WO2005022166A1

WO2005022166A1 - タンパク質結晶化状態判定方法およびそのシステム

Info

Publication number: WO2005022166A1
Application number: PCT/JP2004/008827
Authority: WO
Inventors: Kuniaki Kawabata; Hajime Asama; Kanako Saito; Satoshi Kunimitsu; Taketoshi Mishima
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2005-12-18
Also published as: JP2005009949A; JP4300327B2

Abstract

本発明は、タンパク質溶液の結晶化状態を判定することを課題とする。タンパク質溶液についての観察された電子画像を用いて解析するタンパク質溶液の結晶化状態の判定方法。タンパク質溶液のサンプルについて、原画像取得ステップＳ４２と、原画像行列算出ステップＳ４４と、原画像統計量算出ステップＳ４６と、画像微分ステップＳ４８と、微分画像行列算出ステップＳ５０と、微分画像統計量算出ステップＳ５２と、第１の判定ステップＳ５４と、第２の判定ステップＳ５４を適用して判定する。

Description

明細書タンパク質結晶化状態判定方法およびそのシステム技術分野

本発明は、タンパク質溶液におけるタンパク質結晶生成を自動化するためのタンパク質結晶状態を判定する方法およびそのシステムに関する。背景技術

従来より、タンパク質の結晶構造を角術するために X線結晶構晰法が用いられている。カかる構晰法においては、構劍晰対象のサンプルとなるタンノク質の良質な結晶を得るために、構劍晰サンプル作成の «として、タンパク質の溶液（7j溶液）から水分を蒸発させて結晶を生成する方法（結晶化法）が用いられる。この際、構^性質が未知であるタンパク質溶液から結晶が得られるかどうかを選別するスクリー二ング作業が行なわれている。

従来のこのスクリ一エング作業では、結晶状態を顕微鏡画像から人の目で逐次検討し、そのサンプルの結晶生成の様子を判定している。この判定においては、サンプルのタンパク質溶液力溶液のままである力、沈殿を起こしている力 \微結晶が得られている力、あるいは、結晶が得られるかが判定される。表 1に、このスクリ一エングにおいて用いられる判定基準を示す。

(表 1 ) スコア状態名代表的な観察結果計算の分

類

0 透明透明 A

1 細（ i ) 粒が無く、一様に黒ずんでいる B

2 '細（ i i ) 少し点々がある C

3 'Μ ( i i l ) アモルファス D

4 殿 (i v) 大きくなつたアモルファス

5 微桔晶 50μηη以下の結 (角がある）

6 結晶（針状 E

7 結 ¾ (，· i ) 板状

8 結晶（ i i i ) 結晶が重なり合っているもの

9 結晶（ i v ) 良質な結晶

：いずれにも属さない表 1において、「透明」とは、タンパク質溶液が何らの結晶も生成しない様子を表わしている。また、「沈殿」は、 4つに分類される。即ち、粒が見られず黑ずんでいたり褐色を示すもの（沈殿（i))、点状の組織が観察されるもので白色にみえ、少し点々があるもの（沈殿 (i i))、アモルファス様の組織で透明に見えることがあるもの（沈殿 ( i i i))、大きなアモルファス様の組織で粒子が見えることがあるもの（沈殿 ( i V)) に分類される。また、結晶が生成されているものは、 5つに分類される。即ち、 5 Ομπι¾¾以下の結晶で頂点が観察されるもの（微結晶)、針状結晶が観察されるもの（結晶（i))、板状結晶が観察されるもの（結晶（i 0)、重なり合った結晶力 S観察されるもの（結晶 (i i i) )、良質な結晶が観察されるもの（結晶（i V)) というように分類される。便宜的に、各分類に対してスコアとなる数字が割り当てられて分類されることもある。ただし、タンパク質の結晶の成長過程に従ってこのスコアが順次増してゆくように変化するものとは限らない。このように分類される画像の模式図を、スコアごとに図 7に示す。特に、未知タンパク質溶液の結晶化実験においてこれらに分類されるサンプルの数が多数であるため、大変有用な手段となる。従来の人の観察を基礎とするスクリ一二ング作業では、観察者はトレーニングによつて養成されて、経験的にこのような分類を行なうことができるようになる。養成された観察者が多数のサンプルについて得た顕微鏡画像を観察して選別を行なう。このときに判定された分類は、それ自体も、 X線構^^ iff向けのサンプルにつレヽての有用な情報であり、タンパク質の構造角? や性質の決定に際して重要な指標となっている。

この結晶を得るための手法においては、大別すると、タンパク質溶液をカバーガラスの下面に下垂させて蒸発を行なう手法（ハンギングドロップ蒸気拡散法）と、タンパク質溶液を蒸発容器の上に載置させて蒸発を行なう手法（シッティングドロップ蒸気拡散法）とが用いられる。多数のタンパク質溶液の顕微鏡画像を得るには、自動的に顕微鏡画像を記録することが有効であり、機械化の容易なシッティングドロップ蒸気拡散法が望ましい。

特に、表 1に示した透明、沈殿（i )、沈殿（i i )、沈殿（i i i ) に未知タンパク質溶液のサンプルが分類されることが多いが、これ等に分類されるサンプルは、いまだ結晶が生成されておらず、観察者がこれらを全て観察するのは、効率が悪い。

また、従来のテクスチャ角晰手法の例が、 R. M. Haralick, K. Shanmugamおよ、 I. Dinsteinによる rexture features for image classification (IEEE Trans. Syst. , Man, Cybern. , vol. SMC - 3， no6, pp. 610-621, 1973) に記載されている。発明の開示上記従来のタンパク質溶液の結晶化状態判定方法では、人の目による分類が欠力、せず、スクリーニング作業で処理できるサンプルの数に限界がある。また、その分類基準についても、観察者ごとに判定が異なる場合があり、さらに、同じ観察者であっても繰り返し同じ判定が行なえない場合がある。

多数のサンプルの判定を行なうためには、シッティングドロップ蒸気拡散法による働戎化が望ましいが、結晶化状態の判定は、ハンギングドロップ蒸気拡散法の顕微鏡画像に比べて判定が難しい傾向がある。

本発明は、力、かる従来のタンパク質溶液の結晶化状態判定方法を、顕微鏡画像に対してテクスチャ角晰の手法を用いて «化することを課題とする。また、機械化されて自動される顕微鏡画像おレヽても良好に判定が行なえる判定方法をし、撮影から判定までを «化することができるような効率の高レヽ安定したタンパク質の結晶化状態の判定を可能にする方法やシステムを«することを課題とする。さらに、表 1に示した透明、沈殿（、沈殿（1 1 )、沈殿（1 i i ) を適切に分類する方法を確立することも課題とする。

本発明では、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得ステップと、該原画像の少なくとも一部分について第 1の同時生成行列を算出する原画像行列算出ステップと、該第 1の同時生成行列から第 1組の画像統計量を算出する原画像統計量算出ステップと、該原画像に微分処理を行なって微分画像を得る画像微分ステップと、該微分画像の少なくとも一部分について第 2の同時生成行列を算出する微分画像行列算出ステップと、該第 2の同時生成行列から第 2 組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出ステップと、該第²組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも 2種に分類する第 1の判定ステップと、前記第 1の判定ステップで分類された結果、前記 2種のうちの第 1 種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第 1組の画像統計量を用いて少なくとも 2種に分類する第 2の判定ステップとを含む、タンパク質溶液の結晶化状態の判定方法が^^される。

画像の角晰は、一般にテクスチャ角晰と呼ばれる手法を用いることができる。この角浙対象に、タンパク質溶液の原画像（電子的に取得して明るさや領域の切り出し等の予備的な調整をしたのみの画像で、微分していない画像）と、その原画像を微分した微分画像を共に用いることにより、未知タンパク質の溶液における結晶化の状態を良好に判定できる。

また、判定を 2段階に行なうことにより、タンパク質溶液の結晶化状態を判定する作業の機械化が容易となる。本方法によれば、表 1に示した透明と沈殿 ( i ) とを他のものから適切に分類することが可能となる。

また、本発明においては、前記第 1の判定ステップで分類された結果、前記第 1種以外の種に分類されたタンパク質溶液の電子画像を、前記第 2糸且の画像統計量を用いてさらに少なくとも 2種に分類する第 3の判定ステツプをさらに含む方法が ¾ ^される。

第 3の判定ステップにより、透明と沈殿 ( i ) との分類に加えて、沈殿（i i ) と沈殿 ( i i i ) とを他のものから分類することができる。

さらに、本発明においては、上記方法において、予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 1の判定ステップにおいて用いる第 1 の判定基準と第 2の判定基準とを、前記第 2組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 2の判定ステップにおいて用いる第 3の判定基準を、前記第 1組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 3の判定ステップにおいて用いる第 4の判定基準を、前記第 2組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップとをさらに含む方法がされる。ここで、前記第 1の判定ステップは、前記第 1の判定基準と前記第 2の判定基準とにより、前記第 2組の画像統計量を用いて電子画像を 3種に分類するものであり、前記第 2の判定ステップは、前記第 3の判定基準により、該第 1組の画像統計量を用いて前記 3種のうちの第 1種に属する電子画像をさらに 2種に分類するものであり、前記第 3の判定ステップは、前記第 4の判定基準により、該第 2組の画像統計量を用いて前記第 1種以外のいずれ力の種に属する電子画像をさらに 2種に分類するものである。

判定ステップを適切に選択された 4つの基準を適切な順序で用レヽるものとして構築すれば、判定の際のエラーが低減され、人による判定を十分に再現できる良好な判定が人による分類を経ずとも行なえる。

本発明においては、上記方法において、透明状態、第 1〜第 4の沈殿状態、微結晶状態、およひ佶晶状態を要素として構成される複数の状態のいずれかにタンパク質溶液の電子画像を分類する方法がされる。ここで、前記第 1の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第 1〜第 3の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態と力、らなる状態の！/ヽずれかのどちらにあるかを判定するものであり、前記第 2の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第 1の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第 2〜第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とカらなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、前記第 3の判定基準は、タンパク赏溶液が、透明状態、あるいは、第 1の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、前記第 4の判定基準は、タンパク辦液が、第 2の沈殿状態、あるいは、第 3 の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、前記第 1の判定ステップは、前記第 1の判定基準と前記第 2の判定基準とにより、タンパク質溶液が、透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態のレヽずれか、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態のいずれか、あるいは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのいずれにあるかを判定するステップであり、前記第 2の判定ステツプは、前記第 3の判定基準により、透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液力透明状態、あるいは、第 1の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップであり、前記第 3の判定ステップは、前記第 4 の判定基準により、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態のレヽずれかにあるタンパク質溶液が、第 2の沈殿状態、あるいは、第 3の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップである。

テクスチャ角晰においては、判定基準は一般には様々な画像に基づいて確立することができるが、本発明においては、原画像と微分画像を用い、それぞれの基準が判定する特徴に適した画像の種類をこのように選択することが出来る。これにより、判定のエラーが低減され、人による判定を十分に再現可能な良好な判定の,化が可能となる。

本発明では、さらに、タンパク液について観察された画像を角锊斤することによって該タンパク質溶液における結晶化状態を判定する結晶化状態判定システムがされる。このシステムは、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得手段と、該原画像の少なくとも一部分にっレヽて第 1の同時生成行列を算出する原画像行列算出手段と、該第 1の同時生成行列から第 1組の画像統計量を算出する原画像統計量算出手段と、該原画像に微分処理を行ない、微分画像を得る画像微分手段と、該微分画像の少なくとも一部分について第 2の同時生成行列を算出する微分画像行列算出手段と、該第 2の同時生成行列から第 2 組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出手段と、該第 2糸且の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも 2種に分類する第 1の判定手段と、前記第 1の判定手段で分類された結果、前記 2種のうちの第 1種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第 1組の画像統計量を用いて少なくとも 2種に分類する第 2の判定手段とを含んで構成される。

本発明の解析システムは、タンパク質溶液の結晶化を判定するサンプルについて電子画像を用いて結晶化状態の判定を行なうことが出来る。これにより、従来は観察者に頼っていた結晶化状態の判定作業の «化が可能となる。

さらに本発明の角浙システムに、タンパク質の溶液の結晶化サンプルの自動観察手段を組合わせれば、未知タンパク質の観察とその未知タンパク質の結晶化状態の判定とを連続して自動で行なうタンパク質結晶化状態観察角科斤システムが構築できる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施の形態におけるサンプルの構成を示すサンプル容器の断面図である。図 2は、本発明の実施の形態における結晶化状態判定システムの構成サンプルの構成を示す構成図である。

図 3は、本発明の実施の形態におけるテクスチャ角晰の手法を説明する説明図である。

図 4は、本発明の実施の形態におけるテクスチャ解こおける微分方法を説明する説明図である。

図 5は、本発明の実施の形態における判定基準の確立の方法を示すフローチヤートである。

図 6は、本発明の実施の形態における判定方法を示すフローチャートである。図 7は、タンパク質溶液の結晶状態の画像による分類を模式的に示す説明図でめる。

図 8は、本発明によりされるタンパク質溶液の結晶状態の判定方法を表すフローチヤ一トである。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、コンピュータ装置を用いて実施される。このコンピュータには、適当な画像入力手段が接続されている。その画像入力手段は、例えば顕微鏡に備えられた C C D (電荷結合デバイス）などの撮像装置、 A/Dコンパータ、適当なメモリなどによって電子的な画像を取得し、コンピュータに入力する。また、コンピュータには、演算装置、記憶装置、表示装置、通信装置などの通常の装置が備えられる。本努明の各ステップや各手段は、演算装置に実現された機能ブロックとして処理が行なわれ、機能が実現される。例えば、判定ステップや判定手段は、演算装置において、記憶装置から読み込まれたプログラムが必要なレジスタやメモリによつて構成される記憶動作と演算処理動作によつて判定を行なう機能として実現される。本発明は、このようなコンピュータを用いて、画像処理および画像の分類を用いて、タンパク賢溶液の結晶化状態を判定するための方法や手段を«するものである。

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。

図 1は、本発明において観察対象の溶液においてタンパク質の結晶化（析出）をさせるために製作されるサンプルのされた様子を表わす断面図である。本発明の観察対象は、タンパク質溶液 1を観察する光学顕微鏡の観察像である。タンパク質溶液 1は、 7分を含んだ溶液である。このタンパク質^ ί夜 1は、容器 3 内に配置された滴下ステージ 5に滴下して準備される。容器 3の開口部は、カバ一スリップ 2によつて覆われ、容器 3と力バースリップ 2の接触部はシー^/されて、以後気密が保たれる。容器 3には、予め沈殿材 4が配置されており、容器内の水分を吸収してゆく。

このようなサンプルでは、数日から数年の時間をかけて、溶液中の水分が減少してゆき、タンパク質の飽和溶解度に ¾ "ると、徐々にタンパク質の結晶が成長してゆくことがある。タンパク質の種類によっては、全く結晶を生成しない場合や、沈殿を生じる場合もある。

図 2は、本実施形態の結晶化状態判定システム 1 0 0の構成を説明する構成図である。本システムには、原画像取得手段 1 2、原画像行列算出手段 1 4、原画像統計量算出手段 2 0、画像微分手段 2 2、微分画像行列算出手段 2 4、微分画像統計量算出手段 2 6、判定基準設定手段 2 8、判定基準格納手段 3 2、判定手段 3 4が備えられている。なお、判定手段 3 4には、図示しないが、第 1〜第 3 の判定手段が含まれているものとしてもよレ、。また、本システムにおいては、判定基準を確立するために、予め結晶化状態が分類されたタンパク質の画像について、外部にある撮像装置 1 6からの電子画像のデータ 1 8を取得し、結晶状態データ 3 0を取得するものであってもよい。本システムは、未知タンパク質溶液の画像について、外部にある撮像装置 1 6からの電子画像のデータ 1 8を取得し、その未知タンパク質溶液の結晶ィ匕状態を判定して、その結晶状態のデータ 3 6を出力する。

原画像取得手段 1 2は、例えば顕微鏡に備えられた撮像装置 1 6によって撮影され、デジタル化された電子画像のデータ 1 8を取得して、その電子画像を調整して原画像のデータ 1 2 2とする。調整は、デジタル化されたデータの明度等を適切な範囲に調整したり、計算に十分な範囲で階調の削減を行ったり、必要な領域を切り出す処理などの一般的な処理である。

原画像行列算出手段 1 4は、その調整された原画像のデータ 1 2 2の少なくとも一部分の各画素を走査して、該原画像のデータ 1 2 2に基づいて第 1の同時生成行列 1 4 2を算出する。

ここで、同時生成行列とは、画像の濃度（画素値） iの点から一定の変位 δ = ( r、 Θ ) (図 3 a参照）だけ離れた点の濃度が jとなる確率を要素として持つような行列である。例えば、図 3 bのような画像については、（r、 Θ ) 毎に次式のような同時生成行列が計算される。 0 1 2 3 0 1 2 3

(b) (κθ)=( .ρ') (c) ( =( 1 ,90')

0 1 2 3 0 1 2 3

0 2 J 3 0 0 4 1 0 0

1 2 1 0 1 2 2 0

2 3 1 0 2 2 0 2 4 1

3 0 0 2 0 3 0 0 1 0

n

(d) (η<?)=(!, 135·) (e) ( =( 1 ,45·) ここでは、処理対象の範囲の画素が走査されて、同時生成行列の行列要素に加算されている。

この各行列に現われる要素は、その（r、 0 ) と（i、 j ) の糸且合わせごとの画素の出現頻度を表わしている。この画素の出現頻度を確率に換算するために正規化処理を行なう。この確率を要素とする同時生成行列の行列要素を以後 E ( i , j ) とする。なお、（r、 Θ ) 毎にこの要素が計算されている力記載を省略する。原画像行列算出手段 1 4はこのような確率を求める機能を有しており、適当なメモリーを用レヽて頻度を計算し、その頻度を正規化して確率を要素とする同時生成行列を出力する機能を有している。

このようにして定められる同時生成行列 E ( i , j ) に基づいて、原画像統計量算出手段 2 0は、第 1組の画像統計量 2 0 2を算出する。この画像統計量の組は、次式で表わされる。角 2次モーメント： ∑ ∑ {E(i,j)f … )

/=0 7=0 コントラスト： λ²£ 、, ） -(2)

Ν-\Ν-\

∑ ∑ ijE μ._χμ),

相関： •••(3)

W-lW-l ,

分散二乗和： ∑ ∑ (ϊ-μ_χ)²Ε , •••(4)

逆差分モーメント： ) ■(5)

平均和： ∑ kE _x,_y (k ) ■(6)

IN— 1

分散和： ∑ (lc- ∑ lE_x,_y(l))²E_x+y(k) '••(7)

=0

ェントロピー和一 ••(8)

エントロピー： — ∑ ∑ ，ゾ） log (")} •(9)

/=o =o 分散差： E_x__y(k) •(10)

エントロピー差 - ∑E_x._y(k)\og{E_x__y(k)} •(11) HXY~HXY\

相関計測情報 1 ί ■•(12)

相関計測情報 2 ： [l - exp{- 2.0(HAT 2 - HAT)}]X "(13) 最大相関係数： (ρの 2番目に大きい固有値 z ー(14) ここで、この各画像統計量の計算には、次の関係式が用いられている E_x(0 =∑ E(i ), '' = 0,1,

>=0

E_yU) =∑ E(i,j), j = 0,1

W-l W - 1

E_x,_y(k) = ∑ E(i ), i+ j

ひノ 0

J»ひ；《o

= -∑ ∑ E(i, j) \og{ £(!'，ゾ)}

/=o =o

-∑ ^(り l。g( E_x(i)}

W— 1

HY = -∑ E_y(j)\og {E_y (j)} HXY 1 = -∑∑ log {E, (/)£、,（_ )} 2 = -X X E_x0)E_y(j) \ g {E_x(i)E_y(j)}

=0 =o

^ゾ) = ^ ¾ E_x，(i)E_y(j) なお、これらの画像統計量は、非特許文献 1によって上記と同様に導入されている。

画像微分手段 22は、原画像取得手段 1 2の出力する原画像 122に微分処理を行なう。この微分処理は、本実施の形態にお！/ヽては、一次微分フィルタとして知られる S o b e 1フィルタ（水 ί救分フィルタ：図 4 a参照、垂直微分フィルタ：図 4 b参照）を適用する。この際、図 4では、注目画素である中央の画素に対して、周囲の画素を図示する各重みを考慮して加算する処理が、注目画素を順次走査して行なわれる。これにより、画像微分手段 2 2によって微分画像 2 2 2 が得られる。

微分画像行列算出手段 2 4は、原画像行列算出手段 1 4が原画像 1 2 2に行なつた処理と同様の処理により、微分画像 2 2 2に基づいて第 2の同時生成行列 2 4 2を算出する。また、微分画像統計量算出手段 2 6は、原画像統計量算出手段 2 0と同様の処理により、第 2の同時生成行列 2 4 2力ら第 2糸且の画像統計量 2 6 2を算出する。

判定基準設定手段 2 8は、原画像 1 2 2力 S表 1の結晶状態のいずれのも'のあるかを結晶状態データ 3 0として受け付ける。この結晶状態データ 3 0は、表 1のスコア 0〜9の 1 0段階のいずれであるかを示すデータである。また、判定基準設定手段 2 8は、前記第 1組の画像統計量 2 0 2と、前記第 2組の画像統計量 2 6 2とを受け付ける。

判定基準設定手段 2 8は、これらの受け付けたデータから、 4種の判定基準を線形判別法により確立する。線形判別法は、統計標本が持ついくつ力の特性から、統計標本がどの群（クラス）に属するかを識別する手法である。このとき、統計標本としては、結晶状態データ 3 0を用い、その識別が行なわれる空間（特徴空間）として、微分を用いない原画像に基づいている第 1の画像統計量の 1 4次元空間、あるいは、微分画像に基づ、ている第 2の画像統計量の 1 4次元空間が選択される。

判定基準は、線形識別関数という関数として表現され、一つの線形識別関数で判象を 2つに分類するような基準である。この線形識別関数は、 1 4次元空間内の超平面（1 4次元空間を 2つの半空間に仕切る 1 3次元の自由度を有する面）として決定される。つまり、線形識別関数は、 1 47火元空間に散布されたデ → (各々力予め判定されているタンパク質の結晶状態のいずれ力の情報によつて分類可能であり、第 1の画像統計量または第 2の画像統計量のデータを座標値としてプロットされている点）を 2つに仕切る際の超平面として定義される。線形識別関数を決定するための指標は、直感的には、予め分類されている各データを出来るだけ分離させるような仕切り方となる超平面（線形識別関数）を定めることである。具体的には、第 1の画像統計量または第 2糸且の画像統計量を要素とするデータ u = ( u l、■ · ·、 u l4) Tと、係数行列 (係数べクトル) Αとの内積をとつて、スカラー量 zを算出する（式 ( 1 5 ) )。なお、ここでは、係数行列 Aは、後にフィッティングされる未知パラメータを要素としている。また、データ uは、多数のデータが用いられる力各々力予め結晶状態が判定されて V、て結晶状態データ 3 0力 S得られ、第 1の画像統計量および第 2画像統計量が算出される複数のデータである。

² = A^ru (₁₅) 次に、クラス内共分散行列∑ Z、クラス間共分散行列∑ B力式（1 6 )、 ( 1 7 ) により求められる。

∑w = ∑P{ Oi )∑, (16)

/=1,2

∑a = ∑ (»,)(/«>一一 mf (17)

/=1,2 ここで、 P (ω ί) は 2つに分類された分類の各クラス ω ίの事前確率、 ∑iはクラス ω iの共分散行列、 miはクラス ω iの特徴データ（ 1 4次元の座標値）の単純平均によって作られるベタトル、 mは全パターンにおける同様の平均のベタトルを表わす。

データ uを係数行列 Aで変換したことに対応させて、スカラー量 zのクラス内およびクラス間の分散∑〜Z、 ∑〜Bを求めると、

w ― = A Λ ∑ Ζ,_WψAΆ (is)

∑ = A ∑_BA (19)

のようになる。これを用いて、評価関数 J∑ (A) を式（2 0 ) のように定める

この評価関数は、分類されるクラス間の分離度を表わしている。従って、最適となる係数行列 Αは、この評価関数 J∑の最大値を与えるものである。

評価関数 J∑の最大値を与える Aを算出するには、式（2 1 ) によって与えられる行列の最大の固有値を与える固有べクトルを求めればよい。ム (21)

このようにして求められた最適な Aは、式（2 2 ) に定義される識別関数の超平面の法線べクトルを与えるものである。 "⁰ ₍₂₂₎

= 十… + fl₁₄W₁₄ + M₀

なお、式 2 2の u 0は、 1 4元のベクトル uに mを代入した場合に g (m) = 0 が成立するように定められる。

以上のような処理を、判定基準設定手段 2 8が実行する。このために、判定基準設定手段 2 8には、図示はしないが、行列演算を適切に行なうための手段力^! えられる。具体的には、内積計算（式 1 5、 1 7等)、積和演算（式 1 6、 1 7 ) , 固有値演算（固有値の算出、固有べクトルの決定）が処理できる演算機能を有する。上記の式の説明では、式変形の順を追って説明しているが、判定基準設定手段 2 8は式 1 8〜 2 0については特段計算する必要がない。

本実施形態の結晶化状態判定システム 1 0 0の機能としての判定基準設定手段 2 8の具体的な処理を、図 5を用いて説明する。判定基準設定手段 2 8は、まず、予め結晶状態が判定されている観察画像（教示用の観察画像）について、結晶状態データ 3 0の入力（図 5、 S 2 ) と、その画像について計算された第 1組の画像統計量および第 2組の画像統計量の入力（S 4 ) を受け付ける。次に、確立する判定基準を選択する（S 6 )。そして、処理に用いる画像統計量の組が判定基準に依存するので、確立する判定基準を選択し、予め判定された結晶状態のデータによつて各画像を分類する（ S 8 )。この分類は、表 1に示した各分類を要素とし、その要素の組合わせによってそれぞれが構成された 2つの分類である。この分類は、以下に説明するように、そのとき確立しょうとする判定基準によつて定まる。

本実施の形態では、判定基準 g l〜g 4を確立し、これを判定に用いる。 g l は、タンパク辦液が、透明状態と第 1〜第 3の沈殿状態とからなる状態にあるか、または、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあるかを判定する（第 1の判定基準)。 g 2は、タンパク液が、透明状態と第 1の沈殿状態とからなる状態にあるか、または、第 2〜第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあるかを判定する（第 2の判定基準)。 g 3は、タンノク液が、透明状態にある力 \または、第 1の沈殿状態にあるかを判定する (第 3の判定基準)。 g 4は、タンパク質溶液が、第 2の沈殿状態にある力または、第 3の沈殿状態にあるかを判定する（第 4の判定基準)。なお、各判定基準は式 2 2の多項式の係数を定めるものであり、判定されるべき画像についての画像統計量（1 4個の統計量） uによって各判定基準の多項式の値を計算し、その正負によつて分類がなされる。判定基準 g 1〜 g 4の正負をどのように定めるかについては、上述した最大固有値の固有べクトルが、反転されても同様に同じ固有値の固有べクトルとなる任意性を利用して、任意に定め得る。本実施の形態では、表 1のスコアが小さい側の分類力各判定基準の多項式の評価値が正となるように定める。

例えば判定基準 g 1による判定においては、透明状態と第 1の沈殿状態とからなる状態（第 1の状態）と、第 2〜第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態（第 2の状態）とのいずれにあるかを、分類することに相当する。このように、各判定基準によって異なる分け方で分類が行なわれる。

そして、ステップ S 8において判定基準に合わせて分類された分類を用いて、クラス内共分散行列とクラス間共分散行列を、式 1 6および 1 7に従って算出する（S 1 0 )。そして、式 2 1の行列を算出して（S 1 2 )、その行列の最大固有値に対応する固有ベクトルを算出する（S 1 4 )。この計算には、行列の固有値や固有べクトルを数値的に算出する任意の計算方法を用いることが出来る。固有べクトルが求まると、その固有べクトルを係数とする多項式（式 2 2 ) ί ベタトノレ uに m (mは全パターンにおける特徴データの平均のべクトル) を代入した場合に g (m) = 0が成立するように、 u Oを定める（S 1 6 )。

これにより、式 2 2の全ての係数が算出されて、その判定基準;^確立する。判定基準 g 1〜 g 4の全てについてこのような過程を繰り返すことにより（ S 1 8 )、判定基準が全て確立することとなる。なお、 g 3、 g 4は、既に g l、 g 2 によつて分類されたあと判定にのみ用いるため、ステップ S 8における判定基準に合わせた分類は、確立した g l、確立した g 2によって分類されたものについて判定を行なえばよい。以上のようにして、判定基準設定手段 2 8が判定基準を確立する。

判定基準設定手段 2 8は、判定基準 g 1〜 g 4を判定基準格納手段 3 2に格納する。このような判定基準 g 1〜 g 4によって表 1の右端の列に示す計算による分類 A〜Eが分類される。また、いずれの分類にも入らないものが Fとして分類される。

本実施の形態では、実際にスコア 0〜 9に分類される画像を用いて判定基準 g l〜g 4を確立している。判定基準の確立に用いた画像は、スコア 0〜9の各分類について、予め熟練した観察者によって分類されている 2 0枚から 6 0枚程度の画像である。

続けて、本実施の形態のシステム 1 0 0によって未知タンパク質溶液のサンプルについて判定を行なう方法について説明する。この判定に際しては、判定手段 3 4が判定基準格納手段 3 2から判定基準 g l〜g 4を読み込むことにより行な

5。

未知タンパク質溶液についても、図 1に示したようにサンプルが準備される。そして、光学像として観察画像を取得し、判定基準を確立する際と同一の手段 ( 原画像取得手段、原画像行列算出手段、原画像統計量算出手段、画像微分手段、微分画像行列算出手段、 ί救分画像統計量算出手段）によって同一の処理がなされる。これにより、該未知タンパク質溶液のサンプルについての第 1組の画像統計量と第 2組の画像統計量が得られる。

第 1組の画像統計量と第 2組の画像統計量は、各々 1 4次元の数値データからなるベタトルであるので、これらに、判定基準設定手段 2 8によって確立された 4種の判定基準 g l〜g 4を適用して判定を行なう。つまり、判定基準を示す多項式にこの未知タンパク容液から得られた画像統計量のベタトルを代入して、値の正負を評価することにより、判定を行なう。判果のデータ 3 6は、判定基準設定手段 2 8から出力され、適当な表示手段に表示されたり、記憶手段に格納される。

次に、図 6に従って、第 1〜第 4の判定基準（g l〜g 4) を適用する具体的なステップについて説明する。

判定手段は、まず、第 1の判定基準 g 1と第 2の判定基準 g 2とを用いて、判定を行なう（図 6、 S 2 0 )。ここで、 g lが正であることは、透明状態と第 1 〜第 3の沈殿状態とからなる状態にあることに対応し、 g 1が負であることは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態にあることに対応する。同様に、 _g 2の正と負は、それぞれ、透明状態と第 1の沈殿状態とからなる状態にあること、第 2〜第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とカゝらなる状態にあることに対応する。したがって、 g lと g 2が共に正のときは、未知タンパク質溶液が透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態（図 6、分枝 2 0 2；表 1、 Aまたは B) にある。また、 glが正、 g 2が負のときは、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態（分枝 204 ;表 1、 Cまたは D) にあり、 glと g2が共に負のときは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態（分枝 206；表 1、 E) にある。なお、判定基準において、 glカ負、 g2が正という組合わせについて、実際のタンパク質溶液の結晶化状態を示す画像がこのようになることはほとんどなく、この場合はエラーとして図示しない処理がなされ、表 1の Fに分類さる。

次に、画像が透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態（分枝 202；表 1、 A または B) に判定されると、第 3の判定基準 g 3を用いて判定を行なう（S22 )。 g3の正負は、それぞれ、未知タンパク質溶液が、透明状態（分枝 222 ；表 1、 A) にあるカ第 1の沈殿状態（分枝 224 ；表 1、 B) にあるかに対応する。

また、画像が、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態（分枝 204；表 1、 Cまたは D)に判定されると、第 4の判定基準 g4を用いて判定を行なう（S 24)。 g 4の正負は、それぞれ、未知タンパク質溶液が、第 2の沈殿状態（分枝 242 ；表 1、 C) にある力、、第 3の沈殿状態（分枝 244；表 1、 D) にあるかに対応する。

以上のようにして、表 1の A〜Eのいずれであるかが判定された後、各判诘果に応じて、判定結果を保持する変数 Xにその結果を格納する（S 26 a〜S 2 6 e)。そして、その判定結果を出力する（S 28)。

表 2に、本実施の形態において得られた未知タンパク質の画像の各分類の結果を示す。表の各行には、同じ画像を人により分類した結晶化状態であり、各列には、本実施の形態のシステムによって処理をして求められた分類である。各データは、人による分類と計算による分類とに当てはまる画像の実際の枚数である。「結果」の列には、人により分類されている画像が、計算によって適切に分類されている割合を示している。

(表 2 )

このように、人によって分類されていた分類のうち、透明（表 1 、 A)、沈殿 ( i ) (B)、沈殿（i i ) (C)、沈殿（i i i ) (D) I これらの相互からも、そして、残りの分類 (E) 力らも良好に分類されている。

本実施の形態の構成から、本発明によつて »されるタンパク質溶液の結晶化状態の判定方法をまとめると図 8のようになる。

即ち、タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする（原画像取得ステツプ、 S 4 2 )。そして、該原画像の少なくとも一部分について第 1の同時生成行列を算出する（原画像行列算出ステップ、 S 4 4 )。さらに、該第 1の同時生成行列から第 1組の画像統計量を算出する（原画像統計量算出ステップ、 S 4 6 )。原画像には、微分処理を行なって微分画像が求められる（画像微分ステップ、

S 4 8 )。微分画像の少なくとも一部分について第 2の同時生成行列が算出される（微分画像行列算出ステップ、 S 5 0 )。この第 2の同時生成行列から第 2組の画像統計量が算出される（微分画像統計量算出ステップ、 S 5 2 )。第 2組の画像統計量は、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも 2種に分類するのに用いられる（第 1の判定ステップ、 S 5 4 )。第 1の判定ステップで分類された結果、前記 2種のうちの第 1種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像は、さらに前記第 1組の画像統計量を用いて少なくとも 2種に分類される（第 2の判定ステップ、 S 5 6 )。ここで、第 1の判定ステップは、図 6においてステップ S 2 0として表わされ、第 2の判定ステップは、図 6においてステップ S 2 2として表わされている。この処理は、第 1の判定ステップおよび第 2の判定ステップに本実施の形態のようにして確立した判定基準を用いてコンピュータの動作により実行される。

本発明においては、タンパク質溶液の電子画像の原画像と微分画像を共に用いることにより、タンパク質の溶液における結晶化の状態を良好に判定できる。また、判定ステップを 2段階とすることにより、タンパク容液の結晶化状態を判定する作業の «化が容易となり、判定のエラーが低減される。また、透明、沈殿（i )、沈殿 ( i i )、沈殿 ( i i i ) を適切に分類することが可能となる。判定基準とその順序を適切に構築することにより、判定の際のエラーが低減され、人による判定が良好に再現されて «化が可能となる。さらに本発明の角晰システムに、タンパク質の溶液の結晶化サンプルの自動観察手段を組合わせれば、未知タンパク質の観察とその未知タンパク質の結晶化状態の判定とを連続して自動で行なうタンパク質結晶化状態観察角浙システムが構築できる。

以上のように、いくつかの例示的な実施形態が本発明に関して詳細に説明された。当業者には、本発明の新規な開示および効果から実質的に離れることなくこれら実施形態を様々に改良することが可能であることが分るであろう。したがつて、そのような改良も全て本発明の範囲に含められるべきことが意図されている

Claims

請求の範囲

1 . タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得ステップと該原画像の少なくとも一部分について第 1の同時生成行列を算出する原画像行列算出ステップと、

該第 1の同時生成行列から第 1組の画像統計量を算出する原画像統計量算出ステップと、

該原画像に微分処理を行なつて微分画像を得る画像微分ステツプと、該微分画像の少なくとも一部分について第 2の同時生成行列を算出する微分画像行列算出ステップと、

該第 2の同時生成行列から第 2組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出ステップと、

該第 2組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも 2種に分類する第 1の判定ステップと、

前記第 1の判定ステップで分類された結果、前記 2種のうちの第 1種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第 1組の画像統計量を用いて少なくとも 2種に分類する第 2の判定ステップと

を含む、タンパク質溶液の結晶ィ匕状態の判定方法。

2. 前記第 1の判定ステップで分類された結果、前記第 1種以外の種に分類されたタンパク質溶液の電子画像を、前記第 2糸且の画像統計量を用いてさらに少なくとも 2種に分類する第 3の判定ステップをさらに含む、請求項 1に記載の方法。

3 . 予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 1 の判定ステップにおいて用いる第 1の判定基準と第 2の判定基準とを、前記第 2 組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、

前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 2 の判定ステップにおいて用いる第 3の判定基準を、前記第 1組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと、

前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 3 の判定ステップにおヽて用いる第 4の判定基準を、前記第 2組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するステップと

をさらに含み、

前記第 1の判定ステップは、前記第 1の判定基準と前記第 2の判定基準とにより、前記第 2組の画像統計量を用いて電子画像を 3種に分類するものであり、前記第 2の判定ステップは、前記第 3の判定基準により、該第 1組の画像統計量を用いて前記 3種のうちの第 1種に属する電子画像をさらに 2種に分類するものであり、

前記第 3の判定ステップは、前記第 4の判定基準により、該第 2組の画像統計量を用いて前記第 1種以外のいずれかの種に属する電子画像をさらに 2種に分類するものである、請求項 2に記載の方法。

4. 請求項 3に記載の方法において、透明状態、第 1〜第 4の沈殿状態、微結晶状態、およひ 7诘晶状態を要素として構成される複数の状態のいずれかにタンパク質溶液の電子画像を分類する方法であって、

前記第 1の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第 1〜第 3の沈殿状態とからなる状態のレヽずれか、あるいは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態と力らなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 2の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第 1の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第 2〜第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 3の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第 1の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 4の判定基準は、タンパク辦液が、第 2の沈殿状態、あるいは、第 3 の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 1の判定ステップは、前記第 1の判定基準と前記第 2の判定基準とにより、タンパク質溶液が、透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態のいずれ力、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態のいずれ力、あるいは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのいずれにあるかを判定するステップであり、

前記第 2の判定ステップは、前記第 3の判定基準により、透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液が、透明状態、あるいは、第 1の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップであり、

前記第 3の判定ステップは、前記第 4の判定基準により、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液力第 2の沈殿状態、あるいは、第 3の沈殿状態のどちらにあるかを判定するステップである、方法。

5. タンパク質溶液の電子画像を取得して原画像とする原画像取得手段と、該原画像の少なくとも一部分について第 1の同時生成行列を算出する原画像行列算出手段と、

該第 1の同時生成行列から第 1組の画像統計量を算出する原画像統計量算出手段と、

該原画像に微分処理を行ない、微分画像を得る画像微分手段と、

該微分画像の少なくとも一部分について第 2の同時生成行列を算出する微分画像行列算出手段と、

該第 2の同時生成行列から第 2組の画像統計量を算出する微分画像統計量算出手段と、

該第 2組の画像統計量を用いて、タンパク質溶液の電子画像を少なくとも 2種に分類する第 1の判定手段と、

前記第 1の判定手段で分類された結果、前記 2種のうちの第 1種に属すると判定されたタンパク質溶液の電子画像をさらに前記第 1組の画像統計量を用いて少なくとも 2種に分類する第 2の判定手段と

を含む、タンパク質溶液の結晶化状態の判定システム。

6. 前記第 1の判定手段で分類された結果、前記第 1種以外の種に分類されたタンパク質溶夜の電子画像を、前記第 2糸且の画像統計量を用いてさらに少なくとも 2種に分類する第 3の判定手段をさらに含む、請求項 5に記載のシステム。

7. 判定基準設定手段をさらに備え、

該判定基準設定手段は、

予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 1の判定手段において用いる第 1の判定基準と第 2の判定基準とを、前記第 2組の画像統計量に基づく線形判別法により確立し、

前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 2 の判定手段において用いる第 3の判定基準を、前記第 1組の画像統計量に基づく線形判別法により確立し、

前記予め判定されているタンパク質の結晶状態の電子画像を用いて、前記第 3 の判定手段において用いる第 4の判定基準を、前記第 2組の画像統計量に基づく線形判別法により確立するものであり、

前記第 1の判定手段は、前記第 1の判定基準と前記第 2の判定基準とにより、前記第 2組の画像統計量を用いて電子画像を 3種に分類するものであり、前記第 2の判定手段は、前記第 3の判定基準により、該第 1組の画像統計量を用いて前記 3種のうちの第 1種に属する電子画像をさらに 2種に分類するものであり、

前記第 3の判定手段は、前記第 4の判定基準により、該第 2組の画像統計量を用いて前記第 1種以外のいずれかの種に属する電子画像をさらに 2種に分類するものである、請求項 6に記載のシステム。

8 . 請求項 7に記載のシステムにおいて、透明状態、第 1〜第 4の沈殿状態、微結晶状態、および結晶状態を要素として構成される複数の状態のいずれかにタンパク質溶液の電子画像を分類するシステムであつて、

前記第 1の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第 1〜第 3の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とからなる状態のいずれかのどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 2の判定基準は、タンパク質溶液が、透明状態と第 1の沈殿状態とからなる状態のいずれか、あるいは、第 2〜第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態と力らなる状態のレ、ずれかのどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 4の判定基準は、タンパク質溶液が、第 2の沈殿状態、あるいは、第 3 の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 1の判定手段は、前記第 1の判定基準と前記第 2の判定基準とにより、タンパク質溶液が、透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態のいずれか、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態のいずれか、あるいは、第 4の沈殿状態と微結晶状態と結晶状態とカらなる状態のいずれかのいずれにあるかを判定するものであり、

前記第 2の判定手段は、前記第 3の判定基準により、透明状態と第 1の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク質溶液力透明状態、あるいは、第 1 の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものであり、

前記第 3の判定手段は、前記第 4の判定基準により、第 2〜第 3の沈殿状態からなる状態のいずれかにあるタンパク液が、第 2の沈殿状態、あるいは、第 3の沈殿状態のどちらにあるかを判定するものである、システム。