WO2005014810A1 - ダンベル型ｄｎａの効率的な製造方法 - Google Patents

ダンベル型ｄｎａの効率的な製造方法 Download PDF

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WO2005014810A1
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dna
dumbbell
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antisense
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Yasuomi Takagi
Kazunari Taira
Masumi Taki
Yoshio Kato
Makoto Miyagishi
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing dumbbell-shaped DNA.
  • Non-Patent Document 1 a mechanism for introducing a therapeutic gene into a cell to be treated is called a “vector”, and at present, virus vectors and plasmid vectors are mainly used in actual clinical trials.
  • virus vector a virus or the like which usually has no pathogenicity is used.
  • the virus since the virus uses the function of infecting the cell and sending its own gene to the cell, the advantage is that the gene transfer efficiency of the vector into the cell is higher than other vectors.
  • viral vectors can escape pretreatment (inactivation), which eliminates virulence and renders them non-proliferable, and may exhibit intrinsic pathogenicity as a side effect, or may contain a self-replicating virus.
  • pretreatment activation
  • Other major issues include the possibility of unexpected genetic modification and immunogenicity.
  • Plasmid DNA has recently attracted particular attention as an alternative vector having lower immunogenicity and higher productivity than viral vectors.
  • plasmid CpG motif a sequence called plasmid CpG motif in plasmid DNA recognizes macrophage dendritic cells as uptake as a danger signal, and produces various inflammatory site force-in. It has been clarified that immunoreactivity such as immunoreactivity occurs. Inflammatory site forces are inappropriate for gene therapy because their cytotoxic effects reduce gene expression.
  • plasmid DNA usually has antibiotic resistance genes and extra gene sequences derived from heterologous organisms such as microorganisms, and these proteins are unnecessary for gene therapy, and unnecessary genes encoded by those genes are not necessary.
  • Non-Patent Document 2 discloses a gene expression (MIDGE) vector which is limited to minimal immunogenicity, that is, a gene transfer technique using dumbbell-shaped DNA (MIDGE). Technology) is disclosed.
  • MIDGE gene expression
  • This vector is the DNA from which RNA is transcribed, which is made of circular DNA, forming a dumbbell shape.
  • the circular chain is composed of the first complementary sequence, the first non-complementary sequence, the second complementary sequence, and the second non-complementary sequence.
  • the pair forms a duplex, and these duplexes contain a promoter sequence, a coding sequence, a poly A or a stable sequence, and the first and second non-complementary sequences form a loop that forms a single strand.
  • Patent Document 1 Patent Document 1
  • a dumbbell-type DNA vector has been created as a better alternative vector that compensates for the disadvantages of virus vectors and plasmid vectors and takes advantage of the advantages (Non-Patent Document 3).
  • the dumbbell-type DNA vector has no promoter and transcriptional sequence regions, has no extra sequences, and can minimize immunogenicity.
  • E XO nu C l eaSe E XO type nucleolytic enzymes
  • dumbbell DNA which has the minimum sequence of genes necessary for gene therapy and the like, is formed by three-molecule association as shown in FIG. 6 (Non-Patent Document 4).
  • cDNA containing the target gene sequence is used as type I DNA, and a linear target DNA fragment is amplified by PCR (see Fig. 6).
  • Step l PCR
  • both ends of the linear target DNA fragment are cleaved with restriction enzymes. It is common practice to combine this with two synthetic DNAs having a dumbbell loop using DNA ligase to form dumbbell-shaped DNA.
  • the ligation is based on trimolecular association, and the force is also an intermolecular ligation reaction, so that the ligation efficiency is low.
  • the number of moles of each of the two synthetic DNAs having a dumbbell loop is required to be a large excess with respect to the number of moles of the linear target DNA fragment. They are wasted without reaction, It also hinders production. As a result, the yield of the target dumbbell-shaped DNA is very low.
  • dumbbell-shaped DNA vector in a test tube As another method for producing a dumbbell-shaped DNA vector in a test tube, as shown in Fig. 7, two inverted N.BpulOI nick enzyme recognition sequences are directly converted into cDNA as type I DNA. After preparing a target DNA fragment having a chain at both ends, the plasmid vector DNA that can be amplified using Escherichia coli is subcloned, transformed into Escherichia coli, and amplified in large quantities. It is known that a dumbbell-shaped DNA vector containing the target sequence is prepared by treating the DNA sequence of -9, and the dumbbell-shaped DNA derived from the plasmid vector is digested and purified. However, the drawbacks of this construction method are that the operation is very complicated and time-consuming, such as the necessity of subcloning and the need to digest dumbbell-shaped DNA derived from a plasmid vector.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 6,451,593
  • Non-patent Document 1 Verma, I. M .; Somia, N. Nature 1997, 389, 239-242.
  • Non-Patent Document 2 Luo, D .; Saltzman, W.M.Nat. Biotechnol. 2000, 18, 33-37.
  • Non-Patent Document 3 Schakowski, F .; Gorschluter, M .; Junghans, C; Schroff, M .;
  • Non-Patent Document 4 Zanta, M.A .; Belguise—Valladier, P .; Behr, J.P. Proc. Natl. Acad.
  • An object of the present invention is to provide a simple method for producing a dumbbell-shaped DNA.
  • PCR was performed after chemically modifying only one of the loop portions of the two PCR primers with a fluorescent group (fluorescein).
  • the linear DNA of the PCR product was subjected to dambeirido according to the method of the present invention, and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the modified dumbbell-shaped DNA having only one fluorescent group at the loop had exonuclease resistance and improved stability, as shown in FIG.
  • PCR was performed using a primer having only one amino group in one loop portion of two PCR primers.
  • the linear DNA of the PCR product was subjected to dumbbell shaking by the method of the present invention to prepare a dumbbell-shaped DNA having a primary amino group in only one loop portion.
  • Fluorescein-OSu was applied to this and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. It was a factor that the site-specific fluorescein modification of only one primary amino group of the dumbbell DNA of about 500 bp was performed.
  • the force DNA obtained by performing the same experiment using a dumbbell-shaped DNA having no primary amino group in the loop portion and having the same base sequence was not fluorescently modified.
  • the sequence of a natural U6 promoter used as a promoter for expressing siRNA is about 240 to 400 bases, and the sequence of a natural tRNA promoter is about 100 to 150 bases.
  • the shorter the DNA used for gene transfer the better in terms of cell permeability.
  • the permeability to cells was actually examined. If the short DNA sequence was short, the permeability to cells was increased (Fig. 9 (c)) o
  • the length of the DNA to be introduced is 150 base pairs or less, the DNA to be introduced can be produced synthetically.
  • dumbbell-type DNA vector As a technique for introducing (delivery) a dumbbell-type DNA vector into mammalian cells without using a transfection reagent, a peptide was modified in a loop-specific manner with dumbbell-type DNA.
  • the dumbbell-shaped DNA-peptide covalent conjugate was treated with a restriction enzyme (EcoRI) and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. Degraded fragments appeared at different positions depending on the molecular weight of each peptide, confirming the formation of a dumbbell-shaped DNA-peptide covalent conjugate.
  • EcoRI restriction enzyme
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for producing a dumbbell-shaped DNA in which a sense strand and an antisense strand are linked by a single-stranded DNA having a loop structure at both the 5 ′ end and the 3 ′ end of the linear double-stranded DNA And the following steps:
  • step 3 heating the DNA amplification product that has been treated with the nick enzyme in step 2), followed by annealing, and
  • the 5 'end of the sense primer and antisense primer used in step 1) The above-mentioned method, wherein the 5 ′ end of the DNA amplification product is oxidized or the 5 ′ end of the DNA amplification product after the step 1) is performed and before the step 4) is performed.
  • dumbbell-shaped DNA is a tandem-type siRNA expression vector or a stem-loop-type siRNA expression vector.
  • the sense primer and the Z or antisense primer further have a first spacer sequence and a second spacer sequence, wherein the first spacer sequence and the second spacer sequence The sequences are complementary to each other, and the first spacer sequence and the second spacer sequence are linked to face each other across the sequence (b)! [1] The method according to any one of [4].
  • any sequence of TN ⁇ GG (Rooster himself column, T is thymine, A is adenine, G is Guanin, N 1 is adenine, cytosine, the Guanin or thymine (a)
  • the sequence of (b) is represented by (T) (where T is thymine and n is an integer of 1 or more), and the sequence of (c) is represented by CCTN U AGC (in the sequence, or cytosine, T is thymine, a is adenine, G is Guanin, N 11 is adenine, cytosine, the Guanin or thymine is whether deviation.) represented by [1] one [5] , The method described in the shift.
  • the sense primer and the antisense primer further have a first spacer sequence and a second spacer sequence, and for the sense primer, the first spacer sequence is represented by AG;
  • the second spacer sequence is represented by TC, the second spacer sequence is represented by AG, and the second primer sequence is represented by TC.
  • a composition comprising at least one set of primers that also comprises a sense primer and an antisense primer, wherein the sense primer and the antisense primer each have the following sequence (a) at the 5 ′ end.
  • the composition having the following sequence (b), sequence (c) and sequence (d) in the order of 5 ′ terminal side and 3 ′ terminal direction: .
  • dumbbell-shaped DNA in which a sense strand and an antisense strand are linked by a single-stranded DNA having a loop structure is used.
  • a dumbbell-shaped DNA in which a sense strand and an antisense strand are linked by a single-stranded DNA having a loop structure at each of the 5 ′ end and the 3 ′ end of the linear double-stranded DNA is used.
  • a kit used for production comprising at least one primer consisting of a sense primer and an antisense primer, wherein each of the sense primer and the antisense primer has the following sequence (a) at the 5 ′ end.
  • the kit having the following sequence (b), sequence (c), and sequence (d) in order from the 5 ′ terminal side to the 3 ′ terminal side.
  • dumbbell-shaped DNA in which the sense strand and the antisense strand are linked by a single-stranded DNA having a loop structure, respectively.
  • the 5 'end of the sense primer and antisense primer used in step 1) is phosphorylated, or the 5' end of the DNA amplification product after step 1) and before step 4) Is phosphorylated.
  • dumbbell-shaped DN in which a sense strand and an antisense strand are linked by a loop-structure single-stranded DNA at each of the 5 ′ end and the 3 ′ end of the linear double-stranded DNA.
  • the dumbbell-shaped DNA which is A and comprises the following sequences (a ') to (d'):
  • dumbbell-shaped DNA according to [15] or [16], which is capable of being introduced into a cell or tissue to express a functional nucleic acid in the cell or tissue.
  • dumbbell-shaped DNA according to [17], wherein the functional nucleic acid to be expressed is double-stranded RNA including siRNA or hairpin RNA.
  • dumbbell-shaped DNA according to [17], wherein the functional nucleic acid to be expressed is a ribozyme.
  • dumbbell-shaped DNA according to [17], wherein the functional nucleic acid to be expressed is an antisense RNA
  • dumbbell-shaped DNA according to any one of [17] to [20], including all or a part of a promoter region transcribed from RNA polymerase III.
  • dumbbell-shaped DNA comprising a sequence of 250 bases or less, including at least one sequence of (0-Gv) having a total or partial strength of a promoter region transcribed from RNA polymerase III.
  • ATGCAAAT! is a sequence complementary to ATGCAAAT!
  • R is either guanine or adenine
  • Y is either cytosine or thymine
  • N is any of guanine, adenine, cytosine or thymine.
  • dumbbell-shaped DNA according to any one of [21] to [23], comprising any one of SEQ ID NOs: 1, 22, 23 and 25.
  • dumbbell-shaped DNA according to any one of [17] to [24], wherein the target of the functional nucleic acid to be expressed is a gene associated with a virus or cancer.
  • dumbbell-shaped DNA according to [25], wherein the virus is selected from the group consisting of HIV, HCV and HBV.
  • dumbbell-shaped DNA according to [15] or [16], which can be introduced into a cell or tissue to suppress gene expression.
  • dumbbell-shaped DNA according to any one of [15]-[29], wherein the dumbbell-shaped DNA is a modified DNA produced from optically active boranophosphate.
  • a pharmaceutical composition comprising the dumbbell-shaped DNA according to any one of [15] to [30].
  • the method for producing dumbbell-shaped DNA of the present invention has the following advantages.
  • the ligation reaction that cyclizes to dumbbell-shaped DNA is an intramolecular reaction, so that the amount can be obtained as compared with the conventional method shown in FIG. 6, which is very efficient.
  • the cyclization yield is about 40% in the conventional method (based on double-stranded DNA), but can be 80% or more in the method of the present invention.
  • operation 4 in FIG. 6 only about 4% of synthetic oligo DNA having a functional group or a reaction point in the loop becomes dumbbell DNA, and the remaining 96% is wasted.
  • dumbbell-shaped DNA means that a sense strand and an antisense strand have a single loop structure at both the 5 'end and the 3' end of a linear double-stranded DNA.
  • DNA linked by strand DNA The DNA constituting the dumbbell-shaped DNA may or may not be modified whether the base moiety, the phosphate moiety, the sugar moiety, the 5 ′ end and the Z or 3 ′ end are modified (modified DNA). (Natural DNA).
  • Modified DNA substituted with a group selected from the group consisting of a group (-OR) (R is, for example, a methyl group and an ethyl group) is also available from Biochemistry (1979) 18, 5134 .; Tetrahedron Lett. (1982) 23, 4289.
  • Modified DNA substituted with a group selected from the group consisting of amino groups (-NH-) is described in Nucleic Acids Res. (1997) 25, 830.
  • the oxy group (-0-) force bonded to the 3'-position carbon of phosphorus and sugar in the phosphate moiety methylene group (-CH-), thioxy group (-S-) and
  • Modified DNA substituted by a group selected from the group consisting of amino groups (—NH—) is described in Pro Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 5798. Modified DNA in which the phosphate moiety is phosphorodithioated is described in Tetrahedron Lett. (1988) 29, 2911 .; JACS (1989) 111, 2321.
  • modified base examples include 2-aminopurine, 2′-amino-butyrylvinylene-peridine, 2′-aminoperidine, 2′-deoxyperidine, 2′-fluoro-cytidine, 2′-fluoro-peridine, 2, 6-diaminopurine, 4-thio-peridine, 5-bromo-peridine, 5-fluoro-cytidine, 5-fluoro-uridine, 5-indo-peridine, 5-methyl-cytidine, inosine, N3-methyl-peridine, 7 -Daza-guanine, 8-aminohexyl-amino-adenine, 6-thio-guanine, 4-thio-thymine, 2-thio-thymine, 5-odo-peridine, 5-odo-cytidine, 8-bromo -Guanine, 8-bromo-adenine, 7-deza-adenine, 7-deza-guanine, 8-oxo
  • sugar moiety examples include, but are not limited to, 3'-deoxylation, 2'-fluorination, alabanosidani and the like. These can also be introduced into DNA by chemical synthesis.
  • Examples of the modification at the 5 'end include 5'-amination, 5'-pyotination, 5'-fluorescein, 5' tetrafluoro mouth-fluorescein, 5'-thiol, and 5'-dabsylation Powers that can be mentioned are not limited to these.
  • modification at the 3 'end examples include 3'-amination, 3'-pyotination, 2,3-dideoxylation, 3'-thiol, 3'-dabsylation, 3'-carboxylate , 3'-cholesterylation, etc., but not limited thereto.
  • Nick refers to DNA damage in which a phosphoester bond in one strand of double-stranded DNA is cleaved by the action of endonuclease to produce a phosphate group at 5 'and a hydroxyl group at 3'. It is. This damage is a break that can be repaired by DNA ligase.
  • nick enzyme cleavage recognition sequence refers to a DNA sequence that is recognized by a nick enzyme and has a nick at a specific position.
  • Annealing means that DNA dissociated from double-stranded to single-stranded is reunited with double-stranded DNA.
  • the association of double-stranded DNA may occur between two molecules (ie, between two DNA strands) or may occur within the same molecule (ie, within one DNA strand).
  • the annealing causes association within the same molecule to form a new double-stranded DNA portion and a new loop portion.
  • promoter is a type of regulatory gene to which RNA polymerase binds and initiates operon transcription.
  • siRNA refers to a short, double-stranded oligonucleotide having an RNA interference effect (ie, having an activity of cleaving a target mRNA).
  • the RNA strand that recognizes the target mRNA is the antisense strand, and the other RNA strand is the sense strand.
  • an “antisense strand” is an RNA strand recognized by mRNA.
  • the number of bases of the siRNA is usually 50 or less, preferably 10 to 40, and more preferably 10 to 30.
  • siRNAs are not limited to RNA molecules, and may be chimeric molecules of RNA molecules and other nucleotides (eg, DNA, etc.), and may be substituted or modified forms of these molecules.
  • substituted and modified RNA and DNA molecules include 5'-monophosphoric acid at the 5 'end, 2'-hydroxy, 2'-0-methyl, and biotin at the 3' terminal 2 'hydroxyl group. , 2 ', 3'-dideoxycytosine, and aminoaminophosphoester.
  • siRNA transcription sequence refers to a DNA sequence encoding siRNA.
  • the siRNA transcription sequence includes both a DNA sequence encoding the sense strand of the siRNA and a DNA sequence encoding the antisense strand of the siRNA.
  • a DNA sequence encoding the sense strand of the siRNA and a DNA sequence encoding the antisense strand of the siRNA, which are operatively linked to each of the two promoter sequences, are referred to as tandem siRNA expression.
  • DNA sequence encoding the sense strand of the siRNA and the DNA sequence encoding the antisense strand of the siRNA may optionally form an intervening sequence (for example, a sequence capable of forming a loop structure with a single strand).
  • the one that is operatively linked to the promoter sequence is called the “stem-loop siRNA expression vector”! (A in Fig. 8).
  • “Operably linked” means that a transcription product of a DNA sequence encoding the sense strand of siRNA and a DNA sequence encoding the antisense strand of Z or siRNA is generated upon transcription from the promoter. That is, the DNA sequence and the promoter sequence bind to each other. Therefore, the position of the promoter sequence relative to the DNA sequence may be upstream or downstream, but is usually upstream. Further, between the DNA sequence and the promoter sequence, any DNA sequence may be included as long as transcription of the DNA sequence can occur!
  • the "spacer sequence” is biochemically defined between the single-stranded nucleotide sequence of the loop portion and the target DNA sequence (nucleotide sequence related to promoter, transcription, termination, etc.). If you do not have an oligonucleotide sequence,
  • “Facing” means that two mutually complementary sequences are arranged in opposite directions. For example, if the first spacer sequence is represented by AG, the second spacer sequence is represented by TC, and the sequence (b) is represented by TTTT, the first spacer sequence is represented by AG. When the sequence and the second spacer sequence are ligated to face each other with the sequence (b) interposed therebetween, an AGTTTTCT sequence is obtained.
  • nucleic acid main chain refers to the basic skeleton of '...- sugar-phosphate-sugar-phosphate -...'.
  • the nucleic acid backbone can be modified, if, or not!
  • base moiety refers to a moiety of a purine or pyrimidine base constituting a nucleic acid. Purine or pyrimidine bases may or may not be modified!
  • Delivery agent refers to various molecules having a mechanism for accurately delivering a required amount of a drug to a required place in the body, at a required time, or both.
  • “Functional nucleic acid” refers to a nucleic acid having a specific function in cells, tissues, and organs. It includes nucleic acids having physiological activities such as suppression of gene expression, enzymatic activities such as cleavage of RNA, and the ability to bind to proteins, RNA, low molecular weight compounds, and the like.
  • Hairpin RNA refers to RNA in which both the 5'-end and the 3'-end of a linear double-stranded RNA are connected by an RNA / rape having a single-stranded structure! Includes stem structures, stems with loop structures connecting them, and loop RNAs. The stem structures do not have to match exactly.
  • RNA is a general term for biocatalysts that use RNA as a dandelion entity.
  • Antisense RNA includes RNA molecules having a sequence complementary to a certain RNA, which binds complementarily to a certain target RNA and suppresses its expression.
  • DNA zym is a generic term for biocatalysts that use DNA as a diagonal entity.
  • the "optically active boranophosphate” is a boranophosphate having an asymmetric center formed by a covalent bond of a borano group to a 5 ' ⁇ -phosphorus atom in a deoxynucleotide.
  • one indicates a range including numerical values described before and after it as a minimum value and a maximum value, respectively.
  • ⁇ represents adenine
  • C represents cytosine
  • G represents guanine
  • T represents thymine
  • U represents peracil
  • N represents adenine or cytosine
  • the nucleotide sequence shall be described in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction. The invention's effect
  • dumbbell-shaped DNA can be produced by a simple method.
  • FIG. 1 shows an example of a method for producing a dumbbell-shaped DNA of the present invention.
  • This method is particularly advantageous when one or both of the loop portions (in this case, the TTTT sequence) of the upstream and downstream PCR primers have a functional group.
  • the PCR reaction continues until all the PCR primers (raw materials) are consumed, so that the raw materials are almost wasted. Since operations 2) to 3) are all one-pot reactions (reactions in which reagents are simply mixed into one test tube one after another), the operation is also simple.
  • FIG. 2 shows the stability of DNA to exonuclease digestion. Bands were first visualized by (a) fluoroimager 595. The compound numbers 2c and 4c in Figure 1 also correspond to this figure. The band at about 600 bp is the DNA labeled with fluorescein. The gel was then stained with ethidium bromide and bands were visualized with a transilluminator.
  • FIG. 3 is a diagram showing conversion efficiency from a linear vector to a dumbbell-type vector. Gels were stained with ethidium bromide and bands were visualized with a transilluminator.
  • FIG. 4 shows loop-specific modification of dumbbell-shaped DNA using succinimide ester of fluorescein. Bands were first visualized by (a) Fluoro Imager 595. Next The gel was stained with ethidium bromide and bands were visualized with a transilluminator. In lanes 1 and 2, dumbbell-shaped DNA having a primary amino group in the hairpin loop portion was flown, and in lanes 3 and 4, dumbbell-shaped DNA having no primary amino group in the hairpin loop portion was flown. Lanes 2 and 4 ran a sample of the reaction mixture with fluorescein succinimide ester. Lanes 1 and 3 ran the pre-reaction sample.
  • FIG. 5 shows the state of suppression of EGFP expression by various vectors transfected into HeLaS3 / EGFP cells.
  • FIG. 6 shows one of the conventional methods for producing dumbbell-shaped DNA.
  • 4. Mix two types of synthetic oligo DNA (loop part) in a 10-fold equivalent excess with respect to the target DNA fragment, and associate them with three molecules using DNA ligase to synthesize dumbbell-shaped DNA. The yield is low due to the intermolecular ligation reaction.
  • Fig. 3 (B)) 5. Purify only the target DNA fragment using a DEAE ion exchange column, polyacrylamide gel electrophoresis, or agarose electrophoresis.
  • FIG. 7 shows another method for preparing a conventional dumbbell-shaped DNA.
  • primers A and B each having two independent restriction enzyme cleavage sites and two BpulOI restriction enzyme sites
  • the coding region is amplified and purified.
  • Treat with different restriction enzymes A and B. Purify only the target DNA fragment using a DEAE ion exchange column, polyacrylamide gel electrophoresis, or agarose electrophoresis.
  • a vector DNA such as MIDGE vector
  • FIG. 8 is a diagram schematically showing an example of a tandem type siRNA expression vector (a)) and a stem loop type siRNA expression vector (b)).
  • tandem siRNA expression vector of a sense RNA and antisense RNA are transcribed from two U6 promoters.
  • stem-loop type siRNA expression vector of b short hairpin RNA is transcribed and processed to produce siRNA.
  • FIG. 9 shows the effect of a dumbbell-type vector into which a miniaturized promoter has been introduced.
  • the miniaturized promoter has almost the same expression activity as the natural U6 promoter ((a)), and the siRNA expressed by the miniaturized promoter has the effect of suppressing the expression of the luciferase gene (( b)) Furthermore, the miniaturized promoter was more nuclear permeable than the native U6 promoter ((c)).
  • a type I DNA having a target DNA sequence is prepared.
  • A Chemically synthesized DNA (both single-stranded DNA and double-stranded DNA), DNA synthesized by biochemical methods such as PCR (both single-stranded DNA and double-stranded DNA) In some cases).
  • Type DNA DNA is linear DNA even if it is circular DNA.
  • the length of the target DNA sequence is preferably 20 to 2000 bases, more preferably 40 to 1000 bases, and more preferably 40 to 500 bases.
  • the target DNA sequence includes a promoter sequence, a sequence of a target transcription region (for example, siRNA transcription sequence, decoy transcription sequence, untranslated RNA transcription sequence (for example, microRNA (miRNA) transcription sequence, tRNA transcription sequence), Examples of such sequences include a sequence required for translation of the protein, a decoy sequence, etc.
  • a target transcription region for example, siRNA transcription sequence, decoy transcription sequence, untranslated RNA transcription sequence (for example, microRNA (miRNA) transcription sequence, tRNA transcription sequence
  • miRNA microRNA
  • the promoter is not particularly limited as long as it affects the efficiency of the transcription reaction initiation reaction, but is suitable for expression of short RNA such as siRNA when the dumbbell-shaped DNA of the present invention is used as an siRNA expression vector.
  • short RNA such as siRNA
  • a pol III system is used.
  • polIII promoter examples include, for example, U6 promoter, tRNA promoter, retroviral LTR promoter, adenovirus VA1 promoter, 5S rRNA promoter, 7SK RNA promoter, 7SL RNA promoter, HI RNA promoter and the like. .
  • the natural U6 promoter has several types of sequences, and the promoter sequence (U6 (240)) used in Example 2 described below is as follows.
  • An artificial promoter having a reduced promoter region to be expressed may be used.
  • Examples of such an artificial promoter include those containing all or a part of the promoter region transcribed from RNA polymerase III and containing at least one sequence of the following (0- (iv)).
  • RNA polymerase Examples include all or part of the promoter region transcribed from III and at least one sequence of the following ( ⁇ ′)-( ⁇ ′).
  • R is either guanine or adenine
  • Y is either cytosine or thymine
  • N is any of guanine, adenine, cytosine or thymine.
  • the number of bases in the artificial promoter is 250 Preferably less than 150 bases Below, more preferably 100 bases or less.
  • Examples of the artificial promoter include the U6 (90) and U6 (110) promoters described in Examples below. The sequences of the U6 (90) and U6 (110) promoters are described below. • U6 (90) promoter
  • an inducible promoter as the promoter, it is possible to express the siRNA at a desired timing.
  • inducible promoters include the U6 promoter inducible with tetracycline (Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the tunctional activity of an antisense RNA by a tetracycline— responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)).
  • tissue-specific siRNA expression may be induced using a tissue-specific promoter or a DNA recombination system such as the Cre-LoxP system.
  • the length of the promoter sequence is preferably 11 to 1500 bases, more preferably 40 to 500 bases, and even more preferably 60 to 260 bases.
  • the siRNA transcription sequence may be a DNA sequence encoding the siRNA.
  • Target genes include genes responsible for various diseases including genetic diseases, apoptosis-related genes (eg, p53), leukemia gene bcr-abl junction, cancer ras, myx, met, mdm2, abl, erbB, etc.
  • genes related to various diseases, genomes of pathogenic viruses such as HIV and HCV, and the like can be exemplified.
  • the following documents disclose the siRNA transcription sequence.
  • the C-JUN siRNA transcript sequence is described in J Biol Chem. 2003 Jun 27 Disruption of the c-JUN-JNK complex by a cell-permeable peptide containing the c— JUN delta domain induces apoptosis and affects a distinct set of IL—1— Induced inflammatory genes.
  • Chkl siRNA transcript is described in Mol Cancer Ther. 2003 Jun; 2 (6): 543- 8.Human chkl expression is dispensable for somatic cell death and critical for sustaining g (2) DNA damage checkpoint. Chen Z, Xiao Z, Chen J, Ng S, Sowin T, Sham H, Rosenberg S, Fesik S, Zhang H.
  • the caspase 8 siRNA transcript sequence is Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Jun 16 Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice.Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B, Waltemathe M , Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S .; Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Jun 16 Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice.Zender L, Hutker S , Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B,
  • RECK siRNA transcript sequence is Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Jun 16 Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice.Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B, Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S.
  • STRAD siRNA transcript sequence is EMBO J. 2003 Jun 16; 22 (12): 3062-3072.Activation of the tumour suppressor kinase LKBl by the STE20— like pseudokinase STRAD.Baas AF, Boudeau J, Sapkota GP, Smit L, Medema R, Morrice NA, Alessi DR, Clevers HC.
  • ErbB3 siRNA transcription sequence is described in Oncogene.2003 Jun 5; 22 (23): 3598-607.Atypical expression of t Di33 in myeloma cells: cross-talk oetween trbBj and the
  • interferon-alpha signaling complex Described in Walters DK, French JD, Arendt BK, Jelinek DF.
  • Androgen Receptor Represses the Neuroendocrine Trans differentiation Process in Prostate Cancer Cells.
  • Wright ME Tsai MJ, Aebersold R.
  • the FADD siRNA transcript sequence is described in J Biol Chem 2003 May 12 cFLIP-L inhibits p38 MAPK activation: An additional anti- apoptotic mechanism in bile acid-mediated apoptosis.Grambinler A, Higuchi H, Bronk SF, Gores GJ. I have.
  • siRNA transcription sequence of HB-EGF is described in EMBO J 2003 May 15; 22 (10): 2411-2421 TACE cleavage of proamphiregulin regulates GPCR— induced proliferation and motility of cancer cells.Gschwind A, Hart S, Fischer OM, Ullrich A. EMBO J 2003 May 15; 22 (10): 2411-2421 TA digestion of proamphiregulin regulates GPCR—induced proliferation and motility of cancer cells. Gschwind A, Hart S, Fischer OM, Ullrich A.
  • TACE siRNA transcription sequence is described in EMBO J 2003 May 15; 22 (10): 2411-2421 TACE cleavage of proamphiregulin regulates GPCR— induced proliferation and motility of cancer cells.Gschwind A, Hart S, Fischer OM, Ullrich A. Have been.
  • siRNA transcribed sequence of p73 is described in Cancer Cell 2003 Apr; 3 (4): 403-10 Chemosensitivity linked to p73 function. Irwin MS, Kondo K, Marin MC, Cheng LS, Hahn WC, Kaelin WG.
  • j8-catenin siRNA transcripts are available from Clin Cancer Res 2003 Apr; 9 (4): 1291-300 Small Interfering RNAs Directed against beta-- Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells. Verma UN, Surabhi RM, Schmaltieg A, Becerra C, Gaynor RB.
  • APC siRNA transcripts are available from Clin Cancer Res 2003 Apr; 9 (4): 1291-300 Small Interfering RNAs Directed against beta— Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells.Verma UN, Surabhi RM, Schmaltieg A , Becerra C, Gaynor RB.
  • NF- ⁇ B siRNA transcript sequence is described in Clin Cancer Res 2003 Apr; 9 (4): 1291-300 Small Interfering RNAs Directed against beta— Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells.Verma UN, Surabhi RM Schmaltieg A, Becerra C, Gaynor RB.
  • the pi 20 siRNA transcript sequence is described in Gastroenterology 2003 Apr; 124 (4): 949-60
  • ATM siRNA transcripts are described in Cancer Res 2003 Apr 1; 63 (7): 1550-4 Enhanced Radiation and Chemotherapy-mediated Cell Killing of Human Cancer Cells by Small Inhibitory RNA Silencing of DNA Repair Factors.Collis SJ, Swartz MJ, Nelson WG, DeWeese TL.
  • the ATR siRNA transcript sequence is a
  • telomerase siRNA transcription sequence is described in Mol Cancer Ther 2003 Mar; 2 (3): 209-16 Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference.Kosciolek BA, Kalantidis K, Tabler M, Rowley PT .; Mol Cancer Ther 2003 Mar; 2 (3): 209— 16 Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference.
  • Cyclin G siRNA transcript sequence Oncogene 2003 Mar 20; 22 (ll): 1678-87 Modulation of p53 and p73 levels by cyclin G: implication of a negative feedback regulation. It is described in Ohtsuka T, Ryu H, Minamishima YA, Ryo A, Lee SW.
  • MDCl siRNA transcript sequence is Nature 2003 Feb 27; 421 (6926): 961-6 MDCl is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint.
  • Stepwart GS Wang B, Bignell CR, Taylor AM, Elledge SJ .
  • Nature 2003 Feb 27; 421 (6926): 961-6 MDCl is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint.
  • Stewart GS Wang B, Bignell CR, Taylor AM, Elledge SJ.
  • RNA transcription sequence of DNMTl is reported in Nat Genet 2002 Dec 23 DNMTl is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells.Robert MF, Morin S, Beaulieu N, Gauthier F, Chute IC, Barsalou A, MacLeod AR. Has been described.
  • DNA-PKcs siRNA transcript sequence is as shown in Cancer Res 2002 Nov 15; 62 (22): 6400-4 Silencing Expression of the Catalytic Subunit of DNA- dependent Protein Kinase by Small Interfering RNA Sensitizes Human Cells for Radiation-induced chromosome Damage, Cell Killing, and Mutation. Peng Y, Zhang Q, Nagasawa H, Okayasu R, Liber HL, Bedford JS.
  • the p21Cipl / Wafl siRNA transcript sequence is Genes Dev 2002 Nov 15; 16 (22): 2923-34 Cdk4 disruption renders primary mouse cells resistant to oncogenic transformation, leading to Arf / p53-independent senescence.Zou X, Ray D, Aziyu A, Hristov K, Boiko AD, Gudkov AV, Kiyokawa H.
  • siRNA for EZH2 is Nature 2002 Oct 10; 419 (6907): 624-9
  • the polycomb group protein E H2 is involved in progression of prostate cancer.Varambally 3 ⁇ 4, Dhanasekaran SM, Zhou M, Barrette TR, Kumar—Sinha C, Sanda MG, Ghosh D, Pienta KJ, Sewalt RG, Otte AP, Rubin MA, Chinnaiyan AM.
  • p73 siRNA transcript sequence is described in Oncogene 2002 Jul 18; 21 (31): 4715-27 p53 induces the expression of its antagonist p73 Delta N, establishing an autoregulatory feedback loop.
  • miRNAs are small, untranslated RNAs that interact with other biomolecules to affect development and differentiation.
  • the miRNA transcription sequence may be any DNA sequence that encodes miRNA.
  • the miRNA rooster sequence is described in literature such as Kawasaki H, Taira K., Hesl is a target of microRNA-23 during retinoic-acid- induced neuronal differentiation of NT2 cells., Nature. 2003, 423, 838-842. Been!
  • the length of siRNA and miRNA transcription sequences is preferably 1200 bases, more preferably 15-40 bases. , More preferably 18-25 bases.
  • the tRNA transcription sequence may be a DNA sequence encoding tRNA.
  • the tRNA transcript sequence was identified as Kose i S, lanabe ⁇ , 1 ani K, Asano S, Shioda T, Nagai Y, 3 ⁇ 4himada ⁇ , Ohkawa J, ⁇ aira K., Factors governing the activity in vivo of ribozymes transcribed by RNA polymerase III. , J. Virol. 1999 Mar; 73 (3): 1868-77 .; Kawasaki H, Taira K.
  • tRNA (Val) promoter significantly Induced RNAi—mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells.
  • the length of the tRNA transcription sequence is preferably 1-1200 bases, more preferably 65-110 bases, and more preferably 80-92 bases.
  • the sequence required for Bax translation is 01tvai, ZN, Milliman, L. and Korsmeyer.SJ, Be 2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death, Cell 74 (4), 609-619 (1993).
  • the length of the sequence required for translation of a particular protein is preferably 1 to 2000 bases, preferably 50 to 1000 bases, and more preferably 65 to 800 bases.
  • the decoy sequence has the same sequence as the transcription factor binding site of the gene, and the transcription factor binds to it, preventing the transcription factor from binding to the original genomic binding site, and as a result, the expression of the transcription factor is suppressed. If it is done, it may be good! /.
  • the transcription factors (proteins) other than E2F are known to bind to decoy molecules, such as AP-1, NF-kB, SSRE, CREB, MEF-2, CarG box, tax, VP16, and TAR / tat.
  • GRE / HRE / MRE Heat shock RE ⁇ SRE ⁇ AP-2, sterol response element, TGF- b responsive element ⁇ HIF-1 and so on.
  • a decoy transcription sequence is a sequence encoding a decoy sequence (in the case of RNA decoy).
  • the decoy may also be a short DNA double-stranded nucleic acid (drug) containing the sequence of the DNA binding site of the transcription factor.
  • the dumbbell-shaped DNA itself, which is not transcribed, acts as a ⁇ (decoy) molecule.
  • CDNA having the desired DNA sequence can be obtained by converting the desired DNA sequence into a plasmid, virus, Can be prepared by incorporating it into a PCR product or the like.
  • the method of integration is described in the literature, such as 'Molecular and lomng' from J. bmabrook and DW Russell, www.MolecularClonmg.con.
  • a known method can be used to synthesize type I DNA having the desired DNA sequence.
  • the target DNA sequence in type I DNA is amplified by the nucleic acid amplification method using the sense primer and the antisense primer (1 in FIG. 1)).
  • each of the sense primer and the antisense primer has the following sequence (a) at the 5 ′ end, and is directed in the order from the 5 ′ end to the 3 ′ end in the following order ( It has the sequence of b), the sequence of (c) and the sequence of (d).
  • the length of the sequence (a) is preferably 110 bases, more preferably 117 bases, and even more preferably 5 bases.
  • the length of (b) is preferably 110 bases, more preferably 110 bases, and more preferably 316 bases.
  • the length of (c) is preferably 4-20 bases, more preferably 5-15 bases, and even more preferably 710 bases.
  • the length of (d) is preferably from 5 to 50 bases, more preferably from 10 to 30 bases, and even more preferably from 15 to 25 bases.
  • the nick enzyme should cleave (nick) only one strand of double-stranded DNA.
  • the following are examples of nick enzymes currently on the market that cleave only one strand of double-stranded DNA and their cleavage recognition sequences (restriction enzyme sites).
  • the following sequence is the sequence of the strand that is recognized by the nick enzyme and into which the nick enters (in this case, “sense sequence of nick enzyme cleavage recognition sequence”).
  • BpulOI restriction enzyme site GCTNAGG (N.
  • BpulOI nick enzyme recognizes the sequence of GC'TNAGG and puts a nick at the position; N can be any sequence of ATGC.
  • N.BpvC IB recognition site CCTCAGC (N.BpvC IB nick enzyme recognizes the CC'TCAGC sequence and puts a nick at the position)
  • N.BstNB I recognition site GAGTCNNNNN (N.BstNB I nick enzyme PAG, GAGTCNNNN recognizes' N 'sequence and inserts a nick at' position)
  • N.Alw I recognition site GGATCNNNNN (N.Alw I nick enzyme recognizes the sequence of GGATCNNNN'N and puts a nick at the position)
  • N.BpvC IA recognition site GCTGAGG (N.BpvC IA nick enzyme recognizes the sequence of GC'TGAGG and puts a nick at the position)
  • the sequence of (a) can include TNAGG, and the sequence of (c) can include CCTNAGC.
  • the sequence of (a) includes TCAGC, and the sequence of (c) includes GCTGAGG.
  • the sequence of (a) can be N, and the sequence of (c) can be NNNNNGACTC.
  • the sequence of (a) can be N and the sequence of (c) can be NNNNNGATCC.
  • the sequence of (a) includes TGAGG, and the sequence of (c) includes CCTCAGC.
  • the sequence of (b) may be any sequence as long as it can form a loop structure with a single strand.
  • One example is described below.
  • the sequence of (b) may be a sequence of aptamer DNA.
  • the sequence of the aptamer DNA is described below.
  • one of the sequence (b) of the sense primer and the antisense primer is a sequence of the aptamer DNA
  • the other sequence (b) is a dye (for example, Eu 3+ complex (a rare earth such as europium). Complex with a dye and an organic compound) or Reactive Green 19). Fusion of thrombin DNA aptamer-binding motif with target protein When the protein is expressed in the cell, Eu 3+ complex dye-dumbbell DNA is introduced into the cell, resulting in target protein power (rare earth type) Labeled with dye.
  • Applications such as high-sensitivity measurement of target proteins in cells using delayed fluorescence are possible.
  • One of the sense primer and the antisense primer is a sequence of the aptamer DNA, and the other (b) is modified with a dye.
  • the sense primer and / or the antisense primer may further have a first spacer sequence and a second spacer sequence.
  • first spacer sequence and the second spacer sequence are sequences complementary to each other, and the first spacer sequence and the second spacer sequence are defined as (b) They are connected so as to face each other across the array.
  • the sense primer and antisense plug one more, in the sequence TN ⁇ GG (sequence of (a), T is thymine, A is adenine, G is guaiacolsulfonate Nin, N 1 is Adenine, cytosine, guanine or thymine), and the sequence of (b) is represented by (T) (where T is thymine and n is an integer of 1 or more).
  • N of (T) n is a force that is an integer of 1 or more, preferably an integer of 1 to 10, and more preferably an integer of 3 to 6.
  • the sense primer and the antisense primer further have a first spacer sequence and a second spacer sequence, and
  • the first spacer sequence is represented by G
  • the second spacer sequence is represented by STC
  • the antisense primer the first spacer sequence is represented by TC
  • the second spacer sequence is represented by TC.
  • the spacer sequence is represented by AG
  • the first and second spacer sequences of the sense primer and the antisense primer are opposed to each other across the sequence (b). Being linked,
  • the sequence (d) has a sequence complementary to the sequence of all or a part of the region including the 5 ′ end of the sense strand of the target DNA sequence.
  • the sequence (d) has a sequence complementary to the sequence of all or a part of the region including the 5 ′ end of the antisense strand of the target DNA sequence.
  • the length of the sense primer and the antisense primer is preferably 10-200 bases, more preferably 20-150 bases, and even more preferably 30-120 bases.
  • the sense primer and Z or the antisense primer may be modified with a functional group in at least one of the nucleic acid main chain and the base portion of the sequence (b) and the Z or spacer sequence. Such modification is advantageous because it serves as a reaction point for binding a delivery agent or the like to dumbbell-shaped DNA prepared using these primers.
  • modifications include modifications with functional groups such as amino groups, fluorescent groups such as fluorescein, and biotin groups, proteins, virus-derived proteins, sugar-binding proteins, ferritin, lectins, low-density lipoprotein (LDL), antibodies, Artificial antibodies, peptides, peptide mimetics, insulin, polyethylene glycol, amino acids, unnatural amino acids, copolymers of amino acids and unnatural amino acids, piotin, retinol, retinol derivatives, sugars, oligosaccharides, cholesterol, estradio Nore, estrone, cholesterol monolete derivatives, steroids, hormones, steroid derivatives, binding of delivery agents such as fats, vitamins, folic acid, and the like.
  • functional groups such as amino groups, fluorescent groups such as fluorescein, and biotin groups, proteins, virus-derived proteins, sugar-binding proteins, ferritin, lectins, low-density lipoprotein (LDL), antibodies, Artificial antibodies, peptides,
  • Another functional group functional peptide such as TAT or NLS, antibody that specifically recognizes cancer cells, fluorescent or phosphorescent dye with electron donating ability, and electron accepting ability Fluorescent or phosphorescent dye, protein, virus-derived protein, glycoprotein, ferritin, lectin group, low density lipoprotein (LDL), antibody, artificial antibody, peptide, peptide mimetic, insulin, polyethylene glycol, amino acid, non-natural Amino acids, Ami No acid and unnatural amino acid copolymers, piotin, retinol, retinol derivatives, sugars, oligosaccharides, cholesterol monoles, estradio monoles, estrones, cholesterol monoles derivatives, steroids, hormones, steroid derivatives, fats, vitamins, A delivery agent such as folic acid can be added or substituted.
  • functional peptide such as TAT or NLS
  • antibody that specifically recognizes cancer cells
  • fluorescent or phosphorescent dye with electron donating ability fluorescent or phosphorescent dye with electron
  • the sense primer and the antisense primer may be phosphorylated at the 5 ′ end. If the 5 'end of the sense primer and the antisense primer are phosphorylated, the DNA is ligated with DNA ligase at the final stage of dumbbell-type DNA construction, taking on the hairpin loop structure! The DNA is cyclized by the internal ligation reaction. Phosphorylation at the 5 'end can be carried out by binding a phosphorylating reagent at the final stage of the automatic DNA synthesis and then deprotecting by amo-treatment. In the case of chemically synthesized oligo DNA (5 ′ terminal is a hydroxyl group), it can be phosphorylated enzymatically using T4 DNA ligase.
  • any of the steps before the DNA ligase is allowed to act on DNA which is an amplification product generated by a nucleic acid amplification method using these primers (For example, after nucleic acid amplification, after treatment with a nick enzyme, after heating, after annealing, etc.), the 5 ′ end of the amplification product DNA may be phosphorylated.
  • a known nucleic acid amplification method may be used to amplify the target DNA sequence in type I DNA using a sense primer and an antisense primer.
  • a sense primer and an antisense primer are mixed with type III DNA, and then PCR is performed using a DNA polymerase. Conversion of linear DNA to dumbbell DNA
  • the linear DNA amplification product is mixed with the nick enzyme (for example, at a mixing ratio of 0.5 ⁇ U to 1 ⁇ g of DNA to 0.5 U of the nick enzyme), and the reaction mixture is incubated (for example, at 25-50 ° C. overnight). .
  • the reaction mixture is incubated (for example, at 25-50 ° C. overnight). .
  • double-stranded DNA is nicked (the arrow attached to 2a_c in FIG. 1).
  • the reaction mixture is then heated (eg, 90-100 ° C for 0.5-10 minutes) and allowed to reach room temperature for 1 minute-1 Cool over time (annealing).
  • annealing By these operations, a hairpin loop structure is formed at the end of the linear DNA amplification product (3a-c in Fig. 1).
  • DNA ligase for example, at a mixing ratio of 175-1000 U of DNA ligase to 1 ⁇ g of DNA
  • ligation buffer for example, at 14-37 ° C for 3 min-1 6
  • incubate for example, at 14-37 ° C for 3 min-1 6
  • the above conversion step is a one-pot reaction. That is, this conversion step can be performed in one microphone opening tube.
  • the length of the dumbbell-shaped DNA is preferably from 12 to 2000 bases (corresponding to a duplex), preferably from 50 to 1000 bases (corresponding to a duplex), and more preferably from 150 to 600 bases (corresponding to a duplex). Chain equivalent).
  • the product generated by the ligation may be purified by a known method.
  • dumbbell-shaped DNA is constructed.
  • the dumbbell-shaped DNA may be a modified DNA produced from optically active boranophosphate.
  • a method for producing a modified DNA from an optically active boranophosphate is described in Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 8, 1611-1617.
  • dumbbell-shaped DNA constructed in Step 1 with exonuclease at a temperature of 25-42 ° C for 10 minutes and 12 hours. Take a small amount of dumbbell-shaped DNA before and after exonuclease treatment, and perform electrophoresis to visualize the band. As a result, it was found that dumbbell-shaped DNA exhibited resistance to degradation reaction by exonuclease.
  • the dumbbell-shaped DNA constructed in 1 can be subjected to site-specific modification by a known method. For example, a base at a specific position (for example, in a sequence forming a loop structure with a single strand) If an amino group is introduced into the amino acid group, the dumbbell-shaped DNA can be modified with fluorescein at the site where the amino group has been introduced by using a commercially available Amine Labeling Kit (Panvera, Madison, Wis.). In addition, if an unmodified primer DNA is provided with an SH group using a commercially available kit (FastTag®, vector laboratories ) , it can be reacted with various maleimide derivatives.
  • kit FertTag®, vector laboratories
  • dumbbell-shaped DNA constructed in 1 can be bound to a delivery agent by a known method.
  • Delivery agents include proteins, virus-derived proteins, sugar-binding proteins, ferritin, lectins, low-density lipoprotein (LDL), antibodies, artificial antibodies, peptides, peptide mimetics, insulin, polyethylene glycol, amino acids, Natural amino acids, copolymers of amino acids and unnatural amino acids, piotin, retinol, retinol derivatives, sugars, oligosaccharides, cholesterol, estradio-norre, estrone, cholesterol-norre derivatives, steroids, hormones, steroid derivatives, Examples include fats, vitamins, folic acid, and the like.
  • An example of a method for binding a delivery agent to dumbbell-shaped DNA is described below. In the first example, first, an amide group (-NH) is introduced into dumbbell-shaped DNA (dumbbell-shaped DNA-NH),
  • dumbbell-shaped DNA By reacting it with acid N-hydroxysuccinimide ester, dumbbell-shaped DNA can be converted to maleimide (dumbbell-shaped DNA-NHCO-maleimide).
  • maleimide By reacting the maleimidated dumbbell-shaped DNA (dumbbell-shaped DNA-NHCO-maleimide) with the SH group contained in the peptide, etc., the peptide can be bound to the dumbbell-shaped DNA (dumbbell-shaped DNA-NHCO-maleimide). -peptide).
  • an amide group (—NH 2) is introduced into dumbbell-shaped DNA (dumbbell DNA-NH 2),
  • dumbbell-shaped DNA can be derivatized (dumbbell-shaped DNA-NHCO-derivative). 5. Use of dumbbell type DNA
  • Dumbbell-shaped DNA can be used as a nucleic acid vector.
  • Introduction of the nucleic acid vector into cells can be performed by a known method.
  • the calcium phosphate method (Virology, Vol. 52, p. 456 (1973)), electoporation method (Nucleic Acids Res., Vol. 15, p. 1311 (1987)), Lipofxion method 0. Clin. Biochem. Nutr., Vol. 7, p. 175 (198 9)), infection introduction method by virus (Sci. Am., P.
  • a method for selecting cells into which the nucleic acid vector has been introduced can be selected by a known method such as hybridization or PCR using a DNA sequence specific to the introduced nucleic acid vector as a probe or primer.
  • the nucleic acid vector has a selectable marker, it can be selected using the phenotype of the selectable marker as an indicator.
  • the nucleic acid vector has a dumbbell-shaped DNA force RNA transcription sequence bound to a delivery agent, Can suppress the expression of the gene (mRNA) targeted by the siRNA, so it can be used as a drug for the prevention and / or treatment of disease, or as a reagent for analyzing the function of the gene. Can be used.
  • the genes targeted by siRNA are genes causing various diseases including genetic diseases, apoptosis-related genes (for example, p53), leukemia gene bcr-abl junction, cancer ras, myx, met, mdm2, abl,
  • apoptosis-related genes for example, p53
  • leukemia gene bcr-abl junction for example, leukemia gene bcr-abl junction
  • cancer ras myx
  • met mdm2
  • abl abl
  • dumbbell-shaped DNA or dumbbell-shaped DNA conjugated with a delivery agent can prevent and Z or treat the disease. Can be administered to humans and other animals.
  • Dumbbell-shaped DNA with siRNA sequence or delivery to patient tissue or cells By introducing the dumbbell-type DNA to which the agent is bound, the expression of the target gene in the cell can be suppressed.
  • Dumbbell-type DNA or a dumbbell-type DNA to which a delivery agent is bound can be introduced, for example, by encapsulating them in ribosomes and taking them into cells (Lipidic vector systems for gene transfer (1997) RJ Lee ana L. Huang Rev.
  • dumbbell-shaped DNA or dumbbell-shaped DNA conjugated with a delivery agent for example, partially remove cells at the diseased site, perform gene transfer in vitro, and then reassemble the cells. It can be returned to the patient, or it can be introduced into the diseased tissue.
  • the pharmaceutical composition containing dumbbell-type DNA or a dumbbell-type DNA to which a delivery agent is bound as an active ingredient optionally contains a pharmaceutically acceptable carrier (for example, a diluent such as physiological saline or a buffer solution).
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, a diluent such as physiological saline or a buffer solution.
  • Administration will depend on the severity of the disease state and the responsiveness of the organism, but will depend on the appropriate dosage, mode of administration, and frequency over the period until the efficacy of the treatment is recognized or until the disease state is reduced. It should be done in.
  • dumbbell-shaped DNA of the present invention functional nucleic acids such as double-stranded RNA including siRNA or hairpin RNA, ribozyme, and antisense RNA can be expressed in cells or tissues, and gene expression can be suppressed.
  • the target of the functional nucleic acid may be a virus such as HIV, HCV, HBV, an oncogene or the like. If the expression of the gene can be suppressed when the dumbbell-shaped DNA of the present invention is introduced into cells or tissues, this dumbbell-shaped DNA can be used as a DNAzyme.
  • composition containing the dumbbell-shaped DNA of the present invention can be used for various uses such as pharmaceuticals, cosmetics, reagents, and foods.
  • kits comprising at least one set of primers comprising the above-mentioned sense primer and antisense primer.
  • This kit is a dumbbell type It can be used to produce DNA.
  • the kit may include components other than at least one set of primers consisting of the above-mentioned sense primer and antisense primer.
  • the pU6 to EGFP and pU6i-lamin plasmids have a U6 promoter, enhanced green fluorescent protein (EGFP), and a nairpin-type siRNA expression sequence corresponding to lamin. They were constructed as follows. First, the present inventors constructed an siRNA expression vector with a commercially available pU6icassette vector (iuENE Therapeutics, Tsukuba, Japan). This sales vector has the human U6 promoter and two BspMI sites.
  • siRNA-expression vectors For the construction of siRNA-expression vectors, we synthesized (outsourced) oligonucleotides with hairpin, terminator, and overhanging sequences. Then, the fragments are annealed and inserted into the pU6icassette vector BspMI site ( Ligation).
  • the inserted sequences immediately after the U6 promoter are as follows: For pU6i-EGFP; 5'-GGC TAT GTC TAG GAG TGT ACC TAG AAT TAC ATC AAG GGA GAT GGT GCG CTC CTG GAC GTA GCC-3 '(SEQ ID NO: 9), pU6i -In lamin; 5'-GGG TAA TTG GTA GAT TAA GCG GTG TGC TGT CCC GCT TGA TCT GCC AAT TGC CC-3 '(IS column number 10)
  • Both primers have a BspMI recognition sequence (underlined), and the 5'-end is phosphorylated.
  • PCR products Wizard (R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega, Madison, WI, USA) is purified by using, was digested with BspMI. After reaction was conducted for 7 hours at 37 °, digested product was isolated by Wizard (R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega).
  • the sequence of the oligonucleotide-cap is 5'-pGGT GTG TCC GCG TTG GCT TTT GCC AAC GCG GAC A—3 ' ACG ACT CAC TAT AGG CC-3 '(SEQ ID NO: 14).
  • the reaction mixture was incubated at 16 ° C overnight and the ligation product was obtained by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • dumbbell DNA vectors by intramolecular ligation of PCR products.
  • the sense primer is unmodified (X 1 ; dT), modified with an amino group (X 2 , amino-modified dT), or fluorescein modified (X 3 , fluorescein-modified dT) deoxythymidine.
  • the co-primers purified by HPLC were purchased from Hokkaido System Science Co., Ltd. (Sapporo, Japan).
  • the sequences of the sense and antisense strands of the primers for the first PCR were 5′-GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG AAG GTC GGG CAG GAA GAG-3 ′ (SEQ ID NO: 19) and 5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG AAA AAG GCT ACG TCC AGG AG-3 '(SEQ ID NO: 20).
  • the first PCR product was purified by 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Using the isolated PCR fragment as type I DNA, a second PCR reaction was performed under the same conditions using common primers. The second PCR product was purified using Wizard (R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega, Madison, WI, USA) and.
  • the base sequence of the linear DNA encoding the siRNA is as follows.
  • the Fluorescein Amine Labeling Kit (Panvera, Madison, WI) was used according to the attached manual. Briefly, outline a 67 nM dumbbell-type vector (containing 30 microliters, 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution, 4 mM succinimide ester of fluorescein?) At 37 ° C for 1 hour. and Chillon, then the reaction was terminated by the addition of 100 mM Tris / HCl buffer (pH 8.0). the solution was left for a further 30 minutes. DNA is, Wizard (R) SV Gel and PCR Clean- Up System ( Promega, Madison, WI, USA) .Cells, cell culture, transformation, GFP fluorescent assays
  • HeLa S3 / EGFP cells were obtained as follows. HeLa / S3 cells were transformed with linearized pHygEGFP (Clontech, East Meadow Circle, PA). Then, a hygromycin-physical clone was selected. Cell culture: 10% (v / v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO— BRL, Gaithersburg, MD), hygromycin (100 microphone g / mL; Sigma) ⁇ antibiotic— antimycotic mixture (GIBCO— BRL) was filled
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the cells were cultured in an 8-well cnambered glass slide (Nalge Nunc International, Naperville, Ill.) Until they reached about 40-50% confluence, and transformed with DNA.
  • OPTI-MEM medium Invitrogen, Carlsbad, CA
  • Trans-It LT-1 reagent PanVera, Madison, WI
  • They were independently transfected using 100 ng each of dumbbeU-shaped vectors, linear PCR product vectors, or pU6i-EGFP plasmid vectors expressing siRNA targeting the EGFP gene.
  • a spurious transfection using only the transfection reagent without DNA was also performed as a control experiment. The cells were incubated for 48 hours after transfection.
  • N.BpulOI is a site- and strand-specific, engineered endonuclease. It cleaves only one strand of double-stranded DNA. As shown in Figure 1, the nick enzyme in step 2 cleaves only one strand of DNA.
  • dumbbells with only one primary amino group on dumbbell DNA were successfully converted to fluorescent dumbbell DNA using succinimide esters.
  • dumbbells with primary amino groups did not react at all with succinimide esters.
  • Fluorescent dumbbell DNA can also be made by synthesis using fluorescent primers. It has been known that dumbbell-shaped DNA has a hairpin oligonucleotide structure at the end, and thus becomes resistant to degradation reaction by exonuclease. Intermediate 2c and dumbbell 4d were independently treated with exonuclease for 1 hour and analyzed by 8% PAGE.
  • dumbbell siRNA expression vector was more effective than the linear PCR product after 48 hours of incubation.
  • RNAi effect induced by dumbbell DNA was higher than that of linear DNA, and the effect lasted longer.
  • dumbbell-shaped DNA The minimum unit of expressed DNA that can be constituted by dumbbell-shaped DNA is a sequence recognized by RNA polymerase (promoter) and a sequence encoding RNA to be expressed. It is desirable that the DNA introduced into cells be shorter in terms of the cost as a drug and the efficiency of introduction into cells.Therefore, shortening the introduced DNA is necessary for functional analysis of genes and gene analysis. It is very beneficial in terms of gene therapy. Construction and analysis of miniaturized promoter
  • U6 (90) promoter and U6 (110) promoter were prepared for comparison with the natural promoter. Both are less than half the length of the native U6 promoter.
  • a DNA encoding siRNA targeting luciferase was placed downstream of this promoter to construct a vector.
  • TGCTTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 24) was incorporated to construct an siRNA expression plasmid.
  • luminescence value of luciferase was measured to compare the effect of siRNA.
  • dumbbell-shaped DNA of the present invention can be used for gene therapy. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of U6 promoter.
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the HI promoter.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of the tRNA promoter.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of aptamer for thrombin.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of aptamer for thrombin.
  • SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of aptamer for thrombin.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of aptamer for thrombin.
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of an aptamer that binds to Reactive Green 19.
  • SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of the inserted sequence immediately after the U6 promoter in pU6i-EGFP.
  • SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of the inserted sequence immediately after the U6 promoter in pU6i-lamin.
  • SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of the sense strand of a primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 12 shows the nucleotide sequence of the antisense strand of the primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 13 shows the nucleotide sequence of oligonucleotide-cap.
  • SEQ ID NO: 14 is the oligonucleotide-cap;
  • SEQ ID NO: 15 shows the nucleotide sequence of the sense strand of a common primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 16 shows the nucleotide sequence of the sense strand of a common primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 17 shows the nucleotide sequence of the sense strand of a common primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 18 shows the nucleotide sequence of the antisense strand of a common primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 19 shows the nucleotide sequence of the sense strand of a primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 20 shows the nucleotide sequence of the antisense strand of a primer for PCR.
  • SEQ ID NO: 21 shows the nucleotide sequence of linear DNA encoding siRNA.
  • SEQ ID NO: 22 shows the nucleotide sequence of U6 (90) promoter.
  • SEQ ID NO: 23 shows the nucleotide sequence of .U6 (110) promoter.
  • SEQ ID NO: 24 shows a DNA sequence encoding an siRNA targeting the luciferase gene.
  • SEQ ID NO: 25 shows the nucleotide sequence of U6 (240) promoter (natural U6 promoter).

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Description

明 細 書
ダンベル型 DNAの効率的な製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、ダンベル型 DNAの製造方法に関する。
背景技術
[0002] ヒト 'ゲノムプロジェクトの進歩により数多くの病因遺伝子が同定されるに伴い、「遺 伝子」を薬として生体に導入することによって治療効果を期待する、 Vヽゎゆる「遺伝子 治療」が注目されるようになった (非特許文献 1)。遺伝子治療を行うために、治療用 遺伝子を治療する細胞に入れる仕掛けを「ベクター」と呼び、現在ではウィルスベクタ 一とプラスミドベクターとが主に実際の臨床試験で用いられている。
[0003] ウィルスベクターは、通常病原性をなくしたウィルスなどを用いる。
この場合、ウィルスが細胞に感染して自分の遺伝子を細胞に送り込む働きを利用す るので、他のベクターに比べてベクターの細胞への遺伝子導入効率が良いことが長 所である。しかしながらウィルスベクターはごくまれに、病原性を無くし増殖できなくす る前処理 (不活化)を免れて、副作用として本来の病原性を表わしたり、勝手に増殖 するウィルスが混じることがある。そのほか、予期しない遺伝子組み替えが起こりうるこ と、免疫原性を持つことなども大きな問題となっている。
[0004] ウィルスベクターに比べ免疫原性は低ぐ生産性の高い代替ベクターとしてプラスミ ド DNA(pDNA)が近年特に注目されてきた。し力しながら最近の研究によると、プラスミ ド DNA中〖こ CpG motifと呼ばれる配列が存在すると、マクロファージゃ榭状細胞がこ れを取り込むと危険信号として認識し、種々の炎症性サイト力イン産生などの免疫活 性ィ匕反応が起こすことが明らかにされた。炎症性サイト力インは、その細胞毒性作用 のため遺伝子発現を低下させてしまうため、遺伝子治療では不適切である。また、プ ラスミド DNAは通常、抗生物質耐性遺伝子や、微生物などの異種生物由来の余分な 遺伝子配列を持ち、これらは遺伝子治療に不要なば力りでなぐそれら遺伝子がコー ドする不要なタンパク質が発現する、正常なゲノム DNAに組み込まれるなどして異常 ゲノム DNAができる、などの副作用の危険性がある（非特許文献 2)。 [0005] 米国特許第 6451593号明細書には、最小限の免疫原性に限定した遺伝子発現（ MIDGE； Minimalistic Immunogenically Defined Gene Expression)ベクタ ~~、つまりダ ンベル型 DNAを使った遺伝子導入技術 (MIDGE技術）が開示されている。このべクタ 一は、 RNA転写のもとになる DNAで、その DNAは環状鎖 DNAでできており、ダンベル 型を形成する。このダンベル型ベクターは、環状鎖が最初の相補配列、最初の相補 的でない配列、 2番目の相補配列、 2番目の相補的でない配列からできており、 1番 目と 2番目の相補的配列のペアは 2重鎖を形成し、これら 2重鎖は、プロモーター配 列、コード配列、ポリ Aまたは安定ィ匕配列を持ち、最初と 2番目の相補的でない配列 で 1本鎖を形成するループ部分も持つ (特許文献 1)。
[0006] ウィルスベクターや、プラスミドベクターの欠点を補 、長所を生かす、より優れた代 替ベクターとしてダンベル型 DNAベクターが作成された (非特許文献 3)。ダンベル型 DNAベクターは図 1に示したように、プロモーターと転写配列領域し力含まず、余分 な配列を持たな 、ため免疫原性を最小限にすることができる。さらに必要な遺伝子配 列の両端にそれぞれループ部分を持たせて閉じた環状 DNAとすることで、細胞内に 形質転換させた際に、 EXOnuCleaSe (EXO型核酸分解酵素)活性を受けることなぐ分 解を受けに《比較的血清や細胞内で安定であることが知られている。また、この遺 伝子治療などに必要最低限の遺伝子配列し力持たな 、ダンベル DNAを、図 6に示し たように 3分子会合にて作るやりかたが知られている（非特許文献 4)。図 6に示してあ る一般的なダンベル型 DNAの作成法では、 目的の遺伝子配列を含む cDNAを铸型 DNAとして、 PCR法にて直鎖状の目的 DNA断片を増幅したのち（図 6の工程 l(PCR)) 、直鎖状の目的 DNA断片の両端を制限酵素にて切断する。このものと、ダンベルの ループ部分を持つ合成 DNA2本とを、 DNA ligaseを用いて結合させ、ダンベル型 DNAとする方法を採るのが一般的である。
[0007] し力しながらこの作成法の欠点は、ライゲーシヨン反応（図 6の工程 4 (分子間
ligation) )が 3分子会合によるものであり、し力も分子間ライゲーシヨン反応であるので 、ライゲーシヨン効率が低い。加えて直鎖状の目的 DNA断片のモル数に対して、ダン ベルのループ部分を持つ合成 DNA2本各々のモル数が大過剰必要であり、その結 果殆ど全てのループ部分を持つ合成 DNAが反応することなく無駄となり、これらは精 製の妨げにもなる。結果として、 目的ダンベル型 DNAの収量が非常に低くなつている
[0008] 試験管内でのダンベル型 DNAベクターを作る別のやり方として、図 7に示したように 、 cDNAを铸型 DNAとして、 2つの逆位の（inverted)N.BpulOIニック酵素認識配列を直 鎖状の目的 DNA断片の両端に持たせたものを作成し、大腸菌を用いて増幅可能な プラスミドベクター DNAにサブクローユングを行 、、大腸菌に形質転換させ大量増幅 させた後、図 7の 6-9の処理を行い目的配列を含むダンベル型 DNAベクターを作成し 、プラスミドベクター由来のダンベル型 DNAを消化および精製するやり方が知られて いる。しかしながらこの作成法の欠点は、サブクローユングの必要があること、および プラスミドベクター由来のダンベル型 DNAを消化する必要があるなど、操作が非常に 煩雑で時間を要する。
[0009] 特許文献 1：米国特許第 6451593号明細書
[0010] 非特許文献 1： Verma, I. M.; Somia, N. Nature 1997, 389, 239-242.
[0011] 非特許文献 2 : Luo, D.; Saltzman, W. M. Nat. Biotechnol. 2000, 18, 33- 37.Ferber,
D. Science 2001, 294, 1638- 1642.Medzhitov, R. Nat. Immunol. 2001, 2, 15-16.
[0012] 非特許文献 3 : Schakowski, F.; Gorschluter, M.; Junghans, C; Schroff, M.;
Buttgereit, P.; Ziske, C; Schottker, B.; Konig-Merediz, S. A.; Sauerbruch, T.;
Wittig, B.; Schmidt-Wolf, I. G. Mol. Ther. 2001, 3, 793-800.
[0013] 非特許文献 4 : Zanta, M. A.; Belguise— Valladier, P.; Behr, J. P. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1999, 96, 91—6.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 本発明は、ダンベル型 DNAを製造するための簡易な方法を提供することを目的と する。
課題を解決するための手段
[0015] 従来法 (3分子会合法、図 6)でダンベル型 DNAを作成したのではライゲーシヨン効 率が 40%程度と非常に悪い（図 3 (B))。しかしながら、今回開発した新規手法 (図 1) にてダンベル型 DNAを作成した場合、ライゲーシヨンはほぼ定量的に進行した（図 3 ( A))。図 2に示したように、ライゲーシヨン反応を行う以前の化合物 2cは、 Exonuclease 処理 (37度 1時間）によってほぼ完全に分解されてしまった力 ダンべルイ匕の後の化 合物 4cは Exonuclease耐性を持つに至った（安定性の向上）。
[0016] 2個の PCRプライマーのうち一方のループ部分にただ 1箇所だけ蛍光基 (フルォレセ イン)で化学修飾を行ったのち PCRを行った。 PCR産物の直鎖状 DNAに対し、本発明 の方法でダンべルイ匕を行 、、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析を行った。 ループ部分に 1箇所だけ蛍光基を持つ修飾ダンベル型 DNAは、図 2に示したように exonuclease耐性を持ち安定性が向上した。
[0017] 図 4に示したように、 2個の PCRプライマーのうち一方のループ部分にただ 1箇所だ けアミノ基を持つプライマーを用い PCRを行った。 PCR産物の直鎖状 DNAに対し、本 発明の方法でダンべルイ匕を行 、、 1級アミノ基を 1箇所のループ部分のみに持つダン ベル型 DNAを作成した。これに対し Fluorescein- OSuを作用させ、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動によって分析を行った。約 500bpのダンベル DNAのただ 1箇所の 1級ァミノ 基のみに部位特異的にフルォレセイン修飾されたことが分力つた。ネガティブコント口 ール実験として、 1級アミノ基をループ部分に全く持たない、同じ塩基配列を持つダン ベル型 DNAを用いて同一の実験を行った力 DNAは蛍光修飾されなかった。
[0018] このように、ダンべルイ匕のあとにループ部分特異的に化学修飾を行うことが可能と なったが、この部位特異的修飾はニック酵素処理の前でも可能であった (データは示 さず)。
例えば、 siRNAを発現させるプロモーターとして利用される天然型の U6プロモータ 一の配列は 240塩基から 400塩基程度であり、天然の tRNAプロモーターの配列は 100 塩基から 150塩基程度である。し力しながら、遺伝子導入に用いられる DNAは、細胞 への透過性という面において、短いほど適していると考えられる。そこで、 U6プロモー ター配列を 150塩基以下まで短くした場合において、実際に細胞への透過性を調べ てみたところ、確かに短い DNA配列が短い場合には、細胞への透過性も高まった（図 9(c)) oこのように小型化したプロモーター配列を用いることで、細胞内での発現量の 増加が期待できる。また、導入する DNAの長さが 150塩基対以下の場合、導入する DNAを合成化学的に生産することができる。 [0019] トランスフエクシヨン試薬を用いずに、哺乳類の細胞内にダンベル型 DNAベクターを 導入 (デリバリー）する手法として、ペプチドをダンベル型 DNAのループ部分特異的 に修飾した。ダンベル型 DNA-ペプチド共有結合体に対し、制限酵素 (EcoRI)処理を 行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析を行った。各々のペプチドの分子 量に依存して、別々の位置に分解断片が現れ、ダンベル型 DNA-ペプチド共有結合 体の形成が確認された。
[0020] 本発明は、これらの知見に基づいて、完成された。
[0021] 本発明の要旨は以下の通りである。
[1] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、センス 鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DNA の製造方法であって、以下の工程：
1)センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、铸型 D NA中の目的の DNA配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセン スプライマーは、それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端側力も 3' 末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配列を有し
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
2) 1)の工程で得られた DNA増幅産物を (a)のニック酵素で処理する工程、
3) 2)の工程でニック酵素処理された DNA増幅産物を加熱し、その後にアニーリング する工程、及び
4) 3)の工程で加熱及びアニーリングされた DNA増幅産物を DNAリガーゼで処理 する工程
を含み、ここで、
1)の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの 5'末端がリン 酸化されているか、あるいは 1)の工程が行われた後 4)の工程が行われる前に DNA 増幅産物の 5'末端がリン酸化される、前記方法。
[2] ダンベル型 DNA力 RNA転写のためのベクターとして用いられるものである [ 1]記載の方法。
[3] 目的の DNA配列が 1個以上のプロモーター配列及び siRNA転写配列を有す る [1]または [2]記載の方法。
[4] ダンベル型 DNAがタンデム型 siRNA発現ベクターあるいはステムループ型 si RNA発現ベクターである [3]記載の方法。
[5] センスプライマー及び Z又はアンチセンスプライマーカ さらに、第 1のスぺー サー配列及び第 2のスぺーサー配列を有し、ここで、第 1のスぺーサー配列及び第 2 のスぺーサー配列は互いに相補的な配列であり、かつ、第 1のスぺーサー配列と第 2 のスぺーサー配列とは (b)の配列を挟んで対向するように連結されて!、る [1]一 [4] のいずれかに記載の方法。
[6] センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、 （a)の配列が TN^GG (酉己列中、 Tはチミン、 Aはアデニン、 Gはグァニン、 N1はアデニン、シトシン、グァニン またはチミンのいずれかである。）で表され、（b)の配列が (T) (配列中、 Tはチミンで あり、 nは 1以上の整数である。）で表され、（c)の配列が CCTNUAGC (配列中、 ま シトシン、 Tはチミン、 Aはアデニン、 Gはグァニン、 N11はアデニン、シトシン、グァニン またはチミンの 、ずれかである。 )で表される [1]一 [5]の 、ずれかに記載の方法。
[7] センスプライマー及びアンチセンスプライマーカ さらに、第 1のスぺーサー配 列及び第 2のスぺーサー配列を有し、センスプライマーについて、第 1のスぺーサー 配列が AGで表され、第 2のスぺーサー配列が TCで表され、アンチセンスプライマー について、第 1のスぺーサー配列が TCで表され、第 2のスぺーサー配列が AGで表さ れ、かつ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、第 1のスぺーサー 配列と第 2のスぺーサー配列とは (b)の配列を挟んで対向するように連結されている [6]記載の方法。
[8] センスプライマーの配列及びアンチセンスプライマーについて、（b)の配列が TTTTで表される [7]記載の方法。 [9] センスプライマー及び Z又はアンチセンスプライマーが、（b)の配列及び Z又 はスぺーサー配列の核酸主鎖および塩基部分のうちの少なくとも 1箇所で官能基に より修飾されて 、る [1]一 [8]の 、ずれかに記載の方法。
[10] 1)の工程の後に、官能基変換を行う工程をさらに含む [9]記載の方法。
[11] センスプライマー及びアンチセンスプライマーカもなる少なくとも一組のプライ マーを含む組成物であって、前記センスプライマー及び前記アンチセンスプライマー が、それぞれ、 5'末端に下記の (a)の配列を有し、かつ、 5'末端側カゝら 3'末端側の方 向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配列を有する、前記組 成物。
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
[12] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、セン ス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DN Aを製造するために用いられる [11]記載の組成物。
[13] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、セン ス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DN Aを製造するために用いられるキットであって、センスプライマー及びアンチセンスプ ライマーからなる少なくとも一糸且のプライマーを含み、前記センスプライマー及び前記 アンチセンスプライマーカ それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末 端側から 3'末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の 配列を有する、前記キット。
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部 (d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
[14] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、セン ス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DN Aにデリバリー剤を結合させた核酸ベクターの製造方法であって、以下の工程：
1)センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、铸型 D NA中の目的の DNA配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセン スプライマーは、それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端側力も 3' 末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配列を有し
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
2) 1)の工程で得られた DNA増幅産物を (a)のニック酵素で処理する工程、
3) 2)の工程でニック酵素処理された DNA増幅産物を加熱し、その後にアニーリング する工程、
4) 3)の工程で加熱及びアニーリングされた DNA増幅産物を DNAリガーゼで処理 する工程、及び
5) 4)の工程で DNAリガーゼ処理された DNA増幅産物中の目的の DNA配列以外 の配列にデリバリー剤を結合させる工程
を含み、ここで、
1)の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの 5'末端がリン 酸化されているか、あるいは 1)の工程が行われた後 4)の工程が行われる前に DNA 増幅産物の 5'末端がリン酸化される、前記方法。
[15] [1]一 [10]の 、ずれか〖こ記載の方法で作製されたダンベル型 DNA。
[16] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、セン ス鎖とアンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DN Aであって、以下の (a')— (d')の配列を含む前記ダンベル型 DNA。
(a')ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b')—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c') (a')のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d')目的の DNA配列
[17] 細胞あるいは組織に導入し、機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させる ことができる [ 15]または [ 16]記載のダンベル型 DNA。
[18] 発現する機能性核酸が siRNAあるいはヘアピン RNAを含む二本鎖 RNAである [17]記載のダンベル型 DNA。
[19] 発現する機能性核酸がリボザィムである [ 17]記載のダンベル型 DNA。
[20] 発現する機能性核酸がアンチセンス RNAである [17]記載のダンベル型 DNA
[21] RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域の全部又は一部を含む [ 17]— [20]の!、ずれかに記載のダンベル型 DNA。
[22] RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域の全部又は一部力 以下 の (0— Gv)のうちの少なくとも 1つの配列を含む 250塩基以下の配列を含む [21]記載 のダンベル型 DNA。
(i) TATA
(ii) CTTACCGTAACTTGAAAGT
(iii) YYTCCCANNRTNCNNYGCRR
(iv) ATGCAAATある!、はこれに相補的な配列
(配列中、 Rはグァニンまたはアデニンいずれかであり、 Yはシトシンまたはチミンのい ずれかであり、 Nはグァニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。 ) [23] RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域の全部又は一部力 以下 の (i，）一 (ii，）のうちの少なくとも 1つの配列を含む 150塩基以下の配列を含む [21]記 載のダンベル型 DNA。
(i' )RRYNNARYGG (ii' ) GGTTCGANTCC
(配列中、 Rはグァニンまたはアデニンいずれかであり、 Yはシトシンまたはチミンのい ずれかであり、 Nはグァニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。 )
[24] 配列番号 1、 22、 23または 25のいずれかの配列を含む [21]— [23]のいず れかに記載のダンベル型 DNA。
[25] 発現する機能性核酸の標的がウィルスあるいは癌に関連する遺伝子である [1 7]一 [24]の!、ずれかに記載のダンベル型 DNA。
[26] ウィルスが HIV、 HCVおよび HBVからなる群より選択される [25]記載のダンべ ル型 DNA。
[27] 細胞あるいは組織に導入し、遺伝子の発現を抑制することができる [15]また は [ 16]記載のダンベル型 DNA。
[28] DNAザィムである [27]記載のダンベル型 DNA。
[29] デコイとして作用する [27]記載のダンベル型 DNA。
[30] ダンベル型 DNAが光学活性なボラノホスフェートから製造された修飾型 DN Aである [ 15]— [29]の!、ずれかに記載のダンベル型 DNA。
[31] [ 15]— [30]の!、ずれかに記載のダンベル型 DN Aを含む組成物。
[32] [15]— [30]の!、ずれかに記載のダンベル型 DN Aを含む医薬組成物。 本発明のダンベル型 DNAの製造方法は、以下の利点を有する。
1)図 7の従来法における、 N.BpulOIサイトを 4つ持つ、プラスミドベクター DNA構築の 手間が不要である。
2)図 7の従来法における、ベクター DNA由来の不要なダンベル DNAができない。
3)図 6の従来法では PCRプライマー（合成オリゴ DNA)が 4本必要なのに対し、図 1の 本発明の方法では合成オリゴ 2本のみしか必要でなぐ経済的である。
4)図 1の本発明の方法では、環化してダンベル型 DNAになるライゲーシヨン反応が、 分子内反応なので効率が非常に良ぐ図 6の従来法と比較して量が取れる。
環化収率について、従来法（2本鎖 DNAを基準として) 40%程度であるが、本発明 の方法だと 80%以上となりえる。 つまり、図 6の操作 4において、ループ部分に官能基もしくは反応点を持つ合成オリ ゴ DNAのわず力 4%程度しかダンベル DNAにならず、残りの 96%は無駄に廃棄され る。
し力しながら、 PCRに官能基もしくは反応点を持たせることで、原理的には PCRブラ イマ一の殆ど全てが消費され無駄にならず、ライゲーシヨン反応も分子内反応なので
、官能基もしくは反応点を持つ合成オリゴ DNAの大部分 (80— 95%程度）がダンベル 型 DNAとなる。このように、上流および下流の PCRのプライマーの 1本鎖ループ部分（ 図 1の場合 TTTTのどこ力 のどちらか、または両方に官能基もしくは反応点を持たせ る際に有利である。
5)図 1の操作 2-5までは、全て同じチューブ内での one-pot反応なので、操作が極め て簡便である。
6) PCR法で行う図 6の従来法の場合では精製が 2段階存在するのに対し、図 1の本 発明の方法の場合、精製が最後 (操作 6)だけでよい。精製ステップの省略は、ダン ベル型 DNAの全体での回収量低下を防ぐ。
[0023] 本明細書において、「ダンベル型 DNA」とは、直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3' 末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖をループ構造の一本 鎖 DNAで連結した DNAをいう。ダンベル型 DNAを構成する DNAは、塩基部分、リ ン酸部分、糖部分、 5'末端及び Z又は 3'末端が修飾されていても (修飾型 DNA)、さ れて ヽなくてもょ ヽ（天然型 DNA)。
[0024] 修飾型 DNAの種類及び製法は数々の文献に記載されて ヽる。例えば、リン酸部 分のリンに結合している水酸基 (-OH)力 ボラノ基 (-BH
3 、チオール基 (-S―)、アミノ基
(-NH ),低級アルキル基 (- R) (Rは、例えば、メチル基、ェチル基など）およびアルコキ
2
シ基 (-OR) (Rは、例えば、メチル基、ェチル基など)力もなる群より選択される基に置 換されている修飾型 DNAは、 Biochemistry (1979) 18, 5134.； Tetrahedron Lett. (1982) 23, 4289.に記載されている。リン酸部分のリンに結合しているォキソ基 (=0)が 、チォキソ基 (=S)に置換されている修飾型 DNAは、 Tetrahedron Lett. (1980) 21, 1121.； Biochemistry (1987) 26, 8237.に記載されている。リン酸部分のリンと糖の 5'位 の炭素に結合しているォキシ基 (-0-)が、メチレン基 (-CH -)、チォキシ基 (-S-)および
2
アミノ基 (-NH-)カゝらなる群より選択される基に置換されている修飾型 DNAは、 Nucleic Acids Res. (1997) 25, 830に記載されている。リン酸部分のリンと糖の 3'位の 炭素に結合しているォキシ基 (-0-)力 メチレン基 (-CH -)、チォキシ基 (-S-)およびァ
2
ミノ基 (-NH-)カゝらなる群より選択される基に置換されて ヽる修飾型 DNAは、 Pro Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 5798に記載されている。リン酸部分がホスホロジチ ォエート化されている修飾型 DNAは、 Tetrahedron Lett. (1988) 29, 2911.； JACS (1989) 111, 2321.に記載されている。
[0025] 修飾塩基の例としては、 2-ァミノプリン、 2'-アミノ-ブチリルビレン-ゥリジン、 2'-ァミノ ゥリジン、 2'-デォキシゥリジン、 2'-フルォロ-シチジン、 2'-フルォロ-ゥリジン、 2,6-ジ ァミノプリン、 4-チォ-ゥリジン、 5-ブロモ -ゥリジン、 5-フルォロ-シチジン、 5-フルォロ- ウリジン、 5-インド-ゥリジン、 5-メチル -シチジン、イノシン、 N3-メチル -ゥリジン、 7-デ ァザ-グァニン、 8-ァミノへキシル -ァミノ-アデニン、 6-チォ-グァニン、 4-チォ-チミン 、 2-チォ-チミン、 5-ョード -ゥリジン、 5-ョード -シチジン、 8-ブロモ -グァニン、 8-ブロ モ-アデニン、 7-デァザ-アデニン、 7-デァザ-グァニン、 8-ォキソ -グァニン、 5,6-ジヒ ドロ-ゥリジン、 5-ヒドロキシメチル-ゥリジンなどを挙げることができる力 これらに限定 されることはない。これらの合成ユニットは市販されており（例えば、 Glen Research社 から購入できる）、 DNAへの導入は化学合成により可能である。
[0026] 糖部分の修飾の例としては、 3'-デォキシ化、 2'-フルォロ化、アラバノシドィ匕などを 挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらについても DNAへの導 入は化学合成により可能である。
[0027] 5'末端の修飾の例としては、 5'-アミノ化、 5 '-ピオチン化、 5'-フルォレセイン化、 5し テトラフルォ口-フルォレセイン化、 5'-チォ化、 5'-ダブシル化などを挙げることができ る力 これらに限定されることはない。
[0028] 3'末端の修飾の例としては、 3'-アミノ化、 3 '-ピオチン化、 2,3-ジデォキシ化、 3'-チ オール化、 3'-ダブシル化、 3'-カルボキシレート化、 3'-コレストリル化などを挙げるこ とができる力 これらに限定されることはない。
[0029] DNAの合成反応において、既存の DNAの一次構造が新たに合成される DNAの 一次構造を決定するとき、既存の DNAを「铸型 DNA」という。
[0030] ニック酵素は、サイト及びストランド特異的な、人工的に工学的手法で作られたェン ドヌクレアーゼである。
[0031] 「ニック」とは、エンドヌクレアーゼの作用により、 2本鎖 DNAの一方の鎖のホスホジェ ステル結合が開裂して 5 'にリン酸基、 3'にヒドロキシル基を生ずる DNAの損傷のこと である。この損傷は、 DNAリガーゼにより修復可能な切断である。
[0032] 「ニック酵素の切断認識配列」とは、ニック酵素により認識されて、特定位置にニック が入る DNA配列をいう。
[0033] 「アニーリング」とは、二本鎖から一本鎖に解離した DNAを再び二本鎖 DNAに会 合させることをいう。二本鎖 DNAの会合は、 2つの分子間（すなわち、 2本の DNA鎖 間）で起こってもよいし、同一分子内（すなわち、 1本の DNA鎖内）で生じてもよい。 本発明のダンベル型 DNAの製造方法においては、アニーリングにより、同一分子内 で会合が生じて、新たな二本鎖 DNA部分とループ部分が形成される。
[0034] 「プロモーター」とは、調節遺伝子の一種で RNAポリメラーゼが結合し、オペロンの 転写を開始する部位のことである。
[0035] 「siRNA」とは、 RNA干渉作用を有する（すなわち、標的とする mRNAを切断する活性 を有する）短 、二本鎖オリゴヌクレオチドを 、う。標的とする mRNAを認識する RNA鎖 はアンチセンス鎖であり、他方の RNA鎖がセンス鎖である。一般に、「アンチセンス鎖 」とは mRNAが認識する RNA鎖である。 siRNAの塩基数は、通常 50個以下であり、好 ましくは 10— 40個であり、より好ましくは 10— 30個である。 siRNAは、 RNA分子に限 定されるわけではなぐ RNA分子と他のヌクレオチド (例えば、 DNAなど）とのキメラ分 子であってもよぐまた、これらの分子の置換体又は修飾体であってもよい。 RNA及び DNA分子の置換体及び修飾体の例としては、 5'末端を 5'モノリン酸ィ匕したもの、 3'末 端の 2'水酸基を 2'-デォキシ、 2'- 0-メチル、ピオチン、 2',3'-ダイデォキシシトシン、 ァミノプロピルホスホエステルに変えたものなどを挙げることができる。
[0036] 「siRNA転写配列」とは、 siRNAをコードする DNA配列を!、う。 siRNA転写配列には、 siRNAのセンス鎖をコードする DNA配列と siRNAのアンチセンス鎖をコードする DNA 配列の両方が含まれる。 siRNA転写配列を組み込んだ siRNA発現ベクターにお ヽて 、 2つのプロモーター配列の各々と機能的に連結した、 siRNAのセンス鎖をコードする DNA配列と siRNAのアンチセンス鎖をコードする DNA配列とが直列に結合しているも のを「タンデム型 siRNA発現ベクター」という（図 8の a) )。また、 siRNAのセンス鎖をコ ードする DNA配列と siRNAのアンチセンス鎖をコードする DNA配列とが随意の介在配 列 (例えば、一本鎖でループ構造を形成することができる配列など)を挟んで対向し ているものがプロモーター配列と機能的に連結しているものを「ステムループ型 siRNA発現ベクター」と!、う（図 8の a) )。
[0037] 「機能的に連結した」とは、プロモーターからの転写を受けて、 siRNAのセンス鎖をコ ードする DNA配列及び Z又は siRNAのアンチセンス鎖をコードする DNA配列の転写 産物が生成するように、該 DNA配列とプロモーター配列とが結合して 、ることを 、う。 従って、該 DNA配列に対するプロモーター配列の位置は、その上流、下流を問わな いが、通常上流に位置する。また、該 DNA配列とプロモーター配列との間には、該 DNA配列の転写が起こり得る限り、任意の DNA配列を有して!/、てもよ!/、。
[0038] 「スぺーサー配列」とは、ループ部分の一本鎖のヌクレオチド配列と、 目的の DNA 配列（プロモーター ·転写 ·終結などに関わるヌクレオチド配列）との間にある、生化学 的に意味を持たな 、オリゴヌクレオチド配列を 、う。
[0039] 「対向する」とは、互いに相補的な 2つの配列を互いに逆方向となるように配置する ことを意味する。例えば、第 1のスぺーサー配列が AGで表され、第 2のスぺーサー配 列が TCで表され、（b)の配列が TTTTで表される場合には、第 1のスぺーサー配列と 第 2のスぺーサー配列とが (b)の配列を挟んで対向するように連結させると、 AGTTTTCTの配列となる。
[0040] 「核酸主鎖」とは、 '…-糖-リン酸-糖-リン酸-…'の基本骨格のことをいう。核酸主鎖 は修飾がなされて 、ても、なされて!/、なくともよ!/、。
[0041] 「塩基部分」とは、核酸を構成するプリン又はピリミジン塩基の部分を 、う。プリン又 はピリミジン塩基は修飾がなされて ヽても、なされて!/ヽなくともよ 、。
[0042] 「デリバリー剤」とは、必要な量の薬を、体内の必要な場所または、必要な時間、お よびその両方に正確に配達するための仕掛けを持つ各種分子をいう。
[0043] 「機能性核酸」とは、細胞、組織、および器官にお!、て、特定の働きを持つ核酸を いい、遺伝子発現抑制などの生理活性、 RNAの切断などの酵素活性、タンパク質や 、 RNA、低分子化合物などへの結合能、などを有する核酸が含まれる。
[0044] 「ヘアピン RNA」とは、直鎖状 2本鎖 RNAの 5'末端および 3'末端の両末端同士が、 1 本鎖の構造を持つ RNA/レープでつながった RNAを!、 、、ステム構造とそれをつなぐ ループ構造を持つステム、ループ RNAが含まれる。ステム構造は、完全にマッチして いなくてもよい。
[0045] 「リボザィム」とは、 RNAをィ匕学的実体とする生体触媒の総称である。
[0046] 「アンチセンス RNA」とは、ある RNAと相補的な配列を持つ RNA分子を!、 、、あるタ 一ゲット RNAと相補的に結合し、その発現を抑制する RNA分子を含む。
[0047] 「DNAザィム」とは、 DNAをィ匕学的実体とする生体触媒の総称である。
[0048] 「光学活性なボラノホスフェート」とは、デォキシヌクレオチドにお 、て、ボラノ基が 5' の α -リン原子に共有結合しているために生じる不斉中心を有するボラノホスフェート をいう。
[0049] なお、本明細書において、「一」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値お よび最大値として含む範囲を示す。
[0050] 塩基配列の表示において、 Αはアデニン、 Cはシトシン、 Gはグァニン、 Tはチミン、 U はゥラシル、 Nはアデニン又はシトシン又はグァニン又はチミン若しくはゥラシルのい ずれかの塩基を表す。塩基配列は特にことわりがない限り、 5'→3 '方向に記載する ものとする。 発明の効果
[0051] 本発明により、簡易な方法でダンベル型 DNAを製造することができるようになった
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2003-206905号の 明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
[図 1]本発明のダンベル型 DNAの作成法の一例を示す。この手法は、特に上流およ び下流の PCRプライマーのループ部分（この場合 TTTT配列の部分）のどちらかに 1 個、もしくはループ部分の両方に官能基を持たせる場合に有利である。原理的には 全ての PCRプライマー (原料）が消費されるまで PCR反応は続くので、原料がほとんど 無駄にならない。操作 2)-3)までは全て one-pot反応（1つの試験管のなかへ次々と試 薬を混ぜていくだけの反応)なので、操作が簡便なのも特徴である。 1) 5'末端がリン 酸化されている、 BpulOI制限酵素サイトの一部 TNAGGと、 1本鎖ループ部分の配列 を挟んで第 1のスぺーサー配列と第 2のスぺーサー配列が対向するように連結してい る配列（NNTTTTNN;この図の場合は AGTTTTCTと、 TCTTTTGA)と、 BpulOI制限 酵素サイトのアンチセンス配列 CCTNAGCを持つ 2本の別々のプライマーを用いた PCRにより、 cDNA中の目的の塩基配列（プロモーターおよび目的転写領域;例えば siRNAコード領域)）を増幅し、精製する。 2) N.BpulOI酵素を用いて、 目的の塩基配 列部分のみにニック (切れ目）を入れ、加熱し、徐冷して反応溶液を室温に戻し、ル ープを形成させる。 3) DNAリガーゼを用いて分子内ライゲーシヨン反応を行い、 目 的の 1種類のみのダンベル型 DNAを合成する。分子内ライゲーシヨン反応なので、非 常に高収率である。（図 3(A))その後、 DEAEイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲ ル電気泳動、およびァガロース電気泳動などで、 目的の DNA断片のみを精製する。
[図 2]ェキソヌクレアーゼ消化に対する DNAの安定性を示す。バンドは最初、（a)フル ォロイメージャー 595によって可視化した。図 1に書いてある、 2cとか 4cという化合物番 号は、この図にも対応している。約 600bpのバンドは、フルォレセインによって標識さ れた DNAである。次にゲルはェチジゥムブロマイドによって染色され、バンドは、トラン スイルミネータによって可視化された。
[図 3]直鎖状のベクターから、ダンベル型ベクターへの変換効率をあらわした図。ゲ ルはェチジゥムブロマイドによって染色され、バンドは、トランスイルミネータによって 可視化された。
[図 4]フルォレセインのスクシ-ミドエステルを用いた、ダンベル型 DNAのループ特異 的な修飾を示す。バンドは最初、（a)フルォロイメージヤー 595によって可視化した。次 にゲルはェチジゥムブロマイドによって染色され、バンドは、トランスイルミネータによ つて可視化された。レーン 1と 2は、ヘアピンループ部分に一級アミノ基を持つダンべ ル型 DNAを流し、レーン 3と 4は、ヘアピンループ部分に一級アミノ基を持たないダン ベル型 DNAを流した。レーン 2と 4は、フルォレセインスクシ-ミドエステルとの反応混 合物サンプルを流した。レーン 1と 3は、その反応前のサンプルを流した。
[図 5]HeLaS3/EGFP細胞内にトランスフエクシヨンされた各種ベクターによる、 EGFP発 現抑制の様子を示す。
[図 6]従来のダンベル型 DNAの作成法の一つを示す。 1. それぞれ独立の 2個の制 限酵素切断サイトを持つプライマー Aおよび Bを用いた PCRにより、 cDNA中の目的の 塩基配列（プロモーターおよび目的転写領域;例えば siRNAコード領域)）を増幅し、 精製する。 2. 別々の異なる制限酵素 Aおよび Bで処理する。 3. DEAEイオン交換 カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびァガロース電気泳動などで、 目的の DNA断片のみを精製する。 4. 目的の DNA断片に対して 10倍当量過剰の、 2種類の 合成オリゴ DNA (ループ部分）をまぜ、 DNAリガーゼを用いて 3分子会合し、ダンベル 型 DNAを合成する。分子間ライゲーシヨン反応なので、低収率である。（図 3(B)) 5. DEAEイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびァガロース電気泳 動などで、 目的の DNA断片のみを精製する。
[図 7]従来のダンベル型 DNAの別の作成法を示す。 1. それぞれ独立の 2個の制限 酵素切断サイトを持ち、同時に BpulOI制限酵素サイトを 2つ持つプライマー Aおよび B を用いた PCRにより、 cDNA中の目的の塩基配列（プロモーターおよび目的転写領域 ；例えば siRNAコード領域)）を増幅し、精製する。 2. 別々の異なる制限酵素 Aおよ び Bで処理する。 3. DEAEイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気泳動、お よびァガロース電気泳動などで、 目的の DNA断片のみを精製する。 4. 大腸菌を用 いて増幅可能なベクター DNA (MIDGEベクターなど）に、精製した目的 DNA断片を DNAリガーゼなどを用いてクローユングする。 5. 4を用いて大腸菌の形質転換を行 い、 目的 DNA断片を持つプラスミド DNAを増幅する。 6. N.BpulOI酵素を用いて、 目 的の塩基配列部分のみにニック (切れ目）を入れる。 7. 加熱する。 8. 徐冷して反 応溶液を室温に戻し、ループを形成させる。 9. DNAリガーゼを用いて分子内ライゲ ーシヨン反応を行い、 2種類のダンベル型 DNAを合成する。 10. 大腸菌を用いて増 幅可能なベクター DNA (MIDGEベクターなど）由来のダンベル型 DNAを、制限酵素 処理する。その際、 目的 DNA断片中にその制限酵素配列を持ってはならない。 11. 制限酵素で部分消化したベクター DNA (MIDGEベクターなど）由来のダンベル型 DNAを、完全消化する。 12. DEAEイオン交換カラムやポリアクリルアミドゲル電気 泳動、およびァガロース電気泳動などで、 目的の DNA断片のみを精製する。
[図 8]タンデム型 siRNA発現ベクター（a) )とステムループ型 siRNA発現ベクター（b) ) の一例を模式的に表した図である。 a)のタンデム型 siRNA発現ベクターでは、 2つの U6プロモーターからセンス RNA、アンチセンス RNAが転写される。 b)のステムループ 型 siRNA発現ベクターでは、ショートヘアピン RNAが転写され、プロセッシングを受け て、 siRNAが産生される。
[図 9]小型化プロモーターを導入したダンベル型ベクターの効果を示す。小型化プロ モーターは天然の U6プロモーターとほぼ同程度の発現活性を有し ((a))、小型化プロ モーターで発現される siRNAはルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する効果を有し ており（(b))、さらに、小型化プロモーターは天然の U6プロモーターよりも核透過性が 高かった（(c))。
発明を実施するための最良の形態
[0053] 以下、本発明を詳細に説明するが、これは、本発明の好ましい態様を説明するもの であって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
[0054] 1.ダンベル型 DNAの構築
目的の DNA配列を有する鎳卑』 DNAの構築
まず、 目的の DNA配列を有する铸型 DNAを用意する。铸型 DNAとしては、 cDN
A、化学合成した DNA (—本鎖 DNAの場合も、二本鎖 DNAの場合もある）、 PCR などの生化学的手法により合成した DNA (—本鎖 DNAの場合も、二本鎖 DNAの場 合もある）を例示することができる。铸型 DNAは、環状 DNAであっても、直鎖状 DN
Aであってもよい。
目的の DNA配列の長さは、 20— 2000塩基であるとよぐ好ましくは 40— 1000塩基 であり、より好ましくは 40— 500塩基である。 目的の DNA配列としては、プロモーター配列、 目的とする転写領域の配列（例え ば、 siRNA転写配列、デコイ転写配列、非翻訳 RNA転写配列（例えばマイクロ RNA(miRNA)転写配列、 tRNA転写配列）、特定のタンパク質の翻訳に必要な配列、 デコイ配列などを例示することができる。これらの DNA配列は、巿販の DNA合成機 などを用いて公知の方法で合成することができる。
プロモーターは、転写反応開始反応の効率に影響を与えるものであれば、特に限 定されないが、本発明のダンベル型 DNAを siRNA発現ベクターとして用いる場合に は、 siRNAのような短い RNAの発現に適した pol III系を用いることが好ましい。
polIII系のプロモーターとしては、例えば、 U6プロモーター、 tRNAプロモーター、レ トロウィルス性 LTRプロモーター、アデノウイルス VA1プロモーター、 5S rRNAプロ モーター、 7SK RNAプロモーター、 7SL RNAプロモーター、 HI RNAプロモータ 一などを挙げることができる。
利用可能なプロモーターの名前とその配列を以下に記載する。
•U6プロモーター
5し AAGGTCG GGCAGGAAGA GGGCCTATTT CCCATGATTC CTTCATATTT GCATATACGA TACAAGGCTG TTAGAGAGAT AATTAGAATT AATTTGACTG TAAACACAAA GATATTAGTA CAAAATACGT GACGTAGAAA GTAATAATTT CTTGGGTAGT TTGCAGTTTT AAAATTATGT TTTAAAATGG ACTATCATAT GCTTACCGTA ACTTGAAAGT ATTTCGATTT CTTGGCTTTA TATATCTT- 3' ( 配列番号 1)
天然の U6プロモーターには幾種類かの配列があり、後述の実施例 2で用いたプロ モーター配列（U6(240))は以下の通りである。
•U6(240)
Figure imgf000021_0001
GCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC- 3' (配列番号 25) •HIプロモーター
CC-3' (配列番号 2) •tRNAプロモーター
AGGTCCCCGGTTCGAAACCGGGCACTACAAAAACCA- 3' (配列番号 3) 発現させるプロモーター領域を小型化した人工プロモーターを用いても良い。この ような人工プロモーターとしては、 RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領 域の全部又は一部を含み、以下の (0— (iv)のうちの少なくとも 1つの配列を含むもの を挙げることができる。
(i) TATA
(ii) CTTACCGTAACTTGAAAGT
(iii) YYTCCCANNRTNCNNYGCRR
(iv) ATGCAAATあるいはこれに相補的な配列
(配列中、 Rはグァニンまたはアデニンいずれかであり、 Yはシトシンまたはチミンのい ずれかであり、 Nはグァニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。 ) 別の人工プロモーターとして、 RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域 の全部又は一部を含み、以下の (ί')一 (ϋ')のうちの少なくとも 1つの配列を含むものを 挙げることができる。
(i' )RRYNNARYGG
(ii' ) GGTTCGANTCC
(配列中、 Rはグァニンまたはアデニンいずれかであり、 Yはシトシンまたはチミンのい ずれかであり、 Nはグァニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。 ) 人工プロモーターの塩基数は、 250塩基以下であるとよぐ好ましくは 150塩基以 下、より好ましくは 100塩基以下である。
人工プロモーターとしては、後述の実施例に記載の U6(90)、 U6(l 10)プロモーター などを挙げることができる。 U6(90)、 U6(l 10)プロモーターの配列を以下に記載する。 •U6(90)プロモーター
2)
Figure imgf000023_0001
AAACACC-3' (配列番号 23) また、プロモーターとして、誘導可能なプロモーターを用いることにより、所望のタイ ミングで siRNAを発現させることも可能である。このような誘導可能なプロモーターとし ては、テトラサイクリンで誘導可能な U6プロモーター（Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the tunctional activity of an antisense RNA by a tetracycline— responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)) 等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモーター、あるいは Cre-LoxPシステム のような DNA組み換えのシステムを用いて、組織特異的に siRNAの発現を誘導しても よい。
プロモーター配列の長さは、 1一 1500塩基であるとよぐ好ましくは 40— 500塩基であ り、より好ましくは 60— 260塩基である。
siRNA転写配列は、 siRNAをコードする DNA配列であればよい。標的とする遺伝子（ mRNA)は、遺伝病をはじめとする各種疾患の原因遺伝子、アポトーシス関連遺伝子 (例えば、 p53)、白血病遺伝子 bcr—ablジャンクション、癌 ras, myx, met, mdm2, abl, erbBなどの疾患に関連する遺伝子、 HIV、 HCVなどの病原ウィルスのゲノムなどを例 示することができる。 siRNA転写配列を開示している文献は以下の通りである。
C- JUNの siRNA転写配列は、 J Biol Chem. 2003 Jun 27 Disruption of the c-JUN-JNK complex by a cell-permeable peptide containing the c— JUN delta domain induces apoptosis and affects a distinct set of IL—1— induced inflammatory genes. Holzberg D, Knight CG, Dittrich— Breiholz O, Schneider H, Dorrie A, Hoffinann E, Resch K, Kracht M.に記載されている。
Chklの siRNA転写配列は、 Mol Cancer Ther. 2003 Jun;2(6):543- 8. Human chkl expression is dispensable for somatic cell death and critical for sustaining g(2) DNA damage checkpoint. Chen Z, Xiao Z, Chen J, Ng Sし, Sowin T, Sham H, Rosenberg S, Fesik S, Zhang H.に記載されている。
caspase 8の siRNA転写配列は、 Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 16 Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B, Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S.; Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 16 Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B,
Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S.に記載されている。
RECKの siRNA転写配列は、 Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 16 Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice. Zender L, Hutker S, Liedtke C, Tillmann HL, Zender S, Mundt B, Waltemathe M, Gosling T, Flemming P, Malek NP, Trautwein C, Manns MP, Kuhnel F, Kubicka S.に記載されている。
STRADの siRNA転写配列は、 EMBO J. 2003 Jun 16;22(12):3062-3072. Activation of the tumour suppressor kinase LKBl by the STE20— like pseudokinase STRAD. Baas AF, Boudeau J, Sapkota GP, Smit L, Medema R, Morrice NA, Alessi DR, Clevers HC.に記載されている。
PKA C aの siRNA転写配列は、 J Biol Chem. 2003 Jun 11 PKA blocks Raf- 1 activity by stimulating 14—3—3 Dinding and bloc ing Raf— 1 interaction with Ras.Dumaz N, Marais R.に記載されている。
PKA C βの siRNA転写配列は、 J Biol Chem. 2003 Jun 11 PKA blocks Raf- 1 activity by stimulating 14—3—3 Dinding and bloc ing Raf— 1 interaction with Ras. Dumaz N, Marais R.に記載されている。
ErbB3の siRNA転写配列は、 Oncogene. 2003 Jun 5;22(23):3598-607. Atypical expression of t Di33 in myeloma cells: cross-talk oetween trbBj and the
interferon— alpha signaling complex. Walters DK, French JD, Arendt BK, Jelinek DF. に記載されている。
Androgen Receptorの siRNA転写配列は、 Mol Endocrinol 2003 May 29
Androgen Receptor Represses the Neuroendocrine Trans differentiation Process in Prostate Cancer Cells. Wright ME, Tsai MJ, Aebersold R.に記載されている。
FADDの siRNA転写配列は、 J Biol Chem 2003 May 12 cFLIP- L inhibits p38 MAPK activation: An additional anti— apoptotic mechanism in bile acid-mediated apoptosis. Grambinler A, Higuchi H, Bronk SF, Gores GJ.に記載されている。
HB- EGFの siRNA転写配列は、 EMBO J 2003 May 15;22(10):2411-2421 TACE cleavage of proamphiregulin regulates GPCR— induced proliferation and motility of cancer cells. Gschwind A, Hart S, Fischer OM, Ullrich A.; EMBO J 2003 May 15;22(10):2411-2421 TAし E cleavage of proamphiregulin regulates GPCR— induced proliferation and motility of cancer cells. Gschwind A, Hart S, Fischer OM, Ullrich A.に記載されている。
TACEの siRNA転写配列は、 EMBO J 2003 May 15;22(10):2411-2421 TACE cleavage of proamphiregulin regulates GPCR— induced proliferation and motility of cancer cells. Gschwind A, Hart S, Fischer OM, Ullrich A.に記載されている。
p73の siRNA転写配列は、 Cancer Cell 2003 Apr;3(4):403- 10 Chemosensitivity linked to p73 function. Irwin MS, Kondo K, Marin MC, Cheng LS, Hahn WC, Kaelin WG.に記載されている。
j8 - cateninの siRNA転写配列は、 Clin Cancer Res 2003 Apr;9(4): 1291- 300 Small Interfering RNAs Directed against beta— Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells. Verma UN, Surabhi RM, Schmaltieg A, Becerra C, Gaynor RB.に記載されている。
APCの siRNA転写配列は、 Clin Cancer Res 2003 Apr;9(4): 1291- 300 Small Interfering RNAs Directed against beta— Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells. Verma UN, Surabhi RM, Schmaltieg A, Becerra C, Gaynor RB.に記載されている。
NF- κ Bの siRNA転写配列は、 Clin Cancer Res 2003 Apr;9(4): 1291- 300 Small Interfering RNAs Directed against beta— Catenin Inhibit the in Vitro and in Vivo Growth of Colon Cancer Cells. Verma UN, Surabhi RM, Schmaltieg A, Becerra C, Gaynor RB.に記載されている。
pi 20の siRNA転写配列は、 Gastroenterology 2003 Apr;124(4):949- 60
Up— regulation, nuclear import, and tumor growth stimulation of the adhesion protein pl20 in pancreatic cancer. Mayerle J, Friess H, Buchler MW, Schnekenburger J, Weiss FU, Zimmer KP, Domschke W, Lerch MM.に記載されている。
ATMの siRNA転写配列は、 Cancer Res 2003 Apr 1 ;63(7): 1550- 4 Enhanced Radiation and Chemotherapy-mediated Cell Killing of Human Cancer Cells by Small Inhibitory RNA Silencing of DNA Repair Factors. Collis SJ, Swartz MJ, Nelson WG, DeWeese TL.に記載されている。
ATRの siRNA転写配列は、 Cancer
Res 2003 Apr 1;6J(7): 1550-4 Enhanced Radiation andし hemotherapy— mediated Cell
Killing of Human Cancer Cells by Small Inhibitory RNA Silencing of DNA Repair Factors. Collis SJ, Swartz MJ, Nelson WG, DeWeese TL.に記載されている。
telomeraseの siRNA転写配列は、 Mol Cancer Ther 2003 Mar;2(3):209- 16 Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference. Kosciolek BA, Kalantidis K, Tabler M, Rowley PT.; Mol Cancer Ther 2003 Mar;2(3):209— 16 Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference.
Kosciolek BA, Kalantidis K, Tabler M, Rowley PT.に記載されている。
cyclin Gの siRNA転写配列は、 Oncogene 2003 Mar 20;22(l l):1678-87 Modulation of p53 and p73 levels by cyclin G: implication of a negative feedback regulation. Ohtsuka T， Ryu H， Minamishima YA, Ryo A, Lee SW.に記載されている。
MDClの siRNA転写配列は、 Nature 2003 Feb 27;421(6926):961-6 MDCl is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint. Stewart GS, Wang B， Bignell CR, Taylor AM, Elledge SJ.; Nature 2003 Feb 27;421(6926):961-6 MDCl is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint. Stewart GS, Wang B， Bignell CR, Taylor AM, Elledge SJ.に記載されている。
Fasの siRNA転写配列は、 Nat Med 2003 Feb 10 RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Song E， Lee SK, Wang J, Ince N， Ouyang N， Min J, Chen J, Shankar P， Lieberman J.; Nat Med 2003 Feb 10 RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Song E， Lee SK, Wang J, Ince N， Ouyang N， Min J, Chen J, Shankar P， Lieberman J.; Nat Med 2003 Feb 10 RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Song E， Lee SK, Wang J, Ince N， Ouyang N， Min J, Chen J, Shankar P， Lieberman J.; Nat Med 2003 Feb 10 RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Song E， Lee SK, Wang J, Ince N， Ouyang N， Min J, Chen J, Shankar P， Lieberman J.; Nat Med 2003 Feb 10 RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Song E， Lee SK, Wang J, Ince N， Ouyang N， Min J, Chen J, Shankar P， Lieberman J.; Nat Med 2003 Feb 10 RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Song E， Lee SK, Wang J, Ince N， Ouyang N， Min J, Chen J, Shankar P， Lieberman J.に己載されている。
DNMTlの siRNA転写配列は、 Nat Genet 2002 Dec 23 DNMTl is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Robert MF, Morin S， Beaulieu N， Gauthier F， Chute IC, Barsalou A, MacLeod AR.に記載 されている。
DNA- PKcsの siRNA転写配列は、 Cancer Res 2002 Nov 15;62(22):6400-4 Silencing Expression of the Catalytic Subunit of DNA— dependent Protein Kinase by Small Interfering RNA Sensitizes Human Cells for Radiation-induced chromosome Damage, Cell Killing, and Mutation. Peng Y, Zhang Q, Nagasawa H, Okayasu R, Liber HL, Bedford JS.に記載されている。
p21Cipl/Waflの siRNA転写配列は、 Genes Dev 2002 Nov 15;16(22):2923- 34 Cdk4 disruption renders primary mouse cells resistant to oncogenic transformation, leading to Arf/p53- independent senescence. Zou X, Ray D, Aziyu A, し hristov K, Boiko AD, Gudkov AV, Kiyokawa H.に記載されている。
EZH2の siRNA転写配列は、 Nature 2002 Oct 10;419(6907):624- 9 The polycomb group protein Eん H2 is involved in progression of prostate cancer. Varambally ¾, Dhanasekaran SM, Zhou M, Barrette TR, Kumar— Sinha C, Sanda MG, Ghosh D, Pienta KJ, Sewalt RG, Otte AP, Rubin MA, Chinnaiyan AMに記載されている。 p73の siRNA転写配列は、 Oncogene 2002 Jul 18;21(31):4715-27 p53 induces the expression of its antagonist p73 Delta N, establishing an autoregulatory feedback loop.
Kartasheva NN, Contente A, Lenz— Stoppler C, Roth J, Dobbelsteinに記載されてい る。
miRNAは、他の生体分子と相互作用して、発生や分化に影響する小さな非翻訳 RNAである。 miRNA転写配列は、 miRNAをコードする DNA配列であればよい。 miRNA 酉己列は、 Kawasaki H, Taira K.、 Hesl is a target of microRNA- 23 during retinoic- acid- induced neuronal differentiation of NT2 cells.、 Nature. 2003年、 423、 838-842.などの文献に記載されて!、る。
siRNAおよび miRNA転写配列（プロモーター配列や、ループ部分の配列は含まな いで、目的 RNAに対する結合領域のみの配列）の長さは、 1一 200塩基であるとよぐ 好ましくは 15— 40塩基であり、より好ましくは 18— 25塩基である。
tRNA転写配列は、 tRNAをコードする DNA配列であればよい。 tRNA転写配列は、 Kose i S, l anabe Γ, 1 ani K, Asano S, Shioda T, Nagai Y, ¾himada Γ, Ohkawa J, Ί aira K., Factors governing the activity in vivo of ribozymes transcribed by RNA polymerase III, J. Virol. 1999 Mar;73(3): 1868-77.; Kawasaki H, Taira K. Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi— mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells., Nucleic Acids Res. 2003年 31、 700-707ページ.などの文献に記載されている。 tRNA転写配 列の長さは、 1一 200塩基であるとよぐ好ましくは 65— 110塩基であり、より好ましくは 80— 92塩基である。
特定のタンパク質の翻訳に必要な配列を開示している文献は以下の通りである。
Baxの翻訳に必要な配列は、 01tvai,Z.N.， Milliman, L. and Korsmeyer.S.J., Be卜 2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death, Cell 74 (4), 609-619 (1993).に記載されている。
p53の翻訳に必要な配列は、 Harlow.E., Williams on, N.M., Ralston, R.,
Helftnan.D.M. and Adams, T.E., Molecular cloning and in vitro expression of a cDNA clone for human cellular tumor antigen p53, Mol. Cell. Biol. 5 (7), 1601-1610 (1985)に記載されている。
特定のタンパク質の翻訳に必要な配列の長さは、 1一 2000塩基であるとよぐ好まし くは 50— 1000塩基であり、より好ましくは 65— 800塩基である。
デコイ配列は、遺伝子の転写因子結合部位と同一の配列を持ち、これに転写因子 が結合し、転写因子が本来のゲノム結合部位に結合することが阻害され、その結果、 転写因子の発現が抑制されるものであれば、 、かなるものであってもよ！/、。
デコイ配列の一つを以下に記載する。
E2Fデコイ： TTTCGCGC
デコイ分子が結合することが知られて 、る、 E2F以外の転写因子 (タンパク質）として は、 AP-1、 NF-kB、 SSRE、 CREB、 MEF- 2、 CarG box, tax, VP16、 TAR/tat、 GRE/HRE/MREゝ Heat shock REゝ SREゝ AP— 2、 sterol response element, TGF— b responsive element^ HIF— 1などが知られている。
デコイ転写配列は、デコイ配列をコードする配列である（RNAデコイの場合)。また、 デコイは転写因子の DNA結合部位の配列を含む、短 、DNA2重鎖核酸（医薬)の場 合もある。後者の場合、転写されることなぐダンベル型 DNAそのものが园（デコイ） 分子として働く。
目的の DNA配列を有する cDNAは、目的の DNA配列をプラスミド、ウィルス、また は PCR産物などに組み込むことにより作製することができる。組み込みの方法は、 J. bmabrook and D.W. Russell着、 'Molecularし lomng' www.MolecularClonmg.conなど の文献に記載されている。
目的の DNA配列を有する铸型 DNAをィ匕学合成するには、公知の方法に従えばよ い。 核 麵
センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、铸型 DN A中の目的の DNA配列を増幅する（図 1の 1) )。ここで、センスプライマー及びアン チセンスプライマーは、それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端 側から 3'末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配 列を有する。
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
(a)の配列の長さは、 1一 10塩基であるとよぐ好ましくは 1一 7塩基であり、より好まし くは 5塩基である。
(b)の長さは、 1一 50塩基であるとよぐ好ましくは 1一 10塩基であり、より好ましくは 3 一 6塩基である。
(c)の長さは、 4一 20塩基であるとよぐ好ましくは 5— 15塩基であり、より好ましくは 7 一 10塩基である。
(d)の長さは、 5— 50塩基であるとよぐ好ましくは 10— 30塩基であり、より好ましくは 15— 25塩基である。
ニック酵素は、二本鎖 DNAの 1本のストランドのみに開裂 (ニック）を入れるものであ るとよい。現在巿販されている、二本鎖 DNAの 1本のストランドのみに開裂を入れる ニック酵素及びその切断認識配列 (制限酵素サイト）の例を以下に記載する。なお、 下記の配列は、ニック酵素により認識されてニックが入るストランドの配列（この場合、 「ニック酵素の切断認識配列のセンス配列」）である。
BpulOI制限酵素サイト： GCTNAGG (N. BpulOIニック酵素は、 GC'TNAGGの配列 を認識しでの位置にニックを入れる； Nは、 ATGCのいずれの配列でも可能。
N.BpvC IB認識サイト： CCTCAGC(N.BpvC IBニック酵素は、 CC'TCAGCの配列 を認識しでの位置にニックを入れる）
N.BstNB I認識サイ卜： GAGTCNNNNN(N.BstNB Iニック酵素 ίま、 GAGTCNNNN'N の配列を認識して'の位置にニックを入れる）
N.Alw I認識サイト： GGATCNNNNN(N.Alw Iニック酵素は、 GGATCNNNN'Nの配列を 認識しでの位置にニックを入れる）
N.BpvC IA認識サイト： GCTGAGG (N.BpvC IAニック酵素は、 GC'TGAGGの配 列を認識しでの位置にニックを入れる）
ニック酵素が N.BpulOIである場合、（a)の配列としては TNAGGを、（c)の配列として は CCTNAGCを挙げることができる。
ニック酵素が N.BpvC IBである場合、（a)の配列としては TCAGCを、（c)の配列とし ては GCTGAGGを挙げることができる。
ニック酵素が N.BstNB Iである場合、（a)の配列としては Nを、（c)の配列としては NNNNNGACTCを挙げること力 Sできる。
ニック酵素が N.Alw Iである場合、（a)の配列としては Nを、（c)の配列としては NNNNNGATCCを挙げること力 Sできる。
ニック酵素が N.BpvC IAである場合、（a)の配列としては TGAGGを、（c)の配列とし ては CCTCAGCを挙げることができる。
(b)の配列は、一本鎖でループ構造を形成することができるものであればいかなる 配列であってもよぐその一例を以下に記載する。
(T)n (配列中、 ηは 1以上、好ましくは 1一 10であり、より好ましくは 3— 6である。 )
(b)の配列は、ァプタマ一 DNAの配列であってもよい。ァプタマ一 DNAの配列を 以下に記載する。
•トロンビンに対するァプタマ一； GGNTGGN GGNTGG (配列番号 4一 7) '色素（Reactive Green 19)に結合する DNAァプタマ一の配列モチーフ； 1本鎖ルー プを形成する。 5'- ggcgttcggggggta- 3' (配列番号 8)
例えば、センスプライマー及びアンチセンスプライマーのうちの一方の（b)の配列を ァプタマ一 DNAの配列とし、他方の（b)の配列を色素（例えば、 Eu3+複合体（ユー 口ピウムなどの希土類色素と有機化合物との錯形成物）、 Reactive Green 19など）で 修飾してもよい。トロンビンの DNAァプタマ一結合モチーフと目的タンパク質との融合 タンパク質を細胞内で発現させた時に、 Eu3+複合体色素-ダンベル DNAを細胞内に 導入することで、結果として目的タンパク質力 (希土類系）色素でラベルされる。遅延 蛍光を利用した、細胞内で目的タンパク質の高感度測定を行うなどの応用が可能と なる。センスプライマー及びアンチセンスプライマーのうちの一方の（b)の配列をァプ タマ一 DNAの配列とし、他方の（b)の配列を色素で修飾したもの力も作製したダン ベル型 DNAは、アブタマ一核酸を特異的に認識するペプチド又はタンパク質と in vitro及び Z又は in vivoで結合させることにより、細胞内への導入が容易となる。
センスプライマー及び/又はアンチセンスプライマーは、さらに、第 1のスぺーサー 配列及び第 2のスぺーサー配列を有してもよい。ここで、第 1のスぺーサー配列及び 第 2のスぺーサー配列は互いに相補的な配列であり、かつ、第 1のスぺーサー配列と 第 2のスぺーサー配列とは (b)の配列を挟んで対向するように連結される。
第 1のスぺーサ一の例としては AGを、第 2のスぺーサ一の例としては TCを挙げるこ とがでさる。
ニック酵素として N.BpulOIを使用する場合、センスプライマー及びアンチセンスプラ イマ一について、（a)の配列が TN^GG (配列中、 Tはチミン、 Aはアデニン、 Gはグァ ニン、 N1はアデニン、シトシン、グァニンまたはチミンのいずれかである。）で表され、（ b)の配列が (T) (配列中、 Tはチミンであり、 nは 1以上の整数である。）で表され、（c) の配列が CCTNUAGC (配列中、 Cはシトシン、 Tはチミン、 Aはアデニン、 Gはグァニン 、 N11はアデニン、シトシン、グァニンまたはチミンのいずれかである。）で表されるとよ い。（T)nの nは、 1以上の整数である力 好ましくは 1一 10のいずれかの整数であり、 より好ましくは 3— 6のいずれかの整数である。センスプライマー及びアンチセンスプ ライマーは、さらに、第 1のスぺーサー配列及び第 2のスぺーサー配列を有し、センス プライマーについて、第 1のスぺーサー配列力 Gで表され、第 2のスぺーサー配列 力 STCで表され、アンチセンスプライマーについて、第 1のスぺーサー配列が TCで表 され、第 2のスぺーサー配列が AGで表され、かつ、センスプライマー及びアンチセン スプライマーについて、第 1のスぺーサー配列と第 2のスぺーサー配列とは（b)の配 列を挟んで対向するように連結されて 、るとょ 、。
センスプライマーについて、（d)の配列は、 目的の DNA配列のセンス鎖の 5'末端を 含む全部又は一部の領域の配列に相補的な配列を有する。
アンチセンスプライマーについて、（d)の配列は、 目的の DNA配列のアンチセンス 鎖の 5'末端を含む全部又は一部の領域の配列に相補的な配列を有する。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの長さは、 10— 200塩基であるとよぐ 好ましくは 20— 150塩基であり、より好ましくは 30— 120塩基である。
また、センスプライマー及び Z又はアンチセンスプライマーは、（b)の配列及び Z又 はスぺーサー配列の核酸主鎖および塩基部分のうちの少なくとも 1箇所で官能基に より修飾されていてもよい。このような修飾がなされていると、これらのプライマーを用 いて作製したダンベル型 DNAにデリバリー剤などを結合させる反応点となるので有 利である。修飾の例としては、アミノ基、フルォレセインなどの蛍光基、ピオチン基、 などの官能基による修飾、タンパク質、ウィルス由来タンパク質、糖結合タンパク質、 フェリチン、レクチン群、低密度リポタンパク質 (LDL)、抗体、人工抗体、ペプチド、ぺ プチド疑似物、インスリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸 および非天然アミノ酸の共重合体、ピオチン、レチノール、レチノール誘導体、糖、ォ リゴ糖、コレステロ一ノレ、ェストラジオ一ノレ、エストロン、コレステロ一ノレ誘導体、ステロ イド、ホルモン、ステロイド誘導体、脂肪、ビタミン、葉酸などのデリバリー剤の結合な どを挙げることができる。異なる官能基やデリバリー剤で複数の修飾を行ってもょ 、。 導入された官能基を利用して、別の官能基、 TATや NLSなどの機能性ペプチド、ガン 細胞を特異的に認識する抗体、電子供与能を持つ蛍光又はリン光色素、電子受容 能を持つ蛍光又はリン光色素、タンパク質、ウィルス由来タンパク質、糖結合タンパク 質、フェリチン、レクチン群、低密度リポタンパク質 (LDL)、抗体、人工抗体、ペプチド 、ペプチド疑似物、インスリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、非天然アミノ酸、アミ ノ酸および非天然アミノ酸の共重合体、ピオチン、レチノール、レチノール誘導体、糖 、オリゴ糖、コレステロ一ノレ、ェストラジオ一ノレ、エストロン、コレステロ一ノレ誘導体、ス テロイド、ホルモン、ステロイド誘導体、脂肪、ビタミン、葉酸などのデリバリー剤などの 付加や置換をすることができる。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、 5'末端をリン酸ィ匕しておいてもよ い。センスプライマー及びアンチセンスプライマーの 5'末端をリン酸化しておけば、ダ ンベル型 DNA構築の最終段階で、ヘアピンループ構造をとつて!/、る DNAに DNAリ ガーゼを作用させた時に、分子内ライゲーシヨン反応により DNAが環化する。 5'末端 のリン酸ィ匕は、 DNA自動合成の最後の段階で、リン酸化試薬を結合させたのち、アン モ-ァ処理で脱保護することにより行うことができる。また、化学合成したオリゴ DNA( 5 '末端が水酸基)の場合は、 T4 DNAリガーゼを用いて、酵素的にリン酸化することが できる。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーの 5'末端をリン酸ィ匕しない場合には、 これらのプライマーを用いた核酸増幅法により生成した増幅産物である DNAに DN Aリガーゼを作用させる前のいずれかの段階 (例えば、核酸増幅の後、ニック酵素に よる処理の後、加熱の後、アニーリングの後など)で増幅産物 DNAの 5'末端をリン酸 化しておくとよい。
センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いて、铸型 DNA中の目的の DN A配列を増幅するには、公知の核酸増幅法によればよい。例えば、センスプライマー 及びアンチセンスプライマーを铸型となる DNAと混合し、その後、 DNAポリメラーゼを 用いて PCRを行う。 直鎖状 DNAからダンベル型 DNAへの変換
直鎖状 DNA増幅産物をニック酵素と混合 (例えば、 DNA1 μ g〖こ対してニック酵素 0.5— 2Uの混合比で）し、反応混合物をインキュベーションする（例えば、 25— 50°Cで 一晩）。この操作により、直鎖状 DNA増幅産物（二本鎖 DNA)の 1本のストランドの みにニックが入る（図 1の 2a_cに付した矢印）。
その後、反応混合物を加熱し (例えば、 90— 100°Cで 0.5— 10分）、室温まで 1分一 2 時間かけて冷却する（アニーリング)。これらの操作により、直鎖状 DNA増幅産物の 末端部にヘアピンループ構造が形成される（図 1の 3a-c)。
次いで、 DNAリガーゼ（例えば、 DNA1 μ gに対して DNAリガーゼ 175— 1000Uの 混合比で）とライゲーシヨンバッファーを添カ卩して、インキュベーションする（例えば、 14一 37°Cで 3分一 6時間）。この操作により、ヘアピンループ構造部分で分子内ライゲ ーシヨン反応が起こり、ダンベル型の構造が形成される。
以上の変換工程はワンポット反応である。すなわち、この変換工程は一つのマイク 口チューブ内で行うことができる。
ダンベル型 DNAの長さは、 12— 2000塩基（2重鎖相当分）であるとよぐ好ましくは 50— 1000塩基 (2重鎖相当分)であり、より好ましくは 150— 600塩基 (2重鎖相当分)で ある。
ライゲーシヨンにより生成した産物は公知の方法で精製するとよい。
上記の操作により、ダンベル型 DNAが構築される。このとき、ダンベル型 DNAは 光学活性なボラノホスフェートから製造された修飾型 DNAであってもよ 、。光学活性 なボラノホスフェートから修飾型 DNAを製造する方法は、 Nucleic Acids Research, 1997, Vol.25, No.8, 1611- 1617に記載されている。
2.ェキソヌクレアーゼによる分解反応に対するダンベル型 DNAの安定性の評価
1で構築したダンベル型 DNAをェキソヌクレアーゼで、 25— 42°Cの温度）で 10分一 2時間処理する。ェキソヌクレアーゼ処理前後のダンベル型 DNAを少量とつて、電気 泳動にかけ、バンドを可視化する。その結果、ダンベル型 DNAはェキソヌクレアーゼ による分解反応に対して抵抗性を示すことがわかる。
3.ダンベル型 DNAの部位特異的修飾
1で構築したダンベル型 DNAは、公知の方法により、部位特異的修飾を行うことが できる。例えば、特定位の塩基 (例えば、一本鎖でループ構造を形成している配列中 の塩基）にアミノ基を導入しておけば、市販の Amine Labeling Kit (Panvera, Madison, WI)を用いることにより、アミノ基を導入した部位でダンベル型 DNAをフルォレセイン で修飾することができる。また、市販のキット（FastTag(R),vector laboratories社）を用い て、無修飾のプライマー DNAに SH基を付与させておけば、各種マレイミド誘導体と反 応させることができる。
4.ダンベル型 DNAへのデリバリー剤の結合
1で構築したダンベル型 DNAは、公知の方法により、デリバリー剤を結合させること ができる。
デリバリー剤としては、タンパク質、ウィルス由来タンパク質、糖結合タンパク質、フ エリチン、レクチン群、低密度リポタンパク質 (LDL)、抗体、人工抗体、ペプチド、ぺプ チド疑似物、インスリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸お よび非天然アミノ酸の共重合体、ピオチン、レチノール、レチノール誘導体、糖、オリ ゴ糖、コレステロ一ノレ、ェストラジオ一ノレ、エストロン、コレステロ一ノレ誘導体、ステロイ ド、ホルモン、ステロイド誘導体、脂肪、ビタミン、葉酸等を例示することができる。 ダンベル型 DNAにデリバリー剤を結合させる方法の例を以下に記載する。第一の 例では、まず、ダンベル型 DNAにアミド基 (-NH )を導入し (ダンベル型 DNA-NH )、
2 2 これ EMCS (6-Maleimidohexanoic
acid N-hydroxysuccinimide ester)と反応させることにより、ダンベル型 DNAをマレイミ ド化することができる（ダンベル型 DNA-NHCO- maleimide)。マレイミド化したダンべ ル型 DNA (ダンベル型 DNA-NHCO- maleimide)をペプチドなどに含まれる SH基と反 応させること〖こより、ダンベル型 DNAにペプチドを結合させることができる（ダンベル型 DNA- NHCO-ペプチド）。
第二の例では、ダンベル型 DNAにアミド基（-NH )を導入し（ダンベル DNA-NH )、
2 2 これをスクシ-ミドエステル誘導体と反応させることにより、ダンベル型 DNAを誘導体 化することができる（ダンベル型 DNA-NHCO-誘導体)。 5.ダンベル型 DN Aの利用
ダンベル型 DNAは核酸ベクターとして利用することができる。
核酸ベクターの細胞への導入は、公知の方法で行うことができる。例えば、哺乳動 物細胞への導入では、リン酸カルシウム法 (Virology, Vol.52, p.456 (1973))、エレクト 口ポレーシヨン法 (Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311 (1987))、リポフエクシヨン法 0. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175 (198 9))、ウィルスにより感染導入方法 (Sci.Am., p.34, March (19 94))、ジーンガンなど力も選択することができ、植物細胞への導入 では、エレクト口ポレーシヨン法 (Nature, Vol.319, p.791 (1986))、ポリエチレングリコ ール法 (EMBO J., Vol.3, p.2717 (1984))、パーティクルガン法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo 1.85, p.8502 (1988))、ァグロバタテリユウムを介した方法 (Nucleic. Acids Res., Vol.12, p.8711 (1984))等により行うことができる。
核酸ベクターが導入された細胞を選択する方法としては、導入した核酸ベクターに 特異的な DNA配列をプローブあるいはプライマーとして、ハイブリダィゼーシヨン、 PCR法等の公知の手法により選択することができる。核酸ベクターが選択マーカーを 備えている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる ダンベル型 DNA、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型 DNA力 RNA転写配 列を有する場合には、その siRNAが標的とする遺伝子 (mRNA)の発現を抑制すること ができるので、疾患の予防及び Z又は治療を目的とする医薬品として、あるいは、遺 伝子の機能を解析するための試薬として利用することができる。例えば、 siRNAが標 的とする遺伝子が、遺伝病をはじめとする各種疾患の原因遺伝子、アポトーシス関連 遺伝子（例えば、 p53)、白血病遺伝子 bcr- ablジャンクション、癌 ras, myx, met, mdm2, abl, erbBなどの疾患に関連する遺伝子、 HIV、 HCVなどの病原ウィルスのゲノ ムなどである場合には、ダンベル型 DNA、又はデリバリー剤を結合させたダンベル 型 DNAは、疾患を予防及び Z又は治療するための医薬品として、ヒト、その他の動物 に投与することができる。
患者の組織または細胞に、 siRNA配列を有するダンベル型 DNA、又はデリバリー 剤を結合させたダンベル型 DNAを導入することによって、細胞中の標的遺伝子の発 現を抑制することができる。ダンベル型 DNA、又はデリバリー剤を結合させたダンべ ル型 DNAの導入は、例えば、それらをリボソームに封入し、細胞内に取り込む方法（ Lipidic vector systems for gene transfer (1997) R.J. Lee ana L. Huangし rit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 14, 173-206 ;中西守ら、蛋白質 核酸 酵素 Vol.44, No.ll, 1590-1596 (1999))、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法、リボフエタ シヨン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。ダ ンベル型 DNA、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型 DNAを細胞に導入する 場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、 in vitroで遺伝子導入を行った 後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に導入す ることちでさる。
ダンベル型 DNA、又はデリバリー剤を結合させたダンベル型 DNAを有効成分とし て含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体 (例えば、生理食塩水、緩 衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応 答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成さ れるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
本発明のダンベル型 DNAを用いて、 siRNAあるいはヘアピン RNAを含む二本鎖 RNA、リボザィム、アンチセンス RNAなどの機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現 させたり、遺伝子の発現を抑制することができる。機能性核酸の標的は、 HIV、 HCV、 HBVなどのウィルス、癌遺伝子などであるとよい。本発明のダンベル型 DN Aを細胞 あるいは組織内に導入したときに、遺伝子の発現を抑制することができれば、このダ ンベル型 DNAは DNAザィムとして利用することができる。
本発明のダンベル型 DNAを含む組成物は、医薬品、化粧品、試薬、食品などの 種々の用途に利用することができる。
6.プライマー糸且成物及びキット
本発明の別の態様として、上記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーか らなる少なくとも 1組のプライマーを含むキットが提供される。このキットは、ダンベル型 DNAを製造するために利用することできる。キットは、上記のセンスプライマー及びァ ンチセンスプライマーからなる少なくとも 1組のプライマー以外の要素を含んでもよい 。例えば、核酸増幅の铸型となる DNA、 DNAポリメラーゼ、各種塩基の dNTP、 -ッ ク酵素、 DNAリガーゼ、バッファー（例えば、トリスバッファー、リン酸バッファー、カコジ ル酸バッファーなど）、キットの使用方法を記載した説明書、コバルト塩、マグネシウム 塩、マンガン塩、更なる官能基ィ匕のできる化合物（マレイミド誘導体、スクシ-ミドエス テル誘導体、機能性ペプチド、反応点を持つタンパク質や抗体)などを含んでもよい
実施例
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発 明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例 1]
実験方法 本実験の全般に渡り、全ての溶媒と試薬は市販の物を使い、特に精製を行っていな い。アツセ一は最低 3回行った。 プラスミド構築. pU6ト EGFPと pU6i— laminプラスミドは、 U6 promoterと、 enhanced green fluorescent protein (EGFP)と laminにそれそれ对する nairpin— type siRNA発 現配列とを持つ。それらは，次のように構築した。最初に本発明者らは siRNA発現べ クタ. ~~を、市販の pU6icassette vector (iuENE Therapeutics, Tsukuba, Japan) と に構築した。この巿販ベクターは、 human U6 promoterと 2つの BspMIサイトを持つ。 siRNA-発現ベクター構築のために，本発明者らは hairpin配列， terminator配列， そして overhanging配列を持つオリゴヌクレオチドを (外注で)合成した。そして、それ らフラグメントのァニールを行い、先ほどの pU6icassetteベクター BspMIサイトに挿入（ ライゲーシヨン)を行った。
U6プロモーター直後の挿入配列は次の通り： pU6i- EGFPでは； 5'- GGC TAT GTC TAG GAG TGT ACC TAG AAT TAC ATC AAG GGA GAT GGT GCG CTC CTG GAC GTA GCC- 3' (配列番号 9) , pU6i- laminでは； 5'- GGG TAA TTG GTA GAT TAA GCG GTG TGC TGT CCC GCT TGA TCT GCC AAT TGC CC- 3' (IS 列番号 10)
3つの独立したオリゴヌクレオチドを用いて分子間でダンベル型 DNAを作る従来法.
(a) U6 promoter-によって発生する siRNAをコードする直鎖状 DNAの PCRによる 増幅： 500 pmolのそれぞれの合成 DNAプライマーを pU6i-lamin ベクターとまぜ、 PCR反応を Ex Taq™ DNA polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan).を使って行った。 PCRのためのプライマーの、センスおよびアンチセンス鎖の配列は， 5'-pGGG AAT TCA CCT GCC GGC GAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC GTT G- 3' (配列番号 11)と 5'— pGGC TGC AGA CCT GCC GGC CAC CGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG G-3' (配列番号 12)である。どちらのプライマーも BspMI認識配列 (下 線で示してある),を持ち、 5'-末端はリン酸化されている。 PCR産物は Wizard(R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega, Madison, WI, USA)を用いることで精製さ れ、 BspMIを用いて消化された。 37度で 7時間反応を行ったのち、消化された生成 物は Wizard(R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega)にて単離された。
(b) siRNA発現用直鎖状 DNAのダンベル型 DNAへの変換： ダンベル化されてい ない PCR産物は、 T4 DNA ligase (DNA ligation kit; TaKaRa)を用いて、 10当量過 剰の oligonucleotide- cap分子と反応し、ダンベル化した。ライゲーシヨン反応前に，粘 着性 5'末端を持つ oligonucleotide- capのヘアピン型構造を持つ DNAを、 95度で 1分 処理後、 1時間かけて徐々にそれを室温に徐冷することで得た。
oligonucleotide- capの配列は， 5'- pGGT GTG TCC GCG TTG GCT TTT GCC AAC GCG GAC A— 3' (酉己歹 lj番号 13)と 5し pCCT CGG CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGG CGG GAA CCG CCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CC- 3' (配列番 号 14)である。反応混合物は、 16度，終夜インキュベートを行い，ライゲーシヨン産物 は phenol/chloroform抽出後、エタノール沈殿を行うことで得た。
PCR産物の分子内ライゲーシヨンによるダンベル DNAベクターの新規作成法.
(1) U6 promoter-によって発生する、 laminに対する siRNAをコードする直鎖状 DNAの PCRによる増幅： それぞれの合成 DNAプライマーを 500 pmolずつ、 pU6i- laminベクターと混合し， PCR反応を Ex Taq™ DNA polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan).を使って行った。 PCRのための共通プライマーの、センスおよびアンチ センス鎖の配列は， 5し pTTA GGA GTT XnTC TCC TAA GCG TTT TCC CAG TCA CGA CGT TG-3' (n= l- 3) (配列番号 15— 17)及び 5'- pTTA GGT CTT TTG ACC TAA GCG AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG- 3' (配列番号 18)であ る. どちらのプライマーも N.BpulOI認識配列 (下線で示してある)を持ち、 5'-末端 はリン酸化されている。 PCR産物は Wizard(R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega, Madison, WI, USA)を用いることで精製された。センスプライマーは、未修 飾の（X1; dT),ァミノ基で修飾された（X2, amino-modified dT),またはフルォレセイン で修飾された (X3, fluorescein- modified dT)デォキシチミジンである。それら HPLCで 精製済みの共プライマーは Hokkaido System Science Co., Ltd. (Sapporo, Japan)から 購入した。
(2) U6 promoter-によって発生する、 EGFPに対する siRNAをコードする直鎖状 DNAの PCRによる増幅： 500 pmolの各々の合成 DNAプライマーと pU6i- EGFPプラ スミド DNAとを混ぜ、 最初の PCR反応を Ex Taq™ DNA polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan).を使って行った。 最初の PCRのためのプライマーの、センスおよびァ ンチセンス鎖の配列は， 5'- GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG AAG GTC GGG CAG GAA GAG- 3' (配列番号 19)と 5'- GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG AAA AAG GCT ACG TCC AGG AG- 3' (配列番号 20)である。そして、最初の PCR生成物は、 8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて精製された。 単離した PCRフ ラグメントを铸型 DNAとして， 2番目の PCR反応を共通プライマーを用いて同一条件 にて行った。 2番目の PCR産物は Wizard(R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega, Madison, WI, USA)を用いることで精製された。 siRNAをコ一ドする直鎖状 DNAの塩基配列は以下の通りである。
Figure imgf000042_0001
AA (配列番号 21)
(3) siRNA-を発現するための直鎖状 DNAの、 ダンベル型 DNAへの変換： 18.8マ イクログラムの直鎖状 PCR産物をそれぞれ、 18.8 Uの N.BpulOI (MBI Fermentas, Hanover, MD)と混合し、反応混合物を 37度で終夜インキュベートした。反応混合物 は、 95度で 1分加熱を行い、 95度力 室温まで 1時間かけて徐冷した。この段階で、 末端ヘアピンループ構造が形成される。ヘアピン末端部分での分子内ライゲーショ ンのために， T4 DNAリガーゼ（15,750 U)とライゲーシヨンバッファー（TaKaRa)は 反応混合物に直接加えられ、そして 16度で 3時間インキュベートを行った。以上の 変換過程はワンポット反応である点が特筆される。 つまり、それら全ての過程は、た つた一つのマイクロチューブ内で行われる。 ライゲーシヨン生成物は、
phenol/chloroform抽出後、エタノール沈殿を行うことで得た。 試験管内での、ェキソヌクレアーゼ消化によるベクターの安定性の評価
直鎖状およびダンベル型ベクターの安定性は、 exonuclease III (1500 U/マイクロ g of DNA, TaKaRa)で 37度、 1時間の消化を行うことで評価した。消化反応の前後の各 々のフラクションを一定量用いて、それぞれ 8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて 分析した。電気泳動後のゲノレは、 Fluorlmager 595 (Molecular Dynamics.Uppsala, Sweden)を用いて分析した。この装置には、 アルゴンレーザー（488 nm)が励起光源 として付属しており、 フルォレセイン（λ = 492 nm)の蛍光を検出するために、発色 max
フィルター (around 530 nm)を用いた。次に、先ほどのゲルを用いて、 ethydium bromideによる染色を行った。 DNAの量と、 fluoresceinが付カ卩しているかどうかは、 NIH Image programと ImageQuant program (Molecular Dynamics)を用 ヽ 7こゲノレのノヽ ンド定量することで分析した。 各々のバンド強度は、標準サンプルによる標準カーブ を用いて定量化され、直鎖状 DNAからダンベル型 DNAへの変換効率を求めた。 ダンベル型ベクターのフルォレセインによる部位特異的な修飾
ダンベル型ベクターをィ匕学修飾するため、 Fluorescein Amine Labeling Kit (Panvera, Madison, WI)を添付マニュアル通りに用いた。簡潔に概略を記述すると、 67 nMの ダンベル型ベクター（30マイクロリツター、 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)溶液、 4 mM succinimide ester of fluoresceinを含？ J を 37度、 1 hourでインキュべ ~~シヨン して、その後， 100 mM Tris/HClバッファー（pH 8.0)を加えることで反応を終結させ た。溶液は更に 30分放置した。 DNAは、 Wizard(R) SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega, Madison, WI, USA)を用いることで単離した。 細胞、細胞培養、形質転換、 GFP蛍光アツセー
HeLa S3/EGFP細胞を次のようにして得た。 HeLa/S3細胞は、直鎖状に変換した pHygEGFP (Clontech, East Meadow Circle, PA)を用いて形質転換された。そして、 hygromycin-而性クローンを選び出した。細胞培養は、 10% (v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO— BRL, Gaithersburg, MD), hygromycin (100マイク 口 g/mL; Sigma) ^ antibiotic— antimycotic mixture (GIBCO— BRL)をネ甫填した
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO)を用いてィ丁っ た。クローンの一つ、つまり、 HeLa S3/EGFPクローン番号 3を、以下の実験に用い た。細胞は、先ほどの培地内で、 37度， 5% CO インキュベーター内で維持された。
2
細胞は、 8- well cnambered glass slide (Nalge Nunc International, Naperville, IL)内で 約 40-50% confluenceになるまで培養し、 DNAで形質転換を行った。形質転換には、 OPTI-MEM培地（Invitrogen, Carlsbad, CA)、 Trans-It LT- 1試薬（PanVera, Madison, WI)を用いて、同封マニュアル通りに行った。それらは各々 100 ngの， EGFP遺伝子をターゲットとした siRNAを発現させる dumbbeU-shapedベクター，直鎖 状 PCR産物ベクター，または pU6i-EGFPプラスミドベクターを用いて独立にトランス フエクシヨンされた。 DNAを用いずに、トランスフエクシヨン試薬だけを用いたにせのト ランスフエクシヨンもコントロール実験としてなされた。 トランスフエクシヨン後の細胞の インキュベーションは 48時間なされた。トランスフエクシヨン後 24時間経った時に、培 地を新鮮なものに交換した。ガラスカバースリップ上の生細胞は、 48時間後に蛍光 顕微鏡（LSM- 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)を持ちいて観察した。 結果及び考察 合成 ダンべルづくりのキーステップは図 1に示した。 3段階の反応力もなる。
N.BpulOIは、サイト &ストランド特異的な、人工的に工学的な手法で作られたエンドヌ クレアーゼである。それは、 2本鎖 DNAの 1本のストランドのみに開裂（ニック）を入れる 図 1で示したように、ステップ 2でのニック酵素は DNAの一つのストランドのみを開裂す る。
環化収率は 90%だったことは強調できる。なぜなら環化は分子内ライゲーシヨン反応 として進行する力 である。
ダンベル DNAに 1箇所だけ 1級ァミノ基がついた化合物は蛍光性のダンベル DNAに スクシ-ミドエステルを用いて変換することに成功した。対照的に、一級アミノ基を持 つて ヽな 、ダンベルは、スクシ-ミドエステルと全く反応しなかった。
このことは、様々な置換基がダンベル DNAのヘアピンループ領域だけに、部位特異 的に導入できることを意味して 、る。
蛍光性のダンベル DNAはまた、蛍光プライマーを用いた合成によっても作ることがで ダンベル型 DNAは末端がヘアピンオリゴヌクレオチド構造になって ヽるので、ェキソ ヌクレアーゼによる分解反応に対して抵抗性を示すようになることが知られて 、る。 中間体 2cと、ダンベル 4dとを、独立にェキソヌクレアーゼで 1時間処理し、 8%PAGEで 分析した。
結果を図 2に示したように、末端を持つ DNAは 1時間のヌクレアーゼ処理で完全に分 解してしまったが、ダンベルは明らかに分解に抵抗性を示した。 細胞でのアツセィ プラスミド、直鎖状 DNAも、ダンベル DNAも、同じ発現カセットを持つ。それは、 U6プ 口モーターと EGFPに対する siRNA発現用遺伝子との両方である。
これら異なった siRNA発現ベクターによる細胞内での目的 mRNA遺伝子の阻害効果 をテストするため、本発明者らは Hela/EGFPに形質転換した。
EGFPに対する siRNAを発現する DNAを用いたところ、特異的で効果的なターゲット へのダウンレギュレーションが確認された。
再現性は 3回確認した。
本発明者らは、最高のかつ最も再現性のある阻害がダンベル DNAを使った時に確認 した。
この条件下で、本発明者らはダンベル siRNA発現ベクター力 48時間のインキュベー シヨン後に直鎖状の PCR産物よりもより効果的であることを見つけた。
つまり、ダンベル DNAによって誘発された RNAi効果が直鎖 DNAのそれよりも高ぐ効 果が長持ちした。
直鎖状 DNAの RNAi効果が 48時間後に減少したことを説明するのに、本発明者らは ダンベル DNAの細胞内での寿命力 直鎖状 DNAに比べて長!、からだと考えて!/、る。 このことは、前記の exonucleaseを用いた試験管内での実験で示されたように、ダンべ ル DNAが直鎖状 DNAよりも、細胞の中でも exonucleaseに対してより安定に存在する からであろう。 [実施例 2]
ダンベル型 DNAによって構成しうる発現型 DNAの最小ユニットは、 RNAポリメラーゼ によって認識される配列（プロモーター）および、発現されるべき RNAをコードする配 列である。細胞内に導入される DNAは、医薬品としてのコストや細胞内への導入効率 の面で、より短いものが望ましぐしたがって、導入される DNAを、より短くすることは、 遺伝子の機能解析や遺伝子治療の面で非常に有益である。 小型化プロモーターの作製と解析
小型化プロモーターは天然のプロモーターとの比較のために U6(90)プロモーター および U6(l 10)プロモーターを作製した。どちらも天然の U6プロモーターと比較して 半分以下の長さである。このプロモーターの下流にルシフェラーゼを標的とした siRNAをコードする DNAを配置し、ベクターを構築した。
U6(90)プロモーター配列、ある!/、は U6(l 10)プロモーター配列を有する化学合成 DNAを PCRによって増幅し、 EcoRIおよび BspMI処理後、 piGENE- WJ6ベクター（ iGENE Therapeutics, Tsukuba, Japan)にプロモーター DNAを組み込んだ。これらの プロモーター配列を有するプラスミドを BspMI処理後、ルシフェラーゼ遺伝子を標的と する siRNAをコードする DNA配列
TGCTTTTT-3' (配列番号 24)を組み込み、 siRNA発現プラスミドを構築した。
ベクター DNAを HeLa細胞にトランスフエクシヨン後、発現される RNAの量をノーザン ブロッテイング法を用いて定量した。また、 siRNAの効果を比較するためにルシフェラ ーゼの発光値を測定した。
ベクター DNAを、フルォレセイン蛍光色素を含むプライマーを用いて PCRした後に
、ジギトニン処理した HeLa細胞とインキュベーション後、 1時間後に蛍光を観察した。 結果および考察
U6(90)プロモーター、 U6(l 10)プロモーター、および天然の U6プロモーターにおい て発現量を検出したところ、小型化によって得られたプロモーターは、天然の U6プロ モーターとほぼ同程度で発現活性を有していた（図 9(a))。また、これらのプロモータ 一で発現される siRNAはルシフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する効果を有して ヽた（ 図 9(b))。さら〖こ、蛍光色素で標識した DNAベクターの細胞核透過性を調べたところ、 小型化したベクターでは、従来のベクターよりも核透過性が高いことが明ら力となった (図 9(c))。 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
[0059] 本発明のダンベル型 DNAは、遺伝子治療に用いることができる。 配列表フリーテキスト
[0060] 配列番号 1は、 U6プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号 2は、 HIプロモーターの塩基配列を示す。
配列番号 3は、 tRNAプロモーターの塩基配列を示す。
配列番号 4は、トロンビンに対するァプタマ一の塩基配列を示す。
配列番号 5は、トロンビンに対するァプタマ一の塩基配列を示す。
配列番号 6は、トロンビンに対するァプタマ一の塩基配列を示す。
配列番号 7は、トロンビンに対するァプタマ一の塩基配列を示す。
配列番号 8は、 Reactive Green 19に結合するァプタマ一の塩基配列を示す。
配列番号 9は、 pU6i-EGFPにおける U6プロモーター直後の挿入配列の塩基配列を 示す。
配列番号 10は、 pU6i-laminにおける U6プロモーター直後の挿入配列の塩基配列 を示す。
配列番号 11は、 PCRのためのプライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。 配列番号 12は、 PCRのためのプライマーのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。 配列番号 13は、 oligonucleotide-capの塩基配列を示す。 配列番号 14は. oligonucleotide- capの; ¾基目 il列 不す。
配列番号 15は. PCRのための共通プライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。 配列番号 16は. PCRのための共通プライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。 配列番号 17は. PCRのための共通プライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。 配列番号 18は. PCRのための共通プライマーのアンチセンス鎖の塩基配列を示す 配列番号 19は. PCRのためのプライマーのセンス鎖の塩基配列を示す。
配列番号 20は. PCRのためのプライマーのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。 配列番号 21は. siRNAをコードする直鎖状 DNAの塩基配列を示す。
配列番号 22は. U6(90)プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号 23は. U6(l 10)プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号 24は.ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする siRNAをコードする DNA配列を 示す。
配列番号 25は. U6(240)プロモーター (天然型の U6プロモーター)の塩基配列を示 す。

Claims

請求の範囲
[1] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端にぉ ヽて、それぞれ、センス鎖とァ ンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DNAの製 造方法であって、以下の工程：
1)センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、铸型 D NA中の目的の DNA配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセン スプライマーは、それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端側力も 3' 末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配列を有し
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
2) 1)の工程で得られた DNA増幅産物を (a)のニック酵素で処理する工程、
3) 2)の工程でニック酵素処理された DNA増幅産物を加熱し、その後にアニーリング する工程、及び
4) 3)の工程で加熱及びアニーリングされた DNA増幅産物を DNAリガーゼで処理 する工程
を含み、ここで、
1)の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの 5'末端がリン 酸化されているか、あるいは 1)の工程が行われた後 4)の工程が行われる前に DNA 増幅産物の 5'末端がリン酸化される、前記方法。
[2] ダンベル型 DNA力 RNA転写のためのベクターとして用いられるものである請求項 1記載の方法。
[3] 目的の DNA配列が 1個以上のプロモーター配列及び siRNA転写配列を有する請 求項 1または 2記載の方法。
[4] ダンベル型 DNAがタンデム型 siRNA発現ベクターある!/、はステムループ型 siRNA 発現ベクターである請求項 3記載の方法。
[5] センスプライマー及び Z又はアンチセンスプライマーカ さらに、第 1のスぺーサー配 列及び第 2のスぺーサー配列を有し、ここで、第 1のスぺーサー配列及び第 2のスぺ ーサー配列は互いに相補的な配列であり、かつ、第 1のスぺーサー配列と第 2のスぺ ーサー配列とは (b)の配列を挟んで対向するように連結されて!、る請求項 1一 4の ヽ ずれかに記載の方法。
[6] センスプライマー及びアンチセンスプライマーにっ 、て、 （a)の配列が T^AGG (配列 中、 Tはチミン、 Aはアデニン、 Gはグァニン、 N1はアデニン、シトシン、グァニンまたは チミンのいずれかである。）で表され、（b)の配列が (T) (配列中、 Tはチミンであり、 n は 1以上の整数である。）で表され、（c)の配列が CCTNUAGC (配列中、 Cはシトシン 、 Tはチミン、 Aはアデニン、 Gはグァニン、 N11はアデニン、シトシン、グァニンまたはチ ミンのいずれかである。）で表される請求項 1一 5のいずれかに記載の方法。
[7] センスプライマー及びアンチセンスプライマーカ さらに、第 1のスぺーサー配列及び 第 2のスぺーサー配列を有し、センスプライマーについて、第 1のスぺーサー配列が AGで表され、第 2のスぺーサー配列力TCで表され、アンチセンスプライマーについ て、第 1のスぺーサー配列が TCで表され、第 2のスぺーサー配列が AGで表され、力 つ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーについて、第 1のスぺーサー酉 S列と 第 2のスぺーサー配列とは (b)の配列を挟んで対向するように連結されて!、る請求項 6記載の方法。
[8] センスプライマーの配列及びアンチセンスプライマーについて、（b)の配列力TTTT で表される請求項 7記載の方法。
[9] センスプライマー及び Z又はアンチセンスプライマーカ、（b)の配列及び Z又はスぺ ーサー配列の核酸主鎖および塩基部分のうちの少なくとも 1箇所で官能基により修飾 されて 、る請求項 1一 8の 、ずれかに記載の方法。
[10] 1)の工程の後に、官能基変換を行う工程をさらに含む請求項 9記載の方法。
[11] センスプライマー及びアンチセンスプライマーカもなる少なくとも一組のプライマーを 含む糸且成物であって、前記センスプライマー及び前記アンチセンスプライマーが、そ れぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端側力も 3'末端側の方向に向 力つて順に下記の（b)の配列、（C)の配列及び (d)の配列を有する、前記組成物。
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
[12] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端にぉ 、て、それぞれ、センス鎖とァ ンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DNAを製 造するために用いられる請求項 11記載の組成物。
[13] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端にぉ 、て、それぞれ、センス鎖とァ ンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DNAを製 造するために用いられるキットであって、センスプライマー及びアンチセンスプライマ 一からなる少なくとも一組のプライマーを含み、前記センスプライマー及び前記アン チセンスプライマーが、それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端 側から 3'末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配 列を有する、前記キット。
(a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
[14] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とァ ンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DNAにデリ ノ リー剤を結合させた核酸ベクターの製造方法であって、以下の工程：
1)センスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いた核酸増幅法により、铸型 D NA中の目的の DNA配列を増幅する工程、ここで、センスプライマー及びアンチセン スプライマーは、それぞれ、 5'末端に下記の（a)の配列を有し、かつ、 5'末端側力も 3' 末端側の方向に向力つて順に下記の (b)の配列、（c)の配列及び (d)の配列を有し (a)ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b)—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c) (a)のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d)目的の DNA配列の全部又は一部に相補的な配列
2) 1)の工程で得られた DNA増幅産物を (a)のニック酵素で処理する工程、
3) 2)の工程でニック酵素処理された DNA増幅産物を加熱し、その後にアニーリング する工程、
4) 3)の工程で加熱及びアニーリングされた DNA増幅産物を DNAリガーゼで処理 する工程、及び
5) 4)の工程で DNAリガーゼ処理された DNA増幅産物中の目的の DNA配列以外 の配列にデリバリー剤を結合させる工程
を含み、ここで、
1)の工程で用いられるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの 5'末端がリン 酸化されているか、あるいは 1)の工程が行われた後 4)の工程が行われる前に DNA 増幅産物の 5'末端がリン酸化される、前記方法。
[15] 請求項 1一 10のいずれか〖こ記載の方法で作製されたダンベル型 DNA。
[16] 直鎖状 2本鎖 DNAの 5'末端及び 3'末端の両末端において、それぞれ、センス鎖とァ ンチセンス鎖がループ構造の一本鎖 DNAで連結されているダンベル型 DNAであつ て、以下の (a')— (d')の配列を含む前記ダンベル型 DNA。
(a')ニック酵素の切断認識配列のセンス配列の一部であって、ニック酵素の作用によ りニックが入る部位力 3'末端側の配列を含む配列
(b')—本鎖でループ構造を形成することができる配列
(c') (a')のニック酵素の切断認識配列のアンチセンス配列の全部
(d')目的の DNA配列
[17] 細胞あるいは組織に導入し、機能性核酸を細胞あるいは組織内で発現させることが できる請求項 15または 16記載のダンベル型 DNA。
[18] 発現する機能性核酸が siRNAある 、はヘアピン RNAを含む二本鎖 RNAである請求項
17記載のダンベル型 DNA。
[19] 発現する機能性核酸がリボザィムである請求項 17に記載のダンベル型 DNA。
[20] 発現する機能性核酸がアンチセンス RNAである請求項 17記載のダンベル型 DNA。
[21] RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域の全部又は一部を含む請求項 1
7— 20の!、ずれかに記載のダンベル型 DNA。
[22] RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域の全部又は一部力 以下の (0—
(iv)のうちの少なくとも 1つの配列を含む 250塩基以下の配列を含む請求項 21記載 のダンベル型 DNA。
(i) TATA
(ii) CTTACCGTAACTTGAAAGT
(iii) YYTCCCANNRTNCNNYGCRR
(iv) ATGCAAATあるいはこれに相補的な配列
(配列中、 Rはグァニンまたはアデニンいずれかであり、 Yはシトシンまたはチミンのい ずれかであり、 Nはグァニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。 )
[23] RNAポリメラーゼ IIIから転写されるプロモーター領域の全部又は一部力 以下の (ί') 一 (ϋ')のうちの少なくとも 1つの配列を含む 150塩基以下の配列を含む請求項 21記 載のダンベル型 DNA。
(i' )RRYNNARYGG
(ii' ) GGTTCGANTCC
(配列中、 Rはグァニンまたはアデニンいずれかであり、 Yはシトシンまたはチミンのい ずれかであり、 Nはグァニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかである。 )
[24] 配列番号 1、 22、 23または 25のいずれかの配列を含む請求項 21— 23のいずれか に記載のダンベル型 DNA。
[25] 発現する機能性核酸の標的がウィルスあるいは癌に関連する遺伝子である請求項 1
7— 24の!、ずれかに記載のダンベル型 DNA。
[26] ウィルスが HIV、 HCVおよび HBVからなる群より選択される請求項 25記載のダンベル 型 DNA。
[27] 細胞あるいは組織に導入し、遺伝子の発現を抑制することができる請求項 15または
16記載のダンベル型 DNA。
[28] DNAザィムである請求項 27記載のダンベル型 DNA。
[29] デコイとして作用する請求項 27記載のダンベル型 DNA。
[30] ダンベル型 DNAが光学活性なボラノホスフェートから製造された修飾型 DNAである 請求項 15— 29のいずれかに記載のダンベル型 DNA。
[31] 請求項 15— 30のいずれかに記載のダンベル型 DNAを含む組成物。
[32] 請求項 15— 30のいずれかに記載のダンベル型 DNAを含む医薬組成物。
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