived from the fluorescent organic group is restored.
  • the molecular beacon can also detect SNP, and when the test oligonucleotide has a complementary sequence except for the base, the luminescence derived from the fluorescent organic group does not recover.
  • Non-patent literature l Tyagi, S .; Kramer, F.R.Nat. Biotechnol. 1996, 14, 303-308
  • Non-Patent Document 2 Tyagi, S .; Marras, SAE; Kramer, FR Nat. Biotechnol. 2000, 18, 1191-1196
  • Non-Patent Document 3 Tan, W .; Fang, X ⁇ ; Li, J .; Liu, X. Chem. Eur. J. 2000, 6, 1107-1111
  • Non-Patent Document 4 Zhang, P .; Beck'T ;; Tan, W. Angew. Chem., Int.Ed. 2001, 40, 402-405.
  • the present inventor has made intensive studies to overcome the above-mentioned problems and to provide a more accurate DNA detection molecule by employing a detection system different from the conventional molecular beacon.
  • both ends of a single-stranded oligonucleotide having a hairpin loop structure are modified with the same kind of fluorescent organic group, particularly a fluorescent organic group capable of forming an excimer.
  • the present invention relates to a molecular beacon characterized in that:
  • a second aspect of the present invention relates to a method for synthesizing the molecular beacon.
  • a complementary strand DNA detection method for detecting a test oligonucleotide sequence by switching from excimer luminescence derived from a fluorescent organic group to monomer luminescence, and
  • the invention's effect [0011]
  • a test oligonucleotide sequence can be detected with extremely high accuracy and sensitivity. Furthermore, in the case of a test oligonucleotide containing one non-complementary sequence, switching from excimer emission to monomer emission does not occur, and thus can be used for SNP detection.
  • FIG. 1 shows the structure of a molecular beacon of the present invention.
  • FIG. 2 shows a synthesis example of a fluorescent organic group seed derivative used in the synthesis method of the present invention.
  • FIG. 3 shows a state of switching between monomer luminescence and excimer luminescence accompanying a temperature change of the molecular beacon of the present invention.
  • FIG. 4 shows the results of complementary strand DNA detection using the molecular beacon of the present invention.
  • FIG. 5 shows the results of SNP detection using the molecular beacon of the present invention.
  • the molecular beacon of the present invention is a DNA probe molecule capable of highly selective detection of base pair mismatch. Its structural feature is that both ends of a single-stranded oligonucleotide having a hairpin loop structure are modified with the same kind of fluorescent organic group.
  • the type of such a fluorescent organic group is not particularly limited as long as it is a fluorescent organic group capable of forming an excimer.
  • FIG. 1 shows the structure of the molecular beacon of the present invention.
  • Examples of the fluorescent organic group that can be used in the molecular beacon of the present invention include pyrene or a pyrene derivative, naphthalene-based, fluorene-based, and cyanine-based dyes.
  • the number of bases constituting the single-stranded oligonucleotide is not particularly limited. However, from the viewpoint of detection sensitivity and the like, usually 24 to 34, preferably 26 to 32 bases are used. Have. Furthermore, the hairpin loop region that hybridizes with the complementary oligonucleotide in the DNA molecule to be detected usually has 15 to 22, preferably 17 to 20 bases.
  • the fluorescent organic groups can occupy a spatial position where they can associate with each other by hydrophobic interaction.
  • the fluorescent organic group is connected to the 5 ′ and 3 ′ ends of the single-stranded oligonucleotide via a spacer having an appropriate structure and length. It is preferable that they are bonded together.
  • the structure and length of the spacer are not particularly limited as long as the molecular beacon of the present invention has a structure satisfying the above conditions.
  • at least one of the spacers at the 5 'and 3' ends of the molecular beacon can include a methylene group of 2-8 carbon atoms.
  • constituent elements such as an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom can be included in the spacer.
  • the molecular beacon of the present invention is synthesized by an arbitrary method known to those skilled in the art by appropriately selecting appropriate starting materials, intermediates, reaction conditions, and the like according to the type of the fluorescent organic group used and the like. You can do it.
  • a phosphoramidite derivative of a fluorescent organic group can be used as a derivative for modifying the 5 ′ terminal
  • a succinimidyl derivative of a fluorescent organic group can be used as a derivative for modifying the 3 ′ terminal.
  • phosphoramidite derivatives and succinimidyl derivatives can be synthesized from methyl esters of fluorescent organic groups. Specifically, as in the examples, phosphoramidite derivatives and succinimidyl derivatives are synthesized using 3-pyrenylpropionic acid methyl ester.
  • a fluorescent organic group can be bound to the 3 ′ end by reacting the succinimidino derivative with the amino group at the 3 ′ end.
  • test oligonucleotide sequence or SNP contained in the test oligonucleotide sequence is switched from excimer emission derived from a fluorescent organic group to monomer emission. It is characterized by detecting.
  • fluorescent oligonucleotides are associated with each other by the hydrophobic action of the fluorescent organic groups.
  • the degree of complementarity between the oligonucleotide sequences can be determined by detecting the switching from excimer emission to monomer emission from the fluorescent organic group in the molecular beacon, which is caused by the destruction of the complex.
  • Oligonucleotide system IJ) or SNP contained in the oligonucleotide sequence can be detected.
  • the length of the test oligonucleotide sequence that can be detected by the detection method of the present invention although it substantially corresponds to the length of the base sequence of the hairpin loop region in the molecular beacon to be used, it usually has a base force of 15 to 22, preferably 17 to 20.
  • Two types of pyrene derivatives are synthesized to bind a fluorescent organic group capable of forming excimers at both 3 'and 5' ends of a single-stranded oligonucleotide consisting of 29 bases, for example, pyrene here. did. That is, as shown in FIG. 2, 3-pyrenylpropionic acid methyl ester is used as a common intermediate, a phosphoramidite derivative (1) is used as a derivative for modifying the 5 ′ terminal, and a phosphoramidite derivative (1) is used as a derivative for modifying the 3 ′ terminal.
  • a succinimidyl derivative (2) was synthesized as a derivative.
  • silica gel pretreated in 50: 1 use hexane: CH C1 (6: 1) as eluent)
  • Modification of the 5 'end of a single-stranded oligonucleotide (DNA) consisting of 29 bases with the fluorescent organic group can be carried out using a DNA automatic synthesizer according to a conventional method using the phosphoramidite derivative (1).
  • the reaction was carried out by reacting
  • the obtained single-stranded DNA molecule consisting of 29 bases modified at the 5 'end was analyzed by HPLC using a COSMOSIL 5C-MS-II column (4.6 x 150 mm; Hanoi Tester).
  • the DNA molecules were eluted at a rate of 1.0 mL / min using 0.05M ammonium formate and acetonitrile linear gradient (5-85%) as eluent.
  • the obtained aqueous phase was subjected to the above conditions (however, a linear gradient of acetonitrile (5-85%)). Purification by HPLC yielded the molecular beacon of the present invention (see (3) in FIG. 1). The obtained molecular beacon was confirmed and identified by an absorption wavelength derived from pyrene (det: 340 nm) and an absorption wavelength derived from nucleic acid ( ⁇ det: 254 nm).
  • a fluorescent group capable of modifying both 3 ′ and 5 ′ terminals can be obtained from the same starting material, and the synthesis method of the molecular beacon has been simplified.
  • T of the molecular beacon to which the fluorescent organic group synthesized in Example 1 was covalently bonded was determined according to a conventional method.
  • the molecular beacon of the present invention prepared in Example 1 had a T of 59 ° C.
  • m 59 ° C.
  • the T of the unmodified oligonucleotide base consisting of 29 bases having no pyrene units at both ends was 46 ° C. This result indicates that the two fluorescent organic groups (here, pyrene)
  • excimer emission is prioritized at a temperature lower than T.
  • the fluorescence spectrum has a temperature range of 10-90 ° C (
  • oligonucleotide having a complementary sequence of 19 bases was added at 25 ° C, and the mixture was stirred for about 15 minutes until the fluorescence spectrum did not change any more. Excitation was performed at 345 nm, and measurement was performed in the range of 300 nm to 650 nm. The excimer luminescence disappeared when almost the same amount was reached, and switched to monomer luminescence. Even if an equivalent amount or more of an oligonucleotide having a complementary sequence was added, the intensity of monomer emission did not increase any more, confirming that the molecular beacon was a very highly selective DNA probe molecule.
  • the molecular beacon according to the present invention has selectivity for detecting only one specific base sequence in all species.
  • the simplification and simplification of the synthesis of molecular beacons have been successfully performed by utilizing the switching between monomer emission and excimer emission of a fluorescent organic group capable of forming excimers.
  • the molecular beacon is a highly sensitive DNA probe molecule that responds to almost the same amount of oligonucleotides of the test sequence, and uses the molecular beacon to detect base-pair mismatches at low concentrations with high selectivity. It is possible.

Abstract

従来の分子ビーコンを使用するＤＮＡ検出システムとは異なる、より高精度なDNA検出分子を提供することが可能な手段及び方法を提供すること。 被検オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる一本鎖オリゴヌクレオチドの3'及び5'両末端にエキシマー形成可能な蛍光性有機基を結合させ、モノマー発光とエキシマー発光のスイッチングを利用した分子ビーコン、及び該分子ビーコンを用いる相補鎖DNA配列検出方法ならびにSNP検出方法。

Description

明 細 書
蛍光性分子のモノマー発光とエキシマー発光のスイッチングを利用した 分子ビーコンを用いる DNA検出法
技術分野
[0001] 本発明は、相補鎖 DNA配列検出用及び SNP検出用に使用することができる分子ビ 一コン、並びに、該分子ビーコンを使用する相補鎖 DNA配列検出方法ならびに SNP 検出方法に関する。
背景技術
[0002] 従来の分子ビーコンは、ヘアピンノレープ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの 両末端に、一方は蛍光性有機基を、他方は消光性有機基を共有結合したものである 。ループ領域と二重鎖形成可能な配列を有する被検オリゴヌクレオチド鎖が不在の 時は、分子ビーコンの末端力^テムを形成可能な配列となっていることにより、該蛍 光性有機基と該消光性有機基が蛍光共鳴エネルギー移動 (Fluorescence Resonance Energy Transfer;FRET)する近接位に存在することになる。そこで該蛍光性有機基由 来の発光は、該消光性有機基により消光される。被検配列を有するオリゴヌクレオチ ド鎖を従来の分子ビーコンと共存させることにより、分子ビーコンのループ領域と二重 鎖を形成し、該蛍光性有機基と該消光性有機基が FRETの不可能な距離に位置する ことになる。その結果、該蛍光性有機基由来の発光が復活する仕組みである。分子 ビーコンは、 SNPの検出も可能であり、被検オリゴヌクレオチドがー塩基を除いて相補 的な配列を有する場合において、該蛍光性有機基由来の発光は復活しない。
[0003] また、従来のエキシマー発光 (同種の蛍光性有機分子の基底状態一分子と励起状 態一分子が錯形成したもので、モノマー発光に比べ長波長側に発光を有する)を利 用した DNAプローブ分子は、エキシマー形成可能な蛍光性有機基を共有結合させ た二種類のプローブ分子を用いて、被検相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと 三元系錯体を形成させるものである。
[0004] 非特許文献 l : Tyagi, S. ; Kramer, F.R. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 303-308
非特許文献 2 : Tyagi, S. ; M arras, S.A.E. ; Kramer, F.R. Nat. Biotechnol. 2000, 18， 1191-1196
非特許文献 3 : Tan, W. ; Fang, X· ; Li, J. ; Liu, X. Chem. Eur. J. 2000， 6, 1107-1111 非特許文献 4 : Zhang, P.; Beck'T. ; Tan, W. Angew. Chem., Int.Ed. 2001, 40, 402-405
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] し力 ながら、従来の分子ビーコンを細胞内で使用する際に、消光性有機基ではな い消光性分子による消光や、蛍光性有機基の離脱という不慮の事態を判別すること は不可能である。また、三元系錯体形成を利用したエキシマー発光 DNAプローブ分 子の場合には、分子ビーコンをはじめとする二元系プローブ分子に比べ、エントロピ 一的損失が大きぐ錯体の形成能力が弱いことが問題となる。
[0006] 本発明者は、上記の問題点を克服し、従来の分子ビーコンとは異なる検出システム を採用することにより、より高精度な DNA検出分子を提供するために鋭意研究を行つ た。
[0007] その結果、被検オリゴヌクレオチドとハイブリダィズさせる一本鎖オリゴヌクレオチド の 3'及び 5'両末端に、エキシマー形成可能な蛍光性有機基を結合させ、モノマー発 光とエキシマー発光のスイッチングを利用した分子ビーコンを開発し、本発明を完成 させた。
課題を解決するための手段
[0008] 即ち、本発明は、第一の態様として、ヘアピンループ構造を有する一本鎖オリゴヌ クレオチドの両末端が同種の蛍光性有機基、特に、エキシマー形成可能な蛍光性有 機基で修飾されていることを特徴とする分子ビーコンに係る。
[0009] 本発明の第二の態様として、該分子ビーコンの合成法に係る。
[0010] 更に、第三の態様として、被検オリゴヌクレオチド配列を蛍光性有機基由来のェキ シマー発光からモノマー発光へのスイッチングで検出する相補鎖 DNA検出法及び
SNP検出法に係る。
発明の効果 [0011] 本発明の分子ビーコンを用いることにより、被検オリゴヌクレオチド配列を非常に高 い精度かつ感度で検出できる。さらに、相補的でない配列を 1塩基含む被検オリゴヌ クレオチドの場合には、エキシマー発光からモノマー発光へのスイッチングが起こら ないので、 SNP検出法に使用することが出来る。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]本発明の分子ビーコンの構造を示す。
[図 2]本発明の合成法で使用される蛍光性有機基の種誘導体の合成例を示す。
[図 3]本発明の分子ビーコンの温度変化に伴う、モノマー発光とエキシマー発光のス イッチングの様子を示す。
[図 4]本発明の分子ビーコンを用いた相補鎖 DNA検出の結果を示す。
[図 5]本発明の分子ビーコンを用いた SNP検出の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の分子ビーコンは、塩基対ミスマッチの高選択的な検出することができる D NAプローブ分子である。その構造的な特徴は、ヘアピンループ構造を有する一本 鎖オリゴヌクレオチドの両末端が同種の蛍光性有機基で修飾されていることである。 このような蛍光性有機基の種類としては、エキシマー形成可能な蛍光性有機基であ れば特に制限はない。本発明の分子ビーコンの構造を図 1に示した。
[0014] 本発明の分子ビーコンで使用できる蛍光性有機基の例としては、ピレン又はピレン 誘導体、ナフタレン系、フルオレン系、及びシァニン系色素等を挙げることが出来る。
[0015] 本発明の分子ビーコンにおいて一本鎖オリゴヌクレオチドを構成する塩基数に特に 制限はないが、検出感度等の点からは、通常、 24— 34個、好ましくは 26— 32個の 塩基を有する。更に、検出対象となる DNA分子中の相補的なオリゴヌクレオチドとハ イブリダィゼーシヨンするヘアピンループ領域は、通常、 15— 22個、好ましくは 17— 20個の塩基を有する。
[0016] 本発明の分子ビーコンとハイブリダィズ可能な被検オリゴヌクレオチド配列が存在し ない場合に、蛍光性有機基同士が疎水性相互作用によって会合できるような空間的 位置を占めることが出来るように、本発明の分子ビーコンにおいて、蛍光性有機基は 一本鎖オリゴヌクレオチドの 5'及び 3'末端と適当な構造及び長さのスぺーサーを介し て結合していることが好ましい。
[0017] 本発明の分子ビーコンが上記の条件を満たす構造を有するものである限り、スぺー サ一の構造及び長さに特に制限はなレ、。例えば、分子ビーコンの少なくとも 5'及び 3' 末端におけるスぺーサ一の一方が 2— 8個の炭素原子から成るメチレン基を含むもの とすることが出来る。その他、例えば、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子のような 構成要素をスぺーサ一に含むことが出来る。
[0018] 本発明の分子ビーコンは、使用する蛍光性有機基の種類等に応じて、適用な出発 物質、中間体、及び反応条件等を適宜選択し、当業者に公知の任意の方法で合成 することが出来る。
[0019] 例えば、 5'末端修飾のための誘導体として蛍光性有機基のホスホロアミダイト誘導 体、及び、 3'末端修飾のための誘導体として蛍光性有機基のスクシンィミジル誘導体 を用いることが出来る。更に、蛍光性有機基のメチルエステルから、ホスホロアミダイト 誘導体及びスクシンィミジル誘導体を合成すること出来る。具体的には、実施例にあ るように、 3—ピレニルプロピオン酸メチルエステルを用いて、ホスホロアミダイト誘導体 及びスクシンィミジル誘導体を合成する。又、 3'末端におけるァミノ基とスクシンイミジ ノレ誘導体を反応させることによって、 3'末端に蛍光性有機基を結合させることが出来 る。
[0020] 本発明の相補鎖 DNA検出法及び SNP検出法は、被検オリゴヌクレオチド配列又は 被検オリゴヌクレオチドの配列に含まれる SNPを蛍光性有機基由来のエキシマー発 光からモノマー発光へのスイッチングで検出することを特徴とするものである。
[0021] より具体的には、被検オリゴヌクレオチド配列と本発明の分子ビーコンにおけるヘア ピンノレープ領域におけるオリゴヌクレオチド配列とがハイブリダィズした結果、蛍光性 有機基同士の疎水的作用により会合して形成されていた錯体が破壊されることにより 生じる、該分子ビーコンにおける蛍光性有機基由来のエキシマー発光からモノマー 発光へのスイッチングを検出することによってそれらオリゴヌクレオチド配列間の相補 性の程度が判り、相補鎖 DNA (オリゴヌクレオチド配歹 IJ)又は該ォリゴヌクレオチド配 列に含まれる SNPを検出することができるものである。
[0022] 本発明の検出法で検出することが可能な被検オリゴヌクレオチド配列の長さは、使 用する分子ビーコンにおけるヘアピンループ領域の塩基配列の長さにほぼ対応する ものであるが、通常、 15— 22個、好ましくは 17— 20個の塩基力も成るものである。
[0023] 以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲 はそれらに限定されるものではない。
実施例 1
[0024] 29個の塩基からなる一本鎖オリゴヌクレオチドの 3'、 5'両末端にエキシマー形成可 能な蛍光性有機基、例えばここではピレンを結合させるために二種類のピレン誘導 体を合成した。即ち、図 2に示すように、共通の中間体として 3—ピレニルプロピオン酸 メチルエステルを用い、 5'末端修飾のための誘導体としてホスホロアミダイト誘導体（1 )を、 3'末端修飾のための誘導体としてスクシンィミジル誘導体（2)を合成した。
[0025] 具体的には、 3_ (1—ピレニル）プロパノール（200mg， 0.7mmol)の CH CN溶液
3
(12ml)中に、 1H—テトラゾール（80.7mg, 1.15mmol)及び 2—シァノエチルテトライソプ 口ピルホスホロジアミダイト（463mg, 1.54mmol)を含む CH CN溶液（3ml)を 0°Cにて
3
滴下した。反応溶液を室温で 2時間攪拌した後、溶剤を回転式エバポレーターで除 去した。残渣を炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸ェチルで抽出した。酢酸ェチ ル抽出物を回転式エバポレーターにかけた後、クロマトグラフ展開（へキサン： Et N (
3
50: 1)で予処理したシリカゲルを使用；溶出液としてへキサン： CH C1 (6: 1)を使用）す
2 2
ると、油状のホスホロアミダイト誘導体（1) (242mg,収率 68%)が得られた。
[0026] このホスホロアミダイト誘導体（1)の物性データは以下のとおりである。
IR (KBr) 3041, 2966, 2872, 2251, 1462, 1369， 1183, 1127, 1028, 977, 942, 845 cm
- 1
JH NMR (CDCl , 500 MHz) δ 1.21 (dd， J = 6.5, J = 1.5 Hz, 12 H), 2.17 (m, 2 H),
3 P-H
2.63 (t, J = 7 Hz, 2 H)， 3.44 (t, J = 8 Hz, 2 H), 3.62-3.91 (m, 8 H)， 7.88 (d， J = 8 Hz, 1 H), 7.96-8.03 (m， 3H), 8.08-8.16 (m， 4 H)， 8.29 (d， J = 9 Hz, 1 H);
13C NMR (CDCl， 125 MHz) δ 20.35, 20.40, 24.57, 24.62, 24.67, 29.86, 33.15,
3
33.21， 42.98, 43.08, 58.15, 58.30, 63.06， 63.20, 117.67， 123.36, 124.67, 124.78, 124.82, 124.95, 125.04, 125.77, 126.57, 127.21， 127.32, 127.47, 128.63, 129.81, 130.85， 131.37, 136.13; high-resolution ESI— MS m/e calcd for C H N O P (M+Na+) 483.2177, found
28 33 2 2
483.2197.
[0027] 次に、 3_ ( 1—ピレニル）プロピオン酸（340mg, 1.24 mmol)、ピリジン (105 μ 1)及び Ν , Ν，—ジスクシンィミジルカーボネート（333mg， 1.30mmol)を含む CH CN溶液
3
(30ml)を 50°Cにて 2. 5時間攪拌した。溶剤を回転式エバポレーターで除去した後、 残渣を NaCl飽和溶液に溶解し、酢酸ェチルで抽出した。酢酸ェチル抽出物を回転 式エバポレーターにかけた後、クロマトグラフ展開（シリカゲルを使用；溶出液として CH C1を使用）すると、スクシンィミジル誘導体（2) (378mg,収率 82%)が得られた。
2 2
[0028] このスクシンィミジル誘導体（2)の物性データは以下のとおりである。
mp 179-181 ° C;
IR (KBr) 3043, 2946, 1782, 1737， 1596, 1370， 1214, 1070, 848 cm"1;
JH NMR (CDCl , 500 MHz) δ 2.87 (br s， 4 H)， 3.16 (t, J = 8 Hz, 2 H), 3.80 (t， J = 8
3
Hz, 2 H), 7.93 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.00—8.05 (m, 3 H), 8.13—8.21 (m, 4 H)， 8.25 (d, J = 9 Hz, 1 H);
13C NMR (CDCl， 125 MHz) δ 25.60, 28.23, 32.70, 122.53, 124.87, 125.03, 125.07，
3
125.08， 125.23, 127.04, 127.10, 127.43, 128.00， 128.50, 130.48, 130.76, 131.33, 132.87， 167.95, 169.10;
high-resolution ESI— MS m/e calcd for C H NO (M+) 371.1158, found 371.1123.
23 17 4
[0029] 29塩基からなる一本鎖オリゴヌクレオチド（DNA)の 5'末端の該蛍光性有機基によ る修飾は、常法に従い DNA自動合成機を用いて上記のホスホロアミダイト誘導体（1 ) と反応させることで行った。得られた 5'末端を修飾した 29塩基からなる一本鎖 DNA分 子は COSMOSIL 5C -MS-IIカラム（4.6 x 150 mm;半井テスタ）を用いた HPLCにて
18
精製した。尚、この DNA分子は、溶出液として 0.05Mギ酸アンモニゥム及びァセトニ トリル直線勾配（5-85 %)を用いて、 1.0 mL/minの速度で溶出した。
[0030] 次に、上記の 5'末端を修飾した 29塩基力 なる一本鎖 DNA分子 (100 μ g)の 0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液 (86 μ ΐ, ρΗ 8.5)に、スクシンイミジノレエステル誘導体（2) (250 z g)を含む DMSO (14 μ ΐ)を添加した。反応溶液を室温で 12時間攪拌し、 CHC1で
3 数回洗浄した。得られた水相を上記条件（但し、ァセトニトリル直線勾配（5-85 %) )で HPLCにて精製し、本発明の分子ビーコンを得た（図 1中の（3)参照）。尚、得られた 分子ビーコンは、ピレンに由来する吸収波長（え det : 340nm)及び核酸に由来する吸 収波長（ λ det： 254nm)で確認 ·同定した。
[0031] このように、本合成法により、同一の出発物質から 3'、 5'の両末端を修飾できる蛍光 性基を得ることができ、分子ビーコンの合成法の簡略化に成功した。
実施例 2
[0032] 実施例 1で合成した蛍光性有機基が共有結合した分子ビーコンの T を常法に従 m
い測定した。即ち、分子ビーコンの水溶液 ([分子ビーコン] =2 μ Μ, 20mM Tris-HCl, 5mM MgCl , 50mM KCl; pH8.0)を用いて、電子吸収スペクトルを 10_90°Cの温度範
2
囲（ETC-505T温度コントローラー（JASCO)にて調節）にて測定し、 V-560 UV/VIS 分光光度計（JASCO)に記録した。 T の値はプログラム（Spectra Manager for
m
Windows™ DNA Melting Program: (JASCO》を用いてコンピュータ一にて求めた。
[0033] その結果、実施例 1で調製した本発明の分子ビーコンの T は 59°Cであった。一方、 m
両末端にピレンユニットを持たない非修飾の 29塩基からなるオリゴヌクレオチド鎖の T は 46°Cであった。この結果は、二枚の該蛍光性有機基 (ここではピレン)が疎水性相 m
互作用によって会合することにより、ェクストラな塩基対として機能して二重鎖の安定 性に寄与してレ、ることが示された。
[0034] 更に、上記分子ビーコンの水溶液は T より低い温度ではエキシマー発光が優先さ m
れる力 T 以上になると徐々にエキシマー発光が減少し、モノマー発光へと移行す m
ることを確認した。つまり、ヘアピンループ構造のオリゴヌクレオチド鎖を用いることに より、該蛍光性有機基 (ここではピレン)由来のモノマー発光とエキシマー発光のスイツ チングが達成されることを確認した。蛍光スペクトルは 10— 90°Cの温度範囲（
ETC-505T温度コントローラー（JASCO)にて調節）にて、 345 nmで励起し、 382 nm ( モノマー）及び 498 nm (エキシマー）で測定し、 FP-6500蛍光光度計（JASCO)に記録 した。以上の結果を図 3に示した。
実施例 3
[0035] 次に、相補鎖検出を以下に示す条件で行った。使用した装置類は実施例 2と同じ である。実施例 1で合成した分子ビーコンの水溶液 ([分子ビーコン] =200nM, 20mM Tris-HCl, 5mM MgCl , 50mM KC1; pH8.0)に、該分子ビーコンのループ領域に対す
2
る 19塩基からなる相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（0.1当量刻みに 1当量ま で）を 25°Cで加え、蛍光スペクトルがそれ以上変化しなくなるまで、約 15分間攪拌し た。 345 nmで励起し、 300 nm一 650 nmの範囲で測定した。ほぼ等量に達した段階 でエキシマー発光は消失し、モノマー発光に切り替わった。相補的な配列を有する オリゴヌクレオチドを等量以上加えても、モノマー発光の強度がこれ以上増大しない ことから、該分子ビーコンは非常に高選択的な DNAプローブ分子であることが確認さ れた。
[0036] 相補鎖不在時におけるモノマー発光強度 (I )とエキシマー発光強度 (I )比は I
382nm 498nm
/ I =0.2であるのに対し、相補鎖検出時には I I \ =20となり、約 100倍の
382nm 498nm 382nm 498nm
変化が観測された。該分子ビーコンの測定限界濃度は≤ lnM(DMFを 20%含む)であ ることもわかり、感度の点からも従来の分子ビーコンと比較して勝るとも劣らないことが 判明した。以上の結果を図 4に示した。
実施例 4
[0037] 更に同様の装置を用いて、分子ビーコンを用いて塩基対のミスマッチ（SNP)検出 を行つた。分子ビーコン（[該分子ビーコン] =5nM,実施例 3で使用した緩衝液に 20%の DMFを含む)に対し、以下の表 1に示すように、完全に相補的な配列からなるオリゴヌ クレオチド鎖と、一つの塩基を除いて相補的な配列を有する（SNPを有する）三種類 のオリゴヌクレオチド鎖（1当量刻みに 5当量まで）を 25°Cでカ卩えていつた。完全に相 補的な配列からなるオリゴヌクレオチド鎖の添カ卩時には、エキシマー発光からモノマ 一発光へのスイッチングが観測されたが、一つの塩基を除レ、て相補的な配列を有す る三種類のオリゴヌクレオチド鎖の場合には蛍光強度はほとんど変化しなかった。こ の結果を図 5に示した。
[0038] [表 1] 本発明における分子ビーコン （例えばピレン）
5 ' -(1 - yata lXCW^-CimCGAGTCCTTCCACG !ACCAQICAi - (CS HCOC2M4Hl -pyren 1)-3 '
上記の分子ビーコンにおける配列のみ
5'-£H £OAGTGCTTCCACGA ACCAaiQ fi-3'
上記の分子ビーコンのループ領域に対する相補的な配列
5 ' -TGGTATCGTGGAAGG ACTC-3 '
上記の分子ビ一コンのループ領域に対する 塩基を除いて相補的な配列 5 ' -TGGTATCGT GAAGO ACTC-3 '
5 '-TGGTATCGTIGA^GGACTC-3 '
5 ' -TGG CGT£GAAGG ACTC-3 '
[0039] この結果は非常に重要な意味を持つ。 19塩基からなる DNA鎖の場合、その塩基配 列がゲノム上に出現する確立は 419=2.7 X 1011個の塩基の並びに対して 1度だけであ る。この塩基数は、地球上の生物種のうち最もゲノムサイズの大きなユリ科植物の 2.4 x io11個をも凌駕している。すなわち本発明における該分子ビーコンは、全生物種に おける特定の塩基配列を 1ケ所だけ検出できる選択性を有することになる。
産業上の利用可能性
[0040] 本発明により、エキシマー形成可能な蛍光性有機基のモノマー発光とエキシマー 発光のスイッチングを利用することにより、分子ビーコンの合成の簡略化と単純化に 成功した。該分子ビーコンはほぼ等量の被検配列のオリゴヌクレオチドに対して応答 する高感度な DNAプローブ分子であり、また該分子ビーコンを用いて低濃度での塩 基対ミスマッチの高選択的な検出することが可能である。

Claims

請求の範囲
[I] ヘアピンループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの両末端が同種の蛍光性有 機基で修飾されていることを特徴とする分子ビーコン。
[2] 蛍光性有機基がエキシマー形成可能な蛍光性有機基であることを特徴とする請求項
1に記載の分子ビーコン。
[3] 蛍光性有機基がピレン又はピレン誘導体の残基であることを特徴とする、請求項 2記 載の分子ビーコン。
[4] 一本鎖オリゴヌクレオチドが 24— 34の塩基を有することを特徴とする、請求項 1—3 のレ、ずれか一項に記載の分子ビーコン。
[5] 一本鎖オリゴヌクレオチドが 26— 32の塩基を有することを特徴とする、請求項 4に記 載の分子ビーコン。
[6] ヘアピンループ領域が 15— 22の塩基から構成されていることを特徴とする、請求項
1一 5のいずれか一項に記載の分子ビーコン。
[7] ヘアピンループ領域が 17— 20の塩基から構成されていることを特徴とする、請求項
6に記載の分子ビーコン。
[8] 蛍光性有機基が一本鎖オリゴヌクレオチドの 5'及び 3'末端に適当な長さのスぺーサ 一を介して結合していることを特徴とする、請求項 1一 7のいずれか一項に記載の分 子ビーコン。
[9] 少なくとも 5'及び 3'末端におけるスぺーサ一の一方が 2— 8個の炭素原子から成るメ チレン基を含むことを特徴とする、請求項 1一 8のいずれか一項に記載の分子ビーコ ン。
[10] 5'末端修飾のための誘導体として蛍光性有機基のホスホロアミダイト誘導体、及び、
3'末端修飾のための誘導体として蛍光性有機基のスクシンィミジル誘導体を用いるこ とを特徴とする、請求項 1一 9のいずれか一項に記載の分子ビーコンの合成法。
[II] 蛍光性有機基のメチルエステルから、ホスホロアミダイト誘導体及びスクシンイミジノレ 誘導体を合成することを特徴とする、請求項 10記載の合成法。
[12] 3—ピレニルプロピオン酸メチルエステルを用いて、ホスホロアミダイト誘導体及びスク シンィミジル誘導体を合成することを特徴とする、請求項 11記載の合成法。
[13] 3'末端におけるァミノ基とスクシンィミジル誘導体を反応させることによって、 3'末端に 蛍光性有機基を結合させることを特徴とする、請求項 10— 12のいずれか一項に記 載の合成法。
[14] 被検オリゴヌクレオチド配列を蛍光性有機基由来のエキシマー発光からモノマー発 光へのスイッチングで検出する相補鎖 DNA検出法。
[15] 被検オリゴヌクレオチド配列と請求項 1一 9のいずれか一項に記載の分子ビーコンに おけるヘアピンノレープ領域におけるオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダィズに由来 する該分子ビーコンにおける蛍光性有機基由来のエキシマー発光からモノマー発光 へのスイッチングを検出することを特徴とする、該オリゴヌクレオチド配列を有する相 補鎖 DNAの検出法。
[16] 被検オリゴヌクレオチド配列が 15— 22の塩基から構成されていることを特徴とする、 請求項 14又は 15に記載の相補鎖 DNAの検出法。
[17] 被検オリゴヌクレオチド配列が 17— 20の塩基から構成されていることを特徴とする、 請求項 16に記載の相補鎖 DNAの検出法。
[18] 被検オリゴヌクレオチドの配列に含まれる SNPを該蛍光性有機基由来のエキシマー 発光からモノマー発光へのスイッチングで検出する SNP検出法。
[19] 被検オリゴヌクレオチド配列と請求項 1一 9のいずれか一項に記載の分子ビーコンに おけるヘアピンノレープ領域におけるオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダィズに由来 する該分子ビーコンにおける蛍光性有機基由来のエキシマー発光からモノマー発光 へのスイッチングを検出することを特徴とする、該オリゴヌクレオチド配列に含まれる
SNPの検出法。
[20] 被検オリゴヌクレオチド配列が 15— 22の塩基から構成されていることを特徴とする、 請求項 18又は 19に記載の SNPの検出法。
[21] 被検オリゴヌクレオチド配列が 17— 20の塩基から構成されていることを特徴とする、 請求項 20に記載の SNPの検出法。
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