WO2005004898A1

WO2005004898A1 - セラミド輸送を促進する薬剤、該薬剤を製造する塩基配列、セラミド遊離を促進する活性の測定方法、及びセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法

Info

Publication number: WO2005004898A1
Application number: PCT/JP2004/004455
Authority: WO
Inventors: Kentaro Hanada; Masahiro Nishijima; Keigo Kumagai
Original assignee: Japan Science And Technology Agency; Japan As Represented By National Institute Of Infectious Diseases, Director-General
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2005-01-20
Also published as: EP1652530A1; JP2005035926A; US20080085859A1

Abstract

配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を有効成分として含有するセラミド輸送を促進する薬剤、配列番号３の塩基配列、セラミドを含有する脂質膜とセラミド遊離を促進する薬剤とを混合して得られた混合物を遠心法で分離することにより上清を得、上清に含有されるセラミドを定量するセラミド遊離を促進する活性の測定方法、並びに受容膜とセラミド輸送を促進する薬剤とセラミドを含有する供与膜とを混合して選択的膜凝集剤を添加後、受容膜と供与膜を分離し、受容膜及び供与膜が含有するセラミドを定量するセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法とすることにより、セラミド輸送を促進する薬剤、該薬剤を製造する塩基配列、セラミド遊離を促進する活性の測定方法、及びセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供することができる。

Description

明細書セラミド輸送を促進する薬剤、該藥剤を製造する塩基配列、セラミド遊離を促進する活性の測定方法、及びセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法技術分野

本発明は、セラミド輸送を促進する薬剤、該薬剤を製造する塩基配列、セラミド遊離を促進する活性の測定方法.、及びセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法に関するものである。背景技術

スフインゴ脂質は、真核生物に普遍的に存在する脂質である。スフィンゴ脂質は、細胞増殖分化、炎症反応、及び細胞死といった様々な細胞機能だけでなく、宿主細胞への病原体感染や毒素進入などに重要な役割をはたしている。よって、その代謝や局在に影響を与えるタンパク質や化学物質の発見 ·発明が望まれている。セラミドは、スフインゴ脂質合成の中間体として生合成される分子であり、また、複合スフインゴ脂質の分解によっても生じる分子である。生体内セラミドは、複合脂質合成中間体としての役割だけでなく、細胞増殖や細胞死を制御する役割、および、皮膚組織の保水性維持を司る役割の点から特に注目されている。セラミドは、疎水性が大変高く水に全く溶けず、それ単独では膜間移動速度が極めて遅い。そこで、従来、セラミドを細胞に与える場合、非特許文献 1〜3に記載されるように短いァシル鎖にして親水性を上げた短鎖セラミドを代替利用したり、また、非特許文献 4に記載されるようにエタノール · ドデカン混液に溶かした天然型セラミドを供することが行われてきた。しかしながら、前者の方法では短鎖セラミドが天然型セラミドの機能を不完全にしか模倣しないことが、一方、後者の方法では有機溶媒の毒性が、それぞれ大きな問題となる。これらの問題を解決するには、天然型セラミドの膜間移動を選択的に触媒するような親水性分子の利用によりセラミドを細胞に与える方法が考えられる。しかし、そのような親水性分子は発見 ·発明されていなかった。細胞内では、小胞体で生合成されたセラミドは効率よくゴルジ体へと移動してスフィンゴミエリン（SM)へと変換している。しかし、セラミドの膜間輸送にどのような特異的分子が関わっているかは不明であった。また、最近、一酸化窒素で誘導されるグリオ一マ細胞の細胞死において、細胞内セラミド輸送の阻害が起こることが示されている。よって、セラミド輸送に特異的に関わる生体分子は、例えば、セラミド輸送を促進する生体分子は、細胞の生死を制御する新規な薬剤としても期待されるが、上述したようにセラミド輸送に関わる生体分子は不明のままであつた。

非特許文献 1 van Blitterswijk, W . J . , van der Luit, A.H. , Veldman₃ R. J. , Verhei j, M. and Borst、 (J. Biochem. J. 369， 199-211. , 2003) 非特許文献 2 Hannun, Y.A. and Luberto, C. (Trends Cell Biol . 10, 73-80. , 2000)

非特許文献 3 Math i as, S.， Pena, L.A. and Kolesnick, R. N. (Biochem. J. 335, 465-480. , 1998) 非特許文献 4 Ji， L .， Zhang, G. , Uematsu, S.， Akahori, Y. and Hirabayashi , Y. (FEBS Lett. 358, 211-214. , 1995 ) 従って、本発明の目的は、セラミド輸送を促進する薬剤、該薬剤を製造する塩基配列、セラミド遊離を促進する活性の測定方法、及びセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供することにある。発明の開示

かかる実情において、本発明者らは鋭意検討を行った結果、細胞内セラミド輸送が欠損しているために SM含有量が低下している動物培養細胞突然変異株（以下 LY- A株とも述べる）を分離し、この変異株を用いた解祈から、細胞内セラミド輸送には細胞質タンパク質が必須因子として関わっていることを明らかにし、 SM含有量の低下した細胞を選択的に死滅させる条件を発見し、かかる条件において LY- A株の細胞の機能回復株、すなわち、細胞内セラミド輸送が回復するために SM含有量が回復した機能回復株を選択する方法においてグッドパスチユア抗原結合夕ンパク質 ( Goodpasture antigen-binding protein; 以下 GABPタンノク負と述ぺることがある）の別スプライシング型産物 (以下 GPBPA26夕ンパク質と述べることがある）と本質的な配列が同質な夕ンパク質 (以下 CERT夕ンパク質と述べることがある）が含有されている場合に機能回復株が得られることを知見し、細胞内セラミド輸送の促進に該 CERTタンパク質を有効成分として含有する薬剤が有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明（ 1 ) は、配列番号 1のアミノ酸配列を有する hCERT タンパク質、配列番号 2のアミノ酸配列を有する hCERT_Lタンパク質、配列番号 3のアミノ酸配列を有する cCERTタンパク質、配列番号 4のアミノ酸配列を有する cCERT_Lタンパク質、又はそれらの組換えタンパク質を有効成分として含有するセラミド輸送を促進する薬剤を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（ 1 ) は、セラミド輸送を促進する新規な薬剤を提供することができるという効果を奏する。また、本発明（2) は、制ガン剤、抗炎症剤、器官再生剤、抗感染症剤、又は化粧品用の分配促進剤として用いられる薬剤である前記発明 ( 1) に記載される薬剤を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（2) は、前記発明（ 1) が奏する効果に加えて、新規な制ガン剤、抗炎症剤、器官再生剤、抗感染症剤、又は化粧品用の分配促進剤を提供することができるという効果を奏する。また、本発明（3) はセラミド輸送を阻害する薬剤の検出に用いられる前記（ 1) に記載される薬剤を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（3) は、前記発明（ 1 ) が奏する効果に加えて、新規な薬剤の開発方法を提供することができるという効果を奏する。また、本発明（4) は、配列番号 1または 3のアミノ酸配列の第 37 0残基〜第 59 8残基、あるいは配列番号 2又は 4のアミノ酸配列の第 3 97残基〜第 624残基からなる組換えタンパク質を有効成分とする前記発明（ 1) のセラミド輸送を促進する薬剤を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（4) は、前記発明（ 1 ) が奏する効果に加えて、セラミド輸送を促進する活性が顕著に向上するという効果を奏する。また、本発明（ 5) は、前記発明（ 1) に記載される薬剤を生産するために用いられる配列番号 5， 6 , 7または 8の塩基配列、又はその組換え塩基配列を提供するものである。また、本発明（ 6) は、配列番号 5の塩基配列の第 1 1 08塩基対〜第 1794塩基対、配列番号 6の塩基配列の第 1 1 89塩基対〜第 1 8 72塩基対、配列番号 Ίの塩基配列の第 1 5 39塩基対〜第 2 2 2 5塩基対、又は配列番号 8の塩基配列の第 1 1 89塩基対〜第 1 872塩基対からなる組換え塩基配列であることを特徴とする前記発明（ 5) に記載の塩基配列を提供するものである。また、本発明（7) は、セラミドを含有する脂質膜とセラミド遊離を促進する薬剤とを混合して得られた混合物を保温する保温工程を行い、遠心法で分離することにより保温した後の混合物から上清を得る分離ェ程を行い、次いで、得られた上清に含有されるセラミドを定量する定量工程を行うセラミド遊離を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明 ( 7 ) は、新規なセラミド遊離を促進する活性の測定方法を提供することができるという効果を奏する。また、本発明（ 8) は、前記セラミドを含有する脂質膜が、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合脂質にセラミドを添加して調製されたものである前記発明 ( 7) に記載されるセラミド遊離を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（8) は、前記発明（7) が奏する効果に加えて、セラミド遊離を促進する活性の測定を精度よく行うことができるという効果を奏する。また、本発明（9) は、前記セラミドを含有する脂質膜が、超音波処理されたものである前記発明（7) 又は（8) に記載されるセラミド遊離を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（9) は、前記発明（7) 又は（8) が奏する効果に加えて、セラミド遊離を促進する活性の測定を精度よく行うことができるという効果を奏する。また、本発明（10) は、前記セラミドを含有する脂質膜に添加されるセラミドが、放射性標識されたセラミドである前記発明（8) に記載されるセラミド遊離を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（10) は、前記発明（8) が奏する効果に加えて、定量工程におけるセラミドの定量を簡便に行うことができるという効果を奏する。また、本発明（ 1 1) は、受容膜とセラミド輸送を促進する薬剤とセラミドを含有する供与膜とを混合し、得られた混合物を保温する保温ェ程を行い、保温工程で得られた混合物に選択的膜凝集剤を添加後、遠心法に供して受容膜と供与膜を分離する分離工程を行い、分離した受容膜及び供与膜がそれぞれ含有するセラミドを定量する定量工程を行うセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（ 1 1) は、新規なセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供することができるという効果を奏する。また、本発明（ 12) は、前記受容膜が、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンとの混合脂質で調製されたものである前記発明（ 1 1 ) に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明 ( 1 2) は、前記発明（ 1 1 ) が奏する効果に加えて、セラミドの膜間移動を促進する活性の測定を精度よく行うことができるという効果を奏する。また、本発明（ 13) は、前記セラミドを含有する供与膜が、ホスファチジルコリンと、ホスファチジルエタノールと、ラクトシルセラミドと、セラミドとを含有する混合脂質から調製される前記発明（ 1 1 ) 又は（ 1 2 ) に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（ 1 3) は、前記発明 ( 1 1 ) 又は（ 1 2 ) が奏する効果に加えて、セラミドの膜間移動を促進する活性の測定を精度よく行うことができるという効果を奏する。また、本発明（ 14) は、前記セラミドを含有する供与膜に添加されるセラミドが、放射性標識されたセラミドである前記発明（ 1 1 ) に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明 ( 14) は、前記発明（ 1 1 ) が奏する効果に加えて、定量工程におけるセラミドの定量を簡便に行うことができるという効果を奏する。また、本発明（ 1 5 ) は、前記選択的膜凝集剤がヒマ豆レクチンである前記発明（ 1 1 ) 〜（ 1 4) のいずれか一項に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、本発明（ 1 5 ) は、前記発明（ 1 1 ) 〜（ 1 4) が奏する効果に加えて、分離工程における分離を簡便且つ迅速に行うことができるという効果を奏する。図面の簡単な説明

第 1図は、 CERTタンパク質のドメイン構造及びドメイン欠失構造を示す図である。第 2図は、レトロウイルスベクタ一を用いて hCERTを導入した LY-A2細胞の MCDおよびライセニンに対する感受性を測定した結果を示す図である。第 3図（A) は、 LY-A2/hCERT細胞の MCDおよびライセニンに対する反応性を示す図であり、第 3図 (B) は、 C H 0 - K 1 細胞、 LY-A2細胞、又は LY- A2/hCERT細胞のリン脂質含有量を示す図である。第 4図（A)は、 CHO— K 1細胞、 LY- A2細胞、又は LY- A2/hCERT 細胞における [¹⁴C]セリンによる脂質代謝標識実験の結果を示す図であり、第 4図 (B) は、 C H 0 - K 1細胞、 LY-A2細胞、又は LY- A2/hCERT 細胞における [¹⁴C]コリンを用いた脂質代謝標識実験の結果を示す図である。第 5図は、 C H 0— K 1細胞、 LY- A2細胞、又は LY-A2/hCERT細胞における SM合成酵素活性を示す図である。第 6図は、 CHO— K 1細胞、 LY- A2細胞、又は LY- A2/hCERT細胞における C ₅— D M B— C e rを用いた細胞標識と蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。第 7図は、 C HO-K 1細胞、 LY-A2細胞、又は LY - A2/hCERT細胞における C₈-DMB-Cer の細胞内移動に及ぼすエネルギー阻害剤の影響を求めるために行われた C₅-DMB - C e rを用いた細胞標識と蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。第 8図は、 CHO— K 1細胞、 LY- A2細胞、又は LY- A2/hCERT 細胞における SM新合成に及ぼす（1R， 3R)HPA- 12の影響を調べるために行われた放射性セリンを用いた脂質代謝標識実験の結果を示す図である。第 9図（A) は、 CHO— K 1細胞、 LY-A細胞、又は LY-A/hCERT細胞の MCD感受性を示す図であり、第 9図（B)は、 CHO— K 1細胞、 LY - A2 細胞、又は LY-A/hCERT細胞における [¹⁴C]セリンおよび [¹⁴C]コリンを用いた脂質代謝標識実験の結果を示す図であり、第 9図（C) は、 CHO — K 1細胞、 LY-A2細胞、又は LY-A/hCERT細胞における C₅— DMB— C e rを用いた細胞標識と蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。第 1 0図（A) は、（LY- A2 + FL- hCERT) 細胞、（LY- A2 + FL- hCERT_L) 細胞、 (LY-A2 +空べクタ一）棚胞、 CHO— K 1細胞、及び LY-A2綑胞の MCD 感受性を示す図であり、第 1 0図（B) は、（LY- A2 + FL-hCERT) 細胞、 (LY-A2 + FL-hCERT_L) 細胞、 (LY-A2 +空ベクター) 細胞の抗 FLAG抗体を用いたウエスタンプロット解析の結果を示す図である。第 1 1図は、 CHO-K 1細胞、及び LY-A細胞における CERTタンパク質をコ一ドする mRN Aのノザンブロット解析の結果を示す図である。第 1 2図（A) は、 CHO— K 1細胞、 LY-A2細胞、（LY- A2 + cCERT(G67E)- FL) 細胞及び (LY-A2 + CCERT-FL)細胞の MCD感受性を示す図であり、第 1 2図（B) は、抗 FLAG抗体を用いたウエスタンプロット解析の結果を示す図である。第 1 3図 (A) は、 (CHO-Kl+pEGFP) 細胞、 (CH0-K1+ cCERT-GFP) 細胞、（CHO- K1+ pcCERT(G67E)- GFP) 細胞に発現した GFPまたは GFP融合 CERTとゴルジ体局在マ一カーとの顕微鏡観察による局在解析の結果を示す図であり、第 1 3図（B) は、 CHO- ί(1細胞、（CHO- K1+ pEGFP) 細胞、 (CH0-K1+ pcCERT-GFP) 細胞、 (CH0-K1+ pcCERT(G67E)-GFP) 細胞を用いた抗 GFP抗体を用いたウエスタンプロット解析の結果を示す図である。第 1 4図（A) は、セラミドの遊離を促進する活性の hCERT夕ンパク質量への依存度を示す図であり、第 1 4図（B) は、セラミドの遊離を促進する活性の時間依存性を示す図である。第 1 5図は、セラミド、ジァシルグリセロール、コレステロール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、スフィンゴシンの遊離を促進する活性の測定結果を示す図である。第 1 6図は、 hCERTタンパク質、 hCERT_Lタンパク質、 hCERTAPHタンパク質、 hCERTAMRタンパク質、および hCERTASTタンパク質、並びに PHhCERTタンパク質、 MRhCERTタンパク質および SThCERT タンパク質によるセラミドの遊離活性の測定結果を示す図である。第 1 7図（A ) は、セラミドの膜間移動を促進する活性の hCERTタンパク質量への依存度を示す図であり、第 1 7図（B ) は、セラミドの膜間移動を促進する活性の時間依存性を示す図であり、第 1 7図（C ) は、セラミドの膜間移動を促進する活性の温度依存性を示す図である。第 1 8図は、 hCERTタンパク質、 hCEm タンパク質、 hCERTAPHタンパク質、 hCERTAMRタンパク質、および hCERT厶 STタンパク質、並びに PHhCERT 夕ンパク質， MRhCERT夕ンパク質および SThCERT夕ンパク質によるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の薬剤は、配列番号 1のアミノ酸配列を有する hCEHT夕ンパク質、配列番号 2のアミノ酸配列を有する hCERT_Lタンパク質、配列番号 3 のアミノ酸配列を有する cCERT夕ンパク質、または配列番号 4のァミノ酸配列を有する cCERT 夕ンパク質、又はそれらの組換え夕ンパク質を有効成分するものである。 hCERT夕ンパク質及び cCERT夕ンパク質、並びに hCER タンパク質及び cCERT_Lタンパク質のドメイン構造及びこれらのタンパク質のドメイン欠失構造を図 1に示す。 CERTタンパク質は、図 1に示すように、ァミノ末端約 1 2 0ァミノ酸領域にプレクストリンホモロジ一（PH)ドメインを、カルボキシル末端約 2 3 0アミノ酸領域にステロイドジエック急性制御夕ンパク質関連脂質転移（steroidgenic acute regulatory protein-related lipid transfer; START)ドメインを、それらの中間領域（middle region, MR)のドメインと大きく 3つのドメィンを持っていると考えられている。 CERT夕ンパク質及び以下で述べる CERT_Lタンパク質は、それそれ哺乳動物間で 9 5 %以上もの高いアミノ酸配列同一性を保持しており、それらタンパク質が持つ諸性質は哺乳動物全般で同質と考えられる。よって、ヒトもしくは CH0細胞由来のもので具体的実施例を提示していてもこれらの種に限定されるものではない。ここで、 CERTタンパク質とは、ヒト細胞から得られた hCERTタンパク質及びハムスター細胞から得られた cCERTタンパク質並びにその他の哺乳動物の細胞から得られた類似のタンパク質を示し、 CERT_Lタンパク質とは、ヒト細胞から得られた hCERT_Lタンパク質及びハムス夕一細胞から得られた cCER タンパク質並びにその他の哺乳動物の細胞から得られた類似のタンパク質を示す。ヒト CERT (hCERT)タンパク質は、次のようにして得ることができる。

LY - A株の SM含量を回復させる相補的デォキシリボ核酸（cDNA)を以下の手順に従って単離 ·同定する。ヒト培養細胞由来の c丽 Aライプラリーをレトロウィルスベクターを用いて高頻度かつ安定に LY- A株に導入後、機能回復株を単離する。ここで用いた機能回復株選択法は、 SM含量の減少した細胞がコレステロール引き抜き試薬 , メチルシクロデキス卜リン (MCD )に高感受性になり、 SM含量が回復した細胞が MCDに対する耐性を回復するという知見をもとにして行うことができる。ついで、単離した機能回復株に導入されている cDNAをゲノミック ·ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction; PCR)法によって増幅して回収した。回収した cDNAは二次導入でも LY-A株を野生株レベルの MCD感受性へと変化させるものである。このようにして得られた配列番号 5に記載される cDNAのコードするタンパク質は、ヒト GPBPA26 (hGPBPA26 )として過去に発表されているタンパク質と同一であった。 GPBPA26の細胞内での機能は未解決であった。本明細書に詳述するように、我々は、 GPBPA26の細胞内での機能はセラミド輸送（ceramide traff icking)であることを発見したので、細胞内の機能を表した命名法とするために、 GPBPA26と実質的に同一の配列を有するタンパク質を CERT夕ンパク質と命名した。また、 GPBP と実質的に同一の配列を有するタンパク質を CERT_L( a large spl icing variant of CERT )と命名した。単離 ·同定した cDNAを、例えば、大腸菌、酵母などの細菌、 Sf 9細胞などの昆虫培養細胞、 CH0細胞、 HeLa細胞、 HEK293細胞などの哺乳動物培養細胞などで公知の方法によつて発現させることにより、 CERTタンパク質を得ることができる。無細胞系においてヒト ·コラーゲン 4型のアルファ 3鎖のカルボキシル末端配列に結合して、それをリン酸化するタンパク質として、ヒト GPBP (hGPBP )が報告されている。また、非特許文献 2においては、 hGPBP よりも 26アミノ酸小さい別スプライシング型産物 ' hGPBPA26も存在していることが報告されている。転写 RNAレベルの解析から、 MPBP及び hGPBPA26はともに様々な器官で発現していることが示されているが、 hGPBP厶 26のほうが優勢に発現していることが示されている。しかしながら、 hGPBPA26および hGPBPは細胞質に主に局在しており、この局在は、細胞外分子であるコラーゲンを修飾するという最初に期待された機能とは矛盾している。よって、細胞内でのこれらタンパク質の生理的機能は過去の研究からは解明されていないと考えられるが、本発明者らによって、セラミド輸送を促進する薬剤として有効であることが示された。また、 CERTタンパク質の組換えタンパク質としては、 N末端のァミノ酸を第 1残基として、 START ドメイン、すなわち、配列番号 1又は 3の第 3 7 1残基〜第 5 9 8残基あるいは配列番号 2又は 4の第 3 9 7残基〜第 6 2 4残基を含有する断片を挙げることができ、こ ®ような断片は、 in vitro組換え DNA法、合成法、および in vivo組換え/遺伝子組換えにより得られた DNA断片を発現させて得られた組換えタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質として、 PH ドメインを欠いた CERTAPH タンパク質， MR ドメインを欠いた CERTAMRタンパク質、 START ドメインのみを有する ST CERT夕ンパク質などのドメイン欠失夕ンパク質を例示することができる。なお、 CERTタンパク質の 3 7 0番目のアミノ酸であるリシン残基は、 MR ドメインのカルボキシル末端に相当すると予想される。しかし、カルボキシル末端のリシン残基によってタンパク質が不安定になる可能性があるので、ドメイン欠失タンパク質においては、当該リシン残基を START ドメインのアミノ末端に組み入て、 MR ドメインから除いている。さらに、 hCERTタンパク質とアミノ酸塩基配列が本質的に同一である組換えタンパク質である hGABPA26夕ンパク質は、 Haya₃ Aらの方法（J. Biol . Chem. 275 , 40392-40399, 2000) により得られたプラスミドぺク夕一を用いて、 Raya, Aらの方法（J . Biol . Chem. 274₅ 12642- 12649₃ 1999 )に従って発現を行い、生成物を精製することにより得ることもできる o hCER^タンパク寳と本質的に同等な組換えタンパク質である hGPBPの cDNAの配列は公知の方法によって得ることができる ( GenBank番号： AF136450) 。よって、不足している DNA配列を PCR法によって hCERT配列に付加することで、 hCERT_Lをコードする配列番号 6の DNA配列を得ることができる。そして、得た cDNAから調製したプラスミドベクターを用いて発現を行い、生成物を精製することで hCERT_L夕ンパク質を得ることができる。また、当該 hCERT_Lタンパク質は、 Raya， Aらの方法（J. Biol . Chem. 274, 12642-12649, 1999 )に従って、 cDNAから調製したプラスミドベクターを用いて発現を行い、生成物を精製することにより得ることもできる。さらに、配列番号 Ίの塩基配列に対応する CH0細胞由来の CERT

(cCERT)の全長 cDNA配列は、 cDNAをクロンテヅク社 SMART RACE cDNA増幅キヅトを用いて、 cDNA末端の迅速増幅（rapid ampl ificaton of cDNA ends ; RACE )を行うことで決定することができる。そして、 CH0細胞 cDNA ライブラリ一をテンプレートにした PCRを行うことで、 cCERTの 0RFを得ることができる。また、この PCRによって、配列番号 8の塩基配列に対応する CH0細胞由来の CERT_L( cCERTjをコードする DNA配列を増幅し、クローニングすることもできる。 cCERT_Lのァミノ酸配列は配列番号 4に示している。

本発明の薬剤は、例えば、細胞死を促進または抑制させて、制ガン剤、抗炎症剤、器官再生剤、又は抗感染症剤として用いることができる。また、セラミドの分配促進剤として化粧品において用いることができる。さらに、セラミド輸送タンパク質の阻害剤探索のために利用することもできる。本発明の薬剤は、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により、非経口的に、および経口的に投与し得る。非経口投与のための製薬上許容可能な担体調製物としては、滅菌、あるいは水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばォリーブ油、注射可能有機エステル、例えばェチルォレエートである。閉塞性包帯用の担体は、皮膚透過性を増大し、抗原吸収を増強するために用い得る。経口投与のための液体投薬形態は一般に、液体投薬形態を含有するリボソーム溶液を包含し得る。リポソ一ムを懸濁するための適切な形態としては、当業界で一般に用いられる不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳濁液、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。不活性希釈剤の他に、このような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、風味剤および香料も含有し得る。 , 本発明の薬剤は、アジュバントを含有することも可能である。アジュバントは、特異的免疫応答を非特異的に増大するために用い得る物質である。アジュバントは、それらの粗製に基づいて、大まかにいくつかの群に分けられる。これらの群としては、油アジュバント（例えば、フロイントの完全および不完全アジュパン卜）、無機塩（例えば、 A1K( S0₄)₂、 A1NH₄(S0₄)、シリカ、ミヨウバン、 A1(0H)₃、 Ca₃(P0₄)₂、カオリンおよび炭素）、ポリヌクレオチド（例えばポリ ICおよびポリ AU酸) 、ならびにある種の天然物質（例えば、結核菌 Mycobacterium tuberculosisからのロウ D、ならびに Corynebacterium parvum、百日咳菌 Bordetella pertussisおよびブルセラ族の成員に見出される物質）が挙げられる。発見者らは、セラミドを含む脂質膜を CERTタンパク質とともに保温後、遠心すると、脂質膜に残存するセラミドは沈降し、脂質膜から遊離したセラミドは上清に移行することを見出し、セラミドの遊離を促進する活性を測定する方法を発明した。以下に本発明のセラミド遊離を促進する活性の測定方法について以下に述べる。セラミドを含有する脂質膜としては、特に制限されないが、卵黄由来のホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合脂質、または合成ホスファチジルコリンと合成ホスファチジルエタノールアミンの混合脂質にセラミドを添加して調製したものを例示することができる。このようにして得られたセラミドを含有する脂質膜は、窒素、アルゴンなどの不活性ガスを吹き付けること、または減圧乾燥によって乾固することができる。また、脂質膜又は乾固した脂質膜に NaClおよび EDTAを添加したへぺス- NaOH緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液を添加して浴槽型超音波発生器で超音波処理する方法などによって超音波処理することも可能である。超音波処理条件としては、例えば 2 0〜2 5 °Cで行い、 3〜 6分間の超音波処理を行う条件を挙げることができる。前記混合脂質に添加するセラミドとしては、放射性標識していないものでもよいが、測定の便宜を考えると、放射性標識されているセラミドが好ましく、このようなセラミドとして ¹⁴ C、 ¾、 ¹ N ¹⁵0などによって放射性標識されるセラミドを挙げることができるが、このうち、 ¹⁴ Cによつて放射性標識されたセラミドが、入手のしゃすさや安定性及び³ H標識された別の脂質との二重標識実験が可能になることを考慮すると、好ましい。セラミド遊離を促進する薬剤としては、特に制限されないが、上記した本発明のセラ .ミド輸送を促進する薬剤を例示することができる。保温工程において、セラミドを含有する脂質膜とセラミド遊離を促進する薬剤とを混合する方法としては、特に制限されないが、前記薬剤を、 NaClおよび EDTAを添加したへぺス- NaOH緩衝液、トリス塩酸緩衝液緩衝液などの緩衝液に分散させて前記脂質膜を添加する方法を挙げることができる。また、保温する方法としては、恒温槽、湯浴槽などによって、 1 5〜4 2 °Cで 1 0〜2 5 0分間保温する方法を挙げることができる。分離工程においては、保温した後の混合物を 50，000 x gで 3 0〜6 0 分間遠心分離して上清を得る。定量工程においては、セラミドが放射性標識されている場合においては、上清に含有されるセラミドの放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定することにより上清中に含有されるセラミドを定量することができる。また、上清に含有される脂質を TLCで分離した後、セラミドの放射活性をイメージアナライザーで解析することでも定量することができる。セラミドが放射性標識されていない場合においては、質量分析機器を用いた解析や大腸菌ジァシルグリセロールを用いたセラミド定量法などで測定して上清中に含有されるセラミドを定量することができる ο 本発明のセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法について以下に述べる。セラミドを含有する供与膜としては、特に制限されないが、卵黄由来のホスファチジルコリンとホスファチジルェ夕ノ一ルァミンとブ夕組織由来ラクトシルセラミドの混合脂質、または化学合成したホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールァミンとラクトシルセラミドの混合脂質にセラミドを添加して調製したものを例示することができる。ラクトシルセラミドのかわりにビォチン化ホスファチジルェタノールァミンを利用することも可能である。このようにして得られたセラミドを含有する供与膜は、窒素、アルゴンなどの不活性ガスを吹き付けること、または減圧乾燥によって乾固することができる。また、供与膜又は乾固した供与膜に NaClおよび EDTAを添加したへぺス- NaOH緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液を添加して投げ込み式超音波発生器で超音波処理する方法などによつて超音波処理することも可能である。前記混合脂質に添加するセラミドとしては、上記したセラミド遊離を促進する活性の測定方法と同様のものを挙げることができる。受容膜としては、卵黄由来のホスファチジルコリンとホスファチジルェ夕ノールアミンまたは合成ホスファチジルコリンと合成ホスファチジルエタノールアミンの混合脂質などを用いることができる。受容膜とセラミド輸送を促進する薬剤とセラミドを含有する供与膜との混合方法及び得られた混合物を保温する方法としては、セラミド遊離を促進する活性の測定方法の保温工程と同様に行うことができる。保温工程で得られた混合物に添加する選択的膜凝集剤としては、ヒマ豆レクチンを挙げることができる。ヒマ豆レクチンは、ラクトシルセラミドに含まれるガラクトシル基に結合するため、供与膜とヒマ豆レクチンからなる凝集塊を形成し、低速の遠心分離によって供与膜だけを選択的に沈降させることができる。ラクトシルセラミドのかわりにピオチン化ホスファチジルエタノールアミンを利用する場合は、アビジンゃストレプトアビジンなどのピオチン結合試薬を選択的膜凝集剤として使用することができる。また、保冷は、氷浴、冷蔵庫などを用いて、 0〜4°C で 5〜 1 5分間行うことができる。保冷工程で得られた混合物を分離する分離工程においては、選択的膜凝集剤添加後に冷却した混合物を 12，000 xgで 3〜1 0分間分間遠心分離して上清及び沈降した供与膜を得る。また、得られた供与膜は、 SDS、ォクチルグルコシド、クロ口ホルム等に溶解させて定量工程において用いることができる。定量工程は、セラミド遊離を促進する活性の測定方法と同様に行うことができる。

(実施例）

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。なお、下記実施例において、基本的な分子生物学的操作は特に明示がない限り、「モレキユラ —クロ一ニング（MolecularCloning) 第 2版」 [Sambrook， J. ,Fritsch， E.F.および Maniatis, Τ· 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Press より 1939年に発刊] もしくは「カレントプロトコル 'イン 'モレキユラーノイォ口ジ一 (Current Protocol in Molecular Biology)j [Ausubel, F. Brent, R. , Kingston, R. , Moore, D.， Seidman, J., Smith, J.および Struhl, K.著、 Wiley and Sons社から 1987年から現在に至るまで続刊中]に記載の方法により行うか、または、市販の試薬ゃキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。

<実施例で用いた試料 >

• ヒト 'ヘラ · レトロウィルスライブラリ一（Human HeLa Retroviral library) pLIBベクタ一、 pLIB-EGFP pEGFP-N3および SMART™ RACE cDNA 増幅キヅトは、クロンテック（Clontech)社製のものを用いた。

• pcMA3.1/Hyg( + )、 pcDNA3. l/Neo( + )、リボフヱクタミンプラス

(LipofectAMINE PLUS^TM)試薬、 pcDNA3. 1/V5- His- TOPO(R)ベクタ一、 pCR-Blunt I I-TOPO (登録商標名）ベクター、ス一パースクリプト ' ファ —ストストランド（SuperScript^TMFisrt Strand)合成システム、および合成オリゴヌクレオチドは、インビトロゲン（Invitrogen)社からそれそれ購入したものを用いた。

•二ユートリドーマ（Nutridoma^TM)SP、フ一ジーン（FuGEGE™) 6 トランスフエクシヨン試薬、ハイグマイシン Bおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete^TMEDTA- free)はロシュ · アプライドサイエンス（Roche Applied Science)社から購入したものを用いた。

• LA PCR™キットおよびパイロペスト（登録商標名： Pyrobest) DNAポリメラ一ゼは夕カラ（Takara) 社から購入したものを用いた。

• IIOD-Plus-DNAポリメラ一ゼは東洋紡績社から購入したものを用いた。 - pBlueScript(R) SKI I (pBS)ぺクタ一はストラタジーン（Stratagene)社から、購入したものを用いた。

'プラスミドの小スケール精製には、プロメガ（Promega)社製のウイザ一ドプラス（Wizard PLUS)SVシステムを用いた。

- プラスミドの大スケール精製とゲノム MA精製には、カイァゲン (Qiagen)社の HiSpeedプラスミドキヅトとゲノムチップシステムをそれそれ使用した。 '制限酵素類は、夕カラ社、東洋紡績、またはニューイングランド 'ノ ' ィォラボ（New England Biolabs)社から購入した。

• pET-28a( + )ベクタ一および大腸菌 BL21(DE3)株は、ノバゲン（Novagen) 社から購入した。

'ァレキサフルォロ（登録商標名 AlexaFluor)594ャギ抗マウス免疫グロプリン C；、 6— CN- ( 7—二トロベンゼゾ一 2—ォキサ一 1， 3—ジァゾ一ル一 4—ィル）ァミノ〕カプロイルー D—エリス口一スフインゴシン (6 - CN-(7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol-4-yl)amino)

caproyト d - erythro - sphingosine; C₆- NBD - Cer)および N— (4, 4—ジフルオロー 5， 7—ジメチル一 4—ボラ 3 a, 4 a—ジァザ— s—インダセン一 3—ペンタノィル） — D—エリスロースフインゴシン

(N-(4,4-dif luoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a₅4a-diaza-s-indacene-3-p entanoyl)-d-erythro-sphingosme; C₅-DMB - Cer)はモレキュラー · プローブ（Molecular Probe) 社から購入したものを用いる。

'メチルベー夕シクロデキストリン（methyl-b- cyclodextrin; MCD)、 G418、ポリプレン、抗 FLAG (登録商標名） M2モノクローナル抗体、脂肪酸除去済みゥシ血清アルブミン（B SA)はシグマ社から購入。

■卵黄由来ホスファチジルコリン、卵黄由来ホスファチジルェ夕ノ一ルアミンはァバンティ ■ ポラ一リピド（AvantiPolarLipids)社から購入し 7こ o

•ポリビニリデン · ジフルオリ K( polyvinyl! dene difluoride; PVDF) 膜およびホースラディッシュ ·パ一ォキシダ一ゼ（horseradish

peroxidase; HHP)結合ャギ抗マウス免疫グロプリン Gはバイオラド (Bio-Rad)社から購入した。

· BD Living Colors^TMA.v.モノクローナル抗体はクロンテヅク社から購入し/こ。 • N-パルミトイル- D-ェリス口-スフィンゴシン（C16-セラミド）は、バイオモル · リサ一チ · ラボラトリ一社（BIOMOL Research Laboratories)から購入したものを用いた。

'プ夕組織由来ラクトシルセラミドはマトレーャ（Matreya)社から購入したものを用いた。

- ヒマ豆レクチン（RCA120)はホ一ネン社から購入したものを用いた。 -薄層クロマトグラフィー（TL C)板はメルク社から購入したものを用いた。

• 3― (4， 5—ジメチルー 2—チアゾィル) 一 2， 5—ジフエ二ルー 2 H—テトラゾリゥムプロミド（MT T) は同仁化学研究所から入手したものを用いた。

'マウス抗 G28モノクローナル抗体はストレスゲン（StressGen)社から購入したものを用いた。

• L- [2,3，4，5- ]アルギニン（71 Ci/mmol), L- [ϋ- ¹⁴C]セリン（155 mCi/腿 ol)、 [メチルー¹⁴ C]コリン（55mCi/mmol)、 [la₃2a(n)- ¾]コレステロール（49Ci/mmol)、メガプライム（Megaprime)DNAラベリングキットぉよび増感化学燐光 ( enhanced chemi luminescence; ECL)システムはアマシャム ·バイォサイエンス (Amershani Bioscience) 社から購入したものを用い/! _

· [パルミトイル- 1- ¹⁴C] N-パルミトイル- D-ェリス口-スフインゴシン (55 mCi/mmol)、 [ォレオイル- 1 -¹⁴ C]ジォレオイル -rac-グリセ口一ル (55mCi/mmol)、 [コリンメチル- ¹⁴C]スフィンゴミエリン（55 mCi/mmol)、 [ジパルミトイル- 1- ¹⁴C] L-ひ-ジパルミトイルホスファチジルコリン (55mCi/腿。1)、 [2-パルミトイル- 9 , 1 0 -¾(N)] L- -ジパルミトイルホスファチジルコリン (30〜60Ci /顧 ol)、 D-エリス口- [3- ³H]スフインゴシン（20Ci/匪 ol)はァメリカン · ラジォラペル ·ケミカル社 (American Radiolabeled Chemicals, Inc . )から購入したものを用いた。ただし、購入した [パルミトイル -1- ¹⁴C] N -パルミトイル- D-ェリス口-スフインゴシンに分解物が混在しているよう場合は、 TLCで精製した後に使用した。

• [ -^3zP] dCTP ( 3000 Ci/mmol )はパーキンエルマ一（PerkinElmer)社から、それそれ購入したものを用いた。

• SMART™ RACE cDNA増幅を用いて作成した 5， -RACE Ready CHO cDNA および 3' -RACE Ready CHO cDNAは、国立感染症研究所'細胞化学部（現 · 九州大学理学系大学院）の久下理博士から分与されたものを使用した。

-ライセニンは、全薬工業株式会社の関沢良之博士から分与されたものを用いた。

• ( 1R，3R) N— ( 3—ヒドロキシ一 1ーヒドロキシメチルー 3—フエニルプロル）ドデカンアミド [ ( 1R, 3R) H P A— 1 2 ]は、東京大学大学院薬学系研究科の小林修教授から分与されたものを用いた。

• CH0細胞 cDNAラィブラリ一は、 CHO- K1細胞由来の mMAから、ィンビトロゲン社のスーパ一スクリプト（Superscript™)プラスミドシステムを用いて作成したものを用いた。

- PBS/nFLベクタ一は、 pBS由来の改変ベクターであり、ァミノ末端に FLAG™ェピトープ配列が付加できるようなマルチクローニング部位を持つように、本発明者が、 pBSぺク夕一から作成したものを用いたが、以下に詳述する PBS/nFLベクタ一を用いて行う実験操作は、 pBSベクターを用いて行うことも可能である。

く実施例で使用した分析機器 >

• PCR機器と DNA配列解析機器には、アプライドバイオシステムズ

(Appl ied Biosystems )社製のジ一ンアンプ（登録商標名 GeneAmp )PCRシステム 2700と ABI PRIZM™ 310を用いた。 2004/004455

• TLCなどで分離した放射性物質のィメ一ジ解析には、富士フィルム社の B A S 2000イメージアナライザ一を用いた。

•液体シンチレ一シヨンカウン夕一はァロカ（Aloka)社の LSC-5100を、蛍光スぺクトル測定装置には、日立製作所のモデル F- 3000をそれぞれ用いた。

'蛍光顕微鏡にはカール ' ツァイス社のアキシォバート（登録商標名 Axiovert) S 1 0 0 T Vを、チャージド ·力ップルド ·デバイス（charged coupled device ; CCD )カメラには浜松ホトニクス社のデジタル CCDカメラ C4742-95- 12を使用した。 '

<実験で用いた PCIIプライマー >

本実験で用いた PCRプライマ一を表 1に示す。表 1

4004455

<細胞培養方法 > • CHO-K 1細胞はァメリカンタイプカルチヤ一コレクション

(American Type Cell Collection) から購入し、本発明者らによって継代、保存しているものを用いた。

•CH0細胞変異株 'LY-A株は、本発明者ら（Hanada， Κ·, Hara， T.， Fukasawa, Μ·， Yamaji, A., Umeda, M. and Nishijima, M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 33787-33794.)が樹立したものを使用した。 Kitamuraら (Gene Ther. 1, 1063-1066.， 2000) により樹立されたレトロウィルスパッケジング細胞である Plat-E細胞は、その樹立者である東京大学 ·医科学研究所 '北村俊雄教授から分与されたものを使用した。

· CHO細胞は、 Ham ' s F 1 2培地に 10 %新生ゥシ血清（NBS)とぺニシリン G ( 1 00単位/ mL) および硫酸ストレプトマイシン ( 1 0 0 g/mL)を補充した細胞培養培地（F12/NBS)中、温度 33°Cにおいて、 5 %の C 0₂雰囲気で通常は培養した。 Plat- E細胞の場合は、ダルぺヅコの最小必須培地に 10%胎児血清（FBS)とペニシリン G( l 00単位/ m L ) および硫酸ストレプトマイシン ( 1 00 ^ g/mL) を補充した細胞培養培地（DMEM/FBS)中、温度 37 °Cにおいて、 5 %の00₂雰囲気で培養した。

•また、ニュートリドーマ培地（ 1 %ニュートリドーマ S Pおよび 2 5 g/mLのゲン夕マイシンを含有する H am ^£ s F 1 2培地）もしくは、ニュ一トリドーマ B0培地（ニュートリドーマ培地に 10 〃Mの才レィン酸ナトリウム BSA複合体および 0. 1 %の FBSを添加した培地）は、 Hanadaら (J. Biol. Chem. 267, 23527-23533. , 1992) によって調製されたものを、スフインゴ脂質欠乏培地として用いた。

製造例

<本発明の薬剤の有効成分であるタンパク質の製造 >

以下の手順で CERT夕ンパク質及びその組換え夕ンパク質を製造した。 <LY- A2株樹立の方法 >

CH0細胞は、マウスレトロウィルス受容体であるマウス由来陽性アミノ酸輸送体（mCAT- 1 )が発現していないので、そのままではマウスレトロウィルスベクタ一を感染させることができない。そこで、 LY- A株に mCAT-1 cDNAを安定発現させた株（LY-A2株と命名）を以下のように樹立した。先ず、 Albritton, L.Mら (Cell 57, 659-666. , 1989) に記載きれるプラスミド pJET (米国 · Brigham & Wo匪， s Hospitalの James Cunningham博士より供与されたもの）を、制限酵素 Stu Iおよび Bam HI で処理して切り出した mCAT-1 cDNAを、哺乳動物細胞発現プラスミド · pcDNA3. 1/Hyg ( + ) Eco RV/Bam HI部位に挿入して mCAT-l/pcDNA3. 1/Hyg を作成した。 mCAT-l/pcDNA3. 1/Hygを Bgl I Iで処理して直線化した後、リボフヱク夕ミン ·プラス試薬を用いて、 LY- A細胞に導入した。ハイグマイシン B( 250〃g/mL )を添加した F12/NBS培地中で培養し、ハイグマイシン B耐性細胞を選択した後、限外希釈法によって 6つのハイグマイシン B耐性株を精製した。これらの株の mCAT- 1発現レベルとその安定性を放射性アルギニン取り込みを指標にして検討し、最も安定的に発現する株を LY-A2株とした。放射性アルギニン取り込みアツセィ方法は Wang ら (J. Biol . Chem. 267， 23617 - 23624.， 1992) の方法に準じた。ただし、取り込み反応液は、 25 mMへぺス ' ΚΟΗ (ρΗ 7.2)緩衝液に 115 mM KCl、 0.9 mM CaCl₂₅ 0.81 mM MgS0₄、 5 mM D -グルコースおよび◦. 1 mM L- [³H] アルギニン（1.25/ Ci/mL)を添加したものを用い、反応は 25 ° Cで 30秒間行った。

くヒト cDNAライブラリ一を発現するレトロウィルス粒子の調製方法 > ヘラ（HeLa)細胞に由来する cDNAから構築されているレトロウィルスライブラリ一のプラスミドを、フ一ジーン ' トランスフエクシヨン試薬を用いて、パヅケジング細胞である Plat-E細胞に導入した。トランスフ

Z7 ェクシヨン処理開始の次の日に培地を交換し、さらに 2 4時間培養後、培地を回収する。回収培地を、先ず、 150 X gで 5分間遠心し、その上清をついで 1350 x gで 5分間遠心した上清をウィルス粒子液とした。調製したウィルス粒子液- 80° Cに冷凍保存し、使用直前に融解して感染実験に使用した。

くクローン化された cDNA を発現するレトロウィルス粒子の調製方法 > 発現したい cDNAを pLIBベクターに組み込んだプラスミドを、上述した方法と同様な方法で、 Plat-E細胞へ導入し、ウィルス粒子液を調製した。緑蛍光タンパク質（GFP )を発現するためには、 pUB-EGFPを Plat - E 細胞へ導入し、ウィルス粒子液を調製した。

< LY-A2細胞へのレトロウィルス感染方法 >

感染実験の細胞培養に用いる NBSは、補体因子を失活させるために 58° Cで 30分間処理したものを使用した。 2百万個の LY- A2細胞を 100-mm直径培養皿に播種して、 10 mL F12/NBS中、 37° Cでー晚培養した。次の日、ヒト cDNAライブラリ一発現レトロウィルス粒子液を F12/NBS で 1 0倍希釈し、それに濾過滅菌したポリプレン（800 ju g /ml PBS)を最終濃度 4〃g/ Lとなるように添加したものを感染培地とした。細胞の培養液を培養皿当たり 5 mLの感染培地に交換して、 37° Cで 6時間培養した。培地を 10 mLの F12/NBSに再ぴ交換して、さらにー晚培養した。細胞をトリプシン処理で回収し、 150- mm直径培養皿に一皿当たり 2百万細胞を播種した。 10 mLの F12/NBS中、 33° Cで一晩培養した後、次節の MCD選択に供した。なお、 pL I B- EGFPベクタ一から調製したレトロウィルス粒子液を用いた予備実験から、ここで行つた感染条件下では、約 50% の LY-A2細胞が感染すると見積もられた。

< MCD耐性回復株を選択する方法 > ここで用いた機能回復株選択法は、 SM含量の減少した細胞がコレステロール引き抜き試桀 'メチルシクロデキストリン（MCD )に高感受性になり、 SM含量が回復した細胞が MCDに対する耐性を回復するという知見をもとにして行った。前節で述べたように播種して 33° Cで一晩培養した感染細胞を、 10 mLの無血清 F12培地で二回洗浄した後、 25 mLの 10 mM MCD/F-12 (無血清 F-12培地に溶かした 10 mM MCDを濾過滅菌したもの）中、 37° Cで一時間保温した。培養皿を 12 mLの PBSで三回洗浄後、 25 mL の F12/NBSを加えて 33° Cで 7〜 1 0日間培養した。生き残った細胞をトリプシン処理によって播種し、再び同様の MCD処理に供した。ただし、二度目以降の MCD処理では、細胞数が少ないので、細胞培養スケールを 60 - mm直径培養皿とした。総計 4回の MCD処理をして生き残った細胞に関して、限外希釈を行って細胞を精製した。精製した細胞の中から MCD 耐性、ライセニン感受性および SM生合成が CH0-K1細胞でみられるレべルに回復している細胞株 · LY-A2R細胞を得た。

く LY- A2R細胞に導入されている cDNAを増幅し、クローニングする方法 >

LY - A2R細胞に導入されている cDNAをゲノミック PCRで増幅し、クロ —ニングした。すなわち、 LY-A2R細胞から調製したゲノム MAをテンプレートとして、かつ、 pLIBぺク夕一中の配列に相当する合成オリゴヌクレオチド（表 1のプライマー # 1および # 2 )をプライマ一として、 PCR を行った。増幅した約 2.4 キロ塩基ペア一（l[bp)の DNAを、

PCDNA3.1/V5- His- T0P0ベクターに揷入した。得られたプラスミドを LY-A 細胞に、リボフェク夕ミンプラスを用いて導入すると、 MCD耐性度が CH0-K1細胞レベルに回復する細胞が観察された。当該 2.4 kbp DNAの配列を決定したところ、 Ray a, Aら (J. Biol . Chem. 275, 40392-40399. , 2000) によってすでに報告されているヒト GPBPA26タンパク質の cDNA 配列（GenBank番号： AF232930) と本質的に同一であることがわかった。本明細書にすでに詳述したように、この遺伝子産物の細胞内での機能はセラミド輸送であることが明らかになつたので、発明者らは、（ΪΡΒΡΔ26 タンパク質と本質的に同一の配列を有するタンパク質を CERTタンパク質と命名した。

<ヒト CERTの読み枠配列（open-reading frame, 0RF )のクロ一ニング方法 >

ヒト CERT夕ンパク質の 0RFを以下の方法でクローニングした。クロンテック社製のヒト ·ヘラ ' レトロウィルスライブラリ一をテンプレートとし、かつ、表 1のプライマー # 3及び # 5を用いて PCRを行った。なお、前向きプライマ一であるプライマー # 3には Eco RI部位が、逆向きプライマ一であるプライマー # 5には Xho I部位がそれそれ付加してある。増幅した約 1.8 kbp DNAを Eco RI と Xho Iで処理後、 pBSベクタ —の Eco RI-Xho I部位に挿入してクローニングした。得られたプラスミドは、 pBS/hCEHTと名付けた。ここでクローニングした cMAの配列は、 Raya, Aら（J. Biol . C em. 275, 40392-40399. , 2000) によってすでに報告されているヒト GPBPA26タンパク質の 0RF配列（GenBank番号： AF232930) と同一であることを確認した。

くヒト CERT_Lをコードする DNAの作成方法 >

GPBPA26タンパク質（すなわち実質的に CERTタンパク質）の別スフ' ライシング型として、 78 bpのェキソンがさらに加わり、結果として 2 6アミノ酸残基大きい産物である GPBP (すなわち実質的に CERT_L)が様々な種類の細胞で発現していることが知られている。ヒト CERT_L(hCERT_L ) に相当する 0RF配列を以下のように作成し、クロ一ニングした。先ず、 pBS/hCERTをテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマ一 # 3と # 7を用いて PCRを行い、約 1 .2 1《^の増幅0 を得た。ー方で、 88/]^£ をテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマー # 8と # 5を用いて PCRを行い、約 0.7 kbpの増幅 DNAを得た。次に、これら 1.2 kbpおよび 0.7 kbp DNAを等モルで混合したものをテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマ一 # 3と # 7とを用いて PCRを行い、約 1.9 kbp の増幅 MAを得た。この 1.9 kbp MAの Eco RI と Xho I処理産物を pBS ベクターの Eco RI- Xho I部位に挿入してクロ一ニングしたプラスミドを 88/^^111 と名付けた。；1.9¾ 0 の配列は、すでに 1^7 , ら (J. Biol. Chem. 274, 12642-12649, 1999) によって報告されている hGPBPタンパク質の 0RFの配列（GenBank番号： AF136450) に一致していることを確口、し/ o

く CERTの各種欠失変異体をコ一ドする DNAの作成方法 >

pBS/hCERTをテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマ一を以下のように組み合わせて PCRを行い、 CERT夕ンパク質の各種欠失変異体 0RFをコードする増幅 DNAを得た。 PH ドメイン欠失変異体（hCERTAPH夕ンパク質）をコードする増幅 MAを得るために、プライマ一 # 9と # 5を、 START ドメイン欠失変異体（hCERTASTタンパク質）をコードする増幅 DNAを得るために、プライマー # 3と # 1 0をそれそれ用いた。また、 MR ドメイン欠失変異体（hCERTAMRタンパク質）をコードする増幅 DNA を得るために、プライマー # 3と # 1 1を用いた PCRによる約 350 bp 産物と、プライマ一 # 1 2 と # 5を用いた PCRによる約 770 bp産物とをそれそれ得た後、これら PCR産物 DNAを等モルで混合したものをテンプレートにし、プライマー # 3と # 5を用いて PCRを行い、 hCERTAMR夕ンパク質をコードする約 1.1 kbpの増幅 DNAを得た。これら欠失変異体をコ一ドする DNAは、 EcoRIと Xho I処理して、 pBSベクタ一の EcoM-Xho I部位に挿入してクローニングした。 PH ドメインのみを持つ欠失変異体 (PHhCERT夕ンパク質）をコ一ドする増幅 DNAを得るために、プライマ一 # 1 3と # 1 4を、 MR ドメインのみを持つ欠失変異体（MRhCERT夕ンパク質）をコードする増幅 DNAを得るために、プライマ一 # 1 5と # 1 6を、 START ドメインのみを持つ欠失変異体（SThCERTタンパク質）をコードする増幅 DNAを得るために、プライマ一 # 1 7と # 1 8を、それそれ用いて PCR産物を得た。これらの増幅 DNAの Hind I I I と Xho Ί処理産物を pBS/nFLベクタ一の Hind Ι Ι Ι-Xho I部位に挿入してクローニングした。 <抗？1^6抗体で認識できるアミノ酸配列の hCERT夕ンパク質および MERTLタンパク質への付加方法 >

抗 FLAG抗体で認識できる Asp- Tyr-Lys- Asp- Asp-Asp- Lys配列（FL配列）を CERTのァミノ末端に付加するために、 pBS/hCERTをテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマ一 # 4と # 5を用いて PCRを行った。この増幅 MAの Eco RI と Xho I処理産物を pBSベクタ一の Eco RI-Xho I 部位に揷入してクローニングしたプラスミドを pBS/FL-hCERTと命名した o FL配列を CERT_Lのァミノ酸末端に付加の際には、テンプレートとして pBS/hCERT_Lを用いて同様の PCRを行い、当該産物をクロ一ニングしたプラスミドを pBS/FL- hCERT_Lと命名した。

< CERT夕ンパク質およびその関連夕ンパク質を哺乳動物で発現させるプラスミドの作成方法 >

レトロウィルスベクター感染を介する発現のためには、 pBSベクタ一の Eco RI-Xho I部位にクロ一ニングした各種 DNAを Eco RI-Xho I処理で切り出して、それらをレトロウィルス発現用 pLIBぺク夕一の Eco RI-Sal I部位に揷入して得られたプラスミドを用いた。ヘラ細胞 cDNA ライブラリ一から PCR増幅によってクロ一ニングした hCERTの 0RFを pL IB レトロウィルスベクターに揷入して、プラスミド pL IB/hCERTを得た。この方法は、 CERTタンパク質の組換えタンパク質にも適用することができる。一方、リポフエクシヨンを介する発現のためには、 pBSべク夕一の Eco RI-Xho I部位にクロ一ニングした各種 DNAを Eco RI-Xho I 処理で切り出した MAを、 pcMA3. 1/Neo( + )ベクタ一の Eco RI-Xho I部位に挿入して得られたプラスミドを用いた。ヘラ細胞 cDNAライブラリーから PCR増幅によってクローニングした hCERTの 0RFを pcMA3. l/Neo( + ) ベクタ一に挿入して、プラスミド pcDNA3. 1/hCERTを得た。

<MCDおよびライセニンに対する感受性の定量方法 >

12穴培養皿の各穴当たりに 1 0万個の細胞を 1 mLの F12/NBS培地中に播種し、 33° Cでー晚培養した。培養皿上の細胞を 1 mLの無血清 F12 培地で 2回洗浄後、 1 mLの 10 mM MCD/F12もしくはライセニン（25 ng/mL )/F12を添加した。なお、無血清 F12のみを 1 mL添加したものを対照とした。 37° Cで 1時間保温後、 l mLのリン酸緩衝生理的食塩水（PBS) で 2回洗浄した。ついで、 l mLの MTT ( 0.5 mg/ L )/F12を添加して、 37° C で 1時間保温した。生じた還元型 MTTの相対量を文献 Hanadaら（J. Biol . Chem. 273， 33787-33794. , 1998) の方法で測定した。

< CERTタンパク質をコードする遺伝子の C H O細胞への導入方法および安定発現株の分離方法 >

前節で作成したレトロウィルスべクタ一由来のウィルス粒子を感染させることで、当該遺伝子を LY- A2細胞に発現させた。すなわち、 pLIB/hCERT由来のウィルス粒子を LY- A2に感染させ、当該遺伝子を LY-A2 細胞に発現させた。 hCERTを発現させた場合は、限外希釈法によって精製した形質転換株も分離し、この株を LY-A2/hCERTと命名した。 4日間培養した後、上記した方法により MCDおよびライセニンに対する感受性を調べた。対照として、 cDNAを揷入していない pL IBベクター由来のゥィルス粒子を LY-A2に感染させた細胞についても MCDおよびライセニンに対する感受性を調べた。さらに、 C H 0 - K 1細胞についても MCDおよびライセニンに対する感受性を調べた。 MCDおよびライセニンに対する感受性測定の結果を図 2に示す。また、前節で作成した pcDNA3.1/Neo( + )由来の発現プラスミドを、リポフヱクタミンプラスを用いて LY-A細胞に導入し、当該遺伝子を発現させた。すなわち、 pcDNA3.1/hCERTを遺伝子導入して、当該遺伝子を LY-A 細胞に発現させた。 hCERTの安定発現株を精製するには、先ず、 G418耐性細胞を選択し、それらを限外希釈法によって精製した。その後、上記した方法により MCDおよびライセニンに対する感受性を調べ、 MCD感受性が野生型レベルに回復しているものを分離した。この形質転換株は LY-A/hCERTと命名した。 pLIB/hCERT由来のウィルス粒子を感染させた LY- A2細胞から、形質転換株を精製し、精製株である LY-A2/hCERT細胞の MCDおよびライセニンに対する反応性をさらに詳細に調べた。結果を図 3 (A) に示す。

<細胞の各種リン脂質の含有量の決定方法 >

F12/NBS培地 2 0mL中に 1 5 0 -mm直径培養皿当たり 3 x 1 0⁶の CHO-K 1細胞、 LY- A2細胞、又は LY-A2/hCERT細胞を播種し、 3 3 °C で一晩培養した。無血清 F 1 2培地 1 OmLで 2回洗浄後、二ユートリドーマ B0培地 2 OmL中でさらに二日間培養した。 PBSで洗浄後、細胞を接取り法によって回収し、 PBSに再懸濁し、 Blighら（Can. J. Biochem. Physiol. 37₅ 911-917， 1959)に記載の方法で脂質を抽出した。抽出した脂質は、クロ口ホルムノメタノール/酢酸/ H ₂0 (容量比、 25:15:4:2) を展開溶媒とした T L Cを用いて分離した。 TLCプレート上の分離リン脂質をョ一ド蒸気で呈色した後、各リン脂質をバンドをプレートから搔き出した。搔き出したリン脂質は、 Rouserら（Lipidsl, 85-86.₃ 1966) 4004455

の方法によりリン含有量を測定することで定量した。結果を図 3 (B) に示す。

< 〔¹⁴ C〕セリンおよび〔¹⁴ C〕コリンを用いた脂質の代謝標識実験方法 >

CHO-K 1細胞、 LY- A2細胞、 LY- A2/hCERT細胞をそれそれ F12/NBS 培地 5 mL中に 6 0 -mm直径培養皿あたり 1. 0 x 1 0⁶の細胞密度で播種し、 3 3°Cで一晩培養した。次いで、ニュ一トリド一マ培地 1. 5 mLに培地交換し、〔¹⁴ C〕セリン（0. 7 5 /C i ) または〔¹⁴ C〕コリン（ 1. 0 j C 1 ) を加えた後、〔¹⁴ C〕セリン添加の場合は 2時間、〔¹⁴ C〕コリン添加の場合は 5時間 3 3°Cで培養した。ただし、（1R, 3R)HPA-12の影響を分析する場合、 1〃Mの（1R， 3R)HPA-12を添加した（対照実験には、薬剤を溶かすのに用いたジメチルスルフォキシドを最終濃度 0.01%と合わせるように添加した）二ユートリドーマ培地 1. 5mL 中で 4でで 1 5分間前処理した後、〔¹⁴ C〕セリンを添加して、 3 3°C において 2時間培養した。細胞は冷却 PBS2mLで 2回洗浄後、 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウム ( SD S) 900 /Lで溶解し、そして溶解物の 8 0 0 Lおよび 2 0 zLは、それぞれ、脂質抽出およびタンパク質濃度の決定に用いた。〔¹⁴C〕セリンで標識した脂質の分析のために、脂質は、酢酸メチル /n—プロパノール/クロ口ホルム/メタノール Z0. 2 5 % K C 1 (25:25:25:10:9，容積比）を展開溶媒とした T L Cを用いて分離した。〔¹⁴ C〕コリンで標識した脂質の分析のために、脂質は、クロ口ホルム/メ夕ノール /酢酸/ H ₂0 (25:15:4:2s 容積比）を展開溶媒とした T L Cを用いて分離した。プレート上で分離された放射性脂質は、イメージアナライザ一で検出 '解析した。 ⁴ C〕セリンを用いた結果を図 4 (A) に、〔¹⁴ C〕コリンを用いた結果を図 4 (B) に示す。 P T/JP2004/004455

<酵素活性測定方法 >

SM合成酵素活性のアツセィは、 Hanadaら (Biochim. Biophys. Acta 1086, 151-156., 1991) の方法により、 C ₆— N B D— C e rを基質として用いて実施した。ただし、 CHO— K 1細胞、 LY-A2細胞、

LY-A2/hCERT 細胞からそれぞれ調製された膜画分を酵素源として用いた。結果を図 5に示す。

< C₅-DMB-C e rを用いた細胞標識と蛍光顕微鏡観察の方法 > 天然セラミドの小胞体（以下、 ERとも述べる）からゴルジ体への A T P依存性輸送の活性は、蛍光性セラミド類似体である C₅— DMB— C e rの ERからゴルジ体への再分配の解析から定性的に評価することができることを本発明者ら（J. Cell Biol. 144, 673-685.， 1999) は、すでに明らかにしている。以下に詳述するように、 ERを含む種々の細胞内器官膜のパルス標識のために細胞を 4°Cで、 3 0分間 C₅— DMB 一 C e rに曝し、洗浄後、 33°Cで、 1 5分間蛍光顕微鏡で追跡した。

C₅— DMB— C e rを用いた細胞標識と蛍光顕微鏡観察の方法は、それそれ Yasudaら (J. Biol. Chem. 276, 43994-44002., 2001) の方法及び Fukasawaら（J. Cell. Biol. 144, 673-685., 1999) の方法によって行った。すなわち、ガラス製カバーガラス上に生育した CHO— K 1細胞、 LY- A2細胞、 LY- A2/ ERT細胞をそれそれ、 1 Mの C₅— DMB— C e rを含む F 1 2培地中で、 4 °Cで 3 0分処理後、 F 1 2培地 1 m L で 3回洗浄した。 lmLのニュートリドーマ培地を加え、追跡をしない場合は、すぐに PBSで洗浄をし、一方、追跡をする場合は、 3 3°Cで 1 5 分間培養後に PBSで洗浄した。次に、 0. 1 2 5 %ダルタルアルデヒドの PBS溶液中で、 4°Cで、 5分間で固定した。試料は、固定後直ちに蛍光顕微鏡下で観察およびデジタル CCDカメラ撮影した。結果を図 6に示

~ o 04455

本発明者らは、さらに、セラミドが ERから SM合成の場へと移動する輸送経路には、 AT Pに存性する経路と依存しない経路の少なくとも 2 種類があり、 LY- A細胞では、 ATP依存性輸送経路が欠損していることを本発明者らは、すでに明らかにしている。 hCERTの導入で回復したセラミド輸送経路が、 ATP依存性輸送経路であるか否かを調べるために、 C₅— DMB— C e rの細胞内移動に対する ATP枯渴の影響を解析した。なお、 ATP枯渴条件を用いる場合には、 F 1 2培地 l mLで 3回洗浄した後に、エネルギー阻害剤（50 mMデォキシグルコースと 5 mM アジ化ナトリウム）を添加した lmLのニュートリドーマ培地中、 33°Cで 1 5 分間前処理した後に、 C₅— DMB— C e r処理して PBSで洗浄をして同様に固定して観察及び撮影を行った。また、追跡をする場合は、 C₅ -DMB - C e r処理した後に、さらにエネルギー阻害剤添加培地で 3 3°Cで 1 5分間培養後に PBSで洗浄し、同様に固定して観察及び撮影を行った。結果を図 7に示す。

<セラミド輸送阻害剤の影響 >

AT P依存性セラミド輸送経路に対する選択的阻害剤 '（1ΙΙ，3Ι ΗΡΑ - 12 が、本発明者ら (J. Biol. Chem. 276, 43994-44002., 2001) によってすでに発見されている。 hCERTの導入で回復したセラミド輸送経路が、 (1R，3R)HPA- 12感受性の輸送経路であるか否かを調べるために、 SM生合成に対する（1R，3R)HPA- 12処理の影響を放射性セリンを用いた脂質代謝標識実験によって解析した。結果を図 8に示す。

<hCERT安定発現による LY- A細胞のセラミド輸送機能の回復 >

レトロウィルス受容体を導入していない元来の LY - A細胞においても hCERT発現によってセラミド輸送機能が回復することを以下に述べるようにして確かめた。 hCERTを揷入した pcDNA3.1/Neoプラスミドを LY-A TJP2004/004455

細胞にリボフヱクシヨンで導入し、 G418耐性細胞を選択後、限外希釈によって、形質転換株 · LY- A/hCERTを精製した。その後、 MCDに対する感受性の測定、〔¹⁴ C〕セリンおよび〔¹⁴ C〕コリンを用いた脂質の代謝標識実験、及び C₅— DMB— C e rを用いた細胞標識と蛍光顕微鏡観察を同様に行った。結果をそれそれ図 9 (A) 〜（C) に示す。

く LY- A細胞の欠損は hCER 発現によっても相補することの証拠 >

CERT夕ンパク質及び 2 6アミノ酸残基大きな別スプライシング型産物である CERT^タンパク質が LY- A細胞の欠損を相補するか否かを検証した。ァミノ末端に FL配列を付加した CERT タンパク質及び CERT_Lタンパク質を発現するためのレトロウィルスをそれそれ LY-A2細胞に感染させた。得られた（LY-A2 + FL- hCERT) 細胞及び（LY- A2 + FL- hCERT_L) 細胞の MCD耐性を <MCD耐性回復株を選択する方法 >に記載される方法に準じて生き残った細胞数を数えることによって測定した。また、遺伝子を揷入していない pLIBベクターを用いて LY- A2細胞を感染させて得られた (LY-A2 + 空ベクター) 細胞、 CHO-K 1細胞、 LY - A2細胞も同様に MCD耐性を測定した。結果を図 1 0 (A) に示す。

<抗 FLAG抗体また抗 GFP抗体を用いたウエスタンプロット解析方法 > 細胞破砕液の調製およびウエスタンプロットの方法は、それそれ

Hanadaら（J, Biol. Chem. 273, 33787-33794.₃ 1998) の方法および Bejaoui ら（J. Clin. Invest. 110, 1301-1308., 2002) の方法に準じた。すなわち、冷却 PBSで洗浄した（LY-A2 + FL- hCERT) 細胞、（LY-A2 + FL-hCERT_L) 細胞、及び (LY-A2 +空べクタ一) 細胞をそれぞれ搔取り法によって回収し、 HSEI緩衝液 [10 mMへぺス- NaOH緩衝液（pH 7.5)に 250 mM スクロース、 1 mM エチレンジァミン四酢酸（EDTA)、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したもの]に懸濁後、投げ込み式超音波発生器を用いた超音波処理によって、細胞を破碎した。この破砕液を、 SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、 PVDF膜に転写した。この転写膜に対して、ブロッキング処理、第一次抗体処理および洗浄処理、第二次抗体処理および洗浄処理、そして ECL処理を施し、免疫学的反応蛋白質を検出した。 GFPまたは GFP融合 CERTタンパク質を検出する目的には BD Living Colors™ A. v.モノクローナル抗体を、それそれ第一次抗体として用いた。第二次抗体としては HRP結合ャギ抗マウス免疫グロプリン G を用いた。結果を図 1 0 ( B ) に示す。

< CH0-K1細胞由来 CERTタンパク質の cDNAクロ一ニング方法 >

CH0-K1細胞由来 CERTタンパク質の cDNAをクロンテック社 SMART RACE cDNA増幅キヅトを用いて、 cDNA末端の迅速増幅（rapid ampl if icaton of cDNA ends ; RACE )を行うことでクローニングした。すなわち、当該キットで作成した 5， -RACE Ready CH0 cDNAをテンプレートとし、表 1に記載のプライマ一 # 1 9を遺伝子特異的プライマ一として、 PCRを行った。この際、 DNAポリメラ一ゼとしてパイロペスト DNAポリメラーゼを用いた。一方で、 3， -RACE Ready CH0 cDNAをテンプレートとし、表 1のプライマ一 # 2 0を遺伝子特異的プライマ一として PCRを行った。これら 5⁵ -RACE反応および 3⁵ -RACE反応によって、それぞれ約 1.2 kbpおよび約 1. 4 kbpの増幅差物を得た。これら産物を pCR-Blunt Π- T0P0べク夕一にクロ一ニング後、 DNA配列を決定した。決定した配列中の重複領域を鑑み、 CH0- K1細胞由来 CERT ( cCERT)の cDNA全長の配列 2473 bpを決定した。次に、 cCERTの完全な 0RFを含む蘭 Aを得るために、 CH0細胞 cDNAラィブラリーをテンプレートとし、かつ、表 1に記載のプライマー # 2 1と # 2 2を用いて PCRを行った。増幅した約 1. 9 kbpの DNAを Eco RIおよび Xho Iで処理し、 pBSベクターの Eco Rl-Xho I部位に揷入したプラスミドを BS/cCERTと名付けた。

< CH0細胞由来 CERT夕ンパク質のノザンプロッ卜解析の方法 > CHO-Kl細胞および LY- A細胞から総 RNAをイソゲン（ isogen；日本ジーン社製）を用いて調製した。また、プローブとしては、上述の cCERT 5， -RACEで得た約 1 .2 kbp MAを、 [ひ-³² P]dCTPおよびメガプライム DNA ラベリングキットを用いて ³²P標識したものを使用した。ハイプリダイズ後の洗浄条件はストリンジヱント（stringent)条件で行 όた。転写膜上の放射性パ夕一ンの解析は B A S 2000イメージアナライザ一を用いて行った。また、内部標準のための転写膜再プローブ実験は、和光純薬ェ業から購入した β ァクチン DNA断片を ³² Ρ標識したものをプローブとして行った。結果を図 1 1に示す。

< LY-A細胞由来の cCERT 0RFのクロ一ニング方法 >

LY- A細胞から総 MAをィソゲンを用いて調製した。次に、この Aから、ス一パースクリブト第 1鎖合成システムを用いて cDNAを調製した。次に、本 cDNAをテンプレートとし、かつ、表 1に記載のプライマー # 2 1 と # 2 2を用いて PCRを行った。増幅した約 1. 9 kbpの DNAを Eco RI および Xho lで処理し、 pBSベクタ一の Eco RI-Xho I部位に挿入したフ' ラスミドを pBS/cCERT( G67E )と名付けた。以下に記載するように、 LY - A 細胞由来の cCERTには、 6 7番目のグリシン残基がグルタミン酸に置き換わるミスセンス変異が起こっていることがわかったので、このタンパク質を cCEPJ( G67E )と命名した。

く CH0- K1細胞または LY-A細胞に由来する CERTのカルボキシル末端への FL配列付加方法 >

抗 FLAG抗体で認識できる FL配列を cCERTのカルボキシル末端に付加するために、 pBS/cCERTをテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマ一 # 23 と # 6を用いて PCRを行った。この増幅産物を Cla I と Xho I とで処理して得られる約 300 bp DNAを精製した。そして、 pBS/cCERTおよび pBS/cCERT( G67E )を Cla I と Xho I とで処理して得られる約 3. 7 kbp MAに、先に精製した約 300 bp DNAを挿入することで、カルボキシル末端に FL配列が付加した CERTをコードする MAを作成し、 pBS上にクロ —ニングした。配列を確認後、クローニングした DNAを pLIBベクタ一にも移した。また、 cCERTおよび cCERT(G67E)の FL配列付加型（それそれ、 cCERT- FL および cCERT(G67E)- FLと命名）をコードする cMAをレトロウィルスべク夕一を介して、 LY- A2細胞に導入した（LY-A2 + CCERT- FL)細胞及び（LY- A2 + cCERT(G67E)-FL)細胞、 MCD耐性を <MCD耐性回復株を選択する方法 > に記載される方法に準じて生き残った細胞数を数えることによって測定し、 LY-A2細胞の性質が野生型に回復するか否かを解析した。結果を図 1 2 (A) に示す。さらに、 cCERT- FL配列及び cCERT(G67E)-FL配列に対して、 <抗 FLAG抗体また抗 GFP抗体を用いたウエスタンプロット解析方法 >と同様にウエスタンプロット解析を行った。ただし、 FL配列付加 CERT夕ンパク質を検出する目的には抗 FLAG M2モノクローナル抗体を用いた。結果を図 1 2 (B) に示す。

<GFP融合 CERT発現プラスミドの作成方法 >

hCERT, cCERTおよび cCERT(G67E)のカルボキシル末端に GFPを付加した融合蛋白質を発現するためのプラスミドを以下のように作成した。 pBS/hCERT, pBS/cCERTまたは pBS/cCERT(G67E)をテンプレートにし、かつ、表 1に記載のプライマー #3 と #24を用いて PCRを行った。増幅した約 1.9 kbpの DNAを EcoRIおよび Xho Iで処理し、 pBSベクタ一の Eco RI-Xho I部位に挿入してクローニングした後、塩基配列を確認した。そして、これらクローニングした DNAを EcoRI と Xho I とで処理して切り出し、 PEGFP-N3ベクターの Eco HI- Sal I部位に揷入した。このように作成した CERT-GFP融合蛋白質発現プラスミドは、それぞれ phCERT-GFP, pcCERT-GFP, pcCERT( G67E)-GFPなどと系統的に命名した。なお、プライマ一 # 3と # 24の塩基配列は hCERTの DNA配列を基にして設計しており、 cCERTの当該部分の MA配列とは部分的に異なっている。しかし、当該部分のアミノ酸配列は hCERTと cCEHTとの間で同一であり、かつ、これらプライマ一は cCERTに対する PCRにおいても有効であつたので使用した。

< CH0細胞における GFPおよび GFP融合 CERTの発現方法 >

PEGFP-N3, phCERT-GFP, pcCERT- GFPまたは pcCERT(G67E )-GFPプラスミドを、フ一ジーンを用いて、 CH0-K1細胞に導入した。得られた細胞を (CH0- 1+ PEGFP-N3) 細胞、 (CH0- 1+ phCERT-GFP) 細胞、 (CH0-K1+ pcCERT-GFP) 細胞、 (CH0- l+ pcCERT( G67E)-GFP) 細胞と命名した。 DNA 導入開始から 2 4時間培養後に播種し直し、さらに二日培養後に、蛍光観察もしくは細胞破砕液調製に供した。

< (CHO-Kl+ pEGFP-NS) 細胞、 (CH0- 1+ pcCERT-GFP) 細胞、 (CH0-K1+ pcCERT( G67E)-GFP)細胞に発現した GFPまたは GFP融合 CERTとゴルジ体局在マーカーとの共局在解析方法 >

CERT融合 GFPを一過的に発現した（CHO- Kl+ pEGFP-N3)細胞、 (CH0-K1+ pcCERT-GFP) 細胞、 (CH0-K1+ pcCERT( G67E)-GFP) 細胞において、ゴルジ体に局在する GS28蛋白質に対する抗体を用いた間接免疫細胞染色を行い、 GFPとの細胞内分布を比較した。免疫細胞化学的手法は、 Yasudaら（J. Biol . Chem. 278, 4176-4183. , 2003) の方法に準じた。すなわち、カバーグラス上での培養した細胞に対して、 3.7%ホルムアルデヒド固定処理、 0. 1 M塩化アンモニア処理、 0.2%トリトン X- 100処理、ブロッキング処理、一次抗体処理と洗浄、そして二次抗体処理と洗浄を施した後、スライドグラス上へマウントし、蛍光顕微鏡観察した。ただし、一次抗体にはマウス抗 G28モノクローナル抗体を、二次抗体にはァレキサフルォロ 594ャギ抗マウス免疫グロプリン Gを使用した。結果を図 1 3 ( A ) に示す。

く抗 FLAG抗体また抗 GFP抗体を用いたウエスタンプロット解析方法 > 細胞破砕液の調製およびウエスタンブロットの方法は、それそれ Hanadaら（J. Biol . Chem. 273, 33787-33794. , 1998) の方法および Bejaoui ら（J. Clin. Invest. 110, 1301-1308. , 2002) の方法に準じた。すなわち、冷却 PBSで洗浄した細胞を搔取り法によって回収し、 HSEI 緩衝液 [10 mMへぺス -NaOH緩衝液（pH 7.5 )に 250 mMスクロース、 1 mMェチレンジアミン四酢酸（EDTA)、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加したもの]に懸濁後、投げ込み式超音波発生器を用いた超音波処理によつて、細胞を破碎した。この破砕液を、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、 PVDF膜に転写した。この転写膜に対して、ブロッキング処理、第一次抗体処理および洗浄処理、第二次抗体処理および洗浄処理、そして ECL処理を施し、免疫学的反応蛋白質を検出した。ただし、 FL配列付加 CERTを検出する目的には抗 FLAG M2モノクローナル抗体を、 GFP または GFP融合 CERTを検出する目的には BD Living Colors™ A. v.モノクローナル抗体を、それそれ第一次抗体として用いた。第二次抗体としては IffiP結合ャギ抗マウス免疫グロプリン Gを用いた。結果を図 1 3 ( B ) くヒスチジン夕グ配列が付加した hCERTタンパク質およびその関連タンパク質の大腸菌発現用ベクターの作成 >

ヒスチジン夕グ配列が付加した hCERTタンパク質およびその関連夕ンパク質を大腸菌で発現させるために、本願明細書の段落番号 0 0 6 4 ~

0 0 6 6で作成 · クロ一ニングした MA断片を pET28a( + )ベクタ一のマルチクロ一ニング部位にインフレームになるように移したプラスミドを作成した。すなわち、 pBSベクタ一にクローニングした hCERT , hCERTい hCERTAPH, hCERTAMR，および hCERTASTは、 Eco RI-Xho I処理で回収し、 pET- 28a( + )の EcoRI- Xho I部位に揷入した。一方、 pBS/nFLにクロ一二ングした PHhCERT， MRhCERTおよび SThCERTは、 Hind Ι Ι Ι-Xho I処理で回収し、 pET- 28a( + )の Hind Ι Ι Ι-Xho I部位に挿入した。

く組換え大腸菌からの hCERTの精製方法 >

hCERT夕ンパク質およびその関連夕ンパク質（hCERT夕ンパク質， hCERT タンパク質， hCERTAPHタンパク質， hCERTAMRタンパク質，および hCERTASTタンパク質、並びに PHhCERTタンパク質， MRhCERTタンパク質および SThCERT夕ンパク質) をコードする DNAを組み込んだ pET-28a( + )プラスミドをヒートショック法により大腸菌 BL21 (DE3 )株に導入し、カナマイシンに対する耐性菌として形質転換させた。形質転換細胞をルリア ·ブロース培地中、細胞濁度が波長 600 nmにおける吸光度で 0. 6に達するまで 3 7 °Cで培養した。吸光度 0 . 6に達した時点で、 IPTG (ィソプロピル- 1 -チォ- b- D-ガラクトビラノシド）を終濃度 250〃M になるように加え、更に 2 5 °Cで一晩培養した。培養液を遠心し、沈降した大腸菌を破砕用の緩衝液 {25 mM トリス（pH7.4)、l% トリトン X- 100、 1 mM オルトバナジン酸、 50 mM フッ化ナトリウム、 5 mM ピロリン酸ナトリウム、 2. 5 mM 2メルカプトエタノール、 0. 27 Mスクロース、及びプロテア一ゼ阻害剤混合物（ロッシュ #1873580 ) 1錠 /50 ml} に懸濁したのち、投げ込み式超音波発生器を用いて菌を破砕した。これを 1 0万 g で 1時間遠心し、上清画分を精製に用いた。精製にはクロンテック社の TAL0N (コバルトイオンキレート樹脂）を用いた。 TAL0Nによる精製はマニュアルに従った。 150 mMのィミダゾ一ルで溶出した目的タンパクを一晚透析し、 10 mM トリス（pH 7.4) , 250 スクロースからなる緩衝液、または 10 mM トリス（pH 7.4 )，150 mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に置換したのち、 - 8 0 °Cで保存した。 CERTは、図 1に示すように、アミノ末端約 1 0 0アミノ酸領域にプレクストリンホモロジ一（PH)ドメインを、カルボキシル末端約 2 5 0アミノ酸領域にステロイドジェヅク急性制御タンパク質関連脂質転移（steroidgenic acute regulatory protein-related l ipid transfer; START )ドメインを、それらの中間領域（middle region, MR)のドメインと大きく 3つのドメィンを持っていると示唆されている。そこで、各ドメインのみを欠いた， hCERTAPHタンパク質， hCERTAMRタンパク質，および hCERTASTタンパク質、及び、各ドメインのみを有する PHhCERT夕ンパク質， MRhCERT夕ンパク質および SThCERTタンパク質もアミノ酸配列を解析した。さらに、 hCERTの MR ドメインの最後に 2 6アミノ酸が挿入された構造をしている hCERT_Lタンパク質に相当する組換え体も調製し、アミノ酸配列を解析した。 hCERT 夕ンパク質の配列を配列番号 1のアミノ酸配列として示す。各ドメインのみを欠いたタンパク質である hCERTAPH夕ンパク質， hCERTA R夕ンパク質および hCERTAST タンパク質、及び、各ドメインのみを有する PHhCERTタンパク質， MRhCERTタンパク質および SThCERTタンパク質の構造を図 1に示されている。また、 hCERT_Lタンパク質の配列を配列番号 2 のアミノ酸配列として示す。以上のように、本発明の薬剤に用いるタンパク質を製造し、以下の実施例において用いた。図 2〜図 1 3において以下のことが判明した。図 2に示すように、 pL IB/hCERT由来のウィルス粒子感染によって、 LY- A2は、有意に MCD耐性およびライセニン感受性を獲得したが、一方、 PL IBベクタ一由来のゥィルス粒子感染では、そのような変化は全く起こらなかった。この結果から、 hCERTの発現によって、 LY-A2の MCDおよびライセニンに対する反応性が野生型に似た性質に変化することが示された。図 3 (A) で示すように、精製株である LY- A2/hCERT細胞の MCDおよびライセニンに対する反応性は、野生型 CH0-K1細胞でみられる反応性とほぼ同じレベルであった。さらに、図 3 (B) に示されるように、細胞の含有する各リン脂質を化学的に定量したところ、 LY-A2/hCERT細胞においては、 SM含有量も野生型レベルに回復していた。また、図 4 (A) で示すように、放射性セリンを用いた脂質代謝標識実験を行うと、 SM生合成速度も LY- A2/hCERT細胞では野生型レベルに回復していた。これらの結果から、 LY-A2における SM生合成の低下は、 hCERTの安定発現によつてほぼ完全に野生型レベルへと回復することが明らかとなった。

<LY- A2細胞における SM合成回復は、 SM合成酵素活性や PC生合成の増進ではないことの証拠 >

図 4 (B) に示されるように、 SMはホスファチジルコリン (P C) からセラミドへのホスホコリンの転移により合成され、該反応は SM合成酵素により触媒される。放射性コリンを用いた脂質代謝標識実験においても、 LY- A2/hCERT細胞の SM生合成速度は野生型レベルに回復しており、また PC合成速度も野生株レベルであった。図 5に示されるように、 SM 合成酵素の活性は、 LY- A2/hCERT， LY-A2, CH0-K1細胞間で差はなかった。これらの結果から、 LY - A2細胞における SM合成回復は、 SM合成酵素活性や P C合成の増進によるものではないことが示された。

<生きた細胞における C ₅— DMB— C e rの E Rからゴルジ体への再分配 >

図 6に示されるように、 LY-AZ/hCERT, LY-AE, CH0-K1細胞は、追跡前は、本質的に同じ細胞内 DMB蛍光のパターンを示し、それは細胞内器官膜の全体にほぼ均一に分布していた。一方、標識細胞を追跡したとき、 LY- A2細胞におけるゴルジ体領域への DMB蛍光の蓄積は CHO- K1細胞に比べて明らかに低かつたが、 LY-A2/hCERTでは CHO- K1細胞に匹敵する蓄積が観察された。図 7に示されるように、エネルギー阻害剤（ 5 0 m Mのデォキシ— D 一グルコースおよび 5 mMの N a N ₃ ) 処理によって細胞内 A T Pを枯渴した条件下では、 ERからゴルジ体領域への D M B蛍光の移動は、 CH0-K1細胞においてと同様に LY- A2細胞でも阻害された。これらの結果から、 LY-A2細胞で欠損している A T P依存性の E R -ゴルジ体間セラミド輸送は、 hCERTの安定発現によってほぼ完全に回復されることが明らかとなつた。図 8に示すように、の HPA- 12は、 CH0-K1細胞においてと同様に LY-A2細胞でも SM合成を顕著に阻害した。（1R，3R)HPA- 12感受性輸送経路が欠損している LY-A2細胞では、（1R，3R )HPA-12無処理でも SM生合成が低下しており、本薬剤処理をしてもさらなる阻害はみられなかった。これらの結果から、 hCERTの導入で回復したセラミド輸送経路は

( 1R, 3R)HPA-12感受性経路であることが明らかとなった。図 9に示すように、 MCDに対する反応性、 SM生合成、 C₅- DMB- Cerの ER からゴルジ体領域への移動、それら全ての指標において、 LY-A/hCERT細胞は野生型の性質に回復していた。図 1 0 ( A ) に示すように、 hCERTよりも 2 6アミノ酸残基大きな別スプライシング型産物' hCERT_Lが LY- A細胞の欠損を相補するか否かを検証した。ァミノ末端に FL配列を付加した hCERT (FL-hCERT )もしくは hCERT_L ( FL-hCERT_L )を発現するためのレトロウイルスを LY-A2細胞に感染 04455

させた場合、有意に MCD耐性を獲得したが、一方、空べクタ一由来のゥィルス粒子感染では、そのような変化は起こらなかった。図 1 0 ( B ) に示すように、 FL配列に対するウエスタンブロット解析によると、 FL-hCERTと FL-hCERT_Lの導入発現効率がほぼ等しかった。これらの結果から、 hCERT ま、 hCERTと同様に、 LY- A細胞の欠損を相補する能力があることが明らかとなった。

< CH0-K1細胞由来 CERT cDNAの配列解析 >

CH0-K1細胞由来 CERT m Aに対する全長 cDNAの配列を RACEなどによつて決定した。全長 2473 bpの配列は、 598アミノ酸の産物（cCERT)をコ —ドする 1794 bpの 0RFを含んでいた（配列表 3および 7 ) 。 CERTは、ヒト、マウス、およびチャイニーズハムスターの全てで 5 9 8アミノ酸であり、また、 cCERTと hCERTとの間には、 DNA配列レベルで約 9 0 %、アミノ酸レベルで約 9 8 %の同一性があった。この結果は、 CERTの哺乳動物間での強い保存性を示して'いる。また、 CH0細胞由来の cDNAライブラリーから、 hCERT_Lの相同タンパク質（cCERT_Lと命名）をコードするも PCRで増幅された（配列表 4および 8 ) 。 hCERT_Lと hCERTとの関係に同じく、 cCERT,,は cCERTよりも 26ァミノ酸大きな産物である。

< CH0細胞 CERTのノザンプロット解析 >

図 1 1に示すように、 CHO- K1細胞と LY- A細胞の間に CEM mRNA発現に差があるか否かを調べる目的で、ノザンプロット解析を行った。 CERT プローブにハイプリダイズする 3つの異なる分子量（それそれ、約 1.2， 2.6， 5.5キロ塩基） RNAが検出され、いずれの発現レベルも CH0-IU細胞と LY- A細胞の間に有意の差はなかった。 CHO- K1細胞からクロ一ニングした CERT全長 cDNAは 2473 bpであったので、ノザンブロット解析で検出された約 2.6キロ塩基） RNAがおそらく CERT全長 cDNAに対応する mRNA であると考えられる。他の 1.2および 5.5キロ塩基 RNAは、スプライスアイソフォームまたは未成熟型 CERT mRNAであるのかもしれない。内部対照を得る目的で、 β ァクチン DNAをプローブとして用いた再ハイプリダイズを行い、ァクチン mMAレベルが両細胞 RNAサンプル間で等しいことも確認した。

<LY-A細胞由来 CERT cDNAの配列解析 >

前節で示したように、 LY- A細胞においても CERT mRNAが発現していることを見出した。そこで、逆転写 PCRによって、 LY-A細胞から CERT cDNA をクローニングした。 LY- A細胞の CERT cDNAは、 CHO- K1細胞由来配列と比較した場合、唯一の変異を有していることが明らかとなった。この変異は、 0RFの 6 7番目のコドンが GGAから GAAに変わる一塩基置換であり、結果として cCERT夕ンパク質の 6 7番目のグリシン残基がグルタミン酸残基へと置換するミスセンス変異であった。そこで、この 0RF産物を cCERT( G67E )と命名した。なお、本実験において、 PCRは独立に 2回行い、同一の配列を得た。よって、先述したミスセンス変異は PCRによる人工的な変異ではない。

<LY-A2細胞における cCERTもしくは cCERT( G67E)の cDNA導入発現効果 >

図 1 2 ( A ) に示すように、 LY- A2に cCERT- FL cDNAを導入した場合、明らかな MCD耐性回復が起こったが、それらの G67E変異型を導入した場合は、そのような回復は起こらなかった o FL配列を付加していない cCERT および cCERT( G67E ) ® cDNAを導入して場合でも同様な結果が得られた (データ未表示) o また、図 1 2 ( B ) に示すように、 FL配列に対するウエスタンプロヅト解析における、 cCERT-FLと cCERT( G67E )-FLの発現レベルがほぼ等しいことが示された。よって、 cCERT( G67E)発現レベルが cCERT発現レペルに比べて低いために機能回復能が低いという可能性は 5

否定された。これらの結果から、 LY-A細胞の欠損は、野生型 cCERTの発現により相補されること、 cCERTの当該相補機能は G67E変異によって損なわれることが明らかとなった。なお、図 1 0 ( B ) および図 1 2 ( B ) に示したウエスタンプロット解析結果において、 CERTが二重バンドとして観察されるのは、本蛋白質のリン酸化のためと考えられる。実際、脱リン酸化処理を行うと二重バンドのうち高分子量のほうのバンドは消失した。

< CERTの細胞内分布に対する G67E変異の影響 >

図 1 3 ( A ) に示されるように、 cCERT- GFPを発現させた場合、これらの緑色蛍光は細胞質にも分布するが、核周辺領域に明らかに濃縮していた。この核周辺領域は、 GS28局在領域と一致していることから、ゴルジ体であると考えられる。一方、 cCERT(G67E )-GFPを発現させた場合、その緑色蛍光の分布は、細胞質にほぼ均一に分布し、 GS28局在領域へ選択的に濃縮しなかった。また、 CERTと融合していない GFPを発現させた場合、細胞質だけでなく核にも多く分布した。なお、図 1 3 ( B ) に示される抗 GFP抗体を用いたウエスタンプロヅト解析から、 cCERT-GFPや cCERT(G67E)-GFPは予想された分子量の産物として発現され、 GFP抗体に交差する分解産物は検出されなかった。よって、これら GFP融合タンパク質発現時に観察された GFP蛍光分布は、 cCERT- GFPもしくは

cCERT(G67E )-GFPそのものの分布を反映している。これらの結果から、 CER は、細胞質とゴルジ体に主に分布すること、 CERTのゴルジ体会合能は G67E変異で損なわれること、 G67E変異は CERTが核から除外される性質には影響しないこと、が明らかとなった。 P2004/004455

LY - A株に hCERT cDNAを導入すると SM合成が野生株レベルに回復した。また、蛍光性セラミド類似体を用いたアツセィによって、小胞体からゴルジ体へのセラミド移動が回復することも明らかとなった。別スプライシング型に相当する hCERT_L cDNAも LY-A株を回復させた。よって CERT タンパク質は、細胞内セラミド選別輸送に関わる因子である。以上の結果から、（ 1 ) CERTタンパク質は、セラミド輸送に欠損を持つ LY-A細胞の機能回復探索法で cDNAライブラリーから選択されてきたこと、（ 2 ) CERT夕ンパク質は、 LY- A細胞の知られている限り全ての欠損を相補すること、（ 3 ) LY- A細胞では自身の CERTタンパク質をコ一ドする遺伝子にミスセンス変異が起こっていること、（4 ) LY- A細胞で起こっている変異を持つ CERTタンパク質は、 LY-A細胞の欠損相補能を損なっていることを明示している。従って、これらの結果から、当該 CERT タンパク質をコードする遺伝子における変異が LY- A細胞の欠損の原因変異であること、および、 CERTが細胞内セラミド選別輸送に特異的に関わる因子であることが初めて明らかとなった。実施例 1

く hCERT夕ンパク質、 hCERT タンパク質及びその組換えタンパク質〉次に、 ERT夕ンパク質及ぴその組換えタンパク質（hCERT夕ンパク質， hCER' 夕ンパク質， hCERTAPHタンパク質 ₅ hCERTAMRタンパク質，および liCERTASTタンパク質、並びに PHhCERTタンパク質， MRhCERTタンパク質および SThCERTタンパク質）が脂質膜からセラミドを遊離させる活性を示すか否かを検討した。このァヅセィには、くヒスチジンタグ配列が付加した hCERT夕ンパク質およびその関連タンパク質の大腸菌発現用ぺク夕一の作成 >及びく組換え大腸菌からの hCERTの精製方法 >において、上記したように大腸菌で発現させた CERT夕ンパク質及びその組換えタンパク質（hCERT夕ンパク質， hCERT_Lタンパク質， hCERTAPH夕ンパク質， hCERTAMRタンパク質， hCERTASTタンパク質、並びに PHhCERT夕ンパク質， MRhCERTタンパク質および SThCERTタンパク質）を精製して使用した。

<膜からのセラミド遊離促進活性の検出方法 >

以下に標準的な方法の詳細を記載するが、記載した条件を変更しても、原理的に遊離セラミドを遠心法で分離する手段を有するセラミド遊離促進活性の検出方法は、本発明に属する。セラミド含有脂質膜は、卵黄由来のホスファチジルコリンとホスファチジルェタノールァミンの 4 ： 1 からなる混合脂質をべ一スとして、 1サンプル当たり 12. 5 nCi ( 225 pmol ) の [パルミトィル -1-¹⁴C] N-パルミトイル -D -ェリス口-スフインゴシン（以下 ¹⁴C-セラミドと述べることがある）を含み、濃度が 2. 5 mg/mL になるように調製した。この脂質膜が活性測定 1サンプル当たり 2 0〃L 必要である。活性測定に必要な量の脂質をエツペンドルフチューブに分取したのち、窒素を吹き付けて乾固させた。乾固した脂質膜に濃度が 2. 5 mg/mLになるように、緩衝液 1 [50 mM NaC lおよび 1 mM EDTAを添加した 20 mMへぺス- NaOH緩衝液（pH 7. 4 ) ]を加えた後、浴槽型超音波発生器 [ブランソン（Branson)社製モデル 2210]を用いて穏やかに超音波処理した。超音波処理は 2 5 °Cで行い、 3分間の超音波処理、 3 0秒間のボルテツクス、 3分間の超音波処理、という手順で行った。このようにして調製した脂質膜をセラミド遊離実験に用いた。脂質膜からのセラミドの遊離反応とその検出は以下のように行った。対象とするタンパク質試料として上記した hCERTタンパク質又はその組換えタンパク質それそれ（標準条件では、供与膜中セラミドの 2倍モル等量に当たる 4 5 0ピコモル相当のタンパク質を使用）を、緩衝液 2 [ 100 mM NaClおよび 0. 5 mM EDTAを添加した 50 mMへぺス- NaOH緩衝液 (pH 7.4) ]を用いて 30 j lにメスアップした。ここにセラミド含有脂質膜を 2 0 / L加えて反応を開始した。最終的なリン脂質の濃度は 1 mg/mL になり、セラミドは全リン脂質量に比して約 0. 3%含まれている。これらの混合物を 3 7 °Cで 3 0分間保温した後、 50, 000 x gで 3 0分間遠心し (遠心機，日立ェ機社製 himac CS120EX;遠心ロー夕， RP匪 T3-200 ;遠心チューブ， 0.23PCチューブ）、脂質膜を沈降させた。組み換え大腸菌から精製してきた hCERTタンパク質及び組換えタンパク質を用いた場合、この遠心条件では大部分のタンパク質が上清に残るので、セラミドが hCERT夕ンパク質に結合すると、脂質膜から遊離して上清画分に移行する。上清画分の "Cの放射活性を液体シンチレーシヨンカウン夕一で測定することにより、 hCERTによるセラミドの遊離を促進する活性を算出した。 hCERTタンパク質を用いたセラミドの遊離を促進する活性の測定結果を図 1 4 ( A ) 及び ( B ) に示す。膜小胞からの遊離反応ァッセィにおける基質をセラミドから様々な他の脂質に変えて、反応の特異性を調べた。この際、 hCERTと START ドメイン欠失 hCERTとの差を、 START ドメインを介する脂質引き抜き活性の指標とした。結果を図 1 5に示す。さらに、 hCERT夕ンパク質、 hCERT_Lタンパク質、 hCERTAPHタンパク質、 hCERTAMRタンパク質、およぴ hCERTASTタンパク質、並びに PHhCERT 夕ンパク質， MRhCERT夕ンパク質および SThCERT夕ンパク質によるセラミドの遊離活性の測定結果を図 1 6に示す。精製した組換え体 hCERTを用いて、セラミドの遊離促進活性を測定した。微量のセラミドを含んだリン脂質多重膜小胞を遠心すると、セラミドはほぼ完全にリン脂質小胞とともに沈殿した。しかし、 hCERTが共存 04 004455

する場合には、リン脂質多重膜小胞は完全に沈殿しながらも、セラミドは膜から遊離して hCERTとともに上清み画分に分配するようになった。すなわち、図 1 4 ( A ) 及び（B ) からわかる通り、 hCERTの量及び保温時間の長さに依存して、リン脂質膜からのセラミドの遊離が検出された。一方、 hCERTを加えない場合のセラミドの遊離はほぼゼロであった。これらの結果から、 hCERTは、膜からのセラミド遊離を促進する活性を持つことが明らかになった。現在までに、 CERT以外で START ドメインを持つタンパク質が認識する脂質としては、ホスファチジルコリンゃコレステロールが知られている。しかし、図 1 5に示されるように、 CERT夕ンパク質は、ジァシルグリセ - ロール、コレステロ一ル、ホスファチジルコリン、スフインゴミエリン、スフィンゴシンに対して有意の遊離反応を示さなかった。また、セラミドと構造的に類似しているジァシルグリセロールの遊離促進は、セラミドに対する活性の 5 %程度であった。この結果から、 CERTは、特異的にセラミドを膜から遊離させる活性を持つことが明らかになつた。図 1 6に示されるように、 hCERTの各種欠失変異体を組換え体として作成 '精製し、各ドメインのもつセラミド遊離促進活性について検討した。また、 liCER^も hCERTと同様の活性を示した。 PH ドメインの欠失はセラミドの遊離促進活性に影響を与えず、 MR ドメインの欠失は若干活性を低下させた。一方、このセラミド遊離反応は、 hCERT夕ンパク質から START ドメインを欠失すると起こらなくなり、一方、 START ドメインのみの SThCERTタンパク質でも活性を示した。なお、 hCERT_Lは、 hCERT同様のセラミド遊離促進活性を示した。この結果から、 hCERTによる膜からのセラミドの遊離は START ドメインを介して起こっていることが明らか P T/JP2004/004455

になった。以上の結果から、 CERTおよび CERT_tは、それらの START ドメィンを介して特異的にセラミドを脂質膜から遊離させる活性を持つことが明らかとなった。以上の結果から、 CERTおよび CERT_Lは、それらの START ドメインを介して特異的にセラミドを脂質膜から遊離させる活性を持つことが明らかとなった。実施例 2

<セラミドの膜間移動促進活性の測定方法 >

ついで、以下に詳細に記載するように、セラミドの脂質膜の間の移動を hCERT夕ンパク質及び組換えタンパク質が促進するか否かを検討し、このアツセィにも精製した hCERT夕ンパク質及び組換えタンパク質を使用した。本法は、すでに報告されているホスファチジルイノシトール輸送夕ンパク質によるホスファチジルイノシ卜一ルの膜間移動促進活性の測定法 Kasperら（Biochim. Biophys . Acta 664， 22-32 · , 1981 ) の原理に基づき、新たにセラミドの膜間移動促進活性測定法となるように構築したものである。膜間移動促進活性を測定するために、放射性セラミドを含有した供与膜と、セラミドを含まない受容膜とを調製する。脂質膜の分離のために、供与膜にはラクトシルセラミドが含まれている。供与膜と受容膜を対象とするタンパク質試料とともに保温したのち、ヒマ豆レクチンを加える。低速遠心で沈降しなかつた受容膜の放射活性を測定することにより膜間移動したセラミドを定量することができる。以下に標準的な方法の詳細を記載するが、記載した条件を変更しても、原理的に選択的な認識マーカーをセラミド供与膜または受容膜のいずれかに 4455

導入し、そのマ一力一を利用してセラミド供与膜と受容膜を分離する手段を有する膜間移動促進活性検出方法は、全て本発明に属する。供与膜は、卵黄由来ホスファチジルコリン /ホスファチジルェ夕ノールアミン /ラクトシルセラミド /セラミド = 64/1 6/8/1からなる混合脂質の中に、 1サンプル当たり 1 2. 5nCiの " C-セラミドと 1 2 5nCiの [2-パルミトイル- 9， 1 0-³H(N)] L-ひ-ジパルミトイルホスファチジルコリン（以下³ H- DPPCと述べることもある）を加え、総脂質濃度が 1.77mg/mLになるように調製した。セラミドは ¹⁴C-セラミドに非放射性セラミドを加えて目的の物質量にした。この脂質膜が活性測定 1サンプル当たり 20 L必要である。活性測定に必要な量の脂質をポリプ口ピレンマイクロチューブに分取したのち、窒素を吹き付けて乾固させた。乾固した脂質膜に濃度が 1.77mg/mLになるように、緩衝液 1 [50mMNaCl および ImM EDTAを添加した 20 mMへぺス -NaOH緩衝液（pH 7.4)]を加えた後、投げ込み式超音波発生器（例えば、クボ夕社製 UP50H) を用いて超音波処理した。超音波処理は 25°Cの水浴上で 1 0分間行った。このように調製した供与膜を 4°C、 12,000 30分間の条件で遠心しても (遠心機, トミー社製 MRX-150; 遠心チューブ, ェヅペンドルフ社製 1.5- mlマイクロテストチューブ）、脂質膜の 9 0%以上は沈降せずに上清に回収される。上清に残っている脂質膜と遠心前の脂質膜を液体シンチレ一シヨン力ゥン夕一で測定し、実験毎に両者の間で ¾の放射活性がほとんど変わらないことを確認した（通常 9 0%以上が上清に回収された）。また、 ¾ の放射活性で求めた沈降/非沈降の比は、リン酸定量によって算出した値とほぼ同一の値を示し、供与膜に添加した ¾-DPPCの分配から供与膜全体の分配を推測することが可能であることを確認した。受容膜は、卵黄由来ホスファチジルコリン /ホスファチジルェ夕ノールァミン = 4 Z 1からなる混合脂質であり、総脂質濃度が 5. 33 mg/mL になるように調製した。この脂質膜が活性測定 1サンプル当たり 60 必要である。活性測定に必要な量の脂質を 1. 5- mlマイクロテストチュープ（エツペンドルフ社製）に分取したのち、窒素を吹き付けて乾固させた。乾固した脂質膜に濃度が 5. 33 mg/mLになるように、緩衝液 1を加えた後、投げ込み式超音波発生器（例えば、クボタ社製 UP50H) を用いて超音波処理した。超音波処理、及びそのあとの遠心条件等は、供与膜の調製と同様に行った。セラミドの膜間移動を促進する活性の検出は以下のように行った。 1.5-mlマイクロテストチューブ (エツペンドルフ社製）中において、対象とするタンパク質試料である hCERT夕ンパク質、 hCERT_Lタンパク質、 hCERTAPHタンパク質、 hCERTAMR夕ンパク質、又は hCERTASTタンパク質、あるいは PffliCERTタンパク質， MRhCERTタンパク質又は SThCERT夕ンパク質と（標準条件では、供与膜中セラミドの 0.4%モル等量に当たる 2ピコモル相当のタンパク質を使用）と 60〃Lの受容膜を、緩衝液 1を用いて 8 0 / Lにメスアップした。ここに 20〃Lの供与膜を加えて反応を開始し、 3 7。Cで 1 5分間保温した。反応は 2. 5 mg/mlのヒマ豆レクチンを 30 z L加え、ピベッティングにより攪拌することによって終了させた。凝集体を充分に形成させるため、氷浴上でさらに 1 5分間保冷したのち、 4 °C、 12, 000 X g, 3分間の条件で遠心した。上清をピペットで採取し、沈降した供与膜は 130〃Lの 0 . 1 % SDSにて溶かした。液体シンチレ一シヨンカウン夕一（ァロカ社製 LSC- 5100 ; ¾放射能と ¹⁴ C放射能との選別測定プログラムを使用）で、上清と供与膜の ¹⁴ Cの放射活性を測定することにより、試料がもつセラミドの膜間移動促進活性を測定した。試料を全く含まない場合でも、セラミドはごくわずかに膜間移動するので、これを自由拡散によるバックグラウンドとして差し引いた。供与膜に添加した ³ H-DPPCに由来する放射活性の大部分（通常 9 0 %以上）が供与膜とともに沈降していることを確認することで、供与膜と受容膜が選択的に分離されていることを実験毎に確認した。精製した組換え体 hCERTを用いて、セラミドの膜間移動を促進する活性を測定した結果を図 1 7 ( A ) 、 ( B ) 及び（C ) に示す。さらに、 hCERTタンパク質、 hCEHTLタンパク質、 hCERTAPHタンパク質、 hCERTAMRタンパク質、および hCERTASTタンパク質、並びに PHhCERTタンパク質， MRhCERT夕ンパク質および SThCERT夕ンパク質によるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定結果を図 1 8に示す。

<タンパク質の定量法 >

ビアース（Pierce )社の BCAアツセィ試薬を用いて、夕ンパク質を定量した。標準には、 BSAを用いた。図 1 7 ( A ) 、 ( B ) 及び（C ) に示されるように、 hCERTの量、保温時間の長さ、及び保温温度に依存して、膜間のセラミドの移動が検出された。一方、 hCERTを加えない場合のセラミドの膜間移動はほぼゼロであった。微量の放射性セラミドを含んだセラミド供与膜小胞とセラミドを含まない受容膜小胞とを混ぜて保温した場合、それだけではセラミドは受容膜小胞に 1時間たつても全く移行しなかった。ところが、 hCERT が共存すると、セラミド移行が起こった。添加した CERT量によっては 1 0分間で 5 0 %近いセラミドが受容膜小胞に移行した。なお、ここで用 T JP2004/004455

いた実験条件では、供与膜小胞と受容膜小胞の融合は hCERTの有無にかかわらず起こらなかった。これらの結果から、 hCERTは、膜間セラミド移動を促進する活性を持つことが明らかになった。図 1 8に示すように、 hCERTの各種欠失変異体を組換え体を用いて、各ドメインのもつ膜間のセラミド移動促進活性について検討した。 PH ドメインの欠失は膜間セラミド移動促進活性に影響を与えず、 MR ドメインの欠失は若干活性を低下させた。一方、 START ドメインを欠失すると活性は完全に消失した。さらに、 START ドメインのみでも高い活性が検出されたが、他のドメインのみでは全く活性が検出されなかった。なお、 hCERT_tタンパク質は、 hCERTタンパク質同様の活性を示した。よって、膜からのセラミド遊離促進と同様に、 hCERTによる膜間セラミド移動促進は START ドメインを介して起こっていることが明らかになった。産業上の利用可能性

本発明は、セラミド輸送を促進する新規な薬剤を提供することができる,。また、本発明は、本発明の薬剤を生産するために用いられる塩基配列を提供することができる。また、本発明は、新規なセラミド遊離を促進する活性の測定方法を提供することができる。さらに、本発明は、新規なセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法を提供することができる。配列表フリ一テキスト

配列番号 1〜4は、それそれ、 hCERTタンパク質のアミノ酸配列、 hCERTLタンパク質のアミノ酸配列、 cCERTタンパク質のアミノ酸配列、 cCEETLタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号 5 ~ 8は、それぞれ、 hCERT mRNAの ORFの配列、 hCERT_L mRNAの ORFの配列、 cCERT mRNAの全長 cDNA配列、及び cCERT_L ORFの DNA配列を示す。配列番号 9〜 3 2は、プライマーの配列を示す。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 1のアミノ酸配列を有する hCERTタンパク質、配列番号 2のアミノ酸配列を有する hCERTtタンパク質、配列番号 3のアミノ酸配列を有する cCERTタンパク質、配列番号 4のアミノ酸配列を有する CCERTLタンパク質、又はそれらの組換えタンパク質を有効成分として含有するセラミド輸送を促進する薬剤。

2 . 制ガン剤、抗炎症剤、器官再生剤、抗感染症剤、又は化粧品用の分配促進剤として用いられる薬剤であることを特徴とする請求項 1に記載される薬剤。

3 . セラミド輸送を阻害する薬剤の検出に用いられることを特徴とする請求項 1.に記載される薬剤。

4 . 配列番号 1または 3のアミノ酸配列の第 3 7 0残基〜第 5 9 8残基、あるいは配列番号 2又は 4のアミノ酸配列の第 3 9 7残基〜第 6 2 4残基からなる組換えタンパク質を有効成分とすることを特徴とする請求項 1のセラミド輸送を促進する薬剤。

5 . 請求項 1に記載される薬剤を生産するために用いられることを特徴とする配列番号 5、 6、 7または 8の塩基配列、又はその組換え塩基配列。

6 . 配列番号 5の塩基配列の第 1 1 0 8塩基対〜第 1 7 9 4塩基対、配列番号 6の塩基配列の第 1 1 8 9塩基対〜第 1 8 7 2塩基対、配列番号 7の塩基配列の第 1 5 3 9塩基対〜第 2 2 2 5塩基対、又は配列番号 8の塩基配列の第 1 1 8 9塩基対〜第 1 8 7 2塩基対からなる組換え塩基配列であることを特徴とする請求項 5に記載の塩基配列。

7 . セラミドを含有する脂質膜とセラミド遊離を促進する薬剤とを混合して得られた混合物を保温する保温工程を行い、遠心法で分離することにより保温した後の混合物から上清を得る分離工程を行い、次いで、得られた上清に含有されるセラミドを定量する定量工程を行うことを特徴とするセラミド遊離を促進する活性の測定方法。

8 . 前記セラミドを含有する脂質膜が、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合脂質にセラミドを添加して調製されたものであることを特徴とする請求項 7に記載されるセラミド遊離を促進する活性の測定方法。

9 . 前記セラミドを含有する脂質膜が、超音波処理されたものであることを特徴とする請求項 7又は 8に記載されるセラミド遊離を促進する活性の測定方法。

1 0 . 前記セラミドを含有する脂質膜に添加されるセラミドが、放射性標識されたセラミドであることを特徴とする請求項 7に記載されるセラミド遊離を促進する活性の測定方法。

1 1 . 受容膜とセラミド輸送を促進する薬剤とセラミドを含有する供与膜とを混合し、得られた混合物を保温する保温工程を行い、保温工程で得られた混合物に選択的膜凝集剤を添加後、遠心法に供して受容膜と供与膜を分離する分離工程を行い、分離した受容膜及び供与膜がそれぞれ含有するセラミドを定量する定量工程を行うことを特徴とするセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法。

1 2 . 前記受容膜が、ホスファチジルコリンとホスファチジルェタノールァミンの混合脂質で調製されたものであることを特徴とする請求項 1 1に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法。

1 3 . 前記セラミドを含有する供与膜が、ホスファチジルコリンと、ホスファチジルェ夕ノールと、ラクトシルセラミドと、セラミドとを含有する混合脂質から調製されることを特徴とする請求項 1 1又は 1 2に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法。

1 4 . 前記セラミドを含有する供与膜に添加されるセラミドが、放射性標識されたセラミドであることを特徴とする請求項 1 1に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法。

1 5 . 前記選択的膜凝集剤がヒマ豆レクチンであることを特徴とする請求項 1 0〜 1 4のいずれか 1項に記載されるセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法。