JUSTIERUNG EINES MIKROSKOPS
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Justierung eines Mikroskops nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 15.
STAND DER TECHNIK
Wenn bei einem Mikroskop mehr Messstrahlen in einem Objektraum zu einem Interferenzmuster überlagert werden, hat dies in der Regel den Zweck, eine optische Anoder Abregung in dem Objektraum auf die Bereiche der Intensitätsmaxima des Interferenzmusters zu beschränken. Auf diese Weise wird eine hohe räumliche Auflösung bei der An- bzw. Abregung erreicht. Bei derartigen Mikroskopen sind die Anforderungen an die Genauigkeit der Justierung, welche für eine ordnungsgemäße Funktion der Mikroskope Voraussetzung ist, sehr hoch. Konkrete Kriterien, die bei der Justierung derartiger Mikroskope einzuhalten sind, umfassen die Überdeckung der Spots der Messstrahlen in einer gemeinsamen Brennebene der Objektive. Diese Überdeckung muss bei gepulsten Messstrahlen oder Messstrahlen sehr kurzer Kohärenzlänge nicht nur räumlich sondern auch zeitlich gegeben sein. Weitere Anforderungen an die Justierung entstehen, wenn das Interferenzmuster zum Scannen einer Probe in dem Objektraum bewegt werden soll. Dann muss auch die Phasenebene der Messstrahlen in der gemeinsamen Brennebene der Objektive konstant gehalten werden. Je nach gewünschtem Abbildungsmodus muss die relative Phasenlage der Messstrahlen konstant gehalten werden, um ein Intensitätsmaximum oder -minimum immer genau in der Mitte des Interferenzmusters an der Brennebene zu erhalten. In manchen Fällen muss die Phasenlänge auch ortsabhängig eingestellt werden, um beispielsweise Fehlpassungen der Brechzahl oder Besonderheiten einer Probe auszugleichen. Wenn das Interferenzmuster über einen weiten Wellenlängenbereich der
Messstrahlen möglichst identisch ausgebildet werden soll, so müssen auch Dispersionsunterschiede bei den Messstrahlen aufeinander abgeglichen werden. Da die typischerweise genutzten Wellenlängen der Messstrahlen kleiner als ein Mikrometer sind, sind die Anforderungen an die mechanische Präzision der verwendeten Mikroskope sehr hoch. Bei einem Probenwechsel wird eine Vielzahl zuvor vorgenommener Justierungen zerstört. Zudem sind thermische Einflüsse auf das Mikroskop weder so stark zu reduzieren noch so weit reproduzierbar, dass über längere Zeiträume von vielen Minuten oder gar einigen Stunden konstante Verhältnisse zu erreichen wären. Weitere, eine einmal erzielte Justierung beeinflussende Faktoren sind ein Driften von Sensoren, Aktuatoren und weiteren Systemkomponenten. Entsprechend verlangt die Bedienung von Mikroskopen, wie sie beispielsweise bei der aus der DE 40 40 441 A1 bekannten 4 Pi-Mikroskopie oder der aus der US 5, 671 , 085 bekannten l5M-Mikroskopie verwendet werden, neben einem hohen Maß an Expertise viel Zeit.
Ein grundsätzlich bekanntes Hilfsmittel zur Justierung eines optischen Systems ist es, definierte Lichtstrahlen im sichtbaren Bereich einzukoppeln, um mit dem sichtbaren Strahlengang der Lichtstrahlen den Justierzustand des optischen Systems zu visualisieren.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Justierung eines Mikroskops nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 15 aufzuzeigen, mit denen die Justierung unter Verwendung von Hilfsstrahlen noch weiter vereinfacht und auch automatisiert werden kann.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 15 gelöst. Bevorzugte Ausführungsbeispiele des neuen Verfahrens und der neuen Vorrichtung sind in den Unteransprüchen definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren werden sich von den Messstrahlen unterscheidende Hilfsstrahlen in die Objektive gerichtet und die aus dem Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen zu einem Interferenzmuster überlagert. Dabei bedeutet das Wiederaustreten der Hilfsstrahlen aus den Objektiven, dass diese rückwärtig, d.h. an der Einkoppelseite der Hilfsstrahlen in die Objektive, wieder aus den Objektiven heraus treten. Das Interferenzmuster, zu dem die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen überlagert werden, ist also kein solches, das sich in dem Objektraum des Mikroskops ausbildet. Vielmehr handelt es sich um ein Interferenzmuster, das außerhalb des Objektraums und von dort aus betrachtet jenseits der Objektive erzeugt wird. Ein solches Interferenzmuster ermöglicht je nach Ausrichtung der Hilfsstrahlen Aussagen über unterschiedliche Aspekte der Justierung des jeweiligen Mikroskops. Die Unterscheidbarkeit der Hilfsstrahlen von den Messstrahlen lässt es dabei zu, die die Hilfsstrahlen auch anders als die Messstrahlen auszurichten bzw. zu fokussieren. Weiterhin ist eine Trennbarkeit der Hilfsstrahlen von den Messstrahlen möglich, so dass das neue Verfahren auch während des Messens einer Probe mit den Messstrahlen durchgeführt werden kann. Die Unterscheidbarkeit der Messstrahlen von den Hilfsstrahlen kann in jederlei Hinsicht gegeben sein. Beispielsweise können sie unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, zu unterschiedlichen Zeitpunkten auftreten oder auch nur unterschiedlich ausgerichtet bzw. fokussiert sein.
Wenn die Hilfsstrahlen durch die Objektive in deren Brennpunkten fokussiert werden und die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen in einer gemeinsamen Abbildung der Pupillen der Objektive zu dem Interferenzmuster überlagert werden, so erscheinen in dem Interferenzmuster Interferenzstreifen, die höchstempfindlich laterale Dejustierungen der optischen Achsen der Objektive von wenigen Prozent des Durchmessers der beugungsbegrenzt fokussierten Hilfsstrahlen anzeigen. Des weiteren weisen Krümmungen der Interferenzstreifen auf Aberrationen hin, wie sie beispielsweise durch eine Probe eingeführt werden können.
Zur Vorjustierung der Objektive in lateraler Richtung können die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen, die in die Brennpunkte der Objektive fokussiert sind, zusätzlich als Spots in einer gemeinsamen Abbildung der Brennebenen der Objektive abgebildet werden. Bei dieser Abbildung müssen die Spots für die Grundjustierung in Überdeckung gebracht werden. Die Feinjustierung kann anschließend unter Zuhilfenahme des
Interferenzmusters erfolgen, zu dem die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen in der gemeinsamen Abbildung der Pupillen der Objektive überlagert werden.
In einer weiteren Ergänzung kann mit denselben Hilfsstrahlen auch die axiale Justierung erfasst werden, indem die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen zusätzlich in einer gemeinsamen Abbildung der Brennebene der Objektive auf mindestens einen konfokalen Detektor abgebildet werden. Wenn die die Konfokalität bewirkende Lochblende in einer konjugierten Ebene zu der gewünschten gemeinsamen Brennebene der Objektive angeordnet ist, erfasst der Detektor nur solche Lichtintensitäten, die aus eben diesem axialen Bereich stammen. So ist mit dem konfokalen Detektor festzustellen, welche Lichtintensität der Hilfslichtstrahlen aus dem Bereich der Brennebene zurückkommt, um die herum auch die Hilfslichtstrahlen ein Interferenzmuster ausbilden. Ein auch von der Richtung des axialen Versatzes abhängiges Signal wird erhalten, wenn mit zwei konfokalen Detektoren gearbeitet wird, die unterschiedliche parallele Ebenen, beispielsweise vor und hinter der gemeinsamen Brennebene der Objektive erfassen, oder wenn eine axiale Modulation der Lage des konfokalen Detektors oder der auf ihn erfolgenden Abbildung vorgenommen wird, mit der der dem Detektor konjugierte Punkt einen definierten Bereich abscannt.
Bei dem neuen Verfahren können die Hilfsstrahlen auch in die Pupillen der Objektive fokussiert werden und die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen in einer gemeinsamen Abbildung der Brennebenen der Objektive zu dem Interferenzmuster überlagert werden. Das Interferenzmuster gibt dann Auskunft über die Einstellung der Phasenebenen der in dem Objektraum überlagerten Strahlen.
Für die Grobeinstellung der Phasenebenen können die aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen zusätzlich als Spots in einer gemeinsamen Abbildung der Pupillen der Objektive abgebildet werden. Auch hier sind die Spots im ersten Schritt miteinander zur Deckung zu bringen.
Wenn bei dem neuen Verfahren Spots abgebildet werden, können nicht nur Lageunterschiede der Spots sondern auch auftretende Unscharfen der einzelnen Spots beobachtet und beseitigt werden. Auch hiermit ist ein Mittel zur vereinfachten Justierung eines Mikroskops an die Hand gegeben.
Wenn Messstrahlen von Kurzpulslasern zur Interferenz im Objektraum gebracht werden sollen, oder gar die Interferenz von Fluoreszenz gefordert wird, wie im Falls von 4Pi Typ C- Abbildungen, dann ist ein auf wenige Mikrometer genauer absoluter Weglängenabgleich der Messstrahlen notwendig. Hierzu kann ein Spiegelobjekt an der Stelle der späteren Probe in dem Objektraum angeordnet werden, das alle Lichtstrahlen, die zu dem Objektraum hin aus einem der Objektive austreten, in genau entgegengesetzter Richtung wieder in dasselbe Objektiv zurück reflektiert. Wenn dann ein spektral breitbandiger Hilfslichtstrahl mit einer Kohärenzlänge von nur einigen μm, insbesondere von weniger als 25 μm, in die beiden Hilfsstrahlen aufgeteilt wird, die in die Objektive gerichtet werden, und das Interferenzmuster der aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen spektral analysiert wird, bildet sich das angestrebte Interferenzmuster nur bei Übereinstimmung der Weglängen der Hilfsstrahlen und damit auch der optischen Weglängen der Messstrahlen in dem Mikroskop innerhalb der Kohärenzlänge des Hilfslichtstrahls aus. Zusätzlich resultiert die spektrale Breitbandigkeit des Hilfslichtstrahls in spektrale Aufspaltungen innerhalb des Interferenzmusters, soweit Dispersionsdifferenzen der interferierenden optischen Strahlengänge vorhanden sind. Auf dieser Basis kann ein Dispersionsabgleich, beispielsweise durch Glaskeile, durchgeführt werden. So können, beispielsweise für eine 4Pi Typ C- Abbildung Beleuchtungs- und Detektionsstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge auf eine bestimmte Phasenlage eingestellt werden.
Die gemeinsamen Abbildungen, die bei den verschiedenen Ausführungsformen des neuen Verfahrens erzeugt werden, können vergrößert visualisiert werden, um eine optische Darstellung des Justierzustands zu erhalten, die bei der manuellen Justierung des Mikroskops unterstützt. Die gemeinsamen Abbildungen können aber auch durch Bildverarbeitung automatisch analysiert werden. Hierzu können die Abbildungen auf Bildsensoren, beispielsweise CCD-Sensoren, erfolgen.
Einige der Interferenzmuster, die bei dem neuen Verfahren aus den aus den Objektiven wieder austretenden Hilfsstrahlen erzeugt werden, können aber auch durch einfache Vierquadrantendioden erfasst werden, da im optimal justierten Zustand das Mikroskop gar keine Interferenzstreifen vorliegen, und beim Verlassen dieses Justierzustands sich erste Interferenzstreifen im Randbereich der Interferenzmuster zeigen. Zum Erfassen des Auftretens und der Lage dieser Interferenzstreifen reicht eine Vierquadrantendiode aus.
Um das Vorzeichen einer Verschiebung innerhalb des Mikroskops zu ermitteln, die zu einem Verlust der Justierung führt, kann mindestens einer der Hilfsstrahlen bezüglich seiner Lage axial oder lateral moduliert werden. Aus dem Vorzeichen der Modulation ist dann das Vorzeigen der beobachteten Änderung des Justierzustands ermittelbar.
Jedwede Modulation der Hilfsstrahlen wird vorzugsweise mit eine Scanner des Mikroskops synchronisiert, um jedwede Effekte aufgrund einer asynchronen Überlagerung der Modulationen auszuschließen.
Bei einem erfindungsgemäßen Mikroskop werden die mehreren Messstrahlen von einem Strahlteiler aus einem Lichtstrahl erzeugt. Dieser Strahlteiler teilt auch einen Hilfslichtstrahl in die Hilfsstrahlen auf und führt die Hilfsstrahlen nach ihrem Wiederaustreten aus den Objektiven wieder zusammen. Dabei entsteht das gewünschte Interferenzmuster. Es versteht sich, dass die Hilfslichtquelle eine gewisse Kohärenzlänge aufweisen muss. Für alle Ausführungsformen der Erfindung bis auf den Weglängen- und Dispersionsabgleich ist dabei eine monochromatische Lichtquelle, beispielsweise ein Laser, bevorzugt.
Zur spektralen Analyse eines Interferenzmusters, das mit Hilfe einer spektral breitbandigen Lichtquelle kurzer Kohärenzlänge erzeugt wird, ist vorzugsweise ein Spektrometer vorgesehen, das in seinem Spektralbereich auf die Lichtquelle abgestimmt ist.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des neuen Mikroskops gehen bereits aus der vorstehenden Beschreibung des neuen Verfahrens hervor, oder sie sind der nachstehenden Figurenbeschreibung zu entnehmen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von in den Figuren dargestellten bevorzugten Ausführungsbeispielen weiter erläutert und beschrieben.
Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines 4Pi-Mikroskops.
Fig. 2 zeigt eine Überwachungseinrichtung zur Verwendung mit dem in Fig. 1 skizzierten 4Pi-Mikroskop und zur Ausführung einer ersten Ausführungsform des neuen Verfahrens.
Fig. 3 zeigt ein bei der Überwachungseinrichtung gemäß Fig. 2 angezeigtes Bild zu Beginn einer Justierung des 4Pi-Mikroskop,
Fig. 4 ein Fig. 3 entsprechendes Bild während der Justierung des 4Pi-Mikroskops.
Fig. 5 ein den Fig. 3 und 4 entsprechendes Bild nach der Justierung des 4Pi- Mikroskops.
Fig. 6 zeigt eine Variante der Überwachungseinrichtung gemäß Fig. 2 zur Überwachung der lateralen Strahllage bei dem 4Pi-Mikroskop.
Fig. 7 zeigt eine Überwachungseinrichtung zur Überwachung der axialen Strahllage, die in Ergänzung zu der Überwachungseinrichtung gemäß Fig. 2 vorgesehen sein kann.
Fig. 8 zeigt eine weitere Überwachungseinrichtung zur Verwendung mit dem 4Pi- Mikroskop gemäß Fig. 1 und zur Ausführung einer weiteren Ausführungsform des neuen Verfahrens.
Fig. 9 zeigt eine weitere Überwachungseinrichtung zur Verwendung in Verbindung mit dem 4Pi-Mikroskop gemäß Fig. 1 und zur Ausführung einer weiteren Ausführungsform des neuen Verfahrens,
Fig. 10 zeigt eine Ausführungsform einer Überwachungseinrichtung für das 4Pi- Mikroskop gemäß Fig. 1 , die die Überwachungseinrichtung gemäß den Fig. 2, 6, 7, 8 und 9 zusammenfasst, und
Fig. 11 ist eine Legende zu den zeichnerischen Symbolen, mit denen optische Elemente in den Fig. 1 und 2 sowie 6 bis 10 dargestellt sind.
FIGURENBESCHREIBUNG
Fig. 1 skizziert den Aufbau eines 4 Pi-Mikroskops als Beispiel für ein Mikroskop 1 mit zwei Objektiven 2 und 3. Die Objektive 2 und 3 überlagern zwei Messstrahlen 5 und 6 in einem Objektraum 4, um ein Interferenzmuster um die gemeinsame Brennebene 7 der Objektive 2 und 3 herum zu erzeugen. Dabei kann im Zentrum des Interferenzmusters, dort wo es durch die Brennebene 7 geschnitten wird, ein Intensitätsminimum oder Intensitätsmaximum vorliegen. Durch die Lichtintensitäten in dem Interferenzmuster wird eine Probe 8, die im Bereich der Brennebene 7 angeordnet ist, in einem räumlich eng begrenzten Bereich optisch an- oder abgeregt. Die Objektive 2 und 3 dienen gleichzeitig zur Beobachtung der Probe 8 in Rückwärtsrichtung zu den Messstrahlen 5 und 6. Die Messstrahlen 5 und 6 werden aus einem kohärenten Lichtstrahl 9 mit Hilfe eines Strahlteilers 10 erzeugt und mit Hilfe von Spiegeln 11 und 12 in die Objektive 2 und 3 gerichtet. Die Anordnung der Bestandteile des Mikroskops 1 weist eine Vielzahl von Variablen auf, die auf bestimmte Werte eingestellt sein müssen, um die ordnungsgemäße Funktion des Mikroskops 1 zu gewährleisten. Geht man von einer festen Lage des Objektivs 2 und des ihm zugeordneten Spiegels 11 aus, so ist relativ hierzu die Lage der Probe in x, y und z-Richtung variabel. Weiterhin ist die x, y und z- Richtung des Objektivs 3, die Dispersion des Messstrahls 6 gegenüber dem Messstrahl 5, die mit einer Dispersionsabgleichvorrichtung 13 veränderbar ist, und die Phase des Messstrahls 6 relativ zu dem Messstrahl 5, die in allen drei Raumrichtungen mit Hilfe eines Spiegels 12 veränderbar ist, variabel. In der Praxis tritt auch eine Korrelation vieler dieser Variablen auf, so dass die Justierung des Mikroskops 1 hochkomplex ist. Sie geht überdies bei jedem Probenwechsel in großen Teilen verloren. Dies führt dazu, dass auch hochqualifizierte Fachkräfte nur wenige Proben innerhalb eines bestimmten Zeitraums messen können. Um die Justierung des Mikroskops 1 zu vereinfachen und sogar automatisierbar zu machen, ist hier erfindungsgemäß eine Überwachungseinrichtung 14 für den Justierzustand des Mikroskops 1 vorgesehen. Die Überwachungseinrichtung 14 gibt einen Hilfslichtstrahl 15 ab, der sich von dem Lichtstrahl 9 unterscheidet, welcher von einer Messeinrichtung 16 kommt. Der Hilfslichtstrahl 15 wird von demselben Strahlteiler 10, der den Lichtstrahl 9 in die Messstrahlen 5 und 6 aufteilt, in Hilfsstrahlen 17 und 18 aufgeteilt. Die Hilfsstrahlen 17 und 18 legen dieselben Wege in dem Mikroskop 1 zurück wie die Messstrahlen 5 und 6. Nach dem Durchlaufen der Objektive 2 und 3 kehren sie zu dem Strahlteiler 10 zurück, werden von diesem zusammengeführt und treten wieder in die Überwachungseinrichtung 14 ein. Aufgrund ihrer Natur sind sie von dem Licht unterscheidbar, das von der Messeinrichtung 16 in Folge des Lichtstrahls 9 von der Probe 8
empfangen wird. Die Unterscheidbarkeit kann durch unterschiedliche Wellenlängen aber auch unterschiedliche Zeitpunkte der Lichtstrahlen 9 und 15 gegeben sein. Typischerweise ist der Lichtstrahl 9 ein gepulster Laserstrahl hoher Leistungsdichte, während der Hilfslichtstrahl 15 ein kontinuierlicher Lichtstrahl geringer Leistungsdichte ist. In den 5 folgenden Figuren werden verschiedene Details der Überwachungseinrichtung 14 beschrieben. Die Überwachungseinrichtung 14 steuert in Abhängigkeit von dem ermittelten Justierzustand des Mikroskops 1 hier nicht dargestellte Aktuatoren an, die die Variablen der Anordnung des Mikroskops 1 mit dem Ziel einer vollständigen Justierung des Mikroskops 1 verändern. Ein anderer Eingriff in die Funktion des Mikroskops 1 , d.h. eine Störung dessen 10 Funktion ist nicht gegeben. Die Verbindungslinie 19 zwischen der Überwachungseinrichtung 14 und der Messeinrichtung 16 skizziert, dass Modulationen innerhalb der Überwachungseinrichtung 14, die sich auf den Hilfslichtstrahl 15 oder einen seiner Anteile, d.h. die Hilfsstrahlen 17, 18, auswirken, synchron zu Modulationen innerhalb oder zugunsten der Messeinrichtung 16 erfolgen, um unerwünschte Interferenzen dieser Modulationen zu
•,5 vermeiden.
Fig. 2 zeigt eine erste Ausführungsform der Überwachungseinrichtung 14 gemäß Fig. 1. Dabei ist das Mikroskop 1 nur schematisch als Kasten wiedergegeben. In das Mikroskop 1 wird der von einem Laser 20 kommende Hilfslichtstrahl 15 eingekoppelt. Der Hilfslichtstrahl 15 wird zuvor mit einer oder mehreren Linsen 21 auf eine Lochblende 22 fokussiert, um eine 20 Punktlichtquelle 24 auszubilden. Anschließend wird der Hilfslichtstrahl 15 mit einer oder mehreren Linsen 24 so geformt, dass er von den Objektiven 2 und 3 gemäß Fig. 1 in deren Brennpunkten in der Brennebene 7 gemäß Fig. 1 fokussiert wird. Eingekoppelt in das Mikroskop 1 wird der Hilfslichtstrahl 15 über zwei Strahlteiler 25 und 26. Der Strahlteiler 25 könnte auch ein Spiegel sein. Die Überwachungseinrichtung 14 gemäß Fig. 2 ist aber als
£5 Teil einer komplexeren Überwachungseinrichtung vorgesehen, in der der Strahlteiler 25 erforderlich ist. Vorzugsweise werden Strahlteiler mit einer Dicke verwendet, bei der parasitäre Reflexe außerhalb des Nutzungsstrahldurchmessers zu liegen kommen. Durch die Dicke eventuell auftretende astigmatische Fehler können gegebenenfalls durch zusätzliche Kompensationsplatten minimiert werden. Aus dem Mikroskop 1 kehren die
30 Hilfsstrahlen 17 und 18, die von dem Strahlteiler 10 gemäß Fig. 1 wieder zusammengeführt wurden, in die Überwachungseinrichtung 14 gemäß Fig. 2 zurück. Sie werden hinter dem Strahlteiler 26 über einen Spiegel 27 und eine oder mehrere Linsen 28 auf einen Bildsensor 29 als vergrößerte Darstellung der Brennebenen der Objektive 2 und 3 gemäß Fig. 1
abgebildet. Hieraus resultieren in dem Bild 30 des Bildsensors 29 zwei Spots 31 , 32, die den beiden Hilfsstrahlen 17, 18 zugeordnet sind. Wenn die Brennpunkte der beiden Objektive 2 und 3 zur Deckung gebracht sind, was für die Ausbildung des gewünschten Interferenzmusters aus den Messstrahlen 5 und 6 erforderlich ist, überdecken sich auch die Spots 31 und 32. Durch eine Scharfstellung der Spots 31 und 32 wird eine axiale Justierung der Brennebenen der Objektive 2 und 3 zueinander bewirkt. Weiterhin werden Anteile der beiden Hilfsstrahlen 17, 18 über zwei Strahlteiler 33 und 34 sowie Spiegel 35 und 36 abgezweigt und mit dem verbliebenen Anteilen wieder zusammengeführt. Die abgezweigten Anteile der beiden Hilfsstrahlen 17, 18 werden mit Hilfe einer oder mehrerer Linsen 37 in einer Abbildung der Pupillen der Objektive 2 und 3 gemäß Fig. 1 auf den Bildsensor 29 überlagert. Hieraus resultiert in dem Bild 30 ein Interferenzmuster 38. Die Interferenzstreifen 39 des Interferenzmusters 38 zeigen höchst empfindlich laterale DeJustierungen der Brennpunkte der beiden Objektive 2 und 3 bereits im Bereich weniger Prozent des Brennpunktdurchmessers an. Des weiteren können an Krümmungen der Interferenzstreifen Aberrationen, die etwa durch die Probe 8 gemäß Fig. 1 eingeführt werden, sofort erkannt werden. Ein optimaler Justierzustand ist erreicht, wenn die Interferenzstreifen 39 verschwinden. Die Auswertung des Bilds 30 und die hieraus gefolgerte Justierung des Mikroskops 1 kann durch Bildverarbeitung mit Hilfe eines Rechners 40 erfolgen. Im Folgenden wird ein Beispiel für eine solche Justierung aufgrund des Bilds 30 für verschiedene Justierzustände erläutert werden.
Fig. 3 zeigt das Bild 30 gemäß Fig. 2, welches bei einem realen Justiervorgang am Anfang der Justierung aufgenommen wurde. Die Spots 31 und 32 liegen nebeneinander. Sie sind aber bereits scharf gestellt. Das Interferenzmuster 38 zeigt eine Vielzahl von Interferenzstreifen 39. Bei noch gröberer Dejustierung sind die Spots 31 und 32 immer noch zu sehen. Sie weisen einen noch größeren Abstand auf. Die Interferenzstreifen 39 des Interferenzmusters 38 sind dann aber so schmal, dass sie nicht mehr aufgelöst werden.
Das Bild 30 gemäß Fig. 4 wurde nach Verbesserung der Justierung gegenüber Fig. 3 aufgenommen. Die Spots 31 und 32 beginnen sich zu überlappen. Die Streifen 39 des Interferenzmusters 38 werden weniger und gröber. Bei fast perfekter Justierung ist nur noch am Rand des Interferenzmusters 38 ein dunkler Streifen zu sehen. Hierauf wird im Zusammenhang mit Fig. 6 noch näher eingegangen werden.
Fig. 5 zeigt das Bild 30 nach erfolgter Justierung. Die Spots 31 und 32 liegen übereinander. In dem Interferenzmuster 38 sind keine Interferenzstreifen mehr zu erkennen. Die dort noch zu findende Struktur 41 geht auf parasitäre Reflexe in den Optiken zurück.
Da ein Verlassen des Zustands der perfekten Justierung damit einhergeht, dass am Rand des streifenlosen Interferenzmusters 38 gemäß Fig. 5 ein erster dunkler Streifen auftritt, kann der Zustand der optimalen Justierung mit einer Vierquadrantendiode 42 überwacht werden, was in Fig. 6 skizziert ist. Auf die Vierquadrantendiode 42 wird mit einer oder mehreren Linsen 43 ein über einen Strahlteiler 44 ausgekoppelter Anteil der Hilfsstrahlen 17, 18 in einer dem Interferenzmuster 38 entsprechender Weise auf die Vierquadrantendiode 42 abgebildet. Die Vierquadratendiode 42 erfasst die bereits bei einer geringen Dejustierung beginnende Verdunklung im Randbereich des Interferenzmusters 38 gemäß Fig. 5. Die Vierquadrantendiode 42 erfasst dabei auch die Richtung, aus der die Verdunklung des Interferenzmusters 38 gemäß Fig. 5 hineinläuft. Durch die Symmetrie der Anordnung des Mikroskops 1 entsteht damit aber noch kein zur stabilisierenden Regelung der Strahlengänge des Mikroskops 1 geeignetes Signal. Ein solches Signal kann jedoch leicht erhalten werden, indem zumindest einer der Hilfsstrahlen lateral geringfügig moduliert wird. Dadurch wird auch das Signal der Vierquadrantendiode 42 moduliert. In der Folge kann durch synchrone Demodulation das sonst nicht vorhandene Vorzeichen einer Dejustierung gewonnen werden. Dabei genügt eine Modulation von nur wenigen Prozent des Fokusdurchmessers der Objektive 2 und 3 völlig aus. Zur Vermeidung von Bildstörungen wird jede Modulation für die Überwachungseinrichtung 14 mit Modulationen eines Scanners der Messeinrichtung 16 gemäß Fig. 1 synchronisiert.
Fig. 7 gibt den Aufbau einer Zusatzeinrichtung 45 wieder, mit der ein Signal für eine axiale Stabilisierung der Strahlengänge des Mikroskops 1 gewonnen wird. Hierzu wird ein Anteil der aus dem Mikroskop 1 zurücklaufenden Hilfsstrahlen 17, 18 mit einem Strahlteiler 46 zwischen der Punktlichtquelle 23 und der Linse 24 ausgekoppelt und mit Hilfe eines weiteren Strahlteilers 47 auf zwei konfokale Detektoren 48 und 49 projiziert, die jeweils neben einem Lichtsensor 50 eine Lochblende 51 aufweisen. Die zu den Lochblenden 51 der konfokalen Detektoren 48 und 49 konjugierten Punkte im Objektraum 4 gemäß Fig. 1 liegen axial jeweils etwas hinter und vor der idealen Fokusposition. Im Idealfall vollständiger Justierung des Mikroskops 1 sollten beide konfokalen Detektoren 48 und 49 ein Signal gleicher Größe ausgeben. Eine auftretende Differenz der Signale kann direkt als Regelsignal verwendet
werden, um den axialen Abstand der Objektive zueinander, beispielsweise durch einen PID- Regler einzustellen und konstant zu halten. Das Vorzeichen der Differenz der Signale von den konfokalen Detektoren 48 und 49 gibt dabei die Richtung der vorzunehmenden Korrektur an. Mit der Linse 24 können Farblängsfehler der Objektive ausgeglichen werden, indem die Linse 24 axial verschoben wird. Es ist klarzustellen, dass die Anordnung gemäß Fig. 7 nicht zur Fokussierung eines Objektivs auf eine Objekt verwendet wird. Es handelt sich damit nicht um die in der Literatur bekannte klassische Autofokusanordnung. Anstelle des Differenzsignals von zwei konfokalen Detektoren 48 und 49 kann auch ein fokussierendes Element, wie beispielsweise die Linse 24 axial moduliert werden und ein Regelsignal aus dem dadurch modulierten Detektionssignal nur eines konfokalen Detektors gewonnen werden. Vorteilhafterweise erfolgt die Modulation wieder synchronisiert mit der Messeinrichtung 16 gemäß Fig. 1.
Fig. 8 zeigt eine weitere Ausführungsform der Überwachungsvorrichtung 14. Der Aufbau dieser Überwachungsvorrichtung ist dadurch etwas verkompliziert, dass die Überwachungsvorrichtung 14 gemäß Fig. 8 zur Kombination mit der Überwachungsvorrichtung 14 gemäß Fig. 2 unter Verwendung eines gemeinsamen Bildsensors 29 vorgesehen ist. D.h., es soll nur ein einziges Bild 30 aufgenommen werden, in dem verschiedene Abbildungen nebeneinander liegen. Entsprechend müssen die Strahlengänge der Überwachungsvorrichtungen 14 gemäß den Fig. 2 und 8 vor dem Bildsensor 29 zusammengeführt werden.
Konkret dient die Überwachungsvorrichtung 14 gemäß Fig. 8 zur Einstellung der Phasenebene der von dem Mikroskop 1 im Objektraum miteinander überlagerten Messstrahlen. Hierzu wird ein Anteil des Hilfslichtstrahls 15 hinter dem Strahlteiler 26 mit einer Lambda/2-Platte 52 so polarisiert, dass er nach Umlenkung durch einen Spiegel 53 und einen Strahlteiler 54 von einem Polarisationsstrahlteiler 55 durch den Strahlteiler 26 in das Mikroskop 1 gerichtet wird. Dabei sind eine oder mehrere Linsen 56 so im Strahlengang angeordnet, dass die Hilfsstrahlen 17, 18 in dem Mikroskop 1 in den Pupillen der Objektive 2 und 3 gemäß Fig. 1 fokussiert werden. Die entsprechenden zurücklaufenden Anteile der Hilfsstrahlen 17, 18 werden nach dem Strahlteiler 26 durch den Polarisationsstrahlteiler 55 selektiv ausgelenkt und gelangen durch die Linse 56 und den Strahlteiler 54 auf einen weiteren Strahlteiler 57. Der Strahlteiler 57 teilt die Teilstrahlen 17, 18 in solche Anteile auf, die für eine Abbildung der Pupillen der Objektive 2 und 3 gemäß Fig. 1 ausgelenkt werden,
und solche, die für eine Abbildung der gemeinsamen Brennebene 7 der Objektive 2 und 3 gemäß Fig. 1 durchlaufen. Die durchlaufenden Anteile werden durch einen Strahlteiler 58 weiter aufgespalten. Die hier durchlaufenden Anteile werden in einer Abbildung der Brennebene der Objektive 2 und 3 mit einer oder mehreren Linsen 59 auf eine Vierquadrantendiode 60 abgebildet. Die von dem Strahlteiler 58 ausgelenkten Anteile der Hilfsstrahlen 17, 18 werden mit einer oder mehreren Linsen 61 ebenfalls in einer Abbildung der Brennebenen der Objektive 2 und 3 auf den Bildsensor 29 abgebildet. Dabei werden sie von einem Polarisationsstrahlteiler 62 umgelenkt. Aus dieser Abbildung resultiert ein Interferenzmuster 63 mit Interferenzstreifen 64, das die Feinjustierung der Pupillen der Objektive zueinander ermöglicht, wobei die Interferenzstreifen 64 größer werden und letztlich ganz verschwinden. Die Überwachung der so erreichten Justierung erfolgt mit Hilfe der Vierquadrantendiode 60. Die Vorgehensweise entspricht dabei im Prinzip der anhand der Fig. 2 bis 6 erläuterten lateralen Strahlstabilisierung. Für die Grobeinstellung der Pupillen werden die von dem Strahlteiler 57 ausgelenkten Anteile der Hilfsstrahlen 17, 18 mit einer oder mehrerer Linsen 65 und der Linse 37 in einer Pupillenabbildung auf dem Bildsensor 29 abgebildet. Dabei erfolgen Umlenkungen an einem Polarisationsstrahlteiler 67, dem Spiegel 36 und dem Strahlteiler 34. Diese Abbildung ergibt in dem Bild 30 zwei Spots 68 und 69, die zunächst scharf zu stellen und zur Überdeckung zu bringen sind. Die entsprechende Justierung des Mikroskops 1 kann von einem Bediener des Mikroskops 1 wieder augrund einer Visualisierung des Bilds 30 erfolgen, oder der Rechner 40 nimmt die entsprechenden Einstellungen des Mikroskops 1 automatisch aufgrund einer Bildverarbeitung des Bilds 30 und des Signals der Vierquadrantendiode 60 vor.
Fig. 9 skizziert eine weitere mögliche Ausführungsform der Überwachungseinrichtung 14, zu deren Verwendung ein Spiegelobjekt mit zwei parallel zu der Brennebene 7 verlaufenden Spiegelflächen an der Stelle der Probe 8 in dem Objektraum 4 gemäß Fig. 1 anzuordnen ist. In der Überwachungseinrichtung 14 dient eine Leuchtdiode 70 als Lichtquelle für einen spektral breitbandigen Hilfslichtstrahl 71 mit kurzer Kohärenzlänge von nur wenigen Mikrometern. Konkret kann die Leuchtdiode 70 weißes Licht abstrahlen. Der Hilfslichtstrahl 71 wird durch den Strahlteiler 26 in das Mikroskop 1 eingekoppelt und die von dort zurückkehrenden und wieder überlagerten Hilfsstrahlen 72, 73 werden über den Strahlteiler 26 und einem weiteren Strahlteiler 74 auf ein Spektrometer 75 projiziert. Hier bildet sich ein Interferenzmuster der Hilfsstrahlen 72, 73 nur dann aus, wenn die optischen Weglängen der beiden Hilfsstrahlen 72 und 73 von dem Strahlteiler 10 gemäß Fig. 1 bis zu dem
Spiegelobjekt und wieder zurück innerhalb der Kohärenzlänge der Leuchtdiode 70 gleich lang sind. Darüber hinaus zeigt die Wellenlängenabhängigkeit des Interferenzmusters Dispersionsdifferenzen an. So kann aufgrund des Signals des Spektrometers 75 ein Dispersionsabgleich vorgenommen werden.
Fig. 10 zeigt eine Überwachungseinrichtung 14, in der sämtliche Überwachungseinrichtungen kombiniert sind, welche im Zusammenhang mit den Fig. 2 und 6 bis 9 beschrieben wurden. Die Elemente jedes Teils der Überwachungseinrichtung 14 gemäß Fig. 10 sind mit denselben Bezugszeichen versehen, wie in den vorhergehenden Figuren, so dass eine Zuordnung direkt möglich ist. Als einziges zusätzliches Teil findet sich bei der Überwachungseinrichtung 14 gemäß Fig. 10 ein Filter 76 für die wieder aus dem Mikroskop 1 austretenden Hilfsstrahlen 17, 18. welche unabgelenkt durch den Strahlteiler 26 hindurchtreten. Das Filter 76 ist ein Kerbfilter mit einer auf die Wellenlänge des Lasers 20 begrenzten Transmission. Es sorgt damit dafür, dass weder das Licht von der Leuchtdiode 70 noch das Licht des Messstrahls 9 auf die Vierquadrantendioden 42 und 60 und den Bildsensor 29 fällt. Ebenso könnten im Strahlengang vor den konfokalen Detektoren 48 und 49 entsprechende Filter vorgesehen sein. Die Trennung der Anteile des Hilfslichtstrahls 15 von dem Laser 20 für die Einstellung der Brennebenen einerseits und die Einstellung der Pupillen andererseits erfolgt durch die Polarisation mit Hilfe der Lambda/2-Platte 52 und der Polarisationsstrahlteiler 55, 62 und 67. Die jeweiligen Anteile des Hilfslichtstrahls 15 und der daraus resultierenden Hilfsstrahlen 17, 18 sind senkrecht zueinander polarisiert. Dem Fachmann sind auch noch andere Möglichkeiten der Unterscheidbarkeit der einzelnen Komponenten der Hilfsstrahlen voneinander und insbesondere der Hilfsstrahlen von den Messstrahlen bekannt.
Fig. 11 gibt eine Übersicht über die in den Figuren verwendeten Symbole für bestimmte optische Bauteile.
BEZUGSZEICHENLISTE
Mikroskop 11 Spiegel
Objektiv 12 Spiegel
Objektiv 13 Dispersionsabgleicheinrichtung
Objektraum 14 Überwachungseinrichtung
Messstrahl 15 Hilfslichtstrahl
Messstrahl 16 Messeinrichtung
Brennebene 17 Hilfsstrahl
Probe 18 Hilfsstrahl
Lichtstrahl 19 Verbindung
Strahlteiler 20 Laser
Linse 31 Spot
Lochblende 32 Spot
Punktlichtquelle 33 Strahlteiler
Linse 34 Strahlteiler
Strahlteiler 35 Spiegel
Strahlteiler 36 Spiegel
Spiegel 37 Linse
Linse 38 Interferenzmuster
Bildsensor 39 Interferenzstreifen
Bild 40 Rechner
Struktur 51 Lochblende
Vierquadrantendiode 52 Lambda/2-Platte
Linse 53 Spiegel
Strahlteiler 54 Strahlteiler
Zusatzeinrichtung 55 Polarisationsstrahlteiler
Strahlteiler 56 Linse
Strahlteiler 57 Strahlteiler konfokaler Detektor 58 Strahlteiler konfokaler Detektor 59 Linse
Sensor 60 Vierquadrantendiode
Linse 71 Hilfslichtstrahl
Polarisationsstrahlteiler 72 Hilfsstrahl
Interferenzmuster 73 Hilfsstrahl
Interferenzstreifen 74 Strahlteiler
Linse 75 Spektrometer
- 76 Filter
Polarisationsstrahlteiler 77
Spot 78
Spot 79
Leuchtdiode 80